Biotecnología aplicada a la medicina 8499696481, 9788499696485

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Jesús A. F.-Tresguerres Catedrático. Dpto. de Fisiología Fac. Medicina. Univ. Complutense. Madrid

Vicente Martínez Fernández Víctor Navas Serrano Dpto. Médico. Laboratorios Serono. Madrid

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

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Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright.» © Jesús A. F.-Tresguerres, 2003 Ediciones Díaz de Santos, S. A. Doña Juana I de Castilla, 22 28027 Madrid España Internet: http://www.diazdesantos.es/ediciones E-Mail: [email protected] ISBN: 84-7978-543-8 Depósito legal: M. 43.358-2002 Diseño de cubierta: Ángel Calvete Fotocomposición: FER, S. A. Impresión: Edigrafos, S. A. Encuadernación: Rústica-Hilo Impreso en España

Directores Jesús A. F.-Tresguerres. Catedrático. Dpto. de Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.

Vicente Martínez Fernández. Dpto. Médico. Laboratorios Serono. Madrid. Víctor Navas Serrano. Dpto. Médico. Laboratorios Serono. Madrid.

Autores Elvira Álvarez García. Dpto. Bioquímica. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Jesús Argente. Unidad de Endocrinología Pediátrica. Hospital del Niño Jesús. Madrid. Enrique Blázquez Fernández. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Antonio Campos del Olmo. Dpto. Biotecnología. Laboratorios Serono. Trescantos. Madrid. José Casatorres Hernández. Dpto. Biotenología. Laboratorios Serono. Trescantos. Madrid. Julie Chowen. Unidad de Endocrinología Pediátrica. Hospital del Niño Jesús. Madrid. Elena Cueva. Servicio de Bioquímica. Hospital La Paz. Madrid.

Begoña Ezquieta. Serv. Bioquímica. Hospital «Gregorio Marañón». Madrid. Fco. Javier Fernández. Servicio de Bioquímica. Hospital La Paz. Madrid. M.a Cruz García Martín. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Josefa P. García-Ruiz. Dpto. Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma. Madrid. M.a Luisa Gaspar. Serv. Inmunología. C. N. Biología Fundamental. Instituto Salud Carlos III. Madrid. Carlos Jariego. Servicio de Bioquímica. Hospital La Paz. Madrid. M.a Jesús Lorenzo-Benayas. Dpto. Bioquímica Biología Molecular y Genética. Facultad de Veterinaria. Universidad de Extremadura. Cáceres.

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Alfredo Martínez Mogarra. Dpto. Biotecnología. Laboratorios Serono. Trescantos. Madrid.

Isabel Roncero. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

David Martínez-Selva. Unidad de Investigación Biomédica. Hospital Materno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona.

Juan Miguel Ruiz Albusac. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

Oscar Martínez-Tirado. Unidad de Investigación Biomédica. Hospital Materno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. Ruth Millán González. Dpto. de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

Ángel Santos Ruiz. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Pilar Santisteban. Instituto de Investigaciones Biomédicas. CSIC. Madrid.

Francina Munell. Unidad de Investigación Biomédica. Hospital Materno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona.

Bernat Soria Escoms. Instituto de Bioingeniería. Universidad Miguel Hernández. Elche. Alicante.

Tomás Pino. Unidad de Investigación Biomédica. Hospital Materno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona.

Elena Vara. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

José Regueiro. Dpto. Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

José Manuel Varela. Servicio de Bioquímica. Hospital La Paz. Madrid.

Jaume Reventós. Unidad de Investigación Biomédica. Hospital Materno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona.

Esther Velázquez Sánchez. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

Presentación

La biotecnología es la ciencia que se ocupa de la utilización de procesos biológicos más o menos espontáneos para obtener productos de interés industrial. En realidad, es un proceso que viene utilizándose, desde la antigüedad para elaborar una serie de alimentos que como el pan, el vino, la cerveza, el vinagre, el yogur y el queso, forman parte de nuestro acervo alimentario, desde hace miles de años. No es, pues la biotecnología una metodología moderna. Si lo es, sin embargo, el hecho de utilizar esas mismas técnicas pero modificadas según los avances aportados por la genética molecular. En 1944 Avery, McLeod y McCarty en la Universidad Rockefeller descubrieron que la información genética se albergaba en las moléculas de ADN. Nueve años más tarde Watson y Crick desentrañaron la estructura de dicho compuesto, lo que abrió las puertas a la comprensión de los procesos de replicación, transcripción y traducción del ADN y por ende a explicar el código genético. A partir de ese momento, se introdujo la distinción entre el material genético y el producto de su expresión, conceptos que permanecieron implícitos en toda la biología posterior. En un corto periodo de tiempo, una nueva ciencia empezó a desarrollarse, pasando de la investigación de una serie de sustancias protéicas de interés biomédico al estudio de los mecanismos de su producción y a las posibles alteraciones en los mismos. Había nacido la biología molecular. La posibilidad de influir en los procesos de síntesis de las sustancias de interés terapéutico a través de las técnicas de ADN recombinante abría nuevas posibilidades de la«vieja biotecnología» y la hacía brillar de nueva con luz propia hasta el punto que para muchos y de forma errónea constituía un nuevo concepto. Lo que sí eran nuevos eran toda una serie de elementos que venían de la mano de las nuevas tecnologías. La genética molecular, conjuntamente con la terapia génica y la ingeniería genética, formaban los tres pilares de la nueva biotecnología.

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Genética molecular, con un interés clínico diagnóstico e ingeniería genética, con una serie de productos muy importantes para la industria farmacéutica y la terapéutica se han desarrollado de manera espectacular, mientras la terapia génica todavía está en sus comienzos, absolutamente experimentales. Este libro es el resultado final de un curso sobre introducción a la biotecnología, patrocinado por la Cátedra Serono de Avances de Medicina que tuvo lugar en la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense, en Noviembre de 2000. En el mismo se pretende hacer una puesta al día de los conceptos básicos de la «nueva biotecnología» para los profesionales biosanitarios, dada la importancia creciente que está adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan refrescar y poner al día toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente un repaso a la bioquímica de los procesos que conducen a la síntesis proteica, con un breve recuerdo a las bases de la información genética, con especial hincapié en el ADN y su replicación, a la estructura del ARN, la traducción del mensaje genético y la regulación del mismo. Ésta parte es necesaria para entender el lenguaje del resto del contenido. Para completar la primera parte del libro, hay un capítulo sobre el reconocimiento de antígenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes mutadores, otro sobre apóptosis y su regulación génica y finalmente, uno sobre las bases de la terapia génica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expectativas. Todos los autores de ésta parte, son profesores de bioquímica y biología molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la Universidad Autónoma de Madrid. En la segunda gran parte del libro, se hace una introducción a la biotecnología. Hay dos lecciones sobre ingeniería genética y otras dos más sobre la producción industrial de fármacos recombinantes. Estas lecciones están escritas por los responsables de la planta de producción de GH, por técnicas de ADN recombinante en células de mamíferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia pesonal en los temas que tratan. La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades endocrinas y abarca, desde las técnicas generales para crear ratones transgénicos o KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algún gen de su genoma) que permiten la constatación de las actividades potencialmente pleyotrópicas de los mismos, a la descripción individualizada de los aspectos genéticos de una serie de enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del crecimiento a la Hiperplasia Suprarrenal Congénita, la Diabetes Mellitus, los pseudohermafroditismos, las Neoplasias Endocrinas Múltiples (MEN) y el hipotiroidismo congénito. Con todo ello, éste libro pretende ser el primero de una serie, que aborde las bases moleculares de distintos tipos de enfermedades y que pueda suponer una ayuda para todos aquellos que quieran profundizar en el mejor diagnóstico y tratamiento de muchas de ellas. Jesús A. F.-Tresguerres Vicente Martínez Fernández Víctor Navas Serrano

Índice

Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

IX

1. Concepto de información genética. Ácidos nucleicos, estructura del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Blázquez Fernández

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Flujo de la información génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El ADN como molécula portadora de la información genética . . . . . . . La estructura tridimensional del ADN muestra una doble hélice con cadenas complementarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Conformaciones del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Desenrrollamiento y superenrollamientos del ADN . . . . . . . . . . . . . . . Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina . . . . . . . . . . . . . . Aspectos estructurales y funcionales del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ADN mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 2 6 7 7 8 10 11 13 13

2. Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M.a C. García Martín

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Características generales de la replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15 16

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Replicación en procariotaes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. Iniciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Elongación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. Terminación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. Regulación de la replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Replicación en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura de la cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Papel de las polimerasas eucarióticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Orígenes de replicación en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Replicación en los extremos de los cromosomas lineales . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17 17 20 20 20 21 21 23 24 25 25

3. Estructura y procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I. Roncero

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura secundaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clases de ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ARN mensajero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procesamiento del ARNm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Adición del casquete 5’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Adición de la cola de poli(A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eliminación de intrones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ARN de transferencia (ARNt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procesamiento del ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ARN ribosómico (ARNr) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procesamiento del ARNr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transporte del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Degradación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

27 27 27 28 28 28 29 30 30 31 32 33 35 36 37 37 39 39 40

4. Mecanismo de la transcripción: regulación de la iniciación . . . . . . . A. Santos

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ARN polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

41 42 42 43

ÍNDICE

XIII

Iniciación: Promotores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Promotor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regulación de la iniciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procariotas: Factores m. Operación lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eucariotas: Regulación de la expresión génica por hormonas tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44 44 44 45 48 48

5. Síntesis de proteínas: Traducción y transporte . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Álvarez García

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El código genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Activación de los aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Etapas de la síntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Iniciación de la biosíntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Elongación de la biosíntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Terminación de la biosínesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Antibióticos que inhiben la síntesis proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Destino y transporte de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importación al núcleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importación a las mitocondrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importación al ER y distribución desde el aparato de Golgi . . . . . . . Importación a los lisosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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6. Fundamentos de regulación de la expresión génica. Diferenciación celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Velázquez Sánchez y J. M. Ruíz Albusac

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Niveles de control de la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Visión general del control de la transcripción: regiones reguladoras . . . Principales motivos de unión al ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Motivo hélice-giro-hélice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Proteínas con homeodominio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dedos de zinc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cremallera de leucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Motivo hélice-bucle-hélice (HBH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dimerización de proteínas. Control combinatorio. Importancia en la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49 53

69 70 70 71 71 71 72 72 72 73

XIV

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Regulación de la actividad de las proteínas reguladoras . . . . . . . . . . . . Control de la expresión génica en la diferenciación celular: Miogénesis Etapas de la miogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a) Etapa de Determinación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b) Etapa de Proliferación/Migración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c) Etapa de Diferenciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Proteínas reguladoras de la miogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Factores Musculares Reguladores (FMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio en la miogénesis Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

75 75 75 76 77 77 77 77 78 78 79

7. Genes para la presentación y el reconocimiento de antígenos . . . . R. Millán González y J. R. Regueiro

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . La inmunidad y la autotolerancia innatas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . La inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Linfocitos B y su receptor para el antígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Linfocitos T y su receptor para antígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El TCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El sistema HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fases de la inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tolerancia adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Deleción clonal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tolerancia B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enfermedades autoinmunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diabetes mellitus tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enfermedad de Graves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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8. Oncogenes. Proteínas tumorales. Mecanismos de activación de proto-oncogenes. Genes supresores de tumores. Genes mutadores . J. M. Ruíz Albusac y E. Velázquez Sánchez

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Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Etapas del desarrollo del cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sistemas de señalización celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Genes y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oncogenes. Proteínas tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Retrovirus transformantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

99 99 100 101 101 101

ÍNDICE

Funciones de los proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I. Factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II. Receptores de factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III. Transductores intracelulares de señal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV. Factores de transcripción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V. Reguladores de la muerte celular programada (proteínas antiapoptóticas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI. Proteínas que controlan el ciclo celular . . . . . . . . . . . . . . . . . Activación de proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Genes supresores de tumores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El gen Rb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El gen APC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El gen p53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Genes mutadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XV

103 103 103 104 104 104 104 105 108 110 111 111 112 113

9. Apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 E. Vara Muerte celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cambios bioquímicos y estructurales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Genes implicados en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Acoplamiento entre estímulo y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Papel del p53 en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatológicos . . . . . . . . . . . . . Modulación de la apoptosis por óxido nítrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Efectos proapoptóticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Efectos antiapoptóticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

115 116 117 120 123 124 124 125 125 126 126

10. Terapia génica en células somáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Josefa P. García-Ruíz Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Elementos de los genes eucarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inicio de la transcripción de un gen codificante para una proteína . . . . Transferencia de un gen a una célula somática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vectores derivados de oncorretrovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vectores derivados de los lentivirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Células diana de la terapia génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

129 130 130 132 132 134 137

XVI

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Logro de la terapia génica en la inmunodeficiencia severa combinada (SCID)-X1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

11. Introducción a la Biotecnología y generalidades sobre cultivos celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 A. Martínez Mogarra Definición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Reseña histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Producción de fármacos por Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cultivo in-vitro de células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Medida de crecimiento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cultivo de células eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Células inmortalizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Contaminación y prevención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tipos de cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cultivo discontinuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cultivo continuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

141 143 145 147 147 148 149 151 151 152 152 153

12. La ingeniería genética I. Herramientas y Metodología . . . . . . . . . . . 155 J. Casatorres Hernández Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Técnicas de ADN recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Herramientas de la ingeniería genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ADNasa I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Exonucleasa III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . h Exonucleasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleasa S1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleasa Bal31 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ribonucleasa A (ARNasa A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ribonucleasa H (ARNasa H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enzimas de restricción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enzimas de restricción Tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Polimerasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ADN polimerasa I (ADNpol I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fragmento Klenow de la ADNpol I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa® . . . . . . . . . . . Polimerasas termorresistentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

155 156 157 157 157 157 157 157 158 158 158 158 159 160 161 161 161 162

ÍNDICE

XVII

Transcriptasas reversas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transferasa terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ARNpolimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Poli-A polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Enzimas de modificación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ligasas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Quinasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fosfatasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procedimientos de ingeniería genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos de obtención purificación de AN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos de detección de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos de detección-cuantificación directos . . . . . . . . . . . . . . . Métodos de detección por hibridación: Southern y Northern . . . . Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Secuenciación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos de secuenciación automática del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . Secuenciación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aplicaciones de la secuenciación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . Reacción en cadena de la polimerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

162 162 163 163 163 163 164 164 164 164 167 167 168 172 173 174 175 176 177

13. La ingeniería genética II. Proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 181 J. Casatorres Hernández Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inserción del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN . . . . . . . . . Transferencia del vector de recombinante al hospedador . . . . . . . . . . . Métodos de Transferencia del ADN a células hospedadoras . . . . . . Elección de las células hospedadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hospedadores procarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hospedadores eucarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Selección de los organismos que expresan el gen de interés . . . . . . . . Caracterización del producto y células productoras . . . . . . . . . . . . . . . Caracterización del producto clonado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Caracterización de las células productoras (bancos celulares) . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

181 181 183 186 186 187 188 189 190 191 191 192 192

14. Producción industrial de fármacos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 195 A. Martínez Mogarra Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195 Cultivos procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195 El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

XVIII

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Parámetros de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Control de temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Control del pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aporte de oxígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Agitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Volumen de los cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cultivo de células eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biorreactores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Control de pH y aireación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biorreactores airlift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Células en suspensión y células dependientes de anclaje . . . . . . . . . Cultivo en microcarriers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biorreactores de lecho fluido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Monitorización de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¿Qué controlar? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Los materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Las células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Equipos de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Utilities y Layout . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Autoridades reguladoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tipo de proceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Consideraciones ambientales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Principales agentes causantes de contaminaciones . . . . . . . . . . . Prevención de la contaminación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Impacto ambiental y bioseguridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clasificación y prevención de riesgos en las industrias biotecnológicas. Riesgos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Riesgos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Exposición a la radiación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gestión de residuos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Residuos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Residuos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Residuos radiactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Purificación de proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cromatografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Filtración molecular (Size Exclusión) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cromatografía de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Garantía de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Documentación de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

196 196 197 197 197 197 197 198 198 199 199 200 201 201 201 202 202 202 202 202 203 203 204 204 205 205 206 206 208 208 208 209 209 209 209 210 210 210 211 211 211 211 212

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XIX

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 15. Presente y futuro de la Biotecnología en las ciencias de la salud: productos obtenidos mediante biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 A. Campos de Olmo Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Productos obtenidos mediante biotecnología en ciencias de la salud . . Producción industrial de hormona de crecimiento recombinante (r-hGH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Producción industrial de r-hFSH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Modificación genética en animales. Transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El concepto de transgén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Técnica de generación de animales transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . Microinyección pronuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transgénicos Knock Out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mutagénesis condicional. Sistema Cre/lox P . . . . . . . . . . . . . . . . . . Los transgénicos en la industria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Producción de órganos para xenotrasplantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

215 215 216 217 220 222 222 222 222 222 223 223 223 224 224 225 226 227

16. Biología molecular y endocrinología: El ejemplo de los animales transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 J. Reventos, D. Martínez-Selva, O. Martínez-Tirado, T. Pino, F. Munell Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos utilizados para generar animales transgénicos . . . . . . . . . . . . Métodos clásicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transferencia mediada por espermatozoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . Recombinación homóloga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eliminación de una alelo en un animal: el ejemplo de los ratones knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Animales transgénicos de expresión inducible . . . . . . . . . . . . . . . . . Ejemplos de utilización de los animales transgénicos en biomedicina . Oncología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Creación de animales con enfermedades genéticas . . . . . . . . . . . . . . Ratones transgénicos como modelos para terapia por genes . . . . . . . Endocrinología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

229 230 230 230 230 234 234 235 236 237 237 237 238

XX

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239 17. Bases moleculares de la deficiencia y resistencia a la acción de la hormona de crecimiento: Entidades sindrómicas . . . . . . . . 243 J. A. Chowen y J. Argente Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bases moleculares del hipocrecimiento armónico . . . . . . . . . . . . . . . . I. Hipocrecimiento por deficiencia genética de hormona de crecimiento. A. Deficiencia aislada de GH familiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DAGH IA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DAGH IB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DAGH II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DAGH III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias . . . . . . . . . . . . C. Alteraciones embriológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Holoprosencefalia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Síndrome de Rieger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Displasia septo-óptica o síndrome de Morsier . . . . . . . . . . . . . . . Síndrome de ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino . Anemia de Franconi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Síndrome de Bloom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Síndrome de Aarskog . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II. Hipocrecimiento por resistencia genética a la hormona de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anomalía Post-receptor de GH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Deleción del gen de IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pigmeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resistencia a IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III. Hipocrecimiento por anomalía en genes de los gonosomas . . . . IV. Hipocrecimiento de origen prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Consideraciones finales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

243 244 244 246 246 247 247 248 248 249 249 250 250 250 250 251 251 251 252 253 253 253 253 254 255 256

18. Patología molecular de la hiperplasia suprarrenal congénita . . . . . 263 B. Ezquieta, E. Cueva, FJ. Fernández, JM. Varela y C. Jariego Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pacientes y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sujetos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Análisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa . . . . . . . . . . Análisis indirecto de CYP21B mediante microsatélites en la región HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

263 268 268 269 269 269 270

ÍNDICE

Análisis del gen de 21-OH en población española . . . . . . . . . . . . . . Correlación genotipo-fenotipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aportaciones del análisis genético molecular en la deficiencia de 21-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diagnóstico prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XXI

270 272 274 275 277

19. Terapia celular de la diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 B. Soria Escoms Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¿Qué es la ingeniería celular? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Obtención de células beta artificiales mediante técnicas de bioingeniería . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ingeniería de células de origen tumoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Producción de insulina en otros tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ingeniería celular de precursores. Estímulo y control de crecimiento, regeneración y neogénesis de islotes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clonación terapéutica y diferenciación in vitro de células betas . . . . Trasplante de células beta obtenidas a partir de células madre embrionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

279 280 280 280 281 283 284 285 287

20. Aproximación genética a los pseudohermafroditismos . . . . . . . . . . 289 M. L. Gaspar Determinación y diferenciación sexual. Pseudohermafroditismos . . . . Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica y a la hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor . . . . . . . . . Déficit enzimáticos en la biosíntesis de andrógenos . . . . . . . . . . . . . . . Anomalías en la acción de los andrógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona: mutaciones del gen de la 5_ reductasa-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b) Resistencia a la acción de los andrógenos: mutaciones del gen de su receptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mutuaciones de los genes implicados en la acción de la hormona antimulleriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

289 291 292 294 294 295 297 298

21. Patología molecular de la neoplasia endocrina múltiple (MEN-1, MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma medular de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301

XXII

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

M.a J. Lorenzo-Benayas Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Neoplasia endocrina múltiple de tipo 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Características clínicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bases moleculares del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . La proteína MENIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Detección del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Características clínicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bases moleculares del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . Detección del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

301 302 302 302 303 303 304 304 305 306 307 307

22. Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congénito, Terapia génica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . 309 P. Santisteban . Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congénito . . Factores de transcripción específicos de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . . Factor de transcripción TTF-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Factor de transcripción TTF-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Factor de transcripción Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Desarrollo de la glándula tiroidea y expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Función de los factores de transcripción tiroideos: Generación de ratones knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Factores de transcripción tiroides en el hipotiroidismo congénito . . . . Terapia génica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

309 310 310 311 311 312 312 314 316 318

ÍNDICE ANALÍTICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

1 Concepto de información genética. Ácidos nucleicos, estructura del ADN E. Blázquez Fernández

Flujo de la información génica La vida tiene un fundamento químico y los procesos que la hacen posible están protagonizados por biomoléculas, que para llevar a cabo sus efectos biológicos utilizan entre otros, sistemas capaces de generar, transmitir o perpetuar una información. Entre ellos destacan la transmisión del impulso nervioso, la recepción y transducción de señales generadas por hormonas, factores de crecimiento y neurotransmisores, el funcionamiento del sistema inmune, los mecanismos implicados en la muerte celular programada o apoptosis, y en la transmisión de la herencia y perpetuación de las especies. La expresión de la información genética permite que un organismo pueda replicarse dentro de unos cánones preestablecidos. En las células la información necesaria para ello se encuentra codificada en una molécula conocida como ácido desoxirribonucleico o ADN (1), la cual es transferida a una molécula de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) mediante un proceso conocido como transcripción del ADN (Fig. 1.1). Los ARNm transcritos son traducidos en proteínas específicas. Otras formas de ARN son los de transferencia (ARNt) implicados con el aporte de los diferentes aminoácidos para la síntesis de proteínas, y los que forman parte de los ribosomas o ARN ribosomal (ARNr). Las unidades de información son conocidas como genes, localizados dentro de los cromosomas y que son controlados en su expresión por proteínas reguladoras, que se unen a sitios específicos presentes en regiones cercanas a las zonas codificantes. Aparte de su especificidad en la expresión génica, ésta tiene un efecto amplificador ya que a partir de un solo gen se pueden producir miles de ARN transcritos, y a partir de una molécula de ARNm pueden ser traducidas miles de copias de una cadena polipeptídica, con lo que la información presente en un gen puede generar millones de copias de una proteína específica.

2

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

CÉLULA EUCARIOTA CÉLULA PROCARIOTA

ADN

NÚCLEO Exón Intrón

ADN

Transcripción

Transcripción

preARNm

ARNm Procesamiento ARN

Traducción

ARNm Proteína ARNm Traducción Proteína CITOPLASMA

Figura 1.1. Características de la transferencia de información desde ADN a proteínas en células procariotas y eucariotas.

La transferencia de la información génica es un proceso más sencillo en las células procariotas que en las eucariotas (Fig. 1.1). Las células bacterianas carecen de núcleo y organelas y la información genética está codificada de forma ininterrumpida en el ADN, mientras que en las células eucariotas que son ricas en organelas, tienen un núcleo celular donde ocurren la replicación y transcripción del ADN. En esta molécula existen las secuencias codificantes conocidas como exones, que están separados por los intrones o segmentos de ADN no codificantes. Para la síntesis de una proteína en las células eucariotas, el gen completo con sus exones e intrones es expresado en una molécula de ARN conocido como transcrito primario o pre ARNm, que en una etapa posterior es procesado por enzimas que cortan y empalman los exones liberando de esta forma los intrones. El ARNm resultante abandona el núcleo para en el citoplasma dirigir la síntesis de una proteína específica.

Ácidos nucleicos Aunque a finales del siglo XIX se sabía que la información ligada a los caracteres hereditarios estaba presente en los cromosomas, hasta mediados del siglo XX no se supo que el ADN era la molécula que guardaba dicha información. En 1869 Meischer obtuvo núcleos celulares a partir de leucocitos obtenidos de los vendajes

CONCEPTO DE INFORMACIÓN GENÉTICA

3

de pacientes intervenidos quirúrgicamente, a los que trató con ácido clorhídrico. El tratamiento posterior de los núcleos con una solución alcalina produjo un sedimento que contenía fósforo, carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno al que llamó nucleína, y más tarde al conocerse su carácter ácido denominó ácido nucleico. El conocimiento de la estructura de esta molécula se consiguió a través de un proceso muy lento, que necesitó más de 60 años hasta que se demostró que la nucleína era el ADN. Los estudios químicos pertinentes revelaron que la subunidad repetitiva del ADN era un nucleótido que contenía 2’-desoxi-D-ribosa, un grupo fosfato y una de las cuatro bases nitrogenadas heterocíclicas, de las cuales la adenina y guanina son bases púricas, y las otras dos citosina y timina son bases pirimidínicas (Fig. 1.2). Tanto el ADN como el ARN son ácidos nucleicos constituidos por polímeros de nucleótidos que se diferencian en que el ARN tiene ribosa en vez de desoxirribosa, la base uracilo en vez de la timina, y que se manifiesta como una sola hebra mientras que el ADN lo hace en forma de doble hélice. Con posterioridad se encontró que las bases están unidas al C-1’ de la pentosa mediante un enlace -N-glicosídico, constituyendo lo que se conoce como nucleósido, así como que el fosfato puede unirse al C-3’ o al C-5’ del azúcar, en cuyo caso se forma un nucleótido (Fig. 1.3). También se descubrió que los nucleótidos se unen por un enlace covalente fosfodiéster entre el grupo hidroxilo de un nucleótido y el grupo fosfato de otro nucleótido, que unen los carbonos 5’ y 3’ de los residuos de la pentosa formando enlaces 5’-3’ fosfodiéster, que de esta forma facilitan la formación de una cadena polinucleotídica. En consecuencia el ADN es un polímero lineal de residuos de 2’-desoxirribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster 5’-3’, que contienen cuatro residuos de nucleósidos distintos dA, dT, dC y dG. El prefijo d indica que la pentosa es la desoxirribosa y sirve para distinguirlo de los ARN que poseen como azúcar la ribosa. Los números con prima (‘) indican que el átomo pertenece al carbono, mientras que los números que no los llevan pertenecen al anillo púrico o pirimidínico. Las cadenas polinucleotídicas son direccionales, partiendo del C-5’ de la pentosa y con el siguiente fosfato unido al C-3’ del azúcar. Por ello los extremos de las cadenas polinucleotídicas se denominan 5’ y 3’ para indicar su dirección. Cuando a finales de los años cuarenta se hicieron valoraciones de la composición de bases en el ADN de distintos organismos, se encontró que el número de moles A y T por una parte eran iguales y el de G y C por otra también eran iguales, lo cual no se entendió en aquel momento pero actualmente sabemos que se debe al apareamiento de bases entre las dos hebras del ADN. No obstante las cantidades de C+G y de A+T para una molécula de ADN no suelen ser iguales, con oscilaciones del 35 % al 70 % entre las diferentes especies. De acuerdo con lo representado en la Figura 1.3, los componentes presentes en la cadena polinucleotídica pueden mostrarse de una forma simplificada utilizando líneas verticales y diagonales, y aún más abreviadamente se designa al polinucleótido como G-T-A-C. Determinadas bases del ADN de procariotas y eucariotas (a excepción de levaduras e insectos) están metiladas, las cuales son reconocidas por proteínas implicadas en funciones del ADN, tales como la iniciación de la síntesis y recombinación

4

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

A PIRIMIDINAS NH2

O

O

C

C

C

N O

CH

HN

CH

C

O

HN

C — CH3

C

CH

O

CH

C

CH

N H

N H

N H

Citosina

Timina

Uracilo

PURINAS O

NH2 C

C

N

C

HC

C

N

HN

C

—C

C

N CH

CH 2HN

N H

N

N

Adenina

N H

Guanina

B CH3

CH3 H

C H

N

N

H…O

CH

N…H

HC

C O

N H

CH

C N

Adenina

O

NH

N

C C

C

C

N

Timina

N

C

…H

C

H

C

N

C

C

HC N H

N

CH

…N

NH C

H… O N H

Citosina

Guanina

Figura 1.2. Estructuras de las bases púricas y pirimidínicas (A) y emparejamiento por puentes de hidrógeno de las bases adenina con timina y citosina con guanina (B).

CONCEPTO DE INFORMACIÓN GENÉTICA

A

5

O

NH2

C

C N

C

N

HN CH

O

O

HC

O

C

O — P — O — P — O — P — OCH2 O–

N

N O

–

O–

O

O

O

–

O–

H

H

O–

O–

H HO

C

CH N

O

O — P — O — P — O — P — OCH2

H

O–

O

C — CH3

H

H

HO

H

H

H

H

Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dTTP)

Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dATP)

O–

B Extremo 5’

–

O—P

O

G

T

A

C

O 3’ O

CH2

3’

G

H

P

H

P

P

P

OH

H

H O –

O—P O

5’

H

5’

5’

5’

O –

O

CH2

T

H

H

O

H

H

H

–

O—P

5’ — G — T — A — C 3’

O

O– O

CH2 H

A H H

H O –

O—P

H O

O– O

CH2 Extremo 3’

H

C H H

H HO

H

Figura 1.3. Estructuras de nucleósidos trifosfato (A) y de una cadena polinucleotídica con sus correspondientes abreviaciones (B). G: guanina. T: timina. A: adenina. C: citosina.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

del ADN. Después de la síntesis de ADN las metilasas Dam y Dem llevan a cabo su actividad catalítica, utilizando la S-adenosilmetionina como donador de grupos metilo; la metilasa Dam actúa sobre los residuos de adenina de la secuencia GATC, mientras que la metilasa Dem actúa sobre los residuos citosina de la cadena opuesta de la citada secuencia. A veces una base puede ser metilada antes de ser incorporada al ADN.

El ADN como molécula portadora de la información genética El conocimiento que el ADN contiene la información genética es una adquisición relativamente reciente, ya que hasta 1944 se consideraba que las proteínas cromosómicas tenían esa información, mientras que el ADN jugaba un papel secundario. No obstante la utilización experimental de neumococos de la cepa S (del inglés smooth) llamados de esta forma por su apariencia lisa consecuencia de la presencia de una cápsula responsable de su patogenicidad, y de los neumococos de la cepa R (del inglés rough) carentes de la cápsula y de actividad patógena, fue de gran ayuda para obtener nuevos horizontes. En efecto, cuando se inyectó a ratones neumococos R vivos y neumococos S muertos por calor la mezcla fue letal, mientras que cada uno de ellos por separado no lo fueron. Curiosamente los ratones muertos contenían neumococos S vivos, lo que sugirió que los neumococos S muertos habían transformado a los neumococos R vivos en neumococos S vivos. También se observó que este fenómeno ocurría in vitro, mediante la transformación de células en cultivo de la cepa R en otros de la cepa S por la adición de un extracto libre de células S muertas por calor. Todo ello dio lugar al concepto de principio transformador. En 1944, O. Avery, C. McLeod y M. McCarthy (2) descifraron la naturaleza química de este principio considerándolo un ácido nucleico del tipo desoxirribosa. Esta demostración fue un hito trascendental en la historia de la Biología, que posteriormente fue confirmada por los estudios de la infección del bacteriofago T2 en la bacteria E. coli. Para ello el ADN del virus fue marcado radiactivamente con 32P mientras que las proteínas de su cubierta se marcaron con 35S. A continuación el E. coli fue infectado con el fago doblemente marcado que se unió a la bacteria, procediéndose inmediatamente después a la homogenización de la preparación para proceder a la separación de virus y bacterias. La centrifugación posterior de la suspensión permitió sedimentar las bacterias en el fondo del tubo y localizar las vesículas pequeñas en el sobrenadante. De esta forma se encontró que la mayor parte del ADN del fago se encontraba en la bacteria mientras que la inmensa mayoría de la proteína del virus permanecieron en el sobrenadante. Estudios realizados más tarde mostraron que el 30 % del 32P parental aparecían en los descendientes mientras que sólo el 1 % del 35S fue transferido desde el fago a la progenie. Todo ello mostró el papel del ADN como material genético.

CONCEPTO DE INFORMACIÓN GENÉTICA

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La estructura tridimensional del ADN muestra una doble hélice con cadenas complementarias En 1953, James Watson y Francis Crick (3) describieron la estructura tridimensional del ADN basados en los estudios de difracción de rayos X. Por este trabajo pionero que inició el desarrollo de la Biología Molecular, Watson, Crick y Wilkins recibieron el premio Nobel, que quizás hubieran compartido con R. Franklind si ella no hubiese muerto víctima de cáncer antes de la concesión de ese galardón. El ADN es una doble hélice, donde cada una de las dos hebras se enrolla alrededor del eje central, generalmente en forma de hélice dextrógira. Las dos hebras avanzan en dirección opuesta, por lo que se las considera antiparalelas. En ellas las unidades de fosfato y desoxirribosa se encuentran en el exterior formando ángulos casi rectos con las bases (Fig. 1.3), y éstas se encuentran en el interior en planos que son perpendiculares al eje de la hélice. El diámetro de ésta es de 20 Å, estando las bases adyacentes separadas 3,4 Å a lo largo del eje de la hélice y desplazadas por una rotación de 36 grados. Dado que la estructura helicoidal en cada hebra se repite cada 34 Å, en ellas tienen cabida 10 residuos. Ambas hebras del ADN permanecen unidas por puentes de hidrógeno entre determinados pares de bases. Las interacciones hidrofóbicas y de van de Waals entre las bases apiladas adyacentemente también contribuyen a la estabilidad de la estructura del ADN. La geometría de la estructura doble helicoidal se mantiene por el apareamiento de una purina que es una molécula más grande con una pirimidina. En el ADN nativo la adenina se une siempre a la timina por dos puentes de hidrógeno, y la guanina lo hace siempre con la citosina mediante tres puentes de hidrógeno (Fig. 1.2). Este emparejamiento o complementariedad de las bases es el aspecto más importante de la doble hélice del ADN. Por otra parte la secuencia precisa de bases transmite la información genética y sugiere un mecanismo para la replicación del ADN. De hecho Watson y Crick (4) propusieron que una de las cadenas de cada molécula hija del ADN se sintetiza de nuevo, mientras que la otra procede de la molécula de ADN parental. Por ello esta forma de replicación se denomina semiconservativa. Los enlaces glicosídicos entre las pentosas y las bases de un par de nucleótidos del ADN no se encuentran directamente opuestas entre sí, de manera que pueden reconocerse alrededor de la hélice dos surcos de distinta anchura: como consecuencia de elllo el saliente de la hélice con más de 180° desde un enlace glicosídico a otro se denomina vértice mayor y da lugar al surco mayor, mientras que el que forma menos de 180° da lugar al surco menor.

Conformaciones del ADN La conformación B-ADN descubierta por Watson y Crick (3) y citada en el párrafo anterior es la más frecuente en la naturaleza, pero dependiendo de la composición

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de bases y bajo diferentes condiciones físicas se pueden encontrar las conformaciones A-ADN y Z-ADN (5,6). Los cambios de conformación del ADN no modifican la información contenida en el ADN, pero si pueden alterar la regulación de la expresión génica ya que los cambios conformacionales pueden afectar la unión de proteínas al ADN. Cuando disminuye el contenido de agua y sales en los cristales de B-ADN, la apariencia fina de esta molécula se transforma en otra gruesa y corta correspondiente al A-ADN, con un surco mayor más profundo y ancho y un surco menor superficial y ancho. También en comparación con el B-ADN, que tiene un paso de hélice de 3,4 nm y un número de bases por vuelta de 10,4, la molécula de A-ADN tiene respectivamente 2,46 nm y 11 bases. Aunque esta forma es poco frecuente se encuentra en las hélices ARN-ARN y ARN-ADN. En las conformaciones B-ADN y A-ADN la pentosa y la base se sitúan en lados opuestos al enlace glicosídico, o en conformación anti, con una repulsión mínima entre ambos grupos. Pero con altas concentraciones de cationes algunos nucleótidos experimentan una rotación que sitúan a la pentosa y a la base en el mismo lado del enlace glicosídico, constituyendo lo que se conoce como conformación sin. Así en una cadena de nucleótidos con guanina y citosina alternantes, la conformación del enlace glicosídico con más posibilidades es anti para la citosina y sin para la guanina. Este efecto zig-zagueante de las conformaciones anti y sin es lo que se denomina como Z-ADN. Esta forma es más larga y estrecha que el B-ADN, con 12 pares de bases por vuelta, una vuelta de hélice de 4,56 nm y un diámetro de hélice de 1,84 nm frente a los 2,37 nm del BADN. Asimismo en el Z-ADN el surco mayor prácticamente desaparece por el desarrollo de una superficie convexa, y el surco menor se convierte en una hendidura profunda que gira alrededor de la estructura.

Desenrollamiento y superenrollamientos del ADN Localmente la doble hélice del ADN se desenrolla durante la recombinación génica, replicación y transcripción del ADN, como consecuencia de la ruptura de los puentes de hidrógeno que unen las bases. Un desenrollamiento completo o desnaturalización del ADN puede ocurrir in vitro tras la elevación de la temperatura por encima de un punto determinado. La desnaturalización del ADN puede medirse espectroscópicamente, ya que esta molécula tiene el máximo de absorción de la luz ultravioleta a 260 nm, pero ello aumenta un 37 % cuando está totalmente desenrrollado. Con la representación gráfica de los cambios de la absorción frente a las temperaturas a las que se somete una muestra de ADN, se obtiene una curva sigmoidea llamada curva de fusión del ADN, que refleja las interacciones entre los pares de bases unidos por puentes de hidrógeno y los efectos cooperativos del apilamiento de bases. La temperatura de fusión del ADN está condicionada por la composición de bases, dado que el par adenina-timina tiene un enlace de hidrógeno menos que el par citosina-guanina, y por tanto son menos estables. Todo ello indica que los segmentos ricos en adenina-timina serán los primeros en desenrollarse y tienen una Tm

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(temperatura de fusión) más baja que los poseedores de fragmentos ricos en citosina-guanina que tienen las propiedades opuestas. Tras la separación de las dos hebras y con las condiciones apropiadas de temperatura se pueden renaturalizar adquiriendo con ello el enrollamiento previo. Muchas moléculas de ADN son circulares, como las presentes en el genoma de los procariotas y de bastantes virus, así como el ADN presente en las mitocondrias y cloroplastos. Como en el caso del ADN lineal la elevación de la temperatura y del pH destruyen los enlaces de hidrógeno y otros tipos de interacciones que estabilizan la doble hélice de las moléculas de ADN circular. Sin embargo las dos hebras del ADN circular no se pueden desenrollar o separarse, a menos que una de las hebras sea cortada y después se las someta a desnaturalización. La ruptura de un ADN circular puede ocurrir durante la replicación del ADN, y se puede inducir en el laboratorio mediante la ruptura de un enlace fosfodiéster con el uso de concentraciones bajas de desoxirribonucleasa. Tras un desenrollamiento local del ADN se genera una tensión que se contrarresta con un superenrollamiento (7) del ADN restante. Desenrollamientos y superenrollamientos ocurren durante la replicación, transcripción, unión de proteínas al ADN circular, o por fijación de grandes hebras de ADN dentro de los cromosomas. Los superenrollamientos son reconocidos y regulados por enzimas llamadas topoisomerasas (8). Los superenrollamientos pueden ser negativos y positivos, encontrándose los primeros in vivo y los segundos in vitro. El grado de superenrollamiento de una molécula de ADN se puede verificar cuantitativamente, mediante el número de veces que una cadena de ADN circular cruza a la otra cadena, lo cual define el número de superenrollamientos topológicos (9). Este número puede modificarse sólo por la ruptura de un enlace fosfodiéster en una o dos cadenas con reenrrollamiento y cierre del nuevo círculo. Las enzimas que realizan estos procesos reciben el nombre de topoisomerasas, y son responsables de la introducción o eliminación de superenrollamientos. La topoisomerasas I rompen una cadena de ADN y relaja el superenrollamiento negativo, mientras que la topoisomerasa II rompe ambas cadenas de ADN y añade superenrollamientos negativos. Ambas enzimas son importantes para la replicación del ADN. Estas topoisomerasas han sido tenido en cuenta como dianas de moléculas con acciones antimicrobianas o antitumorales, tales como la camptotecina, antraciclina y amioacridina. Estos agentes actúan inhibiendo parcialmente la actividad enzimática impidiendo la unión de las hebras de ADN, con lo que convierten a las topoisomerasas en agentes rompedores de ADN, que finalmente producen la muerte celular. En este sentido se ha podido demostrar una correlación entre la actividad antitumoral de varios derivados de la camptotecina y sus capacidades para inhibir la actividad de la topoisomerasa I. Asimismo los altos niveles de topoisomerasa I encontrados en el cáncer de colon y otros tumores humanos han contribuido al efecto terapéutico de la camptotecina sobre estas neoplasias. Por otra parte distintos agentes antitumorales como las antraciclinas y los derivados de la acridina ejercen su efecto terapéutico actuando sobre la topoisomerasa II. Neoplasias como las leucemias linfocíticas y no linfocíticas, enfermedad de Hodgkin y linfomas no

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Hodgking se tratan con uno o más inhibidores de la topoisomerasa II acompañados o no de agentes citotóxicos (10).

Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina La denominación de cromatina procede de las observaciones con el microscopio óptico de núcleos correspondientes a células eucariotas teñidos con distintos colorantes, en los que se encontraron zonas bandeadas, llamándose cromatina a las que estaban coloreadas. Más tarde, se encontró que la cromatina al igual que la nucleína se comportaba de una forma semejante con las soluciones ácidas y alcalinas, por lo que se asumió que se trataba de la misma sustancia. Esta conclusión resultó ser parcialmente cierta, ya que la cromatina contiene ADN, que además está fuertemente unido a proteínas. En los estadios de reposo celular, la cromatina tiene una estructura amorfa y dispersa por el núcleo con estructuras de 30 nm de espesor. Sin embargo antes de la división celular la cromatina se perfila en estructuras más compactas en forma de fibras conocidas como cromosomas. La presencia de la cromatina es muy importante para el empaquetamiento del ADN eucariótico, ya que en ella es decisivo la interacción del ADN con las proteínas histonas y no histonas. Estas últimas se encuentran en pequeñísimas cantidades y constituyen un grupo de varios centenares de proteínas íntimamente relacionadas con la organización del cromosoma, replicación y expresión génica. No obstante el componente proteico mayoritario está constituido por las cinco histonas: H1, H2A. H2B, H3 y H4, que son proteínas básicas ricas en arginina y lisina, cuyas cargas positivas se unen inmediatamente con las cargas negativas del ADN. La cromatina se presenta en forma muy condensada, organizada como un módulo repetitivo cada 10 nm constituido por ADN e histonas. Cuando la cromatina se trata con disoluciones de ClNa de gran fuerza iónica sus componentes se distorsionan, observándose al microscopio electrónico imágenes que recuerdan a un collar de cuentas llamado polinucleosoma, en el que la unidad elemental o nucleosoma se repite regularmente. El hilo de ese collar es ADN libre y las cuentas son el ADN enrollado sobre las histonas. Estos últimos complejos de ADN-proteínas constituyen los nucleosomas formados por dos copias de cada histona H1, H2A, H2B, H3 y H4, y por un segmento de 200 pares de bases de ADN. La digestión parcial con nucleasas produce la hidrólisis de una cuarta parte del ADN y la liberación de H1, lo que da lugar al nucleosoma límite que contiene 146 pares de bases de ADN y dos copias de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, que reciben el nombre de octámero de histonas. Los nucleosomas son fibras de 10 nm de diámetro, que cuando producen un triple empaquetamiento dan lugar a fibras de 30 nm de diámetro, que se mantienen unidas por las interacciones cooperativas de la histona H1. El empaquetamiento del ADN en el nucleosoma y luego en las fibras de 30 nm, reduce su longitud en un factor de 50, pero antes de la división celular esta reducción alcanza un factor de 8.000.

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Aspectos estructurales y funcionales del ADN Existen grandes diferencias en los tamaños del ADN, desde varios millares de pares de bases en los virus pequeños hasta millones en el ADN cromosómico de bacterias y miles de millones de pares de bases en el ADN cromosómico de los animales. En humanos el genoma haploide contiene 3,5 × 109 pares de bases, con 120 × 106 pares de bases por cromosoma, y aunque se creía que tenían 100.000 genes, tras la información que se está obteniendo con el programa del genoma humano se cree que son 35.000 genes los presentes en células humanas. Salvo excepciones la cantidad de ADN por célula aumenta con la complejidad de la función celular. En ocasiones algunas células de anfibios, peces y plantas tienen mayores cantidades de ADN que las células de mamíferos, pero ello es debido a la reiteración de secuencias de nucleótidos y no representan un aumento real del tamaño en términos de secuencias únicas. Las endonucleasas de restricción cortan las cadenas de ADN en secuencias específicas que hacen posible la ruptura del ADN en fragmentos más pequeños. Son auténticos bisturís químicos que han facilitado la secuenciación de bases del ADN. Estas enzimas producen un corte en cada hebra del ADN y reconocen secuencias de cuatro o seis nucleótidos de longitud, conocidas como palíndromes y caracterizadas por una completa simetría de repetición invertida. También el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por K. Mullis en 1984, con capacidad para amplificar secuencias específicas de ADN (11), ha sido determinante en el progreso conseguido en la secuenciación y clonación del ADN. También este proceder tiene una gran aplicabilidad en medicina, como en la detección temprana de cánceres mediante el estudio de las mutaciones de genes implicados en el control del crecimiento, en el seguimiento de la quimioterapia aplicada a pacientes con cáncer, o en la detección temprana del virus de la inmunodeficiencia adquirida (HIV-1) en personas en las que aún no se ha detectado los correspondientes anticuerpos, y en la identificación de Mycobacterium tuberculosis en muestras de tejido, que es un proceder muy lento y laborioso por los métodos convencionales. Asimismo en Medicina Forense y Legal, esta técnica es de gran utilidad para determinar el parentesco en casos de disputa de paternidad, o mediante el análisis del PCR de cabellos, manchas de sangre y semen suministran información acerca de casos de crímenes o violaciones. Con la ayuda de la técnica del PCR se han podido descifrar genes de muestras muy antiguas (12) correspondientes a momias egipcias y restos arqueológicos de hace 7.500 años (13), o de una termita fosilizada en ámbar (14) del período del Mioceno con 30 millones de años, con lo cual se ha obtenido información enriquecedora sobre la evolución de determinadas especies. También las sondas de ADN son de gran utilidad diagnóstica en la clínica médica. Estas sondas son oligonucleótidos cortos monocatenarios complementarios de secuencias específicas de interés en un ADN genómico. Las sondas tienen una longitud mínima de 15 nucleótidos, porque fragmentos más pequeños podrían ser complementarios a secuencias que de una forma aleatoria estén presentes en un ADN

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genómico. La utilización de sondas es un procedimiento de gran valor en el diagnóstico de tumores o de alteraciones genéticas como por ejemplo la anemia falciforme, la enfermedad de la hemoglobina C, y la fenilcetonuria. También se utilizan para el diagnóstico selectivo de infecciones por bacterias, como ciertos tipos de sífilis, identificación de microorganismos responsables de la lepra, o neumonías producidas por Clamydia pneumoniae entre otras. En procariotas, un elevado porcentaje del ADN cromosómico codifica proteínas específicas, en contraposición con el ADN eucariótico donde gran parte no es codificante y se considera de «relleno» porque no se ha podido asignar alguna función. Actualmente se piensa que podría desempeñar un papel importante en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo. Por otra parte los genes eucarióticos están separados por una media de 40 kb, y dentro de ellos están interrumpidos por secuencias nucleotídicas interpuestas o intrones (Fig. 1.1) que se eliminan con el procesamiento del preARNm, con lo que la expresión génica sólo se realiza a través de los exones. La función de los intrones no está clara, aunque su presencia en las células eucariotas parece que está relacionada con la evolución génica, ya que ellos no se encuentran en los procariotas ni en los eucariotas inferiores como las levaduras. Otra diferencia importante entre el ADN de células procariotas y eucariota, es que en las primeras las repeticiones de secuencias de ADN son escasas mientras que en las eucariotas el ADN repetitivo puede constituir en el genoma de los vertebrados entre el 25 %-35 % del total. Las secuencias pueden ser de copia única, moderada y altamente reiteradas, y de repeticiones invertidas. Aunque aproximadamente la mitad del genoma humano está compuesto de secuencias únicas, sólo una pequeña fracción codifica proteínas. Ello se debe a que una parte importante del ADN son pseudogenes, o secuencias que presentan analogías con el gen funcional, pero tienen mutaciones que impiden su expresión. Estos pseudogenes que se presentan con una frecuencia elevada contribuyen significativamente al tamaño del genoma eucariótico pero no a su expresión. En determinadas enfermedades humanas como, la distrofia miotónica, la enfermedad de Huntington, la ataxia espinocerebelar, el síndrome de Kennedy relacionado con la atrofia muscular bulbar y espinal ligada al cromosoma X frágil y el cáncer de colon, se han observado secuencias de ADN reiterado en forma tres pares de bases (15). Estas enfermedades se encuentran asociadas a la expansión de algunas repeticiones de tripletes que están representadas en exceso en el genoma humano. De esta forma la ataxia espinocerebelar I se caracteriza por la expansión del triplete CAG, y el síndrome del cromosoma X frágil por la expansión del triplete GCC. Las enfermedades asociadas con un incremento de estos tripletes se caracterizan por un aumento de la gravedad a lo largo de las sucesivas generaciones. Por ejemplo, en el síndrome del cromosoma X frágil, se encuentran 30 copias del triplete CGG asociados con el gen de la enfermedad FMR-1, las cuales se pueden incrementar a 300 en los portadores de mutaciones del gen, e incluso pueden presentarse con varios millares de copias en los individuos que manifiestan la enfermedad.

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ADN mitocondrial Una estructura circular de doble cadena, con 16569 pb y 37 genes constituye el ADN mitocondrial. De ellos 24 genes codifican para 2 ARN ribosomales y 22 ARN de transferencia específicos para la mitocondria, y los 13 genes restantes codifican proteínas que son esenciales para la formación del ATP mitocondrial. Dado que las mitocondrias de los espermatozoides no penetran en el huevo fertilizado los genes mitocondriales sólo tienen herencia materna. Las mutaciones son más frecuentes en el ADN mitocondrial que en el genómico, como consecuencia de una baja fidelidad en la replicación del ADN, menor capacidad reparadora del mismo, y el efecto masivo de radicales libres generados por la mitocondria. Esas mutaciones producen desequilibrios en la fosforilación oxidativa, y se cree que pueden estar implicadas en el envejecimiento y en el desarrollo de las enfermedades degenerativas (16). De hecho durante el envejecimiento de humanos y ratones se han descrito cinco deleciones diferentes del ADN mitocondrial que no se manifiestan en individuos jóvenes. También en pacientes con miopatías mitocondriales con frecuencia se observa la deleción de grandes fragmentos del ADN, lo cual también ocurre en los tejidos sanos de ancianos. Ya que el ADN mitocondrial muta con facilidad y es reparado escasamente, y que en los tejidos de ancianos se acumulan mayor cantidad de radicales libres que pueden actuar sobre el ADN mitocondrial, se ha propuesto que el envejecimiento puede estar relacionado con la acumulación de mutaciones en el ADN mitocondrial (17). Sin embargo no sólo estos factores deben tenerse en cuenta sino que otros genéticos y ambientales deben ser considerados. La epilepsia mioclónica se manifiesta con contracciones musculares incontrolables, fibras rojas deshilachadas, y con una mutación en el gen de un ARNt mitocondrial. También mutaciones en el ADN mitocondrial causan la neuropatía óptica hereditaria de Leber, entidad nosológica transmitida por vía materna y caracterizada por la pérdida de visión en la vida adulta por degeneración del nervio óptico. Esta enfermedad puede aparecer por una mutación en el gen de la NADH deshidrogenasa del complejo I, que produce la sustitución de una arginina por una histidina, y como consecuencia de ello a mitocondrias con una capacidad limitada para el transporte electrónico y la síntesis de ATP. También esta enfermedad puede ser la consecuencia de un solo cambio de bases en el gen mitocondrial que codifica para el citocromo b.

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2 Replicación del ADN M.a C. García Martín

Introducción La replicación del ADN es el proceso mediante el cual el ADN se utiliza como molde para su propia síntesis. En este proceso juegan un papel importante las ADN polimerasas, enzimas capaces de alargar o extender cadenas de ADN en crecimiento. Estas enzimas catalizan la incorporación de unidades de desoxiribonucleósidos 5’ trifosfato, de forma consecutiva, al grupo hidroxilo 3’ terminal de dichas cadenas, de forma que sólo pueden crecer en la dirección 3’-5’. La identidad de los nucleótidos que se incorporan está determinada por la necesidad de aparearse con la correspondiente base del molde. La exactitud de este proceso es muy elevada, sólo se produce un error cada 10 8-10 9 pares de bases. Esta fidelidad de la replicación es consecuencia de las características especiales de las polimerasas. La mayor parte de estas enzimas, además de la actividad polimerizante 3’-5’, poseen actividad exonucleásica en dirección 3’-5’, opuesta a la dirección de síntesis, que les permite eliminar los nucleótidos introducidos de forma errónea. Con esta actividad «correctora de pruebas» las ADN polimerasas pueden comprobar el resultado de cada polimerización antes de catalizar la incorporación del siguiente nucleótido (1-5). En E. coli se han aislado tres formas distintas, las polimerasas I, II y III que desempeñan diferentes papeles en la célula. La ADN polimerasa I consiste en una única cadena polipeptídica con tres actividades enzimáticas, una actividad polimerizante de nucleótidos 3’-5’, una actividad exonucleasa correctora de pruebas, que elimina los nucleótidos desapareados a partir del hidroxilo 3’ terminal, y una actividad exonucleasa 5’-3’ capaz de actuar sobre un ADN de doble hebra (o un segmento ADN-ARN) que contenga una mella. Esta última actividad, coordinada con la actividad polimerasa, permite a la enzima sustituir regiones de una hebra de ADN

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por material de nueva síntesis y tiene dos funciones: participa en la reparación del ADN dañado y elimina los cebadores durante la replicación del ADN. Las tres actividades de la ADN polimerasa I se localizan en dos regiones diferentes de su cadena polipeptídica: un fragmento mayor (o fragmento de Klenow) contiene los dominios polimerasa y 3’ exonucleasa y un fragmento menor contiene el dominio 5’ exonucleasa. La forma en que se disponen estos tres lugares catalíticos en el espacio es importante para comprender cómo actúa cada una de las actividades exonucleasas en coordinación con la polimerasa (1-4). La polimerasa II actúa en mecanismos de reparación del ADN dañado. La ADN polimerasa III es un complejo enzimático formado al menos por 10 subunidades distintas, tres de ellas (designadas como _, ` y e) forman el núcleo catalítico, en el que residen las actividades polimerasa y exonucleasa correctora de pruebas. La asociación de dos núcleos catalíticos en presencia de dos subunidades o forman un dímero, al unirse a las otras subunidades (`, a, b, b’, r y s) forman un dímero asimétrico conocido como holoenzima de la ADN polimerasa III. Estas proteínas accesorias aumentan la procesividad de la enzima, es decir, su capacidad de mantenerse unido al molde-cebador durante sucesivas etapas de polimerización. Estudios estructurales de estas proteínas accesorias muestran que la subunidad ` es la responsable directa del aumento de la procesividad de la enzima, dos subunidades ` forman un anillo cerrado que rodea el molde de ADN y actúa como una «pinza» permitiendo a la polimerasa deslizarse sobre el molde sin disociarse de él. Las otras subunidades, que componen el complejo a, se han identificado como «igualadores moleculares» que utilizan la energía de la hidrólisis de ATP para unir el ADN a la «pinza deslizante» (6). Las células eucariotas contienen cinco polimerasas (_, `, a, b y ¡) con diferente localización y función celular. Las polimerasas _, b y ¡ intervienen en la replicación del ADN nuclear, la polimerasa a participa en la replicación del ADN mitocondrial (8,9), mientras que las polimerasas ` y ¡ intervienen en mecanismos de reparación.

Características generales de la replicación La replicación del ADN presenta varias características comunes en sistemas procariotas y eucariotas. Es un proceso semiconservativo, en el que cada hebra de ADN parenteral se utiliza como molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria. La replicación transcurre de forma ordenada y secuencial. Es un proceso bidireccional que se inicia en puntos fijos del cromosoma, con dos horquillas de replicación que parten de esos orígenes. Cada horquilla está formada por dos hebras hijas que se extienden sobre sus moldes originales de manera simultánea al desenrollamiento de la doble hélice parenteral. Las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas y necesitan una molécula cebadora con un extremo 3’hidroxilo libre sobre el que las poli-

REPLICACIÓN DEL ADN

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merasas puedan adicionar nuevos nucleótidos. Los cebadores son en general cortos segmentos de ARN sintetizados por enzimas especializadas o primasas, aunque en algunos casos también pueden actuar las ARN polimerasas. La replicación del ADN es semidiscontinua, pues debe de extender las dos hebras de ADN antiparalelas en la misma dirección siguiendo el movimiento de la horquilla de replicación. La hebra de ADN que se sintetiza de forma continua siguiendo el movimiento de la horquilla, se llama hebra conductora, mientras que la hebra retardada, es la que crece en sentido contrario al movimiento de la horquilla y se sintetiza de forma discontinua, en forma de pequeños fragmentos, llamados fragmentos de Okazaki, que luego se unen para formar una hebra continua (1-4). Aunque de forma general el proceso de replicación es común a todos los seres vivos, existen diferencias importantes entre procariotas y eucariotas.

Replicación en procariotas Estudios realizados en E. coli han permitido proponer un modelo de replicación que, con algunas excepciones, puede considerarse un esquema básico para la replicación del ADN en muchas otras células. 1. Iniciación La síntesis de ADN comienza en un punto específico del cromosoma, denominado origen de la replicación (OriC en E. coli). El OriC consiste en una secuencia de 245 pares de bases, que contiene cuatro repeticiones de una secuencia de nueve nucleótidos, que une la proteína de iniciación dnaA, y tres repeticiones directas de una secuencia de 13 nucleótidos, ricas en pares de bases A-T fácilmente desnaturalizables. Además, el origen contiene 11 sitios de metilación reconocidos por la enzima metilasa Dam y varios sitios de unión a proteínas básicas (HU e IHF) que facilitan que el ADN se doble, un paso importante en la secuencia que conduce a la iniciación de la replicación. En la iniciación de la replicación participan seis proteínas diferentes (dnaA, dnaB,dnaG, HU, topoisomerasa II y proteínas SSB). El proceso se inicia con la unión de una molécula de dnaA a cada una de las cuatro dianas de nueve nucleótidos siempre que estas dianas estén completamente metiladas. A continuación, varias moléculas adicionales de dnaA (entre 20-40) se añaden consecutivamente por un proceso cooperativo formando un complejo al que también se unen las proteínas HU e IHF. La formación de este complejo dobla el ADN de manera bastante brusca y crea una tensión superhelicoidal negativa que desenrolla el ADN en las regiones de 13 pares de bases, con la apertura de un corto bucle de hebra sencilla. A continuación, un complejo formado por seis monómeros de la proteína dnaC y un hexámero dnaB es guiado por la dnaA hacia la región abierta donde la proteína dnaB, que es una enzima con actividad helicasa, continúa desenrollando esta estructura y crea una «burbuja» de inicio de unos pocos centenares de pares de bases. La

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Molde superenrollado ori C

Segmentos de 9 bp Segmentos de 13 bp

HU ATP • DnaA

1

Complejo inicial

Insensibles a P1 2

20°

38°

5 mM ATP

Complejo abierto

Sensibles a P1 38° 3

Complejo pre-iniciador

Sensibles a P1

4 Iniciación y réplica

Figura 2.1.

Inicio de la replicación del ADN.

DnaB DnaC ATP

REPLICACIÓN DEL ADN

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energía para la formación de la burbuja se obtiene del ATP a través de una reacción catalizada por la topoisomerasa II (Fig. 2.1). La síntesis de un ARN cebador comienza con la adición de la primasa dnaG al dnaB para formar el primosoma. El primosoma interacciona con un molde de ADN en cada una de las dos horquillas creadas por la burbuja de iniciación y empieza la síntesis de los ARN cebadores en las dos hebras conductoras. A continuación, el dnaB interacciona con la ADN polimerasa III formando el replisoma. Para que tenga lugar la formación de las nuevas cadenas es imprescindible la separación previa de las hebras del ADN parenteral. Las helicasas, son enzimas que separan las hebras de ADN al frente de la horquilla de replicación. Su efecto es el de desestabilizar la interacción entre pares de bases complementarias utilizando la energía del ATP. Se mueven con una polaridad definida a lo largo de una u otra hebra de ADN. En E. coli la principal helicasa implicada en el mecanismo de replicación es la proteína dnaB que se mueve a lo largo del molde de la hebra retardada. Una topoisomerasa II alivia la tensión torsional creada por la helicasa. 5’

3’ Topoisomerasa

Doble hebra de ADN original

Helicasa de la hebra conductora Proteína de unión a hebra sencilla

Primosoma ARN cebador

Molde de la hebra retardada

Molde de la hebra conductora

ADN polimerasa I

ADN de la hebra conductora recién sintetizado

Fragmento de Okazaki ADN polimerasa replicativa dimérica

3’

Figura 2.2.

5’

Horquilla de replicación del ADN.

ADN de la hebra retardada

ADN ligasa

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Cuando se han separado las hebras de ADN, las regiones de hebra sencilla generadas se estabilizan mediante su unión a proteínas específicas, llamadas proteínas fijadoras de monohebra (SSB), que se unen al ADN de forma cooperativa (1,4). 2. Elongación Una molécula de la holoenzima de la ADN polimerasa III cataliza la formación de las hebras conductora y retardada. La síntesis de ambas hebras se produce de forma coordinada pues en el molde de la hebra retardada se crea un bucle, originado por un giro de 180˚, que sitúa ambas hebras en la misma orientación. Cuando el extremo 5’ de un fragmento de Okazaki naciente alcanza el extremo 3’ de un fragmento sintetizado previamente, se rompe el bucle y se libera la hebra retardada, entonces, la subunidad de la polimerasa III de la hebra retardada, que es poco procesativa, se disocia de su «pinza» deslizante que la une al molde de ADN, y se une a la «pinza» en otro punto de la hebra retardada, donde la primasa ha sintetizado ya un nuevo cebador. Finalmente los segmentos de ARN cebador de los distintos fragmentos de Okazaki son eliminados y reparados por la ADN polimerasa I y la unión de los mismos catalizada por una ADN ligasa da lugar a hebras de ADN intactas. (Fig. 2.2), (2,4,6). 3. Terminación La replicación del ADN en el cromosoma circular de E. coli termina cuando las dos horquillas de replicación se encuentran en una región terminal, que contiene varias copias de una secuencia de 23 pares de bases llamada ter. Estas secuencias ter detienen el movimiento de la horquilla de replicación pues proporcionan un sitio de unión a las proteínas Tus que actúan como contrahelicasas, interfiriendo la acción de la dnaB. Las proteínas Tus son asimétricas y sólo pueden detener el avance de los replisomas que alcanzan el complejo Ter-Tus desde una dirección específica, pues de lo contrario desplazarían la proteína Tus de su unión a la secuencia ter. Cada replisoma debe traspasar todos los sitios que están orientados en la dirección opuesta antes de llegar a un sitio Tus que presenta la orientación adecuada para la terminación, lo que impide que el replisoma se disocie del ADN hasta que se encuentre con otro replisoma que entra en región ter por el extremo opuesto. De esta manera se asegura la replicación completa del cromosoma y se evita la sobrerreplicación. Los productos resultantes de la replicación son dos cromosomas hijos concatenados, que son separados por acción de una topoisomerasa tipo II (7). 4. Regulación de la replicación La regulación de la replicación tiene lugar en la etapa de iniciación. En E. coli el origen de replicación contiene 11 copias de una secuencia susceptible de ser metilada por la enzima metilasa Dam y el grado de metilación del OriC regula la

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disponibilidad de los sitios de unión a dnaA, así como la concentración de dnaA. Una vez iniciada la replicación, el OriC hemimetilado, interacciona con la membrana plasmática impidiendo el acceso de la dnaA a sus sitios de unión. Además, la unión del ADN cercano al OriC a la membrana celular secuestra el gen dnaA que esta situado cerca del OriC, como resultado se inhibe la síntesis de dnaA, disminuyendo su concentración celular (2,3).

Replicación en eucariotas La replicación del ADN en eucariontes es un proceso esencialmente parecido al que se da en procariontes. La formación de una horquilla de replicación, síntesis de cebadores, creación y maduración de fragmentos de Okazaki son paralelos a las etapas correspondientes que se dan en procariontes, sin embargo el proceso en general es bastante más complejo, debido fundamentalmente al mayor tamaño del ADN y a su diferente empaquetamiento en la cromatina.

Estructura de la cromatina El ADN se encuentra asociado con varias tipos de proteínas formando la cromatina. El componente proteico de la cromatina, que constituye algo más de la mitad de su masa, se compone de dos tipos de proteínas: las histonas, conjunto de pequeñas proteínas básicas, muy ricas en Lys y Arg, que participan en el plegamiento del ADN eucariótico y las proteínas cromosómicas no histonas. La cromatina contiene también un pequeño porcentaje de ARN. En todos los organismos eucariotas se han encontrado cinco tipos de histonas: las histonas nucleosómicas H2A, H2B, H3 y H4 responsables del plegamiento del ADN en los nucleosomas (unidades estructurales básicas de la cromatina) y la histona H1. Las histonas nucleosómicas son proteínas muy conservadas, mientras que las histonas H1 son proteínas más grandes, de carácter más básico y más específicas de especie y tejido. En vertebrados existe una histona adicional, la histona H5, que tiene una función similar a la H1. Las histonas se diversifican aún más mediante algunas modificaciones posttranslacionales de algunos aminoácidos, como reacciones de acetilación, fosforilación, ADP-ribosilación o metilación. Las proteínas no histonas constituyen un grupo de proteínas muy heterogéneo. Muchas de las proteínas no histonas son enzimas o proteínas reguladoras, otras están implicadas en la organización del cromosoma. En la cromatina, el ADN y las histonas se organizan en unidades repetitivas llamadas nucleosomas. Cada nucleosoma (o partícula central del nucleosoma) es una estructura en forma de disco, compuesta por dos unidades de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 y una cadena de ADN de 146 pares de bases que se enro-

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lla alrededor de este octámero de histonas como una superhélice negativa. Las histonas están en contacto con el surco menor de ADN, dejando libre el surco mayor para posibles interacciones con proteínas reguladoras. Los nucleosomas incorporan una molécula de histona H1 que interacciona con ambos extremos del ADN a la entrada y a la salida del nucleosoma para formar el cromatosoma. Las fibras de cromatina están constituidas por una larga cadena de nucleosomas unidos por una región de ADN de longitud variable (de aproximadamente 15-55 pares de bases) denominado ADN de unión. La formación de los polinucleosomas representa el primer nivel de estructuración o empaquetamiento del ADN eucariótico, dando lugar a la denominada fibra de 10nm. Sin embargo, gran parte de la cromatina del núcleo esta todavía más compactada. La histona H1 juega un papel clave en el siguiente nivel de compactación al servir como puente de unión entre nucleosomas adyacentes para formar una hélice solenoidal con 6 o 7 nucleosomas por vuelta que constituye la fibra de 30 nm. Se cree que el siguiente nivel de organización ocurre cuando los filamentos de cromatina de la fibra de 30 nm se organizan en dominios condensados en forma de bucles de tamaño variable según los organismos. Estos bucles están anclados en su base a un andamiaje de proteínas (matriz nuclear), compuesto por histona H1 y otras proteínas no histonas incluyendo una topoisomerasa tipo II que podría regular posibles superenrollamientos. La condensación de los cromosomas mitóticos resulta probablemente de la disposición de la fibra de 30nm en forma de enrollamientos helicoidales estrechamente apilados (10,11). Parece probable que la estructura de la cromatina sea dinámica, con cambios locales a medida que el ADN se replica o se transcribe. Los cambios en el empaquetamiento y por tanto, la transición entre las diferentes formas de la cromatina, parecen estar controladas por medio de modificaciones covalentes en las histonas. Las histonas H3 y H4 pueden experimentar una acetilación reversible dependiente del ciclo celular en el grupo ¡-amino de los restos de Lys, mediante dos enzimas diferentes, una histona acetilasa y una histona desacetilasa. El grupo hidroxilo del residuo N-terminal Ser de la histona H4 puede ser fosforilado mediante una quinasa. La acetilación y fosforilación cambian la carga de la región N-terminal de estas histonas de positiva a negativa y promueve la descondensación de la cromatina. La fosforilación de la histona H1 en los grupos de hidroxilo de restos de Ser está correlacionada con la condensación de la cromatina para dar lugar a los cromosomas metafásicos (11,12). Para que el ADN eucariótico sea accesible a la ADN polimerasas, los nucleosomas deben desensamblarse, a medida que avanza la horquilla de replicación y luego reensamblarse en las moléculas de ADN hijas, según una de las hipótesis propuestas cada nucleosoma se dividiría durante la replicación en dos «medios nucleosomas» permitiendo el acceso de la ADN polimerasa al ADN nucleosómico desenrollado. Además, en base al mayor contenido en ADN de las células animales y a la menor actividad de sus ADN polimerasas, el ciclo de replicación de la célula eucariótica tardaría mucho tiempo en completarse si no entraran en acción factores de compensación.

REPLICACIÓN DEL ADN

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Las células eucarióticas contienen un gran número de moléculas de ADN polimerasas en comparación con las bacterias. Además las polimerasas inician la síntesis bidireccional no en uno, sino en varios puntos de iniciación a lo largo del cromosoma. Los segmentos de ADN situados entre dos puntos de iniciación se denominan replicones.

Papel de las polimerasas eucarióticas A diferencia de lo que ocurre en procariotas, en los que la síntesis de ADN está catalizada por dos subunidades diferentes de la ADN polimerasa III, en eucariotas este proceso es realizado por enzimas diferentes (polimerasas _ y b). La ADN polimerasa _ es una proteína tetramérica, la subunidad mayor tiene actividad polimerizante 5’-3’ y en algunos tipos celulares también dispone también de actividad exonucleásica 3’-5’, otras dos subunidades de menor tamaño confieren a la enzima actividad primasa. El complejo ADN polimerasa _/primasa parece iniciar la síntesis en ambas hebras de ADN al sintetizar un segmento de ARN-cebador cuyo extremo 3’-hidroxilo es extendido por la actividad polimerasa para formar una corta secuencia de ADN llamada ADN i. La ADN polimerasa _, a diferencia de otras polimerasas más complejas, no puede catalizar la síntesis procesativa de ADN y se disocia del molde después de la síntesis del cebador. Los segmentos de ARNADN serán luego extendidos por la ADN polimerasa b (o ¡). La ADN polimerasa b es una polimerasa de alta procesividad que cataliza la elongación de las hebras conductora y de los fragmentos de Okazaki de la hebra retardada. Esta enzima contiene una subunidad de mayor tamaño dotada de actividad polimerizante 5’-3’ y exonucleásica 3’-5’ correctora de pruebas. La elevada procesividad de la ADN polimerasa b se atribuye a la presencia de un factor accesorio conocido como antígeno de proliferación nuclear (PCNA), pues se encuentra en grandes cantidades en los núcleos de las células proliferativas. Tres moléculas de PCNA estrechamente asociadas forman un anillo cerrado en torno al ADN que actúa como una «pinza deslizante» impidiendo la disociación de la enzima. Esto sugiere que en los eucariotas el PCNA es el equivalente funcional de la subunidad ` de la ADN polimerasa III de E. coli. El factor de replicación C (RFC) es otra proteína accesoria que parece interaccionan con la ADN polimerasa b favoreciendo su asociación al PCNA. Alternativamente, el RFC podría participar en el establecimiento de un enlace entre las ADN polimerasas _ y b. La síntesis del ADN eucariótico requiere la participación del factor de replicación A que es el equivalente funcional de las proteínas procariotas (SSB). En eucariotas, las helicasas no parecen estar relacionadas con la actividad primasa, sino que se asocian a la ADN polimerasa (1,2,8,9). En la maduración de los fragmentos de Okazaki, el ARN cebador es eliminado por la acción consecutiva de dos endonucleasas: ARNasa I y FEN1. Alternativamente, podría actuar primero una helicasa, la Dna2, desplazando el ARN cebador, para crear una estructura en forma de fleco sobre la que puede actuar la

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A. ARNasa H1/FEN1 ARN primer 3’

B. Dna2/FEN1

ADN 3’ 5’

5’

3’

ARNasa H1

5’

3’ 5’

3’

5’

3’ Dna2 helicasa

FEN1

FEN1

3’

3’ 5’

3’

Figura 2.3. Mecanismos de eliminación del ARN cebador por acción de la ARNasa H1 (A) y la ADN helicasa (B).

endonuclesa FEN1 (Fig. 2.3). También se ha sugerido que la helicasa Dna2 podría desplazar toda la secuencia ARN-ADNi sintetizada por la ADN polimerasa, para ser sustituida por nuevos desoxirribonucleótidos, lo que representaría una ventaja significativa para el mantenimiento de la integridad de genoma, pues la ADN polimerasa _ no parece presentar actividad correctora de pruebas (8). La ADN polimerasa ¡ es una proteína monomérica grande dotada de actividad polimerasa, exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas y exonucleasa 5’-3’, que podría participar en la reparación del ADN y el relleno de los fragmentos de Okazaki, de forma análoga a la polimerasa I de E. coli. Orígenes de replicación en eucariotas Los orígenes de replicación en eucariotas han sido identificados en levaduras y reciben el nombre de secuencias de replicación autónoma (ARS). Los ARS tienen entre 100 y 120 pares de bases y constan de una región central A y tres elementos B. La región central A contiene varias secuencias de consenso de 11 pares de bases que parecen análogas a las secuencias de 13 nucleótidos del OriC. La unión de proteínas a estas secuencias forma el complejo de replicación (ORC) que promueve la apertura de las hebras de ADN en las secuencias centrales ricas en A-T. La región abierta de ADN se estabiliza por proteínas de unión a monohebra RPA y una helicasa extiende la región abierta permitiendo el acceso de las

REPLICACIÓN DEL ADN

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polimerasas. Cerca de la región A, los elementos B1 y B2 ayudan a la formación del ORC mientras que los elementos B3 están asociados al factor de transcripción ABF1 (2,13). En eucariotas la replicación tiene lugar durante la fase sintética (fase S) del ciclo celular. Se produce bidireccionalmente a partir de múltiples orígenes creando «burbujas» de replicación que crecen de manera independiente hasta que se fusionan copiando todo el cromosoma. No todos los orígenes inician la replicación al mismo tiempo, el proceso de copia empieza en centenares de orígenes, algunos de los cuales son activados al principio de la fase S mientras otros son activados al final de la misma. Coordinar la síntesis de ADN en células eucarióticas significa coordinar la copia de millares de pares de bases, distribuidos en numerosos cromosomas y sólo en el momento adecuado del ciclo celular. Resultados recientes indican que el complejo ORC no actúa sólo en el control de la iniciación, una o más proteínas adicionales, que podrían estar implicadas en el control del ciclo celular, pueden interaccionar en los orígenes de replicación al final de la mitosis y permanecer unidas a ellos, inhibiendo la formación de un nuevo complejo ORC hasta el inicio de la fase S. Otra hipótesis alternativa sugiere que proteínas iniciadoras o «factores permisivos» necesarios para la replicación, podrían unirse débilmente a los orígenes de replicación y serían destruidos o inactivados por el paso de la horquilla de iniciación (13,14).

Replicación en los extremos de los cromosomas lineales Los cromosomas lineales necesitan una serie de pasos adicionales que permitan la replicación de sus extremos. En eucariotas existe un mecanismo para la replicación de los telómeros que implica la participación de la enzima telomerasa. Esta enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomérica repetida y la alarga en dirección 5’-3’. En ausencia de una cadena de ADN complementario, la telomerasa sintetiza una copia de la secuencia repetida empleando un molde de ARN que es componente de la propia enzima. Después de varios ciclos de extensión por la telomerasa, se puede completar la replicación empleando dichas extensiones como molde para la síntesis de la cadena complementaria por la ADN polimerasa. El proceso de recorte y recuperación está equilibrado solo aproximadamente, cada extremo de cromosoma contiene un número variable de repeticiones en tándem de varios cientos de pares de bases de longitud (15).

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3 Estructura y procesamiento del ARN I. Roncero

Introducción El proceso global de transferencia de la información en la célula puede representarse mediante el esquema: ADN A ARN A PROTEÍNAS La expresión de la información genética contenida en un segmento de ADN, siempre tiene lugar a través de una molécula de ARN. Con la excepción de los genomas de ARN de ciertos virus, todas las moléculas de ARN se forman a partir de la información contenida en el ADN. Mediante un proceso llamado transcripción, un sistema enzimático convierte la información genética contenida en un segmento de ADN en una cadena de ARN con una secuencia de bases complementaria a una de las cadenas de ADN.

Estructura del ARN Estructura primaria El ARN es un polímero lineal de ribonucleósidos 5´monofosfato. Las bases que forman el ARN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U). El azúcar que forma los nucleósidos en el ARN es la ribosa, en lugar de la 2´ desoxirribosa que aparece en el ADN. Los nucleósidos están unidos entre sí por enlaces 3´, 5´ fosfodiéster originando una cadena a partir de la cual se extienden las bases. Químicamente el ARN es muy similar al ADN, con las únicas diferencias del grupo OH en la posición 2´ del azúcar y la sustitución de la base timina por uracilo. Sin embargo, estas pequeñas diferencias confieren al ARN una mayor diversidad estructural y funcional que el ADN. Las moléculas de ARN no sólo transportan y

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expresan información sino que también actúan como catalizadores. Por otra parte, el ADN está diseñado para ser estable, mientras que las moléculas de ARN han de variar a lo largo del desarrollo celular, por lo tanto, estas pequeñas diferencias estructurales podrían ser también marcadores que permitan a enzimas específicos reconocer y degradar selectivamente el ARN. La longitud de las moléculas de ARN en eucariotas varía desde unos 65 hasta unos 200.000 nucleótidos. Estructura secundaria A diferencia del ADN, el ARN es una molécula monohebra que está presente en la célula predominantemente como una cadena simple. Una cadena sencilla de ARN puede plegarse de forma que las bases formen pares semejantes a los del ADN, dando lugar a una estructura secundaria como resultado de la presencia de pequeñas regiones de apareamientos intramoleculares entre bases. En el ARN existe una cantidad considerable de estructura helicoidal, incluso en regiones sin apareamientos moleculares de Watson y Crick, debida sobre todo a fuerzas de apilamiento de bases entre residuos de A, G y C. Aunque el ARN bicatenario forma una hélice dextrógira parecida a la del ADN, las estructuras helicoidales del ARN son en general del «tipo A», una hélice más compacta que la del «tipo B», con más pares de bases por vuelta y en la que los pares de bases están inclinados con respecto al eje de la hélice. Las regiones de doble hélice en el ARN se denominan «horquillas» y las regiones sin emparejar «bucles». La estructura de las horquillas es variable al igual que el tamaño y el número de bucles.

Estructura terciaria Las estructuras funcionales reales del ARN son más complejas que las hélices por apareamiento o apilamiento de bases antes mencionados. Además de la estructura secundaria, las moléculas de ARN se pliegan sobre sí mismas, dando lugar a una estructura terciaria en la que se establecen un gran número de enlaces por puentes de hidrógeno y otros tipos de interacciones débiles. Los brazos y bucles se pliegan en conformaciones específicas que se mantienen no sólo por los emparejamientos de bases tradicionales de Watson y Crick, sino también por interacciones entre bases que implican a más de dos nucleótidos. El grupo 2´-OH de la ribosa es un dador y aceptor de hidrógeno, contribuyendo de forma importante al mantenimiento de la forma plegada de la molécula de ARN.

Clases de ARN Según la función que cumplen, existen tres clases principales de ARN:

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

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ARN mensajero (ARNm): Es el portador de la secuencia de bases que codifican la secuencia de aminoácidos de uno o más polipéptidos especificados en un gen o conjunto de genes. Las moléculas de ARNm sirven como molde para la síntesis de proteínas y llevan la información desde el ADN hasta los ribosomas. ARN de transferencia (ARNt): El ARNt actúa como un adaptador que lee la información codificada en el ARNm y transfiere el aminoácido adecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento durante la síntesis de proteínas. Los ARNst transfieren los aminoácidos específicos desde los «pools» de aminoácidos solubles a los ribosomas y aseguran el ordenamiento de estos aminoácidos en la secuencia adecuada antes de la formación del enlace peptídico. Existe, al menos, un ARNt específico para cada uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas. ARN ribosómico (ARNr): Los ARNsr forman, junto con proteínas la compleja maquinaria que cataliza la síntesis proteica: los ribosomas. Los ribosomas son partículas subcelulares formados por, al menos tres moléculas diferentes de ARNr y de 70 a 80 proteínas ribosómicas.

Procesamiento del ARN Gran parte de las moléculas de ARN en procariotas y virtualmente todas las moléculas de ARN de eucariotas son modificadas en mayor o menor grado después de su síntesis. Una molécula de ARN recién sintetizada se llama transcrito primario y éste debe ser modificado posteriormente para dar una molécula de ARN madura, funcionalmente activa. Las reacciones que dan lugar a las formas maduras del ARN comprenden: — Adición de secuencias o nucleótidos no codificados por los genes correspondientes. — Modificación covalente de determinadas bases o residuos de ribosa. — Separación de diferentes secuencias por acción de nucleasas específicas. — Transporte del ARN desde el núcleo al citoplasma. — Degradación completa del ARN para ser reemplazado por ARN recién sintetizado. El procesamiento del ARN está relacionado con la estabilidad. Generalmente niveles elevados de procesamiento se corresponden con ARNs muy estables, si bien la estabilidad depende también del grado de estructura secundaria. En este sentido, las moléculas estables de ARNt y ARNr con vidas medias del orden de horas a días, constituyen un caso extremo. Estas moléculas, como se verá más adelante, presentan estructuras secundarias con alto grado de apareamiento de bases y estructuras terciarias que les confieren resistencia a nucleasas celulares ubicuas. Tanto en procariotas como en eucariotas, estas especies de ARN resultan de un procesamiento extenso de los transcritos primarios. En el extremo opuesto están las moléculas de mARN procariótico que tienen vidas medias de minutos. Estas moléculas carecen de una estructura secundaria particular y raramente son procesadas. Entre estos dos

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extremos están las moléculas de ARNm eucariótico, cuyas vidas medias son del orden de horas. Aunque carecen de estructura secundaria definida, estas moléculas sufren un proceso extenso de maduración. La inclusión del procesamiento entre la transcripción del ARN y la actividad completa del mismo supone para la célula un punto importante de regulación de la expresión génica. El procesamiento del ARN tiene lugar en el núcleo de la célula y sólo cuando este proceso se ha completado el ARN es transportado al citoplasma. Estudiaremos a continuación la estructura y el procesamiento de cada uno de las tres clases principales de ARN.

ARN mensajero Los ARNm son los portadores directos de la información genética desde el núcleo a los ribosomas. Son productos de la transcripción del ADN genómico, con unas características especiales que los destinan a unirse a los ribosomas. Cada ARNm eucariótico contiene información para una sola cadena polipeptídica, por lo que se llaman monocistrónicos, mientras que las especies de ARNm policistrónicas de procariotas pueden codificar más de una proteína. Los ARNm eucarióticos maduros tienen rasgos estructurales únicos que no aparecen en las moléculas de ARNt ni en las de ARNr (Fig. 3.1A). El extremo 5´ del ARNm de eucariotas comienza con una estructura llamada casquete o caperuza (cap) formado por una base nitrogenada metilada, generalmente 7 metil guanosina (m7G), unida al primer nucleótido del transcrito mediante enlaces 5´,5´-fosfotriéster en lugar de los enlaces 3´,5´-fosfodiéster habituales. El primer nucleótido transcrito es generalmente una purina y está metilado en el 2´OH de la ribosa. A continuación del casquete viene una secuencia que no se traduce, llamada secuencia conductora o «leader», seguida de la secuencia o codón de iniciación, que generalmente es AUG y a continuación el mensaje que se ha de traducir o región codificadora. Al final de la región codificadora se encuentra una secuencia o codón de terminación (UAG, UGA o UAA) que señala el final de la síntesis del péptido. Sigue una secuencia no traducida, secuencia remolque (trailer) que termina con una serie de ácidos adenílicos, llamada cola de poli(A) que constituye el extremo 3´ de la molécula de mARN y puede tener una longitud de 20 a 200 nucleótidos.

Procesamiento del ARNm Los rasgos estructurales que acabamos de describir para las moléculas de ARNm maduro de eucariotas no están presentes en los transcritos primarios, éstos los adquieren en el núcleo durante el proceso de maduración que comprende: — Adición del casquete 5´. — Adición de la cola de poli(A) 3´ terminal.

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

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A Transcrito primario 3’

5’ AUG

UAG

Procesamiento RNAm 3’

5’ 7

m Gppp CAP

UAG

AUG Secuencia conductora no traducida

Secuencia codificadora traducida

(AAAA)n Secuencia final no traducida

B 3’

3’

5’ OH 3’

3’ 3’ OH G A

G P

G A P

G U A A G U

G A OH-A

5’

G U A A G U

P

G A

G P

G A A

G P

G A

5’ +

G U A A G U

P

A

5’

Figura 3.1. Estructura y procesamiento del ARNm. (A) Estructura del ARNm eucariótico. (B) Mecanismo de eliminación de intrones.

— Modificación covalente de nucleótidos. — Eliminación de secuencias no codificantes (splicing).

Adición del casquete 5´ El extremo 5´ de los transcritos primarios del ARNm eucariótico, es modificado covalentemente antes de que finalice completamente la transcripción. A medida que el complejo de transcripción se desplaza a lo largo del ADN, las enzimas encargadas de la unión del casquete modifican el extremo 5´ del ARNm naciente. La modificación tiene lugar de la siguiente forma: — El grupo a-fosfato del nucleósido trifosfato terminal se escinde por acción de una fosfohidrolasa.

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— El grupo 5´-difosfato resultante reacciona con el fosfato en posición _ de una molécula de GTP para generar un enlace 5´,5´-trifosfato. Esta reacción está catalizada por la guanililtransferasa que junto con la fosfohidrolasa de la reacción anterior, forman una enzima dimérica que está asociada al extremo C-terminal de la ARN polimerasa II. — En la mayoría de los eucariotas los ARNms son metilados en el nitrógeno en posición 7 de la guanina recién añadida a expensas de S-adenosil metionina como dadora del grupo metilo. El casquete puede a su vez ser modificado de diferente forma según la especie de que se trate. Así, puede metilarse el grupo 2´-OH del último nucleótido del transcrito original o los grupos 2´-OH de los dos últimos nucleótidos. La función del cap es importante ya que interviene en diferentes procesos. Así: 1) protege al ARNm de las actividades 5´ exonucleolíticas al bloquear el extremo 5´ de la molécula; 2) convierte a los precursores del ARNm en sustrato de las siguientes etapas de procesamiento; 3) constituye un sitio de reconocimiento por factores de iniciación de la traducción; 4) se une a proteínas nucleares que dirigen el transporte de las moléculas de ARNm maduras desde el núcleo al citoplasma; y 5) sirve de centro de anclaje a los ribosomas.

Adición de la cola de poli(A) Los precursores del ARNm eucariótico son también modificados en el extremo 3´. Una vez que la ARN polimerasa II ha sobrepasado el extremo 3´ terminal de la región codificadora del ADN, el ARN es escindido por una endonucleasa cerca de un sitio específico cuya secuencia consenso es AAUAAA. La escisión tiene lugar a unos 15-20 nucleótidos hacia el extremo 3´ del sitio de reconocimiento AAUAAA y depende tanto de secuencias adicionales como de la estructura secundaria del precursor del ARNm. La escisión endonucleolítica genera un nuevo extremo 3´ que puede ser utilizado como cebador para la adición de residuos de adenosina en reacción catalizada por la poli A polimerasa. Este proceso, que requiere ATP y puede añadir hasta 250 nucleótidos, puede representarse: ARNm precursor + nATP A ARN(AMP)n + nPPi El proceso de poliadenilación no suele estar acoplado a la terminación de la transcripción, que puede continuar cientos de nucleótidos detrás del sitio de rotura 3´ terminal. La longitud de la cola de poli(A) varía desde 50 a 250 nucleótidos, dependiendo de la especie y de otros factores, como el tipo de ARNm y el estado de desarrollo de la célula. También depende de la edad del ARNm, ya que la cola se va acortando con el tiempo, de hecho se acorta en 50-100 nucleótidos en el tiempo que transcurre hasta que el ARNm maduro alcanza el citoplasma. Esta reducción se debe a la acción de exonucleasas específicas del extremo 3´ terminal del ARN. Así la cola de poli(A) retrasa la llegada de estas exonucleasas a la región codificadora

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

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del ARNm, protegiéndole de su degradación enzimática. La colas de poli(A) se asocian con una proteína de 78 kD formando un complejo que posiblemente contribuye a la estabilidad del ARNm.

Eliminación de intrones En eucariotas, los ARNm citoplasmáticos son más cortos que sus transcritos primarios, los cuales tienen secuencias internas y terminales adicionales. Un transcrito primario de un ARNm eucariótico contiene generalmente secuencias que abarcan un gen. Sin embargo, las secuencias que codifican un polipéptido no son contiguas. En la mayoría de los transcritos primarios, las secuencias codificantes, llamadas exones, están interrumpidas por secuencias no codificantes llamadas intrones (Fig. 3.1). En el proceso llamado de corte y empalme (splicing) se eliminan los intrones del transcrito primario y se unen los exones para formar una secuencia contigua que codifica un polipéptido. El descubrimiento de los intrones a mediados de los años setenta, cambió la idea que se tenía sobre la organización de los genes. Hasta entonces, se asumía que el ARNm maduro era una copia exacta de la hebra molde del ADN, y era traducido de un extremo a otro íntegramente. Este concepto se basaba en experimentos realizados con bacterias, en los que el orden y la distancia entre mutaciones en un gen eran idénticos al orden y la distancia entre los aminoácidos modificados en la proteína correspondiente. Así, las secuencias de aminoácidos en las proteínas parecían estar codificadas por el ADN sin interrupción. Hoy día está bien establecido que esto ocurre sólo en bacterias y en unos pocos eucariotas, en los que la secuencia de ADN que codifica una proteína es continua. Los intrones se cortan del transcrito primario y se empalman los exones formando el ARN maduro funcional, en un proceso que tiene lugar mediante reacciones sucesivas de transesterificación y en el que algunas de las enzimas que intervienen están constituidas por ARN y no por proteína. Además algunas de estas moléculas de ARN están localizadas en los propios intrones, donde autocatalizan su eliminación. ¿Cómo reconoce la célula las secuencias pertenecientes a los intrones y que por tanto debe eliminar y las que deben permanecer en el ARN maduro? Los sitios de corte de las moléculas precursoras de ARNm contienen secuencias consenso relacionadas entre sí. Además, a una distancia de entre 10 y 40 nucleótidos del extremo 3´ terminal del intrón, existe una secuencia consenso, denominada sitio de ramificación, que tiene un papel muy importante en el proceso de corte y empalme. Estas secuencias se representan en el esquema siguiente: Sitio de ramificación 5´––––AGGUAAGU–––––––––––AY–––––YYYYYYYYYAGG––––3´ Å––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––Æ exón5´ intrón exón3´

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

y tienen como características: 1) en todos los genes eucarióticos aparece la secuencia GU en el punto en el que el extremo 5´ del intrón se une al exón 5´. 2) la secuencia AG marca el punto de unión del extremo 3´ terminal del intrón con el exón 3´; y 3) un residuo de adenosina situado entre 10 y 40 nucleótidos más arriba del sitio de corte 3´ forma parte del sitio de ramificación. En el esquema anterior, Y puede ser cualquier nucleótido de pirimidina. La importancia de estas secuencias se manifiestan por los efectos que su alteración produce en el proceso de corte y empalme, que se ve afectado cuando en ellas se sustituye algún nucleótido sobre todo en AG y GU. En muchas especies el proceso es alterado por mutaciones espontáneas en estas secuencias. Así, en el hombre, pueden aparecer mutaciones que alteran el patrón de procesamiento normal de los genes de las globinas _ y `, dando lugar a cadenas anormales en la hemoglobina (talasemias). Por ejemplo, una mutación de G a A en la secuencia GU por la que empiezan todos los intrones, implica que la maquinaria de empalme no la reconocerá como tal secuencia y pasará por alto la unión exón-intrón, dando como resultado la aparición de secuencias adicionales en el ARNm de la ` globina o la eliminación de secuencias en el mismo. En cualquier caso, la cantidad de ` globina funcional estará reducida. En los precursores de los ARNm eucarióticos, los intrones son eliminados mediante dos reacciones de transesterificación, una entre el sitio de corte 5´ del intrón y un resto de adenilato del sitio de ramificación y otra entre el exón 5´ y el sitio de corte 3´ del intrón. Los productos de estas reacciones son los dos exones ligados entre sí y el intrón separado en forma de lazo (Fig. 3.1B). Estas reacciones están catalizadas por un complejo de proteína y ARN de gran tamaño (3.103 kD) y complejidad denominado complejo de splicing o espliceosoma. Las moléculas de ARN que forman este complejo pertenecen a una clase de ARN eucariótico llamado ARN nuclear pequeño (ARNsn) y se asocian con proteínas dando lugar a complejos denominados ribonucleoproteínas nucleares de pequeño tamaño (RNPsn). En las reacciones de corte y empalme intervienen cinco tipos de moléculas de ARNsn: U1, U2, U4, U5 y U6 (U es la abreviatura de uracilo, una base muy frecuente en este tipo de moléculas). Cada una de las moléculas U1, U2, U5 constituyen el núcleo de una RNPsn determinada. U4 y U6 forman parte conjuntamente de la estructura de otra RNPsn. Además cada RNPsn contiene proteínas que son comunes a todas las snRNPs y otras que son exclusivas de cada complejo snRNP particular (Tabla 3.1). Mecanismo del corte y empalme: El proceso empieza con la unión del complejo RNPsnU1 al sitio de corte 5´ del intrón. ARNsnU1 contiene una secuencia complementaria a la secuencia consenso del extremo 5´ del intrón y la unión se realiza mediante el apareamiento entre estas secuencias complementarias en el ARNU1 y el ARNm precursor. Este apareamiento convierte al intrón en diana del mecanismo subsiguiente de eliminación. A continuación, RNPsnU2 se une al sitio de ramificación del intrón y U1 y U2 se asocian acercando entre sí los extremos 5´ y 3´ del intrón, lo que permite que U1 se aparee también con el centro de empalme 3´. El complejo U4 U5 U6 previamente formado, se une al formado por U1 U2 y el pre-

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

Tabla 3.1.

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Moléculas de ARNsn y RNPsn que forman el espliceosoma.

ARNsn

RNPsn

U1

snRNPU1

Unión al centro de empalme 5´y después al centro de empalme 3´

U2

snRNPU2

Unión al sitio de ramificación

U5

snRNPU5

Unión al centro de empalme 5´

U4

SnRNPU4U6

U6

Función

Enmascarar la actividad catalítica de U6 Catalizar el empalme

cursor del ARNm, dando lugar al espliceosoma completo pero inactivo. La ruptura del apareamiento entre U4 y U6, libera la actividad catalítica de U6, que junto con los demás componentes del espliceosoma llevarán a cabo la reacción completa de corte y empalme. Así pues, U4 actúa como un inhibidor que enmascara a U6 hasta que todos los centros específicos de empalme están perfectamente alineados. El resultado de la reacción es el corte preciso del intrón y la unión de los exones para dar lugar al ARNm maduro. El proceso requiere ATP, aunque parece que éste es necesario para el ensamblaje del espliceosoma pero no para las reacciones de corte y empalme del ARN. En este proceso, las moléculas de snARN juegan un papel clave en el alineamiento de los centros de empalme y en la catálisis. Por otra parte, la escisión de cada intrón comporta el ensamblaje y desensamblaje de un espliceosoma. En eucariotas, los transcritos primarios pueden tener señales moleculares para dos o más rutas alternativas de maduración, de modo que se pueden producir uno o más mARN según la ruta escogida. La maduración diferencial del ARN da lugar a múltiples productos a partir de un gen: Una única secuencia de ADN puede dar lugar a diferentes proteínas debido a cortes y empalmes alternativos en el transcrito primario. La regulación del proceso de splicing puede generar diferentes versiones de una proteína en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de la célula.

ARN de transferencia (ARNt) El ARNt transporta los residuos de aminoácidos para ser adicionados a las cadenas polipeptídicas crecientes durante la síntesis de proteínas. El ARNt reconoce las secuencias de tres bases que codifican para un aminoácido (codones) en el ARNm transfiriendo el aminoácido correcto a la cadena polipeptídica en formación. Desde el punto de vista estructural, las moléculas de ARNt presentan dos centros activos: la secuencia CCA en el extremo 3´, a la cual se une enzimáticamente el aminoácido específico y una secuencia de tres bases (anticodón) que se aparea específicamente con el codón correspondiente en el ARNm. Cada ARNt puede transferir un solo tipo de aminoácido.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

A pesar de las diferencias en sus estructuras primarias, todas las moléculas de ARNt tienen una estructura secundaria común con apariencia de hoja de trébol, que se divide en varios lazos y brazos (Fig. 3.2). El triplete del anticodón se encuentra en una de las «hojas del trébol», mientras que la secuencia aceptora del aminoácido, CCA, se encuentra en el «tallo». Las moléculas de ARNt se pliegan sobre sí mismas dando lugar a una estructura terciaria en forma de L, como consecuencia de apareamientos de Watson y Crick entre bases y de otras interacciones débiles. Aunque las estructuras de todos los ARNt son muy similares, presentan diferencias estructurales sutiles que permiten que cada ARNt sea reconocido por una aminoacil ARNt sintetasa específica que cataliza la unión de un determinado aminoácido a su extremo 3´.

Procesamiento del ARNt Los precursores del ARNt se modifican por corte, adición y modificación de bases. Los ARNt proceden de precursores más largos por eliminación enzimática de nucleótidos en los extremos 5´ y 3´. En algunos casos, los transcritos primarios de ARNt tienen también intrones en la región del anticodón que deben ser eliminados. En primer lugar, el transcrito primario es recortado de forma inespecífica para dar lugar a un precursor con extensiones en los extremos 3´ y 5´ relativamente cortas. A continuación una endonucleasa llamada ribonucleasa P (ARNasa P), que es una ribozima, elimina los nucleótidos extra del extremo 5´ mediante un corte endonucleolítico y los del extremo 3´ son eliminados por una o más nucleasas entre las que se encuentra una exonucleasa, llamada ARNasa D. Tras la eliminación de la extensión 3´, se realiza la síntesis del extremo CCA, catalizada por la ARNt nucleotidil transferasa, que utiliza como sustratos ATP y CTP. Los intrones se eliminan 5’

3’

ARNasa P

A 3’ C C

ARNasa D ATP CTP

A 3’ C C

Nucleotidiltransferasa

Brazo aceptor

5’

5’ Endonucleasa Ligasa

ATG

Intrón

Transcrito primario

Figura 3.2.

Estructura y procesamiento del ARNt.

Bucle del anticodón

tARN maduro

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

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por un sistema enzimático de dos componentes, uno es una endonucleasa que elimina el intrón y el otro una ligasa, resella la cadena nucleotídica. Los nucleótidos de los ARNt son los que se encuentran más modificados de todos los ácidos nucleicos. En todos los ARNt se encuentran bases poco frecuentes que se forman por modificación enzimática de los nucleótidos normales. La mayoría de las modificaciones consisten en metilación, desaminación o reducción y se llevan a cabo por enzimas que son específicas para un determinado sitio o para una secuencia de nucleótidos, pero no para una determinada molécula de ARNt. Todas las modificaciones se producen postranscripcionalmente y la mayor parte se completan antes de que los precursores sean procesados a ARNt maduros.

ARN ribosómico (ARNr) La síntesis de proteínas tiene lugar en los ribosomas, que son complejos supramoleculares formados por proteínas y ARN. Los ribosomas de procariotas, con un coeficiente de sedimentación de 70S, están formados por dos subunidades de tamaño diferente (Fig. 3.3). La subunidad mayor (50S), contiene una molécula de ARNr 5S, una de 23S y 34 proteínas. La subunidad menor (30S), está formada por una molécula de ARNr de 16S y 21 proteínas. Las proteínas se designan L1 a L34 las de la subunidad mayor y S1 a S21 las de la subunidad menor. Los ribosomas en eucariotas (80S) son mayores y más complejos que los de procariotas. También constan de dos subunidades cuyo tamaño varía según las especies, pero que por término medio tienen un coeficiente de sedimentación de 60S y 40S respectivamente. La subunidad pequeña tiene un ARNr 18S y la grande una molécula de cada uno de los ARNr de 5S, 5,8S y 28S. En conjunto, los ribosomas eucarióticos contienen más de 80 proteínas diferentes, con excepción de los de las mitocondrias y los cloroplastos que son más sencillos. Tanto en procariotas como en eucariotas las dos subunidades tienen forma irregular y se encajan de manera que entre ellas queda una hendidura, a través de la cual pasa el ARNm a medida que el ribosoma se desplaza a lo largo de dicho ARNm durante la traducción y de la que emerge la cadena polipeptídica recién sintetizada. Los ARNr constituyen el 80 % del ARN celular total y son metabólicamente estables. Esta estabilidad, necesaria para el funcionamiento repetido del ribosoma, se ve aumentada por su estrecha asociación con las proteínas ribosómicas.

Procesamiento del ARNr El procesamiento del ARNr tiene lugar en el nucleolo e incluye rotura del precursor para obtener el tamaño funcional, emparejamiento interno de bases, modificación de determinados nucleótidos y asociación con proteínas ribosómicas para dar una conformación terciaria estable.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Ribosoma procariótico

Ribosoma eucariótico

70S

80S

50S 60S

ARNr 5S ARNr 23S 34 proteínas

30S

ARNr 16S 21 proteínas

Figura 3.3.

ARNr 5S ARNr 28S ARNr 5,8S 49 proteínas 40S

ARNr 18S 33 proteínas

Estructura de los ribosomas.

Tanto en bacterias como en eucariotas, los ARNr se forman a partir de precursores más largos llamados ARNs prerribosómicos, que incluyen también secuencias de entre una y cuatro moléculas de ARNt. En bacterias, los ARNr de 16S, 23S y 5S surgen de un único precursor de 30S. Durante la síntesis del precursor se aparean bases de regiones distantes de la molécula, de manera que los fragmentos de 16S, 23S y 5S del ARNr aparecen formando parte de grandes lazos. EL corte en regiones de doble hebra del precursor por la ARNasa III, produce precursores más pequeños, cada uno de los cuales contiene una única molécula de ARNr de 16S y 23S y es probable que ocurra igual con el ARNr 5S. Los precursores individuales son aún demasiado grandes y deben experimentar un procesamiento posterior en ambos extremos 5´ y 3´. Este procesamiento depende de proteínas ribosómicas concretas que empiezan a ensamblarse en los ARNrs precursores mientras la transcipción continúa aún realizándose. En eucariotas, el producto inicial de la transcripción es un ARN prerribosómico de 45S que contiene las secuencias de los ARNrs de 28S,18S y 5,8S. El ARNr 5S

ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN

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de la mayoría de los eucariotas se forma como un transcrito separado. Al igual que en el ARNm, la maduración de precursores de ARNr se lleva a cabo mediante grandes complejos multiméricos de ARN y proteínas. Para la maduración son imprescindibles al menos tres tipos de ARN en forma de complejos pequeños de ribonucleoproteína nucleolar (snoRNP). Una serie de cortes enzimáticos libera los ARNr 18S, 28S y 5,8S, mientras que el ARNr 5S aparece de forma separada.

Transporte del ARN En eucariotas, todos los ARNs sintetizados en el núcleo deben ser exportados al citoplasma para que puedan intervenir en la síntesis de proteínas. El transporte tiene lugar a través de los poros de la membrana nuclear y constituye otro de los niveles de regulación de la expresión génica. En el caso del ARNm, las moléculas maduras son probablemente reconocidas por proteínas receptoras en el poro nuclear y transportadas activamente al citoplasma. En el transporte participan proteínas que forman complejos con el ARNm (RNPms) y que contienen una señal de exportación del núcleo que estimula su transporte activo. Un complejo nuclear se asocia con el casquete 5´ de la molécula de ARNm y conduce al ARNm al citoplasma. Mediante un mecanismo no bien conocido, en el citoplasma las proteínas se separan del ARNm y son reemplazadas por proteínas citosólicas. Las proteínas nucleares son transportadas de nuevo al núcleo por un mecanismo análogo al de salida. Otros ARNs, como ARNt y ARNr, que carecen del casquete 5´, deben asociarse también con proteínas y ser transportados al citoplasma como parte de estos complejos. La señal de exportación se encuentra probablemente en estas proteínas y se activa después de la unión con las moléculas de ARN, pero se desconoce hasta el momento la naturaleza de estas señales.

Degradación del ARN La degradación del ARNm es un punto importante de regulación de la expresión génica. Los procesos de degradación aseguran que las moléculas de ARNm no se acumulen en la célula y se produzca la síntesis de proteínas no necesarias. Las tasas de degradación varían, así cuando el producto de un gen se necesita solo puntualmente, la vida media de su ARNm puede ser sólo de minutos o incluso segundos. Los productos de genes que se necesitan de forma constante, tienen ARNms estables durante generaciones. En bacterias, la vida media de las moléculas de ARNm es de 1-2 minutos, lo que les permite adaptarse rápidamente a los cambios ambientales. La degradación del ARNm en bacterias se lleva a cabo en un primer paso por endonucleasas que reconocen secuencias diana para el ataque endonucleolítico como consecuencia del cual se liberan fragmentos que son degradados a continuación hasta nucleótidos por acción de exonucleasas que generalmente actúan en

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

dirección 5´ A 3´. Dado que la traducción también se realiza en la dirección 5´ A 3´, se asegura que el ARNm no se degradará antes de haber sido traducido. Entre las enzimas que intervienen en el proceso de degradación del ARNm se encuentran la ribonucleasa E, la polinucleótido fosforilasa (PNPasa) y una helicasa. La estabilidad del ARNm en eucariotas está regulada por la presencia o ausencia de elementos desestabilizantes, tales como la secuencia repetida AUUUA, que promueve la desadenilación y degradación consecutiva del ARNm.

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4 Mecanismo de la transcripción: regulación de la iniciación A. Santos

Introducción La transcripción se define como el proceso de síntesis de ARN dirigido por una molécula de ADN. En la inmensa mayoría de los seres vivos la información genética esta codificada en moléculas de ADN de doble cadena, siendo el proceso de transcripción el primer paso en la lectura de dicha información, es decir, el primer paso en la expresión génica. Es un proceso fuertemente regulado, particularmente a nivel de la etapa de iniciación, constituyendo por tanto, un punto esencial de la regulación de la expresión génica. La regulación de la expresión génica es la clave de procesos como la diferenciación y el desarrollo. Los organismos multicelulares complejos, entre los que se incluye el ser humano, están formados por miles de millones de células que incluye muchos tipos celulares diferentes. Sin embargo todas ellas, con la excepción de algunas células inmunitarias, poseen la misma información genética. ¿Por qué células con la misma información genética tienen morfologías tan diferentes y son capaces de desarrollar funciones tan diversas? La respuesta es que leen partes diferentes de la información genética, siendo la transcripción el primer paso en dicha lectura. La transcripción es un proceso asimétrico, ya que en cada gen únicamente se copia una de las dos cadenas de ADN, la denominada hebra codificadora. Lo llevan a cabo los enzimas ARN polimerasas-ADN dependientes o simplemente ARN polimerasas. Se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación. En la iniciación se selecciona la secuencia de ADN donde se va a empezar la transcripción y se sintetizan los primeros enlaces fosfodiéster entre nucleótidos, originándose una pequeña cadena de ARN complementario de la cadena de ADN que le sirve de molde o templete (hebra templete, sin sentido o hebra –) y que tiene la misma secuencia de bases, pero en nucleótidos de ribosa, que la otra hebra (hebra codificadora, con sentido o hebra +). En este capítulo nos vamos a centrar en la iniciación

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

de la transcripción, y estudiaremos su regulación mediante ejemplos en organismos procariotas y eucariotas que nos permitan comprender los aspectos más básicos de este proceso.

ARN polimerasas Son las enzimas (1,2) que catalizan la reacción de polimerización de ribonucleótidos trifosfato utilizando como molde una molécula de ADN: (ARN)n + NTP = (ARN)n+1 + PPi. Requieren para llevar a cabo su función: un molde, una molécula de ADN de doble cadena normalmente, ribonucleótidos 5’-trifosfato (ATP, GTP, CTP y UTP) y Mg++. Siempre sintetizan el ARN en la dirección 5’-3’ y por tanto, leen la hebra molde en la dirección 3’-5’. Seleccionan el nucleótido adecuado, de entre los cuatro posibles, por complementaridad de bases con el correspondiente nucleótido de la molécula molde. Procariotas Como ejemplo utilizaremos la eubacteria Escherichia coli. Este microorganismo tiene una única ARN polimerasa que interviene en la transcripción, además tiene otras ARN polimerasas implicadas en otros procesos, como por ejemplo la replicación. Dicha enzima está formado por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes, y que se denominan _, `, `’ y m, en una estequiometría de dos subunidades _ y una de cada una de las otras tres. El complejo 2_``’m se denomina holoenzima y es competente para llevar a cabo correctamente y de forma eficiente todas las etapas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. Tras la iniciación y para poder abandonar el sitio de iniciación en la molécula de ADN, «promotor», el holoenzima pierde su subunidad _, siendo la enzima 2_``’, enzima núcleo, la que realmente lleva a cabo el trabajo de síntesis del ARN. La velocidad de síntesis de la enzima núcleo es de aproximadamente 40 nucleótidos por segundo a 37° C. La función de la subunidad m es permitir a la enzima encontrar el sitio en la molécula de ADN donde ha de empezar la transcripción, tarea que es incapaz de conseguir la enzima núcleo por sí sola. Las subunidades ` y `’ forman el centro activo de la enzima y _ es necesaria para ensamblar todo el complejo. La holoenzima tiene un tamaño de 465 kDa y un canal de 2,5 nm de anchura y 5,5 nm de longitud donde se aloja una parte del ADN que se asocia con la enzima y donde reside el centro activo. La enzima en realidad protege 75-80 pares de bases (pb) indicando que el ADN se dobla al estar unido a la holoenzima ya que por su longitud, 16 nm, sólo podría proteger 45-50 bp de ADN estirado. Inicialmente la enzima se une a la doble hebra de ADN en conformación nativa formando un «complejo cerrado», posteriormente la enzima separa ambas hebras del ADN en el punto de iniciación formando lo que se

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

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denomina un «complejo abierto», paso que es crítico para el inicio de la transcripción. La separación de las dos hebras de ADN para constituir la denominada burbuja de transcripción, se produce en el canal de la enzima que hemos descrito y se pone de manifiesto por la acción de agentes químicos que son capaces de alterar las bases del ADN, pero únicamente cuando ambas hebras están separadas. En función del agente químico utilizado se estima que la región separada, burbuja de transcripción, fluctúa entre 10 y 20 pb. En los organismos procarióticos también se pueden encontrar formas de ARN polimerasas más simples, formadas por una sola cadena polipeptídica, que son muy eficientes pero muy limitadas en cuanto carecen de flexibilidad o posibilidades de regulación y actúan sobre un número de promotores muy limitados. Tal es el caso de las ARN polimerasas virales, algunas de las cuales son de gran utilidad en el laboratorio.

Eucariotas En las células animales hay 3 ARN polimerasas diferentes en el núcleo y una en la mitocondria. La ARN polimerasa mitocondrial es una enzima simple de una sola cadena polipeptídica y las nucleares son multiméricas. Las nucleares se denominan ARN polimerasa I, que es la encargada de transcribir los genes que codifican para el ARN ribosómico (ARNr) y se concentra por tanto en el nucleolo. La ARN polimerasa II, que transcribe la inmensa mayoría de los genes incluidos todos aquellos que codifican una proteína y algunos que codifican para ARN de pequeño tamaño. Finalmente la ARN polimerasa III, que transcribe el ARNr 5S, los ARN de transferencia y los restantes ARN de tamaño pequeño. A partir de este momento, siempre que hablemos de transcripción en eucariotas nos referiremos a la transcripción realizada por la ARN polimerasa II. La ARN polimerasa II esta formada por al menos 10 cadenas polipeptídicas diferentes. Las dos cadenas polipeptídicas de mayor tamaño se denominan RPB1 y RPB2 y tienen homología respectivamente con las subunidades `’ y ` de la enzima procariota. La subunidad RPB1 se caracteriza por tener un dominio carboxilo terminal (CTD) muy especial, que está formado por repeticiones del siguiente heptapéptido rico en el aminoácido serina: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. El número de repeticiones es de 52 en los mamíferos y este CTD es esencial ya que células cuyo gen rpb1 carece de este dominio no son viables. RPB3 tiene homología con la subunidad _ de procariotas y RPB5, 6 y 8 son subunidades comunes a las tres polimerasas nucleares. A pesar de su mayor complejidad, la ARN polimerasa eucariótica no es capaz de encontrar el promotor e iniciar la transcripción con una mínima eficiencia, es decir, no es el equivalente a la holoenzima de los procariotas. A pesar de las similitudes, las ARN polimerasas de eucariotas y procariotas son diferentes, permitiendo que drogas que bloquean la función de la enzima procariota no sean capaces de inhibir el enzima eucariota. Algunas de estas sustancias se utilizan consecuentemente como antibióticos para combatir ciertas infecciones.

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Ejemplo de ello son las rifamicinas naturales y sus derivados sintéticos las rifampicinas.

Iniciación: Promotores Una vez formado el complejo abierto, se produce la formación de los primeros enlaces fosfodiéster, siendo seleccionados los nucleótidos que participan en función de su complementaridad con las bases de la hebra templete. Los enlaces fosfodiéster se forma por un ataque nucleofílico del OH 3’ del nucleótido anterior al fosfato _ del siguiente nucleótido 5’-trifosfato. Una vez que se ha sintetizado un fragmento de ARN de aproximadamente 17 nucleótidos en procariotas y de 30-40 nucleótidos en los eucariotas termina la iniciación y comienza la elongación que lleva implícita algunos cambios en la enzima. Estos cambios como hemos comentado consisten en la pérdida de la Subunidad m en los procariotas y cambios más complejos en los eucariotas. El ARN sintetizado permanece unido a la ARN polimerasa y al ADN, formando una hélice ARN-ADN de aproximadamente 7 pb con la hebra molde.

Promotor Procariotas El promotor es aquella región o secuencia del ADN en la que se asienta la ARN polimerasa y se inicia la transcripción. En la eubacteria E. coli, el promotor es una región pequeña del ADN, de aproximadamente 45 nucleótidos. Dado que el genoma de E. coli contiene aproximadamente 2.000 promotores, esto supone que el ADN que hace de promotor es únicamente un 0,02 % del ADN del cromosoma de esta bacteria. Esta pequeña fracción del ADN es la que la ARN polimerasa debe encontrar con eficacia y precisión rastreando todo el genoma de la bacteria. En el caso de las células eucariotas la tarea de encontrar el promotor es mucho más compleja. La estructura del promotor (nos referimos siempre a la secuencia de la hebra codificadora) reconocido por la holoenzima que porta la subunidad m70 estándar es la siguiente: La posición correspondiente al nucleótido +1 es siempre una purina (A o G) y por tanto será una A o una G el primer nucleótido en el ARN. Entre los 45 nucleótidos del promotor hay dos secuencias cortas conservadas, que contienen los nucleótidos con los que contacta la ARN polimerasa y son necesarios por tanto para que esta enzima reconozca dicho punto como el sitio donde ha de iniciarse la transcripción. Son la caja Pribnow y la secuencia -35. La caja Pribnow está en la posición -10 (recordemos que la numeración es negativa en la dirección 5’ y positiva en la dirección 3’ a partir del primer nucleótido transcrito) y es una secuencia muy rica en pares de bases A/T. La secuencia consenso en la posición -35 es TTGACAT (Fig. 4.1).

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

45

PROMOTOR PROCARIOTA (E. Coli m70) –35

TTGACAT Conservación (%)

17±1

–10

+1

TATAAT

CA/GT

84 82 79 64 53 45 41

79 95 44 59 51 96

Secuencia –35

Caja Pribnow

5/8

55 51/42 48

PROMOTOR EUCARIOTA (RNA polimerasa II) CTF –200 CBF…

ccatt

Sp1 …

gggcgg

–25

+1

TATAAAA

Pyr2 CA Pyr5

82 97 93 85 63 83 58

Conservación (%) Inr

Caja TATA

ESTIMULADOR PROMOTOR PROXIMAL

Figura 4.1.

–40

+40

PROMOTOR NÚCLEO

Esquema de la región promotora en organismos eucariotas y procariotas.

Un promotor determinado es tanto más eficiente cuanto más se ajusta a esta secuencia consenso, sería lo que denominamos un promotor fuerte y puede iniciar la transcripción con una frecuencia de una vez cada 1-2 segundos. Por el contrario los promotores débiles, presentan numerosas variaciones con respecto a la secuencia consenso e inician la transcripción con una frecuencia tan baja como una vez cada 10 minutos (recordemos que el ciclo vital de E. coli es de 20 minutos). De esta forma tan sencilla se logra que unos genes, de los que se requiere mayor concentración de proteína, se expresen más que otros de los que se requiere menor concentración de proteína. Eucariotas El concepto de promotor en los eucariotas es más complejo (Fig. 4.1), y sus elementos están peor definidos (3). Nosotros consideraremos las siguientes partes: 1. El promotor núcleo que incluye el sitio de iniciación de la transcripción y la región del ADN donde se une la ARN polimerasa. Comprende una región que va de aproximadamente de la posición -40 a +40, que es aproximadamente la región del ADN protegida por la unión de la polimerasa. 2. Región proximal hasta -200 aproximadamente. 3. Estimuladores o potenciadores (enhancers) (4). Además de estos elementos hay regiones silenciadoras (silencers) (5) que bloquean la transcripción y elementos frontera o aislantes (boundary) (6) que básicamente delimitan la región del ADN sobre el que pueden actuar los demás elementos ennumerados. Estos elementos están peor definidos y el número de ejemplos de los mismos es muy limitado por lo que no hablaremos de ellos.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

1. El promotor núcleo es el elemento mínimo para que se pueda iniciar la transcripción con precisión in vitro. La ARN polimerasa eucariota a diferencia de la procariota no es capaz de iniciar la transcripción ella sola y requiere la participación de otras proteínas que en su conjunto reciben el nombre de factores generales de la transcripción ya que son necesarios para la iniciación en la inmensa mayoría de los genes. Con el concurso de estos factores, la ARN polimerasa ya es capaz de iniciar con precisión y eficiencia in vitro. En el caso de la ARN polimerasa II, elementos característicos de este promotor núcleo son: la caja TATA que está en posición -25; el elemento de reconocimiento del factor general de transcripción TFII-B (BRE); el iniciador (Inr) que es una secuencia rica en pirimidinas; y el elemento 3’ del promotor o DPE (Downstream Promoter Element). En combinaciones apropiadas dichos elementos dirigen la transcripción, aunque sólo pueden dar cuenta de un nivel mínimo in vivo, requiriéndose por lo menos el promotor proximal para observarse actividad promotora. Muchos autores consideran que en eucariotas lo que debiéramos denominar promotor sería la suma del promotor núcleo y el promotor proximal. El promotor mejor conocido es aquel que posee una caja TATA o caja GoldbergHogness e iniciador y es el que vamos a utilizar como modelo de iniciación en eucariotas (7,8) (Fig. 4.2). La secuencia consenso de la caja TATA es 5’-TATAAA-3’ y se sitúa a 25-30 nucleótidos del sitio de iniciación (Fig. 4.1). El primer paso de la iniciación sería el reconocimiento de esta secuencia por el factor de transcripción general de la ARN polimerasa II, el TFII-D (Fig. 4.2). Este factor es un multímero formado por la proteína TBP (TATA Binding Protein) y las proteínas TAFs (TBP TFII-D TFII-B TFII-A

TATA Inr

Complejo de PREINICIACIÓN F

B

D

ARN pol II

A TATA

CTD Inr

ARN pol II E H D

B

D

II

F

B

II

A

A TATA

TATA

Elongación Inr P P P

Inr

C

TD

CTD

P

P

P ARN 30-50

nucleótidos D

F

B

A

E H

TATA

II

TF II E TF II H

C

TD

P Inr P P P

P

P

Complejo de INICIACIÓN

Figura 4.2.

Mecanismo de acción de los factores generales en el inicio de la transcripción.

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

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Associated Factors). La TBP reconoce la secuencia de la caja TATA y se une a ella orquestando todo el proceso de iniciación. Al complejo caja TATA-TFII-D se unen consecutivamente los factores TFII-A y TFII-B formando el complejo de preiniciación. TFII-A estabiliza la unión de TFII-D al ADN y es necesario particularmente in vivo donde hay numerosos elementos que se opondrían a la unión de TFII-D a TATA. El factor TFII-B también estabiliza este complejo de preiniciación, pero sobre todo sirve de puente para unir la ARN polimerasa a dicho complejo. A continuación, se une la ARN polimerasa que lleva asociado el factor TFII-F, que actúa de puente entre la polimerasa y los factores TFIID y TFIIB unidos a la caja TATA. El factor TFII-F es un dímero formado por las cadenas polipeptídica RAP30 y RAP74 (RNA polymerase Associated Protein) que son capaces de asociarse a la ARN polimerasa y a los factores TFII-D y TFII-B, labor realizada fundamentalmente por RAP30. RAP74 induce un cambio conformacional que favorece los contactos entre la RNA polimerasa y el ADN. Finalmente se unen TFII-E y TFII-H completándose la formación del complejo de iniciación. TFII-H es un complejo multimérico que tiene actividad helicasa y quinasa. Específicamente fosforila, en el complejo de iniciación, el dominio CTD de la subunidad mayor de la ARN polimerasa, paso que es imprescindible para que la enzima una vez iniciada la transcripción pueda abandonar el promotor y elongar. Este factor, junto con los otros unidos a la polimerasa, se separa de la misma una vez sintetizados los primeros 30-50 nucleótidos de ARN. Una vez terminada la iniciación la ARN polimerasa se libera del complejo de preiniciación (Fig. 4.2) y es capaz de llevar a cabo la elongación. El complejo de preiniciación podría quedar unido al ADN y reiniciar la transcripción. 2. La información presente en el promotor núcleo, a diferencia de lo que ocurre in vitro, es muy poco eficaz para iniciar la transcripción in vivo. Ello se debe a que in vivo el ADN está asociado a las histonas, formando la cromatina, y el complejo de iniciación tiene que competir con ellas para unirse al ADN. En consecuencia, para que la iniciación sea eficaz se necesita el concurso de al menos la región promotora proximal. Esta secuencia de ADN tiene sitios de unión para otras proteínas que se denominan factores de transcripción específicos o simplemente factores de transcripción y son capaces de unirse a secuencias específicas del ADN y regular el inicio de la transcripción. Estos factores de transcripción tienen un dominio de unión al ADN, del que existen diversos tipos, y uno o varios dominios de transactivación, que son básicamente dominios que les permiten a estas proteínas interaccionar con otras y estimular el inicio de la transcripción. También pueden reprimir la transcripción en cuyo caso, se denominan represores. 3. Los estimuladores, son elementos originalmente definidos en el estudio del promotor del virus SV40. Son secuencias del ADN capaces de aumentar la transcripción, cuando se unen a un promotor núcleo, de forma independiente de su orientación, es decir, las podemos unir 5’-3’ o 3’-5’ con respecto al sitio de iniciación, y de su distancia, pudiéndose poner en situación 5’ o 3’ con respecto al sitio de iniciación. Son secuencias de 50 pb a 1.5 kbp que frecuentemente aparecen diseñados como para llevar a cabo una función específica, como por ejemplo, activar un gen en un determinado tipo celular o en un momento determinado del desarrollo. La

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expresión de un gen puede estar regulada por muchos estimuladores diferentes. Estos elementos, al igual que lo indicado para el promotor proximal, contienen secuencias o sitios de unión de factores de transcripción, a veces los mismos que se unen al promotor proximal, que influyen en la iniciación de la transcripción. Se sitúan a una distancia y orientación muy variable con respecto al sitio de iniciación, pero siempre distal con respecto al promotor núcleo por lo que frecuentemente se les llama elementos distales. Como ejemplo tenemos: un estimulador, importante para el gen de la cadena del receptor de células T, se sitúa a 69kb en la dirección 5’ del sitio de iniciación y en contraste el estimulador núcleo de locus de ratón de la inmunoglobulina H se localiza en el segundo intrón. Lo más usual sin embargo, es que estos elementos se sitúen en dirección 5’ a pocas kb de distancia del sitio de iniciación. Debemos recordar, que los elementos frontera impiden que el rango de acción de los estimuladores, algunos de los cuales son enormemente potentes, se extiendan más alla de los límites deseados.

Regulación de la iniciación En este apartado introduciremos algunos de los conceptos básicos de la regulación de la iniciación de la transcripción en procariotas y eucariotas (9,10) a través de algunos ejemplos bien caracterizados. Procariotas: Factores m. Operón lactosa Dada la relativa simplicidad de la ARN polimerasa procariota y la función tan claramente definida de su subunidad sigma, es obvio que una forma muy sencilla de regulación sería el disponer en el genoma de varios genes que codifiquen subunidades sigma capaces de unirse a promotores diferentes. De esta forma, se pueden poner en marcha diversos programas genéticos en función de las necesidades de la célula, ya que las distintas subunidades sigma dirigirían la polimerasa núcleo a diferentes grupos de genes. Esto es lo que ocurre en E. coli, su genoma codifica además de m70 las subunidades m32 y m54, que son la subunidad de choque térmico y de deficiencia en nitrógeno respectivamente. En condiciones normales el contenido de estas proteínas es muy bajo y no son capaces de competir con m70 por la unión a la enzima núcleo por lo que los genes que están bajo su control no se transcriben. Sin embargo, en caso de un aumento de temperatura o falta de las fuentes usuales de nitrógeno respectivamente la expresión de estos genes se induce y como consecuencia de ello, la expresión de otra serie de genes que le permitirán a la bacteria combatir eficazmente estas situaciones. El promotor de m32 es muy diferente del de m70, particularmente en lo que se refiere a la secuencia de la caja Pribnow. La secuencia -10 para m32 es CCCATNT (N es cualquiera de los cuatro nucleótidos del ADN) en claro contraste con la caja Pribnow de m70: TATAAT. El Operón lactosa esta formado por tres genes estructurales que se transcriben juntos a partir de un único promotor y que codifican para tres proteínas que le per-

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

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miten a la bacteria utilizar el disacárido lactosa como fuente de carbono. También forma parte de él el gen que codifica para el represor lac, proteína fundamental en la regulación de este operón. El represor lac es una proteína de 37kDa de tamaño que forma un tetrámero y es capaz de unirse a secuencias específicas de ADN. En el promotor de los genes estructurales hay una secuencia de 28pb a la que se une el represor lac y que se denomina operador, y que está situada entre -5 y +25. La unión del represor lac impide que la ARN polimerasa pueda iniciar la transcripción. Es necesario quitar esta proteína del operador para que los genes estructurales puedan transcribirse, y esto es lo que ocurre cuando hay lactosa en el medio de cultivo, ya que el represor lac se une a un derivado de la lactosa y pierde su afinidad por el ADN. Esto es un paso necesario para que se puedan transcribir los genes estructurales, pero no es muy eficiente, ya que el promotor de los genes estructurales se aleja del consenso y es poco activo. El aumento en la expresión de estos genes estructurales sólo por la presencia de lactosa no es por tanto muy grande. Sin embargo, cuando la presencia de lactosa se combina con una disminución o ausencia de glucosa en el medio, se produce un importante aumento de la expresión de los genes estructurales. Ello se debe a que también interviene la proteína CAP (Catabolite gene Activator Protein), que se une al ADN en una secuencia muy cercana al promotor de los genes estructurales, situada entre -71 y -53, e induce la transcripción. El funcionamiento de la proteína CAP depende de la eliminación del represor lac unido al operón y de la presencia del nucleótido cíclico adenosina 5’,3’ monofosfato cíclico, AMPc. En presencia de concentraciones de glucosa adecuadas, los niveles de AMPc son bajos en la célula, insuficientes para formar complejos CAP-AMPc y en consecuencia CAP no se une al ADN y por tanto no tienen ningún efecto sobre la transcripción. Cuando disminuye la glucosa sube la concentración de AMPc que se une a CAP y el complejo AMPc-CAP se une a su sitio de unión del ADN y favorece de forma muy eficiente la iniciación de la transcripción por el holoenzima de la ARN polimerasa estándar. Con este modelo tan sencillo definimos una parte de los elementos que intervienen en la regulación de la transcripción y que tienen sus elementos paralelos en situaciones mucho más complejas como es la regulación de la transcripción en eucariotas. Hay, por tanto, señales que son secuencias específicas en el ADN (frecuentemente denominados elementos cis), y tenemos, aparte de la maquinaria basal de la transcripción, otras proteínas que reconocen estas señales y regulan el inicio de la transcripción (elementos trans). De esta forma, es perfectamente posible que dos células con la misma información genética hagan cosas diferentes en función de la dotación de proteínas lectoras de estas señales. Tal es el caso de células E. coli cultivadas en medios de diferente composición, en nuestro caso uno con glucosa y otro sin glucosa y con lactosa. Eucariotas: Regulación de la expresión génica por hormonas tiroideas La situación es mucho más compleja en los eucariotas y particularmente en los organismos pluricelulares complejos como es el caso del ser humano. Este apartado lo limitaremos a describir el mecanismo de acción de la hormona tiroidea, que den-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

tro de las limitaciones que ello supone nos permitirá familiarizarnos con algunos conceptos muy importantes como es el papel de la cromatina en la regulación de la expresión génica. El receptor de hormona tiroidea (3,5,3’-triiodotironina, T3) es un factor de transcripción dependiente de ligando y que está codificado por dos genes en los vertebrados diploides: NR1A1 y NR1A2 según la nomenclatura de la «superfamilia de receptores nucleares» (11) a la que pertenecen estos dos genes o genes _ (T3R_) y ` (T3R`) como nomenclatura más familiar y más frecuentemente en la literatura científica. En el genoma humano T3R_ y T3R` están situados respectivamente en el cromosoma 17 y 3. A partir del gen T3R_ se originan al menos dos proteínas diferentes por corte y empalme alternativo que son la isoforma T3R_ 1 y T3R_ 2, que se diferencian en el extremo carboxilo terminal (C-t). Como consecuencia de la sustitución de los 40 aminoácidos C-t, T3R_ 2 ha perdido su capacidad de unir T3 y por tanto no actúa como un receptor de dicha hormona y su función es desconocida. Del gen T3R` se originan dos proteínas a partir de dos promotores diferentes T3R` 1 y T3R` 2, que se diferencian en la región amino terminal y unen T3 actuando ambas como receptores. T3R` 2 se expresa de forma abundante sólo en la hipófisis y las restantes isoformas se expresan de forma ubiquista. Todas estas proteínas tienen un dominio central que es el de unión al ADN (DBD, DNA Binding Domain), que es prácticamente igual para todas ellas y que se corresponde con el dominio mejor conservado en la superfamilia de los receptores nucleares. Un dominio amino terminal en el que T3R` 1 difiere de T3R` 2 y ambas isoformas de las isoformas _, no estando conservada esta región en la superfamilia. Finalmente está la región o dominio carboxilo terminal que es el más grande y complejo, en el se incluyen entre otros el dominio de unión a la hormona (LBD, Ligand Binding Domain) que se distribuye a lo largo de la mayor parte de esta región y que está relativamente conservado en la superfamilia, el dominio de dimerización y el dominio más importante de transactivación denominado AF2. A la superfamilia de los receptores nucleares también pertenecen los receptores de hormonas esteroideas, ácido retinoico, vitamina D3, el protooncogen v-erbA del virus de la eritroblastosis aviar (que es una forma mutada del receptor T3R_ 1 de pollo) y otras proteínas con o sin ligando conocido. Los miembros de la superfamilia sin ligando conocido frecuentemente se denominan «receptores huérfanos» (12), que es una denominación confusa ya que implicaría que han de tener un ligando y ser receptores. Sin embargo, muchas de ellas son factores de transcripción normales, pertenecientes a esta superfamilia por homología de secuencia, y que no actúan como receptores. Los receptores de T3 se encuentran en el núcleo, muchos de ellos unidos a las secuencias de ADN que reconocen y que se denominan TREs o T3REs (Thyroid receptors Responsive Elements) ya que no requieren de la hormona para ello. Los TREs están formados por repeticiones de la secuencia hexamérica 5’-AGGTCA-3’, siendo la forma más frecuentemente encontrada en los genes regulados por hormona tiroidea aquel que está formado por dos secuencias de este tipo separadas por cuatro nucleótidos (DR4, Direct Repeat 4). Se unen al ADN en forma de un heterodímero con otro factor de transcripción de la misma superfamilia, el RXR, que es un receptor de retinoides, aunque también es capaz de unirse al ADN como homodímero o monómero, no

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

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estando clara la importancia funcional de estos dos últimos. En ausencia de T3 el T3R unido al ADN está en una conformación que le permite unirse a una serie de proteínas denominadas correpresores (13), que son capaces de unirse a otras proteínas para formar un complejo cuya función va a ser compactar la cromatina en el área donde están concentrados y hacerla más inaccesible a la maquinaria basal de la transcripción, complejo represor (Fig. 4.3). Tras la unión de T3, la conformación del receptor cambia de forma que se expone el dominio de transactivación AF2, que se corresponden con los últimos aminoácidos de la proteína y que forman parte de una hélice _ y se esconde el dominio de unión a los correpresores. Como consecuencia de ello, el receptor pierde su capacidad de unión a los correpresores y se une a otras proteínas que se denominan coactivadores (14), que a su vez interaccionan con otras proteínas formando un complejo, complejo activador, que es capaz de modificar la cromatina originando una forma de la misma más abierta y accesible a la maquinaria basal de la transcripción (Fig. 4.3). Finalmente el receptor unido al ADN y al ligando es también capaz de unirse a otros grandes complejos multiméricos de unas 16 cadenas polipeptídicas y que reciben nombres como TRAP (Thyroid hormone receptor Associated Proteins), DRIP (vitamine D Receptor Interacting Proteins), o ARC (Activator-Recruited Cofactor) cuya composición y actividad está peor caracterizada, pero parece que actuaría básicamente como moléculas puentes entre T3R y la maquinaria basal de la transcripción, ya que interaccionan con el complejo de preiniciación, facilitando el acceso de la ARN polimerasa II al promotor núcleo. En resumen, el mecanismo de acción del receptor de hormona tiroidea se ajustaría a un modelo de dos pasos propuestos por Roeder et al. (15) en el que tras la unión de la hormona al receptor, éste se disociaría del complejo represor y se asociaría con un complejo activador a través de proteínas coactivadoras o con los complejos puente. En la (Fig. 4.3) hemos esquematizado este modelo y debemos añadir que la acción de los dos tipos de complejos, el que denominamos activador y los complejos puente (TRAP/DRIP/) podrían actuar de una forma secuencial, combinatoria, o paralela. Una idea importante, es que el receptor sin ligando no es una proteína inactiva, como ocurre con muchos receptores de hormonas esteroideas, sino que tienen una actividad represora y tras la unión de la hormona cambia hacia una actividad fundamentalmente activadora de la transcripción. En la formación del complejo represor juegan un papel destacado los correpresores, de los que se conocen y han clonado varios, entre ellos N-CoR (Nuclear Receptor Corepressor) y SMRT (Silencing Mediator of Retinoic acid and Thyroid hormone receptors). Estas dos proteínas son proteínas grandes y modulares, es decir, que poseen diversos dominios. La actividad de estos dominios es la de reconocer otras proteínas y unirse a ellas. Tienen dos dominios carboxi-terminal que reconocen a los receptores nucleares y al menos dos dominios amino-terminal que se denominan dominios de represión y que les permiten reclutar otras proteínas como Sin 3, histonas deacetilasas y otras ensamblando finalmente un complejo represor. Los dominios de interacción con los receptores nucleares reconocen en el T3R la región Visagra (hinge o dominio D) que está expuesta cuando el receptor no está unido a la hormona. El nombre de dominio Visagra es debido a que inicialmente

Figura 4.3.

TRE

RXR TR

Complejo represor HD

TATA

TRANSCRIPCIÓN

Desacetilación CROMATINA histonas COMPACTA

T3

Complejo activador HAT

Complejo represor HD

TRE

RXR TR

TRE

A

TRAP/ DRIP/ ARC

RXR TR

D

B

TATA

F

II

TRANSCRIPCIÓN

TRANSCRIPCIÓN

Acetilación CROMATINA histonas ABIERTA

TATA

Complejo activador HD

52 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Esquema del mecanismo de regulación de la transcripción por hormona tiroidea.

MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE…

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esta región del T3R era simplemente una región flexible que unía los dominios de unión al ADN y de unión al Ligando. El número de coactivadores conocidos y clonados es mayor y entre ellos están: SRC-1/NcoA-1 (Steroid Receptor Coactivator-1/Nuclear receptor Coactivator-1), TFI-2/GRIP-1/NcoA2 (Transcriptional Intermediary Factor-2/Glucocorticoid Receptor Interactin Protein-1/Nuclear receptor Coactivator-2) y pCIP/ACTR/AIB1(p300/CBP co-Intergator-Protein/Activator of the Thyroid and Retinoic acid receptors/Amplified in Breast Cancer). Son también proteínas modulares, que reconocen el dominio de transactivación AF-2 en el complejo T3-T3R a través de unas secuencias cortas situadas en la región central de dichas proteínas y que se denominan cajas NR y cuya secuencia es Leu-XX-Leu-Leu (X es cualquiera de los 20 aminoácidos). A su vez poseen otros dominios denominados de activación que reconocen proteínas como la CBP y p300 que además de poseer actividad acetilasa de histona (HAT) tienen dominios de unión a otras proteínas como p/CAF (p300/CBP Associated Factor) que también poseen HAT y son capaces de interaccionar con la maquinaria basal de la transcripción. Finalmente la complejidad y el número tan grande de cadenas polipeptídica que participan en la regulación de la iniciación de la transcripción en los eucariortas, y que a primera vista podría antojársenos excesiva, constituye probablemente la manera de lograr que la transcripción funcione en estos organismos con la flexibilidad, gradación y capacidad de integración necesarias para lograr el grado de ajuste entre sus células en organismos multicelulares complejos.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

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5 Síntesis de proteínas: Traducción y transporte E. Álvarez García

Introducción Las proteínas son los productos finales de la mayoría de las rutas de transmisión de la información genética. Las células las sintetizan en función de los requerimientos fisiológicos y posteriormente se transportan al lugar donde van a desempeñar su función. La síntesis de proteínas es el mecanismo biosintético más complejo. En este proceso la información codificada en un ARN mensajero (ARNm) se traduce mediante la maquinaria de síntesis de proteínas de las células que incluye los ribosomas —complejos de ARN y proteínas—, las enzimas necesarias para activar los aminoácidos precursores uniéndolos a los ARN de transferencia (ARNt) y factores proteicos específicos que participan en las distintas fases de este proceso: inicio, elongación y terminación. Esta ruta biosintética es muy importante para las células, en ella se consume hasta el 90 % de la energía química utilizada en procesos biosintéticos. A pesar de su complejidad las proteínas se sintetizan a gran velocidad. Una célula de E. coli a 37° C puede sintetizar una cadena polipeptídica completa de 100 residuos en cinco segundos.

El código genético Durante el proceso de síntesis de proteínas, la maquinaria que lleva a cabo la traducción se desplaza a lo largo de una molécula de ARNm en dirección 5’ A 3’ y lee la secuencia de nucleótidos de tres en tres. Cada triplete de nucleótidos (codón) en la molécula de ARNm específica para un aminoácido y durante la síntesis de proteínas un codón se aparea con la secuencia del extremo anticodón de una molécula de ARNt unida covalentemente a un aminoácido, de esta forma el codón determina qué aminoácido será añadido a la cadena polipeptídica en crecimiento.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

El ARN contiene cuatro nucleótidos diferentes que permiten 4 × 4 × 4 = 64 posibles tripletes del ARNm para codificar los 20 aminoácidos. Tres de estos 64 tripletes (UAA, UAG y UGA) no codifican ningún aminoácido sino que se utilizan como señales que especifican la terminación de la síntesis proteica y se denominan como señales de terminación. Los 61 codones restantes especifican para los 20 aminoácidos que forman parte de las cadenas polipeptídicas. La mayoría de los aminoácidos están determinados por más de un codón, por esta razón se dice que el código genético está degenerado. La degeneración del código genético indica que tiene que existir mas de un ARNt para transportar cada aminoácido o que la secuencia del anticodón de una molécula de ARNt puede reconocer más de un codón del ARNm. Ambas opciones son ciertas, algunos aminoácidos pueden ser transportados por diferentes moléculas de ARNt y los anticodones de muchas moléculas de ARNt pueden reconocer más de un codón. El apareamiento descrito por Watson y Crick tiene lugar sólo en las dos primeras posiciones de un codón y existe una mayor libertad de apareamiento en la tercera posición, esta libertad en el emparejamiento de la 3.a base del codón se conoce como «balanceo». Algunas bases del anticodón están modificadas. La presencia del nucleótido inosina (I), cuya base hipoxantina procede de la desaminación de adenina, permite también apareamientos alternativos en la tercera posición de un codón. Por ello, los apareamientos posibles entre la primera base del anticodón y la 3.a del codón son los siguientes: primera base del anticodón C A U G I

tercera base del codón G U AoG UoC U, C, o A

Así, el anticodón del ARNt para la alanina cuya secuencia es 5’-IGC-3’ reconoce tres codones GCU, GCC y GCA. anticodón 3’—CGI—5’ ARNm 5’—GCU—3’

anticodón 3’—CGI—5’ ARNm 5’—GCC—3’

anticodón 3’—CGI—5’ ARNm 5’—GCA—3’

Sin embargo, los codones UUA y CUA que codifican leucina son leídos por diferentes ARNts. De este modo, en general, los codones alternativos para un mismo aminoácido difieren sólo en la tercera base (GCA, GCC, GCG y GCU especifican alanina, GGA, GGC, GGG y GGU especifican glicina). Sólo dos aminoácidos están determinados por un solo codón: metionina (AUG) y triptófano (UGG). El codón AUG funciona también como señal de iniciación para la síntesis proteica además de codificar metionina en posiciones internas de la cadena polipeptídica.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

57

Activación de los aminoácidos Uno de los requisitos previos a la incorporación de un aminoácido a una cadena polipeptídica es su activación. Este proceso tiene lugar tras la unión de cada uno de los 20 aminoácidos a su ARNt específico para formar el aminoacil-ARNt (aa-ARNt). Las moléculas de ARNt cuya estructura tridimensional tiene forma de L, unen por uno de sus extremos el aminoácido específico y en el otro extremo, que contiene los tres nucleótidos del anticodón, reconoce y se aparea con un codón de la molécula de ARNm. La formación de estos complejos tiene dos funciones. Una de ellas es unir el aminoácido con el ARNt que posee el anticodón complementario al codón del ARNm que especifica para este aminoácido y que permite que durante la síntesis de proteínas, las secuencias de nucleótidos se conviertan en la secuencia de aminoácidos de una proteína. Otra de las funciones de estos complejos es la activación del extremo carboxílico del aminoácido, es decir, la formación de un enlace rico en energía que permita la formación de un enlace peptídico al reaccionar con el grupo amino del aminoácido situado a continuación en la cadena que se está sintetizando. El acoplamiento entre los aminoácidos y ARNts está catalizado por enzimas específicas denominadas aminoacil-ARNt sintetasas, cada una de las cuales reconoce un aminoácido concreto y su ARNt adecuado. Esta reacción tiene lugar en dos etapas y la energía para la activación proviene de la hidrólisis de ATP. En la primera etapa se forma un aminoacil-adenilato, que en el ejemplo elegido sería la activación de glicina: +

H3N–CH2–COO– + ATP A +H3N–CH2–CO–AMP + PPi

En la segunda etapa el aminoácido se transfiere al extremo 3’ de una molécula de tARN. +

H3N–CH2–CO–AMP + ARNt A +H3N–CH2–CO–ARNt + AMP

Las aminoacil-ARNt sintetasas, altamente específicas, son capaces de discriminar entre las distintas cadenas laterales de los aminoácidos y entre varias moléculas de ARNt.

Etapas de la síntesis de proteínas Todos los demás acontecimientos de la síntesis de proteínas están catalizados en los ribosomas y se pueden diferenciar tres etapas: iniciación, elongación y terminación de la cadena, de acuerdo con lo representado esquemáticamente en la Figura 5.1. El proceso de traducción es muy parecido en células eucariotas y procariotas. Por ello aquí lo describiremos a continuación en células procariotas destacando al final de cada una de las etapas las diferencias con células eucariotas.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

A) Iniciación

sitio P

sitioA

sitio E fMet-tARNi

Ribosoma

fMet

AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA

5’

3’ ARNm

B) Elongación

fMet

Asp

AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA

5’

3’

Thr fMet

Asp

AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA

5’

3’

C) Terminación Factordeterminación Cadena polipeptídica fMet

5’

Asp

Thr

Pro

Gly

Glu

Val

Leu

Ala

AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA

3’

Figura 5.1. Representación esquemática de las etapas de la síntesis de proteínas: (A) Iniciación, (B) Elongación y (C) Terminación.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

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Iniciación de la biosíntesis de proteínas En esta etapa se forma un complejo de iniciación formado por un ribosoma unido al ARNm y al ARNt iniciador cargado (fMet-ARNti). La etapa de iniciación requiere además la presencia de tres factores de iniciación (IF1, IF2 e IF3). Los factores IF1 e IF3 facilitan la disociación del ribosoma 70S. El ARNm se une a la subunidad ribosómica pequeña 30S. Ribosoma 70S + IF1 + IF3 A Subunidad 30S-IF1-IF3 + Subunidad 50S Subunidad 30S-IF1-IF3 + ARNm + GTP-IF2-fMet-ARNti A Complejo de iniciación 30S + IF3 El factor de iniciación IF2 tiene un sitio de unión para GTP y es capaz de reconocer el ARNt iniciador; este metionil-tARN es un sustrato de una transformilasa. De este modo, todas las proteínas procariotas empiezan con N-formilmetionina y también las sintetizadas en las mitocondrias de células eucariotas. El aminoacil-ARNt iniciador se aparea con el codón de iniciación frecuentemente AUG o en algunos casos GUG que señala el principio de la cadena polipeptídica. La posición correcta para comenzar la lectura depende también de una secuencia situada en el extremo 5’ del ARNm, secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria a un fragmento del ARNr 16S que forma parte de la subunidad pequeña 30S. Una vez formado el complejo de iniciación 30S, se libera el factor IF3 y se une la subunidad 50S. Esta subunidad tiene tres lugares para la unión del ARNt denominados: sitio P (peptidilo) donde normalmente se une el ARNt unido a la cadena polipeptídica que se está sintetizando, sitio A (aminoacilo) donde se une el ARNt portador del nuevo aminoácido que se va a incorporar a la cadena polipeptídica y el sitio E (salida) donde se unen ARNts vacíos antes de abandonar el ribosoma (Fig. 5.1). Al unirse la subunidad 50S el codón AUG con su fMet-ARNti se sitúa en el sitio P. En este momento el GTP unido al IF2 se hidroliza y el factor IF2-GDP se libera. El complejo de iniciación 70S formado está preparado para aceptar un segundo ARNt cargado y pasar a la etapa de elongación (Fig. 5.1 A). Complejo de iniciación 30S + Subunidad 50S A Complejo de iniciación 70S + IF1 + IF2 + GDP + Pi El proceso de traducción en células eucariotas es en general muy parecido al que ocurre en procariotas. Las diferencias más destacables ocurren a nivel de la iniciación. En las células eucariotas existen al menos nueve factores de iniciación y los ARNms se unen al ribosoma formando un complejo con varias proteínas. Algunos factores facilitan la disociación de las subunidades 60S y 40S del ribosoma. Ribosoma 80S + eIF6 + eIF3 + eIF4C A Subunidad 60S + Subunidad 40S-eIF3-eIF4C

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

El ARNm se asocia con varios factores de iniciación uno de ellos se denomina proteína de unión al casquete (CBPI). ARNm + CBPI + eIF4A + eIF4B + eIF4F A Complejo de ARNm El complejo de mARN se une a la subunidad ribosómica 40S y al ARNt iniciador que va acompañado también por el factor eIF2, una proteína que une GTP (GTP-eIF2-Met-ARNti) y a continuación se realiza un barrido del ARNm para localizar el primer codón AUG que indica el inicio de la lectura del ARNm. Este proceso es dependiente de la hidrólisis de ATP. Complejo de ARNm + Subunidad 40S-eIF3-eIF4C + GTP-eIF2-Met-ARNti + nATP

A Complejo de iniciación 40S + nADP + nPi El factor de iniciación eIF5 induce la liberación de otros factores. Una vez que ocurre el emparejamiento entre el Met-ARNti y el codón AUG tiene lugar la hidrólisis del GTP unido al factor eIF2 que se libera, y la subunidad 60S se une al complejo formado por el ARNt iniciador, el ARNm y la subunidad 40S. Complejo de iniciación 40S + eIF5 + Subunidad 60S A Complejo de iniciación 80S + eIF2-GDP + Pi + eIF3 + eIF4C + eIF5 Elongación de la biosíntesis de proteínas La cadena polipeptídica se alarga mediante unión covalente de unidades de aminoácidos transportados al ribosoma por los aminoacil-ARNts y posicionados correctamente por apareamiento de bases del anticodón del ARNt con el correspondiente codón del ARNm. En esta etapa participan también factores de elongación (EF-Tu, EF-TS y EF-G). Al comienzo de cada ciclo la cadena polipeptídica está unida a un ARNt en el lugar peptidilo y los otros lugares están vacíos. El factor de elongación Tu (EF-Tu), al igual que eIF2, está unido a un nucleótido de guanina y acompaña al aminoacil-ARNt al sitio A del ribosoma; a continuación el GTP se hidroliza y la forma EF-Tu-GDP se libera del ribosoma. –sitio P peptidil-ARNt Ribosoma

+ GTP-EF-Tu-aa-ARNt –sitio A vacío –sitio P peptidil-ARNt

A Ribosoma

+ GDP-EF-Tu –sitio A aa-ARNt

La hidrólisis del GTP unido al factor de elongación Tu desempeña una función importante en la fidelidad de la síntesis de proteínas. Mientras el EF-Tu no se diso-

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

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cie no se puede formar un nuevo enlace peptídico y la disociación requiere la hidrólisis del GTP. El tiempo que transcurre hasta que se hidroliza el GTP permitiría que un aminoacil-ARNt incorrecto unido en el sitio A abandonara el ribosoma. Una vez liberado el EF-Tu-GDP, éste tiene baja afinidad por un aminoacil-ARNt pero posee alta afinidad por otro factor de elongación Ts (EF-Ts) que facilita la liberación del GDP y la asociación con GTP dando lugar a la forma de alta afinidad para todos los aminoacil-ARNts excepto el ARNt iniciador. EF-Tu-GDP + EF-Ts A EF-Tu-EF-Ts + GDP EF-Tu-EF-Ts + GTP A EF-Tu-GTP + EF-Ts EF-Tu-GTP + aminoacil-tARN A EF-Tu-GTP-aminoacil-tARN Una vez formado el complejo en el que el aminoacil-ARNt ocupa el sitio A y la cadena polipeptídica unido al último ARNt que se ha incorporado ocupa el sitio P tiene lugar la formación de un nuevo enlace peptídico. La actividad enzimática que cataliza la formación del enlace peptídico (peptidiltransferasa) es parte de la subunidad grande del ribosoma y juega un papel importante el ARNr 23S que actúa como una ribozima. El grupo amino del aminoacil-ARNt en el sitio A ataca al enlace éster que une la cadena polipeptídica en crecimiento a la molécula de ARNt en el sitio P y la cadena polipeptídica es transferida al grupo amino del aminoacilARNt situado en el sitio A (Fig. 5.1 B). Sitio P

| N–H | R1–C–H | O=C | O | tARN peptidil-ARNt

Sitio A

N–H2 | R2–C–H | O=C | O | tARN aa-ARNt

Sitio P

A

OH | tARN ARNt vacío

Sitio A | N–H | R1–C–H | O=C | N–H | R2–C–H | O=C | O | tARN peptidil-ARNt

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

El paso siguiente del ciclo de elongación se denomina translocación. El ribosoma se desplaza la distancia de un codón hacia el extremo 3’ del ARNm. Este desplazamiento traslada al peptidil-ARNt desde el sitio A al sitio P mientras que el ARNt descargado pasa al sitio E y después se libera. El movimiento del ribosoma requiere también la presencia del factor de elongación G (EF-G) también llamado translocasa, que une GTP. La hidrólisis del GTP permite que EF-G-GDP se libere del ribosoma. Después de la translocación, el sitio A está vacío y se puede iniciar un nuevo ciclo de elongación. El ciclo de elongación en eucariotas es parecido, con tres factores de elongación eEF1_, eEF1`a y eEF2 que tienen funciones análogas a los factores EF-Tu, EF-Ts y EF-G. Terminación de la biosíntesis de proteínas Todo el proceso se repite hasta que en el sitio A del ribosoma está ocupado por uno de los tres codones de terminación; ningún aminoacil-ARNt se une al ribosoma cuando uno de los codones UAA, UGA o UAG ocupan este sitio. Estos codones son reconocidos por proteínas denominadas factores de terminación o liberación. El factor RF1 reconoce los codones UAA o UAG y el factor RF2 reconoce UAA o UGA. La unión de un factor de liberación en el sitio A a un codón de terminación cambia y activa la actividad peptidiltransferasa y se transfiere la cadena polipeptídica a una molécula de agua (Fig. 5.1 C). El factor RF3 une GTP y tiene actividad GTPasa que parece estimular el proceso mediante hidrólisis de GTP. Finalmente se liberan también los factores de terminación, el ARNm y el ribosoma se disocia en las subunidades 30S y 50S. –sitio P peptidil-tARN + GTP-RF + H2O A cadena

Ribosoma –sitio A codón de terminación

polipeptídica + GDP+ Pi + RF+ ARNm + Subunidad 50S + Subunidad 30S En eucariotas un único factor de terminación, eRF, reconoce los tres codones de terminación.

Antibióticos que inhiben la síntesis proteica La síntesis de proteínas es una de las rutas fisiológicas vitales para las células y muchos antibióticos actúan inhibiendo este proceso. Algunos de estos antibióticos aprovechan diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas de procariotas y eucariotas, de esta forma, algunos resultan específicos para los ribosomas bacterianos entre ellos: estreptomicina, eritromicina, cloranfenicol y tetraciclina.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

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Estreptomicina: es un trisacárido muy básico que interfiere con la unión del fMet-ARNt iniciador y también provoca errores de lectura originando proteínas aberrantes. Eritromicina: se une a un lugar específico en el ARNr 23S de la subunidad grande e inhibe la translocación. Cloranfenicol: impide la actividad peptidiltranferasa de la subunidad 50S. Tetraciclina: se une a la subunidad pequeña y bloquea la unión de las moléculas de aminoacil-ARNt al ribososma. In vitro puede inhibir también síntesis de proteínas en ribosomas eucariotas. Puromicina: tiene una estructura parecida al extremo 3’ de un aminoacil-ARNt lo cual facilita que se pueda unir al sitio A y la cadena polipeptídica en crecimiento se transfiere a la puromicina provocando la terminación precoz de la misma. Este antibiótico inhibe la síntesis de proteínas en células procariotas y eucariotas.

Destino y transporte de proteínas Las células eucariotas contienen diferentes orgánulos cada uno de los cuales poseen sus propias proteínas. La síntesis de la mayoría de las proteínas (excepto las codificadas por el ADN mitocondrial) se inicia en los ribosomas libres en el citoplasma. Su destino final está determinado por señales de clasificación presentes en la estructura de la propia proteína que dirigen su transporte hasta otros orgánulos. En la Figura 5.2 aparecen las secuencias que dirigen las proteínas hacia el núcleo, las mitocondrias, los peroxisomas, o la señal que dirige los ribosomas hacia el retículo endoplásmico (ER) y desde el ER las proteínas pasan al complejo de Golgi y otros destinos como los lisosomas, membrana plasmática y vesículas de secreción. También aparecen diferenciados los tres mecanismos mediante los cuales las proteínas se desplazan entre los diferentes compartimentos celulares: a) el transporte entre el citoplasma y el núcleo (Fig. 5.2, flecha ) tiene lugar a través de poros nucleares que actúan de forma selectiva permitiendo la difusión de moléculas de pequeño tamaño y siendo necesario un mecanismo de transporte activo para moléculas de mayor tamaño, denominado también transporte regulado; b) el transporte de proteínas desde el citoplasma a otros orgánulos (mitocondrias, peroxisomas y ER) implica en todos los casos que las proteínas tienen que atravesar una bicapa lipídica, se conoce como transporte de transmembrana (Fig. 5.2, flechas )y son necesarios translocadores proteicos y el mantenimiento de las proteínas en una conformación desplegada. c) el transporte vesicular (Fig. 5.2, flechas ) mediante el cual se mueven las proteínas desde el ER al complejo de Golgi y desde donde son clasificadas bien en vesículas de secreción o destinadas a los lisosomas y membrana plasmática fundamentalmente. Estas vesículas se producen en un orgánulo por gemación transportando tanto fragmentos de membrana como moléculas del lumen del compartimento. Las vesículas después de ser transportadas a su destino descargarán su contenido mediante fusión con la membrana del otro compartimento.

ENDOSOMAS

LISOSOMAS

SUPERFICIE CELULAR

APARATO DE GOLGI

VESÍCULAS SECRETORAS

Figura 5.2. Destino y transporte de proteínas. Secuencias que dirigen su transporte a los diferentes compartimientos. Mecanismos de transporte: transporte regulado (flecha ), transporte de transmembrana (flechas ), y transporte vesicular (flecha ).

Man 6-P

+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-LeuVal-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-GluGln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln

-Ser-Lys-Leu-

PEROXISOMAS

-Lys-Asp-Glu-Leu-COO–

RETÍCULO ENDOPLÁSMICO

+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-ArgPhe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-CysSer-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu

MITOCONDRIAS

-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

NÚCLEO

CITOPLASMA

64 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

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Importación al núcleo Las proteínas destinadas al núcleo tiene péptidos señal en el interior de la cadena polipeptídica que constan de cinco residuos aminoacídicos cargados positivamente (Fig. 5.2). Estas secuencias son reconocidas por proteínas que se mueven entre el citoplasma y el núcleo. Las importinas _ y ` actúan como un dímero receptor para estas señales. El complejo formado es translocado a través del poro con la participación de una GTPasa; en el núcleo este complejo se disocia y las proteínas transportadoras salen de nuevo al citoplasma. Importación a las mitocondrias Las proteínas destinadas a la mitocondria contienen en el extremo amino terminal un péptido señal de 20 a 35 aminoácidos en el que se alternan residuos cargados positivamente y residuos hidrofóbicos (Fig. 5.2). Estos residuos se pliegan en forma de hélice alfa anfipática. La cadena polipeptídica se mantiene desplegada mediante interacción con proteínas chaperonas (Hsp-70). En las membranas mitocondriales existe complejos que reconoce la hélice alfa y facilita el transporte a través de las membranas. El transporte a través de la membrana interna depende del gradiente electroquímico y de la hidrólisis de ATP. Una vez en la matriz mitocondrial la secuencia señal se elimina y tiene lugar el plegamiento de la proteína. Importación al ER y distribución desde el aparato de Golgi Las proteínas que contienen una secuencia señal hidrofóbica (5-10 residuos) en el extremo amino terminal (Fig. 5.2) dirigen estos ribosomas hacia el ER. Los ribosomas unidos a membranas sintetizan fundamentalmente tres tipos de proteínas: proteínas lisosómicas, proteínas de secreción y proteínas de membrana. Este péptido señal es reconocido por un complejo denominado partícula de reconocimiento de la señal (SRP) que consta de un ARN de 300 nucleótidos (7SL-ARN) y seis proteínas diferentes una de estas subunidades une e hidroliza GTP. La unión de SRP detiene la síntesis proteica y el complejo ribosoma-SRP se dirige hacia la membrana del ER donde existen receptores de SRP localizados en la cara citoplasmática. La cadena polipeptídica pasa a un complejo de translocación, posteriormente se hidroliza GTP y la SRP se disocia del ribosoma permitiendo que se reanude la síntesis de proteínas. Si no existen más señales el polipéptido completo atraviesa la membrana pasando a la luz del ER donde una peptidasa elimina la secuencia señal. En el caso de proteínas transmembrana pueden existir varios tipos, uno de los más simples son aquellas que además de la secuencia señal ya descrita contienen otro segmento hidrofóbico adicional (secuencia de anclaje). Esta secuencia de anclaje detiene el proceso de translocación originando proteínas con una única región de transmembrana y el extremo amino terminal situado en la cara externa de la membrana plasmática. Las proteínas que contienen más de una región de transmembra-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

na necesitan señales adicionales que inician y detienen de nuevo la translocación de la cadena polipeptídica. En la luz del ER las proteínas recién sintetizadas se pliegan y muchas son modificadas mediante N-glucosilación (oligosacáridos unidos al nitrógeno de los grupos amida de residuos de asparagina). Después las proteínas correctamente plegadas son transportadas mediante vesículas al aparato de Golgi donde los oligosacáridos previamente unidos pueden ser modificados y se pueden añadir nuevos. Los oligosacáridos añadidos en el Golgi pueden estar unidos al oxígeno de los grupos hidroxilo de residuos de serina o treonina (O-glucosilación). Proteínas que contienen la secuencia KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) en el extremo C-terminal se unen a receptores específicos en la región de cis Golgi y son devueltas al ER. Importación a los lisosomas Las hidrolasas destinadas a los lisosomas durante su paso por las distintas cisternas del Golgi son modificadas. Estas proteínas son reconocidas por una glucosiltransferasa que transfiere una N-acetilglucosamina fosfato a un residuo de manosa. Posteriormente una glucosidasa elimina el residuo de N-acetilglucosamina originando un oligosacárido con grupos de manosa 6-fosfato. La presencia de residuos modificados de manosa-6-fosfato permite que estas hidrolasas sean reconocidas por proteínas receptoras en membranas del complejo trans Golgi donde se forman vesículas que se dirigen a los lisosomas. Durante el transporte el receptor y las hidrolasas se disocian, tanto por efecto de la disminución del pH como por la presencia de fosfatasas que eliminan los grupos fosfato, facilitando el reciclaje de los receptores al complejo de Golgi mientras que las vesículas con las hidrolasas finalizan fusionándose con lisosomas. Las proteínas que son destinadas a la membrana plasmática no necesitan señales específicas cualquier proteína que pase del ER al Golgi será dirigida hacia la superficie celular (vía por defecto) a menos que contenga señales que la envíen hacia los lisosomas o a vesículas de secreción. No se conocen cuáles son las señales que determinan que las proteínas sean dirigidas a vesículas de secreción. Estas señales de clasificación en algunos casos puede estar en regiones de estas proteínas que son procesadas proteolíticamente durante su transporte. Estas proteínas forman agregados en la región trans del complejo de Golgi y posteriormente se forman vesículas de secreción que permanecen cerca de la membrana hasta que se produce una señal de liberación. Bibliografía 1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson D. Molecular biology of the cell. (3.a ed.). Nueva York. Garland Publishing Inc., 2000.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE

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6 Fundamentos de regulación de la expresión génica. Diferenciación celular E. Velázquez Sánchez y J. M. Ruíz Albusac

Introducción (1,2) Los organismos pluricelulares contienen una gran cantidad de células que se organizan de una forma precisa para conformar los diferentes tejidos y órganos. Los distintos tipos presentan tantas diferencias, en la forma y en su actividad biológica, que cuesta trabajo pensar que los cromosomas de todas ellas contengan la misma información genética. Por esta razón, y dado que la diferenciación celular suele ser un proceso irreversible, se llegó a creer que este proceso se producía como consecuencia de la pérdida selectiva de genes. En cambio, hoy se sabe que lo que diferencia a una célula de otra es la cantidad y calidad de las proteínas que contiene, lo cual viene condicionado por el patrón de expresión génica que cada una de ellas posee. Por este motivo, la diferenciación celular se produce como consecuencia de modificaciones en la expresión génica y no como consecuencia de la pérdida secuencial de genes. El genoma de una célula contiene, en la secuencia de su ADN, la información necesaria para sintetizar millares de proteínas diferentes. De todos los genes que constituyen el genoma de los diversos organismos, sólo se expresa una fracción de ellos, al menos durante un periodo de tiempo determinado. Atendiendo a la forma de expresión de las distintas proteínas en los diferentes tipos celulares, se pueden distinguir los siguientes tipos: a) Proteínas sintetizadas por todos los tipos celulares de un organismo. Éstas, a su vez, pueden estar presentes en altas concentraciones, como las proteínas del citoesqueleto, o las histonas, etc.; o en bajas concentraciones, como las enzimas implicadas en la reparación de ADN. b) Proteínas presentes en determinados tipos de células especializadas y ausentes en las demás. Quizás el ejemplo más característico sea la hemoglobina,

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

que se encuentra presente solo en los eritrocitos y, además, a elevadas concentraciones. c) Proteínas sintetizadas en muchos tipos celulares por un periodo de tiempo limitado. A este tipo pertenecen las proteínas reguladoras implicadas en el desarrollo embrionario y en la diferenciación celular.

Niveles de control de la expresión génica (1,2,3) El coste energético de la síntesis de proteínas es muy elevado, tanto si una proteína se expresa durante toda la vida de la célula, como si lo hace durante un periodo de tiempo limitado. Por ello, el control de la expresión génica es un proceso esencial que permite a las células aprovechar al máximo la energía metabólica disponible. Este control se puede ejercer, en todas las etapas del proceso que, desde el ADN, conduce a las proteínas: a) Control de la transcripción. Regula el tiempo y el número de veces que un gen, o un conjunto de genes, debe ser transcrito. b) Control del procesamiento postranscripcional. Regula las reacciones que producen la transformación de los transcritos primarios del ARN, en los correspondientes ARN mensajeros maduros. c) Control del transporte de los ARN mensajeros. El ARN mensajero es sintetizado en el núcleo: sin embargo, sus lugares de actuación se encuentran en el citoplasma, por lo que previamente han de ser transportados a través de los poros nucleares. d) Control traducional. Selección de los ARN mensajeros citoplasmáticos que deben ser traducidos por los ribosomas. e) Control de la degradación de los ARN mensajeros. Algunos ARN mensajeros presentes en el citoplasma son inactivados de forma selectiva. f) Control de la actividad proteica. Las proteínas sintetizadas son convertidas de manera selectiva en las correspondientes formas activas o inactivas. De todos los niveles posibles en los que puede ser regulada la expresión génica, la regulación a nivel del inicio de la transcripción es la más importante y la mejor caracterizada para la mayoría de las células. Este nivel de control es el que tiene lugar preferentemente en el proceso de la diferenciación celular.

Visión general del control de la transcripción: regiones reguladoras (1,4) La transcripción génica está regulada por una o varias regiones situadas a lo largo de la molécula del ADN y que precisamente reciben el nombre de regiones reguladoras. Las regiones reguladoras actúan a la manera de «interruptores mole-

FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

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culares», más o menos complejos, cuya función es la activación o la represión de la expresión génica. Estos interruptores moleculares que controlan la transcripción están constituidos por dos elementos esenciales: Secuencias específicas en el ADN y proteínas reguladoras que se unen a él. a) Secuencias específicas de ADN. El ADN posee un gran número de segmentos de pequeño tamaño (menos de 20 pares de bases) cuya secuencia posee una composición definida, que son reconocidos por una proteína reguladora única o por un conjunto de proteínas relacionadas. La interacción de una proteína reguladora con su correspondiente secuencia diana en el ADN determina la activación o la inactivación (represión) de uno o de varios genes. El fundamento de la regulación de la expresión génica viene representado por la naturaleza de la interacción entre las proteínas reguladoras con sus respectivas secuencias diana en el ADN. Las proteínas reguladoras contactan con el surco mayor del ADN mediante interacciones no covalentes. Aunque la energía de interacción de cada uno de estos contactos es en sí débil, la existencia simultánea de entre 18 y 22 contactos asegura una unión fuerte y altamente específica. b) Proteínas reguladoras. Una proteína reguladora reconoce una secuencia de ADN porque las superficies de contacto de ambas moléculas son complementarias. Cada proteína reguladora presenta una secuencia de aminoácidos característica y, por tanto, los motivos de reconocimiento proteína-ADN son típicos en sus detalles. Sin embargo, el estudio de los complejos proteínaADN, mediante cristalografía de rayos X o por espectroscopia de resonancia magnética nuclear, ha determinado, que la mayoría de las proteínas reguladoras conocidas, se puede agrupar en alguno de los tipos de motivos estructurales de unión al ADN que se describen a continuación.

Principales motivos de unión al ADN Motivo hélice-giro-hélice (6,7) Este motivo, descrito originalmente en proteínas bacterianas, se encuentra presente en un gran número de proteínas reguladoras, tanto de procariotas como de eucariotas. Está formado por dos hélices a unidas por una corta cadena de aminoácidos que forman el giro. La hélice más cercana al extremo carboxilo se denomina «hélice de reconocimiento» y se adapta al surco mayor del ADN. Proteínas con homeodominio (8,9,10) Este motivo está constituido por tres hélices a conectadas por dos bucles. Fue primeramente descrito en las proteínas reguladoras denominadas «homeóticas»,

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

codificadas, a su vez, por los genes homeóticos cuya expresión es esencial para el desarrollo de la mosca del vinagre (Drosophila). Este motivo se halla también presente en las proteínas reguladoras de los organismos superiores. Dedos de zinc (11,12) La característica principal de este motivo, del que se han descrito varios tipos diferentes, es que todos ellos contienen, al menos, un átomo de zinc. Hoy se conocen varios tipos distintos, en unos, el átomo de zinc conecta una hélice a con una lámina `, en otros, como en la familia de receptores para hormonas tiroideas, el átomo de zinc conecta dos estructuras a helicoidales. En ambos casos la interacción de la proteína con el ADN tiene lugar por sus regiones _ hélice. Cremallera de leucina 5,13,14 Es una hélice _ en donde se distinguen dos dominios funcionalmente diferentes: a) Dominio de dimerización. Se forma a partir de una región a helicoidal que contiene un mínimo de cuatro leucinas, separadas cada una de ellas por seis aminoácidos. La estructura primaria es: Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu, en donde X puede ser cualquier aminoácido. Puesto que hay 3,6 aminoácidos por vuelta de hélice, las leucinas se alinean en un margen de la hélice, lo que les permite establecer interacciones hidrofóbicas con otra proteína que presente un motivo estructural similar. Las proteínas con cremallera de leucina pueden unirse a otra proteína idéntica para formar un homodímero, o a una proteína diferente, pero que presente ese mismo motivo estructural, y formar así un heterodímero. b) Dominio de unión al ADN. Se sitúa a continuación de la cremallera de leucina, presenta estructura de _ hélice y contacta con el surco mayor del AND. Motivo hélice-bucle-hélice (HBH) (4,15) Este motivo está constituido por dos hélices _ anfipáticas conectadas por un bucle de longitud variable. A través de una de las hélices se produce la interacción con el ADN, la segunda hélice permite la interacción con un motivo semejante perteneciente a una proteína igual o diferente; las proteínas que contienen este motivo pueden formar por tanto dímeros: homodímeros o heterodímeros. La capacidad para formar dímeros depende de la naturaleza de la hélice _ y es común a todas las proteínas que contienen el motivo HBH. La mayoría de las proteínas que contienen el motivo HBH presentan además una secuencia con alto contenido en aminoácidos básicos. Esta región básica se sitúa en una posición adyacente al motivo HBH y es de capital importancia para la interacción con el ADN. Este motivo se denomina hélice bucle hélice básico (HBHb).

FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

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Dimerización de proteínas. Control combinatorio. Importancia en la expresión génica (1,3,4) La dimerización de proteínas es de gran importancia para el control de la expresión génica durante la diferenciación celular. Los heterodímeros se forman mediante interacción de proteínas con diferentes especificidades de unión al ADN; puesto que hay varias proteínas diferentes (con motivos estructurales «complementarios») éstas pueden combinarse de varias maneras, en función de la «combinación» establecida en un momento preciso el resultado sobre la expresión de un gen o de un conjunto de genes puede ser muy diferente. Del control combinatorio se deducen varios aspectos fundamentales (Fig. 6.1): en primer lugar, que el control de un solo gen puede requerir la presencia de varias proteínas reguladoras, en segundo lugar, que una misma proteína reguladora puede estar implicada en la expresión de varios genes diferentes y en tercer lugar, que la misma proteína reguladora puede formar parte de un complejo regulador activador o represor, dependiendo del resto de las proteínas que formen parte del complejo. Una consecuencia importante del control combinatorio es que unas cuantas proteínas reguladoras, combinadas de forma adecuada, pueden formar varios tipos celulares diferentes, a lo largo del desarrollo. En la Figura 6.2 puede verse como, mediante la combinación de cinco proteínas, cuya expresión ha sido inducida de PROTEÍNAS REGULADORAS

COMPLEJOS ADN-PROTEÍNA A Gen activo

B Gen inactivo

Figura 6.1. Efecto de la combinación de proteínas reguladoras unidas a su ADN diana sobre la transcripción génica. (A) Combinación activadora de la transcripción. (B) Combinación inhibidora de la transcripción.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Célula embrionaria

1.a DIVISIÓN

2.a DIVISIÓN

3.a DIVISIÓN

Figura 6.2. Importancia del control combinatorio para la diferenciación celular. La decisión de sintetizar una proteína (escogida de entre un par) se toma después de cada división celular atendiendo a criterios posicionales (las células hijas situadas a la derecha del embrión expresan únicamente la proteína representada a ese lado de la flecha, y las de la izquierda, las representadas a ese mismo lado). Cuando una generación inicia la expresión de una proteína, las generaciones sucesivas la expresan también. En el ejemplo se representa la formación de ocho tipos celulares con cinco proteínas reguladoras diferentes (triángulos ’ y », círculo k, corazón ♥ y media luna z).

forma secuencial a lo largo de tres divisiones celulares, y teniendo en cuenta la posición ocupada por cada célula en el embrión, se han formado ocho tipos diferentes de células. Otra consecuencia del control combinatorio es que el efecto de añadir una nueva proteína a una célula depende de la historia anterior de la misma, puesto que esta historia determina qué proteínas reguladoras se encuentran ya en la célula. Así, durante el desarrollo, una célula acumula una serie de proteínas que pueden no modificar su expresión génica, pero en un momento determinado, cuando se expresa el último miembro de la combinación requerida, se completa el mensaje regulador, y en consecuencia se producen grandes cambios en la expresión génica. Esto puede explicar por qué los fibroblastos pueden ser convertidos en células musculares por efecto de la expresión inducida de un gen denominado mioD, como veremos después.

FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

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El control combinatorio puede también explicar el proceso de la determinación celular por la cual una célula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciación y un destino, y el proceso de la diferenciación celular, mediante el cual una célula expresa su carácter diferenciado.

Regulación de la actividad de las proteínas reguladoras (1,3,4) La combinación de las proteínas reguladoras para activar la expresión génica no se produce al azar, sino que está, a su vez, regulada por señales extracelulares que combinan su mensaje mediante receptores situados en la membrana plasmática o en el interior celular. La señal externa es transducida hasta el núcleo celular y la consecuencia es la activación/inactivación de una o de varias proteínas reguladoras.

Control de la expresión génica en la diferenciación celular. Miogénesis (1,3,4) El proceso mediante el cual un huevo es transformado en un organismo multicelular requiere la ejecución de un complejo programa de desarrollo. Para que este programa pueda llevarse a cabo, es necesaria la activación de una serie de genes. Esta activación debe producirse en el momento preciso, en una secuencia determinada y en una localización exacta. Son varios los mecanismos y procesos implicados en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo. Como resultado de esos controles, las células responden a los cambios producidos en su entorno y así los diferentes tipos celulares pueden producir sus proteínas características. La mayoría de los mecanismos implicados en la regulación de la expresión génica durante la diferenciación celular requieren la participación de una gran cantidad de proteínas reguladoras que actúan de forma combinada. El resultado de su actuación es la activación/represión de la transcripción de uno o de varios genes. Uno de los ejemplos más representativos y mejor caracterizados sobre el control de la expresión génica en la diferenciación celular lo constituye la miogénesis, algunos de cuyos aspectos se describen a continuación.

Etapas de la miogénesis (3,15) Las células musculares se forman en los organismos superiores a partir de los somitos (bloques de células mesodérmicas localizadas a ambos lados del tubo neural) mediante tres etapas: Determinación, Proliferación/Migración y Diferenciación (Fig. 6.3).

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Somito Determinación Proteínas

MioD/Myf5

Mioblastos ProliferaciónMigración

Células musculares indiferenciadas Diferenciación

Proteínas

Miogenina Mrf4

Miotubo

Figura 6.3. Esquema representativo de las tres etapas principales que intervienen en la miogénesis. Influencia de las proteínas miogénicas. De acuerdo con el modelo representado, las proteínas MioD y Myf5 actuarían fundamentalmente en la etapa de determinación, mientras que, Miogenina y Mrf4, lo harían en el transcurso de la diferenciación.

a) Etapa de Determinación Una célula está determinada cuando ha tomado una decisión sobre su desarrollo; es decir, cuando ha experimentado un cambio que la diferencia, a ella y a sus descendientes, de las otras células del embrión y que la obliga a tomar una vía de desarrollo determinada. En este caso, algunas células concretas de los somitos se determinan, convirtiéndose así en mioblastos; precursores de las células musculares, que carecen todavía de grandes cantidades de las proteínas propias de la célula madura.

FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

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b) Etapa de Proliferación/Migración Después de la determinación, una subclase de mioblastos (los destinados a convertirse en músculo) migran desde los somitos hacia las regiones en donde se formarán las extremidades, aquí proliferan y se funden para formar un sincitio. c) Etapa de Diferenciación En esta etapa los precursores se convierten en células musculares maduras (miotubos). Se emplea el término diferenciación para designar la especialización celular manifiesta; es decir, la manifestación de un carácter celular muy evidente (expresión de actina, miosina, troponina, receptor de acetilcolina, etc.). Las señales extracelulares que inducen la determinación de cada grupo de mioblastos proceden de las células vecinas, principalmente del tubo neural y del ectodermo lateral, y se expresan sólo de forma transitoria. Estas señales disparan la expresión de numerosos factores intracelulares que mantienen el programa miogénico en ausencia de las señales inductoras. Durante el proceso de la miogénesis se produce un gran aumento de la expresión de los genes necesarios para el desarrollo del músculo y para su función biológica: genes miogénicos.

Proteínas reguladoras de la miogénesis En la determinación y diferenciación del músculo intervienen varias proteínas reguladoras pertenecientes a dos familias diferentes de factores de transcripción denominadas FMR (Factores Musculares Reguladores o Proteínas Miogénicas), y MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2). Factores Musculares Reguladores (FMR) (3,16,17,18,19) En esta familia se incluyen cuatro proteínas denominadas MioD (primera descubierta), Miogenina, Myf5 y Mrf4. Reciben el nombre colectivo de Proteínas Miogénicas porque cuando su expresión es inducida experimentalmente en otras células (fibroblastos) estas expresan las proteínas propias de las células musculares. Los miembros de esta familia se expresan únicamente en las células musculares y se unen a secuencias específicas en el ADN denominadas cajas E. La expresión de los FMR está sometida a regulación espacial y temporal a lo largo del desarrollo muscular. Por ejemplo, se detecta expresión de Myf5 en la región dorsomedial del somito en el día octavo del desarrollo, expresándose un día y medio después en la región lateral. Con excepción de la Mrf4, que se expresa de forma transitoria durante los días diez y once del periodo embrionario y nuevamente, a partir del día dieciséis, el resto de las proteínas miogénicas, una vez ini-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

ciada su expresión, ésta permanece, aunque en intensidad variable, hasta el estado adulto. Diversos estudios de mutagénesis dirigida, parecen indicar, que cada una de las proteínas miogénicas poseen diferentes funciones in vivo. Así, las proteínas MioD y Myf5 parecen estar principalmente implicadas en la determinación de los somitos y en su conversión en mioblastos (Fig. 6.3), mientras que Miogenina y Mrf4 intervendrían más bien en el proceso de la diferenciación. MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) (17,18,20) Los MEFs, a diferencia de los FMR, son incapaces por sí mismos de inducir la miogénesis, pero hacen posible que los FMR lo hagan. Los MEFs son expresados por otros tipos celulares, además de por las células musculares, durante el desarrollo. Las regiones del ADN a las cuales se unen específicamente se denominan cajas MEF.

Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio en la miogénesis (3,4,17) Tanto los FMR como los MEFs contienen en su estructura molecular el motivo HLH básico. Esto les permite formar homodímeros y heterodímeros y por tanto, combinarse de formas diversas, con las correspondientes implicaciones en la expresión génica. Y así, aunque cada uno de estos factores puede unirse a sus ADNs diana, la afinidad de unión es mucho mayor, cuando cualquiera de ellos lo hace asociado con él mismo o con otro. Por ejemplo, los MRFs forman heterodímeros con la proteína E2A (factor de transcripción expresado en varios tipos celulares, que posee también el motivo HLH básico), y este heterodímero se une a la caja E del ADN. Por su parte, la unión de los MEFs a su ADN diana (caja MEF), requiere la dimerización de los mismos. Los dímeros MEF-MEF, pueden a su vez combinarse con los heterodímeros MRF-E2A. Teniendo en cuenta que los genes implicados en la diferenciación terminal del músculo (Fig. 6.4) poseen cajas E, cajas MEFs o ambas, y que los heterodímeros MRF-E2A interaccionan con los dímeros MEF-MEF, dependiendo del tipo de interacción, con las mismas proteínas reguladoras pueden activarse hasta tres genes diferentes. En general, estas diferentes posibilidades de combinación, producen altos niveles de expresión en los genes responsables de la formación del músculo. En conclusión, la llave de la especificidad miogénica se encuentra en la asociación combinatoria de las diferentes proteínas a sus correspondientes sitios de control.

FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

A

E2A

FMR

MEF

MEF

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Promotor

Caja MEF

B

MEF

MEF

FMR

E2A

Promotor

Caja E Caja MEF

C

MEF

MEF

E2A

FMR

Promotor

Caja E

Figura 6.4. Modelos de combinación de las proteínas implicadas en la miogénesis. Cada una de las tres combinaciones de proteínas (A, B y C) podría activar un gen diferente implicado en la miogénesis. FMR (Factores Musculares Reguladores). E2A (Factor de transcripción E2A). MEF (Muscle Enhancer Binding Factor). Caja E (secuencia de ADN especifica para la unión del dímero FMR-E2A). Caja MEF (secuencia de ADN específica para la unión del dímero MEF-MEF).

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7 Genes para la presentación y el reconocimiento de antígenos R. Millán González y J. R. Regueiro

Introducción El sistema inmune surgió durante la evolución de los vertebrados para combatir las infecciones causadas por virus, bacterias, protozoos, hongos y helmintos. Estos patógenos pueden ser responsables de infecciones intracelulares o extracelulares, para las cuales la respuesta inmune debe ser diferente. De hecho, el sistema inmune ha desarrollado una variedad de respuestas apropiadas para combatir cada tipo de patógeno, al mismo tiempo que mantiene la tolerancia a los componentes del propio organismo. Para eliminar un patógeno que haya establecido una infección (atravesando las barreras epiteliales del organismo) lo primero que debe de hacer el sistema inmune es reconocerlo como tal y a continuación desarrollar una respuesta adecuada para destruirlo. Para ello el sistema inmune ha desarrollado dos tipos de mecanismos cuya diferencia principal reside en las estructuras de reconocimiento de los patógenos, ya que los mecanismos efectores de destrucción son esencialmente similares. Estos dos mecanismos son la inmunidad innata y la inmunidad adquirida.

La inmunidad y la autotolerancia innatas Los mecanismos innatos, más primitivos evolutivamente hablando, de acción inmediata, son mecanismos inespecíficos de reconocimiento del patógeno y carentes de memoria inmunológica. Son los encargados de combatir la infección desde el mismo momento de su inicio y durante sus primeras fases (aproximadamente de 0-5 días) con gran eficacia. Si éstos no consiguen eliminar la infección, al menos la mantienen bajo control mientras se desarrolla el otro tipo de mecanismo, la inmunidad adaptativa, que requiere más tiempo (aproximadamente una semana) para

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

desarrollarse. Las respuestas innatas generadas influyen en el tipo de respuesta adaptativa que se desarrollará más tarde. La inmunidad innata se basa en la activación del complemento por la vía alternativa y en los fagocitos (monocitos/macrófagos y neutrófilos) e inflamocitos (mastocitos), células que tienen receptores innatos para múltiples patógenos (1): 1. Receptores que reconocen estructuras características de los patógenos. — Lectinas de superficie que reconocen carbohidratos en la superficie de bacterias, levaduras y células senescentes (como LPSR o CD14 y el receptor de manosa, MR). — Receptores de detritos (scavenger) que reconocen polímeros aniónicos presentes en la superficie microbiana y de células muertas. 2. Receptores para el fragmento Fc (FcR) de las inmunoglobulinas. Se encuentran en la superficie celular y están específicamente diseñados para reconocer y unirse al fragmento constante de las inmunoglobulinas y mediar su función biológica. 3. Receptores para proteínas del complemento (CR). Todos estos receptores son capaces de reconocer, de forma inespecífica, estructuras propias del patógeno y opsoninas. Una vez que el patógeno ha sido reconocido, se iniciará la fase efectora de la respuesta inmune innata. En el caso de un fagocito, tras el reconocimiento, se producirá la activación del fagocito, ingestión del patógeno (formación del fagosoma) y, por último, la digestión (formación del fagolisosoma y destrucción del patógeno). Existen otros mecanismos innatos que no actúan inmediatamente, sino que son inducibles, como son la respuesta de fase aguda, los interferones (especialistas en defendernos de los virus), las células citolíticas naturales (NK, natural killer), las citocinas y otros mediadores que producen inflamación. Como se indicó anteriormente, la función principal del sistema inmune es la defensa frente a las infecciones, pero además, dicho sistema tiene que aprender a tolerar las estructuras propias para no reaccionar contra ellas. En el caso de la inmunidad innata, debido a que es una inmunidad que ya está desarrollada desde el nacimiento (está determinada en la línea germinal) y no necesita el contacto previo con la sustancia ofensiva, los mecanismos de tolerancia se realizan por la acción de la selección natural. Los individuos en los que las células o moléculas que pertenecen a la inmunidad innata no respeten los componentes propios del organismo serán purgados por acción de la selección natural y no serán viables.

La inmunidad adaptativa Los mecanismos adaptativos (más recientes evolutivamente hablando) tardan una semana en desarrollarse (por eso constituyen la inmunidad adquirida), tienen unos mecanismos de reconocimiento del patógeno extremadamente específicos (los

GENES PARA LA REPRESENTACIÓN Y EL RECONOCIMIENTO…

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receptores para antígeno TCR y BCR) y presentan memoria. Los linfocitos T y B son las únicas células capaces de reconocer específicamente los agentes patógenos, cada linfocito está programado genéticamente para reconocer de forma exclusiva un único antígeno. El sistema inmunitario en conjunto puede reconocer específicamente miles de antígenos, de tal forma que los linfocitos que reconozcan un antígeno determinado deben constituir una fracción minúscula del conjunto total de linfocitos (2). ¿Cómo es posible entonces generar una respuesta inmunitaria adecuada frente a un agente infeccioso? La respuesta es que cuando un agente se une a las escasas células capaces de reconocerlo, dichas células inician un proceso de proliferación masiva. Al cabo de pocos días, su número es suficiente para ejercer una respuesta inmunitaria eficaz. Es decir, el antígeno selecciona los clones de células que son capaces de unirse a él y promueve su proliferación (véase Fig. 7.1).

FASES

RECONOCIMIENTO (SELECCIÓN CLONAL)

LINFOCITOS VÍRGENES

B

B

B

1

2

B 3

n

SELECCIÓN CLONAL

B ACTIVACIÓN (EXPANSIÓN CLONAL)

B

2

2

PROLIFERACIÓN LINFOCITOS ACTIVADOS

B

2

B

2 B

2

B

2 2

DIFERENCIACIÓN LINFOCITOS EFECTORES

2

2 2

CÉLULAS PLASMÁTICAS FUNCIÓN EFECTORA

2

2

CÉLULAS DE MEMORIA

ANTICUERPOS

Figura 7.1. La selección clonal. Cada linfocito y su progenie (el clon) tienen una única especifidad generada por azar (de la 1 a la n). Cada antígeno seleciona por estimulación al linfocito que es capaz de reconocerlo, ignorando a los demás (el 2 en este ejemplo). Éste entonces prolifera y madura amplificando la respuesta específica y generando memoria inmunológica. Las fases de reconocimiento, activación y función efectora son aplicables.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Por tanto, el fenómeno primario y esencial de toda respuesta inmune es el reconocimiento del antígeno por los linfocitos T y B, que se consigue gracias a la presencia en su membrana de receptores específicos para él. En el caso de los linfocitos B, este receptor está constituido por inmunoglobulinas de membrana (mIg), que se hallan asociadas de forma no covalente con el heterodímero CD79_-CD79`. En el caso de los linfocitos T, lo constituye el TCR, que se halla asociado de forma no covalente a las moléculas CD3. Un sistema especial de reordenamiento de estos genes, sistema que sólo poseen los linfocitos T y B, garantiza que durante su desarrollo en los órganos linfoides primarios, cada clon linfocitario (célula y todas las células derivadas de ella por división celular) adquiera un receptor antigénico (inmunoglobulina en el caso de los linfocitos B, TCR en el caso de los linfocitos T) con un único sitio de unión al antígeno, es decir, con una sola especificidad, que es diferente de la de los receptores de los otros clones linfocitarios. El repertorio de especificidades distribuidas clonalmente entre los distintos linfocitos T y B maduros es enorme, lo que permite que haya siempre linfocitos, aunque sea en muy bajo número, con receptores específicos para epítopos de las múltiples (potencialmente millones) sustancias extrañas (antígenos) que pueden penetrar en el organismo de un individuo. Una vez maduros, los linfocitos pasan a la periferia, circulando y recirculando por los órganos linfoides secundarios, donde desarrollarán las respuestas cuando encuentren el antígeno para el que son específicos. Estas respuestas obedecen al principio de selección clonal, de forma que el antígeno «selecciona» (es decir, se une de forma selectiva) clones de linfocitos T y/o B con receptores específicos para él; esto determina la activación y proliferación de dichos clones y la consiguiente amplificación clonal del número de linfocitos específicos para ese antígeno. Esta ampliación del número de linfocitos específicos de antígeno garantiza que la respuesta secundaria frente al mismo antígeno se comporte como una respuesta con memoria, es decir, sea mucho más rápida, eficaz e intensa.

Linfocitos B y su receptor para el antígeno Las células B son generadas por el organismo a lo largo de toda su vida, producción que tiene lugar en la médula ósea. Las células precursoras residentes en dicho órgano tienen que sufrir un proceso de diferenciación, en el que se requiere la participación de las células del estroma a través de contactos directos célula-célula y a través de la producción de factores solubles. En el proceso de maduración del linfocito B se va a producir la formación del complejo BCR (receptor de la célula B) maduro y funcional. El BCR está formado por dos tipos de cadenas, cadenas variables (inmunoglobulina de membrana) y cadenas invariables (iguales en todos los linfocitos, CD79). Cada complejo receptor está formado por la unión de la inmunoglobulina a dos heterodímeros CD79_/CD79`. ¿Cómo se genera la diversidad en estos receptores? (3) Las moléculas de inmunoglobulina son codificadas por genes que contienen múltiples versiones para cada región de la cadena. De este modo un linfocito B elige entre todas esas opciones posibles y expresa al final en su mem-

GENES PARA LA REPRESENTACIÓN Y EL RECONOCIMIENTO…

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brana una molécula de inmunoglobulina concreta. Las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas se encuentran codificadas por los denominados segmentos C y las regiones variables por los segmentos V y J o V, D y J según se trate de cadenas ligeras o pesadas respectivamente. Los segmentos codificantes (V, J y C, y también D en el caso de las cadenas pesadas) se encuentran separados en el genoma de todas las células del organismo, excepto en los linfocitos B, la aproximación de estos segmentos génicos durante la maduración de la célula B es necesaria para su expresión. Dicha aproximación tiene lugar por un proceso de recombinación somática (véase Fig. 7.2). Sólo los segmentos que codifican para la región variable de cada cadena recombinan y se aproximan. Los segmentos constantes permanecen separados del resto y es a nivel del ARNm cuando se unen a la combinación VDJ o VJ ya recombinada. Por tanto, el mecanismo básico para la generación de la diver-

Figura 7.2. Ejemplo de reordenamiento, transcripción y traducción de una cadena ligera g en un precursor de linfocitos B. Una de las versiones V (•) se yuxtapone a una J (•) por recombinación somática, eliminándose grandes segmentos de ADN (*). Ahora ya es posible la síntesis de un RNA con los segmentos necesarios (V, J, C) que se alinearán por excisión intrónica (se eliminan grandes segmentos de ARN). La región variable de la cadena ligera está codificada por dos segmentos génicos (V y J).

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

sidad de los anticuerpos es la recombinación somática al azar de las distintas versiones de los genes que codifican cada región de sus cadenas, y la asociación al azar de las propias cadenas pesadas y ligeras, pero no es el único. La imprecisión en la unión de los segmentos génicos a la hora de la recombinación y la hipermutación somática que tiene lugar durante el reordenamiento amplifican dicha diversidad. Tenemos, por tanto, formado un amplio repertorio de linfocitos B capaces de reconocer específicamente un amplio espectro de antígenos a pesar de que cada linfocito B expresa y sintetiza una única inmunoglobulina. Linfocito T y su receptor para antígeno Los linfocitos B reconocen antígenos libres o solubles mediante su receptor antigénico de superficie. En el caso de los linfocitos T, el antígeno es previamente degradado y procesado en el interior de las células presentadoras de antígeno (APC). Posteriormente, los fragmentos procesados son expuestos en la superficie de la célula presentadora, en el seno de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC de clase I o de clase II). El TCR no reconoce al antígeno libre de forma directa como ocurre con los anticuerpos, sino que reconoce sólo fragmentos del antígeno en la membrana de esas células presentadoras, unidos o «presentados» por las regiones polimórficas de las moléculas MHC de clase I o clase II propias. Esto implica que el MHC heredado por un individuo determinado condiciona o restringe la especificidad del TCR de sus linfocitos T. En otras palabras, una célula T no es específica de un antígeno, X, como ocurre con los linfocitos B, sino de X + MHC propio. La restricción por el MHC de la especificidad de las células T es una propiedad adquirida durante su desarrollo en el timo. Además del TCR, las células T expresan en su membrana determinadas proteínas de superficie, denominadas colectivamente moléculas accesorias, cuya función principal es estabilizar la interacción inicial entre la célula T y la célula presentadora (como CD4, CD8, CD2). Esta interacción inicial facilita el posterior reconocimiento del antígeno por el TCR. Además, asociado a las dos cadenas polimórficas que constituyen el TCR se encuentra un grupo de proteínas monomórficas, denominado en conjunto CD3, formando así el complejo TCR-CD3. Las cadenas CD3 son imprescindibles para la transmisión de la señal de reconocimiento antigénico al interior celular, estando probablemente implicadas en las interacciones del TCR con las moléculas accesorias antes citadas. A lo largo de su desarrollo en el timo los linfocitos T adquieren el receptor del antígeno de las células T (TCR), y al igual que ocurre con los linfocitos B, cada linfocito T adquiere un único TCR, cuya especificidad es distinta de la de los otros linfocitos T. El TCR Es un heterodímero con un peso total de 86 kD cuyas dos cadenas polipeptídicas, denominadas _ y `, están unidas covalentemente por puentes disulfuro. Es la

GENES PARA LA REPRESENTACIÓN Y EL RECONOCIMIENTO…

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porción específica del receptor, por lo tanto polimórfica, y en ella se da la variación clonotípica que permite el reconocimiento de los diferentes antígenos. Existe un isotipo del TCR que se encuentra en una pequeña subpoblación (inferior al 5 %) de células T y está formado por cadenas a y b en lugar de _ y `. Este heterodímero tiene una estructura similar al TCR_`, y su función biológica aún no está claramente determinada. Los genes que codifican las cadenas del TCR están formados por la unión de elementos génicos separados que codifican para las regiones V, D, J y C. Las secuencias adyacentes a los segmentos V, D y J tienen, como los de las inmunoglobulinas, determinadas secuencias (heptámero-espaciador-nonámero) que están implicadas, como señal de reconocimiento, en el reordenamiento somático. El mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas: a) interacción de las secuencias complementarias de uno de los genes D y J, al azar; b) el gen V sigue un mecanismo análogo, constituyéndose segmentos V-D-J; los segmentos V podrían asociarse con los J cuando no existe la región D, y c) por último, se produce un reordenamiento de un gen de la región C, dando lugar al ADN reordenado y completo que habría así creado una especificidad al azar. La amplia diversidad de TCR posibles se genera por los siguientes mecanismos: multiplicidad de genes V; unión aleatoria de los múltiples segmentos de los genes V, D, J y C; diversidad de unión que resulta de una fusión imprecisa entre los últimos segmentos, responsable de deleciones y adiciones de nucleótidos, lo que origina una diferencia en el número de aminoácidos (este cierto grado de flexibilidad es una característica que sólo poseen los linfocitos T), y asociación al azar de las dos cadenas (_-` y a-b) que constituyen el receptor. En contraste con las inmunoglobulinas, los genes de TCR no parecen diversificarse mediante mutaciones somáticas de los genes reordenados, posiblemente debido a la necesidad de reconocimiento de las moléculas MHC.

El sistema HLA El sistema HLA constituye el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) humano. Está compuesto por una serie de proteínas de membrana que se hallan codificadas por genes situados en una región, cercana al centrómero, en el brazo corto del cromosoma 6. Su función en el sistema inmunitario consiste en combinarse con péptidos que han sido procesados por las células presentadoras de antígenos (APC), formando un complejo que puede ser reconocido por las células T. Para este fin, las moléculas de histocompatibilidad cuentan con una región polimórfica, que se encarga de unir péptidos e interaccionar con el TCR, y una región monomórfica, que ancla la molécula a la membrana y se encarga de interaccionar con los correceptores CD4 o CD8. Dos familias de moléculas de histocompatibilidad se han especializado en presentar péptidos a los linfocitos T CD4+ y CD8+: las de clase II y las de clase I respectivamente. Cada familia de moléculas cuenta con varias versiones o isotipos (HLA A, B, C de clase I y HLA-DR, DP, DQ de clase II), cada uno de los cuales presenta un elevado polimorfismo en la población. Cada una de la variantes o alotipos de cada uno de los isotipos de las moléculas de clase I y

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de clase II presenta un grupo de péptidos ligeramente diferente, aunque la flexibilidad existente permite que siempre se produzca alguna presentación.

Fases de la inmunidad adaptativa Si un patógeno logra sortear las tremendamente eficaces barreras inmunes innatas y establecer una infección, se ponen en marcha los mecanismos de inmunidad adaptativa. A menudo ésta se pone en marcha de todos modos, simplemente para reforzar la inmunidad innata en futuras infecciones. Las respuestas adaptativas comienzan con el reconocimiento del antígeno, a continuación se produce la activación de los linfocitos y su posterior proliferación para alcanzar un número de linfocitos mínimo tal que, al diferenciarse y adquirir su función efectora, sean capaces de eliminar el antígeno (patógeno). A la vez que se generan linfocitos efectores también se producen linfocitos de memoria. La respuesta inmune adaptativa consta de las siguientes fases: 1. Reconocimiento: Consiste en la unión del antígeno a los receptores específicos para antígeno de los linfocitos maduros. Los linfocitos B reconocen determinantes antigénicos conformacionales (proteínas, carbohidratos o lípidos) de los patógenos extracelulares o sus productos (en forma soluble) por medio de su BCR. Los linfocitos T reconocen el antígeno por medio de su TCR, pero a diferencia del linfocito B no lo hacen en forma soluble, sino que reconocen pequeños péptidos (924 aminoácidos) unidos a las moléculas de histocompatibilidad HLA (de clase I y II) propias presentados por células presentadoras de antígeno. Las moléculas MHC de clase II y de clase I muestran una diferente especialización para presentar el antígeno según la procedencia intracelular o extracelular de éste. Las de clase II están especializadas en la presentación de antígenos extracelulares (cualquier antígeno proteico exógeno) que entren en la célula presentadora por endocitosis o fagocitosis, mientras que las de clase I están especializadas en la presentación de antígenos procedentes de proteínas citosólicas sintetizadas por la propia célula (como una proteína vírica en una célula infectada). Esto está condicionado por las distintas vías biosintéticas seguidas por las moléculas MHC de clases II y I. Las cadenas que forman las moléculas de clase I se sintetizan en el retículo endoplásmico, donde se ensamblan, formando un heterodímero físicamente inestable a temperatura fisiológica. La presencia de péptidos antigénicos de 8-10 aminoácidos es esencial para la formación de heterodímeros estables. Una vez formado el heterodímero estable unido al péptido, se sigue el proceso de exocitosis común a las moléculas de membrana, es decir, del retículo endoplásmico son transportadas al aparato de Golgi y, desde éste, pasan a la membrana plasmática a través de un sistema vesicular. Los péptidos que se unen a las moléculas MHC de clase I en el retículo endoplásmico proceden generalmente de proteínas citosólicas o nucleares que se han degradado en el citosol. Los péptidos producidos como consecuencia de esta degradación son transportados a la luz del retículo endoplásmico mediante trans-

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porte activo dependiente de ATP que es llevado a cabo por proteínas transportadoras de péptidos (TAP, del inglés transporters associated with antigen presentation), consistentes en dos subunidades (TAP-1 y TAP-2) ancladas a la membrana formando un heterodímero. Se han descrito péptidos procedentes de las secuencias señales que pueden unirse al MHC de forma independiente de TAP, probablemente tras degradación proteica dentro del retículo endoplásmico. Por otro lado existen otros genes, LMP2 y LMP7, que codifican subunidades de un complejo de proteasas citosólico denominado proteasoma, que pueden estar involucrados en la producción de los péptidos citosólicos que van a ser transportados al retículo endoplásmico. En cuanto a las moléculas MHC de clase II, las cadenas _ y ` que forman el heterodímero también se sintetizan en el retículo endoplásmico. Dentro de éste se asocian a una tercera cadena polipeptídica, la cadena invariante (hi), formando un trímero _`-hi. Dicha asociación impide a la molécula de clase II unirse a un péptido dentro del retículo endoplásmico. Además, la cadena invariante dirige el transporte de las moléculas MHC de clase II a través del aparato de Golgi a un compartimiento de la vía endolisosómica, aún no totalmente definido, donde se separa por proteólisis, dejando dímeros _` libres para unir péptidos procedentes de la degradación proteolítica de antígenos que han entrado en la vía endocítica. Los péptidos antigénicos que se unen a las moléculas MHC de clase II proceden, en su mayor parte, de proteínas extracelulares que entran en la célula por endocitosis. La unión del péptido y las moléculas MHC de clase II en los endolisosomas es independiente de TAP. En células en reposo se ha demostrado que los ligandos naturales de las moléculas de clase II proceden mayoritariamente de proteínas citosólicas que pueden entrar en la vía endolisosomal. 2. Activación: Para la completa activación del linfocito se requieren simultáneamente sobre él dos tipos de señales: la primera se la da el antígeno y la segunda procede de una célula coestimuladora o accesoria (una célula presentadora de antígeno profesional para los linfocitos T y un linfocito Th para los B). Si se produce un reconocimiento del antígeno sin señal coestimuladora no sólo no se activa el linfocito, sino que se puede convertir en anérgico y ya no responder más a dicho antígeno (mecanismo que previene de la autoinmunidad). Una vez activado correctamente el linfocito, comienzan los procesos de proliferación que conducen a la expansión de los clones de linfocitos específicos de antígeno para generar un número de linfocitos necesario para eliminar (una vez adquirida la función efectora en una fase posterior) al patógeno (esta fase lleva una semana aproximadamente). Una vez alcanzado un número de linfocitos suficiente se produce su diferenciación (mediada por citocinas distintas a las que mediaban la proliferación) con lo que adquieren su función efectora definitiva (una pequeña parte de los linfocitos proliferantes permanecen como células de memoria). Por ejemplo, los linfocitos B se diferencian a células plasmáticas productoras de anticuerpos, que se unen al antígeno en el medio extracelular y activan los mecanismos de eliminación del antígeno dependientes de anticuerpos. Los linfocitos T se diferencian a linfocitos T cooperadores que ayudan a los macrófagos a la lisis de patógenos fagocitados por éstos,

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o ayudan a los linfocitos B en la producción de anticuerpos, o bien se diferencian a linfocitos T citolíticos con capacidad de lisis de células infectadas intracelularmente (por ejemplo, por virus). En esta fase, además de generarse un elevado número de linfocitos efectores, también se producen cambios en otras proteínas de su superficie, las moléculas de adhesión, las cuales les permiten llegar rápidamente a los lugares del organismo donde se está produciendo la infección. 3. Función efectora: Son todos los mecanismos que emplea el linfocito diferenciado para eliminar el antígeno. Con la adquisición de la función efectora se produce la transición de unas pocas células con una única función de reconocimiento específico de antígeno, a un elevado número de células con capacidad de mediar (directa o indirectamente) la destrucción específica de dicho antígeno. Lo que diferencia realmente a los linfocitos del resto de las células efectoras del sistema inmune (además de la memoria inmunológica) es su sutil capacidad para reconocer las estructuras (por el BCR) o secuencias de aminoácidos (por el TCR) de los patógenos que sean distintas a las propias (para las cuales es tolerante). Dichos antígenos son imposibles de distinguir por los mecanismos de inmunidad innata. Por lo demás, los mecanismos efectores destructivos son muy similares en las respuestas innatas y en las respuestas adaptativas y la función biológica de los linfocitos es hacer de adaptadores (de ahí la palabra adaptativa) para poner en contacto a los esquivos patógenos con los diversos y universales mecanismos destructores, que también funcionan en ausencia de linfocitos.

Tolerancia adaptativa El sistema inmune es capaz de responder a una gran variedad de antígenos diferentes, debido al amplio repertorio de especificidades, generadas somáticamente, que poseen sus células B y T. Sin embargo, y como consecuencia de que la generación de dicho repertorio es aleatoria, es posible que muchos de los linfocitos T o B producidos por el organismo reconozcan componentes propios. Estas células se encuentran normalmente controladas por distintos mecanismos que aseguran la tolerancia a lo propio. Pero, ocasionalmente, alguna célula B o T específica para un antígeno propio puede escapar a estos mecanismos generadores de tolerancia y atacar a los tejidos propios donde se localice el antígeno para el que es específica, dando lugar a una patología de tipo autoinmune: Los componentes de la inmunidad innata son en general autotolerantes de manera igualmente innata, por lo que sólo participan en las reacciones autoinmunes si son invocados por los linfocitos T o las Igs. El establecimiento de tolerancia frente a los componentes propios (autoantígenos) es un proceso fundamental para el normal funcionamiento del sistema. En el caso de la inmunidad adaptativa, la tolerancia es específica del antígeno y es un fenómeno adquirido. La deleción, la anergia y la ignorancia clonales son los principales mecanismos de inducción y mantenimiento de la tolerancia. Cada uno de ellos puede intervenir a nivel central (timo o médula ósea para las células T y B, res-

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Figura 7.3. La selección de los timocitos _`. En el timo se rescatan (selección positiva de los útiles), se eliminan (selección negativa de los dañinos) o se pierden (no selección de los útiles) los timocitos según la afinidad de su TCR_` por las moléculas de MHC/péptidos propias. Apenas un 5 % de los timocitos sobreviven.

pectivamente) o periférico (órganos linfáticos secundarios y tejidos) (véase Fig. 7.3). Deleción clonal El mecanismo fundamental, aunque no el único, de tolerancia T a nivel central es la deleción de los clones de timocitos autorreactivos en el timo. En el timo ocurren dos procesos aparentemente contradictorios: la selección positiva de aquellos linfocitos cuyo receptor es capaz de reconocer las moléculas HLA propias y la eliminación (selección negativa) de las células T autorreactivas. Las células del estroma tímico son las encargadas de presentar péptidos propios a los linfocitos T para realizar dicha selección (4). Existen dos umbrales de afinidad diferentes entre el TCR y el complejo HLA-péptido propio: los linfocitos portadores de TCR con afinidades

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bajas e intermedias por los complejos HLA-péptido propio serían seleccionados positivamente (a efectos prácticos se habrían seleccionado todos los linfocitos capaces de reconocer el HLA propio), mientras que aquellos cuyo TCR tuviera una afinidad alta serían seleccionados negativamente. Por tanto, en el timo morirán timocitos por tres razones distintas: a) fallo en la producción de un TCR funcional a través de los procesos de recombinación de los segmentos V, J y D de las cadenas _ y ` del TCR; b) incapacidad de su TCR de reconocer algún complejo HLA-péptido incluso con una afinidad relativamente baja; y c) reconocimiento con muy alta afinidad del TCR de complejos HLA-péptido propio. El mecanismo de muerte de los timocitos en todas estas circunstancias es la apoptosis. El proceso de deleción de los clones autorreactivos en el timo no puede ser exhaustivo so pena de reducir drásticamente el repertorio de linfocitos T disponible para responder a los antígenos ajenos, por lo que se mantienen en circulación clones capaces de reconocer antígenos de los tejidos periféricos (por periféricos se entienden todos los tejidos que no forman parte del sistema hematopoyético y el timo) aunque normalmente, no responden a antígenos periféricos. Las razones de esta ausencia de respuesta pueden ser de dos tipos: a) Ignorancia, indiferencia clonal o silencio inmunológico. Estos tres términos, prácticamente equivalentes, describen el siguiente mecanismo: la mayoría de las células parenquimatosas de los tejidos periféricos —desde las células musculares hasta las neuronas— no expresan moléculas de HLA de clase II, un requerimiento esencial para el reconocimiento de los antígenos por parte de los linfocitos CD4+ de tipo colaborador. Normalmente, estas células periféricas tampoco expresan moléculas de adhesión (por ejemplo ICAM-1) que faciliten el contacto con ellos, y las células endoteliales de los capilares que las rodean no expresan niveles suficientes de moléculas de adhesión o receptores de «asentamiento» linfocitario. La circulación de linfocitos a través de estos tejidos periféricos es, en situación normal, muy reducida y, por tanto, la probabilidad de encuentro con su autoantígeno en forma inmunogénica, remota. El resultado es que los linfocitos autorreactivos se mantendrán indiferentes frente a células periféricas que, si bien contienen antígenos reconocibles por ellos, los mantienen inmunológicamente silentes. b) Anergia clonal. Se ha demostrado que algunas células T circulantes autorreactivas no responden a la presentación del autoantígeno en el contexto apropiado. Se cree que dichas células están en una situación de anergia, este estado se produce probablemente por la presentación «incompleta» de los antígenos periféricos. Este concepto parte de la hipótesis de que la activación de todo linfocito requiere dos señales: una primera señal generada por el contacto del TCR con el complejo HLA-péptido apropiado y una segunda señal normalmente generada por el contacto con células presentadoras de antígeno «profesionales» (es decir, macrófagos y células dendríticas) o por otras moléculas, como citocinas e incluso ciertas moléculas de adhesión y los correceptores CD4 y CD8. Dado que en la periferia las células parenquimatosas, incluso cuando expresan HLA de clase II, no poseen —que se sepa— actividad coestimuladora, al interaccionar con los linfocitos autorreactivos los anergizarían.

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Tolerancia B Está bien establecido que una notable proporción de linfocitos B del repertorio normal primario (células B recién formadas que no han tenido contacto con el antígeno) expresan inmunoglobulina de membrana (mIg) con actividad contra autoantígenos. Hay que señalar, sin embargo, que no existen linfocitos B reactivos contra autoantígenos ampliamente distribuidos e importancia biológica decisiva como los antígenos de los grupos sanguíneos ABO o los antígenos de histocompatibilidad. Además, afortunadamente, estos linfocitos B autorreactivos, en condiciones normales, no desarrollan una respuesta, ya que para ser activados por un antígeno los linfocitos B, requieren la colaboración de linfocitos T CD4+ específicos de otros epítopos del mismo antígeno, y el repertorio de linfocitos T CD4 es poco autorreactivo. Esta limitación no es absoluta y, de hecho, falla cuando el sistema se enfrenta a un autoantígeno que contenga (en la misma molécula o en moléculas físicamente asociadas) epítopos reconocidos por linfocitos B autorreactivos junto a epítopos exógenos reconocibles por el repertorio de linfocitos T CD4. Éste sería el caso de una molécula microbiana con epítopos reconocidos por células B que tenga reactividad cruzada (mimetismo molecular) con un componente propio o bien un fármaco que se conjugue a una proteína propia; la célula B autorreactiva puede entonces activarse y secretar autoanticuerpos ya que recibe la ayuda de las células T CD4+ que reconocen los epítopos extraños. Hay que tener en cuenta, además, que durante su respuesta frente a los antígenos exógenos, las células B diversifican su repertorio de anticuerpos (repertorio secundario de células B) por los mecanismos de hipermutación somática de los genes de las regiones VH y VL, con lo que se pueden generar autoanticuerpos de alta afinidad. La alta frecuencia de células B autorreactivas en el repertorio primario se explica porque éstas no sufren un proceso de selección negativa durante su desarrollo en la médula ósea, tan radical y riguroso como ocurre con los linfocitos T en el timo. Al igual que en el caso de las células T, la deleción clonal es el principal mecanismo de tolerancia central (en la médula ósea), mientras que la anergia clonal lo sería en la periferia. Estudios con ratones que expresan transgenes codificadores de autoanticuerpos contra distintos tipos de autoantígenos indican que las células B fuertemente autorreactivas contra autoantígenos de membrana celular de amplia distribución, como las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, son delecionadas a nivel central y no se hallan en la periferia. En cambio, cuando se trata de autoantígenos proteicos solubles, los linfocitos B autorreactivos no son delecionados sino que aparecen en la periferia; sin embargo son anérgicos, es decir, incapaces de activarse frente al antígeno. El hecho de que un autoantígeno favorezca la deleción en lugar de la anergia, depende de su mayor capacidad para inducir un fuerte ligamiento cruzado de las mIg, lo que se da en el caso de los autoantígenos multivalentes de membrana. Dicho «puenteo» de las mIg de los linfocitos B en desarrollo generaría una fuerte señal activadora que, en ausencia de una segunda señal proporcionada por las células T (probablemente vía CD40), conduciría a la apoptosis de la célula B; si este «puenteo» es menor, como ocurre con los antígenos solubles,

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se favorecería la anergia. Por otro lado, las células B autorreactivas generadas en el repertorio secundario, es decir, por el mecanismo de hipermutación somática del centro germinal de los folículos linfoides durante una respuesta frente a un antígeno exógeno, serían igualmente eliminadas por deleción clonal o silenciadas por anergia clonal, incluso si el antígeno se hallara bien representado en el microambiente del centro germinal, al faltarles la ayuda (vía CD40) de células T CD4+ específicas del mismo autoantígeno. Los mecanismos generadores de tolerancia que se han descrito, tienen una eficiencia muy elevada. Por ello, se cree que la autoinmunidad podría reflejar la activación desafortunada de algunas células potencialmente autorreactivas en estado de anergia o ignorancia inmunológica. Sólo algunos autoantígenos inducen autoinmunidad, y suelen ser aquellos para los que es difícil generar tolerancia central o periférica por no ser ni muy abundantes ni extremadamente raros y para los que existen linfocitos autorreactivos. La mayoría de las veces, estos linfocitos no se encuentran activados, y sólo se activan en determinadas circunstancias, dando lugar a la respuesta autoinmune. Debido a la depedencia de los linfocitos B y Tc respecto a los Th, se considera que la mayor parte de las respuestas autoinmunes comienzan por la activación de linfocitos Th autorreactivos, que precisa de dos señales, la generada por un autoantígeno asociado a MHC, y la señal coestimuladora de la propia célula presentadora. Esta última es necesaria, no sólo para la activación del linfocito efector, sino para el mantenimiento de la función efectora: si el coestímulo cesa, entonces el linfocito autorreactivo deja de actuar y muere.

Enfermedades autoinmunes Las enfermedades autoinmunes son la consecuencia patológica de una respuesta inmune contra componentes del propio huésped. Aunque no se conoce todavía la causa o causas concretas que desencadenan la autoinmunidad, parece necesaria la existencia de células presentadoras con complejos MHC/autoantígeno en su superficie, de células T o B efectoras autorreactivas y de señales coestimuladoras capaces de activar a esos linfocitos. Se ha sugerido que las infecciones pueden ser un factor desencadenante, y así parecen probarlo algunos datos experimentales. La pérdida de tolerancia podría deberse a que el agente infeccioso induce la expresión de moléculas MHC de clase II y/o señales coestimuladoras —antes ausentes— en la célula presentadora o diana del ataque autoinmune o bien el patógeno obliga a rescatar linfocitos anérgicos que finalmente consiguen eliminarlo, pero con el coste autoinmune. También se ha apuntado la posibilidad de que anticuerpos o células T generadas frente al agente infeccioso puedan dar reacciones cruzadas con antígenos propios. En este caso, los anticuerpos o linfocitos T reconocen, además de los antígenos del agente infeccioso, otros propios del organismo de similar estructura (mimetismo molecular). Otro modelo propone que las células B capaces de reconocer el antígeno propio interaccionan con él cuando éste se encuentra asociado a la bacteria —que actúa como «portadora»— y pueden recibir, entonces, ayuda de

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las células Th. En el caso de tejidos inmunoprivilegiados, se ha sugerido que el trauma o la infección podrían permitir el acceso de los linfocitos autorreactivos a los autoantígenos antes secuestrados, disparando la autoinmunidad. Por otro lado, parece claro que muchas, si no todas, las patologías autoinmunes tienen un importante componente genético, además del ambiental. De hecho, muchas enfermedades de este tipo parecen presentar una fuerte asociación con ciertas moléculas HLA, principalmente de clase II, aunque a veces con clase I. Esta idea no es nada descabellada, puesto que la respuesta inmune (y autoinmune) implica la participación de células T que reconocen, precisamente, péptidos presentados por moléculas del MHC. Además de las moléculas HLA, otros factores genéticos, como el sexo, son importantes en el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes pueden estar mediadas por anticuerpos como tales o formando parte de complejos inmunes o por linfocitos T, tanto Th como Tc. Los síntomas que se asocian a cada enfermedad autoinmune dependen esencialmente del origen (ubicuo o localizado) y la naturaleza del autoantígeno (soluble, o bien asociado a membranas celulares, o a la matriz extracelular...). Diabetes mellitus tipo I Es un trastorno en el cual la destrucción de las células ` productoras de insulina de los islotes pancreáticos de Langerhans, origina deficiencia de insulina. Está mediado por células Tc (que a diferencia de las Th reconocen autoantígenos citoplásmicos, esto es, producidos por las propias células blanco). En esta enfermedad las células ` del páncreas son destruidas selectivamente. Además, hay presencia de anticuerpos contra diversos antígenos, algunos de ellos sin caracterización molecular hasta el momento; entre ellos, los más representativos son (5): Anticuerpos contra células de los islotes (ICA). El antígeno, quizás un glucolípido, aún no ha sido caracterizado. Anticuerpos antiinsulina. Se han descrito en el suero del 50 % de los pacientes en estadios preclínicos y clínicos de inicio reciente. Antidescarboxilasa del ácido glutámico (GAD). El GAD existe en dos formas derivadas de genes separados que codifican para las proteínas GAD-65 y GAD-67 que tienen un 65 % de identidad de aminoácidos. Ambas formas se encuentran en altas concentraciones en neuronas y en células ` del páncreas. Aunque se han descrito anticuerpos contra ambas formas, los correspondientes a 65 kD se han detectado con mayor frecuencia (80 % de las formas preclínicas). Autoanticuerpos contra otros antígenos. Entre ellos se incluyen el anti-37 kD/40 kD, que es un fragmento tríptico de GAD-65, y el anti-38 kD una proteína parcialmente purificada de la membrana de los gránulos secretores de insulina (anticuerpos contra este antígeno se encuentran en el 30 % de los pacientes con enfermedad de inicio reciente). Otros aspectos inmunológicos de la diabetes tipo I son: a) infiltrado linfoide de los islotes (insulitis), preferentemente a expensas de linfocitos T citotóxicos (ver

Figura 7.4. Mecanismos de autotolerancia y autoinmunidad. Nótese el papel central de los lifoncitos Th en la respuesta autoinmune. Los lifoncitos anérgicos pueden ser rescatados por patógenos en ciertas circunstancias, causando quizá autoinmunidad.

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Fig. 7.4); b) rechazo rápido con insulitis de páncreas trasplantados, y c) asociación con DR3, DR4, de modo que un alelo u otro se encuentra en el 90-95 % de los pacientes diabéticos, mientras que la frecuencia en la población no diabética es del 40-45 %. El posible papel de este hecho en la instauración de la enfermedad aún no se ha aclarado. El HLA-DR2 se considera un alelo protector. Enfermedad de Graves Es una enfermedad autoinmune que se presenta como tirotoxicosis con bocio difuso. El diagnóstico inmunitario de la enfermedad se basa en la identificación de anticuerpos antitiroideos con propiedad de alterar la función normal tiroidea. Hay anticuerpos estimulantes del tiroides [antirreceptor de hormona tirostimulante (TSH)] en el 90 % de los casos, y anticuerpos antitiroglobulina y antiperoxidasa tiroidea en el 25 y el 50 %, respectivamente, de los pacientes. Se observa infiltración linfocitaria difusa, a expensas de células T activadas, CD4+ y, en menor cantidad, CD8+. Los anticuerpos antirreceptor de TSH con frecuencia pertenecen a un solo tipo de cadena ligera, kappa o lambda, lo que sugiere que se desarrollan a partir de una población de células B restringida. Los autoanticuerpos promueven in vitro el crecimiento de las células tiroideas, por lo que al parecer desempeñan un papel en el aumento del tamaño de la glándula. La responsabilidad de los anticuerpos antirreceptor de TSH en la patogenia del hipertiroidismo se demuestra convincentemente por el cuadro de hipertiroidismo que presentan los hijos recién nacidos de madres con enfermedad de Graves, cuadro clínico que desaparece cuando catabolizan los anticuerpos transferidos de la madre. La oftalmopatía de la enfermedad de Graves se asocia a la presencia de anticuerpos contra una proteína del músculo del ojo de 64 kD (véase Fig. 7.4).

Resumen Los principales aspectos que se han tratado en el presente artículo son: Genes para la presentación y el reconocimiento de antigenos BCR, TCR Polimorfismo MHC. La autoinmunidad innata (determinada en línea germinal) se purga por la acción de la selección natural. La autoinmunidad adaptativa (determinada somáticamente) se purga por la acción de la selección negativa central y por anergia por falta de colaboración con linfocitos T colaboradores (a nivel periférico). Los mecanismos de tolerancia a veces fallan: enfermedades autoinmunes. Ejemplo de enfermadad autoinmune mediada por anticuerpos: Enfermedad de Graves. Ejemplo de enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T citotóxicos: IDDM.

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¿Por qué existen estos fallos en la tolerancia? Papel central de los linfocitos Th. Factores genéticos (asociación con MHC clase I y II) y factores ambientales (infecciones).

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8 Oncogenes. Proteínas tumorales. Mecanismos de activación de proto-oncogenes. Genes supresores de tumores. Genes mutadores J. M. Ruíz Albusac, y E. Velázquez Sánchez

Introducción Etapas del desarrollo del cáncer (2,3) La investigación llevada a cabo sobre las bases moleculares del cáncer ha permitido conocer las fases del desarrollo del mismo: • Comienza cuando una célula de una población normal sufre una mutación genética que le permite continuar proliferando cuando, en condiciones normales, debería estar quiescente. Esta célula alterada —y su progenie— conserva su apariencia normal, pero se reproducen en exceso (hiperplasia). • Años más tarde, alguna de estas células sufre otra mutación que altera, aún más, el control del crecimiento celular, con lo que su progenie presentará un aspecto anormal en su morfología y orientación (displasia). • Después de cierto tiempo, una de estas células adquiere una mutación que altera su comportamiento. Sus descendientes tienen otro aspecto y presentan nuevas anomalías en su desarrollo. Si no ha traspasado ninguna barrera, se forma un tumor benigno, o cáncer in situ, capaz de permanecer así indefinidamente y alcanzar grandes proporciones. • Algunas células pueden sufrir nuevas mutaciones. Si estos cambios genéticos permiten la ruptura de la lámina basal, la invasión del tejido circundante y la entrada de las células en el torrente circulatorio (o en la linfa), se forma un tumor maligno. • La acción inmediata de las células del sistema inmune acabará con la mayoría de ellas. No obstante, si unas pocas células supervivientes se adhieren a la pared vascular, de los capilares que bañan otro tejido u órgano, podría producirse extravasación.

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• Las células invasoras pueden proliferar hasta dar lugar a nuevos tumores en otra parte del cuerpo, formando un tumor secundario o metástasis, que puede resultar letal si afecta a un órgano vital. En resumen, una neoplasia se define como un proceso complejo, que se desarrolla en múltiples etapas y que envuelve cambios secuenciales en los mecanismos moleculares responsables del control del crecimiento celular; esto es: a) b) c) d)

Proliferación o división celular. Diferenciación celular. Muerte celular programada (apoptosis). Reparación del ADN.

Sistemas de señalización celular (2,5,13) ¿Cuáles son los eventos moleculares involucrados en el control de la división celular? ¿Qué mecanismos producen la pérdida de este control y la formación de células cancerosas? Las células normales están, permanentemente, recibiendo señales del exterior: por vía endocrina, paracrina, autocrina o yuxtacrina. Todos los mensajes son transmitidos hasta el núcleo e integrados por el reloj del ciclo celular que, en definitiva, será el encargado de decidir si las células deben o no proliferar: • Las señales estimuladoras son iniciadas por los factores de crecimiento (EGF, PDGF, etc.), cuyo objetivo es la producción de proteínas que ponen en marcha la división celular. • Las señales inhibitorias, iniciadas por citoquinas (TGF-`, interferón, TNF, etcétera) producen, por el contrario, proteínas que inhiben la división celular. Una alteración en las cascadas estimuladoras producirá una señal continuada de proliferación celular. Una pérdida de la señal de parada producirá un error en la inhibición de la división celular. En ambos casos, la consecuencia es la misma: la célula pierde el control de su propio crecimiento, permitiendo que avance en el ciclo. Los factores de crecimiento hacen que las células en reposo (G0, quiescentes) entren y progresen a través del ciclo celular. Durante la fase G1 temprana es necesaria la presencia sostenida (varias horas) de los denominados factores de competencia (EGF, PDGF, etc.). En el primer punto de control del ciclo (punto de Restricción), para que la célula no detenga su crecimiento, se necesita la presencia simultánea de los denominados factores de progresión. Durante la fase G1 tardía, y el comienzo de la fase S, sólo es necesaria la presencia de factores de progresión (IGF-I, etc.). En ciertas células, la ausencia de estimulación por factores de crecimiento causa una rápida entrada en muerte celular programada. Algunas citoquinas (TGF-`), pueden antagonizar los efectos proliferativos de los factores de crecimiento, e incluso revertir su efecto, si se añaden al final de la fase G1.

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Otros puntos de control del ciclo se encuentran en la fase G2 y en la propia fase M, impidiendo, mediante su destrucción, que la célula llegue realmente a dividirse.

Genes y cáncer (1,2,11,15,16,17,18,19,20,21,22) El genoma es el portador de la información expresada en las proteínas que regulan la división celular; por ello, sólo se puede considerar el cáncer como una enfermedad genética, cuando las alteraciones tienen lugar al nivel de los genes. ¿Cuáles son estos genes? Se distinguen tres categorías: Proto-oncogenes: Regulan los procesos de crecimiento celular. Genes supresores de tumores: Responsables de inhibir la mitogénesis. Genes mutadores: responsables de la reparación del ADN.

Oncogenes. Proteínas tumorales (7) Los oncogenes son las versiones patológicamente alteradas de los proto-oncogenes que, de forma dominante, están involucradas en la transformación neoplásica de las células. La mayoría de los acontecimientos genéticos que producen cáncer ocurren en las células somáticas. Éstos se acumulan a lo largo de la vida del individuo, hasta que se pierde un número crítico de elementos de control del crecimiento. De esta forma se origina el clon que dará inicio a un tumor. La frecuencia con la que transcurren estos acontecimientos puede alterarse por la exposición a mutágenos ambientales. Como estas alteraciones genéticas tienen lugar en las células somáticas, no se transmiten a las generaciones futuras; es decir, no se heredan. Sin embargo, si el daño se produce en las células germinales, los descendientes recibirán una forma alterada de estos genes, heredando la predisposición o la susceptibilidad de padecer cáncer.

Retrovirus transformantes Los oncogenes fueron inicialmente identificados como genes portados por un tipo de virus cuyo material genético estaba constituido por ARN, y que eran capaces de causar tumores en los organismos susceptibles a los pocos días de la infección. Por ello, recibieron el nombre de retrovirus de transformación aguda. Por el contrario, los retrovirus de transformación crónica o débil (no defectivos) no portan oncogenes. Estos virus causan tumores en tejidos específicos (tras un periodo de latencia de muchos meses), pero por un mecanismo diferente al de los anteriores y, aunque pueden replicarse in vivo, no son capaces de transformar células en cultivo. El virus del sarcoma de Rous es uno de los más representativos del grupo

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de retrovirus transformantes agudos. Su genoma, además de los genes característicos (gag, pol y env), que porta la especie salvaje de referencia (virus de leucemia murina), y que codifican las proteínas necesarias para la proliferación viral, contiene el oncogén v-src. Este oncogén codifica una proteína tirosina quinasa responsable del sarcoma de los pollos. El oncogén v-src resulta ser la forma mutada de un proto-oncogén homólogo, denominado c-src, presente en el genoma de la célula huésped. Se conocen más de 30 oncogenes responsables de causar tumores en animales (incluido el hombre); algunos de ellos se mencionan en la Tabla 8.1. En general, cada genoma viral porta un oncogén, aunque hay casos, como el del virus de la eritroblastosis aviar, que porta dos oncogenes: erb-A y erb-B. Si los oncogenes proceden de la célula huesped, ¿cómo han sido incorporados al genoma de los retrovirus? La información genética de los retrovirus está contenida en una molécula de ARN monocatenario, por lo que la replicación del virus pasa necesariamente por la síntesis, dentro de la célula huésped, de su ADN complementario. La enzima responsable de esta síntesis se denomina transcriptasa inversa y es una de las proteínas cuya información está contenida en el genoma viral. Este ADN complementario viral se integra seguidamente dentro del genoma del huésped, formando lo que se denomina un provirus. Los retrovirus pueden transferir información genética tanto horizontalmente como verticalmente. La transferencia horizontal se lleva a cabo durante el proceso de infección viral y que consiste en el aumento del número de células infectadas en un mismo huésped. La transferencia vertical tiene lugar cuando el provirus se ha integrado en las células germinales de un organismo, pudiendo ser transmitido a la generación siguiente como si se tratara de un locus de herencia mendeliana. Tabla 8.1.

Algunos retrovirus transformantes, tumor inducido y oncogén responsable.

Virus (nombre) Sarcoma de Rous (RSV) Sarcomas murinos: de Harvey (Ha-MuSV) de Kirsten (Ki-MuSV) de Moloney (Mo-MuSV) Osteosarcoma murino de FBJ (FBJ-MuSV) Sarcoma de simio (SSV) Sarcomas felinos: (PI-FeSV) (SM-FeSV) (ST-FeSV) Sarcoma de ave (ASV-17) Sarcoma de Fujinami (FuSV) Mielocitomatosis de ave (MC29) Leucemia de Abelson (MuLV) Reticuloendoteliosis (REV-T) Eritroblastosis de ave (AEV) Mieloblastosis de ave (AMV)

Tumor inducido (especie)

Oncogén

sarcoma (pollo)

src

sarcoma/eritroleucemia (rata) sarcoma /eritroleucemia (rata) sarcoma (ratón)

H-ras K-ras mos

condriosarcoma (ratón) sarcoma (mono)

fos sis

sarcoma (gato) fibrosarcoma (gato) fibrosarcoma (gato) fibrosarcoma (pollo) sarcoma (pollo) carcinoma/sarcoma/mielocitoma (pollo) linfoma de células pre-B (ratón) leucemia linfoblástica (pavo) eritroleucemia/fibrosarcoma (pollo) leucemia mieloblástica (pollo)

sis fms fes jun fps myc abl rel erb-B, erb-A myb

ONCOGENES. PROTEÍNAS TUMORALES. MECANISMOS DE…

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A veces la integración del provirus se produce en un lugar cercano a un protooncogén. Cuando se producen errores de transcripción, el genoma retroviral puede llevar parte de la secuencia del proto-oncogén. En sucesivas transmisiones verticales esta secuencia puede ir completándose, hasta que una partícula viral porte la secuencia completa de exones codificados por el proto-oncogén. Si durante cualquiera de los ciclos de reproducción del retrovirus, el proto-oncogén sufre una mutación, se formará un oncogén. Este oncogén tiene la capacidad de transformar la célula huésped dado que, expresa un producto proteico defectuoso: oncoproteína o proteína tumoral, que interviene activamente en la regulación de la proliferación celular. ¿Para qué le sirve al virus el oncogén? Una célula en continuo proceso de proliferación debe tener a punto su maquinaria de replicación, transcripción y traducción. Obviamente, esta maquinaria será utilizada por el virus. Parece claro que alguna ventaja evolutiva obtendrá, máxime cuando la mayoría de los retrovirus transformantes han perdido parte del gen pol —en esto el virus del sarcoma de Rous representa una excepción—, que les impide replicarse por sí mismos. En este caso la infección va acompañada de la cepa salvaje del virus, que actúa como ayudante de la replicación. Los retrovirus portadores de oncogenes son capaces de transformar células en cultivo, produciendo cambios fácilmente apreciables a tres niveles: • Anomalías en la membrana plasmática: Incremento de las necesidades metabólicas; aumento del paso de los distintos metabolitos con pérdida de especificidad de algunos transportadores; aparición de burbujas. • Problemas de adherencia: Disminución de la adherencia al sustrato; cambio del aspecto normal poligonal-aplastado a la forma redondeada; nueva reorganización del citoesqueleto; incremento de la proteólisis extracelular. • Anomalías en la proliferación celular: Las células crecen formando focos; baja dependencia de los factores de crecimiento y de anclaje; proliferan indefinidamente y pueden causar tumores si se inyectan a animales susceptibles. Funciones de los proto-oncogenes En general, los proto-oncogenes codifican proteínas que están implicadas en el control del crecimiento celular. Según sus propiedades bioquímicas y funcionales se clasifican en los siguientes grupos: I. Factores de crecimiento Polipéptidos que funcionan como señales extracelulares. Estimulan la proliferación de las células que disponen en su membrana plasmática de un receptor específico para dicho factor. II. Receptores de factores de crecimiento Son las máquinas moleculares que transmiten información unidireccionalmente a través de la membrana celular. En general, constan de tres dominios:

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• Extracelular de unión al ligando. • Transmembrana. • Intracelular con actividad tirosina quinasa. La fosforilación de proteínas citoplasmáticas específicas pone en marcha una serie de eventos bioquímicos dirigidos hacia la división celular. III. Transductores intracelulares de señal Transmiten la señal desde la cara interna de la membrana plasmática hasta el núcleo, mediante proteínas —generalmente fosforiladas— que interaccionan en el citosol. Dos grupos principales: • Proteína quinasas citosólicas (no receptores). – Tirosina quinasas. – Serina/Treonina quinasas. • Proteínas de unión a GTP/con actividad GTPasa intrínsica. – Monoméricas (ras). – Heterotriméricas (proteínas G). IV. Factores de transcripción Son proteínas nucleares que regulan la expresión de los genes o familias de genes diana. La regulación transcripcional es mediada por proteínas de unión a secuencias de ADN específicas o motivos estructurales de ADN, usualmente localizados corriente arriba del gen diana. Los factores de transcripción son el eslabón final en la vía de transducción de señal que convierten señales extracelulares en cambios modulados en la expresión génica. V. Reguladores de la muerte celular programada (proteínas antiapoptóticas) Los tejidos normales presentan un balance regulado entre la proliferación celular y la muerte celular programada, un componente importante en el proceso de embriogénesis normal y desarrollo orgánico. En las células cancerosas falla también la muerte celular programada, último recurso que dispone una célula, que presenta una regulación descontrolada de su crecimiento, para evitar que se transforme al fenotipo neoplásico. VI. Proteínas que controlan el ciclo celular Para que el ciclo celular avance, determinadas proteínas deberán ejercer sus acciones específicas en ciertos momentos del mismo. Modificaciones en la actividad de los complejos ciclina/quinasa dependiente de ciclina pueden dar lugar a un exceso de señal de división.

ONCOGENES. PROTEÍNAS TUMORALES. MECANISMOS DE…

Tabla 8.2.

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Clasificación funcional de oncogenes/proto-oncogenes.

A

B

C

D

E

F

G

H

I

c-sis KS/HST wnt1 int2

c-erb-B erb-B2,3 c-ms c-kit ros trk ret sea met mas

N-ras Ha-ras Ki-ras gsp/gip

c-src c-abl yes fgr fes syn c-fps

mos A-raf B-raf

crk vav

c-fos c-jun c-erbA c-myb c-myc N-myc L-myc c-rel

Bcl-2

PRAD1 MDM2 cdk4

A. Factores de crecimiento; B. Receptores de Factores de crecimiento; C. Proteínas de unión a GTP; D. Tirosina quinasas post-receptor; E. Serina/Treonina quinasas; F. Reguladores SH2/SH3; G. Factores de transcripción; H. Reguladores de la apoptosis; I. Reguladores del ciclo celular.

Se conocen más de 100 proto-oncogenes, algunos de los cuales se presentan en la Tabla 8.2. Mediante técnicas bioquímicas y de citogenética, la localización cromosómica de muchos de ellos ya se conoce.

Activación de proto-oncogenes Se denomina activación de proto-oncogenes al conjunto de circunstancias que causan alteraciones en la estructura/función, o en la expresión, del producto proteico de un proto-oncogén. Se dice entonces que el proto-oncogén se ha convertido en un oncogén, y por ello capaz de transformar células al fenotipo neoplásico. Puesto que la neoplasia es un proceso en varias etapas, más de uno de estos mecanismos deberán coincidir en una célula para que ésta contribuya en la génesis de un tumor. Por otra parte, en la expresión completa del fenotipo neoplásico —incluyendo la capacidad para formar metástasis—, normalmente estarán involucrados una combinación de proto-oncogenes activados y la pérdida o inactivación de genes supresores de tumores. Los mecanismos de activación de proto-oncogenes siguen dos modelos: A) Modelo cualitativo. El producto proteico presenta cambios estructurales, responsables de la alteración de su actividad biológica, sin que haya modificación en la cantidad de proteína expresada. Tres tipos: 1. Deleción. 2. Mutación puntual. 3. Translocaciones que producen proteínas de fusión. B) Modelo cuantitativo. El producto proteico presenta una actividad biológica normal, pero se expresa una cantidad mucho más elevada de lo normal, o bien se expresa en un tejido inadecuado. Tres tipos:

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1. Inserción mutacional. 2. Amplificación génica. 3. Translocaciones que producen activación génica. Estas alteraciones se producen en las células somáticas (excepcionalmente, alteraciones en los oncogenes RET, CDK4 y NET también pueden producirse en las células germinales), y se transmiten a las células hijas en forma autosómica dominante, mediante un mecanismo de ganancia de función. Un ejemplo de deleción lo constituye el oncogen v-erb B, que codifica para un receptor de EGF cuyo dominio de unión al ligando está ausente y el extremo carboxílico, que regula la actividad tirosina quinasa del receptor, truncado. En consecuencia, el oncogén v-erb B está permanentemente activado, aun en ausencia del factor de crecimiento. El proto-oncogén src codifica una proteína tirosina quinasa unida a la membrana plasmática, cuya activación depende de la unión de un factor de crecimiento a su receptor. La quinasa, en su forma inactiva, tiene en la posición 527 un resto de tirosina fosforilada, unido a un dominio SH2 del extremo N-terminal, y otro residuo de tirosina desfoforilado, en la posición 416, dentro del dominio catalítico. La unión del ligando produce: la dimerización del receptor y la consiguiente autofosforilación en residuos específicos de tirosina. Estas nuevas fosfotirosinas compiten por el dominio SH2 de src, liberando la fosfotirosina 527, que inmediatamente es desfosforilada, a la vez que el resto de tirosina 416 es fosforilado. De este modo la quinasa se convierte en la forma activa. El producto del oncogén v-src tiene sustituidos los 19 aminoácidos finales (incluida la tyr-527) por otros 12 aminoácidos diferentes —como consecuencia de una mutación puntual que origina un error en la lectura de los tripletes del ARN durante la síntesis proteica, a la vez que anticipa el codón de terminación—, y la tyr416 está fosforilada. Esta alteración permite que la proteína src se encuentre activa de forma constitutiva. En la mayoría de los tumores en los que se ha aislado el oncogén ras, la alteración consiste en una mutación puntual que da lugar a la sustitución de un solo aminoácido. La familia de proto-oncogenes ras codifican proteínas de 188-189 aminoácidos (en general, conocidas como p21ras). Las mutaciones normalmente se han detectado en las posiciones 12, 13 y 61. Por ejemplo, la sustitución de la glicina-12 por cualquier otro aminoácido —excepto prolina—, o de la glutamina-61 por un aminoácido distinto de la prolina o el ácido glutámico, da lugar a una proteína mutante, que tiene alterada su actividad biológica. Las proteínas ras ocupan un papel central en la transducción de señales generadas por factores de crecimiento, interviniendo en la cascada de activación de la familia de proteína serina/treonina quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas) que inducen, a su vez, la fosforilación —activación— de determinados factores de transcripción. Se trata de una proteína monomérica de unión a nucleótidos de guanina con actividad GTPasa intrínsica. La proteína ras unida a GDP es inactiva, mientras que la unida a GTP es activa. Pues bien, las proteínas ras mutantes, cuya

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forma unida a GDP fuera activa o que la forma unida a GTP no pudiera desfosforilarse, estarían enviando al núcleo una señal continuada de proliferación y serían responsables de su acción oncogénica. Las células tumorales suelen expresar resistencia a algunos agentes quimioterapeúticos mediante el mecanismo de amplificación génica. Consiste en la producción de centenares o millares de copias de un gen que codifica para una proteína que interviene en el proceso degradativo del agente. Los cromosomas son notablemente más largos, y mediante las técnicas de bandeo se aprecian segmentos cromosómicos que han perdido el patrón normal de alternancia de bandas claras y oscuras, denominadas regiones homogéneamente teñidas (HSR), y cuya ruptura da lugar a los llamados cromosomas diminutos. Uno de los genes más comúnmente afectados por este mecanismo de amplificación es el de la dihidrofolato reductasa (DHFR). A veces, cuando uno de estos genes se encuentra próximo a un proto-oncogén (por ejemplo, c-myc), éste también se amplifica. En consecuencia, se produce una sobreexpresión de la proteína Myc y un incremento en la señal de proliferación. El mecanismo de inserción mutacional se produce cuando un retrovirus no defectivo, de transformación lenta o crónica —que no porta un oncogén— integra su ADN complementario en las proximidades de un proto-oncogén (por ejemplo, myc). Los elementos reguladores del provirus (LTR), y no el promotor de myc, son los que dirigen la transcripción del mismo. De este modo, el proto-oncogén escapa a los mecanismos de control celular, produciéndose una sobreexpresión de la proteína Myc. El gen myc consta de tres exones: el exón 1, no se traduce, y los exones 2 y 3 forman la proteína c-Myc. Se han descrito distintos sitios de inserción de retrovirus en los dominios del proto-oncogén myc: 1) dentro del primer intrón; 2) dentro de este primer intrón, pero orientado a la inversa; 3) pasado el tercer exón. En todos los casos, la secuencia codificada por c-myc es correcta, por lo que la oncogenicidad es atribuida a la pérdida de control normal y a la sobreexpresión del gen. La baja probabilidad de las inserciones retrovirales en las proximidades de un proto-oncogén, y los diferentes modos de inserción, justifican que los retrovirus no defectivos tengan periodos de latencia muy largos, y que sus efectos transformantes sean menos intensos que el de los retrovirus portadores de oncogenes. En ocasiones, una recombinación anormal entre cromosomas puede situar a un proto-oncogén bajo la influencia de las secuencias reguladoras de otros genes, que tienen la propiedad de ser muy expresados en un tipo celular determinado. En estas circunstancias se produce también una sobreexpresión del proto-oncogén, y como consecuencia de ello, una elevación de los niveles de la proteína oncogénica que da lugar a la aparición del fenotipo neoplásico. Este fenómeno recibe el nombre de activación génica. Un ejemplo característico lo representa el linfoma de Burkitt, en donde se produce una translocación entre el cromosoma que contiene al protooncogén c-myc (cromosoma 8) y uno de los cromosomas que contienen los genes que codifican para la cadena pesada y las cadenas kappa y lambda ligeras de las inmunoglobulinas (cromosomas 14, 2 y 22); o bien otra translocación entre los cromosomas 8 y 14, que sitúa al proto-oncogén c-myc próximo al gen del receptor _ de las células T (TCR_). En cualquiera de las circunstancias descritas se produce

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una desregulación de la expresión del proto-oncogén c-myc, que puede dirigir hacia la transformación neoplásica de la célula. La sobreexpresión de c-Myc impide a los linfocitos inmaduros diferenciarse en células B y T, maduras. Existe otro tipo de reordenamiento cromosómico en donde el punto de ruptura se sitúa dentro del loci de dos genes. Se produce un nuevo gen, que contiene en su extremo inicial parte de uno, y en su extremo final parte del otro. Los genes híbridos de fusión codifican proteínas quiméricas de fusión con actividad transformante, en la que los dos genes implicados en la fusión contribuyen al potencial transformante de la oncoproteína quimérica. En consecuencia, la cantidad de proteína expresada es normal, pero tiene la función biológica alterada. El ejemplo mejor conocido se corresponde con la leucemia mieloide crónica (LMC), una enfermedad que se caracteriza por la presencia en todos los pacientes del denominado cromosoma Filadelfia. Durante algún tiempo, se pensó que este pequeño cromosoma se formaba como consecuencia de la transformación neoplásica de las células; hoy se conoce bien que este cromosoma representa la causa misma de la enfermedad. La leucemia mieloide crónica (y la leucemia linfoblástica aguda, LLA) se caracteriza por una translocación entre los cromosomas 9 y 22, dentro de los loci del protooncogén de Abelson (c-abl) y del gen bcr, respectivamente. El gen bcr codifica para una proteína adaptadora que regula la actividad de proteína tirosina quinasas; el proto-oncogén abl codifica para una proteína tirosina quinasa citosólica. La translocación produce un gen híbrido que tiene secuencias del gen bcr, al principio, y la secuencia que expresa el dominio catalítico del c-abl, en el extremo del gen. Este gen híbrido se transcribe y el mensaje se traduce en una proteína de fusión (BcrAbl), en la que los aminoácidos codificados por bcr activan a los aminoácidos de la región codificada por el gen c-abl. Esta proteína híbrida tiene propiedades oncogénicas, ya que pone en marcha la división celular al mantener constitutivamente activa la vía de transducción de señales a través de Ras. En general, las translocaciones cromosómicas asociadas a cánceres del ser humano afectan mayoritariamente a las células sanguíneas. No obstante, también se han descrito translocaciones responsables de algunos tumores sólidos.

Genes supresores de tumores (4,12,14) Los genes cuya actividad esencial consistía en inhibir una proliferación celular descontrolada fueron primeramente conocidos con el nombre de antioncogenes. No obstante, esta denominación se consideró inapropiada, ya que su mecanismo de acción molecular no consistía en oponerse a la de los oncogenes. Pronto se descubrió que la fusión de células malignas con células normales en cultivo producía la supresión del fenotipo maligno en las células híbridas; por ello recibieron el nombre de genes supresores de tumores. Las mutaciones en estos genes impiden que ejerzan su función normal de control de la división celular. Por analogía con los oncogenes, se dice entonces que han adquirido capacidad oncogénica, dada su implicación en el desarrollo de tumores; por ello se les conoce también con el nom-

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bre de oncogenes supresores. Estas mutaciones pueden producirse tanto en las células somáticas —cáncer espontáneo—, como en las células germinales —cáncer hereditario—. También se les denomina oncogenes recesivos, dado que las mutaciones se transmiten en forma autosómica recesiva, mediante un mecanismo de pérdida de función; esto es, desde el punto de vista celular, las mutaciones son recesivas y las células heterocigóticas no desarrollan tumores. Sin embargo, estas mutaciones son dominantes desde el punto de vista del individuo, dado que los heterocigóticos suelen desarrollar la enfermedad —en realidad, lo que se hereda como rasgo autosómico dominante es la gran predisposición a la formación de tumores—. Esta aparente contradicción se resuelve teniendo en cuenta que sólo se necesita una única célula tumoral, en una población de millones de células, para iniciar un tumor. Se conocen algo más de una docena de genes supresores de tumores. Codifican proteínas que intervienen en la transducción de señales, en la transcripción, en las interacciones célula-célula y, sobre todo, en alguna de las etapas directamente implicadas del ciclo celular (Tabla 8.3). Tabla 8.3. Gen

Algunos ejemplos de genes supresores de tumores y su papel en el cáncer Función del producto génico

Cáncer hereditario

RB1

Interrumpe el ciclo celular al formar un complejo con E2F

Retinoblastoma/osteosarcoma

APC

Interacciona con la catenina ` en la vía de señalización de Wnt

Cáncer de colon familiar con poliposis adenomatosa

NF1

Inhibe la proteína ras

Neurofibromatosis tipo 1

NF2

Enlace entre proteínas de membrana y el citoesqueleto

Neurofibromatosis tipo 2

p53

Induce parada del ciclo celular o apoptosis. Factor de transcripción

Síndrome de Li-Fraumeni

VHL

Regula la elongación transcripcional

Enfermedad de von-Hippel-Lindau

WT1

Factor de transcripción

Tumor de Wilms

p16

Inhibidor de CDK

Melanoma familiar

BRCA1

Interacciona con RAD 51 (proteína reparadora de ADN)

Cáncer de mama y ovario familiar

BRCA2

Interacciona con RAD 51

Cáncer de mama familiar

PTEN

Fosfatasa

Enfermedad de Cowden

AT

Regula el ciclo celular en respuesta al daño en el ADN

Ataxia telangiectasia

ARF

Antagoniza a mdm2 para activar p53

DPC4

Inhibe la división celular

Cáncer de páncreas

Cd95

Responde al daño en el ADN por rayos a

Linfoma de timo

–

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El gen Rb 9 Uno de los ejemplos más característicos que ilustran la diferencia entre genes del cáncer hereditario y genes alterados somáticamente es el responsable del retinoblastoma (Rb) en humanos. Una persona que hereda una copia de un gen mutado del retinoblastoma ha de experimentar una segunda mutación somática, en uno o más retinoblastos, para desarrollar uno o más retinoblastomas. Igualmente, pueden producirse dos mutaciones somáticas en un único retinoblasto de un feto no predispuesto, lo que dará lugar a un retinoblastoma esporádico. Por esta razón, todos los pacientes con retinoblastoma hereditario presentan tumores bilaterales, mientras que los retinoblastomas esporádicos aparecen normalmente en un solo ojo. La eliminación de la copia normal del gen Rb, en una célula retiniana (heterocigótica) que ha heredado una copia defectuosa, puede llevarse a cabo mediante alguna de las siguientes vías: pérdida del cromosoma completo portador del gen normal (monosomía) durante la mitosis; segregación cromosómica errónea y duplicación del único cromosoma portador del gen anormal; recombinación mitótica; conversión génica; deleción y mutación puntual del gen normal. Todas estas situaciones llevan a la pérdida de heterocigosidad para el gen del retinoblastoma en una célula determinada, la cual comenzará a proliferar de forma descontrolada y constituirá el clón que posteriormente dará origen a un tumor. Además del retinoblastoma, otros cánceres humanos también manifiestan la pérdida de heterocigosidad. El gen Rb, situado en el cromosoma 13 (13q14), codifica una proteína nuclear (pRB, de 928 aminoácidos) que se encuentra en todos los tipos celulares, incluyendo tanto las células en reposo como las que se dividen muy activamente. Además, se encuentra presente durante todas las etapas del ciclo celular, en donde funciona sincrónicamente como un conmutador molecular, regulando el avance a través del mismo. Si pRB está desfosforilada —activa—, durante la fase G1, forma un complejo con el factor de transcripción E2F, que queda inactivo. De esta forma pRB actúa como el freno principal del paso a la fase S, deteniendo la división celular. Por el contrario, si pRB está fosforilada —inactiva—, el factor E2F queda libre y por tanto activo, permitiendo la transcripción de los genes que codifican para proteínas necesarias para que la célula avance en el ciclo celular. La fosforilación es catalizada por proteínas quinasas dependientes de ciclinas (concretamente las CDK4 y CDK6), que son activas cuando forman un complejo con las ciclinas D o E. Si las dos copias del gen Rb desaparecen o sufren una mutación en una célula retiniana, la proteína pRB estará ausente o defectuosa, no pudiendo, por tanto, regular la división celular. En este caso, la célula se divide continuamente, formando un tumor. Si esta alteración se produce, por ejemplo, en hueso dará lugar a un osteosarcoma. Como pRB juega un papel esencial en la regulación del ciclo celular, cualquier situación que la mantenga inactiva producirá los mismos efectos sobre la división celular. Así, por ejemplo, la activación del proto-oncogén cdk4, producirá una oncoproteína activa constitutivamente; es decir, que mantiene permanentemente fosfo-

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rilada a la pRB, aun en ausencia de ciclinas, permitiendo que el ciclo celular avance. Igualmente, la inactivación de pRB por interacción con oncoproteínas virales (antígeno T del SV 40, o la proteína E7 del virus del papiloma), permitirá que el factor de transcripción E2F esté siempre activo, enviando una señal continuada de proliferación celular. El gen APC En ocasiones, la aparición de un cáncer puede deberse a la alteración de un solo gen —caso del retinoblastoma—; sin embargo, en otras muchas, el cáncer surge como consecuencia de múltiples eventos moleculares que producen la activación de proto-oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores. Un buen ejemplo lo representa el cáncer de colon familiar con poliposis adenomatosa, en donde, al menos, tres oncogenes (K-ras, neu, myc) y cuatro genes supresores (APC, DCC, p53, HNPCC) han sido caracterizados en algún momento del desarrollo del tumor. Aunque para el desarrollo de tumores malignos, a partir de la mayoría de los adenomas, sea decisiva la suma de los cambios acumulados, en este caso los fenómenos mutacionales suelen producirse en una determinada secuencia. Así, los adenomas más precoces muestran un sólo cambio genético (APC), los intermedios llevan dos o tres y los más tardíos cuatro o cinco. Para la formación del carcinoma y las posteriores metástasis, los demás cambios adicionales también tienen que producirse. Una alteración en el gen APC predispone significativamente al cáncer de colon, y también está implicado en la mayoría de las manifestaciones esporádicas del mismo. Este gen supresor de tumores, situado en el brazo largo del cromosoma 5, funciona como principal regulador de la vía Wnt, un sistema de señalización bien caracterizado desde el punto de vista bioquímico, que interviene en las fases del desarrollo y embriogénesis. Codifica para una proteína que puede modular los niveles de `-catenina, una proteína implicada en la adhesión celular y en la formación de complejos de transcripción. Existen cánceres de colon que presentan el gen APC normal, pero tienen mutado el gen de la `-catenina. El gen p53 (8) Aproximadamente el 50 % de los cánceres humanos se caracteriza por tener formas mutadas del gen supresor de tumores p53. Este gen codifica una fosfoproteína nuclear de 390 aminoácidos, que presenta varios dominios: • • • • •

De activación de la transcripción (aminoácidos: 1-50). De señalización (60-90). De unión al ADN (100-290). De oligomerización (320-350). De unión al ADN dañado (370-390).

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La forma activa de la proteína es tetramérica. Cuando se asocian determinadas formas mutantes con la forma nativa de la proteína, el tetrámero adopta la conformación mutante y es incapaz de funcionar. Por ello, aunque se considera a p53 como un gen supresor de tumores, estas mutaciones ejercen un efecto dominante sobre la transformación celular: Mutantes dominantes negativos. Otras formas mutantes de p53 tienen propensión a amplificar el ADN. No obstante, el 80-90 % de las mutaciones del gen p53 son de sentido erróneo y se concentran en la región del gen que codifica para el dominio de unión al ADN. El gen p53 se activa en respuesta a señales de daño —por irradiación— en el ADN. La proteína P53 actúa como un factor de transcripción que interacciona, al menos, con otros seis genes. Si la célula se encuentra en la fase G1 del ciclo celular, P53 se une al promotor del gen p21, que codifica una proteína inhibidora de CDK4 (p15, p16 y p27 también bloquean la activación de la proteína del retinoblastoma —PRB—). Se detiene el ciclo celular antes de pasar a la fase S, proporcionando tiempo a la célula para la reparación del ADN dañado. Alternativamente, si la célula se encuentra en la fase G2, p53 pone en marcha un programa de muerte celular (apoptosis); esta respuesta se elige también cuando no es posible detener el ciclo celular para reparar el ADN por estar afectada la vía del PRB. No obstante, los mecanismos moleculares que pone en marcha p53 para optar por una vía u otra aún no se conocen. Cuando existen mutaciones en p53, las células con el ADN dañado no detienen el ciclo para su reparación y eluden los programas de autodestrucción, por lo que la proliferación continuada de células con el ADN dañado puede dar lugar a la aparición de tumores El dominio central de unión al ADN capacita a P53 para unirse un palíndromo de 10 pares de bases. Este dominio también es reconocido por determinadas oncoproteínas virales. Los virus que contienen ADN se reproducen —infectan— en células permisivas; por el contrario, cuando un virus entra en células no permisivas, no se produce infección, sino la integración de parte o todo el ADN viral en regiones al azar dentro del genoma del huésped. Por ejemplo, la transcripción y posterior traducción de la región temprana del virus SV40, integrado en una célula huésped da lugar a la aparición de los antígenos T/t. Estos antígenos pueden bloquear el dominio de unión al ADN de la proteína P53, ocasionando la transformación de la célula huésped.

Genes mutadores (6) Se denominan genes mutadores a aquellos que codifican para un sistema de enzimas «correctores de pruebas». Estos genes fueron primeramente estudiados en E. coli y en levaduras, constituyendo los genes Mut HLS. También se les conoce con el nombre de genes reparadores de los errores en el ADN. Detectan los defectos en el apareamiento de bases causados por errores de la transcripción o por agentes mutagénicos exógenos. Los individuos que heredan una mutación en estos genes son constitutivamente heterocigotos, transmitiéndose mediante un mecanismo de pérdi-

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da de función. La ausencia o un defecto en la actividad de los enzimas reparadores, incrementa la tasa de mutación espontánea, lo que aumenta el riesgo de desarrollar tumores. Los homólogos humanos de los genes mutadores fueron localizados en las mismas regiones cromosómicas responsables del cáncer de colon hereditario sin poliposis (HNPCC). Este síndrome de predisposición al cáncer se hereda como un desorden autosómico dominante y constituye un ejemplo de cáncer producido por inestabilidad genómica. La inestabilidad genómica se caracteriza por la presencia en el genoma de microsatélites: Breves secuencias de los nucleótidos CA o CG, repetidas decenas o cientos de veces en un solo sitio, que se encuentran distribuidas por millares de sitios diferentes del genoma. Se han identificado cuatro genes mutadores implicados en este cáncer: hMSH2, hMLH1, hPMS1 y hPMS2.

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9 Apoptosis E. Vara

Muerte celular La muerte celular es un fenómeno fundamental de los organismos biológicos. Es un proceso que ocurre de forma fisiológica durante la organogénesis y embriogénesis y también en el «turnover» celular en el adulto, y como proceso patológico en respuesta a distintos tipos de daño. Hay dos tipos fundamentales de muerte celular que se conocen como necrosis y apoptosis (1) (Fig. 9.1). El término necrosis se refiere a la muerte de la célula por un daño severo y repentino como el debido a un trauma físico o químico y se suele referir a un tipo de muerte accidental en el que la célula pierde rápidamente la capacidad para mantener la homeostasis. En la necrosis, la membrana plasmática suele ser el lugar principal que sufre el daño perdiendo su capacidad para regular la presión osmótica por lo que tanto la célula como los orgánulos subcelulares se rompen esparciendo su contenido al espacio tisular adyacente, provocando así una respuesta inflamatoria. Los leucocitos intentan eliminar los restos de células necróticas para tratar de reparar el daño, pero al mismo tiempo liberan mediadores proinflamatorios que pueden lesionar el tejido normal vecino, amplificando así el daño (1). La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso normal que contribuye a la renovación tisular tanto en el desarrollo como en el estado adulto (1,2). Durante el desarrollo, la apoptosis está implicada en diversos procesos tales como la selección clonal negativa, remodelación de tejidos y diferenciación celular, y se ha sugerido que este fenómeno podría jugar un papel complementario a la vez que opuesto, a la mitosis en el mantenimiento de la homeostasis celular (3). La apoptosis está también implicada en procesos patológicos, tales como la muerte de células tumorales, enfermedad de injerto contra huésped, respuesta al estrés celular, exposición a compuestos citotóxicos y puede funcionar también en la patogénesis de algunas enfermedades degenerativas. Podríamos decir que la apoptosis es un

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

NECROSIS

APOPTOSIS

Fagocitosis

Figura 9.1.

Muerte celular por necrosis y apoptosis.

proceso fisiológico y sutil mediante el cual la célula activa una serie de mecanismos que desencadenan en última instancia su propia autodestrucción de una forma discreta y programada. Así, la apoptosis es equivalente a un suicidio celular.

Cambios bioquímicos y estructurales Los cambios mas característicos observados en una célula que sufre apoptosis (1-4) incluyen alteraciones de la membrana plasmática, condensación de la cromatina, reducción del tamaño celular, formación de poros en la membrana nuclear y finalmente fragmentación de la célula en los llamados cuerpos apoptóticos, en los que distintos componentes celulares están rodeados y sellados por una membrana plasmática que no permite que salga nada al exterior por lo que no se provoca reacción inflamatoria, a diferencia de lo que ocurría en la necrosis. Estos cuerpos apoptóticos son reconocidos por células fagocíticas adyacentes que se encargan de su eliminación (Fig. 9.1). Este proceso de eliminación por fagocitosis puede efectuarse en etapas más tempranas del proceso apoptótico y muy frecuentemente no se llega al último paso de fragmentación total de la célula. También la membrana celular sufre alteraciones durante la apoptosis. Las células pierden el contacto con las células vecinas y comienzan a aparecer «ampollas» hasta que la célula adquiere una forma característica «blebbing» previa a la formación de los cuerpos apoptóticos. Además en los primeros estadios de la apoptosis la

APOPTOSIS

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célula pierde la asimetría de los fosfolípidos de membrana y los residuos de fosfatidil serina (PS), que en una célula normal se encuentran en la cara interna de la membrana, se reorientan hacia la superficie externa de la membrana celular. En cuanto a la mitocondria, aunque su estructura permanece intacta, durante la apoptosis hay una alteración del potencial de membrana debido a cambios en la distribución de H+ y otros iones a través de la membrana mitocondrial. Estos cambios en el potencial de membrana ocurren muy tempranamente, antes de la fragmentación del ADN e incluso antes de la reorientación de los residuos de PS y parecen estar mediados por canales transmembrana que regulan el potencial iónico de la célula (4). En cualquier caso, el hecho más característico de la apoptosis es la fragmentación del ADN por lo que cuando se examina por electroforesis se observa una escalera de bandas múltiplos de 180-200 pares de bases. Cada cromosoma eucariótico contiene una molécula de ADN que debido a su gran tamaño debe plegarse y compactarse de forma ordenada dentro del núcleo de la célula formando complejos compactos con proteínas, preferentemente histonas, constituyendo lo que se denomina la cromatina. Las histonas son proteínas relativamente pequeñas, enriquecidas con residuos de arginina y lisina cargados positivamente, que se agregan para formar una especie de bolsas alrededor de las cuales el ADN se enrolla dando lugar a los llamados nucleosomas que se conectan entre sí por fibras delgadas de ADN. La longitud del ADN asociada con cada uno de los nucleosomas es de aproximadamente 180-200 pares de bases. Cuando se produce una respuesta apoptótica se activa una endonucleasa endógena que degrada al azar al ADN que une nucleosomas adyacentes en la fibra de cromatina ya que este ADN internucleosomal es más accesible al ataque enzimático que la región nucleosomal protegida por las histonas. La acción de la endonucleasa genera de esta forma varios fragmentos de ADN múltiplos de 180-200 pares de bases. La separación ulterior del ADN y la posterior electroforesis en geles de agarosa del ADN aislado permite visualizar, tras tinción con bromuro de etidio, la escalera típica de fragmentos de ADN característica de la apoptosis (Fig. 9.2).

Genes implicados en la apoptosis Para que el procero apoptótico se desencadene, es necesario que se activen en la célula una serie de mecanismos que en muchos casos van a estar controlados a nivel genético (4). Los mejores ejemplos de genes implicados en la apoptosis han sido definidos en invertebrados, sobre todo en Caenorhabditis elegans, un nematodo en el que se han realizado una gran parte de los estudios sobre este proceso y en el que se identificaron genes implicados en el inicio de la apoptosis (eg-1, ces-1, ces-2), en el proceso mismo de la apoptosis (ced-3, ced-4, ced-9), en la fagocitosis de las células apoptóticas (ced-1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7, ced-8, ced-10) y en la digestión y degradación de la célula muerta (nuc-1); de todos ellos han resultado ser especialmente interesantes el ced-9 que es un supresor de la apoptosis y el ced-3 que es

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Nucleosoma Cromatina –

Digestión por endonucleasa Electroforesis

Dirección de migración

180-200 bp

180-200 bp +

Figura 9.2.

Fragmentación del ADN en fragmentos múltiplos de 180-200 bp.

necesario para que se produzca la apoptosis. Estos genes se habían identificado en invertebrados, pero la apoptosis es un proceso conservado a lo largo de la evolución. Esta sugerencia de conservación evolutiva fue sugerida por la confluencia de estudios genéticos realizados en nematodos y en células tumorales. Tres tipos de proteínas (Tabla 9.1) parecen ser críticos en esta vía tan conservada: a) Proteínas reguladoras. Pueden promover o reprimir la apoptosis. b) Adaptadores. Interaccionan tanto con los reguladores como con los efectores. En ausencia de factores tróficos promueven la activación de los factores.

Tabla 9.1.

Tipos de proteínas implicadas en la apoptosis

Reguladores C. Elegans Vertebrados

Adaptadores Ced-9 Bcl-2

Ced-4 Apaf-1

Efectores Ced-3 Casp9

A Muerte celular A Casp3 A Muerte celular

APOPTOSIS

Tabla 9.2.

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Inductores de apoptosis

Activadores fisiológicos Proteínas de la familia del TNF (TNF, Fas L) Ausencia de factores de crecimiento Glucocorticoides

Inductores de daño Células T citotóxicas p53 Radicales libres de oxígeno

Agentes asociados a terapias Quimioterapia Radiación Y Radiación UV

Toxinas Etanol

c) Efectores. Son una familia de cistein proteasas cuya activación conduce a la degradación de varios sustratos celulares y finalmente a la muerte celular. El control de la apoptosis implica diferentes mecanismos y/o factores que inducen o reprimen la apoptosis. El balance entre inductores (Tabla 9.2) e inhibidores (Tabla 9.3) va a determinar si la célula vive o muere. En muchos casos la apoptosis es iniciada por la unión de un ligando a un receptor específico y han sido descrita una familia de receptores que puede disparar específicamente la apoptosis. Estos receptores, «death receptors» (4,5), se caracterizan por poseer dominios extracelulares ricos en cisteína, y un dominio intracelular que acopla los receptores a la maquinaria inductora de apoptosis. Miembros de esta familia incluyen el CD95 (Apo 1 o Fas), TNF-R1, FADD (Fas activating death domain), TRADD (TNF-R1 asociated death domain) y RIP (receptor interacting protein). De todos ellos el mejor caracterizado es el Fas. Todos ellos poseen una región homóloga de 70 aminoácidos (death domain) necesaria para la transmisión de la señal de muerte y que está muy conservada filogenéticamente. Los ligandos que se unen a estos receptores (oncogene related products) también presentan estructuras homólogas, lo que se refleja en mecanismos similares de reconocimiento del receptor e iniciación de la respuesta. Estos ligandos (excepto el Lt_) son sintetizados como proteínas transmembrana, a partir de las cuales se puede generar una forma soluble por acción de metaloproteasas. El papel de estas formas solubles no está claro y aunque en algunos casos se ha reportado actividad para estas formas solubles, otros autores piensan que solo es capaz de inducir apoptosis la forma unida a membrana. In vivo, la activación de los «death receptor» es controlada en muchos casos por la expresión «de novo» de sus respectivos ligandos. Tabla 9.3.

Inhibidores de apoptosis

Inhibidores fisiológicos Factores de crecimiento Proteínas reguladoras Andrógenos Estrógenos bcl-2

Agentes virales

Otros

Adenovirus

Ciertos agentes farmacológicos

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Acoplamiento entre estímulo y apoptosis Aunque en el acoplamiento entre estímulo y el proceso final de apoptosis van a estar implicadas diferentes señales, en la mayor parte de los sistemas apoptóticos está implicada una actividad proteolítica. Se puede considerar la proteólisis como un fenómeno común en todos los procesos apoptóticos, con diferentes proteasas implicadas y distintas proteínas como diana de esta actividad proteolítica. Los candidatos mas importantes como mediadores finales de la apoptosis son las caspasas (4,6). Las caspasas son una familia de cistein proteasas de las que se conocen al menos 14 homólogos aunque no todos han sido asociados a la apoptosis. Los genes codificantes de caspasas codifican proenzimas que requieren una ruptura proteolítica para su activación. Las caspasas pueden propagar la señal apoptótica rompiendo/activando otras caspasas o pueden intervenir en el proceso final rompiendo sustratos (6). Por ejemplo, la caspasa 8 activa a la caspasa 3, mientras que ésta actúa sobre proteínas diana específicas como poly-ADP polimerasa, laminina, actina, quinasa dependiente de ADN, etc. En mamíferos (7), la vía más importante de iniciación de la apoptosis es vía Fas (Fig. 9.3), que es un receptor de superficie relacionado con el receptor de TNF (su ligando el Fas L está relacionado con el TNF). La unión de un ligando al receptor inicia la activación de una proteasa lo que conduce a la liberación de citocromo c de la mitocondria lo que a su vez activa a otras proteasas, siendo el resultado final la destrucción de las estructuras celulares. El TNF-R está unido a una proteína llamada TRADD (TNF-R asociated death domain) que a su vez se encuentra unido a FADD (Fas activating death domain) mientras que el receptor Fas se encuentra unido a FADD. En ambos casos FADD se une a la caspasa 8 (FLICE), la cual tiene un dominio de muerte, «death domain» y una actividad catalítica proteasa que inicia un camino común. La caspasa 8 hidroliza a la proteína Bid liberando el extremo C-terminal que se transloca a la membrana mitocondrial e induce la liberación del citocromo c. El citocromo c induce la interacción de una proteína, Apaf 1, con la procaspasa 9; esto causa una autohidrólisis que activa a la caspasa 9 que a su vez hidroliza a la procaspasa 3 para dar lugar a la caspasa 3 activa (7) (Fig. 9.4). La caspasa 3 puede ser considerada el efector de la vía y es la que va a actuar sobre los sustratos diana, lo que implica hidrólisis de proteínas y ADN. La fragmentación del ADN implica la hidrólisis por parte de la caspasa 3 de una subunidad del dímero DFF (ADN fragmentation factor). La otra subunidad activa a una nucleasa que degrada ADN (6). El camino descrito es la vía que podríamos llamar prototípica, pero el Fas también puede activar la apoptosis por un camino que implica una quinasa, la JNK quinasa, cuyo sustrato predominante es el factor de transcripción c-jun. Esto conduce, por mecanismos no bien conocidos, a la activación de proteasas (Fig. 9.4). En este camino juega un papel importante como mediador la proteína Daxx que reconoce en FADD un sitio diferente a Fas por lo que ambos caminos pueden funcionar independientemente. Es probable que la activación de Fas active ambas vías de apopto-

APOPTOSIS

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TNF-R1

Fas/TNF-R1

FADD

Caspasa-8

Bid

Anti-apoptosis Bcl-2 Mitocondria Caspasa-9 Apaf-1

Caspasa-3 DFF

Degradación de proteínas

Daño de membranas Ruptura del ADN

Figura 9.3.

Camino clásico de iniciación de la apoptosis mediada por Fas.

sis y la importancia relativa de ambos caminos puede variar dependiendo del tipo de célula y/o la señal que reciba. La liberación de citocromo c es un punto importante de control de la apoptosis (7,8). A este nivel parecen jugar un papel regulador importante una serie de proteínas de la familia bcl 2, entre las que se incluyen bcl 2, que tiene un papel regulador antiapoptótico y bid que ya hemos visto que favorecía la apoptosis. Otros miembros de la familia bcl 2 pueden jugar un papel importante en la regulación de la apoptosis favoreciéndola (bclxs, bax) o inhibiéndola (bclxL). Estas proteínas de la familia bcl 2 pueden estar en forma de homodímeros o heterodímeros y parece necesaria la formación del homodímero bcl2/bcl2 para que pueda ejercer su papel protector, mientras que los heterodímeros bcl2/bax o bcl2/bclxs no protegen. Se puede concluir que las diferentes asociaciones entre miembros de la familia pueden producir dímeros con diferentes efectos en la apoptosis y que la expresión relativa entre los diferentes miembros de la familia puede ser importante. La sus-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Fas/TNF-R1

Daxx

JNK

C-Jun

C-Jun

Caspasas

APOPTOSIS

Figura 9.4.

Apoptosis, vía Fas, mediada por JNK quinasa.

ceptibilidad de una célula a la apoptosis parece ser proporcional a la relación entre ellos. Un hecho importante es que todas las proteínas de esta familia parecen actuar a nivel de la membrana mitocondrial, así por ejemplo, Bid favorece la liberación de citocromo c y bcl2 la inhibe; bax probablemente está implicado en los cambios de potencial de membrana. Se ha sugerido (8) que el papel inhibidor de los factores de crecimiento sobre la apoptosis se deba a la inhibición de estos reguladores proapoptóticos. En presencia de factores tróficos (por ejemplo NGF que protege a las neuronas de la muerte celular) se estimula la PI3 quinasa que a su vez activa la AKT-quinasa que fosforila a Bad. Bad cuando está fosforilado forma un complejo con la proteína 14-3-3 y permanece en el citosol formando un complejo antiapoptótico que puede inhibir a Bax previniendo la liberación de citocromo c y la activación de la cascada de caspasas. En ausencia de factores tróficos, no se activan las quinasas, Bad no se fosforila y se une a las proteínas antiapoptóticas impidiendo que inhiban a Bax. Bax forma

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canales que permite el flujo de iones lo que implica la liberación de citocromo c y activación de las caspasas. Otro posible camino (9) apoptótico es el disparado por los linfocitos T citotóxicos, los cuales matan a las células diana por un proceso que implica la liberación de gránulos conteniendo serin proteasas y otros componentes líticos como perforina y granzimas. La granzima B puede iniciar algunos de los hechos característicos de la apoptosis incluyendo la activación de caspasas y fragmentación del ADN.

Papel del p53 en la apoptosis El p53 (10) es una proteína que se une al ADN y que normalmente se encuentra en forma de tetrámero. Puede actuar como activador transcripcional de una serie de genes diana, pero también puede tener un papel como represor transcripcional, probablemente por interacción con factores de la transcripción. Además puede interaccionar con otras proteínas celulares y él mismo es molécula diana para ciertas proteínas virales. Su papel esencial es la prevención de la proliferación de células portadoras de mutaciones. En una célula normal los niveles de p53 son bajos; en respuesta al estrés genotóxico el p53 se activa (y esto implica también un aumento de sus niveles) y dos tipos de acontecimientos son iniciados como consecuencia de esta activación: Parada del crecimiento celular y apoptosis. El p53 bloquea el ciclo celular tempranamente (fase G1) lo que permite la reparación del ADN dañado antes de entrar en la fase S; en este aspecto, parece que el p53 podría intervenir directamente en la reparación del ADN y/o probablemente activar enzimas reparadoras. Si una célula está en fase de división, entonces el p53 inicia un programa de muerte celular. En resumen, cuando una célula normal sufre una lesión en su ADN tiene la posibilidad de dos respuestas, detener el ciclo celular o bien seguir la apoptosis. La decisión de seguir una respuesta u otra dependerá en primer lugar del ciclo en el que se encuentre la célula, pero también depende del tipo de célula y de factores extrínsecos medioambientales (2,11-13). Los desencadenantes de la apoptosis dependiente de p53 incluyen, además de las lesiones del ADN, la activación inapropiada de oncogenes, citoquinas, hipoxia o el shock térmico. Los mecanismos moleculares por los que actúa el p53 no son totalmente conocidos, pero parece que es necesaria la transcripción de Bax, que cuando supera los niveles de bcl2 induce la apoptosis (10). La apoptosis dependiente de p53, inducida por lesiones en el ADN, es crítica en el embrión para evitar la teratogénesis radio-inducida y en la supresión de carcinogénesis en especial en los tejidos hematopoyético y linfático. La apoptosis dependiente de p53 que se produce en respuesta a una proliferación inadecuada inhibe la carcinogénesis en un estadio precoz al destruir células potencialmente neoplásicas (10).

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Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatológicos El hecho de encontrar que el p53 y otros protooncogenes están implicados en la regulación de la apoptosis de las células neoplásicas ha sido un hallazgo importante en el campo de la oncología, ya que el proceso apoptótico parece estar relacionado con la progresión tumoral y con la respuesta de las células tumorales a los diferentes tratamientos. Se puede destacar el caso de los adenocarcinomas gástricos y sobre todo colorectales en los que la progresión tumoral está directamente relacionada con la apoptosis, cuya determinación en el laboratorio podría incluso servir para la clasificación y seguimiento post-quirúrgico de estos tumores (14). Pero además del cáncer cada vez es más evidente que la apoptosis puede jugar un papel importante en la patogénesis de un gran número de enfermedades. En este aspecto hay que considerar dos tipos de alteraciones, las asociadas al incremento de apoptosis (14,15) o sea, con un aumento de muerte celular, y aquellas asociadas a una disminución de la apoptosis (15-18), lo que resulta en una supervivencia prolongada. Entre las enfermedades asociadas a la inhibición de la apoptosis se encuentran varios tipos de neoplasia, como los tumores dependientes de hormonas, cáncer de próstata, de ovario o de mama; carcinomas que expresan mutaciones en el p53, linfomas foliculares, algunas enfermedades autoinmunes y algunas enfermedades virales. Otras enfermedades o situaciones se asocian con un incremento de la apoptosis, entre ellas el SIDA, algunas enfermedades degenerativas (Alzheimer, Parkinson), síndromes mielodisplásicos (anemia aplásica), lesiones isquémicas (infarto de miocardio o síndrome de isquemia-reperfusión), enfermedades hepatotóxicas (alcoholismo) y enfermedades autoinmunes (diabetes).

Modulación de la apoptosis por óxido nítrico Se acepta generalmente que el óxido nítrico (NO), y sus productos de reacción, pueden tanto prevenir como inducir apoptosis. El NO podría ser uno de los factores responsables del daño celular en respuesta a diferentes situaciones patológica y recientemente, ha sido sugerido para el NO un papel como modulador de la apoptosis (19), aunque sin embargo su papel no ha sido completamente aclarado y se han descrito tanto efectos proapoptóticos como antiapoptóticos para esta molécula. El NO es una molécula de vida media corta sintetizada a partir de L-arginina por acción de las NO sintasas. Estos enzimas son expresados en microorganismos, plantas y mamíferos y participan en diferentes funciones fisiológicas incluyendo la neurotransmisión, regulación del tono vascular, comunicación celular, inflamación y respuesta inmune. En mamíferos se expresan tres isoformas distintas de nitrato sintasa, la nNOS (neuronal tipo 1) y eNOS (endotelial tipo 3) que son constitutivas y se regulan predominantemente a nivel postranscripcional, y una isoforma inducible iNOS (tipo 2) que puede ser inducida en respuesta a varios estímulos. Las formas constitutivas son importantes en los procesos fisiológicos, mientras que el NO gene-

APOPTOSIS

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rado por la iNOS funciona tanto como regulador como efector en los procesos de infección e inflamación. Dentro de las funciones efectoras se incluiría la citotoxicidad frente a células tumorales, microorganismos y células huésped. La capacidad citotóxica del NO resulta de la capacidad de interacción del NO con el ión superóxido para formar peroxinitrito que es un potente antioxidante.

Efectos proapoptóticos del NO La capacidad del NO para inducir apoptosis fue descrita por Albina et al. en 1993 (20), que observó que el NO inducia apoptosis en macrófagos; posteriormente se describieron efectos proapoptóticos para el NO en otros tipos celulares. La sensibilidad al NO depende del tipo de célula. Entre las células que muestran mayor sensibilidad se incluyen, además de los macrófagos (20), las células ` de los islotes pancreáticos (21), timocitos (22) y ciertas neuronas (23). Los efectos proapoptóticos del NO parecen ser independientes de la acumulación de cGMP, aunque también han sido descritos efectos apoptóticos para el NO vía activación de la guanilato ciclasa soluble (24), probablemente mediados por una protein quinasa dependiente de cGMP. Aunque los factores que determinan la sensibilidad de los distintos tipos celulares al NO no están totalmente dilucidados, la inducción de apoptosis por NO puede ser el resultado del daño al DNA lo que resultaría en un aumento de los niveles de p53 que, ya se ha dicho, es un indicador primario y esencial de la inducción de apoptosis (25). En cualquier caso, la inducción de apoptosis por NO requiere la exposición a niveles altos de NO. Tales niveles tóxicos de NO podrían ser poco importantes en condiciones fisiológicas, pero se pueden encontrar en ciertas alteraciones patológicas como la sépsis. Es posible además que esta acción del NO rompiendo el DNA pueda estar mediada por la formación del radical peroxinitrito (25).

Efectos antiapoptóticos del NO Han sido descritas también la inhibición de la apoptosis por NO en otros tipos celulares. El NO puede suprimir la apoptosis por dos mecanismos diferentes. A través de la activación de la guanilato ciclasa soluble con el consiguiente aumento de los niveles de cGMP que interrumpe las señales apoptóticas en algunos tipos celulares, incluyendo hepatocitos (26) y esplecnocitos (27). El aumento de los niveles intracelulares de cGMP disminuye la concentración de Ca2+ que es una de las llaves señalizadoras de la apoptosis. En este caso, el mecanismo propuesto también (como en las acciones proapoptóticas) implica la activación de una proteína quinasa dependiente de cGMP. Esta proteína quinasa podría participar en la inhibición de las caspasas lo que a su vez podría limitar la degradación de bcl2. El NO también puede inhibir las caspasas directamente. A través de estos mecanismos, el NO

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puede prevenir la degradación de bcl2 y la liberación de citocromo c de la mitocondrias (27). La decisión de que una célula sufra o no apoptosis depende del balance entre las fuerzas proapoptóticas y antiapoptóticas. El NO parece contribuir de forma importante a este balance suprimiendo el camino apoptótico a diferentes niveles; la inhibición de las caspasas por nitrosilación es el mejor conocido. Sin embargo, niveles muy altos de NO podrían inclinar la balanza en el sentido de la apoptosis. Además, la presencia del ión superóxido podría dirigir el papel del NO en el sentido apoptótico debido a la formación de peroxinitrito.

Resumen La apoptosis es una forma fisiológica de muerte celular. Sus causas y mecanismos de ejecución todavía no son totalmente conocidos y diferentes mediadores, entre ellos NO, estrés oxidativo, Ca2+, proteasas, nucleasas y alteraciones en la mitocondria, han sido implicados. Por otra parte, dado que la apoptosis es un proceso altamente regulado e implica la actividad de enzimas hidrolíticos, condensación de la cromatina y formación de vesículas apoptóticas, es probable que sea un proceso altamente dependiente de energía (28). Alteraciones en los niveles energéticos de la célula (ATP) podrían ser un factor determinante en la decisión de muerte celular por apoptosis o necrosis.

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APOPTOSIS

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10 Terapia génica en células somáticas J. P. García-Ruíz

Introducción La terapia génica tiene como objetivo corregir enfermedades mediante la inserción de un gen funcional en células somáticas. En teoría todas las enfermedades hereditarias como la inmunodeficiencia severa combinada (SCID), la fibrosis quística, la enfermedad de Huntington, la anemia falciforme o enfermedades adquiridas durante la vida de un individuo, como el cáncer o el SIDA, podrían ser tratadas mediante terapia génica. Este sueño, que nació hace 25 años, no es una ilusión sino algo muy complejo que requiere la cooperación y los avances científicos de las distintas áreas de las Ciencias de la Salud, tales como Biología Molecular, Genética, Virología, Endocrinología Molecular, Inmunología, etc. La terapia génica ha resultado ser mucho más compleja de lo que se podía prever por ignorar aspectos básicos y tan importantes como la toxicidad que representa la expresión de un transgén en un sitio inadecuado, o la respuesta inmunológica de algunos de los vectores usados para insertar el transgén. En este sentido, Alain Fisher comenta en un artículo reciente sobre lo «naïve que resultan hoy los primeros intentos de terapia génica sin tener presente el bagaje de los conocimientos actuales» (1). El análisis genético y el uso de técnicas de ADN recombinante han permitido el aislamiento y caracterización de gran número de genes, así como la caracterización de aquellos cuyo defecto es causa de enfermedades hereditarias en humanos. Tanto las enfermedades causadas por una alteración en un único gen, o monogénicas, como las debidas a fallos en varios genes, o multigénicas, tienen interés en terapia génica. Sin embargo, las enfermedades monogénicas son los objetivos prioritarios y en ellas es donde se han obtenido los primeros logros terapéuticos. La terapia génica requiere de la inserción de un gen correcto en una célula somática específica y que éste se exprese adecuadamente durante toda la vida del individuo. Con objeto de entender la complejidad del abordaje de este tipo de terapia y los

130

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

logros conseguidos, resulta necesario recordar algunos conceptos, como qué es un gen y cómo se transcribe, los vectores virales que ofrecen más ventajas en la transferencia génica y cómo se obtienen y cultivan las células somáticas objetivo de la transferencia génica.

Elementos de los genes eucarióticos Un gen puede ser definido como la secuencia de nucleótidos necesaria para la síntesis de una proteína funcional y está compuesto por la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína (secuencia codificante) y por secuencias de nucleótidos no codificantes de proteína pero absolutamente necesarias para la correcta transcripción del gen. Los genes humanos son monocistrónicos y contienen la secuencia nucleotídica que los codifica distribuida en un número variable de exones. Las secuencias no codificantes de proteína se encuentran localizadas entre los exones, intrones, y en ambos extremos del gen. En el extremo 5´ del inicio de la transcripción de los genes, se encuentran las regiones reguladoras de la transcripción, conocidas como enhancers o potenciadores distribuidas a una distancia variable que puede llegar a ser de 50 Kb o mayor. Las otras secuencias no codificantes de proteínas, que igualmente son críticas en la transcripción correcta de un gen, son las señales de corte y poliadenilación localizadas en el extremo 3´ del gen y las secuencias que intervienen en el splicing o ayuste de los transcritos primarios. La complejidad de los genes es variable. Los hay que producen un solo tipo de transcrito que codifica para una proteína (unidades de transcripción simple), y otros cuya transcripción es compleja. Estos últimos son genes que tienen varios sitios de iniciación de la transcripción regulados por distintos elementos y/o que cuyos transcritos primarios pueden ser procesados mediante diferentes pasos. A modo de ejemplo sirve la transcripción del gen del receptor de la hormona prolactina. La transcripción del único gen del receptor puede ser regulada desde tres regiones diferentes localizadas en el extremo 5´ del gen y, además, presenta una transcripción alternativa de exones que da lugar a varias moléculas de ARNm, cuya composición es parcialmente distinta, y que son traducidas en las conocidas isoformas del receptor de prolactina (2). Cualquier mutación en la secuencia nucleotídica de los exones, intrones o regiones reguladoras de un gen puede ocasionar alteraciones en la expresión de una proteína. Con este concepto de gen es fácil darse cuenta de la cantidad de trabajo pendiente de realizar para conocer todos los genes humanos.

Inicio de la transcripción de un gen codificante para una proteína Los factores que determinan que los genes codificantes de proteínas en los organismos pluricelulares tengan una velocidad de transcripción específica de tejido son muchos, incluyendo las decisiones tomadas por las células durante el desarrollo

TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS

Estado celular y desarrollo Conformación y accesibilidad del DNA

131

Ligandos neuroendocrinos/receptores

Segundos mensajeros

ARN polimerasa II Factores de transcripción Activadores e inhibidores

5’

TATA

Promotor distal

Figura 10.1.

Promotor proximal

3’

Iniciación

Elongación

Terminación

Esquema de los factores implicados en la transcripción de un gen.

(Fig. 10.1). La enzima que cataliza esta reacción es la ARN polimerasa II (3). Esta proteína reconoce una secuencia o «caja» TATA presente en el extremo 5´ no codificante del gen y hace que la ARN polimerasa II se asocie a la secuencia existente entre –35 y –10 del codón de iniciación. La región, que ocupa aproximadamente 200 pb anteriores al sitio de iniciación de la transcripción, constituye la región promotora donde existen secuencias consenso para la unión de distintos factores de transcripción. Hay genes que tienen otra región promotora más alejada del inicio de la transcripción llamada promotor distal. La transcripción de un gen, así como la activación como la represión, es consecuencia de la unión de los factores de transcripción a sus sitios consenso, la adecuada activación de éstos y de la cooperación de interacciones entre los factores de transcripción y el complejo de iniciación de la transcripción (4). Este proceso es más complejo en algunos genes ya que pueden utilizar promotores alternativos. Los factores neuro-endocrinos y citoquinas regulan la expresión génica mediante la unión a sus respectivos receptores y la activación de las cascadas de reacciones celulares que modulan la expresión de los factores de transcripción y/o el estado de activación de éstos. Los genes que codifican proteínas suponen únicamente el 5 % del genoma humano. La accesibilidad de un gen dentro de la estructura de la cromatina a los factores proteicos implicados en la regulación del inicio de la transcripción es crítica en la expresión de éste. La estructura de la cromatina es muy compacta. La doble cadena de ADN se dispone alrededor de un octámero de proteínas, denominadas histonas, constituyendo la unidad estructural de la cromatina: el nucleosoma. Una secuencia de seis nucleosomas espaciados por regiones que asocian a la Histona tipo 1, His1, forma un selenoide donde las His1 quedan en el interior de una estructura muy compacta. El grado de condensación de la cromatina se regula por la acetilación de la región amino-terminal de la His1. Cuando la cromatina está conden-

132

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

sada, los factores de transcripción no pueden acceder a las regiones reguladoras de muchos genes (5). Este hecho, entre otros factores, supone que la expresión de algunos genes sea específica de tejido.

Transferencia de un gen a una célula somática La transferencia de un gen a una célula es un proceso que tiene lugar normalmente ex vivo, es decir, en células explantadas de un paciente, las cuales, una vez modificadas genéticamente, seleccionadas y expandidas in vitro son reimplantadas en el mismo paciente (6,7). Existen muchos métodos para la introducción de material genético en células en cultivo, cuya eficacia es variable en función del tipo de célula. La manera más eficaz de transferir un gen a células somáticas es con la ayuda de vectores derivados de virus. Existen vectores virales derivados de los Retrovirus, Adenovirus, Herpesvirus y Parvovirus, tales como el virus asociado a Adenovirus (AAV) entre otros. Todos los vectores conservan la capacidad de infectar células y son manipulados genéticamente para que transporten el gen objeto de la terapia. De todos los posibles vectores virales, los más idóneos son aquellos cuyo ciclo biológico comprende una fase de integración en el ADN genómico teniendo menor interés aquellos que se mantienen como elementos episomales o aquellos que activan una respuesta inmunológica del huésped.

Vectores derivados de oncorretrovirus Los vectores más utilizados en terapia génica son los derivados de los Oncorretrovirus, concretamente los derivados del virus de la leucemia murina (MoMLV) (8). Las partículas del MoMLV están formadas por dos moléculas idénticas de ARN, y las enzimas que requiere el virus para su replicación rodeadas por la nucleocápsida y por la envoltura viral. Esta última se compone de una glicoproteína viral y fracción de membrana perteneciente a la célula huésped donde se replicó el virus. La molécula del ARN viral presenta en la mitad dos fases abiertas de lectura (ORF) (Fig. 10.2). La primera ORF corresponde a dos genes en tándem: gagpol, que codifican para una poliproteína precursora de la proteína de la nucleocápsida (GAG), la transcriptasa inversa (RT) y de la integrasa (IN). La segunda ORF constituye el gen env que codifica las proteínas de la envuelta viral (ENV) y es responsable del reconocimiento de los receptores de la célula en el proceso de infección, denominado tropismo viral. En el extremo 5´ contiene varias regiones no codificantes: R, que se repite en sentido directo en el extremo 3´; U5, que contiene la señal de poliadenilación del ARN; PBS, lugar donde hibrida un ARNt cebador usado en la actividad RT; SD, secuencia donadora de splicing, y s, necesaria para la encapsidación del ARN en las partículas virales. En el extremo 3´ tiene secuencias no codificantes, como PPT (Poly Purina Track) necesarias para la síntesis de la segunda cadena de ADN viral, y la U3, que corresponde al promotor viral.

TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS

133

A gag-pol R

U5

PBS ^

PPT U3

R

env SD

SA

B gag

pol

LTR

LTR env

Figura 10.2. Esquema de la molécula ARN del virus de la leucemia murina (A). Esquema del ADN viral correspondiente al virus citado (B).

El ciclo de replicación de un retrovirus se muestra en el esquema de la Figura 10.3. La infección viral empieza cuando la glicoproteína de la envoltura viral interacciona con los receptores presentes en las células suceptibles de la infección, fusionándose los componentes de membrana de la envoltura viral y de la célula. El ARN es transcrito por las moléculas de RT dando lugar sucesivamente a una cadena de ADNc y al ADN viral de doble cadena. El ADN es transportado al núcleo en forma de un complejo con las proteínas, ING, GAG y otras, llamado complejo de pre-integración (PIC). El PIC es de gran tamaño molecular por lo que la entrada al núcleo se logra cuando la célula está en mitosis. El provirus es integrado en el ADN cromosómico en sitios no predeterminados de éste y es catalizado por la actividad integrasa viral que elimina dos nucleótidos de ambas LTR (Long Terminal Repeat) y corta el ADN cromosómico. Los vectores derivados de MoMLV, y en general de los retrovirus, son virus que han sido modificados para que pierdan su capacidad de propagación (8). Mediante ingeniería genética se retiran los genes virales gag-pol y env y se introduce el gen de interés terapéutico (Fig. 10.4). La propagación de los vectores en células se puede conseguir suministrando los productos de los genes gag-pol y env de diversas maneras: mediante el uso de virus auxiliares; cotransfectando con vectores de expresión que codifican para los genes gag-pol y env; o usando células empaquetadoras. Las células empaquetadoras son células modificadas para expresar constitutivamente los genes correspondientes a las proteínas virales antes mencionadas y así obtener las denominadas partículas transferentes de los genes terapéuticos (Fig. 10.5). Se dispone de muchos tipos de células empaquetadoras, ya que el gen env, responsable del tropismo, puede ser modificado. Por ejemplo, sus-

134

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Virus infectivo

Transcripción reversa

Producción de proteínas virales ADN viral

Integración ARN viral ADN celular

Provirus

ADN celular

Encapsidación del ARN viral

núcleo citoplasma

Liberación de partículas virales

Figura 10.3.

Esquema mostrando el ciclo de replicación de un retrovirus.

tituyendo parte del gen env por el gen de la hormona eritropoyetina, se obtienen partículas transferentes que reconocen las células que expresan el receptor de esta hormona.

Vectores derivados de los lentivirus Otros vectores retrovirales con gran futuro son los generados a partir de los lentivirus. Éstos tienen, tanto el genoma, como el ciclo de replicación, más complejo Sitio de integración

Sitio de integración

PPT PBS

Inicio de la transcripción

Figura 10.4.

SD

^ TRANSGÉN

LTR

LTR

Término de la transcripción

Esquema de una partícula transferente de un transgén derivada de un retrovirus.

TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS

135

Vector con el transgén Producción de proteínas virales

Encapsidación del vector transgén gag-pol

env núcleo citoplasma

Liberación de partículas transferentes del transgén

Figura 10.5. quetadora.

Esquema mostrando la producción de partículas transferentes en una célula empa-

que los oncorretrovirus. Sin embargo, los lentivirus, en término de aplicabilidad clínica, además de incorporarse al genoma, infectan células que no están en división (9,10). Los vectores más estudiados son los derivados del virus de la inmunodeficiencia humana HIV-1 (Fig. 10.6). En el genoma del HIV-1 hay genes accesorios que juegan un papel importante en el ciclo de replicación, como tat, rev y vpr. La proteína TAT activa el promotor HIVLTR, y la REV junto a la VPR intervienen en el transporte del ADN viral al núcleo. El complejo de preintegración (PIC) de los lentivirus tiene asociadas varias proteínas, entre ellas la proteína VPR capaz de unirse al poro nuclear, mientras que la integrasa y la proteína de la matriz (GAG) tienen dominios que actúan de chaperonas del complejo facilitando su transporte al tat rev

pol LTR

gag

rev LTR

vif vpr

Figura 10.6.

Esquema del genoma de de HIV-1.

vpr

nev

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

núcleo. Recientemente se ha demostrado que la secuencia PPT juega un papel importante en el transporte del PIC al núcleo (11). Esta secuencia interviene en la generación de una triple hélice de ADN importante en la estructura del complejo PIC. La generación de la triple hélice se produce mediante el siguiente proceso (Fig. 10.7). La transcripción inversa que sufren las dos copias del ARN presentes en la partícula viral, empieza con la síntesis de la hebra (-). La síntesis de la hebra (+) es discontinua y los segmentos a la derecha e izquierda se sintetizan independientemente. Desde el PPT se inicia uno de estos segmentos (+) que cuando se une al segmento generado en dirección contraria, da lugar a un segmento solapante de 99 nucleótidos conocido como flap. La triple cadena así generada es importante en la estructura del complejo PIC para que sea transportado al núcleo, como ha sido demostrado con mutantes de la región PPT.

Transcriptasa inversa

ADNc viral PPT

Hebra – Hebras + Complejo de pre-integración

Poro nuclear

Figura 10.7. Esquema que muestra la formación del complejo de preintegración de un lentivirus y su entrada por el poro nuclear de la célula infectada.

TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS

137

La mayoría de los vectores lentivirales derivan del HIV-1 (9,10). También hay vectores derivados del HIV-2 (12), del virus de la inmunodeficiencia de simios, SIV (13) y equinos (14). Las estrategias seguidas han sido realizadas para cambiar el tropismo natural del virus por el receptor CD4 de macrófagos y linfocitos T, manipulando el gen env y la generación de células empaquetadoras. Mediante estos vectores se ha conseguido introducir genes en hígado, retina, músculo y neuronas.

Células diana de la terapia génica Los tejidos de los animales adultos tienen un número variable de células embrionarias que sirven para los procesos de regeneración. Estas células pueden ser aisladas, expandidas in vitro e implantadas en un mismo individuo sin disparar la respuesta del sistema inmmune. La médula ósea del hombre adulto es una fuente asequible y excelente de células pluripotenciales del sistema inmuno-hematopoyético y mesenquimales. Las correspondientes al sistema inmuno-hematopoyético se aíslan del resto porque expresan el antígeno de superficie CD34 y, por esto, están siendo ampliamente utilizadas en todos los proyectos de terapia génica del sistema inmune con gran éxito, como veremos en el siguiente apartado. Las células pluripotenciales mesenquimales (MSCs) aisladas de la médula ósea tienen la potencialidad de diferenciarse en cartílago, hueso, tejido adiposo, tendón, etc. (Fig. 10.8) (15). Las células implantadas adquieren el fenotipo del lugar de la implantación como hueso, cartílago, tejido adiposo, músculo, etc. (16,17), y se están empezando a establecer las condiciones y factores necesarios para la diferenciación in vitro (18). Resultan muy interesantes los estudios que muestran la diferenciación de la MSCs en neuronas. El potencial terapéutico de las MSCs es grande. Éstas se aíslan del resto de células de la médula ósea por su capacidad de adherencia. El número de MSCs presentes en la médula ósea varía en relación inversa a la edad de los individuos. Sin embargo, la potencialidad de diferenciación de las MSCs obtenidas de adultos se mantiene inalterada. Estas células pluripotentes amplificadas in vitro son unas dianas excelentes para ser modificadas genéticamente mediante el uso de los vectores antes mencionados, ya que al ser implantadas adquieren el fenotipo adecuado para la expresión del transgén. En estas células descansa el futuro de la terapia génica sin alterar la células germinales de los individuos.

Logro de la terapia génica en la inmunodeficiencia severa combinada (SCID)-X1 La enfermedad hereditaria SCID-X1 se caracteriza por un bloqueo temprano en el proceso de diferenciación de los linfocitos. La causa de esta enfermedad es un defecto en el receptor de citoquinas ac (19). Dos niños franceses con edades de 11

Figura 10.8.

Hueso

Osteocito

Cartílago

Condrocito Hipertrófico

Condrocito

Condrocito Transitorio

Osteoblasto Transitorio

Osteoblasto

Condrogénesis

Osteogénesis

Tendón/ ligamento

Fibroblasto

Fibroblasto Transitorio

Tendogénesis/ Ligamentogénesis

Músculo

Miotúbulo

Fusión Mioblástica

Mioblasto

Miogénesis

Médula

Célula Estromal

Célula Estromal Transitoria

Estroma Celular

Esquema de la diferenciación de las células pluripotenciales mesenquimales aisladas de la médula ósea.

Maduración

Diferenciación

Expansión clonal

Destino

Proliferación

Célula Mesenquimal Progenitora

Proceso Mesengénico

Tejido conjuntivo

Adipocito Célula Dermal Otros

Otros

138 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS

139

y 8 meses que padecían dicha enfermedad han sido pioneros en experimentar con éxito la terapia génica (20). A ambos pacientes se les extrajo médula ósea y se aislaron las células progenitoras del sistema inmunitario mediante bolitas magnéticas tapizadas con el anticuerpo anti-CD34. Las células progenitoras CD34+ se amplificaron en placas tapizadas con fibronectina y en medio de cultivo definido. El medio contenía IL-3, factor de diferenciación de megacarioticitos y el tiempo de incubación empleado fue de 24 horas. El gen humano completo codificante para el receptor ac fue introducido en un vector oncorretroviral llamado MFG-ac y empaquetado en una línea de células disponibles en el mercado. El sobrenadante de las células conteniendo 500.000 partículas transferentes por ml fue utilizado para infectar durante tres días las células progenitoras CD34+ aisladas de ambos pacientes. Transcurrido este tiempo, las células se lavaron y fueron retornadas a la médula de los respectivos pacientes. Los resultados del seguimiento efectuado durante 10 meses a los dos pacientes, muestran que la expresión del transgén comienza a las dos semanas de la infusión de las células en la médula y consecuentemente se llega a alcanzar unos niveles de linfocitos T, B y NK, similares a los controles sin enfermedad. Además los pacientes muestran una funcionalidad del sistema inmunitario totalmente normal cuando fueron vacunados de la polio, el tétano y la difteria. Gracias a la terapia génica, estos niños destinados a vivir en una burbuja o recibir un transplante alogénico llevan casi dos años haciendo vida normal con la única molestia de dos inyecciones en la médula.

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11 Introducción a la Biotecnología y generalidades sobre cultivos celulares A. Martínez Mogarra

Definición En líneas generales podemos definir la Biotecnología como la utilización industrial de seres vivos para la obtención de sustancias de interés. Como vemos se trata de una definición muy amplia por lo que no debe sorprendernos el hecho de que la Biotecnología sea casi tan antigua como la civilización. Los procesos biotecnológicos más antiguos de los que se tiene conocimiento son las fermentaciones para obtener bebidas alcohólicas o la aplicación de pan mohoso a las heridas que los antiguos egipcios practicaban como profilaxis de las infecciones. En la actualidad existe una larga lista de productos obtenidos por la Biotecnología que afecta a todos los órdenes de la vida: tejidos, alimentación, caucho, farmacia, medio ambiente. Así pues, atendiendo a la amplitud del campo en el que nos movemos, centraremos nuestra atención en la aplicación de la Biotecnología a las Ciencias de la Salud. La palabra «Biotecnología» deriva de vocablos griegos cuyo significado es «utilización industrial de formas vivas» o «el uso integrado de la ingeniería, la bioquímica y la microbiología para conseguir la aplicación tecnológica de las capacidades de microorganismos, células de tejido cultivado y sus partes». En el campo de la salud, existe una multitud de productos de origen natural debido en general a que su elevada complejidad estructural hace muy difícil su síntesis. Incluso algunos productos como las vacunas, son organismos vivos o partes de ellos. Hace 20 o 30 años habríamos podido decir que la Biotecnología farmacéutica era la obtención de fármacos a partir de substratos naturales. El conocimiento actual de la Biología es lo que nos ha permitido alcanzar el nivel molecular de la vida, abriendo con ello nuevos horizontes de posibilidades en la obtención de sustancias curativas. De hecho y como más adelante volveremos a mencionar, el desarrollo de la tecnología del ADN recombinate y su aplicación industrial ha abierto las puertas de un mundo de posi-

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bilidades tanto en la fabricación de drogas como en la directa terapia sobre enfermos de dolencias hasta la fecha consideradas incurables. No debemos olvidar que el término «droga» que se utiliza habitualmente referido a personas es sin embargo utilizable en la salud animal y que la farmacia veterinaria tiene también un peso económico importante. Muchas sustancias terapéuticas han sido descubiertas accidentalmente en animales y plantas. Sólo en épocas muy recientes la ciencia ha explorado en el nivel básico y ha sido capaz de convertir en drogas el producto de esa investigación. Éste hecho es lo que comúnmente veníamos denominando «Biotecnología Farmacéutica». Sin embargo, el término «Biotecnología Farmacéutica» se ha desvirtuado y se ha transformado en un cajón de sastre en el que se incluye una amplia variedad de avances científicos dirigidos al cuidado de la salud. Dentro de ellos pueden destacarse siete campos: 1. Reconocimiento y caracterización de factores endógenos que median los efectos producidos por las drogas tradicionales. 2. Utilización de la tecnología del ADN recombinante. 3. Producción industrial de anticuerpos monoclonales para terapia, diagnóstico y purificación de otras sustancias. 4. Diseño de fármacos por ordenador. 5. Sistemas de administración de drogas (DDS) 6. Organismos transgénicos. 7. Aplicaciones del cultivo de tejidos. Inevitablemente se genera una nueva industria sobre estas tecnologías con un elevado desarrollo potencial y real. Existen miles de empresas en EE UU y Europa relacionadas con estos campos. Actualmente hay diversos fármacos en el mercado producidos mediante tecnología del ADN recombinante y muchos más en fase de ensayos clínicos o esperando su aprobación por las autoridades sanitarias (r-hGH, r-FSH, Insulina, Factor VIII, Factor IX...). Estas producciones dan lugar al desarrollo de una gran industria auxiliar dedicada a la fabricación de plásticos, reactivos, etcétera, formando todo ello un tejido industrial que mueve actualmente miles de millones de dólares. La evidencia de que la Biotecnología es una industria y que como tal tiene un peso económico (creciente) nos conduce a definiciones si bien un tanto prosaicas del término, no por ello desacertadas. De este modo se dice que la Biotecnología es hacer dinero con la Biología o en una concepción menos económica pero también llena de pragmatismo la Biotecnología se define como la aplicación industrial de la Biología. La «Biotecnología Farmacéutica» persigue la obtención de cantidades «industriales» de productos que existen en la naturaleza en cantidades muy pequeñas con objeto de tratar enfermedades. Uno de los más antiguos productos obtenidos por la Biotecnología Farmacéutica es la insulina, que en los años veinte comenzó a purificarse en grandes cantidades a partir de los páncreas porcinos y bovinos. La extracción de sustancias a partir de tejidos animales, no digamos ya humanos, lleva aparejados problemas relacionados con la presencia de agentes adventi-

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cios difícilmente detectables. Ejemplos muy sobresalientes de este hecho es el lamentable contagio de SIDA de personas tratadas con factor VIII o la aparición prematura de demencia senil como manifestación de la enfermedad de CreutfeldtJakobs en personas tratadas con hormona de crecimiento extraída de tejidos humanos. Por otra parte, determinadas sustancias que son muy escasas en la naturaleza pueden obtenerse en cantidades relativamente abundantes mediante la manipulación genética de organismos. Estos hechos favorecen que la tecnología del ADN recombinante irrumpa con fuerza en la Biotecnología Farmacéutica y que sea en la actualidad la más sobresaliente aplicación de tecnología con una realidad terapéutica y comercial. Hoy en día disponemos de moléculas humanas en grandes cantidades que, sin embargo, jamás han estado relacionadas con seres humanos. Tal es el caso de la hGH , insulina o factores de coagulación. También en el campo de la inmunología tiene una gran importancia la tecnología del ADN recombinante puesto que diversas vacunas incluyen únicamente partes del patógeno incapaces de desarrollar enfermedad alguna, sino tan sólo la respuesta inmune. Las fronteras actuales de la Biotecnología Farmacéutica se encuentran en la búsqueda de nuevos productos capaces de acabar con enfermedades como el cáncer y en el tratamiento a nivel genético de las enfermedades para poder corregirlos en origen. Es la terapia génica que comienza a mostrar sus primeros éxitos. Con todo lo dicho podemos redefinir el término Biotecnología Farmacéutica como el uso de sistemas biológicos para producir drogas o sustancias o también como la utilización de tecnologías modernas para producir sustancias terapéuticas a partir de sistemas biológicos.

Reseña histórica Ya se ha indicado que la Biotecnología tiene una edad no inferior a los 5.000 años pero entre las primeras fermentaciones en la antigua Mesopotamia y las modernas terapias génicas se producen una serie de hechos destacados que van marcando la pauta de desarrollo y crecimiento de esta tecnología. A continuación trataremos de sintetizar la historia de la aplicación industrial de organismos vivos en varias etapas. 1. Anterior a Pasteur. Se limita a la producción de alimentos y bebidas fermentadas, destilación, utilización de levaduras y fabricación de yoghurt y vinagre, todos ellos procesos tradicionales cuyas causas son, evidentemente desconocidas para quienes las realizan. 2. Era Pasteur. Los trabajos de Louis Pasteur demostraron la participación de los microorganismos como agentes activos en la producción de cerveza y vino y en la descomposición de alimentos. Los hitos principales de este periodo son fundamentalmente dos:

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• Producción microbiológica de butanol, glicerol y ácido cítrico. • Producción de acetona y butanol con Clostridium acetobutylicum (Weizmann 1913-1915, Manchester). 3. Era de los antibióticos. Fleming descubrió en 1928 la penicilina pero hasta 1940 no se inició su producción en masa gracias a la aplicación de la tecnología de la industria alimentaria, que permitió la fermentación a gran escala del Penicillium notatum, que hasta entonces se había crecido en botellas. Al desarrollo de la penicilina, le siguieron otros muchos antibióticos, como la eritromicina y la estreptomicina. 4. Era Post-antibióticos. El desarrollo de la bioquímica y la microbiología impulsó la utilización de microorganismos en la producción de diversas sustancias; es el caso de las vitaminas B2 y B12, de aminoácidos (licina y glucosa) o la transformación masiva de glucosa en fructosa. Otros productos de interés industrial generados por Biotecnología son el gasohol, etanol obtenido por fermentación y utilizado como combustible y la goma de xantano, que reemplaza el caucho. Un uso muy llamativo aunque fallido de los microorganismos fue la producción de SCP (Single Cell Proteins) que durante un tiempo persiguió la obtención de proteínas útiles para el consumo animal e incluso humano a partir de la transformación de residuos agrícolas y petroleros, partiendo de la premisa de que el mundo tendría en el futuro escasez de proteínas. Tras varios años de inversión y esfuerzo investigador, el cultivo de la soja terminó con esta iniciativa. También corresponde a este periodo la utilización de microorganismos para la limpieza de efluentes y como auxiliares de lixiviación. 5. Incorporación de la Biología Molecular. La combinación de las técnicas de la Biología Molecular con el cultivo masivo de microorganismos ha supuesto una revolución en el campo de Biotecnología. La tecnología del ADN recombinante en combinación con las técnicas de cultivo masivo de bacterias y, desde 1962, también de células eucariotas se convierte en la vía para producir cantidades importantes de proteínas de interés terapéutico, como anticuerpos monoclonales de gran especificidad, hormonas, mediadores biológicos, etcétera. La frontera actual de la biotecnología se encuentra en la creación de seres transgénicos capaces de expresar genes ajenos e incorporar el producto o efecto de los mismos como parte de su propia naturaleza, en la clonación de organismos superiores y en las terapias génicas que permiten la corrección de defectos genéticos en organismos ya desarrollados. Fuera del campo de la salud, los sensores biológicos y las enzimas inmovilizadas ocupan la vanguardia de la Biotecnología.

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Producción de fármacos por Biotecnología Una vez detectado el interés terapéutico de una sustancia, hay que seguir una secuencia de pasos hasta llegar el producto final. Con matices, todos los fármacos obtenidos por un proceso biotecnológico siguen una secuencia similar. Nos centraremos pues en la producción de proteínas recombinantes. Una vez detectada, aislada y caracterizada la sustancia de interés terapéutico se procede a la localización del ADN que la codifica en el organismo de origen, habitualmente el hombre. Existen diversos métodos para aislar la secuencia de ADN, como la creación de sondas y genotecas, que en otro capítulo se describirán en detalle. Cuando se posee el ADN de interés, se transfiere al organismo elegido para la producción industrial. En este paso temprano se aplican por primera vez criterios económicos al proceso. Así, si bioquímicamente, es viable la producción de la proteína, en diversos organismos, será necesario pensar en las posibilidades de sacar adelante el cultivo, productividad, costes de purificación del producto, problemas de impurezas y caracterización final. Como ejemplo, siempre que una proteína requiera modificaciones estructurales post-traduccionales para ser funcional, las bacterias quedarán automáticamente descartadas como organismo productor. Una vez realizada la construcción génica y seleccionado y creado el organismo hospedador, se ha de proceder a la elaboración del banco de células. Éste no es sino un reservorio de células productoras, todas iguales entre sí, que se mantienen en condiciones de conservación durante años. La homogeneidad y buena conservación de las células resulta esencial para garantizar el desarrollo del proceso productivo. Una vez creado el banco de células, comienza el diseño del proceso de producción. La naturaleza del hospedador seleccionado, bacteria o eucariota es muy determinante en este desarrollo. Las bacterias admiten condiciones de crecimiento mucho menos depuradas que las células. Las áreas de trabajo en la optimización del proceso son también diferentes dependiendo de que se trabaje en células o bacterias y de si aquellas viven en suspensión o son dependientes de anclaje. Parámetros como la concentración de gases en solución, la distribución de temperaturas en el tiempo o el control de pH, por ejemplo, son algunos de los factores a tratar a la hora de poner en marcha un proceso. En estos desarrollos son habituales los ensayos multifactoriales para determinar los parámetros realmente importantes y la manera en que inciden sobre el mismo. Un aspecto de capital importancia a la hora de seleccionar el organismo productor es el método de purificación del producto final. Un ejemplo muy ilustrativo lo encontramos en la fabricación del tPA. Esta proteína fue clonada en Escherichia coli y en células CHO (Chinese Hamster Ovary). En ambos casos y pese a tratarse de una proteína con estructura terciaria, el producto resultaba funcional tanto in vitro como in vivo. Además, el producto generado por E. Coli (ECOtPA) resultaba más estable una vez inyectado que el procedente de células CHO con lo que reque-

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ría dosis menores para actuar. Sin embargo, la ECOtPA se producía en forma de gránulos insolubles intracelulares lo que requería un complejo proceso de recuperación y purificación en el que se consumían grandes cantidades de urea y guanidina y hacía necesario el trabajo con grandes volúmenes. Además, el rendimiento final del proceso era de un 2,8 %. Consecuentemente se adoptó la CHO como organismo productor de tPA a pesar de que la productividad en el crudo era de tan sólo 33,5 mg/L frente a los 460 mg/L generados por las bacterias. Junto con la elección de las condiciones de cultivo y de los pasos a dar para la purificación del producto, se definen los controles en proceso necesarios. El control en proceso es fundamental para la elaboración de un producto de estas características puesto que un conocimiento preciso de la evolución de la producción resulta imprescindible para detectar y atajar los posibles problemas que vayan surgiendo y garantizar la ausencia de «sorpresas» desagradables en el producto final. El diseño general del proceso de fabricación junto con las características del organismo hospedador, dará la pauta a seguir en el diseño de las instalaciones y la elección de los métodos de trabajo. La forma final del procedimiento de fabricación se obtiene con el rodaje de la producción, ya que sólo la práctica diaria pone de manifiesto los problemas existentes. El tiempo requerido por un fármaco para llegar al mercado se divide en tres periodos: • Preclínico: Es toda la etapa de desarrollo del producto que ya hemos comentado. La fase en que se produce la detección de la sustancia, su implantación en un organismo hospedador y el desarrollo del modelo de producción. • Clínico: Es el momento en que comienzan los ensayos clínicos. Las observaciones realizadas en esta fase pueden modificar partes o incluso la totalidad del proceso de producción. • De revisión: Terminadas las dos fases anteriores, la propuesta de productos es enviada a las autoridades sanitarias para su estudio y aprobación. Las preguntas y demostraciones solicitadas por dichas autoridades pueden también afectar al proceso de fabricación. El tiempo medio de salida al mercado de productos obtenidos por biotecnología viene siendo de siete años desde su concepción hasta su venta al público. Este tiempo es comparable al requerido para la salida al mercado de drogas para el tratamiento del SIDA y sensiblemente menor que el requerido a los fármacos tradicionales o los extractivos, estos últimos permanentemente bajo sospecha y frecuentemente inspeccionados. Un punto que ayuda a la rapidez en la salida al mercado de productos biotecnológicos es el hecho de que algunos de ellos, como la insulina y la hGH, son sustancias que ya existían como fármacos y en los que únicamente cambia el sistema de fabricación. No obstante, y en el caso de los NBE (New Biological Entities), los productos biotecnológicos también vienen requiriendo menores tiempos de revisión por parte de las autoridades.

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Cultivo in-vitro de células Una población bacteriana depositada en el seno de un medio nutritivo y no renovado, produce un perfil de crecimiento de tipo sigmoide. En la curva de crecimiento se identifican tres fases fundamentales que son de importancia a la hora de desarrollar una producción biotecnológica. Dichas fases son: • De latencia o lag. Durante este periodo las bacterias se adaptan al medio. • De crecimiento exponencial o log. Es el periodo de crecimiento neto, caracterizado por una intensa duplicación del cultivo. Las bacterias se multiplican en una progresión geométrica de razón 2 durante esta fase, es decir, siendo N el número inicial de individuos, la población crecerá de la siguiente manera: N A 2N A 4N A 8N A 16N… Entre cada multiplicación transcurre un tiempo específico, constante y característico de cada especie que es conocido como tiempo de duplicación. Es posible determinar este tiempo, el número de duplicaciones producidas o prever la cantidad de bacterias al cabo de cierto tiempo mediante ecuaciones sencillas. Xt = X0 · 2n Donde Xt : microorganismos en tiempo t X0: microorganismos en t0 n: número de duplicaciones Puesto que n = t / td, siendo td el tiempo de duplicación, entonces: Xt = X0 · 2n = X0 · 2t/td c X/X0 = 2t/td c n(X-X0) = ln 2t/td Por tanto: 0,693 (logX – logX0) 2,303 ––––––––––––– = ––––– t td Es decir, que una gráfica de crecimiento frente al tiempo produce una recta cuya pendiente es 0,693/td. Estos cálculos sólo son aplicables a la fase de crecimiento exponencial, lógicamente.

Medida de crecimiento bacteriano Existen diversos métodos para medir el crecimiento. Podemos clasificarlos en directos e indirectos.

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— Directos: Son los diversos sistemas de recuento, ya sean la cámara cuentaglóbulos o los contadores de células. — Indirectos: Evalúan diversos parámetros que dan una idea aproximada del número de células presente. • Peso seco: Recuperación mediante filtración o centrifugación de las células contenidas en un volumen conocido de cultivo, desecación en estufa de las células retiradas y pesada de las mismas. • Peso húmedo: Se recuperan las células mediante la filtración de un volumen conocido de cultivo y se pesa la biomasa recogida. • Disolución seriada de una muestra del cultivo y siembra en medio sólido. Se considera que cada una de las colonias formadas sobre la placa corresponde a una sola bacteria en suspensión. Multiplicando el número de colonias obtenidas por el factor de dilución se puede estimar la concentración bacteriana en el cultivo original. • Absorción de luz visible. Las suspensiones de bacterias absorben luz visible. La absorción es tanto mayor cuanto más elevada es la concentración de bacterias. La combinación de esta medición con la realización de diluciones seriadas de los cultivos permite establecer una relación entre la concentración de microorganismos y la absorbancia de un cultivo bacteriano.

Cultivo de células eucariotas Gran parte de los principios aplicados al cultivo de bacterias son extrapolables a los cultivos de células. De hecho, bastantes técnicas de trabajo con bacterias han sido aplicadas al cultivo de eucariotas. Sin embargo, es frecuente que las células eucariotas pierdan parte de sus propiedades cuando son extraídas de los órganos que se encuentran y que su proliferación requiera la utilización de condiciones especiales, incluyendo los cultivos histotípicos. En esencia, la célula inmortalizada en cultivo sigue un ciclo similar al que hemos visto en bacterias. Tras una fase inicial de latencia se produce un crecimiento exponencial con una fuerte predominancia de células en división que conduce a una fase estacionaria cuando los elementos críticos para el desarrollo comienzan a escasear, culminada por una fase de muerte si los nutrientes llegan a desaparecer por completo. La cinética de este crecimiento puede expresarse en forma de ecuaciones matemáticas idénticas a las que hemos visto para el caso del crecimiento bacteriano. Entre los diversos parámetros que definen la dinámica de una población celular destacaremos por su utilización frecuente la estimación del número de duplicaciones n. X n = 3,32 log ––– X0 Donde X es el número de células a tiempo t y X0 el número inicial de células.

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Células inmortalizadas A diferencia de las bacterias, la célula eucariota carece de sistemas de protección frente al entorno quedando esta función supeditada a la organización tisular y orgánica. Así pues, una célula eucariota extraída de su entorno muere con facilidad, aun manteniéndola en un ambiente muy controlado. En ocasiones se realiza cultivo de órganos que, tras una necrosis traumática inicial, adquieren un estado estacionario en el que pueden vivir durante días e incluso semanas en condiciones de laboratorio. Esta modalidad de cultivo, utilizada tan sólo con fines científicos, tiene la ventaja de mantener las condiciones fisiológicas y bioquímicas propias del tejido original. Sin embargo plantea problemas de reproducibilidad de los experimentos. Como alternativa al cultivo de órganos se encuentra el cultivo de células que consiste, como ya indica su nombre, en el mantenimiento de las condiciones vitales de células que se han independizado de la estructura tisular. El paso del órgano a las células independientes tiene lugar por simple y espontánea migración de las células o bien mediante la disgregación mecánica o enzimática del órgano y tejido originales. Las células diferenciadas son incapaces de dividirse en la mayoría de los casos. Por otra parte, un cultivo de células específicas puede presentar diversos estadios, así por ejemplo, el cultivo de queratinocitos puede contener células madre que se multiplican, células precursoras y escamas queratinizadas. En otros casos, las células pueden mantener un aspecto homogéneo y dar lugar a cultivos cuya proliferación depende de la densidad, como es el caso de los fibroblastos, capaces de dividirse a baja densidad (104 cell/cm2) pero incapaces de multiplicarse a altas densidades (106 cell/cm2). Finalmente, una población celular puede tener un aspecto homogéneo y mantener sin embargo diferencias genéticas distribuidas en distintos clones. La multiplicación de las células en cultivo requiere la utilización de densidades de crecimiento adecuadas, bajas concentraciones de Ca++ (entre 100 y 600 mM) y la utilización de factores de crecimiento tales como el EGF, IGF, PDGF, retinoides, etcétera, todos ellos presentes en el suero sanguíneo. Con todo, las células normales en cultivo se dividen un número limitado de veces y después mueren. Sin embargo las células de origen tumoral son capaces de dividirse ilimitadamente con tal de que se mantengan las condiciones adecuadas para ello. Algunas, como las células B16 procedentes de un melanoma de ratón son capaces de sufrir una diferenciación parcial y seguir no obstante dividiéndose. Las células de tipo no neoplásico pueden generar líneas inmortales. La aparición de estas células inmortales se registra al cabo de una serie de divisiones, cuando la mayoría de las células en cultivo empiezan a morir. La inmortalización de las células se considera producto de mutaciones relacionadas con delecciones en algunos genes pero no se puede descartar la pre-existencia de clones inmortales en un tejido normal.

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Las células inmortalizadas presentan diferencias morfológicas con respecto a aquellas células de las que proceden. En general suelen ser de menor tamaño, menos adherentes, más redondeadas y presentan una relación núcleo/citoplasma mayor. Son también frecuentes alteraciones de tipo cromosómico siendo muy habituales las aneuploidías y la heterocariosis. Las células inmortalizadas en cultivo son las más utilizadas en la biotecnología farmacéutica actual para producir proteínas de interés terapéutico. Las células en cultivo pueden vivir en suspensión, como es el caso de los hibridomas, células procedentes de la fusión entre linfocitos y células procedentes de un tumor ascítico. La otra forma de crecimiento de células en cultivo son las células dependientes de anclaje (ADC), que deben mantenerse unidas a una superficie para su desarrollo. La selección del tipo de células más adecuado durante el proceso de desarrollo de un fármaco biotecnológico debe tener en cuenta las posibilidades de realizar con éxito un cultivo a gran escala y tratar de compatibilizarlo con las posibilidades de transformación de la célula. Las células capaces de crecer en suspensión ofrecen algunas ventajas sobre las dependientes de anclaje. • Fácil escalado. • Menor manipulación. • Fácil inducción del estado estacionario. El cultivo de células es una técnica de gran complejidad y precisión con un fuerte predominio de las respuestas empíricas. Los métodos, materiales y medios de cultivo deben ser previamente ensayados en el laboratorio para realizar la elección de los mismos. Con todo, hay algunos valores de referencia que pueden darse como norma general: • pH. El valor óptimo suele encontrarse en torno a 7,2 y 7,4. Valores inferiores a 6,8 suelen resultar inhibitorios del crecimiento. El mantenimiento del pH se consigue tamponando los medios de cultivo habitualmente con CO3H– que se mantiene en equilibrio con el CO2 atmosférico. • Temperatura. Frecuentemente se considera que la temperatura óptima de crecimiento es de 37° C pero esto no ha de ser necesariamente así. Determinadas líneas celulares murinas muestran su crecimiento óptimo a 35 °C y hay líneas celulares de aves que encuentran su temperatura óptima a 40 °C. • Aporte de oxígeno. La solubilidad del oxígeno es de 7,6 μg/ 106 cell/mL. El ritmo de consumo de O2 alcanza los 6 μg/ 106 cell/mL lo que significa que un cultivo estándar con 2·106 células /mL acaba con todo el oxígeno en solución en menos de una hora. Existen diversos sistemas de aporte de O2 que van desde variaciones en la superficie de aireación hasta sofisticados sistemas de burbujeo y perfusión y cuya elección depende del tipo de cultivo.

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• El medio de cultivo. No existe un medio de cultivo universal. Cada célula, cada proceso, y cada producción debe llevar su medio de cultivo específico. Los medios de cultivo contienen una fuente de carbono, habitualmente glucosa y/o glutamina, diversas sales minerales y un amplio abanico de nutrientes fundamentalmente aminoácidos esenciales y vitaminas. • Suero. Es frecuente que el medio de cultivo se complemente con suero animal. Existen varias fuentes de suero comúnmente utilizadas y comercializadas: humano, equino, etc., pero la más habitual es el suero fetal bovino. El aporte del suero es fundamental para el desarrollo de los cultivos puesto que proporcionan a las células una multitud de factores de crecimiento y elementos mitogénicos además de un ambiente muy estable y adecuado para el crecimiento. Es habitual la utilización de concentración de suero entre el 2 % y el 20 %. El suero presenta, no obstante, importantes inconvenientes tales como la posible aparición de agentes adventicios, la no garantía de abastecimiento y la falta de homogeneidad del producto. De ahí que se esté desarrollando un intenso trabajo en la obtención de medios de cultivo libres de suero en los cuales éste se sustituye por una variedad de componentes estimulantes de crecimiento conocidos y en cantidades controladas.

Contaminación y prevención No podemos terminar este apartado de generalidades sobre el cultivo celular sin mencionar la principal amenaza que sobre ellos pesa: La contaminación. Por su crecimiento lento y la riqueza en nutrientes y condiciones altamente fisiológicas que se requieren, los cultivos celulares son un blanco ideal para la contaminación por bacterias, levaduras y hongos. Es por ello frecuente la adición de antibióticos a la formulación del medio, pero esto no siempre puede ser así: la producción de proteínas para consumo humano debe hacerse necesariamente sin antibióticos que de otro modo podrían generar resistencias o reacciones alérgicas en los pacientes. Aparte de estos contaminantes comunes, merecen especial atención los micoplasmas, diversos virus animales y, últimamente, los priones, como es el caso de la BSE. Existen diversos métodos para detectar la presencia de agentes adventicios que, en muchos casos, pueden no presentar efectos citopáticos visibles. La mejor manera de evitar la aparición de estos elementos indeseables en los cultivos es el análisis de las materias primas, el trabajo aséptico y la utilización de salas y equipos controlados y diseñados para prevenir la contaminación.

Tipos de cultivos Trabajemos con procariotas o eucariotas, los cultivos se dividen en dos categorías: batch o discontinuo y continuo.

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Cultivo discontinuo Consiste en la inoculación de una cantidad conocida de células en un cierto volumen de medio, bajo las condiciones adecuadas para el crecimiento. Las células se multiplican y van cambiando su ambiente debido al consumo de nutrientes y a la acumulación de metabolitos tóxicos. Esta variación en el entorno se traduce en alteraciones de carácter fisiológico en las células que finalmente terminarán por morir o mantener una población residual. Existen diversas variaciones del cultivo discontinuo destinadas a prolongar la duración del mismo. Éstas son: • Batch alimentado (fed batch). Consiste en la adición periódica de cantidades de medio de cultivo sin retirada del consumido, con el consecuente incremento de volumen. • Batch semi-continuo. Consiste en la periódica retirada de cantidades fijas de medio de cultivo y su sustitución por medio nuevo. Estos sistemas retienen siempre en mayor o menor medida una cierta cantidad de desechos y mantienen por ello un ambiente fluctuante. • Sistemas de perfusión. Consisten en la continua entrada de medio con salida de cantidad igual, manteniendo las células retenidas en el reactor. Es el típico sistema de los cultivos histotípcios como el biorreactor de fibra hueca. La renovación del medio se puede realizar con medio fresco o bien procediendo a la regeneración del medio consumido.

Cultivo continuo Es en el que se consiguen auténticas condiciones homeostáticas evitando fluctuaciones en el ambiente. Consiste en la salida continua de medio de cultivo con células que es reemplazado por medio fresco. El fundamento del quimiostato reside en el hecho de que el crecimiento celular está determinado por la concentración de nutrientes específicos limitantes del crecimiento. En un cultivo, las células crecen hasta alcanzar un equilibrio que está relacionado con la dilución de un factor limitante. Entonces las células entran en lo que se denomina «estado estacionario». En el estado estacionario, el ratio de crecimiento, μ, es igual al ratio de dilución, D que a su vez es la relación entre el flujo de medio entrante (f) por unidad de tiempo y volumen de cultivo V es decir: μ = D = f/V · días –1 Puesto que el ratio de crecimiento es dependiente del ratio de flujo entrante, el tiempo medio de generación puede expresarse como: td = ln(2/D)

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Un sistema automatizado para conseguir un cultivo continuo es el turbidostato, que valora la densidad celular por turbidimetría. El interés del cultivo continuo reside en el mantenimiento de las condiciones fisiológicas óptimas, requisito en muchos casos para mantener una buena producción.

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12 La ingeniería genética I. Herramientas y Metodología J. Casatorres Hernández

Introducción En el inicio de la década de los sesenta los genetistas tenían una clara visión de la genética clásica. Sin embargo, carecían por completo de metodología para estudiar y obtener los genes excepto a través de laboriosos experimentos de apareamientos y análisis de los mutantes resultantes. No existían procedimientos para examinar los genes a nivel molecular. No fue hasta 1974 cuando las operaciones de ingeniería genética, también llamadas técnicas de ADN recombinante se hicieron realidad. La ingeniería genética es un término que, por un lado, hace referencia a aspectos técnicos: ingeniería, herramientas y a ensamblaje, mientras que el otro término, genética, remite a los genes, el soporte material de la herencia, a la transmisión a los descendientes de la información inscrita en el patrimonio hereditario de un organismo. La ingeniería genética no es una ciencia sino un compendio de técnicas capaces de intervenir sobre el patrimonio genético de los organismos; de esta forma, las técnicas de ingeniería genética permiten modificar selectivamente (reprogramar) los genes de un organismo mediante la incorporación de nueva información genética, de forma que ésta se exprese y se perpetúe en la progenie. Desde su aparición hacia 1974, la ingeniería genética ha evolucionado muy deprisa hacia un grado muy alto de perfección técnica, en la actualidad es posible aislar fragmentos discretos de ADN procedentes de un gran genoma, mantenerlos y expresarlos en sistemas sencillos que faciliten su estudio a nivel molecular. Es posible también, secuenciar y mutar el gen clonado, ponerlo bajo óptimas condiciones de expresión, en distintos hospedadores, observar su comportamiento, determinar la estructura tridimensional y determinar interacciones con otras macromoléculas. Todos estos estudios han supuesto un avance espectacular en el campo de la

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Biología Molecular, ejemplo de ello son los descubrimientos de la organización de los genes eucarióticos en intrones (o regiones no codificantes) y exones (o regiones codificantes), la caracterización de innumerables nuevos genes y sus elementos de control. Además del avance en conocimientos e investigación básica, las técnicas de ingeniería genética han llevado al campo biomédico a cambios revolucionarios como son la producción masiva de proteínas con alto valor terapéutico, (escasas o difíciles de extraer del organismo humano u otras fuentes naturales) o sentar las bases para la terapia génica. A pesar de todo lo anterior, la puesta en práctica de la ingeniería genética se ha enfrentado y enfrenta a dificultades. Es muy frecuente que estas dificultades sean tanto técnicas como económicas; las técnicas de ingeniería genética conllevan elevados gastos económicos y la mayoría de los trabajos sobre expresión génica se llevan a cabo en los laboratorios de empresas de ingeniería genética que se encuentran en una carrera vital de supervivencia para comercializar producciones lucrativas. La información esencial y útil no deriva a la comunidad científica y se conserva como secreto industrial. A veces, es posible técnica y económicamente la obtención de un determinado producto mediante ingeniería genética y son otros factores, no científicos (presiones políticas o ecológicas) los que evitan que la producción se lleve a cabo.

Técnicas de ADN recombinante Las técnicas de Ingeniería Genética han permitido romper las barreras naturales entre especies y se ha cambiado el concepto clásico de herencia: genes eucarióticos se expresan en sistemas procarióticos con gran eficiencia; genes procarióticos se insertan en genomas de mamíferos y también se expresan, los genes humanos se pueden aislar, mutar y sustituir; la manipulación genética de plantas permite obtener plantas resistentes a plagas o herbicidas. En conjunto, estas técnicas han abierto un inmenso abanico de posibilidades y aplicaciones prácticas en campos tan dispares como la biomedicina, agricultura, ganadería o industria. Todos estos avances han sido y son en la actualidad posibles en base a los dos pilares de la ingeniería genética: 1. El empleo de proteínas (enzimas) con capacidad de intervenir sobre los ácidos nucleicos (AN) macromoléculas de la herencia. Estas proteínas constituyen las herramientas de la ingeniería genética. 2. La universalidad del código genético que nos permite cruzar las barreras naturales entre especies, introduciendo y expresando genes de cualquier organismo en un organismo hospedador no relacionado, en el que pueden perpetuarse indefinidamente.

LA INGENIERÍA GENÉTICA I

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Herramientas de la ingeniería genética Nucleasas de ácidos nucleicos Las nucleasas son enzimas que degradan los AN. En función de si actúan degradando desde los extremos o desde el interior de la cadena se denominan exonucleasas o endonucleasas respectivamente. Las más empleadas se describen a continuación: ADNasa I Características: Endonucleasa inespecífica de ADN de cadena sencilla (ADNcs) o doble (ADNdc). En presencia de Mg++ produce cortes al azar en ambas cadenas originando mellas o nicks, si se utiliza Mn++ los cortes se producen enfrentados en ambas cadenas provocando una degradación del ADN tratado. El corte se realiza en 3’ del esqueleto azúcar-fosfato dejando extremos 3’-OH y 5’-fosfato (5’-P). Uso en ingeniería genética: Esta enzima se emplea para realizar digestiones totales o parciales de ADN para generar genotecas de genomas completos. También es muy utilizada para marcaje de fragmentos de ADN junto con la ADN polimerasa en la técnica de desplazamiento del corte (nick translation). Exonucleasa III Características: Exonucleasa inespecífica de ADNdc que corta en dirección 3’ A 5’ hasta dinucleótido dejando extremos 5’P protuberantes. Requiere que el extremo 3’ esté sin fosforilar. Uso en ingeniería genética: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3’ de fragmentos de ADN en combinación con la ADN polimerasa I que rellena los extremos protuberantes generados por la Exonucleasa III. También se emplea para generar delecciones unidireccionales progresivas de fragmentos de ADNdc.

h Exonucleasa Características: Aislada de E. coli infectada por el fago h. Es una exonucleasa inespecífica de ADNdc que corta en dirección 5’ A 3’ hasta dinucleótido a partir de extremos 5’P generando extremos 3’ protuberantes. Uso en ingeniería genética: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3’ de fragmentos de ADN en combinación con la Transferasa terminal que alarga los extremos protuberantes 3’ generados por la h Exonucleasa. Nucleasa S1 Características: Es una exonucleasa y Endonucleasa de ADN y ARN de cadena simple en dirección 5’ A 3’ cortando en 3’ dejando extremos 3’-OH y 5’P.

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Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar los extremos 5’ protuberantes generados por las enzimas de restricción o fragmentos de ADN o ARN de cadena simple libres que no estén hibridados a un molde. Nucleasa Bal31 Características: Es una exonucleasa sobre ADNdc y endonucleasa sobre ADNcs. Posee las actividades de la Exo III (3’ A 5’) y la h Exonucleasa (5’ A 3’) pero degrada de forma progresiva. Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar los extremos 3’ o 5’ protuberantes generados por las enzimas de restricción. Puesto que la degradación del ADN es estrictamente dependiente de Ca++ es posible controlar la reacción a diferentes tiempos mediante la adición de agentes quelantes de Ca++ como EGTA lo cual hizo de esta enzima la de elección cuando se necesitaban generar delecciones progresivas de fragmentos para su posterior secuenciación, previo relleno de los extremos con el fragmento Klenow de la ADNpol I. Ribonucleasa A (ARNasa A) Características: Es una endonucleasa sobre ARN de cadena sencilla con especificidad de corte en pirimidinas (U y C). Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar ARN en purificaciones de ADN y/o proteínas, eliminación de ribosondas no hibridadas y dada su especificidad de corte en U+C, se emplea en la secuenciación de ARN. Ribonucleasa H (ARNasa H) Características: Es una endonucleasa sobre ARN siempre que se encuentre en forma de cadena mixta (heterodúplex) ADN/ARN. Presenta especificidad de corte en restos de riboadenina (A). Uso en ingeniería genética: El hecho de no degradar ARN de cadenas dobles o sencillas hace que su empleo fundamental sea la eliminación del ARN del híbrido ADN/ARN tras la transcripción reversa previa a la síntesis de la segunda cadena de ADNcopia (ADNc) en la construcción de genotecas. Enzimas de restricción El ADN de las células se presenta en forma de moléculas inmensas que hay que fragmentar de manera precisa y reproducible para aislar los pequeños fragmentos que contienen los genes. Fue a partir del año 1974, momento en el que se descubrieron las endonucleasas de restricción, cuando se pudo dividir el ADN de los organismos en fragmentos discretos relativamente fáciles de manejar.

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Las enzimas de restricción son proteínas, que se encuentran de forma natural en las bacterias. Suponen un sistema inmunitario rudimentario frente a la infección de las bacterias por fagos (virus bacterianos). El término restricción refiere a que las enzimas de restricción degradan el ADN «intruso» a la vez que protegen el suyo modificándolo. Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de cortar en el interior de la doble cadena de la molécula de ADN cuando reconocen una secuencia diana de nucleótidos específica siempre y cuando la diana no tenga modificados por metilación algunos de los nucleótidos que la componen. El corte se puede producir sobre la diana de reconocimiento o a una cierta distancia de ella. Hay varios tipos de enzimas de restricción, denominados Sistemas I, II y III por sus diferentes características. Los sistemas I y III no se emplean en ingeniería genética, se caracterizan porque la secuencia de reconocimiento y la secuencia de corte están separadas una distancia variable (entre 24-26 pb en el caso del sistema III o 1.000 pb en el sistema II) y las secuencias de corte aunque no son al azar no son totalmente específicas. En cualquier caso las enzimas de restricción de tipo II son las verdaderas tijeras moleculares de la ingeniería genética. Enzimas de restricción Tipo II Las enzimas de restricción de tipo II se caracterizan porque cortan la molécula de ADN en la misma secuencia diana de reconocimiento. Las secuencias de reconocimiento son específicas para cada enzima de restricción y constan de una corta secuencia de 4 a 10 nucleótidos que sirven de referencia para realizar el corte. Las secuencias reconocidas por estas enzimas son capicúas o palindrómicas, es decir, la lectura un sentido (5’ A 3’) de los nucleótidos de la diana en una cadena idéntica a la de la cadena complementaria del ADN leída en ese mismo sentido (5’ A 3’). El corte dentro del ADN se realiza en el extremo 3’ del esqueleto azúcar-fosfato, liberando fragmentos 5’-fosfato y 3’-OH. Este dato es muy importante, pues se trata de extremos que luego podrán ser reparados con ligasas de ADN. En general la secuencia de reconocimiento es específica, pero cambiando las condiciones de sal y sustituyendo Mg++ por Mn++, es posible modificar la actividad de algunas enzimas, obteniéndose una especificidad de corte relajada que se denomina actividad estrella. Existen enzimas que producen cortes enfrentados en ambas cadenas dentro de la secuencia de reconocimiento y generan fragmentos con los extremos lisos o romos; otras sin embargo, realizan cortes quebrados en la secuencia de reconocimiento y generan extremos protuberantes. Los extremos protuberantes son también denominados como cohesivos o adhesivos dado que la complementariedad de bases permite que sean más fácilmente soldados por acción de ligasas ya que los puentes de hidrógeno que se forman entre ambos extremos estabilizan el ADN y las ligasas actúan más eficientemente.

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La nomenclatura de las enzimas de restricción hace referencia al género y la especie bacteriana de la que se aislaron inicialmente; así la primera letra indica el género y las siguientes la especie y cepa. Si existen más enzimas de restricción en la especie se numeran con números romanos: PstI: Providentia stuartii I.

Sau3AI: Staphilococus aureus cepa 3AI

Cuando dos enzimas de restricción diferentes reconocen, total o parcialmente, la misma secuencia y cortan en la misma posición se denominan isosquizómeros. En principio es posible calcular la frecuencia de corte de una enzima de restricción en función del número de nucleótidos que constituyen la diana de corte. Para enzimas que reconocen un tetranucleótido la frecuencia de corte sería 44, una vez cada 256 nucleótidos, para un hexanucleótido 46, una vez cada 4.096 nucleótidos. Sin embargo estos datos no son reales debido a que el contenido real de GC en relación a AT no es del 50 % en los ADN y por tanto, la distribución de las dianas no es homogénea en los genomas. Actualmente se han identificado unas 150 enzimas de restricción, la mayoría de ellas disponibles comercialmente como herramienta de biología molecular. La gran importancia de estas enzimas radica, como se indicó inicialmente, en la capacidad de cortar de forma precisa, específica y reproducible moléculas de ADN para su posterior manipulación.

Polimerasas de ácidos nucleicos Las polimerasas son enzimas que catalizan la formación de las moléculas de AN a partir de sus unidades correspondientes y un molde para copiar. Hay muchos pasos en los experimentos de ingeniería genética que requieren de la participación de las polimerasas de los AN: polimerasas de ADN (ADNpol) y de ARN (ARNpol). El empleo de estas enzimas es vital para la síntesis de ADN o ARN in vitro o crear sondas con las que localizar luego genes o secuencias de interés. Todas las polimerasas requieren: • Presencia de Mg++ y nucleótidos trifosfato (deoxi- o ribo-) en el medio para su actividad. • Un molde de ácido nucleico (con la única excepción de la enzima denominada transferasa terminal) para copiar. • Un cebador, corta secuencia de oligonucleótidos hibridado al molde que proporciona el punto de partida de la polimerización. • Todas la polimerasas presentan polaridad de síntesis, siempre en la dirección 5’ A 3’ del ADN a partir de un extremo 3’-OH libre. Las polimerasas más empleadas en ingeniería genética se describen brevemente a continuación:

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ADN polimerasa I (ADNpol I) Características: La enzima funciona con actividad polimerasa y exonucleasa en dirección 5’ A 3’ y tiene una actividad exonucleasa correctora de errores 3’ A 5’. Uso en ingeniería genética: La principal utilidad de esta enzima es el marcaje radiactivo o fluorescente de moléculas de ADN por el procedimiento de traslado de corte (nick translation). El procedimiento se basa en el tratamiento de ADN con una pequeña cantidad de una endonucleasa (ADNasa I) para que se generen pequeños cortes al azar en la molécula de ADN, estos pequeños cortes proporcionan el extremo de inicio a la ADNpol I. En presencia de Mg++ y deoxinucleótidos trifosfatos la ADNpol I va digiriendo los nucleótidos de la cadena por delante del corte en dirección 5’ A 3’ a la vez que los sustituye por los deoxinucleótidos trifosfato del medio. Uno o varios de estos deoxinucleótidos puede ser radiactivo o llevar algún agente fluorescente, de forma que la molécula de ADN estaría marcada para emplearla como sonda. Fragmento Klenow de la ADNpol I Características: Es una modificación de la ADNpol I que ha perdido la actividad exonucleasa 5’ A 3’ y por tanto no puede alargar los cortes en una molécula de ADN. Uso en ingeniería genética: Se utiliza principalmente para el relleno de huecos internos en moléculas de ADN o el relleno extremos cohesivos generados por enzimas de restricción para hacerlos romos. Es muy utilizada para la síntesis de la segunda cadena de ADN a partir de un molde de cadena sencilla. Inicialmente se empleó en las reacciones de secuenciación por el método de los di-deoxinucleótidos, en la actualidad se emplea frecuentemente para el marcaje isotópico de fragmentos de ADN con alta actividad específica empleando cebadores de secuencia aleatoria de 4-6 nucleótidos que hibridan aleatoriamente con ambas cadenas del ADN a marcar (ramdom priming). ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa® Características: La ADNpol T7 es una polimerasa que se aisla de E. coli infectada por el fago T7. Es la polimerasa de ADN más eficiente que se conoce y la que sintetiza cadenas más largas. Posee las actividades exonucleasa y polimerasa 5’ A 3’ y la exonucleasa 3’ A 5’. Sin embargo esta actividad correctora de errores es tan potente que a veces destruye los fragmentos cebadores si no están fuertemente apareados con el molde. Uso en ingeniería genética: La enzima modificada sin la actividad exonucleasa 3’ A 5’ se denomina Secuenasa ®, su elevada procesividad (numero de nucleótidos incorporados cada vez que una molécula de enzima se une al ADN molde) la hacen la enzima de elección en la secuenciación del ADN.

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Polimerasas termorresistentes Características: Son un conjunto de polimerasas de AN caracterizadas por ser termoestables y presentar temperaturas óptimas de actividad entre 75-80 ºC. La más conocida es la Taq polimerasa, aislada originalmente de Thermus aquaticus y en la actualidad obtenida por ingeniería genética. Otras polimerasas termoestables son la Pfu polimerasa o la Vent polimerasa que polimerizan ADN con menores errores de copia que la Taq. Otra enzima termoestable importante es la Tth polimerasa que además de su actividad ADN polimerasa, posee capacidad de transcripción reversa: utilizando un molde de ARN y un cebador, es capaz de sintetizar ADN. Uso en ingeniería genética: Estas enzimas se emplean en reacciones de secuenciación y de amplificación de ADN mediante PCR (-Polymerase Chain Reactionreacción en cadena de la polimerasa).

Transcriptasas reversas Características: Las transcriptasas reversas son enzimas de retrovirus que sintetizan ADN utilizando ARN como molde siempre y cuando exista un corto cebador hibridado que proporcione un 3’-OH como punto de inicio de polimerización. Las transcriptasas reversas carecen de la actividad exonucleasa 3’ A 5’ y por lo tanto cometen bastantes errores de copia (1 nucleótido erróneo cada 500 incorporados) y poseen una actividad enzimática ARNasa H que degrada híbridos ADNARN. Las transcriptasas más empleadas son la AMV polimerasa (del Virus de la mieloblastosis aviar) y la MMLV polimerasa (del virus de la leucemia murina) en las versiones comerciales modificadas por ingeniería genética que han perdido la actividad ARNasa H. Uso en ingeniería genética: Se emplean en la obtención de ADN copia (ADNc), a partir de ARN molde. Estas enzimas son fundamentales para la generación de genotecas de ADNc. Transferasa terminal Características: Es una polimerasa que cataliza la adición de deoxinucleótidos a extremos 3’-OH libres de moléculas de ADN. Prefiere extremos protuberantes 3’-OH de cadenas simples o dobles de ADN, pero también es capaz de actuar con extremos romos. Uso en ingeniería genética: La enzima se emplea comúnmente para añadir colas de homopolímeros a moléculas de vector e inserto que se quieren unir posteriormente usando ADN ligasa.

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ARNpolimerasas Características: Son enzimas que reconocen secuencias específicas en el ADN llamadas promotores y en presencia de ribonucleótidos trifosfatos y Mg++ catalizan la síntesis de ARN complementario a una de las hebras del ADN molde. Requieren de ADN de doble cadena (ADNdc) como molde y no necesitan ningún cebador, siendo el ribonucleótido 5’ de inicio un ribonucleótido trifosfato. Las ARN polimerasas más empleadas son las ARN polimerasas de los fagos SP6 y T7 debido a que sus secuencias promotoras son muy potentes y la transcripción a ARN desde estos promotores es muy eficiente. Usos en ingeniería genética: Estas enzimas se emplean junto con vectores que poseen sus secuencias promotoras para realizar transcripción in vitro (obtención de ARN a partir de un ADN incluido en un vector de expresión. La transcripción in vitro se puede emplear para marcaje homogéneo, isotópico o no isotópico, de un fragmento de ARN (ribosonda) o para realizar una traducción in vitro a proteínas de los ARN sintetizados u obtener cortos ribonucleóticos que sirvan como ARN antisentido para bloquear transcripción de un fragmento de ADN. Poli-A polimerasas Características: Son enzimas que añaden colas de AMP a los extremos 3’-OH de los ARNs a partir de ATP y en presencia de Mg++ y Mn++. No necesitan molde ni cebador. Usos en ingeniería genética: Tanto las eucarióticas como las procarióticas se emplean para añadir colas de poli-A a los extremos 3’ de ARN para obtener ARN poliA+ y retrotranscribirlos a ADNc. Se pueden obtener de esta forma genotecas de ADNc a partir de ARN total. El empleo de ATP marcado isotópicamente o con fluorocromos permite obtener ribosondas marcadas en el extremo 3’.

Enzimas de modificación de ácidos nucleicos Ligasas de ADN Características: Las ligasas de ADN catalizan, la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo 3’-OH y el extremo 5’-P de moléculas de ADN mediante la hidrólisis de rATP a rAMP y pirosfofato. La más empleada comercialmente es la ligasa del fago T4 (T4 ligasa) que también puede ligar ARN. La reacción de ligación es más eficiente en la unión de moléculas de ADN con extremos cohesivos pero también es factible entre moléculas de extremos romos. Usos en ingeniería genética: La ligasa se emplea en la reparación de cortes o mellas en la moléculas de ADN de doble cadena, ya sean lineales o circulares. Sin embargo el principal uso de las ligasas ha sido su empleo como pegamentos mole-

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culares en la unión de fragmentos de ADN generados por las enzimas de restricción para experimentos de clonaje. Quinasas de ácidos nucleicos Características: Las quinasas catalizan la transferencia del grupo fosfato en a del rATP a extremos 5’-OH libre de múltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas simples y dobles o oligonucleótidos sintéticos. La enzima comercialmente usada es la quinasa del fago T4 (T4 quinasa). Esta enzima es capaz también de provocar el recambio del grupo fosfato de un extremo 5’-P. Usos en ingeniería genética: La quinasa posee múltiples usos, se emplea en el marcaje isotópico de extremos 5’-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP estos fragmentos marcados en 5’ se emplean como sondas o para secuenciación de ADN o ARN o simplemente como marcadores radiactivos de peso molecular para electroforesis. Otro importante uso es la fosforilación de extremos 5’-OH de fragmentos de ADN (normalmente generados por las enzimas de restricción) para poder ser unidos por las ligasas. Fosfatasas de ácidos nucleicos Características: Las fosfatasas catalizan la eliminación del grupo fosfato terminal de los extremos 5’-P de múltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas simples y dobles o oligonucleótidos sintéticos. La enzima comercialmente usada es la fosfatasa alcalina. Usos en ingeniería genética: Las fosfatasas se emplean en la preparación de fragmentos de ADN que se desea que no sean sustratos de las ligasas o en el marcaje isotópico de extremos 5’-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP, primero se tratan con fosfatasas para eliminar el fosfato terminal frío y luego se marcan empleando la quinasa.

Procedimientos de ingeniería genética A continuación se describen una serie de procedimientos y técnicas básicas que se emplean habitualmente en los laboratorios de biología molecular para la obtención, caracterización y modificación de los AN.

Métodos de obtención purificación de AN El primer paso para la caracterización y aislamiento de un gen de interés lleva asociado el aislamiento y purificación física del ADN o el ARN que codifica por él. No existe un método general y perfecto para el aislamiento y purificación de los

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AN, sino que los métodos se emplean en función de diversos factores condicionantes: • Fuente de obtención, (organismos procarióticos y/o eucarióticos). • Tipo de ácido nucleico: ARN o ADN. • Propósitos preparativos o analíticos del ácido nucleico purificado. En cualquier caso, en el aislamiento y purificación de los AN se siguen una serie de pasos secuenciales: 1. Ruptura celular. En función de la fuente biológica de los AN podemos seguir distintos procedimientos: • Cultivos bacterianos: El paso inicial suele ser la concentración del cultivo bacteriano, normalmente por centrifugación. Una vez obtenidas las células bacterianas los métodos de ruptura empleados pueden ser mecánicos (mediante homogeneización con abrasivos como alúmina o procesos sucesivos congelación/descongelación) químicos (mediante el empleo de detergentes iónicos como el SDS o neutros como el Tritón X-100 o Nonidet P-40) o enzimáticos (mediante el empleo de una solución isotónica de lisozima que degrada las paredes bacterianas). • Virus en suspensión: Tras un paso inicial de concentración por centrifugación el método más empleado es el de la degradación de las envueltas de los virus con detergentes y tratamiento con proteasas de baja especificidad como la proteinasa K. • Cultivos celulares y tejidos: En el caso de tejidos el paso previo es la disgregación celular mediante tratamiento enzimático (con colagenasa) o mecánico (ruptura en mortero con nitrógeno líquido) seguido de una homogeneización en un homogenizador. El tratamiento de elección depende de la consistencia del tejido de partida (tejido animal o vegetal) y la cantidad de partida. En el caso de cultivos celulares, el paso previo es la obtención de la suspensión celular, bien mediante raspado directo de las células sobre las placas de cultivo, bien por tratamiento enzimático con tripsina. Una vez obtenidas las suspensiones celulares la rotura de las células se realiza por tratamiento con detergentes iónicos o no iónicos o directamente por la adición de solventes orgánicos. 2. Fraccionamiento celular. Una vez obtenido el homogeneizado se procede a la separación y eliminación de los lípidos, azúcares y proteínas de los AN. El fraccionamiento utilizado de forma habitual implica una digestión previa con proteinasa K seguida de extracciones empleando solventes orgánicos en los cuales no son solubles ni proteínas ni AN La extracción en fenol de los homogeneizados seguida de centrifugaciones ha sido el método tradicional de obtención de los AN, fundamentalmente ADN. La elección del procedimiento de fraccionamiento dependerá del propósito final al cual se destine el ácido nucleico y el tipo del mismo; por lo gene-

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ral si es ADN de alto peso molecular se suelen emplear tratamiento suaves (sin agitar o pipetear) que evitan la rotura de las moléculas de ADN, este ADN es susceptible de ser empleado en la construcción de genotecas a partir de ADN genómico. En el caso de ARN se han empleado soluciones que llevan agentes caotrópicos como el isotiocianato de Guanidina o cloruro de guanidina que desnaturalizan y destruyen las ARNasas que pudieran dañar al ARN a purificar. Al final de esta etapa de fraccionamiento se suele obtener una fracción acuosa con los AN y algunas proteínas contaminantes. Es posible ya el aislamiento directo de ambos AN mediante precipitación llevando la fase acuosa a una determinada concentración de sal y añadiendo un alcohol (etanol o isopropanol). La concentración de sal, los volúmenes de alcohol y la temperatura determinan una precipitación selectiva de uno o ambos AN, que se recogen posteriormente por sedimentación tras una etapa de centrifugación. Normalmente el ADN precipita en forma de hebras mientras que el ARN lo hace como copos. A la etapa de sedimentación le sucede una etapa de secado y resuspensión en una solución adecuada, a ser posible estéril y libre de nucleasas. El ADN así obtenido es susceptible de ser digerido por enzimas de restricción o modificado por otras enzimas de ácidos nucleicos. 3. Purificación. Si el propósito del ADN es analítico (secuenciación) o si se va a utilizar para introducirlo en células (tranfección) o se van a aislar distintos tipos de moléculas (mARN de ARN totales) se suelen llevar a cabo procesos de purificación adicionales. Estos procesos de purificación se basan en dos tipos de técnicas: Centrifugación: Se emplea la sedimentación en gradientes de sedimentación alcalinos de sacarosa (que informan acerca de la conformación de las moléculas de ADN) o en gradientes de densidad de cloruro de cesio (CsCl). Este último método es un método de purificación basado en la gran diferencia de densidad de las proteínas y el ADN en un gradiente de CsCl. El ADN obtenido por este método es de gran pureza, además, si el gradiente de densidad generado con el CsCl se realiza en presencia de bromuro de etidio, es posible separar moléculas de ADN circulares intactas de moléculas de ADN circulares con cortes en alguna de las cadenas. Esta tediosa técnica se ha empleado muy frecuentemente en el pasado para la obtención de plásmidos (vectores transmisión de información genética) Cromatografía: Actualmente se emplean microcolumnas de cromatografía, disponibles comercialmente, preempaquetadas con distintas matrices capaces de retener y eluir selectivamente los distintos AN de banda simple o doble. En otros casos el tratamiento de las soluciones de AN con pequeñas bolitas modificadas químicamente permite la purificación de subpoblaciones de moléculas de ADN o ARN.

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Hoy en día en los laboratorios de biología molecular se dispone de un catálogo muy amplio de productos específicamente diseñados para el objetivo perseguido por el investigador y en función de sus necesidades. La mayoría de estos productos no emplean los disolventes orgánicos anteriormente tratados y se basan en el empleo de columnas desechables que suelen ahorrar tiempo de procesamiento y rinden el producto específico buscado: ARN poliadenilado, ADN circular o lineal, de doble cadena o cadena sencilla.

Métodos de detección de ácidos nucleicos: Métodos de detección-cuantificación directos Una vez obtenidos los AN el siguiente paso lógico es la cuantificación de los mismos; para ello se han empleado tres tipos básicos de valoración de los AN: Métodos biológicos: Son métodos que implican que los AN obtenidos sean biológicamente activos para poder someterlos a reacciones enzimáticas. Estos métodos no suelen ser muy utilizados para cuantificación, por citar algún ejemplo: la valoración de la eficiencia de transformación (en un determinado rango de concentración de ADN existe una relación lineal entre colonias de transformantes que toman el ADN y la concentración del ADN empleado). En el caso de ARN mensajero, la eficiencia de síntesis in vitro de una proteína es, en determinadas condiciones, una relación directa de la cantidad de ARN mensajero del ensayo. Métodos físicos: Los métodos físicos se basan fundamentalmente en la medida espectrofotométrica de la cantidad de radiación ultravioleta (UV) absorbida por las bases nitrogenadas de los AN. Este método es el más empleado si la muestra es relativamente pura (sin cantidades significativas de contaminantes tales como proteínas, fenol o agarosa). Las determinaciones se realizan midiendo la absorción de la muestra a dos longitudes de onda UV a 260 y 280 nm. La relación entre la absorción a ambas longitudes de onda indica (DO260/DO280) determina la pureza de la muestra: Muestras puras de ADN o ARN presentan valores de DO260/DO280 de 1,8 y 2,0 respectivamente, valores inferiores indican una contaminación de la muestra con proteína o fenol. La lectura de absorción a 260 nm indica la concentración de AN en la muestra, un valor de DO260 = 1 corresponde a 50 μg/mL de ADNdc, 40 μg/mL de ADNcs o ARN y 20 μg/mL de oligonucleótidos de cadena simple. El principal inconveniente de esta técnica radica el bajo grado de sensibilidad y que no es posible cuantificar por separado ADN, ARN y oligonucleótidos. Métodos químicos: Se basan en reacciones de los AN con reactivos adecuados que originan complejos coloreados o fluorescentes. Tradicionalmente se emplearon métodos específicos de baja sensibilidad como el del orcinol para el ARN (el orcinol en presencia de FeCl2 reacciona con la ribosa del ARN y origina un complejo de color verdoso) o la difenilamina para el ADN (la difenilamina reacciona con las 2’deoxipentosas del ADN y genera, en medio ácido, un color azulado); sin embargo

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los métodos más empleados actualmente emplean agentes que permiten cuantificar cantidades del orden de pg (10-12 g) y ng (10-9 g). Los agentes más empleados son el bromuro de etidio, Sybr Green®, azul de metileno y naranja de acridina: Bromuro de etidio: La determinación se basa en valorar la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio intercalado entre las bases nitrogenadas del ADN o ARN al irradiar la muestra con luz UV de 300 nm de longitud de onda. Puesto que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la masa total del ADN, la cantidad de ADN en una muestra puede ser estimada comparando el rendimiento de fluorescencia de la muestra con una serie de estándares de ADN de concentración conocida. Mediante este método es posible detectar visualmente concentraciones entre 1-5 ng totales de ADNdc. Dado que la afinidad del bromuro de etidio por AN de cadena sencilla, es relativamente baja comparada con la afinidad por AN de cadena doble, la sensibilidad para la cuantificación de ADNcs y ARN es también menor. Sybr Green®: El mecanismo de actuación del fluorocromo Sybr Green® es similar al del bromuro de etidio pero es menos carcinogénico que él y el nivel de sensibilidad es mucho mayor (25-100 veces más sensible). El fluorocromo es capaz de unirse a ADNdc, ADNcs y ARN y sólo manifiesta fluorescencia cuando está unido al AN y se irradia la muestra con luz UV. La sensibilidad de este método alcanza entre 20 y 60 pg de ADNdc y 1-2 ng para ARN, ADNcs y oligonucleótidos. Azul de metileno y naranja de acridina: Los niveles de sensibilidad de estos dos reactivos están muy lejos de los dos anteriores (40-200 ng de ADNdc para el azul de metileno 50-100 ng de ADNdc y ADNcs respectivamente, para el naranja de acridina), sin embargo, el hecho de tratarlos se debe a que el azul de metileno no es tóxico y el naranja de acridina permite distinguir entre moléculas de cadena sencilla (presentan fluorescencia en color rojo) y cadena doble (que presentan fluorescencia en color verde.). La mayoría de estos colorantes químicos no solo se emplean para cuantificar los AN en solución, sino que son ampliamente utilizados para visualizar las moléculas de los mismos cuando se separaran por electroforesis en gel como veremos más adelante. Métodos de detección por hibridación: Southern y Northern Las principales técnicas de detección/identificación de AN se basan en la complementariedad de bases, propiedad química que hace que dos cadenas simples de ácidos nucleicos se unan o apareen entre sí al establecerse puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de cada cadena. Esta propiedad hace que dos cadenas complementarias de un AN (ADNdc o ARNdc o híbrido ADN/ARN) puedan ser separadas individualmente (desnaturalizadas) mediante distintos tratamientos y luego vuelvan a unirse de forma espontánea al cesar el proceso de desnaturalización. Las técnicas que aprovechan esta propiedad se denominan técnicas de hibridación, las principales son el Southern y el Northern. La idea es obtener un fragmen-

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to de ADN (denominado sonda) o ARN (ribosonda) de cadena sencilla marcado de alguna forma (isotópica, fluorescente o enzimáticamente), que, en presencia de una población de moléculas de ADN o ARN, sea capaz hibridar o aparearse con secuencias complementarias presentes en esa población de AN. La marca de la sonda hibridada nos identificará la molécula de interés de la población total. Las técnicas de hibridación normalmente requieren de un paso de separación e inmovilización de las poblaciones o fragmentos de ácidos nucleicos previo a la identificación con sondas. Normalmente el paso suele ser la electroforesis. Electroforesis de AN. Los ácidos nucleicos sometidos a electroforesis van a migrar en el campo eléctrico generado hacia el cátodo (b+) debido a su carga neta negativa. Su velocidad vendrá determinada por su tamaño molecular y el tamaño de poro determinado por la composición de la matriz. La electroforesis a través de geles de agarosa o poliacrilamida es un método estándar de separación, identificación y purificación de fragmentos de AN principalmente ADN. La localización de fragmentos de ADN o poblaciones de ARN dentro del gel puede ser determinada por tinción del gel con un agente intercalante de los AN como son el bromuro de etidio o Sybr Green®; así, bandas discretas de ADN o ARN pueden ser identificadas mediante visualización del gel teñido expuesto a la luz ultravioleta. Si fuera necesario, es posible aislar las moléculas de AN que componen una banda discreta y recuperarlas del gel para su empleo en variedad de aplicaciones. Los geles de agarosa y poliacrilamida se pueden emplear en multitud de tamaños, grosores y porosidades y desarrollar la electroforesis en diferentes configuraciones. La elección depende principalmente del tamaño de los fragmentos a separar: • Los geles de poliacrilamida en vertical son el método de elección más efectivo en la separación de pequeños fragmentos de ADN (5 A 500 pb —pares de bases—). El poder de resolución es tan alto, que es posible separar fragmentos de ADN que difieren en tamaño en 1 pb, como ocurre en el caso de la secuenciación de ADN. Los principales inconvenientes de los geles de poliacrilamida son: la neurotoxicidad de la acrilamida y la dificultad de preparación y manejo. • Los geles de agarosa poseen un poder de resolución mucho menor pero presentan a su favor una amplio rango de separación para fragmentos de alto peso molecular (100 pb A 50 Kpb). Normalmente los geles de agarosa se desarrollan en horizontal y sumergidos en el tampón de electroforesis. Existen una serie de factores que afectan la migración de los AN sometidos a electroforesis, entre todos ellos destacaremos: — Tamaño o peso molecular: Moléculas lineales de AN de cadena doble migran a través de la matriz del gel a velocidades inversamente proporcionales al logaritmo decimal de su peso molecular en pb. La moléculas de alto peso molecular migran más lentamente que las de bajo peso molecular debido al efecto de filtrado ejercido por el tamaño de poro de la matriz del gel.

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— Porosidad de la matriz del gel: Un fragmento lineal de AN migra a diferente velocidad en función del tamaño de poro del gel. Usando geles de diferentes concentraciones de agarosa o poliacrilamida es posible resolver distintos rangos de tamaños de AN. — Conformación del AN: La conformación de las moléculas también influye sobre la velocidad de migración, en presencia de bromuro de etidio las moléculas lineales son las más lentas, a continuación las moléculas circulares con cortes y las más rápidas son las moléculas circulares cerradas. Técnicas de Southern y Northern. En realidad se trata de una única técnica de hibridación con sondas con dos variaciones: El Southern trata de identificar unas moléculas de ADN concretas en una población general de moléculas de ADN separadas por electroforesis e inmovilizadas en un filtro mediante el empleo de una sonda específica (ya sea sonda o ribosonda). La técnica del Northern trata de realizar el mismo objetivo pero sobre una población de moléculas de ARN. En resumen, la técnica de Southern identifica por hibridación moléculas específicas de ADN mientras que la técnica de Northern identifica por hibridación moléculas específicas de ARN. Ambas técnicas se basan en la capacidad de adsorción selectiva que tienen las membranas de nitrocelulosa para retener específicamente ADN o ARN de cadena sencilla. Si bien en un principio fue la nitrocelulosa el soporte empleado, en la actualidad existe una amplia oferta comercial de membranas adaptadas a la fijación específica de AN de cadena sencilla o doble, diseñadas para ADN y/o ARN que, mediante la unión covalente de las moléculas inicialmente adsorbidas, permiten su empleo sucesivas veces. Las más utilizadas en la actualidad son las membranas de nailon cargadas positivamente. Aunque cada fabricante refiere las condiciones para una retención óptima del AN con su membrana, el procedimiento general se describe a continuación: 1. En un primer paso la población de moléculas se separa por electroforesis, esta población puede variar desde un ADN genómico de alto peso molecular digerido con enzimas de restricción hasta el ARN total de un tejido o cultivo celular. En el caso de electroforesis de ARN, ésta se realiza en condiciones desnaturalizantes (en presencia de formaldehído o glioxal) de forma que el ARN migre en el gel como moléculas lineales en función sólo de su peso molecular. 2. Tras la electroforesis, el gel, conteniendo las distintas poblaciones de AN separadas por peso molecular, se somete a un tratamiento desnaturalizante de forma que todas las moléculas sean de cadena sencilla. Este tratamiento se suele realizar con una solución de alta sal y con hidróxido sódico, después se neutraliza el gel en condiciones de alta sal para evitar que las cadenas desnaturalizadas por acción del hidróxido sódico vuelvan a hibridar entre sí. En el caso del ARN no es necesario este tratamiento desnaturalizante. 3. El siguiente paso es la transferencia de las moléculas de AN desnaturalizadas desde el gel de electroforesis hasta la membrana de nitrocelulosa o nailon.

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Existen tres métodos de transferencia básicos, a elección en función de las características de las membranas a emplear, tipo de gel y AN a transferir: — Capilaridad: Fue el método empleado originalmente. En este método los fragmentos de AN son transportados desde el gel hasta el filtro mediante un flujo de líquido que es mantenido por la acción capilar ejercida por un bloque de papel absorbente. Obviamente, la velocidad de transferencia es función del tamaño de poro del gel y del tamaño molecular de los AN: a menor tamaño molecular mayor movilidad. Normalmente las transferencias por capilaridad se realizan durante una noche (12-15 horas). — Electrotransferencia: Es un método más rápido que la capilaridad que se basa en transferir las moléculas de AN desde el gel hasta la membrana a través de un campo eléctrico empleando un tampón de transferencia. Este sistema requiere habitualmente de un sistema de enfriamiento del tampón ya que se genera bastante calor en la transferencia. Este método es el de elección para transferencias desde geles de poliacrilamida y se lleva a cabo normalmente entre 2-3 horas. — Vacío: La transferencia por vacío es extremadamente más rápida y eficiente que la capilaridad. En este método, el gel es puesto en contacto directo con el filtro y ambos depositados sobre una base porosa conectada a una cámara de vacío. Un contenedor con tampón de transferencia que es situado encima del gel, proporciona la solución que arrastra los AN desde el gel hasta el filtro al ser absorbido por el vacío de la cámara inferior. La transferencia se realiza entre 30 minutos y una hora. 4. Una vez obtenido el filtro o membrana con la población de moléculas de AN separadas y adheridas, el siguiente paso consiste en identificar aquellas moléculas que tienen algún interés, para ello es necesario diseñar una sonda que sirva como anzuelo molecular para «pescar», mediante hibridación, esa población de moléculas. La dificultad técnica reside en cómo diseñar la sonda y prepararla para nuestros propósitos. Existen diferentes abordajes: — Si lo que se persigue es identificar un gen de secuencia no conocida aún, es posible emplear como sonda un fragmento del gen homólogo de una especie relacionada. — Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica es posible deducir mediante la equivalencia entre codón (triplete de nucleótidos que codifica por un aminoácido) y aminoácido, la secuencia de nucleótidos que posee el gen en su parte codificante y poder diseñar y sintetizar sondas ARN que tengan la secuencia complementaria para capturar el fragmento que contenga el gen. — En el caso de disponer de información de la secuencia de nucleótidos del gen el procedimiento es igual al anterior: diseño y síntesis de fragmentos de cadena simple de ADN o ARN que tengan la secuencia complementaria del gen para emplearlos como sonda.

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En lo referente a la preparación de la sonda, la elección de la naturaleza (sonda de ADN o ARN), la longitud de la misma y el tipo de marcaje (isotópico, fluorescente o enzimático, etc.) depende de cada caso, pero en general la preparación de la sonda se realiza por marcaje in vitro utilizando las enzimas anteriormente descritas y los procedimientos de relleno de extremos, nick translation, marcajes terminales, etc. 5. Para finalizar, una vez se dispone de la sonda marcada y las poblaciones de AN inmovilizadas en el filtro, los pasos finales se destinan a lograr que las moléculas de sonda busquen e hibriden con las moléculas de AN que poseen la secuencia complementaria. La hibridación se lleva a cabo en recipientes herméticos, (bolsas selladas o tubos cerrados), a elevada temperatura que ponen en contacto el filtro con el AN y una solución de hibridación que contiene las moléculas de sonda y una serie de aditivos que optimizan y favorecen la hibridación. La temperatura a la cual se realiza el proceso de hibridación es un parámetro crítico ya que va a determinar la formación del híbrido específico entre la sonda y las moléculas de AN diana. Una temperatura demasiado baja producirá hibridaciones inespecíficas por apareamientos parciales de la sonda con fragmentos que sólo sean complementarios con alguna región de la sonda. Una temperatura demasiado alta evitará la hibridación entre la sonda y el AN. 6. Pasado el tiempo de hibridación se procede a la identificación del AN que ha hibridado con las moléculas de sonda, para ello se lava el filtro para eliminar las moléculas de sonda que no estén completamente hibridadas a su AN complementario y se procede a revelar la señal portada por la sonda: — Si el marcaje de la sonda es isotópico o fluorescente, la energía de la radiación o fluorescencia se utiliza para impresionar películas autorradiográficas, de forma que una vez expuesto el filtro con la película y revelada ésta es posible identificar las bandas hibridadas al aparecer éstas como bandas de color gris o negro sobre un fondo claro. — Si el marcaje de la sonda es enzimático, el revelado puede ser directo sobre el mismo filtro, utilizando algún sustrato colorante que reacciona con la enzima de la sonda y permite la visualización o emite quimioluminiscencia que es detectada, de forma indirecta, mediante una película autorradiográfica.

Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos La variabilidad de las moléculas de los AN no radica en su estructura ni en la diversidad de sus componentes, sino en el orden secuencial de los cuatro nucleótidos constituyentes de sus moléculas (A, G, C y T para el ADN y A, G, C y U para el ARN). Dado que diferencias de un solo nucleótido en una secuencia pueden representar un enorme cambio en la proteína codificada, el último paso en el conocimiento de los AN reside en la determinación de su secuencia constituyente.

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Secuenciación del ADN Existen dos técnicas básicas rápidas para obtener la secuencia correcta de un ADN: secuenciación por el método de degradación química y secuenciación por el método enzimático. Aunque diferentes en el abordaje ambos métodos comparten algunos puntos: • Es necesario el marcaje (isotópico o fluorescente) de las moléculas a secuenciar. • Es necesario generar una población de moléculas de ADNcs marcadas en un extremo cuyo tamaño molecular difiera únicamente en un solo nucleótido. Esta población de moléculas puede ser separada en sus elementos constituyentes, que difieren en una sola base, mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida. El orden de los nucleótidos en el ADN puede ser leído directamente de la imagen del gel obtenida por autorradiografía o por un sistema automático de lectura asistida por computador. Método de secuenciación por degradación química: Fue descrito inicialmente por Maxam y Gilber en 1977 y modificado en 1980. El método implica un marcaje de la molécula a secuenciar en uno de sus extremos. Este marcaje terminal se lleva a cabo en los extremos 5’ P mediante la acción de la enzima T4 polinucleótido quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5’[a32P o a35S]. Como el marcaje terminal se verifica en ambas cadenas del ADNdc es necesario separarlas para la secuenciación de cada una individualmente (mediante el corte con una enzima de restricción por ejemplo). El marcaje terminal genera de esta forma una población de moléculas idénticas marcadas en su extremo 5’. El siguiente paso es separar la población en cuatro muestras que se someterán, por separado, a una degradación química específica para una base o tipo de base (púricas: A+G o pirimidínicas T+C). Las condiciones de reacción con los reactivos específicos son tales que sólo se permita una modificación de una(s) base(s) por molécula. De esta forma distintas moléculas, para un mismo tratamiento, serán modificadas en diferentes puntos susceptibles de degradación. Se emplean cuatro tipos de reactivos específicos, el primero modifica los residuos de guanina (G), el segundo modifica las purinas: adenina (A) y guanina (G) (A+G), el tercer reactivo modifica los residuos de timina (T) y el último ataca las citosinas (C). El tratamiento final de estas moléculas con otro reactivo (piperidina) rompe la cadena por la base modificada. Cada tratamiento individual ha generado una población de moléculas que poseen un extremo 5’ terminal común marcado y se alargan hasta el punto en donde la base específica fue modificada. Las moléculas obtenidas por los cuatro tratamientos se separan mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida cargando cada reacción en pocillos contiguos. La exposición del gel seco a una película de autorradiografía hace que se obtenga una escalera decreciente de fragmentos radiactivos que permiten la lectura secuencial de los nucleótidos modificados desde el extremo inferior del gel (representado por el nucleótido más próximo al extremo 5’ marcado) hasta la parte superior del gel (que representa los extremos más alejado del mar-

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caje terminal). Este método de secuenciación cuando está optimizado permite la lectura directa de fragmentos de unos 250 nucleótidos como máximo, pero presenta una gran ventaja: la secuenciación es directa sobre moléculas de ADN originales, a diferencia del método enzimático que la secuencia se determina a partir una copia generada del fragmento molde a secuenciar. Método de secuenciación enzimática: Fue descrito inicialmente por Sanger en 1977. Es conocido como método de terminación de cadena por dideoxinucleótidos trifosfatos (ddNTPs). El método se basa en obtener una población de moléculas marcadas sintetizadas a partir del ADN molde del cual queremos obtener la secuencia, para ello se necesita un cebador que proporcione el extremo 3’-OH libre para la síntesis del ADN por la acción de una polimerasa. Este oligonucleótido cebador suele ser específico y complementario de una secuencia de localización concreta en el fragmento del ADN molde a secuenciar o próxima a él en el vector de secuenciación. Las enzimas empleadas para la síntesis del ADN que vamos a marcar radiactivamente (normalmente usando _ 35S dATP) son el fragmento Klenow de la ADNpol I o más frecuentemente la Secuenasa®. Al igual que con el método de secuenciación química, el ADN a secuenciar se divide en cuatro muestras y en cada una individualmente se llevarán a cabo reacciones específicas para cada base (A, T, G, C). Las reacciones de secuenciación individuales se llevan a cabo en dos pasos: En el primer paso el cebador se hibrida con el ADN molde y se inicia la síntesis del ADN complementario hasta una distancia determinada del punto de hibridación, esta síntesis se lleva a cabo en presencia de los cuatro, dNTPs incluyendo el _ 35S dATP marcado isotópicamente. En el segundo paso se incorpora a cada reacción una pequeña cantidad de un dideoxirribonucleótido análogo de la base específica que queremos identificar, así en la muestra de identificación de la adenina (A) se añade dideoxirriboadenosina trifosfato (ddATP), a la muestra de la citosina se le añade dideoxirribocitosina trifosfato (ddCTP) y lo mismo en las muestras restantes, ddTTP y ddGTP. La adición de los ddNTPs provoca la terminación de las cadenas que estaban siendo elongadas cuando incorporan el ddNMP. Los dideoxirribonucleótidos, al carecer de grupos -OH tanto en el carbono 2’ como en el 3’ de la ribosa, imposibilitan el crecimiento de la cadena en la que se han incorporado y se paraliza su síntesis. El resultado final en cada muestra es una población de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base en concreto existan en la secuencia. Los fragmentos generados se cargan y separan por electroforesis, como en el caso anterior, y la secuencia se lee directamente por autorradiografia del gel de igual forma. Este método permite leer por encima de 300 nucleótidos.

Métodos de secuenciación automática del ADN La incorporación de la informática y la microelectrónica al campo de la secuenciación y la carrera por la obtención de la secuencia completa del genoma humano

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han llevado al desarrollo de sistemas automatizados para obtener y analizar la secuencia de bases de cualquier ADN. Existen dos sistemas básicos de secuenciación automática: Secuenciación por hibridación: Microchips de ADN. Es un método, actualmente en desarrollo, basado en utilizar oligonucleótidos sintéticos de secuencia conocida inmovilizados en un soporte de vidrio modificado o polipropileno que permiten la hibridación y detección de fragmentos de ADN marcados (con fluorocromos o isotópicamente) de secuencia desconocida. Un ordenador, con el software apropiado se encarga de la lectura del microchip de ADN y determina la secuencia del ADN. Secuenciación automática con fluorocromos: Es una adaptación del método de secuenciación enzimática que permite eliminar el marcaje radiactivo y automatizar las fases de manipulación del gel y lectura de la secuencia. Las reacciones de secuenciación se realizan mediante la técnica de PCR. El marcaje de la población de moléculas generada por elongación del ADN molde se realiza de dos formas: 1) Marcaje terminal de las cadenas terminadas, cada uno de los cuatro dideoxirribonucleótidos de terminación de cadena lleva conjugado un fluorocromo diferente. Esta estrategia ha sido utilizada por la empresa Celera en la secuenciación del genoma humano. 2) Marcaje de cebadores. Las moléculas de cebadores de cada reacción se marcan con un único fluorocromo o bien con diferentes tipos de fluorocromo. En la primera opción, cuando las cadenas han sido terminadas por los dideoxirribonucleótidos cada reacción se lee mediante un rayo láser en pocillos separados de un gel de electroforesis. El rayo láser manda la información del tamaño del fragmento detectado en cada pocillo a un ordenador, que se encarga de ordenar los fragmentos y proporcionar la secuencia. En la segunda opción, como los cebadores están marcados de forma diferencial con diferentes fluorocromos, las cuatro reacciones se cargan en un único pocillo y son leídas directamente por el rayo láser. Como los espectros de emisión de cada fluorocromo son distintos el láser envía directamente al ordenador información de la secuencia a medida que los fragmentos, con diferentes pesos moleculares, pasan por el detector. Con estos métodos de secuenciación rápida es posible determinar un total de unas 600 bases con fiabilidad. Es posible utilizar también el método de marcaje con fluorocromos para realizar de una forma automatizada la secuenciación por degradación química. La única diferencia es que son las moléculas originales de ADN las que resultan marcadas con el/los fluorocromo/s. Secuenciación del ARN Al igual que en la secuenciación del ADN existen las mismas técnicas rápidas para obtener la secuencia correcta de un ARN: secuenciación por el método de degradación química y secuenciación por el método enzimático. Las consideraciones establecidas para la secuenciación del ADN son también válidas aquí: el mar-

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caje (isotópico o fluorescente) de las moléculas a secuenciar y la generación una población de moléculas de ARN marcadas en un extremo cuyo tamaño molecular difiera únicamente en un solo nucleótido que se resuelve posteriormente en sus elementos constituyentes mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida. El orden de los nucleótidos en el ARN es establecido de la lectura directa de una autorradiografía del gel. Método de secuenciación por degradación química: Se procede al marcaje 5’ terminal de la moléculas de ARN mediante la acción de la enzima T4 polinucleótido quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5’[a32P o a35S]. El siguiente paso es separar la población en cuatro muestras que se someterán, por separado a una degradación química específica para una base o tipo de base (puricas: A+G o pirimidinicas U+C). Las condiciones de reacción y los reactivos empleados son diferentes a los empleados en la secuenciación del ADN pero los pasos de separación de las moléculas por electroforesis y lectura de la secuencia son equivalentes. Método de secuenciación por degradación enzimática: Este método no es equivalente al método enzimático de secuenciación del ADN, en realidad es una variación del método anterior de degradación química pero utilizando la especificidad de corte de ribonucleasas para degradar específicamente una base o grupo de bases. Así la ribonucleasa T1, ARNasa T1 corta en guaninas (G), la ARNasa P corta en pirimidinas (C+U), la ARNasa U2 corta en adeninas (A) y la ARNasa I corta en adeninas, guaninas y uracilos (-C). Una estrategia alternativa es secuenciar el ARN a través de su copia a ADNc y secuenciar el ADNc de cadena sencilla mediante los métodos de secuenciación del ADN. Si el ARN a secuenciar es un ARN mensajero eucariótico, la cola de poli-A del extremo 3’ puede servir de molde para un corto cebador poliT. La hibridación del cebador e incubación de ambos con una transcriptasa reversa en presencia de dNTPs provoca la síntesis de la cadena de ADNc sobre el molde de ARN. La eliminación posterior del ARN molde mediante la adición de ARNasa H, libera las moléculas de ADNc de cadena simple que puede ser secuenciado directamente por cualquier método de secuenciación de ADN. En el caso de que los ARN a secuenciar carezcan de cola de poli-A, la estrategia es la misma pero utilizando la actividad de la enzimas poli-A polimerasa para añadir una cola de poli-A que sirva de secuencia de enganche al cebador poli-T para la síntesis de la cadena complementaria de ADNc.

Aplicaciones de la secuenciación de ácidos nucleicos Los métodos de secuenciación automatizada han supuesto una revolución biotecnológica, si en principio se procedió a la determinación de la secuencia de bases de genes codificantes de proteínas conocidas como la insulina, citocromo c, hemoglobina, interferones, etc., y se procedió al estudio de las mutaciones que generaban diferentes enfermedades genéticas como la hemofilia A y talasemias, en la actualidad se está abordando el proceso inverso, el denominado clonaje posicional, la idea

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es proceder a secuenciar grandes regiones del genoma y localizar posteriormente enfermedades cuyos marcadores citogenéticos estén relacionados con los genes descubiertos en dichas regiones y de los cuales se desconoce la función de la proteína o proteínas que provocan la enfermedad. Los intereses científicos y económicos implicados han desencadenado una verdadera carrera para obtener la secuencia completa del genoma humano (3 × 10 9 pares de bases). La secuencia completa identificará unos 35.000 nuevos genes que constituirán un verdadero diccionario del ser humano y cuya información será empleada (bajo patente) para generar nuevos agentes terapéuticos en cuatro áreas principales: • Terapia Génica: Cada nuevo gen descubierto posee el potencial de uso en terapia génica humana. La terapia génica se empleará para el tratamiento del cáncer, enfermedades genéticas y enfermedades inducidas por virus (SIDA hepatitis, etc.). • Terapia Proteica: Cada nuevo gen puede emplearse para generar su correspondiente proteína recombinante que pueda usarse como agente terapéutico en distintas enfermedades. Ejemplos actuales son la eritropoyetina, interferones, hormona de crecimiento o la insulina. • Estudios farmacogenómicos: Puesto que el genoma humano contiene numerosas variaciones denominadas polimorfismos no existen dos individuos iguales. Cuando estas variaciones afectan a regiones codificantes de genes, las proteínas de distintos individuos pueden manifestar diferentes comportamientos en términos de eficacia o efectos secundarios, frente a una droga determinada. La correlación entre cambios en el genoma y el estudio de los efectos farmacológicos de una droga se conoce como farmacogenómica. Un ejemplo de un gen con diferentes variantes polimorficas que afectan al metabolismo de drogas terapéuticas es el gen del citocromo P450. • Diseño Químico: Cada nuevo producto génico es una nueva diana para desarrollar, mediante ingeniería química, nuevas moléculas capaces de interaccionar con él aumentando o bloqueando su actividad. (Generación de moléculas bloqueantes de receptores celulares, bloqueo de moléculas de anticuerpos, etc.). • Otras aplicaciones de la secuenciación de los AN se encuentran en el campo de la medicina forense o en estudios epidemiológicos.

Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa o PCR puede definirse como un método enzimático in vitro que permite la amplificación selectiva de una secuencia de ADN dada. Este mecanismo de amplificación selectivo in vitro mimetiza el proceso de replicación del ADN in vivo. Para entender la reacción de PCR es necesario recordar varios puntos principales: • Las dos cadenas de ADN forman una doble hélice.

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• La secuencia de bases en ambas cadenas de la molécula de ADN es complementaria. • La orientación de ambas cadenas es opuesta: La cadena sentido posee orientación. 5’ A 3’ La cadena antisentido posee orientación 3’ A 5’. • Todas las polimerasas conocidas sintetizan ADN en el sentido 5’ A 3’. La PCR consiste en la amplificación de copias de ADN por medio de la repetición de unas reacciones cíclicas, que constan de tres pasos que se realizan a diferentes temperaturas: 1) desnaturalización 2) hibridación y 3) extensión. En el primer paso, desnaturalización, las moléculas de ADN de doble cadena se desnaturalizan por calor; la temperatura, entre 92-95 °C, rompe los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas complementarias y se separan entre sí como cadenas sencillas de ADN que servirán de moldes para la amplificación. En el segundo paso, hibridación, dos tipos de moléculas cebadoras (primers) cuyas secuencias son complementarias a los extremos de la secuencia a amplificar en el ADN, hibridan específicamente con las secuencias presentes en las moléculas de ADN molde desnaturalizadas anteriormente. La temperatura de hibridación varía entre 60-40 °C en función de la longitud y secuencia de los cebadores. Una vez hibridadas las moléculas de los cebadores al ADN molde se generan cortos fragmentos de ADN de doble banda que sirven como puntos de partida para la posterior polimerización. En el tercer paso, extensión, una ADN polimerasa termorresistente sintetiza una cadena complementaria a cada una de las cadenas molde, adicionando nucleótidos al extremo 3’ del cebador hibridado. La reacción de elongación se realiza a una temperatura próxima a los 72 °C y se realiza en ambas cadenas en dirección de la secuencia que se quiere amplificar. Al final del proceso de extensión se generan dos nuevas moléculas de ADN de cadena doble idénticas a la original en la secuencia amplificada. Las nuevas cadenas sintetizadas sirven a su vez, además del ADN original, como moldes en el siguiente ciclo de reacción. Los ciclos se repiten un número variable de veces entre 20-45, resultando una acumulación exponencial del fragmento de ADN amplificado delimitado por cebadores: en teoría, después de 20 ciclos de amplificación se obtendría un millón de copias de la secuencia amplificada, después de 30 ciclos 1.000 millones de copias. A medida que aumenta el número de ciclos se incrementa la cantidad de moléculas en las cuales sólo se amplifica la región de interés comprendida entre ambos cebadores. Esta cantidad de ADN amplificado es más que suficiente para ser visualizado y cuantificado por los métodos espectofotométricos o directamente en geles de electroforesis con colorantes como el BrEt o Sybr-green®. El ARN puede también servir de molde para la PCR (RT-PCR), pero se necesita un paso previo de síntesis a ADNc catalizada por una transcriptasa reversa. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente ADN polimerasas termo-

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rresistentes con actividad transcriptasa reversa que permiten la realización de que ambas reacciones de forma secuencial con una sola enzima y en el mismo tubo de reacción. Las reacciones de PCR se encuentran totalmente automatizadas por el uso de aparatos llamados termocicladores que realizan de forma autónoma los ciclos de subidas y bajadas de temperatura. Cada ciclo de reacción (desnaturalización-hibridación-extensión) se repite una y otra vez en menos de 3-4 minutos, por lo que en menos de dos horas se pueden generar más de 1.000 millones de copias de la secuencia deseada. Desde la publicación en 1985 del método de la amplificación específica de fragmentos de ADN por Mullis, Saki y colaboradores, la reacción en cadena de la Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) ha producido un cambio revolucionario en las tecnologías aplicadas al diagnóstico y la investigación. La PCR se ha convertido en un procedimiento rutinario, imprescindible en cualquier laboratorio de biología molecular debido a su capacidad para amplificar fragmentos de ADN (o ARN) de forma específica. La posibilidad de automatización de esta técnica abre un potencial ilimitado de aplicaciones, entre las cuales podemos destacar: • Diagnóstico genético pre y postnatal de enfermedades genéticas. • Estudio y análisis de mutaciones en enfermedades genéticas. • Diagnostico general (sanidad, agricultura y ganadería) de enfermedades infecciosas causadas por diferentes organismos (virus, bacterias o parásitos unicelulares). • Aislamiento de genes a partir de genotecas. • Estudios epidemiológicos. • Estudios de evolución molecular entre especies. • Obtención de huellas genéticas aplicables a medicina forense (estudios de paternidad y análisis de muestras de ADN en casos forenses de crímenes o violaciones). La extraordinaria y rápida contribución de esta metodología en proyectos médicos, industriales y de investigación fue reconocida por la concesión del Premio Nobel de Medicina a su autor, K. Mullis, sólo ocho años después de su descubrimiento.

13 La ingeniería genética II. Proteínas recombinantes J. Casatorres Hernández

Introducción Como se indicó en la introducción con la tecnología del ADN recombinante, además del avance en conocimientos e investigación básica, uno de los principales objetivos de la ingeniería genética persigue la producción masiva de proteínas con alto valor terapéutico en diferentes organismos. Este objetivo implica la reprogramación genética de los organismos para adquirir los genes que les capacitan para la síntesis de las proteínas de interés. La estrategia a seguir para lograr esta reprogramación conlleva una serie de pasos sucesivos: 1) aislamiento del gen que codifica para la proteína de interés; 2) inserción del gen en un vector adecuado; 3) transferencia del vector recombinante al organismo hospedador; 4) selección de los organismos modificados genéticamente que expresan el gen de interés; 5) caracterización del producto clonado; y 6) crecimiento a gran escala de los organismos genéticamente modificados para la producción industrial de la proteína de interés. Con la excepción del punto 6) que será objeto de otro capítulo, pasaremos a analizar los elementos clave implicados en este proceso.

Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje) En el caso de proteínas constituidas por un pequeño número de aminoácidos de los cuales se conoce su secuencia (entre 15-20 aminoácidos), es posible un abordaje directo y sintetizar artificialmente el gen teniendo en cuenta el código genético: tres bases sucesivas en el ADN (codón) codifican por un aminoácido. Conociendo los codones que codifican de los aminoácidos identificados se procede a la síntesis química de un oligonucleótido que sería la cadena sencilla codificante de la proteína (cadena con sentido). Una vez sintetizada la cadena con sentido se sintetiza la

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cadena complementaria para disponer del fragmento de ADNdc que se incluiría en el vector adecuado. Este abordaje tan sencillo, no es posible llevarlo a cabo con proteínas de alto peso molecular. Puesto que el gen a aislar se encuentra dentro del genoma completo del individuo, el aislamiento del gen del resto de las secuencias implica necesariamente un primer paso de fragmentación del ADN completo del organismo en fragmentos de un tamaño adecuado de manera que en alguno/s de los fragmentos generados se encuentre nuestro gen. El mayor problema de la ruptura del genoma completo es la obtención de fragmentos de ADNdc de tamaños adecuados y a la vez que homogéneos. Las técnicas de ruptura del ADN genómico para la obtención de fragmentos (insertos) son de dos tipos: • Roturas inespecíficas: El ADN se rompe por mecanismos físicos como agitación o ultrasonicación. La fragmentación se produce al azar y los fragmentos generados oscilan entra 300 pb y 40 Kpbs según el método empleado. En general, las condiciones se eligen para generar fragmentos de tamaño medio entre 20 y 40 Kpbs, suficientemente grandes para incluir la mayoría de los genes típicos. • Roturas específicas: El ADN genómico se digiere mediante enzimas de restricción de tipo II que reconocen y cortan en secuencias específicas. Se suelen elegir enzimas con dianas de corte de cuatro nucleótidos y las condiciones de digestión son parciales de forma que no se corten todas las dianas para la enzima en todas las moléculas de ADN genómico. La enzima de restricción más empleada es Sau3A. Con cualquiera de los dos métodos se obtienen poblaciones de insertos de ADN genómicos en los que se encuentra representada la totalidad del genoma del organismo que sintetiza la proteína de interés. Estos fragmentos, incluidos en vectores adecuados, constituirán las llamadas genotecas o librerías genómicas (también llamadas bancos de genes). Un abordaje más adecuado y sencillo siempre que se trate del clonaje de genes eucarióticos es conseguir fragmentos de ADN que incluyan sólo las secuencias que codifican para proteínas y buscar el fragmento que codifica nuestra proteína. Para obtener este tipo de fragmentos se parte del ARN mensajero (ARNm) maduro del tipo celular donde se expresa la proteína de interés o del organismo completo. Todas las moléculas de ARNm se copian en ADN complementario o copia (ADNc) mediante la acción de la enzima transcriptasa reversa. Se obtiene así una población de fragmentos de ADNc que son representativas de los genes que se expresan en un momento dado en una población celular. La inserción de estos fragmentos en vectores adecuados da lugar a las genotecas de ADNc o librerías de expresión. Por lo general, el aislamiento y clonaje de un gen de secuencia conocida no implicará necesariamente la construcción de una genoteca, en la actualidad se dispone comercialmente de un amplio catálogo de genotecas, tanto genómicas de múl-

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tiples organismos, como genotecas de expresión de distintos organismos, tejidos o fases de desarrollo, para proceder a la búsqueda del gen de interés mediante la técnica de PCR. La secuencia del gen será amplificada del ADN de la genoteca e incluida en el vector adecuado a través las dianas de restricción presentes en las moléculas de los primers cebadores. Por si ello no fuera suficiente, existen empresas comerciales capaces de generar genotecas a medida a partir del ADN genómico proporcionado el investigador o, incluso, proceder al aislamiento directo del clon que contenga el gen de interés para el investigador.

Inserción del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN Una vez obtenidos los insertos representativos de todo el genoma o sólo de aquellos genes que se expresan en proteína, se insertan en moléculas genéticas portadoras (vectores). Los vectores son moléculas especiales de ADN que sirven como vehículos para la transferencia de ADN a distintos organismos hospedadores. A grandes rasgos es posible distinguir dos tipos principales de vectores: • Vectores de clonaje: Son aquellos utilizados para servir únicamente como vehículos replicativos del ADN que llevan insertado. • Vectores de expresión: Son aquellos que llevan todos los elementos para la expresión del gen que va incluido en el inserto una vez introducido en el hospedador adecuado. Si bien esta diferenciación es válida a nivel conceptual, la gama actual de vectores disponibles hace que las barreras de definición de uno y otro tipo queden a menudo eliminadas y es posible obtener vectores con ambas características. Por lo general, se tiende a emplear los vectores de clonaje para la inserción de grandes fragmentos de ADN (construcción de genotecas de ADN genómico) en los cuales proceder, posteriormente, a la identificación del fragmento que posee el gen de interés. Una vez identificado el inserto, se procede a su manipulación (subclonaje) para eliminar las secuencias adyacentes hasta obtener un fragmento que sólo incluya el gen de interés. Los vectores de expresión se emplean, bien cuando el gen de interés está ya caracterizado (subclonado), bien para insertar fragmentos de ADNc cuya expresión es directa (genotecas de ADNc). La elección del tándem vector-hospedador es crítica a la hora de lograr el fin experimental de obtener la expresión de una proteína de interés. La elección exige sólidos conocimientos sobre los mecanismos de replicación/expresión del vector y sobre los mecanismos de expresión del gen en la célula hospedadora en donde se va a introducir. Los vectores actuales, tanto para células hospedadoras procarióticas como para células eucarióticas, son construcciones artificiales muy complejas, elaboradas mediante técnicas de ingeniería genética en base a una serie de cualidades:

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• Estabilidad, una vez incluido el fragmento de ADN exógeno no debe perderlo ni modificarlo. • Genéticamente heredables a la progenie. • Fenotipo seleccionable, el vector debe conferir unas características que nos permitan identificarlo en la población de células hospedadoras (resistencia a antibióticos, actividad enzimática marcadora, expresión de una proteína fluorescente). • Número de copias constante y alto para que se incremente el número de copias del gen mantenidas dentro del hospedador o ser susceptibles de ser traducidas a proteína. • Capacidad de replicación en varios tipos de hospedadores (vectores lanzaderas). • Existencia de regiones de control de replicación, expresión compatibles con la biología molecular de las células hospedadoras. La presencia de estas regiones de control en el entorno del hospedador adecuado servirán para lograr tanto una adecuada replicación del gen incluido en el vector como una potente expresión del gen. De particular importancia son las señales de excreción que permiten la excreción de la proteína al exterior celular para facilitar la purificación de la misma. Los vectores más utilizados en ingeniería genética son de cuatro tipos principales: 1) Plásmidos; 2) Cósmidos; 3) Bacteriófagos; y 4) vectores virales eucarióticos. 1) Plásmidos: Son moléculas de ADNdc circulares de pequeño tamaño (53-4 Kpbs) con replicación autónoma aislados inicialmente en bacterias a la cuales confieren resistencia a antibióticos. Los plásmidos actuales son todos artificiales y tienen su tamaño reducido al mínimo para así aumentar su capacidad de aceptar insertos. El tamaño máximo de inserto aceptado suele ser de 10-13 Kpbs, ya que plásmidos recombinantes (plásmido+inserto) de más de 15 Kpbs son muy inestables. Todos los plásmidos artificiales poseen: Adaptadores de policlonaje, secuencias únicas para 10 o más enzimas de restricción, estos adaptadores de policlonaje se emplean para incluir el inserto dentro del vector. Marcadores fenotípicos de selección. Normalmente son de dos tipos, genes de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol o neomicina) y genes de marcadores enzimaticos (`-galactosidasa) o fluorescentes (luciferasa o GFP). En el caso de plásmidos bacterianos normalmente el adaptador de policlonaje se encuentra incluido en medio del gen de la `galactosidasa. La secuencia de policlonaje no afecta a la expresión de la enzima de manera que las células hospedadoras bacterianas que reciben el vector sin inserto poseen `-galactosidasa, estas colonias en presencia de un colorante llamado X-gal presentan un color azulado en placas de agar. Si el

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vector lleva un inserto, la interrupción de la secuencia del gen de `-galactosidasa por el inserto, inactiva la expresión del gen de la `-galactosidasa y las colonias de bacterias presentan un color blanco al no poder degradar el colorante X-gal. Regiones de control de replicación y expresión compatibles con las células hospedadoras. 2) Cósmidos: Los cósmidos son plásmidos modificados con la región Cos del fago h para aceptar insertos de gran tamaño. Estos vectores se introducen (empaquetan) en fagos (virus de bacterias) como ADNdc lineales, estos fagos al infectar las bacterias inyectan el ADN del cósmido que se vuelve circular cerrado y se comporta como un plásmido dentro de las bacterias. Las bacterias infectadas se seleccionan por resistencia a antibióticos. Los cósmidos son los vectores de clonaje de elección para las inserción de fragmentos de ADN genómicos grandes, entre 40 y 50 Kpbs. 3) Bacteriófagos: Los vectores derivados de bacteriófagos más empleados derivan del fago M13 y del fago h. Los vectores derivados del fago M13 son moléculas de ADN circulares de cadena sencilla cuando están empaquetados dentro de la partícula viral o de cadena doble cuando el ADN ha sido inyectado en bacterias. Estos vectores, que poseen selección por color (`-galactosidasa) y resistencia a antibióticos, se emplean como vectores de clonaje para secuenciación del ADN insertado por el método enzimático y para realizar mutagénesis dirigida de los insertos, aprovechando la característica de ser moléculas de cadena sencilla. Los vectores derivados del fago h son de dos tipos, vectores de sustitución en los cuales un fragmento de ADN no esencial para la viabilidad del fago h es reemplazado por el inserto y vectores de inserción en los que el inserto se integra dentro del genoma del fago por una diana de restricción determinada. Los vectores de sustitución, son vectores de mixtos clonaje-expresión ideales para incluir fragmentos de ADN genómicos o de ADNc grandes, hasta 24 Kpbs. Los vectores de inserción son vectores de expresión ideales para ADNc pequeños (hasta 8 Kpbs), su principal ventaja reside en que producen proteínas de fusión con el extremo amino del gen de la `-galactosidasa, lo cual permite utilizar métodos inmunológicos (anticuerpos) para la detección de la expresión del inserto. 4) Vectores virales para células eucarióticas. No profundizaremos demasiado en su descripción, en general son de dos tipos: Plásmidos modificados artificialmente con secuencias reguladoras de control de replicación expresión y excreción derivadas de genes eucarióticos o virus de células eucarióticas. Virus eucarióticos modificados con regiones de control virales o de genes eucarióticos, equivalentes a los vectores de reemplazamiento e inserción derivados del fago h. Los principales vectores de origen viral derivan de baculovirus, retrovirus, SV40, virus de la vacuna, herpesvirus y virus del papiloma.

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Una vez obtenidos los fragmentos de ADN y las moléculas de vector, el paso final es la incorporación de las moléculas de inserto en las moléculas de vector. Para realizar este paso de unión se incuban ambas poblaciones de moléculas en presencia de la enzima ADN ligasa. Existen distintas estrategias para asegurar que los fragmentos de ADN se inserten en los vectores con orientaciones determinadas o para evitar que las moléculas de inserto o de vector se unan así mismas.

Transferencia del vector de recombinante al hospedador Métodos de Transferencia del ADN a células hospedadoras Una vez obtenidos los vectores recombinantes, el siguiente paso a seguir es la introducción de los mismos en una célula hospedadora adecuada, los métodos de transferencia de ADN son múltiples y dependientes tanto de la célula hospedadora receptora como del tipo de vector en el cual se encuentre nuestro ADN. La transferencia de ADN exógeno a bacterias y levaduras se denomina transformación, la transferencia de ADN exógeno a células en cultivo se denomina: transfección si el vector es un plásmido o derivado plasmídico o transducción si es un vector viral, incluido en una partícula de virus, el que transfiere el ADN. Los métodos más empleados se explican a continuación: • Transformación con CaCl2. La transferencia se realiza empleando bacterias competentes, es decir, capaces de aceptar ADN extracelular. Las bacterias se vuelven competentes en una determinada fase de su crecimiento al tratarlas con una solución de CaCl2 en frío (4 °C). En condiciones óptimas es posible obtener eficiencias de transformación mayores de 108 colonias por μg de ADN de plásmido. En la actualidad existen cepas bacterianas competentes, disponibles comercialmente capaces de generar rendimientos * 5 ×109 colonias/μg de ADN. • Transformación con bacteriófagos: Cuando los vectores son cósmidos o bacteriófagos la transformación es normalmente directa. Los vectores recombinantes son partículas virales infecciosas capaces de infectar bacterias sensibles y transferirles el ADN incluido en el vector. • Transfección con fosfato cálcico: Se desconoce el mecanismo por el cual las células de mamífero son capaces de ingerir el ADN por endocitosis al ser tratadas con fosfato de calcio. El procedimiento es conseguir la formación de microprecipitados de ADN con el fosfato de calcio mediante la mezcla de ADN con cloruro de calcio y un tampón fosfato. Es el método más común para la transferencia de plásmidos a células de mamífero. • Electroporación: Este método se encuentra desarrollado tanto para transferir ADN a células eucarióticas como a procarióticas. Las eficiencias de transformación son las más elevadas, del orden de 109-1010 colonias/μg de ADN para bacterias y 20-30 transformantes por cada 105 células eucarióticas. El procedimiento es relativamente sencillo, se realiza en pequeñas cámaras en las cua-

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les se encuentra un microelectrodo, se mezclan el ADN y las bacterias o células eucarióticas en una solución conductora. La cámara se coloca en frío y se da un pulso eléctrico de alto voltaje (entre 2 y 4 Kv). Los poros inducidos momentáneamente en las células permiten la entrada del ADN. • Liposomas: La transfección se realiza empleando de soluciones de lípidos, disponibles comercialmente, que envuelven (liposomas catiónicos) o introducen en su interior (liposomas aniónicos) las moléculas de ADN para ayudarlas a atravesar la membrana plasmática de las células de mamífero. • Transducción: Cuando se trata de vectores virales de células de mamífero, los vectores se encuentran incluidos en partículas virales infectivas, de forma que los mecanismos de infección viral se encargan de introducir el vector recombinante en las células en cultivo. Existen, en otros contextos, otros métodos para la transferencia de ADN a células de mamífero como son la microinyección directa y el bombardeo genético. La microinyección nos permite la introducción de ADN (o cualquier otro compuesto) de forma directa e individual en el interior del núcleo de una célula. Este proceso se realiza ayudado por un micromanipulador y visualizando la operación en un microscopio o una pantalla de vídeo. El bombardeo genético se utiliza para la transferencia de ADN a células vegetales o células con paredes celulares consistentes. El método usa una pistola especial que proyecta una nube de partículas de un metal pesado, como oro o tungsteno, recubiertas de ADN sobre las células. Elección de las células hospedadoras Bacterias, levaduras, células de insectos y mamíferos son los organismos hospedadores comúnmente empleados a la hora de expresar proteínas de interés. La elección particular del hospedador, incluso del tipo celular o cepa bacteriana dependerá de múltiples factores tanto biológicos (biología del hospedador, el tipo de vector elegido, el tamaño de la proteína, facilidad de purificación, inmunogenicidad, etc.) como de otros factores políticos o económicos (impacto ambiental, costo de producción, mercado potencial de aplicación, etc.). Los principales factores a considerar a la hora de elegir la célula hospedadora incluyen: 1) velocidad de crecimiento (rápido o lento); 2) coste económico de la producción y purificación (necesidad de medios especiales o suplementos nutritivos, necesidad de manipulaciones especiales y el diseño de las áreas de producción, (upstream) y purificación, (downstream); 3) nivel de expresión y excreción de la proteína en la célula hospedadora; 4) capacidad del hospedador para rendir un producto biológicamente activo, no inmunogénico, mediante una adecuada síntesis y modificación post-traduccional de la proteína; y 5) la posibilidad de obtener vectores de expresión adecuados para el hospedador elegido. En base a la variedad de estos factores, la mayoría de las veces la elección del hospedador viene determinada por un compromiso entre los mismos. Analizaremos a continuación cada uno de los candidatos a célula hospedadora:

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Hospedadores procarióticos Las bacterias han sido los primeros hospedadores para el clonaje y expresión de genes, tanto eucarióticos como procarióticos y en la actualidad aún juegan un decisivo papel en la expresión de productos de interés biotecnológico. Tradicionalmente se han empleado cepas de Escherichia coli, debido principalmente a su bien conocida genética y biología. Otras bacterias utilizadas han sido Bacillus subtilis y algunas cepas de Salmonella. Las bacterias se han empleado como hospedadores cuando se trataba de obtener proteínas de pequeño peso molecular que no requieren de modificaciones posteriores a la traducción para su actividad biológica. Estos microorganismos presentan numerosas ventajas para la producción en masa: — Cultivo celular fácil y barato. — Facilidad de escalado desde la fase piloto a la etapa industrial. — Rápida velocidad de crecimiento (divisiones cada 20-90 minutos). — Con el vector apropiado, generan altos rendimientos de producción. — Son bastante resistentes a cambios bruscos del medio. Sin embargo, también presentan graves inconvenientes: — Incapacidad de procesar los ARN transcritos directamente de genes eucarióticos que contienen secuencias no codificantes (intrones). Este problema es evitable clonando en los vectores solamente los ADNc obtenidos a partir de los ARNm maduros. — Incapacidad de segregar al medio de cultivo las proteínas recombinantes de alto peso molecular. Este hecho determina una posterior lisis de las células para obtener la proteína de interés. Esta lisis provoca la contaminación del producto recombinante con proteínas bacterianas que pueden arrastrarse hasta el producto final y provocar reacciones inmunogénicas en los individuos que han sido tratados con proteínas recombinantes. En algunos casos, es posible introducir una señal de secreción en el vector (secuencia líder) junto con el gen que permita la exportación al espacio periplásmico. En cualquier caso, es necesaria una lisis controlada de la pared celular para liberar la proteína al medio. Este proceso conlleva de nuevo, el riesgo de contaminación con los restos de la pared bacteriana. — Tendencia a concentrar las proteínas expresadas en forma de gránulos insolubles en los que la proteína, en muchos casos, pierde su actividad biológica de forma irreversible o incluso puede resultar tóxica para el propio hospedador. Esta toxicidad puede llevar a la lisis de la bacteria. — Carencia de un sistema postraduccional de maduración de proteínas, que incapacita a estos organismos para la síntesis de proteínas eucarióticas las cuales requieren de estas modificaciones post-traduccionales. Si estas modificaciones son requeridas para la funcionalidad biológica de la proteína puede darse la paradoja de obtener grandes cantidades de una proteína correctamente expresada sin ninguna actividad biológica.

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Hospedadores eucarióticos Normalmente las proteínas eucarióticas después de su síntesis requieren de una serie de modificaciones postraduccionales que permiten que la proteína adquiera una conformación espacial adecuada, responsable de su completa actividad biológica. Las modificaciones más comunes son: establecimiento de puentes disulfuro, modificaciones de algunos aminoácidos (hidroxilación, metilación, acetilación y fosforilación) y la incorporación de moléculas de azúcares (glicosilación) y de ácidos grasos (acilación). Estas modificaciones son muy importantes no sólo por conferir la actividad biológica a la proteína, sino porque además determinan las propiedades antigénicas y de estabilidad de la misma. Se entiende ahora el por qué de la necesidad de hospedadores eucarióticos que puedan proporcionar estos mecanismos para la expresión de proteínas eucarióticas funcionales, estables y totalmente inocuas cuya actividad biológica sea estrictamente idéntica a la natural. Otra ventaja adicional de los hospedadores eucarióticos, respecto a los procariotas, es la secreción directa de las proteínas sintetizadas al medio de cultivo, con la consiguiente facilidad de purificación. Tradicionalmente se han empleado las levaduras y las células de mamífero como sistemas huésped, sin embargo las células eucarióticas de insecto comienzan a dar resultados prometedores. Levaduras. Las levaduras comparten muchas ventajas con las bacterias (rápida velocidad de crecimiento, bajo costo de producción entre otras) pero la expresión de genes en células de levadura plantea también graves inconvenientes: — El nivel de expresión es considerablemente inferior al obtenido en bacterias. — Un uso un poco especial del código genético. — Una tendencia a la inestabilidad de los vectores de expresión. — Cierta especificidad por los genes propios (preferencia en la expresión). — Aunque el sistema de eliminación de los intrones de los ARN transcritos funciona correctamente, el sistema de modificación post-traduccional, fundamentalmente la glicosilación, es diferente (inducen hiperglicosilación) al de células eucarióticas de mamífero. A pesar de estas limitaciones, se ha logrado producir y excretar un número aceptable de proteínas heterólogas con eficiencias variables (entre 1-10 mg/L) como la lisozima humana o el antígeno vacunal del virus de la hepatitis B. Células de insecto: La expresión de proteínas recombinantes en células eucarióticas de insectos puede ser comparable o superior al sistema de las levaduras, con producción de 1 a 100 mg por litro de cultivo. Cultivos de células de insecto han logrado producciones a gran escala de productos de alto valor económico como el interferón _ humano, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o polimerasas de ácidos nucleicos para uso comercial. Las vectores de expresión son virus de invertebrados en los cuales un gen estructural del virus (gen de la poliedrina) es sustituido por el gen de interés.

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La principal desventaja de estos hospedadores radica en la incapacidad de generar un patrón correcto de glicosilación muy parecido al de células de mamífero. Otros inconvenientes adicionales son de carácter básicamente económico y comunes a los de la células de mamíferos. Células de mamífero. Sólo las células de mamífero en cultivo son satisfactorias para la producción de proteínas humanas normales, correctamente plegadas y provistas de todas las modificaciones que puedan generar la totalidad de la funcionalidad biológica, estabilidad e inocuidad. El uso de células de mamífero plantea fundamentalmente inconvenientes de índole económica (altos costos) como de índole sanitario (capacidad de contaminación con agentes infecciosos). El cultivo de células de mamífero no es siempre sencillo: — Poseen unos complejos requerimientos nutricionales que hace que los medios de cultivo y sus suplementos provoquen altos costos de producción. — Las células poseen un crecimiento lento (duplicaciones cada 16-24 horas). — Los rendimientos de producción no son muy elevados (100 mg/L de cultivo). — El empleo de células de mamífero conlleva la necesidad de evaluar los posibles contaminantes, normalmente virus o ADN viral de los vectores, que, procedentes de la células o de los suplementos de origen animal, puedan contaminar el producto. Así, la producción industrial en células de mamífero resulta relativamente cara y está solamente reservada a proteínas complejas de alto valor biológico y económico.

Selección de los organismos que expresan el gen de interés Una vez transferidas las moléculas de ADN recombinante la célula hospedadora elegida, el paso final es el de seleccionar aquellas células hospedadoras que han tomado el gen codificante para la proteína de interés para su aislamiento y posterior escalado. Normalmente este proceso de selección se lleva a cabo en dos etapas: 1) una etapa inicial de cribado (screening) de toda la población de células hospedadoras resultantes de la transferencia para seleccionar sólo aquellas que han tomado los vectores con los insertos ADN recombinante (clones recombinantes); y 2) una etapa final de selección de los clones recombinantes para identificar cuál o cuáles poseen y/o expresan el gen de interés. Estos abordajes son tanto válidos para células procarióticas como eucarióticas. Los métodos de screening o cribado se basan, normalmente en las características fenotípicas aportadas por las moléculas del vector (resistencia a antibióticos, la expresión de actividades enzimáticas o expresión de proteínas fluorescentes). Es relativamente sencillo de detectar la presencia de los clones recombinantes sin más que seleccionar aquellos que presentan estos fenotipos en la población; más complicado es el proceso de selección del clon o clones de interés. Existen tres enfoques principales:

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1. Detección de la actividad biológica de la proteína de interés. En este método se ensayan los clones recombinantes a la búsqueda del que presenta la actividad biológica buscada. Este abordaje es perfecto siempre y cuando se disponga de un método lo suficientemente sensible de detección de la actividad biológica y que las células hospedadoras no posean una actividad biológica similar. La selección del hospedador en este caso es crítica. 2. Métodos de detección inmunológicos. Si se poseen anticuerpos específicos para la proteína existen numerosos protocolos para determinar qué clones recombinantes de la población están secretando la proteína reconocida por el anticuerpo. 3. Métodos de hibridación de los AN. Estos métodos se apoyan en ensayos de hibridación similares a los explicados en la técnica de Southern. Los métodos de hibridación se basan en encontrar o diseñar sondas específicas (los métodos de diseño de las sondas ya fueron explicados en la técnica de Southern) del gen de interés. Estas sondas marcadas (isotópica, enzimáticamente, o con fluorocromos) sirven de anzuelos moleculares para buscar, sobre el ADN de los clones recombinantes transferido a membranas de hibridación, aquellos clones que poseen el gen de interés que lleva la secuencia complementaria a la de la sonda. En el caso de cultivos de células de mamíferos, es posible aplicar una variación de esta técnica de hibridación con sondas específicas sin necesidad de transferir el ADN de los clones a membranas de hibridación simplemente realizando la hibridación sobre los clones directamente mediante la técnica de hibridación in situ.

Caracterización del producto y células productoras Caracterización del producto clonado La caracterización del producto recombinante obtenido puede ser tan importante como el proceso de clonaje y obtención del mismo, sobre todo en aquellos casos en los que la fidelidad entre la proteína original y la producida por ingeniería genética haya de ser máxima. En el entorno farmacéutico las proteínas recombinantes están sometidas a rigurosos controles periódicos por agencias gubernamentales. En estos controles además del verificar la estabilidad del proceso de producción bajo normativa GMP (Good Manufacture Procedures), se analiza exhaustivamente la similitud entre el producto obtenido in vitro y el natural. La caracterización primaria (o de identidad) incluye la determinación del peso molecular, carga eléctrica, punto isoeléctrico, secuencia y composición de aminoácidos e hidrofobicidad. Adicionalmente se analiza la conformación estructural y la actividad biológica o enzimática. Especial atención se dedica a los extremos amino y carboxilo para detectar la posible degradación por proteasas, así como al correcto patrón de glicosilaciones, puentes disulfuro, fosforilaciones y cualquier otra

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modificación postraduccional que requiera la proteína para su actividad biológica y estabilidad. La caracterización secundaria (pureza y estabilidad) es otro factor crítico para descartar la posible contaminación del producto con péptidos inmunogénicos. Es necesario asegurar, mediante diferentes métodos físico-químicos e inmunológicos, que la proteína está libre de virus o ácidos nucleicos que, procedentes del medio o de las células hospedadoras pudieran suponer un factor de riesgo para el hombre. Caracterización de las células productoras (bancos celulares) El otro punto de control para asegurar una correcta obtención de las proteínas recombinantes se encuentra en la caracterización de la célula hospedadora. De acuerdo a la producción bajo normas GMP, la estabilidad genética de las células productores es un factor crítico. Es necesario establecer y caracterizar un determinado clon celular de producción a partir del cual generar un banco celular maestro origen de la producción (Master cell bank). Este banco celular se expande en cultivo para obtener bancos celulares de trabajo (Working cell bank) con los cuales llevar a cabo los lotes individuales de producción. Ambos tipos de bancos, almacenados en N2 líquido a –196 °C, deben ser amplia y cuidadosamente caracterizados para asegurar: 1) La estabilidad genética e identidad de las células productoras. (Caracterización morfológica, análisis de isoenzimas y análisis citogenéticos.) 2) La estabilidad de la construcción genética que origina la proteína recombinante. (Secuenciación de la contrucción génica, patrón de restricción, estimación del número de copias del gen.) 3) La ausencia de agentes adventicios como virus y micoplasmas. (Análisis de carga viral y análisis de actividad transcriptasa reversa; test de detección de micoplasmas.) 4) La consistencia de crecimiento y productividad de las células. (Determinación de la productividad y número de duplicaciones de la población en los diferentes lotes de producción.) Estos procedimientos de control aseguran la consistencia y reproducibilidad de cada lote de producción. Bibliografía Alberts B. Bray D. Lewis J. Raff M. Roberts, K, Watson JD. Molecular biology of the cell. New York Garland Publising. 1994. Davies J. Ingeniería genética. Ciclo de conferencias sobre biotecnología. Salamanca Universidad de Salamanca. 2000. Davies, J. Ingeniería Genética. Mundo Científico (1987) n.o 71 vol 7: 704-713. Izquierdo M. Ingeniería genética y transferencia génica. Madrid, Ediciones Piramide. 1999.

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Lewin B. Genes IV. Chichester, John Wiley and Sons Publishers. 1990. Sambrook J. Fritsch EF. Maniatis T. Molecular Cloning (I, II and III). New York, Cold Spring Harbour Laboratory Press. 1989. Walker JM. and Gingold EB. Biología molecular y biotecnología. Zaragoza, Editorial Acribia 1997. Thilly WG. Mammaliam Cell Technology. London, Butterworths Publishers. 1988. Nota del Autor: Ambos capítulos (12 y 13) de Ingenieria Genética fueron desarrollados sobre la base de una presentación de Microsoft® Power Point®. Las figuras complementarias al texto de ambos capítulos estan disponibles, con fines educativos, solicitándolas a la siguiente dirección electrónica. [email protected]

14 Producción industrial de fármacos recombinantes A. Martínez Mogarra

Introducción Toda persona con experiencia en un laboratorio de investigación está familiarizada con cierto equipo de cultivo: placas, matraces, frascos T, placas multipocillo, estufas de cultivo, incubadores orbitales y con unas determinadas condiciones de trabajo relativas a las salas, aislamiento, material de protección. Muchos de estos sistemas son también utilizados a nivel industrial, unas veces tal cual los conocemos en el laboratorio y otras modificados y adaptados al manejo de grandes volúmenes. Los equipos utilizados en la producción de grandes cantidades de células son muy diversos ya que en muchos casos han sido desarrollados pensando en satisfacer las necesidades creadas por un organismo concreto. Haremos una primera mención al cultivo a gran escala de bacterias y hongos para entrar con alguna extensión en los sistemas de producción masiva desarrollados para el cultivo de células, siempre más complejos y sofisticados. También haremos referencia a las necesidades de construcción y diseño que plantea un proceso de producción en la industria biotecnológica sin dejar de lado las condiciones ambientales y de bioseguridad que debe cumplir una industria con tantos problemas potenciales. A continuación repasaremos algunas nociones de purificación de proteínas, para terminar con una mirada a las condiciones de calidad requeridas en la industria.

Cultivos procariotas Tanto bacterias como hongos presentan muchas ventajas y facilidades en su cultivo a gran escala si se comparan con las células eucariotas. Estas ventajas residen fundamentalmente en dos cualidades de este tipo de células, su activo metabolismo que les facilita el uso de una amplia gama de nutrientes y el rápido incremento de

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biomasa, y su natural resistencia mecánica y química que facilita enormemente el control de las condiciones de cultivo en términos de aparataje. Los cultivos masivos de bacterias se llevan a cabo en fermentadores. Los fermentadores son equipos que consisten en un vaso que puede ocupar volúmenes muy diversos, desde unos pocos litros hasta decenas de miles, en el que se carga el medio de cultivo y se inocula el organismo adecuado, acompañado por sistemas de control de las condiciones de cultivo. Veamos a continuación los principales elementos del cultivo de procariotas.

El medio de cultivo Los medios de cultivo definidos, es decir, aquellos en que se conoce la naturaleza y cantidad de todos y cada uno de sus componentes, tan utilizados en el laboratorio, resultan inviables en la producción a gran escala debido a su coste y/o baja capacidad para generar biomasa y producción. Es frecuente pues, que se utilicen medios de cultivo total o parcialmente indefinidos en los que se incluyen componentes de naturaleza compleja que aportan cierta variabilidad al proceso. En algunas fermentaciones se intenta utilizar como elemento nutritivo determinados desechos agrícolas. En general, el medio de cultivo para bacterias debe incluir una fuente de carbono, y una fuente de aminoácidos y/o proteínas siendo también deseable el aporte de ácidos grasos esenciales en algunos casos. Para evitar el desarrollo de revertientes es frecuente la adición de algún antibiótico cuyo gen de resistencia va incorporado a la construcción que contiene el DNA de la proteína recombinante.

Parámetros de cultivo Control de temperatura Los requisitos de temperatura para garantizar la supervivencia de las bacterias no son demasiado estrictos aunque saliendo de determinados márgenes se pueden ocasionar caídas de productividad o mutaciones indeseables. Salvo que el microorganismo presente un requerimiento específico de temperatura, se trabaja dentro de rangos fisiológicos, entre 35 y 37 ºC. Algunos equipos permiten diseñar un perfil de temperatura cambiante a lo largo del proceso. Este sistema resulta muy útil cuando las temperaturas óptimas de crecimiento y producción no coinciden o cuando es necesario un pulso de temperatura para estimular la producción de la proteína de interés. La cuba del fermentador está equipada con una camisa de refrigeración por la que circulan a conveniencia vapor, agua caliente y líquido refrigerante. El refrigerante habitual es el agua aunque es posible la utilización de otras mezclas refrigerantes como agua glicolada.

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Las fases iniciales del cultivo, cuando la biomasa es escasa, requieren la calefacción del mismo. A medida que el cultivo se desarrolla y la actividad metabólica se intensifica se genera calor y el cultivo puede llegar a requerir refrigeración lo que se consigue haciendo circular líquido refrigerante por la camisa. Control del pH La cuba del fermentador está dotada con sondas de pH a partir de cuya señal se adicionan pulsos de soluciones concentradas de ácido o base directamente sobre el cultivo. Aporte de oxígeno La solubilidad del oxígeno en medio acuoso es muy baja. De ahí que los cultivos líquidos a pequeña escala requieran grandes cámaras de aire para evitar la aparición de procesos anaerobios. Estas cámaras de aire no son posibles en los cultivos masivos, con lo que es necesario recurrir al burbujeo bien sea de aire o de mezclas conocidas y controladas de gases. Agitación Dentro del fermentador son deseables unas condiciones lo más homogéneas posibles. Para conseguir un óptimo de productividad y minimizar el riesgo de mutaciones es deseable eliminar los microambientes. Además, una adecuada corrección del pH y la temperatura y una aireación apropiada exigen la continua mezcla de los elementos del cultivo. Esto se consigue con la introducción de un sistema de agitación, consistente en un eje con unas palas impulsado por un motor eléctrico, gobernado por un variador de velocidad. Es habitual que el variador esté conectado al sistema de control de aireación y qué parámetros como la presión parcial de oxígeno sean los que regulen el incremento o disminución de la velocidad de agitación. Volumen de los cultivos La agitación en combinación con la presencia de concentraciones elevadas de proteínas y otras sustancias tensoactivas, provocan la formación de grandes cantidades de espuma que es preciso evitar. Los fermentadores están dotados de sondas de nivel que regulan la adición de productos antiespumantes.

Cultivo de células eucariotas La extremada sensibilidad tanto frente a agentes químicos como físicos que presentan las células eucariotas y la posibilidad de que sea necesario su anclaje a super-

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ficies para posibilitar su crecimiento, hacen que el cultivo de este tipo de organismos, partiendo de unos elementos comunes con respecto al crecimiento bacteriano se sofistique enormemente tanto en los métodos empleados como en las medidas de calidad necesarias. Como se ha mencionado anteriormente, el medio de cultivo adecuado para las células eucariotas no responde a una fórmula universal. Cada tipo de célula, cada producción específica, requiere su propia formulación. Los medios de cultivo utilizados a gran escala son los mismos empleados en el laboratorio y habitualmente contienen concentraciones de suero entre el 2 y el 10 %. Además de los componentes nutricionales del medio es frecuente que la formulación incluya agentes antiespumantes y viscosizantes como el poliglicol o la carboximetilcelulosa, con objeto de minimizar el efecto de cizalladura y prevenir la formación de espuma.

Biorreactores Este término se aplica a los sistemas de cultivo a gran escala para células eucariotas. Sus fundamentos proceden de los fermentadores pero los equipos de control utilizados y la forma de trabajar son diferentes de la de aquéllos, especialmente cuando se trata de sistemas perfundidos. Como norma general, los biorreactores deben cumplir con lo siguiente: • Estar construidos en materiales de calidad farmacéutica (acero 316 L o hastelloid, plástico clase VI USP). • Tener sistemas de impulsión que no provoquen turbulencias ni cizalladuras, siendo el caso extremo los fermentadores de tipo airlift. • No presentar en su interior piezas de gran tamaño que dificulten la circulación del líquido. • Tener una geometría interior suave, con fondos cóncavos y el mínimo posible de ángulos y esquinas para facilitar la homogeneización del cultivo y facilitar la limpieza y esterilización del equipo. • Interiores electropulidos o pulidos «a espejo». El medio de cultivo que entra en un cultivo de células debe incorporarse en perfectas condiciones de pH, temperatura y gases en solución, con lo que los recipientes de cultivo van frecuentemente acompañados de recipientes de «acondicionamiento» en los que se rectifican los parámetros mencionados.

Control de pH y aireación El tampón más frecuentemente utilizado en los cultivos de células es el CO2CO3H–, que basa su capacidad tamponante en la relación entre el CO2 atmosférico y el CO2 en disolución. De este modo, la generación metabólica de CO2, la difusión

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de gases en el medio y la eliminación de gases de desecho se mantienen en íntima relación. El aporte de gases al medio se realiza por difusión a través de membranas semipermeables o por simple burbujeo de aire comprimido o mezclas controladas de gases. En este último caso, es posible la regulación del pH variando la concentración relativa de los gases de la mezcla. La difusión de gases mediante el sistema de agitación que tenía lugar en los fermentadores está sin embargo limitada en el cultivo de eucariotas que rara vez admiten velocidades de agitación superiores a las 350 RPM.

Biorreactores airlift Este tipo de biorreactores hace referencia a equipos que no utilizan sistemas de agitación y que para homogeneizar el cultivo mantienen un burbujeo desde la base con la mezcla de gases adecuada. Las burbujas de gas arrastran las células hacia la parte superior del reactor al mismo tiempo que oxigenan el medio de cultivo. Además, el medio oxigenado es ligeramente menos denso con lo que, junto a la aireación, se generan corrientes de convección que arrastran a las células a lo largo de todo el vaso. Los reactores airlift son muy adecuados para células especialmente frágiles o que no admiten sustancias viscosizantes pero tienen el inconveniente de requerir una relación diámetro-altura muy baja, es decir, son altos y estrechos, lo cual plantea serios problemas en el escalado.

Células en suspensión y células dependientes de anclaje Estos términos hacen referencia al hecho de que una célula pueda vivir en una fase líquida, tal y como ocurre con las células sanguíneas o con muchas células tumorales y transformadas o si por el contrario requieren una superficie a la que mantenerse adheridas, como es el caso de los fibroblastos, por ejemplo. Las células dependientes de anclaje incluyen un nuevo factor limitante a tener en cuenta a la hora de diseñar el cultivo: la superficie disponible. Las células que deben crecer asociadas a un sustrato lo hacen hasta alcanzar un cierta densidad más allá de la cual no les es posible la división. Es el estado conocido como confluencia. Cuando el cultivo llega a la máxima confluencia entra en fase estacionaria. Si en un cultivo de estas características se desea obtener un mayor número de células que el alcanzado es necesario separar las células del sustrato, diluirlas y resembrarlas sobre nuevas superficies en el proceso que se conoce como subcultivo. La necesidad de una superficie para el crecimiento de las células introduce nuevos factores de incertidumbre en el cultivo, relacionados con la influencia que el material de soporte puede ejercer sobre el crecimiento celular y aún sobre la expresión de los genes insertados. Existen diversos materiales susceptibles de soportar el

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crecimiento celular entre los que el vidrio y el plástico ocupan lugares destacados. Se dispone además de diversos tratamientos para modificar plástico y vidrio aumentando su afinidad hacia las células. El cultivo a gran escala de células dependientes de anclaje se puede asociar a varios sistemas en los que se juega con la relación superficie/volumen. Un primer paso en el cultivo a gran escala de células dependientes de anclaje son las botellas rodantes. Estas botellas son recipientes cilíndricos en cuya pared se adhieren y multiplican las células. El medio de cultivo no llena completamente la botella, antes al contrario, deja una gran cámara de aire para facilitar el intercambio de gases. Las botellas se emplazan en dispositivos que las mantienen rodando sobre sí mismas a velocidad constante para permitir el intercambio de gases y nutrientes. Las botellas rodantes pueden ser de superficie lisa o presentar diversas morfologías que aumenten su superficie. Diversos fabricantes han presentado múltiples opciones para incrementar la relación superficie-volumen. De este modo se pueden encontrar productos como el Spiracel ®‚ de Sterilin, consistente en una botella rodante que incluye una lámina espiral de plástico en su interior o el sistema de tubos de vidrio de Belco. Más allá de las botellas rodantes existe toda una gama de métodos para crecer células dependientes de anclaje que buscan reproducir unas condiciones lo más fisiológicas posibles. Se trata por lo general de sistemas perfundidos (con continua renovación de medio). Algunos de ellos son: • Multitray. Consiste en una colección de superficies paralelas para permitir el anclaje de las células, encerradas en un contenedor. El ejemplo más sofisticado es el Cell-Cube ® de Corning, que permite realizar cultivos entre 8.500 y 340.000 cm2 de forma perfundida. • Biorreactores de fibra hueca. Ofrecen una matriz fibrosa y repleta de canales en los que introducen y multiplican las células y por el que perfunde medio de cultivo. Este sistema permite muy elevadas densidades de células.

Cultivo en microcarriers Los microcarriers o microportadores son partículas destinadas a servir como soporte a las ADC (células dependientes de anclaje). Tales microcarriers (MC) están constituidos por materiales en principio inertes, que resultan adecuados para la unión de las células. Las células se anclan a la superficie del MC y proliferan sobre ella hasta alcanzar el grado máximo de confluencia. La utilización de MC para el cultivo de ADC presenta una ventaja crucial sobre todos los otros métodos de cultivo en masa existentes para este tipo de células: los MC se introducen en un biorreactor convencional y permiten tratar a las ADC como células en suspensión. Consecuencias derivadas de ello son una mayor homogeneidad de las condiciones de cultivo, la posibilidad de sacar muestras e incluso de observar las células al microscopio, la posibilidad de recuperar fácilmente las células, y fundamentalmen-

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te de poder disponer de un sistema de cultivo sencillo y fácil de controlar, que genera unas densidades de células y unas productividades superiores a otros métodos de cultivo existentes para ADC. El uso de MC fue inicialmente publicado en los años sesenta por van Wezel, que utilizó partículas de una resina de intercambio iónico, la dietil-aminoetil-sephadex (DEAE) de Pharmacia ®. Posteriormente se utilizaron otras resinas de intercambio iónico; la constatación de cierta toxicidad en estos materiales así como la aparición de nuevos sustratos y tratamientos físico-químicos para los mismos han dado lugar a la aparición de una amplísima gama de MC disponibles en el mercado. No existe un MC universal que garantice el crecimiento y la producción de cualquier tipo de célula o material. Como de costumbre, cuando se habla de cultivos celulares, es necesario probar hasta encontrar el sustrato más adecuado para nuestra línea celular e incluso para nuestra producción. Biorreactores de lecho fluido Son sistemas de cultivo en los que no existe agitación. Las células se crecen en el interior de MC especiales, porosos y de gran tamaño, generalmente fabricados en colágeno, que reposan en la base del reactor y reciben una corriente de medio de cultivo fresco y acondicionado. Las células disfrutan de un ambiente muy estable y alcanzan altas densidades de crecimiento al desarrollarse en el seno de una matriz porosa.

Monitorización de procesos La biotecnología farmacéutica se ha incorporado en la industria como el nuevo método de producción de principios activos. Es un procedimiento muy diferente de los tradicionales de la industria, como la síntesis química o la extracción, debido a que utiliza un elemento completamente nuevo: organismos vivos. El uso industrial de organismos vivos tiene una característica que es a la vez un inconveniente, sólo son relativamente predecibles, lo que es especialmente notorio en el caso de las células eucariotas. Las células pueden ser extremadamente sensibles a factores ambientales, en ocasiones a elementos que no pueden ser controlados por los propios métodos analíticos. Así pues, para garantizar la máxima reproducibilidad posible en los métodos de producción, es necesaria una exhaustiva monitorización de los cultivos. ¿Qué controlar? En un cultivo de células hay que asegurar que el ambiente que rodea a las mismas es el óptimo y que la variación es la menor posible. Para ello hay que vigilar muchos puntos:

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El medio de cultivo Normalmente se utilizan formulaciones específicas realizadas por fabricantes industriales. Es normal que al fabricante se le exijan certificados de composición del medio, de origen de los componentes, especialmente de aquellos de origen animal y garantías sobre la ausencia de determinados agentes adventicios. No es inusual que en una producción industrial se especifique por parte del cliente el tamaño de lote que se requiere para evitar la variabilidad debida a esta causa. Mención especial requiere el suero. Los sueros utilizados en la producción farmacéutica deben ser de origen conocido y garantizar su trazabilidad hasta los mataderos en que se recolecta la sangre. Naturalmente deben estar acompañados de análisis que certifiquen la ausencia de micoplasmas. No es inusual que los propios consumidores testen la capacidad del suero para facilitar el crecimiento de sus líneas celulares. Una vez fabricado el medio de cultivo y antes de su utilización es imprescindible comprobar temperatura, pH y osmolalidad. El agua El agua utilizada en cultivos celulares debe ser bidestilada, apta para la administración de inyectables conforme a normas USP. Los materiales Para evitar sorpresas desagradables, hay que asegurarse de que todos los materiales utilizados en el cultivo de células son inertes. Dentro de que se manejen calidades farmacéuticas, siempre respetando las normas USP y equivalentes, es importante la realización de ensayos de toxicidad sobre cuantos materiales nuevos entren en la producción. Tampoco hay que olvidar todos los sistemas de lavado, secado, acondicionamiento y esterilización de materiales directa o indirectamente relacionados con los cultivos. Las células Las células utilizadas deben pertenecer a bancos controlados y analizados. Su historia ha de ser trazable desde origen. El cultivo A lo largo del desarrollo del cultivo es necesario chequear el número de células ya que la densidad de las mismas es un parámetro de vital importancia. Cuando se

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producen proteínas recombinantes es preciso monitorizar el nivel de excreción. Además es frecuente la monitorización de parámetros metabólicos, como el consumo de glucosa o la generación de lactato y el control de la presión parcial de diversos gases. El estudio de estos parámetros nos da una visión general de lo que ocurre en el cultivo que nos puede permitir actuar sobre algunos elementos para garantizar las condiciones óptimas de producción.

Equipos de control Los aparatos de control se basan en la utilización de transductores. Los transductores son aparatos capaces de transformar un tipo de energía en otro, habitualmente una señal eléctrica. Así nos encontramos con transductores de presión, de temperatura (termómetros), químicos (electrodos). Todos o la mayoría de ellos tienen cabida en un sistema de cultivo de células. La preparación de medios y soluciones requiere el empleo de pH-metros, termómetros, etc. Fermentadores y biorreactores, así como sistemas perfundidos incorporan electrodos que monitorizan diversos parámetros a controlar en la producción: pH, pCO 2, temperatura, densidad celular. Es habitual que estos equipos envíen su señal a aparatos de integración y registro que representan la evolución de los valores a lo largo del tiempo. Además de indicar el valor que están midiendo, los sistemas de control son susceptibles de ser programados con valores de referencia que generen acciones correctoras sobre el sistema y que tiendan a mantener la condición estable. Los mecanismos de control pueden ser de dos tipos: — Regulación de todo o nada. El controlador acciona el mecanismo efector correspondiente hasta alcanzar el valor de consigna prefijado. Una vez alcanzado dicho valor, el efector se desactiva, volviéndose a activar si se pierde dicho valor. — Regulación PID. El controlador recoge la lectura del valor y estima la segunda derivada de la función resultante en ese punto. En base a este dato y comparándolo con los valores óptimo y de histéresis consignados, estima la oportunidad o no de activar o desactivar el efector. Este tipo de control es mucho más sofisticado que el sistema de todo o nada y permite un control mucho más ajustado.

Utilities y Layout Identificamos como Utilities los servicios necesarios para llevar a cabo un proceso de producción mediante Biotecnología, y como Layout a las edificaciones destinadas a albergar el proceso.

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A la hora de diseñar una planta de producción hay que tener en cuenta tres elementos principales: las autoridades reguladoras, el tipo de proceso y las consideraciones ambientales.

Autoridades reguladoras La venta en el mercado de un producto está condicionada por la necesidad ineludible de contar con el permiso de las autoridades sanitarias locales. Habitualmente se viene tomando como referencia la Food and Drug Adminstration (FDA), autoridad reguladora de los Estados Unidos. Normalmente las autoridades reguladoras exigirán distintos niveles de realización y de seguridad en la construcción y los servicios dependiendo de que nuestro producto esté destinado a consumo humano, animal o agrícola. Tampoco el nivel de exigencia es el mismo si nos disponemos a fabricar materia prima o producto terminado ni si éste tiene como forma final un encapsulado o un inyectable. Frecuentemente facilita las cosas la existencia de plantas que produzcan un producto de características similares cuya venta esté autorizada y que su proceso haya sido auditado.

Tipo de proceso El sistema de fabricación de la proteína resulta esencial a la hora de establecer la forma final de las instalaciones. Existen como hemos visto diversos sistemas de cultivo de células a gran escala y todos ellos tienen sus ventajas y desventajas que también alcanzan el terreno del diseño de salas y la elección de equipos. Así por ejemplo, un proceso de producción en botellas rodantes requiere la construcción de cámaras calientes de grandes dimensiones y la presencia de autoclaves y zonas de flujo laminar habitualmente en mayor cantidad que un proceso realizado en fermentadores. Estos, por su parte, suelen requerir una gran variedad de servicios disponibles en el propio punto de fabricación. En el caso en que se utilicen biorreactores, no es lo mismo si se trata de un proceso discontinuo que si se pretende realizar un proceso perfundido. Normalmente, los cultivos de tipo batch se realizan en reactores de grandes dimensiones que requieren salas amplias y techos altos. Los sistemas perfundidos utilizan biorreactores de menor tamaño que se ubican en salas de dimensiones más reducidas. Es habitual que los biorreactores, especialmente si son grandes, lleven incorporados sistemas de limpieza y esterilización in situ. También es frecuente que el máximo posible de conexiones a servicios sea permanente. En el siguiente cuadro se muestra la influencia que el método empleado para el cultivo ejerce sobre la construcción:

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Cultivo discontinuo

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Cultivo perfundido

Tamaño de salas

Gran tamaño. Techos elevados

Pequeño tamaño. Techos bajos

Instalación

Difícil

Sencilla

Integración del reactor y la sala

Muy integrados

Baja o moderada

Preparación de medios

No son necesarias instalaciones adicionales

Instalaciones especiales para este fin

Purificación/concentración

– Poco frecuente

– Frecuente

– Grandes volúmenes

– Volúmenes pequeños

– Dirigida por el cultivo de células

– No dirigidas por el cultivo de células

Consideraciones ambientales Cada proceso tiene sus requerimientos ambientales. Estos vienen dados generalmente por el riesgo de contaminación de los cultivos y del producto. Así pues, las medidas para prevenir la contaminación no son las mismas en una zona en que se realiza un cultivo de células que en una sala en la que se concentra un eluído de una cromatografía. Dentro de los cultivos, el riesgo de contaminación es menor si se trata de un cultivo tipo batch que si se trata de un cultivo perfundido que se debe mantener varios meses. Por otra parte, el riesgo de contaminación es mucho más alto en los cultivos de células que en los bacterianos. Principales agentes causantes de contaminaciones Trataremos de enumerar los agentes que pueden causar la contaminación de un cultivo de células y la forma de detectarlos. Más adelante nos referiremos a medidas preventivas y correctivas. • Bacterias, hongos y levaduras. Son los más habituales. En general resultan sencillos de detectar puesto que suelen producir turbidez e incluso colonias apreciables a simple vista o cuando menos al microscopio. • Micoplasmas. Los micoplasmas son bacterias de pequeño tamaño y desprovistas de pared bacteriana, lo que les permite atravesar los filtros que retienen bacterias, de 0,2 μm, considerados habitualmente como esterilizantes. La presencia de micoplasmas es frecuentemente difícil de detectar debido a sus requisitos para cultivo in vitro. Los sistemas habituales de detección de micoplasmas son el cultivo en condiciones especiales, la tinción diferencial (Hoescht), métodos inmunológicos y últimamente la detección de su ADN mediante técnicas de PCR. Algunas veces los micoplasmas pueden tener efectos citopáticos y producir alteraciones visibles en los cultivos, tales como lisis

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celular y turbidez y disminución de la productividad en proteínas recombinantes, pero es frecuente que los micoplasmas convivan con las células sin manifestar ningún efecto. • Virus y retrovirus. Al igual que los micoplasmas, es frecuente que las infecciones por este tipo de agentes no provoquen cambios apreciables. Es pues necesaria su identificación mediante métodos inmunológicos o bioquímicos. Prevención de la contaminación El riesgo de contaminación y los efectos económicos de la misma sobre el proceso, marcan el nivel de inversión a realizar a la hora de prevenir las contaminaciones. Entre los elementos disponibles, algunos de los más destacados son: • Tratamiento de aire. Consiste en la filtración de aire por filtros de profundidad de distintas categorías. El aire filtrado se clasifica en función del número de partículas por m3 y hora de muestreo. La clase 100 es considerada como ambiente estéril. Por encima de ella tenemos las clases 1.000, 10.000 y 100.000. • Cascadas de presión atmosférica. Es posible regular el número de renovaciones de aire en una sala mediante la velocidad de impulsión y de salida del aire de la misma. Merced a este sistema, se puede regular la presión atmosférica en una zona de trabajo. Las presiones de las distintas salas de una instalación de producción se pueden regular para establecer el sentido de circulación del aire. • Esclusas de acceso. Un método de aislamiento de una sala consiste en la creación de un espacio intermedio en el que es posible regular la presión del aire para evitar la mezcla de ambientes de dos salas contiguas. • Zonas de descontaminación. Áreas en las que se realiza la desinfección de materiales o personas que entran o salen de las zonas de producción. • Áreas de cambio. Frecuentemente se requiere la utilización de vestuario especial para acceder a las zonas de producción. Es importante construir dependencias en las que se realice el cambio de equipamiento de forma ordenada y racionalizada. En todo caso, no se debe olvidar que el principal vehículo de acceso de las contaminaciones son los propios operadores y que ninguna prevención en el diseño de instalaciones puede sustituir las normas de correcta fabricación y la adecuada formación del personal.

Impacto ambiental y bioseguridad Todas las actividades fabriles suponen un riesgo para los trabajadores y para el entorno. La industria farmacéutica y más concretamente la Biotecnología, junto

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con la investigación científica en el campo de la Biología no son una excepción. Es frecuente el uso de reactivos de gran peligrosidad (ácidos, bases, neurotóxicos) y se trabaja sobre organismos vivos frecuentemente modificados genéticamente cuando no patógenos para el hombre o los animales domésticos. La más incipiente actualidad en este terreno se centra sobre el esparcimiento en la naturaleza de seres que han sufrido modificaciones genéticas en el laboratorio, es decir, de cultivos transgénicos La peligrosidad generada por la industria biotecnológica y la investigación científica en este campo se encuentra regulada por diversas directivas de la CEE, así como la Ley de Prevención de Riesgos Laborales y los diversos Reales Decretos que la complementan. El marco jurídico que regula los riesgos de la Biotecnología es el siguiente: • Directiva 90/219/CEE. Referente a la utilización de organismos modificados genéticamente para usos comerciales o de investigación. • Directiva 90/220/CEE. Sobre la liberación internacional en el Medio Ambiente de organismos modificados. • Directiva 98/81/CEE Por la que se modifica la directiva 90/219/CEE relativa a la utilización confinada de organismos modificados. • Ley 15/1994 de 3 de junio. Por la que se establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente a fin de prevenir los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. • Real Decreto 915/1997 de 20 de junio. Por el que se aprueba el reglamento general para el desarrollo y ejecución de la Ley 15/1994 de 3 de junio. • Ley de Prevención de Riesgos Laborales (1995). • Real Decreto 664/1997 de 12 de mayo. Sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos. • Directiva 98/24/CEE de 7 de abril. Relativa a la protección de la salud y la seguridad de los trabajadores contra los riesgos relacionados con los agentes químicos durante el trabajo. • Real Decreto 833/1998 de 20 de julio. Por el que se aprueba el reglamento para la ejecución de la Ley 20/1988 básica de residuos tóxicos y peligrosos. • Real Decreto 1078/1993 de 2 de julio. Por el que se aprueba el reglamento sobre clasificación, envasado y etiquetado de preparados peligrosos. Al amparo de este conjunto de directivas, leyes y decretos, las agencias estatales o comunitarias correspondientes crean su propia documentación en forma de reglamentos, ordenanzas sugerencias o los conocidos guidelines que regulan a nivel práctico las actuaciones y medidas pertinentes para proteger al medio ambiente y a los trabajadores de los peligros que acarrea su actividad.

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Clasificación y prevención de riesgos en las industrias biotecnológicas Los riesgos generados por la industria biotecnológica son de tres tipos, biológicos, químicos y radiactivos. Riesgos biológicos Se deben al tipo de organismo utilizado. Existe una completa clasificación de microorganismos en función del riesgo que entraña su manipulación y su cultivo a gran escala en el que se valora su capacidad de supervivencia en condiciones naturales, su capacidad infectiva y el tipo de dolencias que genera. La lucha contra el riesgo biológico se lleva a cabo mediante los sistemas de biocontención. Existen diversos mecanismos y sistemas para proteger a operadores y entorno de los potenciales riesgos biológicos. Estos mecanismos se agrupan en equipos de seguridad o barreras primarias, instalaciones o barreras secundarias y las prácticas de trabajo. Entre las barreras primarias nos encontramos con las cabinas de trabajo, sistemas que aíslan al operador del material biológico, vestuario específico y quipos de respiración. Las barreras secundarias, o de construcción, hacen referencia a sistemas de esterilización, como los autoclaves, los pasillos especiales de acceso, duchas químicas, etcétera. Por último, la buena práctica dentro del laboratorio se convierte en el elemento esencial de todo sistema de seguridad. Una correcta metodología de acceso a las zonas y el respeto y escrupuloso cumplimiento de la normativa son la garantía para alcanzar el nivel de bioseguridad requerido de una manera efectiva. Riesgos químicos La Biotecnología utiliza frecuentemente productos intermedios con características químicas especiales que impiden su eliminación por los cauces habituales. Valores extremos de pH, componentes orgánicos o presencia de sustancias altamente tóxicas exigen protocolos especiales para su destrucción. Los trabajadores más afectados por estas sustancias son sobre todo analistas e investigadores que deben utilizar las medidas de protección adecuadas para cada caso. Al igual que con el riesgo biológico, el factor fundamental de la seguridad es el adecuado entrenamiento de los operadores y la existencia y cumplimiento de una serie de normas de seguridad en las que se debe indicar el tipo de vestimenta a utilizar, la necesidad de guantes y máscaras protectoras, las condiciones de almacenamiento (humedad y temperatura), etc. Como norma general, el almacenamiento de productos químicos debe realizarse en lugares de acceso restringido, no expuestos a la luz directa ni a humedad excesiva o temperaturas extremas salvo para productos que lo requieran específicamen-

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te. Los productos volátiles, tales como los solventes orgánicos, deben guardarse en lugares ventilados para evitar la acumulación de gases. Exposición a la radiación A escala industrial este riesgo se suele restringir a los analistas. Por lo general es recomendable evitar la realización de pruebas radiactivas en las industrias. Si no hay posibilidades alternativas, existen una serie de barreras físicas basadas en la utilización de materiales como el plomo y el wolframio que son opacos a las radiaciones. En la construcción de instalaciones, dado el elevado coste de estos materiales, se utiliza el hormigón. El personal que trabaja con radiactividad debe estar sometido a un estricto control médico y respetar escrupulosamente todas las normas de seguridad relativas al manejo de fuentes radiactivas.

Gestión de residuos Tras la protección de las personas, procede hacerse cargo de la protección del ambiente, es decir, de la gestión de los residuos generados por el trabajo con productos biológicos, químicos o radiactivos. Residuos biológicos En el nivel de bioseguridad 1, se considera que los residuos biológicos generados no son peligrosos y pueden por lo tanto ser eliminados por las vías normales sin ningún tipo de tratamiento adicional. En niveles de bioseguridad superiores se prevén diversas vías de eliminación de sólidos, líquidos y gases, todas ellas relacionadas con líneas de desagüe especiales, sistemas de esterilización y filtros. Los laboratorios de mayor seguridad filtran el aire que vierten al exterior. Residuos químicos Las administraciones locales especifican la forma en que se deben eliminar los diversos vertidos. En el caso de la Comunidad de Madrid, las vías de eliminación son las siguientes: Medicamentos caducados y vertidos de alta toxicidad. Se debe contratar a una empresa autorizada por la Comunidad que se encargue de la destrucción específica para cada sustancia. Existe normativa muy precisa sobre las condiciones de embalaje y almacenamiento de estos residuos. Vertidos de baja toxicidad. Se eliminan a la red de alcantarillado después de un tratamiento que garantice que los valores de pH, conductividad, DBO y DQO se encuentran dentro de ciertos límites. Para que los vertidos alcancen esta situación,

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es necesaria la construcción de fosas de neutralización, depósitos en los que el vertido es tratado antes de su eliminación. Residuos radiactivos La peligrosidad de los residuos radiactivos y por lo tanto su eliminación varía con la actividad, tipo de emisión y vida media de la fuente emisora. En general, las instalaciones radiactivas deben proceder a una clasificación de los residuos que generan basándose en los parámetros mencionados. Las administraciones públicas se hacen cargo de estos residuos que deben cumplir condiciones muy precisas de embalaje. Las condiciones habituales de almacenamiento para residuos de alta actividad dependen de su vida media. Se considera que por encima de 300 años de vida media, las administraciones no pueden garantizar el almacenamiento seguro de residuos radiactivos en superficie por lo que las prácticas habituales consisten en el enterramiento a gran profundidad o adecuadamente embaladas en los fondos marinos.

Purificación de proteínas recombinantes Una vez generada la proteína de interés, la encontramos en situación de «crudo», es decir, en un medio de cultivo modificado por el microorganismo o la célula productora. A veces incluso, la proteína puede encontrarse en el interior de la célula que es incapaz de excretarla al entorno, siendo necesario un proceso de lisis que libere el producto del interior de las células sin dañarlo. El proceso de purificación debe asegurar la recuperación del producto libre de contaminantes. Dichos contaminantes son, además de otras proteínas, el DNA y los pirógenos. En cada etapa de una purificación se pierde parte del producto a purificar, lo que da a esta fase de la producción un gran peso económico dentro del proceso global. El primer paso en la purificación de la proteína será necesariamente la clarificación del crudo que consiste en la filtración del mismo a través de filtros inertes de las dimensiones adecuadas. Una vez realizada la clarificación se suceden procesos de cromatografía y concentración.

Cromatografia Es el proceso más universalmente utilizado para purificar proteínas. Se basa en las interrelaciones de éstas con matrices poliméricas que exhiben diversas propiedades físico-químicas. Según sean dichas propiedades se establecen las interacciones con las proteínas y los distintos tipos de cromatografías. Los tipos de cromatografía posibles son los siguientes:

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Filtración molecular (Size Exclusion) Separan las proteínas en función de su tamaño. Los geles utilizados en este tipo de cromatografía son porosos y permiten el paso a su través de proteínas hasta un cierto tamaño. El tiempo que tardan las proteínas en recorrer la columna es tanto más largo cuanto mayores son. La relación longitud-diámetro requerido en esta cromatografía debe ser entre 20:1 y 100:1, lo que hace difícil su utilización a escala industrial, al menos en fases tempranas en que el producto suele suponer grandes volúmenes. Cromatografía de adsorción En este modelo se establecen uniones transitorias entre la proteína a purificar y el gel de cromatografía. Este tipo de unión puede ser producida por cargas eléctricas (cromatografía de intercambio iónico), por hidrofobicidad (cromatografía de interacción hidrofóbica), por afinidad funcional tipo enzima-sustrato (cromatografía de afinidad) o por relaciones inmunológicas (cromatografía de inmunoafinidad).

Garantía de calidad A lo largo de este capítulo hemos mencionado varias veces la importancia de los métodos y las buenas prácticas a la hora de garantizar la seguridad del producto, las personas y el entorno. Existe un área de las industrias farmacéuticas, presente también en las biotecnológicas como no podía ser de otra manera, que se ocupa de que los productos fabricados sean aceptables y cumplan plenamente su función; estamos refiriéndonos a los departamentos de Garantía de Calidad. La Garantía de Calidad se ocupa de que todos los procesos se hagan de manera controlada, conforme a métodos descritos, plenamente documentados y respetando las GMP.

GMP Es la abreviatura que designa los Good Manufacturing Practices (normas de buena manufactura). Las GMP son un conjunto de normas que regulan el correcto proceder a la hora de llevar a cabo un proceso industrial. Las GMP cubren un amplísimo espectro de temas, desde el tipo de materiales y acabados a utilizar hasta la secuencia de documentos necesaria para la correcta realización de un proceso. Las GMP no aparecen como tales en un solo documento ni constituyen una doctrina estática e inamovible. Antes bien, existen normas escritas, líneas de actuación y «recomendaciones» de las autoridades sanitarias. Existe una continua renovación de las GMP que procede de los registros de nuevos fármacos, de las inspecciones de las autoridades y del desarrollo de nuevas tecnologías.

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Documentación de procesos Cuando se desea fabricar una sustancia para su venta como producto terapéutico es preciso contar con la correspondiente autorización para su venta. Dicha autorización debe estar avalada, además de por una serie de ensayos clínicos, por una descripción detallada del producto, de sus características químicas y biológicas y del proceso seguido en su fabricación. Es el «registro» del medicamento. En el registro de un producto fabricado por biotecnología figuran una descripción del método, de los equipos y de los controles analíticos que se realizan así como de los criterios que debe cumplir la sustancia en cada paso de la fabricación para acceder al siguiente. Este registro se entrega a las autoridades sanitarias y constituye la documentación de referencia a la que debe supeditarse toda documentación de procesos. En el punto de fabricación debe contarse con una descripción detallada y aplicable de todas y cada una de las operaciones que el personal debe realizar. Son los llamados SOP (Standard Operating Procedures) o PNT (Procedimiento Normalizado de Trabajo). Los SOP hacen referencia a todo tipo de normas, desde la forma de inocular un reactor hasta el orden en que debe vestirse una persona para acceder al área de trabajo o cómo debe procederse en la limpieza de un equipo. A lo largo de la realización de un proceso se generan una serie de datos correspondientes a medidas, cantidades administradas, confirmación de operaciones realizadas. Todos estos datos primarios se deben ir recogiendo en el momento y lugar en que se producen. Los datos recogidos deben estar autentificados y comprobados. El documento oficial que recoge los datos primarios del proceso es la guía de fabricación o batch record. Por último, es esencial garantizar que las personas que trabajan en el proceso conozcan el mismo perfectamente. Deben existir planes de formación que cubran este objetivo. La formación de cada persona debe estar adecuadamente registrada. A lo largo de la vida de un proceso de fabricación es normal que éste vaya cambiando para incorporar nuevos materiales y avances tecnológicos. Cuando la incorporación de tales avances es contraria o se sale de lo indicado en el registro, es preciso comunicarlo a las autoridades sanitarias. Éstas valoran la importancia del cambio propuesto por el fabricante y requieren la documentación y las pruebas que consideren procedentes para dar por válido el método de fabricación modificado.

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15 Presente y futuro de la Biotecnología en las ciencias de la salud: productos obtenidos mediante biotecnología A. Campos de Olmo

Introducción Los rápidos y constantes cambios que se han vivido en las ciencias en general nos han llevado a cambiar el modo de entender la investigación, la medicina y la técnica. Al hablar de biotecnología, a la mayoría de nosotros se nos agolpan en la mente películas tremendistas con un mucho de ficción científica y un algo de base científica o noticias no siempre bien tratadas sobre clonaciones, monstruos y eugenesia. En la actualidad las características de las nuevas biotecnologías tienen tal potencial que han pasado de ser la cenicienta de los laboratorios a una disciplina con un peso específico tan grande que está modificando y obligando a revisar conceptos y fronteras entre los diferentes campos implicados. Así pues, hablamos de una disciplina multidisciplinar y multicultural en la que colaboran especialistas de campos que tradicionalmente no tenían nada en común.

Productos obtenidos mediante biotecnología en ciencias de la salud La biotecnología que debemos desarrollar en el presente siglo se fundamenta en el proyecto Genoma Humano, farmacoquímica-macrocíclica, diseño de fármacos, diagnóstico génico ingeniería proteica y biomimética, terapia génica xenotrasplantes, etc. La aplicación práctica de todas estas especialidades ha llevado a obtener productos de difícil catalogación en las rígidas estructuras de clasificación tradicionales, así nos encontramos con vacunas que son anticuerpos y que a la vez son recom-

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binantes y que se han diseñado por ingeniería molecular y lo producen organismos transgénicos. Pero lo realmente importante de todo esto es que ya se tienen vacunas mucho más efectivas y sobre todo seguras y que proporcionan una inmunidad bastante larga. Por técnicas de ADNr se han desarrollado cepas vivas atenuadas de V. Cholerae que se usan como vacunas orales, también se ha dado un importante desarrollo en la generación de vacunas de subunidades, sobre todo con el virus de la hepatitis, las denominadas vacunas peptídicas y anticuerpos anti-idiotipos. Otro punto a mencionar es el desarrollo de anticuerpos monoclonales partiendo de los cultivos de hibridomas (células tetraploides resultantes de la fusión somática de linfocitos B con células de mieloma). Su campo de aplicación es muy amplio y se pueden utilizar para eliminar selectivamente células que expresan un determinado antígeno (como ciertos antígenos asociados a células tumorales), se han desarrollado anticuerpos específicos de marcadores de diferenciación celular para seleccionar poblaciones celulares (como en trasplantes de médula ósea) o frente a mediadores solubles. También son capaces de modificar el efecto de ciertas moléculas antigénicas o funcionar como reactivos para estudiar distribuciones tisulares de proteínas. A continuación haremos un breve repaso sobre el proceso de producción industrial de hormonas recombinantes.

Producción industrial de hormona de crecimiento recombinante (r-hGH) En la actualidad se comercializa hormona de crecimiento humana por parte de varios laboratorios farmacéuticos. Durante los últimos treinta años del siglo pasado la obtención de hormona de crecimiento se conseguía por sistemas extractivos de hipófisis de cadáveres y a principio de la década de los ochenta se aplican técnicas microbiológicas junto con la técnica del ADN recombinante para obtener bacterias productoras de somatropina. No es hasta los primeros noventa con la aplicación de la ingeniería genética junto con las técnicas de cultivos celulares de eucariotas cuando se comienza a obtener una hormona de crecimiento recombinante totalmente humana y en las cantidades y calidades necesarias para abastecer el mercado mundial. Una primera fase fue la obtención de una línea celular apropiada. En nuestro caso se trata de células de cáncer de mama de ratón, células C127 que son dependientes de anclaje e inhiben su crecimiento por contacto. Se les introduce el gen de la hGH humana y se obtiene un producto de altísima calidad al realizar estas células una modificaciones postranscripcionales (splicing de ARNm) y postransduccionales idénticas que en humanos (sobre todo la última glicosilación, que en bacterias no era completa e incorporaba distintos residuos con un ligero potencial antigénico. En estas células todas las modificaciones de maduración de Prot, se realizan por parte del retículo endoplasmático y Golgi).

PRESENTE Y FUTURO DE LA BIOTECNOLOGÍA…

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Una vez conseguido este importante logro científico en laboratorios de investigación comienza la fase de escalado para conseguir un proceso industrial. Siendo éste un paso complicado es factible y alcanzable. El ciclo de producción tipo se compone de dos fases diferenciadas (Fig. 15.1). 1. Upstream a) Subcultivos. b) Producción. 2. Downstream a) Cromatografía de interacción hidrofóbica. b) Cromatografía de intercambio iónico. c) Cromatografía de filtración molecular. CICLO DE PRODUCCIÓN DE r-hGH Día de trabajo 0 S1

S2

S3

54

H1H2H3

H14

Cultivo celular

70

84

Final de Fin de la producción purificación

Comienzo producción

Descongelar ampollas

Figura 15.1.

S4

26

Producción (14 Cosechas)

90% Purif.

Control de calidad

Análisis

Ciclo completo de un lote de producción de r-hGH.

Upstream Primeramente se genera un banco de células patrón (master cell bank = M CB) a partir del cual se crean los bancos de células de trabajo (working cell bank = WCB). Se mantienen las células congeladas en N2 líquido y almacenadas en viales o ampollas. Los envíos de viales entre el MCB y el WCB se realizan en equipos especiales que aseguran el mantenimiento de las condiciones óptimas durante todo el trayecto, estando constantemente monitorizados por registradores de temperatura. La producción de r-hGH comienza con la descongelación de los viales del WCB. El número a descongelar está directamente relacionado con el tamaño final del lote de producción. Una vez descongelados los viales ser realiza un pool celular sobre DMEM suplementado con suero fetal bovino (SFB) sembrándose todo sobre botellas rodantes (roller bottles = Rb) de 850 cm2 de superficie. A estas botellas, por lo general entre 6 y 11, se les realizan varios cambios de medio para producir el crecimiento del cultivo y fomentar la división celular. Cuando el cultivo ha alcanzado la fase de confluencia se realiza el primer subculti-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

vo. El objetivo de éstos es ir aumentado el número de células productoras en el lote lo que se acompaña, por tanto, de un incremento en el número de botellas rodantes. La fase de escalado se completa con un cuarto subcultivo que fija el tamaño de lote en unas 3.000 botellas rodantes de 2.125 cm2 o 1.700 cm2 de superficie (la elección de una u otra superficie viene condicionada por las necesidades de hormona. Actualmente tenemos capacidad para trabajar con un máximo de 3.600 Rb´s de 2.125 cm2). A partir del subcultivo 4 se comienza un paulatino proceso de aclarado y eliminación de SFB del DMEM para dirigir el metabolismo celular a la producción de la hormona y no a la duplicación celular. La fase de producción propiamente dicha se compone de 14 cosechas o harvest durante los cuales se recoge entre 900 y 1.125 litros de medio de cultivo por día y que contiene entre un 30-40 % de hormona en el total de proteína. Las botellas, lógicamente, se rellenan con DMEM fresco. Todos los procesos enumerados anteriormente se realizan de forma automatizada por robots ubicados dentro de cabinas de flujo laminar. El sistema está gestionado por un complejo sistema informático que transmite órdenes precisas para que el brazo robótico realice las típicas fases en técnicas de cultivos celulares (aclarado, harvest, cambio de medio, tripsinizaciones, etc.). Destacar lo complicado de todas estas operaciones, pues las instrucciones deben asegurar que el robot se mueva en las tres direcciones del espacio, con movimientos suaves para que no afecten al cultivo y todo ello en tiempos compatibles con un proceso industrial (preferiblemente dentro de una jornada laboral) (Fig. 15.2).

Figura 15.2. Robot trabajando con cultivos celulares. El brazo articulado se encuentra en el interior de un flujo laminar y es capaz de realizar todas las tareas propias de un laboratorio de cultivos celulares.

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219

Todas estas manipulaciones se llevan a cabo en un laboratorio de cultivos celulares con técnicos muy cualificados que deben trabajar en condiciones de sala blanca. Todo el laboratorio cuenta con un ambiente controlado en temperatura, humedad, calidad y renovación del aire durante todos los días del año. La totalidad de las Rb del cultivo se mantienen constantemente en movimiento rotatorio en unos armarios denominados comercialmente como roller cell y que cuentan con una capacidad de 100 botellas cada uno. De esta forma nos aseguramos que la monocapa celular se encuentre siempre bañada por el medio que le aporta los nutrientes necesarios. Los roller cell se introducen en cámaras calientes que mantienen temperaturas de 36.5 °C y sólo se permiten variaciones de + 0,2 °C. UPSTREAM Día 0

Día 28

Día 54

Crecimiento

Cosecha

Descongelación

Lote 1

Lote 2

Lote 3 18 Lotes al año

Subcultivos

(8) X

Ampollas WCB

Botellas rodantes 850 cm2

Botellas rodantes 1.700 cm2 (3.000) ⫻ 30

Figura 15.3.

Esquema de la fase de producción de la hormona de crecimiento.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Una parte importante de todo el proceso es la logística de materiales y soluciones. El ingente volumen de DMEM y tampones necesario por operación requiere de sofisticados sistemas de esterilización. Los materiales de vidrio, plástico o acero resistentes al autoclave se lavan previamente en máquinas especiales que utilizan agua purificada para minimizar los contaminantes químicos en los materiales que vayan a estar en contacto con las células. Los equipos que no caben en los autoclaves pasan por sistemas de esterilización CIP-SIP. Todos los líquidos que se preparan para su uso en los cultivo de células o determinados pasos del proceso de purificación se esterilizan por filtración en carcasas de 20 pulgadas. Los ciclos de los autoclaves y las máquinas lavadoras son específicos para cada tipo de material y volumen de carga. Están validados en las condiciones de uso conforme a los requisitos que marcan las reglamentaciones vigentes y toda la documentación generada durante la fabricación de un lote de producción se almacena en registro escrito durante 10 años después de la caducidad del producto en el mercado (en realidad estamos hablado de periodos de tiempo cercanos a los 30 años.) El abastecimiento de agua para inyección (WFI) es crucial para la preparación del medio de cultivo y las distintas soluciones de la fase de purificación. En la planta contamos con un lazo de agua WFI que la mantiene constantemente a 80 °C y en circulación para evitar el crecimiento de microorganismos. El sistema se completa con unas células de luz UV que esteriliza el agua por radiación. Todo el complejo productor de agua se controla exhaustivamente incluyéndose caracterización orgánica e inorgánica (conductividad y TOC) y monitorización continua, lo que asegura una calidad constante y, lo que es muy importante, estable (Fig. 15.3).

Downstream El proceso de purificación de hormona aprovecha tres características de la hormona de crecimiento: 1. Interacción hidrofóbica: en esta primera etapa se utiliza una columna de phenyl-shepharosa que se carga con el harvest salado. Se recoge un pico característico del cromatograma (Abs a 280 nm). 2. Cromatografía de intercambio iónico: Se aprovechan las regiones polares de la hormona para retenerla en el gel. En esta etapa se usa una columna de DEAE sepharosa que se carga con los eluidos obtenidos en la fase PS. El pico del cromatograma se recoge en seis fracciones que incluyen los coleos de la curva del cromatograma. En este paso la pureza de la hormona es ya de un 85 %. 3. Cromatografía de filtración molecular: En este paso los «contaminantes» son en realidad agregados (tetrámeros) y dímeros de la hormona. El pool DEAE se ultracentrifuga y se carga una columna de ultragel ACA54. Esta columna está compuesta de varios discos interconectados entre sí, pues de

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lo contrario tendría una altura cercana a los 6 metros. El cromatograma nos separa tres picos que se corresponden con los diferentes agregados y se recoge el monómero. Todo el eluido se dosifica y se obtiene una hormona purificada al 90 %. En un sencillo último paso se obtiene r-hGH al 99 %. Algunas de estas columnas tienen diámetros de lecho de 60 cm e incluso de ¡1 metro! El lector acostumbrado a trabajar en condiciones de laboratorio sabrá valorar el dato en toda su magnitud (Fig. 15.4). Las especificaciones durante el control en proceso (IPC) se basan en la identificación y pureza del producto final (SDS-PAGE, RP-HPLC y SE-HPLC), valoración (SE-HPLC y OD a 276 nm) y microbiología (carga bacteriana, endotoxina, micoplasma y transcriptasa inversa). Todo el proceso de producción se encuentra estrechamente vigilado por un estricto control de calidad que se basa en especificaciones generados a partir de leyes y organismos reguladores nacionales e internacionales (NDA, FDA, y distintas farmacopeas como USP, PhEUR).

COSECHA (1 cada 2 Días) (14 por lote)

PURIFICACIÓN r-hGH

PS

Cromatografía de interacción hidrofóbica

–40 °C (+/–5) FROZEN r-hGH

PS1

PS2

PS13

PS14

r-hGH LOTE

DEAE

AC 54

Cromatografía de interacción iónica

Filtración molecular

Filtración y dosificación r hG LOTE 90%

Figura 15.4. Proceso de purificación de r-hGH. (Esquema cortesía Dpt. Purificación SERONO. Tres Cantos.)

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Producción industrial de r-hFSH Utilizando los últimos avances en cultivos celulares, la producción industrial de r-hFSH se basa en la tecnología de microportadores en biorreactores de células eucariotas. En este caso la célula vector es de ovario de hámster chino (célula CHO). La ventaja de estas células es que presentan patrones de glicosilación postrancripcional idénticos a humanos, incorporando correctamente los restos de ácido siálico, galactosa, manosa y fucosa con lo que la hormona obtenida es totalmente humana. De estas células se conoce perfectamente su biología celular, son fácilmente cultivables en laboratorio y secretan el producto al exterior. Igual que en el caso anterior el proceso industrial se divide en dos fases. 1. Upstream: a) Proceso de cultivo celular o escalado (36 días). 1. Descongelación de viales de WCB. 2. Expansión celular en frascos T o botellas rodantes. 3. Tripsinización y mezcla con el lecho de microportadores y transferencia al biorreactor. b) Producción de r-hFSH (34 días). 1. Fomentar el anclaje y el crecimiento celular. 2. Dirigir el metabolismo celular para la producción de hormona. 3. Recolección (16 harvest). 2. Downstream: a) b) c) d) e) f)

Ultrafiltración. Cromatografía. Inmunoextracción de r-hFSH. Cromatografía y RP-HPLC. Ultrafiltración. r-hFSH purificada al 99 %.

La aplicación de biorreactores a la producción de hormona es una técnica muy novedosa a escala industrial. En nuestro caso utilizamos equipos de flujo continuo de más de 50 litros lo que permite una recogida de tres harvest cada 24 horas.

Modificación genética en animales. Transgénicos. Introducción A finales del siglo XX los biólogos moleculares y celulares, en sus laboratorios, han sido capaces de identificar, aislar y modificar genes en multitud de especies incluida la humana.

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El segundo paso fue desarrollar técnicas que permitiesen introducir esos genes en células y organismos vivos para poder estudiar sus funciones y efectos. En 1982 los doctores. Brinster y Palmiter fueron los primeros en fabricar «ratones gigantes» obtenidos por la modificación del gen de la hormona del crecimiento. Demostraron así la posibilidad de alterar de modo permanente características en animales y durante todo su ciclo vital. Desde entonces han producido varios miles de líneas de animales transgénicos y no sólo ratones. Algunas de estas modificaciones buscan obtener modelos válidos de enfermedades humanas en animales para diseñar y ensayar nuevas terapias.

El concepto de transgén Estructuralmente, un transgén es idéntico a un gen que se expresa in vivo, por tanto debe contar con secuencias reguladoras y el gen estructural: 1. Gen estructural: secuencia de bases que codifica la información genética necesaria para la síntesis del producto de interés. Actualmente se dispone de varios miles de genes clonados y ya se ha anunciado la secuenciación completa del genoma humano. 2. Elementos reguladores: secuencias responsables de la expresión y regulación del gen determinan los tipos celulares y tejidos en los que el transgén será funcional.

Técnicas de generación de animales transgénicos Microinyección pronuclear Es el primer método desarrollado, se inició en el ratón y es el más ampliamente utilizado. Permite la adición del gen exógeno a todas las células del animal incluso las de línea germinal con lo que pueden transmitir el transgén a su progenie. Las hembras donantes de embriones son tratadas previamente con hormonas para inducir una superovulación. A continuación se cruzan con machos fértiles y posteriormente a la monta (por aparición de tapón vaginal) se sacrifican para recoger los embriones producidos. Los embriones se recogen en estadio de dos pronúcleos y son necesarios varios cientos por experimento. Los embriones se mantienen en placas de cultivo y en un microscopio dotado de un sistema de micomanipuladores, se sujeta mediante una pipeta de sujeción. Con una finísima aguja de vidrio (diámetro inferior a 1 mm) se le inyecta en uno de sus pronúcleos (normalmente el paterno) una solución inocua cargada con entre 20 y 200 copias del transgén. Los embriones así tratados son implantados en grupos a varias madres adoptivas en las que completarán su desarrollo. Una vez terminada la gestación y mediante técnicas de análisis del ADN como PCR o Southern blot se identifican los animales

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

transgénicos (si hay alguno, pues la eficacia de la técnica no supera el 5-15% para construcciones génicas no muy grandes y con técnicos muy experimentados) y a través de un sistema adecuado de cruzamiento se obtienen las líneas transgénicas de interés.

Transgénicos Knock Out Permite la mutagénesis de genes en ratones. Su desarrollo se basa en el establecimiento de líneas de células madre embrionarias (ES) derivadas de la masa celular interna del embrión que una vez transferidas a blástulas pueden dar lugar a cualquier línea celular del ratón (totipotencia). El gen exógeno se integra gracias al mecanismo conocido como recombinación homologa. Este sistema se suele utilizar para estudiar la función de un gen pues la forma salvaje se sustituye específicamente por el transgen de interés. Otra aproximación consiste en la inactivación de un gen, en cuyo caso la modificación afecta a la totalidad del organismo. Con este sistema se obtuvieron los primeros ratones transgénicos en los años ochenta y es una técnica que se encuentra actualmente en auge en investigación básica aplicada a la clínica.

Mutagénesis condicional. Sistema Cre/lox P El sistema Cre/lox se basa en la capacidad que tiene la enzima recombinasa Cre (bacteriófago P1) de reconocer una secuencia de ADN llamada lox P. Si encuentra dos copias de la secuencia lox P con igual orientación, se produce una recombinación en la que se ve interesado el fragmento de ADN qué está entre ellas. Es decir, la acción de Cre elimina o sustituye (según en que condiciones) ese fragmento. El desarrollo del sistema «recombinasa Cre-secuencia de reconocimiento lox P» ha permitido trabajar en modificaciones casi puntuales y específicamente dirigidas sobre el genoma del ratón. La cualidad más sobresaliente de este novedoso sistema es la capacidad de inactivar la función de un gen tan solo en aquellas células del organismo que expresen la recombinasa Cre. Para producir transgénicos por este sistema se necesitan dos líneas diferentes de ratón (la primera creada por mutagénesis dirigida y la segunda por microinyección pronuclear): 1. Un ratón portador del gen «floxeado» («flanqueado por las secuencias lox P»). 2. Un ratón que exprese Cre en un tejido diana. Del cruce de ambos (a ser posible de distinto sexo) obtendremos un individuo que ha perdido el gen «floxeado» en los tejidos diana que expresan Cre. Un esquema con dos de los sistemas se presenta en la Fig. 15.5:

PRESENTE Y FUTURO DE LA BIOTECNOLOGÍA…

A

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B

X

Gen endógeno

Obtención de embriones

Recombinación homóloga en células ES lox P

lox P

Gen flanqueado por secuencias lox P Microinyección e integración del transgén

X Ratón portador gen «loxeado» lox P

Ratón expresando Cre en partes de sus tejidos lox P Promotor

Cre

Transferencia a madre adoptiva El gen «loxeado» se pierde en los tejidos que expresan Cre Identificación de transgénicos

Figura 15.5. Esquema transgénicos. (A): Esquema de transgénesis por microinyección pronuclear. (Foto cortesía de Dept. de Biología Molecular y Celular CIEMAT). (B): Esquema de transgénesis en sistemas inducibles crelox.

Los transgénicos en la industria Hasta el momento solo se ha hablado de ratones transgénicos con aplicaciones en experimentación básica y/o clínica. Pero una técnica con tantas posibilidades no queda fuera de los «procesos industriales» por mucho tiempo. En 1985 se publican los primeros éxitos en la producción de conejos, ovejas y cerdos transgénicos. Sin embargo la técnica tiene limitaciones, como ya se ha indicado anteriormente se necesitan muchos embriones y muchas madres de alquiler para obtener un animal transgénico. En el caso de roedores (como el ratón o el conejo) el elevado numero de crías por camada, su relativa facilidad de cría y su rápido desarrollo permiten obtener buenos resultados a medio plazo con lo que el establecimiento de líneas animales productoras es complicado pero abordable. En el caso de animales como ovejas, cerdos, vacas o cabras las eficiencias de la técnica bajan espectacularmente (entre el 1 y el 2 % de los embriones manipulados dan lugar a animales transgénicos. A nadie se le escapa que conseguir 50 embriones de vaca, manipularlos, implantarlos en otras tantas vacas nodrizas y esperar el nacimiento de terneros trasnsgénicos es un proyecto muy largo y costoso (el proceso de gestación en las vacas es de nueve meses, pero luego hay que esperar a tener individuos adultos y del sexo requerido) y sin una seguridad de éxito a medio plazo, pues en ocasiones no se pueden regular todos los factores de los sistemas biológi-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

cos lo que provoca en ocasiones que el transgén no tenga ningún efecto o su efecto sea negativo. De todas formas existen pequeños rebaños de ovejas, cabras y vacas transgénicas que producen en la leche diferentes proteínas de interés comercial. Los conocimientos de la glándula mamaria y su capacidad de generación láctea de manera más o menos continua y estable y la relativa facilidad de separación de productos en la misma, han ayudado a ello: 1. Producción de fármacos en leche. En la producción de proteínas con carácter terapéutico en este tipo de animales se pueden conseguir concentraciones de incluso 1 a 10 g/l. La caracterización de los elementos reguladores de la expresión de distintos genes codificantes de proteínas lácteas ha permitido su empleo para dirigir la síntesis de proteínas de interés en la leche de hembras transgénicas, con eficiencias del orden de 1 a 40 gramos de proteína por litro de leche producida (calcitonina, _-1-antitripsina, antitrombina III, factores de coagulación. Como ejemplo de los problemas que pueden surgir en la aplicación industrial de estas técnicas mencionaremos el caso del factor activador del plasminógeno humano. Cabras transgénicas que generaban de 1 a 7 g/l de esta proteína en leche, tenían períodos de lactación muy cortos y presentaban signos similares a la mastitis debido a la insolubilidad del plasminógeno a esas altas concentraciones. El mayor problema que se plantea en estos casos es el conseguir lotes de producción estables y consistentes que puedan abastecer un mercado muy exigente. Normalmente las producciones de referencia en artículos suelen contabilizar un número muy reducido de animales y además estos animales se ven afectadas por las diferentes estaciones, el clima, la alimentación y las enfermedades que suelen contraer de manera natural. 2. Leche humanizada. Los intentos principales se dirigen a producir leches humanizadas enriquecidas (ricas en lactoferrina) para minimizar intolerancias alimentarias. De todas maneras en 1998 se pusieron en marcha protocolos de ensayo clínico para proteínas recombinantes que se extraían de diferentes animales transgenicos como la alfa-glucosidasa de conejo (actualmente en fase II) y la antitrombina III de cabras transgénicas (fase III). Aún no está resueltos ciertos problemas de bioseguridad y regulación y no se conocen los efectos de una posible interferencia de secuencias retrovirales.

Producción de órganos para xenotrasplantes Actualmente la técnica de trasplante de órganos (tanto en cirugía como en control del rechazo) es de uso común y es la falta de donantes lo que limita el uso de la misma (se estima en un 50 % los trasplantes que no se realizan por falta de donantes). La posibilidad del xenotrasplante (trasplante entre distintas especies) como alternativa, pasa por evitar el rechazo hiperagudo. Este rechazo viene provocado por

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la unión de anticuerpos del organismo receptor a moléculas xenorreactivas del tejido trasplantado y que desencadena la activación del sistema del complemento, que se traduce en alteraciones de los vasos del órgano injertado. Se han generado cerdos con proteínas humanas reguladoras del complemento así como cerdos con bajos niveles de xenorreactivos, en un intento de evitar el rechazo hiperagudo del trasplante. El uso de órganos de estos cerdos transgénicos, unido a los moderadores de rechazo utilizados en trasplantes humanos, permitió notables resultados en xenotrasplantes cerdo-mono. El uso de este tipo de órganos está actualmente condicionado a la posibilidad de transmisión de enfermedades vinculadas al xenotrasplante. Bibliografía Alberts, BB, D. The cell 3 th Ed. Barcelona. Ed. Omega, 1996. Brown F, Lubiniecki A. Murano G. Characterization of biotechnology pharmaceutical product. Basilea. Ed. Karger, 1998. Doyle A. Griffiths JB. Cell and tissue culture: Laboratory procedures. New York Ed. Wiley, 2000. Freshney RI. Animal cell culture. A practical approach Oxford IRL Press, Oxford University Press, 1992. García Barreno P. Tecnologías innovadoras: de la biotecnología a la nanotecnología. Medicine 1993; 6 (nº ext) 65-81. Gavilondo J. Larricck JW. Antibody engineering at the millenium. Biotechniques (2000) 29: 128-145. Glick, BRO. Pasternak, JJ. Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA. Washington ASM Press, 1994. Izquierdo M. Ingeniería genética y transferencia génica. Madrid, Ed. Pirámide, 1999. Klegerman ME. Groves, MJ. Pharmaceutical biotechnology. Fundamentals and essentials. Buffalo Grove, ILL Interpharm Press, 1992. Lanzov VA. Gene targeting for gene therapy: prospects. Mol Genet. Metab. 1999. 68: 276. Lubiniecki AS. Large-scale mammalian cell culture technology. New York, Marcel Dekker, 1990. Melvin SO. Randall GR. Cell bilogy and biotechnology. Novel approaches to increased cellular productivity. Serono Symposia, New York, Ed Springer-Verlag. 1993. Natalie SR. Biopharmaceutical production in transgenic livestock. TIBTECH Sept. 1999 (Vol. 17). Paul WE. Fundamental inmunology. Philadelphia-New York, Lippincott-Raven Publishers 1999. Ramirez-Solis R. Liu P. Bradley A. Chromosome engineering in mice. Nature 378: 720. 1999. Ridells, Greenberg PD. Principles for adoptive T-cell therapy of human viral diseases. Ann Rev Inmunol 1995 13: 545-586. Springham, DG. Biotechnology. The science and the business. Amsterdam, Harwood Academic Publishers, 1999. Trevan MD. Boffey S. Goulding KH, Stanbury P. Biotecnología: Principios Biológicos. Zaragoza, Ed. Acribia, 1989. Walker, JM, Gingold, EB. Biología molecular y biotecnología. Zaragoza, Ed. Acribia, 1997.

16 Biología molecular y endocrinología: El ejemplo de los animales transgénicos J. Reventos, D. Martínez-Selva, O. Martínez-Tirado, T. Pino, F. Munell

Introducción En septiembre de 1980, Gordon et al. consiguieron el primer éxito en la producción de un animal transgénico (1). Ello consistió en incorporar de forma permanente un gen clonado previamente en el genoma del embrión de un mamífero, en este caso, de un ratón. Estos autores acuñaron el término transgénico para referirse a estos ratones (2). Este término es el usado actualmente para referirse tanto a animales como a plantas a los cuales se les ha transferido artificialmente material genético que en principio no poseen naturalmente. ¿Cuáles son las razones por las que esta tecnología —la creación de animales transgénicos— ha revolucionado de forma tan notable la investigación en biología y medicina y ha permitido este sustancioso avance en la comprensión de la regulación genética y del desarrollo embrionario? (3). La repuesta a esta pregunta podría resumirse de la siguiente manera: los genes inyectados se expresan correctamente en los ratones. Sabiendo que la distribución tisular de la expresión de un gen, así como su regulación durante el desarrollo, están controlados por secuencias de ADN situadas muy cerca del gen mismo, se podrá dirigir la expresión de éstos a voluntad del investigador siempre y cuando dichas secuencias reguladoras (promotores y enhancers) se sitúen por delante del gen que se quiere expresar. Este descubrimiento fue realizado por Brinster et al (4) al dirigir el gen de la timidin quinasa del herpes hacia el hígado de ratones transgénicos, poniendo además este gen bajo el control del promotor del gen de la metalotionina de ratón, que normalmente se expresa en el hígado.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Métodos utilizados para generar animales transgénicos Métodos clásicos Los primeros ratones transgénicos fueron realizados por el método de microinyección (2) en el pronúcleo, aunque actualmente existen otros tres métodos que son también de gran utilidad para la producción de estos animales. Éstos son la infección de embriones por retrovirus portadores del gen que se quiere transferir (5), la utilización de células pluripotenciales embrionarias previamente transfectadas con ADN (6) y la trasferencia genética mediada por espermatozoides (los detalles de los cuatro métodos para producir animales transgénicos pueden verse en detalle en las Figuras 16.1, 16.2, 16.3 y 16.4). Estos métodos tienen ventajas e inconvenientes cuando se comparan entre sí. Los puntos principales de esta controversia se hallan resumidos en la Tabla 16.1.

Transferencia mediada por espermatozoides A mediados de los ochenta, en Roma, en el laboratorio de Corrado Spadafora, se desarrolló un método nuevo para crear animales transgénicos que se denominó «transferencia génica mediada por espermatozoides» (7). El método en cuestión consistía en incubar el ADN que se quería introducir en el ratón transgénico con espermatozoides de ratón. Después de dicha incubación se procedía a fertilizar in vitro óvulos de un ratón hembra donante con dichos espermatozoides. El resultado era la incorporación del ADN externo en algunas de las crías resultantes (Fig. 16.4). La aparición de este método fue ampliamente discutida por la comunidad científica que no consiguió repetirlo en otros laboratorios. Sin embargo, en un pasado más reciente, han seguido apareciendo publicaciones de distintos laboratorios confirmándose su validez.

Recombinación homóloga Los genetistas de las levaduras fueron los primeros en observar que un ADN externo transferido a una célula de levadura se integraba en el mismo locus que el gen endógeno. Ese mecanismo se denominó recombinación homóloga, a diferencia del anteriormente descrito que era al azar o recombinación no-homóloga. Poco tiempo después se conoció que este tipo de recombinación tenía también lugar en las celulas de mamíferos pero en una frecuencia bajísima de aproximadamente 1:1.000. El descubrimiento importante llegó de las manos del laboratorio de Mario Capecchi, en la Universidad de Utah, con la propuesta del método de selección llamado «positivo-negativo» (8) que permitía identificar esta recombinación homóloga entre otras 999 no-homólogas (ver detalles en la Figura 16.5, en su leyenda y en la referencia (9)).

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS…

231

Embrión unicelular en estadio pronuclear ADN ajeno

Microinyección en el pronúcleo

Implantación oviductal

Pseudogestante

Identificación de animales con el gen

Southern-blot

Reacción en cadena de polimerasa

Figura 16.1. El gen que se quiere transferir se inyecta normalmente en el pronúcleo masculino de un embrión unicelular, con la ayuda de un microscopio y de un micromanipulador. Estos embriones se obtienen a partir del oviducto de hembras normales inmaduras superovuladas con FSH y LH que han sido cruzadas el día anterior con machos fértiles normales. Después de inyectarlos, los embriones manipulados serán transferidos al oviducto de una hembra pseudogestante, es decir que ha sido cruzada el día anterior con un macho estéril. Esta madre portadora dará a luz a crías que habrán incorporado o no el gen inyectado (esto se detectará a través de un «Southern blot» o estudio del ADN de las crías por PCR). Las crías que posean el gen (muestra número 3 en la Figura ), se irán cruzando progresivamente entre sí hasta obtener la línea de animales transgénicos.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Vector retroviral infeccioso

Embriones de ratón

Células productoras de retrovirus

Inserción del ADN retroviral en el genoma

Ratón con ADN retroviral

Figura 16.2. Transferencia de genes mediada por retrovirus. El grupo de Rudolph Jaenisch fue el pionero en la utilización de los retrovirus como vectores para transferir genes en embriones de ratón. Estos son desprovistos de la zona pelúcida y puestos en contacto con células productoras de virus (Moloney Murine Leukemia Virus, en la figura). Una vez inyectados, los embriones serán implantados en una hembra portadora pseudogestante.

ADN ajeno

Inyección de células pluripotenciales transfectadas en blastocitos normales de ratón

Células pluripotenciales (stem cells)

Ratón normal

Ratón quimérico

Híbrico F1 El 50% es portador del nuevo gen

Figura 16.3. Utilización de células pluripotenciales (stem cells) para crear animales transgénicos. Las células pluripotenciales existen en líneas establecidas a partir de embriones de ratón. Estas células pueden ser mantenidas indefinidamente en cultivo y se les puede transfectar el ADN que convenga. Las células así manipuladas serán a continuación inyectadas en los blastocitos de ratones normales y posteriormente implantadas en las madres portadoras. Los ratones resultantes, que serán quimeras, serán cruzados con ratones normales hasta obtener la línea de ratones transgénicos.

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS…

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Esperma de ratón ADN ajeno

El ADN ajeno se incorpora a los genes del ratón Óvulo de ratón

Figura 16.4. Transferencia génica mediada por espermatozoides. Este método se basa en el hecho de que el esperma maduro tiene la capacidad de incorporar ADN exógeno al ponerlo en contacto con él. Los espermatozoides de ratón obtenidos a partir del epidídimo son incubados con el ADN de interés que se desea transferir. Dichos espermatozoides incorporarán el ADN y serán posteriormente utilizados en un proceso de fertilización in vitro. Los embriones así fertilizados serán reintroducidos en el oviducto de hembras pseudogestantes y las crías transgénicas identificadas como se describe en la leyenda de la Figura 16.1.

234

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Tabla 16.1. Comparación de las ventajas e inconvenientes de los tres métodos más comúnmente utilizados para producir animales transgénicos Método

Ventajas

Inconvenientes

Microinyección

Técnicamente fácil, alto nivel de expresión.

Existencia de cambios importantes en los cromosomas (concatámeros).

Infección por retrovirus

Técnicamente fácil, integración de una sola copia de ADN, lo que facilita la posterior clonación.

Bajo nivel de expresión. Limitación de tamaño de ADN que se puede inyectar.

Utilización de células pluripontenciales

Se puede seleccionar antes de producir el animal.

Técnicamente muy difícil. La transmisión a las líneas celulares germinal no siempre ocurre (quimeras).

Eliminación de una alelo en un animal: el ejemplo de los ratones knock-out La estrategia de la recombinación homóloga, ampliamente utilizada en la actualidad, permite, no solo expresar el gen de interés bajo control de los promotores endógenos existentes en el genoma del receptor, sino la misma sustitución del gen endógeno, evitando pues su expresión, por un nuevo gen externo o construcción génica que se desee insertar (10). Esta metodología permitió, además de la transgénesis convencional, en este caso dirigida, la eliminación de un gen de forma selectiva. Los animales resultante de dicha manipulación se han denominado «alelos nulos» o «knock-outs». Conceptualmente, estos modelos representarían los opuestos a los transgénicos clásicos en los que se sobreexpresaba un gen externo de interés. Estos modelos están contribuyendo de forma extraordianaria al establecimiento de la función de los genes y de sus correlaciones entre genotipos y fenotipos. Veremos en el curso de esta revisión algunos de los modelos de «knock-out» más relevantes en la endocrinología.

Animales transgénicos de expresión inducible Sin embargo, cuando un gen, ya sea sobreexpresado o anulado por transmisión germinal en un animal transgénico, está presente en dicho animal desde el inicio del desarrollo embrionario, éste puede en muchas ocasiones hacer inviable el desarrollo del animal y por tanto la no obtención del modelo deseado. Esta estrategia, útil en muchos ejemplos, puede no serlo en otros. Para ello, varios grupos han diseñado un modelo de animal transgénico inducible externamente o condicional. Este método de expresión inducible y tejido-específica, basado también en la recombinación homóloga, se fundamenta en el sistema de recombinación Cre-loxP (11,12) (véase Fig. 16.6).

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS…

235

Gen clonado X interrumpido por la inserción del gen aph Gen tk

Recombinación homóloga

Recombinación no-homóloga

aph

tk

Célula resistente al G 418 y sensible al ganciclovir

aph Gen X interrumpido, célula resistente al G 418 y al ganciclovir

Figura 16.5. Selección positiva-negativa para identificar los eventos de recombinación homóloga. El gen clonado X ha sido interrumpido por la inserción de un gen aph (que codifica para la resistencia al análogo de la neomicina G418). En dirección 3’ se ha clonado un marcador tk. La incorporación de un marcador positivo se utilizará para seleccionar las células que hayan incorporado el vector de ADN después de la transfección. La pérdida del marcador negativo se utiliza para distinguir las células que han incorporado la construcción al azar de las que lo han incorporado por recombinación homóloga. El marcador negativo está clonado en un extremo de la construccción, donde hay una región de no homología entre el vector de inyección y el ADN cromosómico. Cuando la recombinación homóloga tiene lugar, esta zona es eliminada por la maquinaria que gobierna la recombinación homóloga, y las células adquieren la capacidad de sobrevivir en un medio selectivo que contenga el análogo de la timidina ganciclovir. En las células que han incorporado el ADN al azar, la presencia de un tk activo permitirá la selección con ganciclovir.

Ejemplos de utilización de los animales transgénicos en biomedicina Los animales transgénicos se han utilizado para resolver una gran variedad de problemas que la biología tiene planteados, principalmente relacionados con la regulación génica. En la segunda parte de esta revisión, presentamos brevemente algunos de los trabajos de más relevancia en campos tan distintos como la oncolo-

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gía, la inmunología, la terapia por genes, la endocrinología (véanse revisiones en (13) y (14), etc.

Oncología La posibilidad de introducir en animales genes potencialmente oncogénicos clonados a partir de virus o de células tumorales, ha permitido estudiar detalladamente la función que tales genes pueden desempeñar en el desarrollo y en la evolución del cáncer (3). La introducción en ratones del oncogén c-H-ras unido al promotor de la elastasa pancreática del tipo I causó la aparición de tumores de páncreas exocrino; sin embargo, cuando es el proto-oncogén ras el que se introduce, los tumores pancreáticos no aparecen. Gen diana

Recombinación homóloga

Gen diana HSV-tk

loxP

HSV-tk

Construcción diana

neo

loxP

loxP

Recombinación homóloga de la línea germinal

neo

Recombinación mediada por Cre-loxP + tratamiento con ganciclovir

gen diana flanqueado por loxP

Delección del gen diana

Knockout inducible

Knockout no inducible

Figura 16.6. Estrategia para generar deleciones de genes inducibles en células embrionarias por recombinación homóloga. En un primer tiempo, una construcción génica direccional que albergue tres sitios loxP flanqueando al gen diana y un cassette con un marcador de selección que contenga el gen para la resistencia a la neomicina (neo r) y un HSV-TK son recombinados con el ADN de la línea germinal. En un segundo tiempo, la enzima Cre se expresa en las células embrionarias que contienen el ADN recombinado homólogamente. La expresión de Cre podrá resultar ya sea en la deleción del gen diana producido por las células embrionarias portadoras de la deleción en la línea germinal, o en una deleción del cassette con el marcador de selección productor del gen flanqueante en el locus diana, permitiendo la inactivación inducible en las células embrionarias resultantes.

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS…

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La introducción de genes virales en ratones transgénicos ha permitido crear modelos para estudiar la malignidad y el potencial oncogénico de los virus. La inyección en ratones del virus SV40 o de su antígeno T, origina la aparición de papilomas del plexo coroideo. Cuando este gen se une al promotor de la insulina, los tumores aparecen en el páncreas endocrino. Este tipo de experimentos ilustra claramente el poder de esta tecnología al dirigir la expresión de oncogenes hacia tejidos específicos, permitiendo con ello seguir de forma precisa el proceso de transformación celular. Creación de animales con enfermedades genéticas De la misma manera que la transferencia de un gen puede corregir una enfermedad genética, aquella puede también originarla. El mejor ejemplo de este tipo de experimentos fue el crear un modelo portador de la mutación letal responsable de la osteogénesis imperfecta, que es una enfermedad en la que existe una alteración de la formación del colágeno. Para producir dicho modelo animal, Stacey et al. mutaron in vitro el gen clonado de la cadena alfa 1 del colágeno, insertando una cisteína o una arginina en la posición 849 de la proteína. Cuando el gen mutado artificialmente se transfirió a los ratones, éstos desarrollaron la enfermedad letal parecida a la osteogénesis imperfecta (13). Ratones transgénicos como modelos para terapia por genes Los ratones que tienen una mutación específica responsable de una enfermedad son modelos ideales para ser tratados restituyendo el gen anómalo o ausente (terapia por genes). Los ratones portadores de una deleción del gen de la beta globina, al ser cruzados hasta obtener homocigocidad, desarrollan la enfermedad conocida como beta talasemia, que es una hemoglobinopatía corriente en humanos. Costantini et al. consiguieron corregir la beta talasemia en estos ratones inyectándoles el gen de la beta globina humana (3). Endocrinología La determinación del sexo, en los animales superiores, requiere la expresión de un gen del cromosoma Y, el SRY, que es capaz de inducir el desarrollo de la gonada indiferenciada hacia testículo en lugar de ovario. La evidencia directa de que el gen SRY era el gen determinante de la aparición de testículos se obtuvo gracias al análisis del genoma de hembras XY con disgenesia gonadal. La prueba definitiva para demostrar la función del gen SRY se obtuvo, sin embargo, al introducir dicho gen en embriones XX y observar si éstos desarrollaban un fenotipo masculino (15). Este experimento, cuyos resultados fueron positivos, permitió identificar la secuencia concreta del gen SRY responsable de la diferenciación testicular y del desarrollo masculino.

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Todas las proteínas de la familia de las inhibinas y de las activinas han sido utilizadas en animales transgénicos ya sea sobreexpresándolas o anulando su expresión. En este sentido, y lejos de querer hacer cualquier tipo de revisión exhaustiva en el presente manuscrito, quisiéramos mencionar únicamente algunos de los modelos de «knock-out» obtenidos por recombinación homóloga que han contribuido enormemente a la comprensión de la función de estas proteínas en la reproducción. Estos modelos, la mayoría provenientes del laboratorio de Martin Matzuk del Baylor College of Medicine de Houston, incluyen prácticamente la totalidad de los genes de la familia (16,17). El gen de la subunidad alfa de la inhibina fue delecionado por recombinación homóloga en ratones. Los animales con el alelo nulo, aunque fueron viables en su desarrollo, presentaron, posteriormente y en ambos sexos, tumores de los cordones sexuales. Este hallazgo confirmó la función de la inhibina como gen supresor de tumores. Su función en la reproducción, sin embargo, se afectaba de forma distinta en cada sexo. Mientras las hembras deficientes en inhibina eran estériles, los machos, inicialmente, eran fértiles, con presencia de esperma en sus epididimos y con la capacidad de entrecruzarse. Sin embargo, la presencia de los tumores mencionados anteriormente acababa alterando la fertilidad normal. El nanismo hipofisario y el hipogonadismo hipogonadotropo constituyen dos ejemplos de enfermedades endocrinas congénitas que también han sido curadas en ratones al inyectarles el gen deficitario. En el primer ejemplo, Palmiter et al. (18) consiguieron normalizar el crecimiento (e incluso sobrepasar la normalidad) de los ratones enanos (lit/lit) mediante la inserción de gen de la hormona de crecimiento de rata. Mason et al. (19) hicieron lo propio con los ratones mutantes portadores de una deleción en el gen del factor liberador de las gonadotrofinas. Al inyectar el gen de dicha hormona, estos autores consiguieron restituir los valores normales de LH y de FSH, así como de fertilidad. Otro modelo creado en ratones transgénicos ha sido el de la diabetes mellitus insulino-dependiente. Una teoría de base autoinmune explicaría esta enfermedad como consecuencia de una inflamación pancreática de origen infeccioso que a su vez induciría la producción de interferón, causando ésta la aparición de moléculas del antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II en las células de los islotes pancreáticos. La asociación de estos determinantes antigénicos MHC con antígenos específicos del páncreas es la causa de que las células T no reconozcan como propias a las células de los islotes. Ello comportará el consecuente rechazo autoinmune. Sarvetnick y colaboradores inyectaron en embriones de ratón el gen de interferón o el del MHC unidos al promotor de la insulina produciendo en ambos casos la destrucción de las células de los islotes pancreáticos (3).

Conclusiones Estamos viviendo unos años de intensa revolución en la investigación en biología y medicina. El descubrimiento de los animales transgénicos a finales de 1980 ha

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS…

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contribuido notablemente al avance y mejora de la utilización de las técnicas de biología molecular (1-3,13,14,19). La medicina y la biología se basaron en una época en los estudios en pacientes y animales de laboratorio. Esto fue seguido por el aislamiento de órganos y tejidos y el consecuente estudio histológico y anatomopatológico individualizado. Los importantes avances de la bioquímica permitieron posteriormente identificar de forma muy precisa las sustancias producidas por los tejidos aislados. A todo ello le siguió la explosión de la biología celular y el desarrollo de los cultivos de células in vitro. A partir de este momento fue posible determinar las funciones de las células, estableciendo una relación causa-efecto casi perfecta. Los cultivos celulares, sin embargo, prescinden de la inervación, de la vascularización así como de otros sistemas de comunicación paracrina que el tejido poseía in vivo, por lo que muchos de los resultados obtenidos con esta metodología deben ser analizados con cierta prudencia. La biología molecular cambió por completo las técnicas de investigación hasta entonces utilizadas, ya que permitió identificar genes, así como conocer sus secuencias, establecer comparaciones filogenéticas, etc. Hasta la llegada de las primeras técnicas de transfección de genes en células en cultivo no se pudo profundizar en la compresión de los efectos de dichos genes en sistemas biológicos. En este sentido, los animales transgénicos representan, en cierto sentido, la culminación de una tecnología muy sofisticada de investigación, ya que permiten estudiar los efectos de un gen o parte de un gen (promotores, enhancers, etc.) en el contexto del animal vivo. La tecnología de los ratones transgénicos y su extensión a animales mayores ha demostrado ser de grandísima utilidad en aspectos muy diversos de la biología y de la medicina. Esta técnica tiene aplicaciones en todos los aspectos del desarrollo de los mamíferos en los que la endocrinología ocupa un lugar prioritario (13,14,19,20-23). El hecho de poder dirigir la expresión de un gen a un órgano o tejido específico ha permitido la producción de hormonas de forma no fisiológica, para con ello alterar los sistemas de feed-back normales y poner en evidencia mecanismos de regulación endocrina hasta ahora desconocidos. Aunque creemos que los aspectos mencionados, así como otros muchos presentes en la literatura científica, permiten augurar un rápido incremento de la aplicación de la tecnología de los animales transgénicos en la mayoría de las áreas de las ciencias biológicas y médicas, es oportuno señalar también que siguen existiendo dudas y problemas todavía no resueltos que estos modelos plantean y que deberan ser objeto de futuras investigaciones.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

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17 Bases moleculares de la deficiencia y resistencia a la acción de la hormona de crecimiento: Entidades sindrómicas J. A. Chowen y J. Argente

Introducción El crecimiento humano, entendido como un proceso biológico determinado genéticamente y modulado por factores ambientales, puede alterarse por defecto (hipocrecimiento) o por exceso (hipercrecimiento). El desarrollo espectacular de los conocimientos moleculares en los últimos años ha permitido un diagnóstico cada vez más preciso de las anomalías moleculares del crecimiento humano, distinguiendo eficientemente aquellas alteraciones debidas a lesiones genéticas, de las causas nutricionales, orgánicas, tumorales, psicológicas o traumáticas. Esta revisión se centrará, exclusivamente, en el análisis de las bases moleculares conocidas en el momento actual, capaces de generar deficiencia de hormona de crecimiento (GH), aislada o combinada o resistencia a la acción de la misma. Las bases moleculares de la talla baja debida a deficiencia o resistencia a la acción de la hormona de crecimiento, se han desarrollado gracias a la localización y caracterización en el ser humano de los genes que codifican proteínas implicadas en la regulación hormonal del crecimiento. Todo ello ha contribuido al descubrimiento de nuevas enfermedades, como es el caso de la deficiencia combinada de hormonas hipofisarias. Asimismo, ha mejorado el conocimiento de las deficiencias de GH originadas por mutaciones del gen GH1 y del gen del rGHRH, demostrándose al menos en un caso mutaciones en el gen de IGF-I. Finalmente, se ha consolidado la comprensión de la heterogeneidad molecular de los síndromes de resistencia periférica a la GH por anomalías del gen del rGH, tanto en la forma clásica como en la forma parcial, ya por la existencia de mutaciones en el dominio extracelular, transmembrana o intracelular. Las bases moleculares de la talla baja debida a anomalías en determinados genes localizados en los gonosomas, tanto cromosoma X como Y, ha despertado un enorme interés y se encuentra en fase de profunda investigación. En la porción terminal

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del brazo corto, en la región pseudoautosómica, de los cromosomas X e Y se ha cartografiado un gen relacionado con la talla baja (SHOX), cuya presencia o ausencia, tiene un efecto significativo sobre la estatura. Además, algunas mutaciones en el gen BTK (Xq21.3-q22) están implicadas como única causa de inmunodeficiencia y déficit aislado de GH (tipo III). Junto a ello, ciertos casos de talla baja y deleción del brazo largo del cromosoma Y (46, XYq-), apoyan la hipótesis de la presencia de uno o más genes relacionados con el crecimiento en el brazo largo del cromosoma Y. De hecho, se ha cartografiado en su porción proximal, cercano al centrómero, un gen específico de crecimiento (GCY -«growth control in the Y»).

Bases moleculares del hipocrecimiento armónico La deficiencia en factores de crecimiento semejantes a la insulina, en particular del número I (IGF-I), ya por deficiencia o insuficiencia de hormona de crecimiento (GH), ya por resistencia, completa o parcial, a la acción de la misma, ya por deficiencia primaria de IGF-I, de naturaleza congénita, se caracteriza por la ausencia, absoluta o relativa, de IGF-I detectable en suero o plasma. La resistencia a la acción de IGF-I originaría, en teoría, un fenotipo similar con niveles normales o elevados de IGF-I. La deficiente acción de IGF-I conduce, sea cual fuere su etiología, a un fenotipo caracterizado por un hipocrecimiento armónico, facies de muñeca con frente abombada y puente nasal escasamente desarrollado. La longitud al nacimiento es normal o está ligeramente disminuida en la mayoría de los niños con deficiencia de IGF-I; sin embargo, el crecimiento postnatal es completamente anómalo, debido al enlentecimiento progresivo de la velocidad de crecimiento, en especial a partir de los seis meses de edad. I. Hipocrecimiento por deficiencia genética de hormona de crecimiento En la actualidad puede procederse al diagnóstico de mutaciones en los genes de GH1, Pit1, Prop1, Lhx3, Hesx1, rGHRH y SHOX. La posible implicación de otros factores de transcripción [RPX, PITX1 (5q31), PITX2 (4q25-q26), IsI1 (5q)] en la producción de deficiencia de GH en humanos, está en estudio. Se conocen al menos cuatro tipos mendelianos de déficit aislado de la GH (DAGH) (1). La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, denominada con anterioridad panhipopituitarismo, es una alteración caracterizada por el déficit de al menos una hormona hipofisaria, además de la deficiencia en GH, que puede presentar patrones variables de herencia: autosómica recesiva o ligada al cromosoma X. El déficit de hormona de crecimiento puede asociarse también a alteraciones del desarrollo embriológico secundarias a anomalías monogénicas o cromosomopatías. En general, las anomalías en el desarrollo de la línea media cerebral pueden cursar

BASES MOLECULARES DE LA DEFICIENCIA Y RESISTENCIA…

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con afectación hipofisaria o hipotalámica y, por consiguiente, con deficiencia de GH. Entre estos cuadros clínicos se incluyen la ausencia aislada de hipófisis, la anencefalia, la holoprosencefalia, algunos casos de displasia septo-óptica o síndrome de de Morsier, el síndrome ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino (síndrome EEC), la anemia de Fanconi, el síndrome de Bloom, la deleción del brazo corto del cromosoma 18 (18p-) y el cromosoma 18 en anillo. Los genes conocidos relacionados con la expresión de la GH humana, son los que siguen: Cluster de la GH: El cluster del gen de la GH humana se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 (17q22-24) y ocupa una distancia de 66,5 kilobases (kb) (2). Se compone de cinco genes alineados en la misma orientación transcripcional 5’ a 3’: gen de la GH hipofisaria (GH1), pseudogén 1 de la hormona somatomamotropina coriónica (CSHP1), gen 1 de la hormona somatomamotropina coriónica (CSH1), gen de la GH placentaria (GH2) y el gen 2 de la hormona somatomamotropina coriónica (CSH2). Cada uno de los cinco genes consta de cinco exones con cuatro intrones intercalados y todos ellos muestran entre sí un alto grado de homología (92-98 %) en toda su secuencia. El análisis de esta importante homología ha sugerido la hipótesis de que todos estos genes surgieron de un gen ancestral común a través de una serie de recombinaciones homólogas, pero desiguales, que dieron lugar a duplicaciones génicas (3). El gen GH1 se expresa en las células somatotropas de la hipófisis anterior, mayoritariamente como una proteína de 191 aminoácidos (GH de 22kDa). Gen de la hormona hipotalámica liberadora de la GH (GHRH): El gen que codifica la GHRH en el hombre es único y ha sido localizado en el brazo largo del cromosoma 20 (20q11.2) (4). Su longitud es de aproximadamente 10 Kb y contiene 5 exones. La transcripción del gen da lugar a un ARNm de aproximadamente 750 bases, cuya traducción origina un péptido de 107-108 aminoácidos que contiene: un péptido señal, los 44 aminoácidos de la GHRH y un péptido carboxi-terminal, cuya función, si es que la tiene, se desconoce (5). Todavía no se han descrito mutaciones del gen de GHRH en humanos ni en otras especies. De hecho, se ha excluido su existencia en la totalidad de casos familiares de déficit aislado de GH en que se ha estudiado (6). Gen de la hormona hipotalámica inhibidora de la GH (Somatostatina): El gen que codifica la SS en el hombre es único y se encuentra localizado en el cromosoma 3 (7). Su expresión da lugar a una molécula de 116 aminoácidos, la pre-prosomatostatina (pre-proSS), que tras ruptura del péptido señal da lugar a la prosomatostatina (proSS). Ésta es una prohormona de 92 aminoácidos con un peso molecular de 10,3 kD de la que, en todos los mamíferos estudiados, se originan tanto la SS-14, como la SS-28 (8). Del procesamiento de la proSS derivan otros péptidos que no contienen la estructura de la SS-14 y por tanto no poseen actividad somatostatinérgica y cuyas funciones son desconocidas; éstos son: SS-28(1-12), proSS(1-76), proSS (1-63) y antrina.

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Las posibles implicaciones de este gen en trastornos del crecimiento humano, aún están por dilucidar. Gen del receptor de GHRH: El gen que codifica el receptor de la hormona liberadora de la GH (rGHRH) ha sido recientemente clonado y caracterizado (9), y asignado al cromosoma 7p14. (10). Una mutación homocigota en el receptor de GHRH ha sido definida como la base molecular del defecto del ratón Little («Little mouse»), un modelo animal de deficiencia aislada de GH autosómico recesivo (11), sugiriendo que el gen homólogo humano podría ser un buen candidato para explicar al menos algunos casos de déficit familiar aislado de GH. Posteriormente, se han descrito anomalías en el gen del rGHRH causantes de talla baja en el ser humano y que proporcionan las bases moleculares en algunos casos del déficit familiar de GH tipo IB (12). Gen del factor de transcripción hipofisario número 1 (Pit1): La activación específica de los genes de GH, prolactina y `TSH, requieren la presencia del factor de transcripción Pit1 (13,14). Pit1 o GHF-1 es una proteína de 33 kD que contiene dos dominios («POU-specific domain» y «POU-homeodomain»). El gen del Pit1 humano se localiza en el cromosoma 3p11 (15); consta de seis exones y cinco intrones. El interés en dicho gen radica en el hecho de que ya ha sido demostrada la existencia de anomalías en el mismo causantes de patología en el crecimiento humano, como se describirá más adelante. Gen del factor de transcripción hipofisario Prop1: El «profeta» del Pit1, denominado Prop1 y localizado en el brazo largo del cromosoma 5, ha sido recientemente implicado en patología humana (16). A. Deficiencia aislada de GH familiar Las cuatro formas descritas varían en cuanto a la intensidad del déficit, el modo de herencia y la respuesta al tratamiento sustitutivo con hormona de crecimiento. DAGH IA Es el más intenso. Los pacientes afectos de DAGH IA son, habitualmente, de longitud normal o algo pequeños en el momento del nacimiento, pudiendo presentar hipoglucemias en el período neonatal; sin embargo, todos ellos muestran un hipocrecimiento muy marcado a los seis meses de edad. Los niveles circulantes de GH son indetectables tanto en condiciones basales como tras respuesta a cualquier estímulo provocativo. La base molecular de esta enfermedad autosómica recesiva, en la mayoría de los casos, consiste en una deleción de ambos alelos en homocigosis del gen que codifica para la GH hipofisaria (GH1). La forma más frecuente (aproximadamente en el 70 % de los casos) es de 6,7 kilobases (kb). El resto de las deleciones descritas, son: 7,6 kb, 7 kb, 45 kb, y una doble deleción en el cluster del gen de GH (17).

BASES MOLECULARES DE LA DEFICIENCIA Y RESISTENCIA…

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Además de las deleciones, se han descrito otras mutaciones en el gen GH1 (T20X, IVS4+1GfiT, 300 del AG) en asociación con un fenotipo severo de DAGH IA y niveles plasmáticos indetectables de GH (18). Todas estas mutaciones originan alelos nulos del gen GH1, dando lugar a la producción de una proteína truncada que, probablemente, es degradada intracelularmente.

DAGH IB Enfermedad con patrón de herencia autosómico recesivo, asocia niveles plasmáticos de GH bajos pero detectables tras estímulos farmacológicos estándar, con el resto de las funciones endocrinológicas normales, y un fenotipo menos severo que el tipo IA. El gen de GHRH ha quedado excluido (6) y se han demostrado, recientemente, mutaciones en el gen del rGHRH (12) que podrían establecer las bases moleculares de esta anomalía en algunos casos.

DAGH II Presentan las mismas características clínicas y similares criterios diagnósticos que los pacientes con DAGH IB (1). El modo de herencia es autosómico dominante. Los estudios de ligamiento genético son compatibles con cosegregación de DAGH II con el gen GH1 en la mayoría de las familias, mientras que el gen de GHRH ha sido excluido mediante análisis de ligamiento en todas las familias estudiadas (6). La alteración molecular causante del déficit aislado de GH tipo II ha sido descrita en varias familias no relacionadas. Curiosamente, en todos los casos se trata de mutaciones en un alelo en el intrón III del gen GH1 (18). Tres de ellas son sustituciones de un nucleótido en la secuencia 5’ donante para el empalme del ARNm (IVS3 + 1G c A, + 2T c C y + 6 T c C) (19), mientras que otras dos, una sustitución simple (IVS3 + 34 G c A) y una deleción de 18 pares de bases (IVS3 + 27 del 18) dentro de la secuencia intrónica (20,21), afectan secuencias necesarias para el procesamiento normal del ARNm («splicing enhancers») (22) o la estructura secundaria del ARN heteronuclear. Todas estas mutaciones intrónicas producen el mismo efecto en el procesamiento postranscripcional del ARN originando un escape o pérdida completa del exón 3 de GH1 en el ARNm maduro. La proteína mutante que resulta de la traducción del ARNm mutado sería la GH descrita de 17,5 kD que carece de los aminoácidos 32 a 71, incluyendo un residuo de cisteína. Aunque el efecto negativo dominante de estas mutaciones no se encuentra claramente definido, podría suponer la existencia de dimerización de la proteína mutante con la GH normal gracias a la formación de puentes disulfuro intermoleculares entre los residuos libres de cisteína.

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DAGH III Se han descrito escasas familias con deficiencia aislada de GH mostrando un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X, en las que todos los varones afectos presentaban también hipogammaglobulinemia (23,24). El tratamiento de estos pacientes con GH se ha asociado con un incremento de los linfocitos B y unos niveles plasmáticos más elevados de inmunoglobulinas (25). El análisis genético en varias de estas familias sugirió que la combinación de agammaglobulinemia ligada al X (XLA) y deficiencia aislada de GH podría ser debida a una alteración genómica que afectase al gen de XLA (BTK) en el cromosoma Xq21.3-q22 y/o un locus contiguo probable necesario para la expresión de GH. Sin embargo, se ha comprobado la existencia de mutaciones puntuales en BTK como única causa de la inmundeficiencia y del déficit de GH en al menos dos familias (26,27). Es probable la existencia de otras formas de DAGH ligadas al X. Estas alteraciones explicarían el exceso de varones afectos en relación a mujeres en los casos de DAGH. En la actualidad, existen evidencias que sugieren la presencia de varios loci en el cromosoma X capaces de intervenir en la regulación de la hormona de crecimiento. Así, se han descrito algunos pacientes con DAGH asociado a anomalías en distintas regiones del cromosoma X, incluyendo una deleción intersticial de Xp22.3 y una duplicación de Xq13.3-q21.2 (28,29).

B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, se caracteriza por presentar deficiencia de una o más de las hormonas tróficas hipofisarias (TSH, ACTH, FSH, LH), además de deficiencia de GH. Aunque la mayoría de los casos son esporádicos, se han descrito varias familias en las que se sugiere un modo de herencia autosómico recesivo (tipo I) y una forma ligada al cromosoma X (tipo II) (1). Algunos de los supuestos casos autosómicos recesivos presentan anomalías anatómicas con una silla turca pequeña o alargada. El grado de expresión fenotípica de las diferentes deficiencias en las hormonas tróficas hipofisarias presenta variabilidad inter o intrafamiliar. Los loci responsables de la mayoría de los casos de estas enfermedades hereditarias no han sido todavía establecidos, excepto para el subtipo autosómico recesivo debido a mutaciones en el gen Pit1 que asocia específicamente déficit de GH, prolactina y, en ocasiones, TSH, con normalidad del resto de la función hipofisaria y, más recientemente, para el subtipo debido de mutaciones en el gen Prop1 causantes de deficiencias en GH, TSH, prolactina, FSH y LH, y del gen Lhx3 causantes de deficiencia, asimismo, en GH, TSH, prolactina, FSH y LH. La similitud de este fenotipo humano con la de los ratones enanos «Snell» y «Jackson», en los que el fenotipo autosómico recesivo es causado por mutaciones en el locus Pit1, condujo al análisis del gen de Pit1 en las familias afectas con deficiencias de GH, prolactina y TSH. La producción de una proteína truncada en

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homocigosis por la mutación R172X se asocia a un fenotipo muy llamativo en el que predomina déficit de TSH con cretinismo congénito (30,31). Una mutación «missence» R158P en el dominio específico POU, bien en homocigosis o en heterocigosis con el otro alelo nulo origina en los pacientes la ausencia de secrección de GH y prolactina junto con una deficiencia parcial de TSH y un tamaño de la hipófisis normal (32). Por último, una mutación «missence» de novo se ha descrito en un paciente heterocigoto con el fenotipo de enanismo panhipopituitario (33). Esta mutación está localizada más allá del dominio de unión al ADN (R271W) y, curiosamente, la proteína mutante parece tener un efecto dominante negativo que inhibe la unión al ADN de la proteína normal. No obstante, el hallazgo de la misma mutación en otra familia japonesa en la que varios portadores no presentaban fenotipo alguno, ha puesto en cuestión la significación biológica de ese efecto dominante negativo (34). Un segundo ratón mutante, denominado «enano Ames», el cual es no alélico, pero fenotípicamente similar a la mutación que exhibe el ratón enano Snell, define un segundo locus para el enanismo. Tras la localización del gen de Prop1 en el ratón Ames por Sornson et al. en 1996 en el ratón (16), se ha podido localizar el gen en el ser humano en el brazo largo del cromosoma 5 (5q). Recientemente, Wu et al. han demostrado la existencia de mutaciones en el gen Prop1 del ser humano (35). Todas parecen mutaciones hipomórficas o amórficas y las variantes alélicas descritas hasta ahora incluyen dos sustituciones simples de aminoácidos, R120C y F117I (35), y una deleción de dos pares de bases en el exón 2 (301delAG) que conduce a un error de lectura desde el codón 101 con un codón de finalización prematuro en 109 (35). Más recientemente, Cogan et al. (36) analizaron 10 casos familiares y 21 esporádicos de deficiencia combinada de hormonas hipofisarias. Demostaron que de los casos familiares estudiados, cinco fueron homocigotos y uno heterocigoto para la mutación 301delAG, mientras que entre los 21 casos esporádicos estudiados, encontraron la misma mutación en dos casos en homocigosis y en un caso en heterocigosis(36). Por tanto, esta mutación puede ser la causa más frecuente de deficiencia combinada familiar de hormonas hipofisarias. C. Alteraciones embriológicas Entre el amplio número de alteraciones embriológicas y algunos otros síndromes genéticos que cursan con déficit asociado de hormona de crecimiento, se conocen las bases moleculares siguientes: Holoprosencefalia Se trata de una malformación de la línea media asociada con frecuencia a labio leporino o hendidura palatina y que cursa con alteraciones del desarrollo del tracto olfatorio y de los globos oculares, así como déficit motores y psíquicos y grados variables de hipofunción hipotalámica. Pueden presentar déficit aislado o combi-

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nado de GH. La mayoría de los casos son esporádicos o secundarios a cromosomopatías (trisomía 13, 13q-, 18p-, 7q-), pero el 30 % son familiares con transmisión autosómica dominante o recesiva. Recientes estudios han demostrado mutaciones en genes que codifican señales de migración neuronal, ZIC2 en 13q32 (37) y Sonic Hedgehog en 7q36 (38), como responsables de dos tipos de holoprosencefalia. Existen al menos otros dos loci implicados en este cuadro, HPE1 localizado en 21q22.1, y HPE2 en 2p21, pero los genes responsables no han sido aislados todavía.

Síndrome de Rieger Se caracteriza por la existencia de displasia del iris, hipodontia, atrofia óptica y déficit de GH ocasional (39). Se hereda de modo autosómico dominante con expresión variable. Se trata de un síndrome heterogéneo en el que se han descrito al menos dos genes implicados: RIEG1 (4q25-q26) (40) y RIEG2 (13q14) (41).

Displasia septo-óptica o síndrome de Morsier Cursa con hipoplasia del nervio óptico acompañada o no de anomalías del septum pellucidum y del cuerpo calloso. El grado de insuficiencia hipofisaria varía desde un déficit aislado de GH hasta situaciones de panhipopituitarismo. La diabetes insípida suele estar presente en más de la mitad de los casos. La alteración parece radicar en el hipotálamo. Se trata de una entidad casi siempre esporádica, aunque algunos casos sugieren una herencia monogénica autosómica recesiva. Recientemente, se han implicado mutaciones en el gen HESX1 como causantes de algunos casos de displasia septo-óptica (42).

Síndrome de ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino También denominado síndrome EEC. Se ha demostrado herencia tanto autosómica dominante [EEC1 (7q11.2-q21.3)] como autosómica recesiva [EEC2] (43,44). El cuadro clínico queda definido por el nombre del síndrome, a lo que se asocia déficit de GH con ausencia del septum pellucidum en algunos casos.

Anemia de Fanconi Entidad nosológica que se hereda de un modo autosómico recesivo y se caracteriza por anemia, leucopenia, trombocitopenia, talla baja, hiperpigmentación cutánea, anomalías del pulgar, malformaciones cardíacas y renales y, ocasionalmente, déficit de GH. Se distinguen ocho grupos bien diferenciados por estudio de com-

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plementación celular (A-H) (45), cada grupo probablemente debido a una anomalía genética específica (46). Se han identificado los genes mutados en los grupos A, C y G (47-49). El gen del grupo D (FANCD) se localiza en el cromosoma 3 (3p22-26) (50).

Síndrome de Bloom Se trata de una anomalía que se hereda con patrón mendeliano autosómico recesivo que cursa con exantema facial teleangiectásico, hipersensibilidad lumínica con piel hipo e hiperpigmentada y predisposición al padecimiento de procesos malignos. El gen responsable se ha aislado por clonación posicional desde el brazo largo del cromosoma 15 (15q26.1) (51), aunque se desconoce el mecanismo por el cual puede aparecer déficit de GH.

Síndrome de Aarskog Talla baja, hipertelorismo y anomalías del escroto caracterizan a este síndrome, habiéndose demostrado un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X. El cuadro está causado por mutaciones en el gen FGD1, que codifica una proteína implicada en transducción de señales importantes para el crecimiento durante el desarrollo (52).

II. Hipocrecimiento por resistencia genética a la hormona de crecimiento En 1966 Laron et al. publicaron los casos de tres hermanos con elementos clínicos y bioquímicos de deficiencia de hormona de crecimiento (GH), pero en los que se detectaban niveles extremadamente elevados de GH (53). En los dos años siguientes, los mismos autores diagnosticaron 22 pacientes similares de descendientes de judíos orientales (54). El diagnóstico de resistencia a la hormona de crecimiento se efectuó tanto por los niveles elevados de GH como por la incapacidad de la hormona de crecimiento administrada exógenamente para incrementar los niveles plasmáticos de factor de IGF-I. (55,56). En 1984 se demostró que esta enfermedad es debida a la existencia de una anomalía en el receptor de GH que conduce a un síndrome de resistencia a esta hormona (57). La clonación (58) y caracterización (59) del gen de rGH y la introducción de nuevas técnicas de biología molecular, han proporcionado la identificación de una serie de defectos moleculares en dicho receptor de GH. El consenso internacional sobre la nomenclatura a emplear, así como los criterios taxonómicos del síndrome de insensibilidad o resistencia a la GH, se efectuó en 1993 (60). Los nombres más comúnmente empleados en la actualidad son los de síndrome de Laron, síndrome de resistencia primaria a la GH o síndrome de insensi-

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bilidad primaria a la GH, diferenciándolo, de este modo, de los síndromes de resistencia secundaria a la GH. Hasta la fecha, se han diagnosticado varios cientos de pacientes. Los análisis genéticos demuestran la existencia de un modo de herencia autosómico recesivo (61). Un listado más detallado puede obtenerse a partir de una revisión reciente de este síndrome (62). Los niños pequeños se asemejan a los afectos de deficiencia aislada hereditaria de GH; poseen cabello ralo y la cabeza parece grande debido a la falta de desarrollo de los huesos faciales, así como a la acromicria. No obstante, el perímetro craneal se encuentra por debajo del tamaño normal (63). Todo ello proporciona la apariencia típica de frente prominente, nariz en «silla de montar» y mirada en «puesta de sol». Si no reciben tratamiento, como ocurre en la mayoría de los pacientes con síndrome de Laron, la talla adulta se sitúa entre 119 y 142 cm en varones y entre 108 y 136 cm en mujeres (64). El gen del rGH localiza en el brazo corto del cromosoma 5 (p13-p12) (65). Está compuesto de 620 aminoácidos, una secuencia señal de 18 aminoácidos, y conformado por 9 exones, con una extensión de 87 Kb. Los exones 2 a 7 codifican el dominio extracelular de 246 aminoácidos. El exón 8 corresponde al dominio transmembrana, conformado por 24 aminoácidos. Finalmente, los exones 9 y 10 corresponden al dominio intracelular, quedando conformado por 350 aminoácidos. La forma clásica de resistencia a la GH tipo 1a es debida a la existencia de mutaciones del rGH. Hasta la fecha, se han descrito una amplia variedad de ellas: sin sentido, error de lectura, y de empalme, afectando tanto a exones como a intrones (66-74). La mayoría de las anomalías se localizan en el dominio extracelular del receptor (exones 3-7 e intrones 2-7), dando lugar a la ausencia de niveles circulantes de GHBP (75,76). Solamente se han descrito dos publicaciones con anomalías en el dominio transmembrana (exón 8) (71,72), y otras dos mutaciones en el dominio intracelular (exón 10) (74). Se han descrito tres hermanos con una anomalía post-receptor, aún no bien definida (76). La demostración de niveles séricos bajos de GHBP en los parientes de pacientes con síndrome de Laron ayuda a identificar los portadores heterocigotos por anomalías en el dominio extracelular del rGH (77,78). Por el contrario, la existencia de niveles séricos de GHBP normales o elevados en pacientes con síndrome de Laron implica la existencia de una anomalía, ya en el dominio transmembrana, ya en el dominio intracelular, ya post-receptor de GH (síndrome de Laron tipo b o c).

Anomalías Post-receptor de GH La primera familia descrita con esta anomalía se comunicó en 1993. El test de estimulación de IGF-I no produjo respuesta de IGF-I, aunque produjo una elevación

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de IGFBP-3, (76) demostrando que la última vía está intacta. La naturaleza de esta anomalía no se ha dilucidado todavía.

Deleción del gen de IGF-I Recientemente, Woods et al. (79) describieron un varón, hijo de progenitores consanguíneos, con talla baja extrema, en el que se demostró la existencia de una deleción homocigota de los exones 4 y 5 del gen de IGF-I. El paciente mostraba: marcado retraso del crecimiento, perímetro craneal pequeño, acromicria, hipogonadismo, retraso del desarrollo motor, hipoglucemia en la infancia, niveles séricos elevados de GH (94 mg/mL) y bajos de IGF-I, que no se incrementaron tras la administración de hormona de crecimiento humana.

Pigmeos Los pigmeos parecen tener una disminución en el número de receptores de GH, lo que podría constituir la anomalía primaria. En una revisión reciente, Merimee y Laron (80) afirman que la talla baja de los pigmeos africanos es debida primariamente, quizás exclusivamente, a una deficiencia de IGF-I por deficiencia del rGH. Dado que los pacientes con síndrome de Laron son más bajos que los pigmeos y sus niveles de IGF-I también más bajos, los pigmeos podrían tener una anomalía genética diferente, probablemente menos completa. El conjunto de las alteraciones metabólicas reflejan una disminución en receptores de hormona de crecimiento, incluyendo una disminución de los niveles séricos de GHBP, lo que indica la posibilidad de una anomalía en el dominio externo del receptor de GH.

Resistencia a IGF-I Existen muy pocas referencias sobre tallas bajas que puedan enmarcarse en esta categoría. En el caso clínico comunicado por Bierich (81) de un niño con un retraso severo de crecimiento y niveles elevados de IGF-I y, el de Momoi et al. (82), en una niña con hallazgos similares, no se ha podido demostrar una base molecular.

III. Hipocrecimiento por anomalías en genes de los gonosomas Se conocen al menos ocho genes localizados en la región pseudoautosómica (PAR) del brazo corto de los cromosomas X e Y (83,84). La PAR del brazo corto (PAR1) está conformada por 2.500 kb de longitud. Las PAR de los cromosomas X e Y presentan una homología del 99 %. La asociación de talla baja y deleciones tanto del brazo corto del cromosoma X, como del brazo corto del cromosoma Y,

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sugiere la presencia de un gen para la talla en los 700 kb distales de PAR1, ya que los pacientes con una única copia de esta región presentan talla baja. Se ha clonado un gen desde un segmento crítico de 170 kb de PAR1, que se ha denominado SHOX (short stature homeobox-containing gene). Dicho gen codifica proteínas de 292 y 225 aminoácidos y se ha encontrado delecionado al menos en 36 pacientes con talla baja y reorganizaciones en el Xp22 o en el Yp11.3. Entre 91 pacientes con talla baja idiopática sin otras complicaciones, Rao et al. (85) sólo encontraron uno con una mutación sin sentido en el gen SHOX, detectando, asimismo, una mutación similar en otros cuatro miembros de la familia, en tres generaciones, afectos de talla baja. La causa de la talla baja en las pacientes con síndrome de Turner puede ser explicada, al menos en parte, por la pérdida del gen SHOX, debida a la ausencia de un cromosoma X. Además, los casos con talla baja y deleción del brazo largo del cromosoma Y (46, XYq-) apoyan la hipótesis de la presencia de uno o más genes de crecimiento en el brazo largo del cromosoma Y. En efecto, mediante la realización de estudios genéticos de pacientes varones con deleciones parciales del Yq, una región cuya presencia o ausencia tiene un marcado efecto sobre la talla, se ha logrado cartografiar por diferentes investigadores en la porción proximal del brazo largo del cromosoma Y, cercana al centrómero, un gen que se denomina «Control de Crecimiento en el cromosoma Y», Growth Control in the Y, (GCY) o gen específico del crecimiento en el cromosoma Y (86-88), habiéndose empleado marcadores con secuencias específicas para el cromosoma Y completo, capaces de definir la lesión del punto de ruptura. Los estudios moleculares en una translocación cromosómica X; Y [46, X, der(X)t(X;Y) (p22.3; q11.2)] en una mujer con deleción de la región pseudoautosómica (Xp22.3) que presentaba una talla normal, sugieren que el gen específico de crecimiento del cromosoma Y (CGY) en el Yq puede compensar el gen SHOX de crecimiento perdido (89). Se presume que puedan existir más genes que intervengan en la regulación del crecimiento humano en los gonosomas, por lo que es menester que las investigaciones en esta línea continúen desarrollándose.

IV. Hipocrecimiento de origen prenatal El enanismo primordial constituye un retraso de crecimiento de origen prenatal que continúa en el periodo postnatal y que se subdivide en dos grandes grupos, según se asocie o no a microcefalia. Una forma específica de enanismo primordial no microcefálico es el síndrome de Russell-Silver, que asocia unos rasgos craniofaciales típicos con facies triangular, orejas prominentes, posibilidad de asimetría en miembros y clinodactilia del quinto dedo de las manos. La causa de este cuadro es probablemente heterogénea y quizá la mayoría de los casos se deben a mutaciones dominantes de novo. Se ha sugerido la posible implicación en el fenotipo de un

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locus en 17q25 basado en alteraciones cromosómicas recurrentes (90). Sin embargo, la primera pista sobre una de las posibles bases moleculares reales de estos cuadros fue la observación de disomía uniparental materna del cromosoma 7 en un individuo homocigoto para una mutación causante de fibrosis quística siendo sólo la madre portadora (91). Este paciente, al igual que otros descritos posteriormente, presentaba retraso de crecimiento intrauterino y postnatal no justificable por su fibrosis quística. Posteriormente, se detectó la existencia de disomía uniparental materna del cromosoma 7 en el 10 % de los pacientes con enanismo primordial del tipo del síndrome de Russell-Silver (92). Por consiguiente, los resultados indicaban la existencia de uno o varios genes en el cromosoma 7 reguladores del crecimiento y sometidos a impronta gamética, bien genes potenciadores del crecimiento que se expresen sólo desde el cromosoma de origen materno, o bien genes represores del crecimiento que se expresen sólo desde el cromosoma paterno. El hallazgo de un caso familiar de síndrome de Russell-Silver (madre e hija) con una duplicación en tándem de la región 7p13-p11.2, permitió definir el intervalo crítico del cromosoma 7 a una región que contiene los genes IGFBP1, IGFBP3 y GRB10 (growth factor receptor-binding protein 10) (93). Posteriormente, se ha encontrado una duplicación similar en un paciente, cuya caracterización molecular ha demostrado la inclusión de los genes citados y el origen materno de la región duplicada (94). Por tanto, parece que el retraso de crecimiento que se produce en estos cuadros se debe probablemente a la existencia de uno o varios genes represores del crecimiento que se expresan exclusivamente desde el cromosoma materno en condiciones normales y cuya expresión se encuentra aumentada en casos de disomía uniparental materna o de duplicaciones maternas de la región. El gen GRB10 es un candidato óptimo dado que se encuentra en el intervalo crítico de las citadas duplicaciones y que el ortólogo de ratón (gen Meg1/Grb10, localizado en el cromosoma 11) tiene expresión exclusiva desde el cromosoma materno y está probablemente implicado en los defectos de crecimiento que se observan en los ratones con duplicaciones del cromosoma 11 y deficiencia recíproca (95). La función de la proteína GRB10 también es sugerente, dado que se une al receptor de insulina y al receptor de IGF-I (IGF1R) a través de un dominio con homología a Src (SH2), e inhibe la actividad tirosín-quinasa asociada al receptor, actividad que está implicada en las acciones promotoras del crecimiento de la insulina, IGF-I e IGF-II. (96)

Consideraciones finales En resumen, en las últimas dos décadas hemos asistido a la identificación, caracterización y secuenciación de múltiples genes, localizados tanto en los autosomas como en los gonosomas, involucrados en la regulación del crecimiento humano. Asimismo, se han identificado mutaciones en muchos de ellos que conducen a la producción de patología del crecimiento por defecto o por exceso. El hipocrecimiento armónico de base genética puede ser debido a una deficiencia de GH, aislada o combinada, a una resistencia a la acción de la misma, a una

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anomalía del gen de IGF-I y, tal vez, a una resistencia a la acción de éste; conduciendo, en cualquier caso a una deficiencia en IGF-I y, por ende, a una talla baja. Existen además genes reguladores del crecimiento que son dependientes de dosis y presentan sistemas de control epigenéticos del tipo de impronta gamética. La alteración de estos genes se asocia con trastornos del crecimiento de origen prenatal. Por último, se han identificado genes relacionados con el crecimiento en los gonosomas, aunque todavía se requiere más investigación. En conclusión, la patología del crecimiento humano por defecto incluye numerosas enfermedades cuya base molecular es conocida en la actualidad, y es de esperar que la lista vaya aumentando en los próximos años. El clínico debe aproximarse a su conocimiento para un mejor diagnóstico y consejo genético apropiados. Bibliografía 1. Phillips III JA. Inherited defects in growth hormone synthesis and action. En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, (eds.) The metabolic basis of inherited disease. 6.a ed. New York: McGraw-Hill; 1989; 1965-1983. 2. Chen EY, Liao YC, Smith DH, Barrera-Saldana HA, Gelinas RE, Seeburg PH. The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomics 1989; 4: 479-497. 3. Hirt H, Kimelman J, Birnbaum MJ, Chen EY, Seeburg PH, Eberhardt NL et al. The human growth hormone gene locus: Structure, evolution and allelic variations. DNA 1987; 6: 59-70. 4. Pezzolo A, Gimelli G, Sposito M, Giussani U, Rossi E y Suffardi O. Definitive assignment of the growth hormone releasing factor gene to 20q11.2. Hum Genet 1994; 93: 213-214. 5. Mayo KE. Structure and expression of growth hormone-releasing hormone (GHRH) genes. En: Müller EE, Cocchi D, Locatelli V, (eds.) Advances in growth hormone and growth factor research. Roma-Milano y Berlín-Heilderberg, Springer-Verlag, Pythagora Press, 1989; 217-230. 6. Pérez Jurado LA, Phillips III JA, Francke U. Exclusion of growth hormone-releasing hormone gene mutations in familial isolated growth hormone deficiency by linkage and single strand conformation analysis. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78: 622-628. 7. Naylor SLA, Sakaguchi AY, Shen L, Bell GL, Rutter WJ y Shows TB. Polymorphic human somatostatin gen is located on chromosome 3. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 2686-2689. 8. Benoit R, Esch F, Benneth HPJ et al. Processing of prosomatostatin. Metabolism 1990; 39 (supl 2): 22-25. 9. Mayo KE. Molecular cloning and expression of a pituitary-specific receptor for the growth hormone-releasing hormone. Mol Endocrinol 1992; 6: 1733-1744. 10. Gaylinn BD, von Kap-Herr C, Golden W, Thorner MO. Assignment of the human growth hormone-releasing hormone receptor gene (GHRHR) to 7p14 by in situ hybridization. Genomics 1994;19: 193-195. 11. Lin SC, Lin CR, Gukovsky I, Lusis AJ, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. Molecular basis of the little mouse phenotype and implications for cell type-specific growth. Nature 1993; 364: 208-213.

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18 Patología molecular de la hiperplasia suprarrenal congénita B. Ezquieta, E. Cueva, F. J. Fernández, J.M. Varela, y C. Jariego

Introducción El término Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) engloba todos aquellos déficit enzimáticos de carácter hereditario que dan lugar a una disminución en la síntesis del cortisol y a la consiguiente estimulación del eje hipotálamo-hipófisissuprarrenal. Se han descrito cuadros clínicos por la deficiencia de los enzimas implicados: 3`hidroxiesteroide deshidrogenasa, 17_hidroxilasa, 21-hidroxilasa (21-OH) y 11`hidroxilasa, siendo todos ellos de carácter autosómico recesivo; reconociéndose, al menos a escala bioquímica, tanto formas neonatales como formas no clásicas o tardías de cada una de estas deficiencias. Los distintos pasos metabólicos de la síntesis del cortisol tienen lugar en distintos compartimentos celulares (mitocondria, citoplasma, microsomas); siendo debida la hiperplasia lipoide al déficit hereditario de la proteína de transporte requerida para dicho cambio de compartimento (proteína StAR). Las bases moleculares de las formas severas, neonatales, de HSC se conocen para cada uno de los déficit, conociéndose la localización, estructura y mutaciones de los genes implicados en cada uno de ellos (1). Este estudio está centrado en el análisis genético molecular de la deficiencia de esteroide 21-hidroxilasa, por ser la causa mayoritaria de HSC (90-95 % de los casos; para una revisión reciente del tema, véase White y Speiser 2000) (2). La deficiencia de 21-OH es una enfermedad monogénica autosómica recesiva. Se debe a mutaciones en un solo gen, el gen de la esteroide 21-hidroxilasa, y ello, tanto en sus formas severas como tardías. Las enfermedades con este patrón de herencia suelen presentar una misma alteración en los dos alelos mutados (los pacientes son homocigotos), y ello ocurre generalmente por consanguinidad. A diferencia de estas otras enfermedades, en la deficiencia de 21-OH, los enfermos frecuentemente son «heterocigotos compuestos». Sólo en el caso de mutaciones frecuentes, y por supuesto, en el caso de consanguinidad, los enfermos son

264

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

homocigotos. Los portadores de esta deficiencia presentan un solo cromosoma mutado y, en principio, no manifiestan signos clínicos, aunque sí una respuesta elevada del metabolito marcador de esta deficiencia, 17-hidroxiprogesterona, en el test de Synachten. En ocasiones se ha descrito la presencia de signos clínicos de hiperandrogenismo en niños portadores, definidos tanto a nivel molecular como bioquímico (1,3). La incidencia de las formas clásicas es de aproximadamente 1:10.000 a 1:15.000, lo que supone una elevada frecuencia de portadores (1:50 a 1:60) con variaciones significativas según las zonas geográficas (2,4,5). Las formas tardías se presentan con una frecuencia de 1:1.000 (frecuencia de portadores 1:15). Aunque, sobre la base de datos hormonales, se han estimado incidencias superiores, del 1% en el área Mediterránea (4,6,7), e incluso de 1/40 y 1/50 en zonas de la antigua Yugoslavia, Italia y España; estos datos podrían estar magnificados, como está poniéndose de manifiesto al disponer de los datos moleculares. De cualquier manera, las formas tardías de 21OHD constituyen una de las enfermedades autosómicas recesivas más frecuentes en humanos. Es especialmente llamativo el hecho de que, incluso las formas severas que pueden comprometer la vida, y con ello autolimitar la diseminación de estos alelos, sean tan frecuentes. Ello podría ser debido al peculiar mecanismo de producción de las mutaciones que existe en este gen por la existencia de un pseudogén; y/o a una posible ventaja de los heterocigotos portadores, como recientemente se está volviendo a plantear (8,9). El gen responsable del déficit se denomina CYP21B y se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 6, en la región III del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA, Fig. 18.1. A). Muy próximo a él se encuentra su pseudogén (o gen no funcional), CYP21A, que tiene una homología del 96 % (Fig. 18.1. B). Este pseudogén presenta una serie de mutaciones que impiden su expresión y/o su funcionalidad. Los genes CYP21B y CYP21A se encuentran muy próximos uno del otro, a una distancia de 30 kb (kb: 1.000 pares de bases) y dispuestos en tándem con los genes C4A y C4B (Fig. 18.1. B) que codifican para el cuarto componente del complemento y también presentan una homología importante (2,6,10). El gen CYP21B tiene 3,2 kb, está constituido por 10 exones y da lugar a un mRNA de aproximadamente 2 kb. La proteína tiene 500 aminoácidos y contiene como grupo prostético el grupo HEM. Es una monooxigenasa de esteroides en posición 21, de localización microsomal. Son dominios importantes para su funcionalidad, la región de anclaje a la membrana del microsoma y la región de centro activo donde se unen los sustratos, 17OHP y progesterona (Fig. 18.2). CYP21B se expresa en el tejido suprarrenal dando lugar al enzima específico. También se ha detectado su expresión en linfocitos (Zhou et al. 1997), así como una actividad 21 hidroxilante inespecífica, que podría parcialmente compensar la deficiencia suprarrenal severa en el adulto. La gran mayoría de las mutaciones que causan deficiencia de este enzima son el resultado de dos tipos de mecanismo: la recombinación asimétrica en la meiosis, que se ve favorecida por la región duplicada de 30 kb existente en el locus de la 21OH, que origina deleciones (Fig. 18.3. A); y la conversión génica que introduce en

PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA HIPERPLASIA SUPRARRENAL…

A

265

Brazo corto del cromosoma 6 Locus HLA

A

C

Clase I B

B

CYP 21 B

DR

DQ

Clase III

DP

Clase II

Gen de la 21-Hidroxilasa 30 kb

C4 A

CYP 21 A Pseudogén

C4 B

CYP 21 B Gen funcional

esteroide 21-hidroxilasa

Figura 18.1. (A) Esquema del cromosoma 6 de humanos, en que se indica la localización del gen de la esteroide 21-hidroxilasa en el locus HLA. Nótese que B y DR son los antígenos HLA más próximos por lo que su informatividad ha sido de utilidad en el seguimiento del gen 21-OH. (B) Esquema del locus de la 21-OH; CYP21B es el gen funcional, CYP21A en humanos es un pseudogén (homólogo al gen funcional pero incluye mutaciones en su secuencia que lo hacen «no funcional»). Las flechas bajo los correspondientes genes indican la dirección de expresión, véase que en el caso de C4 (factor 4 del complemento) ambos genes se expresan, aunque la proteína tiene distintas propiedades hemolíticas y antigénicas.

el gen funcional mutaciones puntuales (Fig. 18.3. B), por transferencia de las mismas desde el pseudogén. El mecanismo de la conversión génica, que no está completamente establecido, fue descrito en levaduras en sistemas que requieren diversificación, como las proteínas de apareamiento. Los datos existentes en humanos sobre este mecanismo han sido aportados por el propio gen de la 21-OH. Estas mutaciones puntuales se denominan microconversiones para diferenciarlas de las conversiones grandes que involucran a varios exones o a la totalidad del gen. La recombinación asimétrica y la manera en que se generan las deleciones y duplicaciones están esquematizadas en la Figura 18.3. A. Las deleciones y duplicaciones del pseudogén mantienen un gen funcional por lo que, per se, no son las alteraciones responsables del déficit. En algún caso una determinada mutación puntual,

266

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

17-OHP NADP

+

NADPH e-

P450reduc

Arg356Trp 11-Deoxicortisol Triple mut ex 6

Pro453Ser P450c21 Val281leu e1le172Asn HEM Pro30Leu Deleción Conversión 655 AoC-G Gln318Stop 306insT Deleción 8pb Mutaciones que dan lugar a ausencia de la proteína

NADP+

b5

NADPH

Centro activo y/o interacción con reductasa Unión de grupo prostético (HEM) Anclaje a la membrana Dominios de la proteína cuyos aminoácidos mutados dan lugar a pérdida de la funcionalidad

Figura 18.2. Esquema de la proteína esteroide 21-hidroxilasa ubicada en la membrana microsomal junto a sus enzimas auxiliares. Sobre la proteína se indican las mutaciones localizadas en los dominios cuya funcionalidad afecta esencialmente a la actividad enzimática. En el recuadro externo se recogen las mutaciones que darían lugar a una carencia de la proteína.

Val281Leu, se asocia a la duplicación de CYP21A. Las tradicionalmente denominadas «deleciones del gen 21-OH» corresponden con un híbrido pseudogén-gen no funcional que es el resultado de una recombinación intragénica. Las deleciones y conversiones grandes dan cuenta de aproximadamente un 25-30 % de los alelos mutados (11,12,13). Cuando el mecanismo de conversión génica actúa sobre una región limitada de la secuencia del gen funcional el cambio introducido en el gen funcional se comporta como una aparente mutación puntual. La aplicación de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite el estudio de estos alelos que presentan mutaciones puntuales, y que constituyen un elevado porcentaje de los alelos mutados, 70-90% en las formas severas y tardías respectivamente. En la Figura 18.3. B se recoge el esquema de la estructura del gen con sus diez exones o zonas codificantes, y regiones intrónicas o no codificantes. En él se indican las 10 mutaciones descritas en el pseudogén, que cuando son transferidas a CYP21B lo inactivan. Todas ellas se encuentran en la región codificante excepto la mutación 655 A o C –G que se localiza en el intrón 2 y afecta al procesamiento del RNA mensajero, que como veremos es la mutación más frecuente en las formas severas. Las mutaciones específicas en el gen dan lugar a una pérdida de la actividad enzimática de la esteroide 21-OH más o menos severa, que según su grado se

PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA HIPERPLASIA SUPRARRENAL…

267

A Generación de deleciones y duplicaciones de CYP21B y A C4A

CYP21A

C4B

CYP21B

C4A

CYP21A

C4B

CYP21B

2

1 Puntos de recombinación

1

C4A

CYP21A

C4B

C4A CYP21A Duplicación del pseudogén C4B

CYP21B

CYP21B

Deleción del pseudogén-gen 2 C4A

21A-21B

Híbrido pseudogén-gen denominado clásicamente deleción del gen 21-OH

B Microconversiones de CYP21B Exones I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

3 1

2

Pro30Leu

655G

4

mutación de procesamiento 1le172Asn 5 Mutaciones severas Mutaciones leves

10

7 8 306insT Stop318 6

Del8pb

Val281Leu

Pro453Ser 9

Arg356Trp Ile236Asn/Val237Glu/Met239Lys

Figura 18.3. (A) Esquema de la recombinación asimétrica y de las duplicaciones y deleciones del gen. Los puntos 1 y 2 son los puntos de recombinación que dan lugar a estas entidades. La recombinación por delante de C4A (punto 1) da lugar a las deleciones y duplicaciones del pseudogén, que mantienen en su estructura un gen funcional. La recombinación intragénica (punto 2) da lugar a un híbrido pseudogén-gen no funcional. (B) Esquema del gen 21-OH con sus diez exones o zonas codificantes y regiones intrónicas. Se indican las mutaciones puntuales que existen el pseudogén de la 21-OH y por conversión génica pueden transferirse a CYP21B haciéndolo no funcional. Las mutaciones subrayadas dan lugar a una afectación moderada de la actividad enzimática y se asocian con formas leves o tardías de la deficiencia. El resto de mutaciones afectan de forma severa a la enzima y se encuentran primordialmente en formas clásicas de 21-OHD (ver correlación genotipo-fenotipo).

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puede correlacionar con las distintas formas clínicas (11,12,13), como se comentará más adelante al discutir las relaciones genotipo-fenotipo. De cualquier manera, también se han descrito, mediante secuenciación (véase revisión White y Speiser 2000 (2)), otras mutaciones del gen no atribuibles a los mecanismos indicados. El planteamiento molecular aplicado al tratamiento de la Hiperplasia Suprarrenal Congénita es todavía muy limitado en lo que se refiere a la terapia génica. A nivel experimental, se ha conseguido rescatar mediante transgénesis de CYP21B humana a ratones deficientes en 21-hidroxilasa (14). Por el momento existen dificultades importantes para este tipo de abordaje, derivadas de la necesidad de mantener un nivel elevado de funcionalidad en el tejido específico para suprimir los andrógenos ya que los resultados obtenidos han requerido inoculación intrasuprarrenal y la actividad se ha mantenido únicamente siete días. La terapia sustitutiva es efectiva y económica y se han centrado esfuerzos en conseguir definir nuevos abordajes farmacológicos combinando el bloqueo del receptor de andrógenos y la inhibición de la aromatasa con niveles reducidos de glucocorticoides (15). El tratamiento prenatal de la HSC sí se ha visto beneficiado muy directamente por la aportación del diagnóstico molecular. El tratamiento prenatal persigue frenar la suprarrenal fetal mediante dexametasona administrada a la madre para evitar la virilización de las niñas afectas. La efectividad del tratamiento, debidamente iniciado, dosificado y pautado, fue descrita por Forest et al (16) y recientemente confirmada (17); Speiser et al. (18) señalan la utilidad del diagnóstico molecular en la definición de la situación de enfermo, sano ó portador del feto a riesgo. Si bien parece ser importante el tratar los embarazos a riesgo, también es importante no mantener un tratamiento que no es necesario, y en ambos aspectos es el análisis molecular el que nos permitirá definir tanto los portadores de mutaciones severas como la situación de afecto-sano-portador del feto. En este estudio se presentan los resultados del análisis del gen de la 21-hidroxilasa en población española y se analizan las relaciones genotipo-fenotipo. El análisis se plantea en formas severas y tardías de la deficiencia tanto en estudios de tipo familiar como en diagnósticos prenatales, discutiéndose las aportaciones del abordaje molecular al estudio de estos pacientes.

Pacientes y métodos Sujetos Trescientas quince familias (367 pacientes, 923 individuos) con al menos un caso afecto de deficiencia de 21-OH de las distintas formas clínicas (109 pierde-sal PS, 26 virilizantes simples VS y 180 no clásicas o tardías NC) procedentes de distintas Comunidades (Andalucía, Cataluña, País Vasco, Navarra, Valencia, Castilla León, Castilla La Mancha, Murcia, Asturias, Extremadura, Aragón) del ámbito nacional. También hemos estudiado 60 casos de pacientes con hiperandrogenismo y 17OH progesterona (17OHP) en test de Synachten en el rango de portadores del

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déficit de 21-OH (7), que se discuten brevemente en el apartado relativo a las aportaciones del análisis molecular. En 23 familias se realizó estudio de muestra prenatal, 11 muestras de vellosidad coriónica y 12 de líquido amniótico.

Métodos Análisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa Las deleciones del gen se estudian mediante la técnica de Southern (13). El polimorfismo que gen y pseudogén presentan para determinados enzimas de restricción (Taq I, Bgl II, Kpn I, entre otros) permite estimar la intensidad relativa (mediante densitometría) de los fragmentos generados cuando el ADN genómico de cada paciente es tratado con estos enzimas. En esta técnica, los fragmentos de ADN se separan en una electroforesis según su tamaño molecular y son transferidos, tras ser desnaturalizados, a un soporte (membrana de nailon) que nos permite su revelado con la sonda específica del gen, en este caso pC21/3c marcada radiactivamente. El empleo de varios enzimas de restricción permite excluir la posibilidad de interpretar incorrectamente como deleciones, patrones que podrían ser debidos a una conversión de una zona que incluyera los sitios de restricción analizados. El estudio de las microconversiones o mutaciones puntuales se hizo mediante PCR e hibridación específica de alelo (13,19). La amplificación específica del gen se realizó utilizando como zonas de especificidad el exón 3, que tiene una deleción de 8 pares de bases, y el exón 6 que tiene una triple mutación (ambas en el pseudogén CYP21A). El gen completo se amplifica en fragmentos solapantes que son desnaturalizados y fijados sobre membranas de nailon. De esta manera, en forma paralela, se estudian sobre estas membranas las distintas mutaciones mediante hibridación específica de alelo (ASO). En esta técnica se utilizan pequeñas sondas u oligonucleótidos marcados específicos de las secuencias normal y mutada que hibridarán específicamente con las secuencias correspondientes. El análisis de los alelos no caracterizados mediante el cribado de las mutaciones más frecuentes se hizo mediante una técnica de screening basada en el polimorfismo que presenta la cadena sencilla de ADN a la presencia de cambios puntuales y posterior secuenciación (20).

Análisis indirecto de CYP21B mediante microsatélites en la región HLA La ubicación del gen 21OH en el locus HLA (Fig. 18.2. A) hace que su haplotipaje sea de utilidad en el análisis indirecto de esta enfermedad. Aparte de los problemas de recombinación y mutaciones de novo, estos marcadores presentaban algunos inconvenientes, especialmente en el caso de muestras prenatales (21), como la frecuente homocigosidad de B, la falta de expresión de DR en amniocitos, y el requerimiento de análisis mediante Southern para A y B, técnica que exige cantida-

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des grandes de ADN de calidad o pureza elevada). Ello llevó a que se planteara en este estudio la utilización de nuevos marcadores, planteamiento que se recoge en el estudio de Ezquieta et al (22). La amplificación de la región que incluye el microsatélite se hace utilizando oligonucleótidos cebadores marcados radiactivamente ó con fluorescencia, y su posterior resolución se realiza mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes en acrilamida o mediante electroforesis capilar utilizando el secuenciador automático ABI prism 310 (20).

Resultados y discusión Análisis del gen de 21-OH en población española El análisis directo del gen de la 21-OH mediante Southern y PCR-ASO nos ha permitido la caracterización de una gran mayoría de los alelos mutados (93%, 236/ 265 cromosomas de formas clásicas y 84 %, 302/360 cromosomas de formas no clásicas). La distribución de mutaciones se muestra en la Tabla 18.1. Hemos estudiado de formas separada las formas clásicas y tardías, ya que las mutaciones no se distribuyen por igual en dichos grupos, y el porcentaje de las distintas mutaciones dentro de una serie global se ve muy influenciado por el número de pacientes de cada una de las formas que se incluyan. La mutación más frecuente en formas severas es el cambio 655 A ó C en el alelo normal por G (30%) en el intrón 2 originando un sitio de procesamiento incorrecto en el ARNm); hecho también descrito en otras poblaciones de distintas razas. Algunos alelos que han presentado esta mutación han mostrado, de forma adicional, una segunda mutación (13) (doble microconversión), Val281Leu o Pro453Ser. Este hecho pone de manifiesto la importancia de establecer la segregación de alelos cuando se analiza el gen de la 21-OH a la hora definir Tabla 18.1. española

Frecuencia y distribución de las mutaciones del gen 21-OH en población Formas clásicas 265 alelos

Formas tardías 360 alelos

Deleciones Conversiones

15% 15%

5%

intrón 2G del8pb Ile172Asn Exón6 (3x) 306 insT Gln318Stop Arg356Trp

30% 3% 5% 0,8% 3% 14% 4%

5% 1% 2% 0% 0,8% 4% 2%

Pro30Leu Val281Leu Pro453Ser

1% 2,6% 0%

3% 60% 4%

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las mutaciones existentes en un determinado individuo. Ello tiene también trascendencia al estimar el porcentaje de cromosomas caracterizados, se trataría de dos mutaciones pero de un solo cromosoma caracterizado; y al pretender establecer correlación genotipo-fenotipo, en la que sólo pueden valorarse aquellos pacientes con dos alelos caracterizados, no dos mutaciones caracterizadas que podrían estar en el mismo alelo. Estas consideraciones han de aplicarse también a los cromosomas que presentan conversiones que incluyen varios exones del gen y por ello dan resultado positivo para varias mutaciones. Las deleciones y conversiones grandes dieron cuenta, en conjunto, de un 30% de los alelos severos. El resto de mutaciones severas, excepto la mutación Gln318Stop (14 %), resultaron ya menos frecuentes (0,8 al 4 %). Comparativamente con otras poblaciones, la distribución de mutaciones en población española no es distinta salvo en la mutación mencionada, que en otras poblaciones se presenta en el 4 % de los alelos. Determinadas áreas de nuestra geografía han mostrado esta mutación con elevada frecuencia (9). Otra de las mutaciones severas, aunque mucho más infrecuente, 306insT, fue documentada por primera vez por nuestro grupo en un paciente con una forma pierde-sal en heterocigosis con una deleción (13), y ha sido posteriormente detectada en otros pacientes. Estos pacientes, por otro lado, mostraron en el análisis indirecto idénticos marcadores polimórficos, sugiriendo un origen común y reciente de este alelo mutado en nuestra población. Todos estos pacientes procedían de Castilla La Mancha. Estas particularidades mencionadas, en las mutaciones Stop318 y 306insT en nuestra población, parecen poner de manifiesto la importancia del mecanismo de diseminación de mutaciones en este gen por un efecto fundador (9). Recientemente se ha vuelto a poner en relevancia la existencia del efecto fundador en la diseminación de las mutaciones de este gen y la posible ventaja en los heterocigotos portadores (8). La mutación más frecuente en formas tardías fue Val281Leu (60 %), al igual que en otras poblaciones. Esta mutación junto a las mutaciones Pro453Ser y Pro30Leu, constituye el grupo de alteraciones que producen una afectación moderada de la actividad enzimática (ver correlación genotipo-fenotipo). Como puede verse en la Tabla 18.1., las formas NC también mostraron mutaciones severas, en este caso en uno solo de los cromosomas; este hecho tiene trascendencia en cuanto al consejo genético en estas pacientes y será analizado más abajo. Las formas virilizantes simples, por constituir un grupo reducido en esta serie (26 pacientes), no se han separado para el estudio de frecuencias en formas clásicas y se han analizado junto a las formas pierde-sal. Queremos señalar que estos pacientes presentaron la mutación Ile172Asn con una frecuencia superior (25 % de los cromosomas, 50 % de los pacientes; ver a continuación correlación genotipo-fenotipo). El estudio de las mutaciones más frecuentes permite caracterizar la gran mayoría de los alelos mutados pero no su totalidad y ha de recurrirse a técnicas complementarias de análisis como el SSCP y la secuenciación (20). Este tipo de abordaje nos ha permitido caracterizar nuevos alelos mutados: 64insT, mutación severa de desplazamiento de la fase de lectura encontrada en homocigosis en un paciente con una forma pierde-sal en que aparentemente no existía consanguinidad y en el que el

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tipaje de microsatélites nos permitió documentar dicha consanguinidad; e His61Leu y Met283Val en pacientes con formas leves de la deficiencia en heterocigosis compuesta con mutaciones severas (23).

Correlación genotipo-fenotipo Los estudios de actividad enzimática de los alelos mutados se realizan in vitro. La mutación se introduce en el gen mediante mutagénesis dirigida, expresándose posteriormente y evaluando la actividad del enzima mutado frente a un control, que proviene de la expresión, también in vitro, del gen normal. De esta manera se ha definido como mutación severa del gen de la 21-OH, aquella que deja una actividad residual menor o igual que el 1%. Se incluyen también como mutaciones severas aquellas que, en homocigosis, se asocian invariablemente con formas pierde-sal. Son, por ello, mutaciones severas: las deleciones y conversiones grandes; las mutaciones que dan lugar a que aparezca un codón de parada, tanto porque el cambio de base genere un codón de parada (Gln318Stop), como porque suponga una inserción o deleción de base/s y el consiguiente desplazamiento de la fase de lectura con la aparición del «Stop» (deleción 8pb y 306insT); mutaciones de cambio de aminoácido que se ubican en el dominio de centro activo (Arg356Trp y triple mutación del exón 6); y la mutación que afecta al procesamiento del mRNA (655 A/C a G). La mutación de cambio de aminoácido, Ile172Asn, da lugar a un enzima con una actividad residual del 1-2 % y se asocia con formas virilizantes simples. Las mutaciones se consideran leves cuando el enzima mutado in vitro muestra una actividad igual o menor al 25 % y/o sus constantes enzimáticas se ven afectadas (velocidad máxima, especificidad de sustrato). Estas mutaciones son: Val281Leu, Pro30Leu y Pro453Ser. La mutación Arg339His es también una mutación leve aunque no se debe al mecanismo de microconversión y es más infrecuente. En la Figura 18.2., se esquematiza la esteroide 21-hidroxilasa con sus enzimas auxiliares en la membrana microsomal, indicando la ubicación de las mutaciones de cambio de aminoácido en los correspondientes dominios funcionales de la proteína: centro activo (triple mutación en exón 6 y Arg356Asn), unión a membrana (Ile172Asn y Pro30Leu) y unión de grupo prostético (Val281Leu y Pro453Ser). Para el estudio de la correlación genotipo-fenotipo los pacientes se agrupan según combinen en su genotipo dos mutaciones severas, una mutación leve y una severa o dos mutaciones leves (11,12,13). Según definió Speiser et al. (11) la afectación enzimática esperada de la combinación de dos mutaciones severas sería total (actividad nula), mientras que sería parcial cuando se combinaran dos mutaciones leves o una mutación leve y una severa. El estudio de correlación genotipo-fenotipo sólo puede hacerse sobre los pacientes completamente genotipados (mutaciones caracterizadas en ambos alelos paterno y materno). En nuestra serie son 260 los pacientes de los que se presenta este análisis (Tabla 18.2.). En conjunto, podemos afirmar que existe una fuerte, aunque no total, relación (248/260, el 95 % de los pacientes mostraron el fenotipo esperado). Todos los pacientes con dos mutaciones severas

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Tabla 18.2. Correlación genotipo-fenotipo para los 260 enfermos en que el estudio molecular permitió el genotipaje completo (caracterización de las mutaciones de ambos alelos) • Severa/Severa (112 pacientes)

112 formas severas (100%)

60 formas leves (90%) • Severa/Leve (67 pacientes) 7 formas severas (5 VS) 76 formas leves (94%) • Leve/Leve (81 pacientes) 5 formas crípticas 95% (248/260 correlación genotipo-fenotipo)

(112/112) mostraron formas clásicas. Los pacientes con dos mutaciones leves nunca mostraron una forma severa y la gran mayoría de ellos (76/81) mostraron una forma NC; los cinco pacientes restantes presentaron una forma críptica. Las formas crípticas sí manifiestan bioquímicamente la deficiencia, tanto su 17OHP basal como tras estímulo con ACTH es alta; la falta de relación estaría, no entre los hallazgos moleculares y el déficit enzimático, sino entre el grado de déficit enzimático y el hiperandrogenismo generado por esos andrógenos en exceso. De cualquier manera, se han contabilizado como falta de correlación genotipo-fenotipo. Las formas virilizantes simples presentaron mayoritariamente una heterocigosis compuesta para Ile172Asn y mutación severa (13/26), aunque tres pacientes mostraron Val281Leu en heterocigosis con una mutación severa. La mutación Ile172Asn mantiene in vitro una actividad residual, aunque reducida, que podría justificar la producción mínima de aldosterona que previniera la pérdida de sal y por ello se asociaría fuertemente con las formas pierde-sal. Una forma virilizante simple mostró la mutación de procesamiento del intrón 2 en sus dos alelos (13) este hecho, que ha sido descrito en otras series (11,12), se atribuye a un cierto grado de procesamiento alternativo correcto del ARNm en estas pacientes. El resto de pacientes homocigotos para esta mutación en nuestra serie (18 pacientes) presentaron formas pierde-sal. Los heterozigotos compuestos para mutación leve y severa presentaron mayoritariamente (60/67) una forma leve, como podíamos esperar del déficit enzimático parcial producido por este genotipo. En este grupo se encontró una mayor dispersión, ya que se encontraron siete pacientes con formas CL, todos ellos con

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Val281Leu en el alelo leve; cabe señalar que dos de ellas fueron formas VS sin síndrome pierde-sal como se ha comentado más arriba. No podemos excluir que existiera una segunda mutación severa no caracterizada en el alelo portador de la Val281Leu. Esta heterocigosis compuesta para mutación severa y leve (Val281Leu) en pacientes con formas pierde-sal se ha descrito en otras series de otras poblaciones (11). Cabe señalar que en este grupo de mutación leve/severa también se encontraron formas crípticas y oligosintomáticas. Recientemente hemos descrito (Martínez Olmos et al. 1997) una forma oligosintomática en dos hermanas, cuyo genotipo fue 655G (severa)/Val281Leu (leve). La fuerte correlación genotipo-fenotipo en esta enfermedad ha llevado a algunos autores (12) a considerar que el genotipaje de mutaciones puede ser más relevante que la propia categorización clínica de estos pacientes. Ya que, según argumentan, la severidad clínica puede estar condicionada por el estrés y otros factores ambientales y queda oscurecida por factores relacionados con el sexo. Los niños pueden ser diagnosticados y tratados antes de que aparezcan los signos clínicos y el tratamiento prenatal ha de plantearse siempre que exista un feto a riesgo de presentar dos mutaciones tipo severa/severa.

Aportaciones del análisis genético molecular en la deficiencia de 21-OH De manera general, tanto en formas tardías como neonatales, el análisis molecular nos ha permitido realizar el diagnóstico de portadores. Hemos de señalar que un 20% de los portadores genotipados (con mutación caracterizada mediante análisis del gen) presentaban unos valores de 17OHP tras estímulo con ACTH en el rango de la normalidad. El análisis molecular nos ha permitido confirmar el diagnóstico en la gran mayoría de los casos, con algunas salvedades. Un importante porcentaje (38 %) de las formas tardías ha presentado en uno de sus alelos una mutación severa, es decir, que se encuentran a riesgo de, si tienen descendencia con otro portador de mutación severa, tener un hijo/a con una forma neonatal, pierde-sal o virilizante simple. De hecho, incluso en formas crípticas y oligosintomáticas de la deficiencia hemos constatado a nivel molecular en algún caso la existencia de mutación severa en uno de los alelos (24). Teniendo en cuenta que en esta enfermedad es posible realizar tratamiento prenatal, que evita la masculinización de genitales externos en la niñas afectas y prevenir el síndrome pierde-sal si se conoce la situación de afecto del feto varón o niña, habría de plantearse adecuadamente el consejo genético de estas pacientes. Por otro lado, la realización del análisis molecular nos ha permitido perfilar mejor los dinteles diagnósticos del test de Synachten, separando formas clínicas que podrían ser susceptibles de distinto seguimiento, tratamiento, etc. Los denominados hiperandrogenismos funcionales son pacientes que presentan signos clínicos de virilización sin hiperandrogenemia bioquímica y en los que únicamente la 17OHP tras estimulación con ACTH es superior a la normalidad, aunque situándose en el

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rango definido para portadores (7). En el análisis molecular realizado a estos pacientes no se encontraron en ningún caso dos alelos mutados, aunque sí resultaron portadores de la deficiencia con una frecuencia superior a la población normal (1/3 vs 1/15). Los resultados de este estudio sugieren que: si se encuentran unos niveles de 17-OHP tras estímulo con ACTH por debajo de 12 ng/ml es muy probable que no se trate de una forma tardía; que si se detectan unos niveles entre 12 y 16 ng/ml, se encuentran por encima del 95 % de los portadores genotipados, pero en ellos se ha podido documentar la existencia de pacientes con dos alelos mutados; y que las formas tardías con diagnóstico molecular que evidencia la presencia de dos alelos mutados presentaron niveles superiores de este metabolito. En dos de estas formas tardías la 17O-HP tras el estímulo con ACTH fue de 17 y 18 ng/ml. El resto, presentó niveles superiores a 20 ng/ml. En cuanto a las basales de 17-OHP, no permiten el diagnóstico de portadores en ningún caso, y sí pueden permitir el diagnóstico de forma tardía (no en todos los casos), que habría de confirmarse con el test de ACTH. Azziz et al (7) sugieren que cifra de 17-OHP basal por encima de 5ng/ml permiten efectuar el diagnóstico. Algunas formas tardías presentan 17-OHP basal en el rango, o próxima, a la normalidad y sólo son diagnósticas con el test de estimulación. Una paciente homocigota para Val281Leu mostró una basal de 2,4 con un test de estimulación de 21 ng/ml. Las aportaciones del estudio molecular en las formas clásicas de la deficiencia en lo que se refiere al diagnóstico, son por lo general, únicamente de tipo confirmatorio, aunque en algunos casos de HSC con 17-OHP elevada y 11-deoxicortisol superior a la normalidad que plantearon dudas sobre si se trataba de un déficit de 21-OH o de 11-OH, se pudo constatar que existían alteraciones moleculares en el gen de la 21. Los valores altos de 11-deoxicortisol, metabolito por debajo del bloqueo enzimático, pueden ser debidas a la interferencia del 21-deoxicortisol (metabolito no fisiológico cuya concentración se hace relevante en aquellos casos en que la 17-OHP se encuentra muy elevada y es hidroxilada en posición 11) y a una cierta inhibición de la 17-OHP sobre la 11-hidroxilasa. Otro tipo de interferencias en la determinación de 17-OHP, que son especialmente importantes en neonatos han podido llevar en alguna ocasión al diagnóstico de forma virilizante del déficit de 21 con valores de 17-OHP entre 10-20 ng/ml, que a nivel molecular no se ha evidenciado como tal. La trascendencia de estos hechos se plantea especialmente en el consejo genético y diagnóstico prenatal en estas familias. El diagnóstico molecular mediante análisis directo del gen permite evitar estos problemas. El diagnóstico prenatal constituye otra importante aportación del análisis molecular al estudio de la HSC y se describen a continuación los resultados de dicho estudio en nuestra población.

Diagnóstico prenatal El tratamiento prenatal en la HSC por deficiencia de 21-OH se plantea en la embarazada a riesgo de tener un hijo con una forma clásica de la deficiencia (fami-

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lia que tiene ya un caso afecto o en pareja de portadores de mutación severa). De los 23 estudios de muestras prenatales realizados por solicitud de endocrinólogos, genetistas y ginecólogos de distintos hospitales del ámbito nacional incluidos en este trabajo, sólo en 17 casos se daba esta circunstancia, y lo que es más importante, en sólo 10 de los 17 casos se había iniciado adecuadamente el tratamiento prenatal. El resto de casos eran parejas en que la madre presentaba una forma tardía de la deficiencia y en cinco de los casos se había iniciado un tratamiento que no hubiera sido necesario. En referencia concreta a aquellos casos en que el diagnóstico prenatal tuvo que definir si el tratamiento había de ser retirado o mantenido (10 casos de los que 6 fueron niñas): dos eran niñas afectas en las que el tratamiento se mantuvo y evitó la virilización neonatal (25), y en cuatro se pudo retirar el tratamiento, tres de ellas eran portadoras. La constatación de que se trate de un niño, sea o no afecto, o de una niña portadora o sana nos lleva a retirar el tratamiento. En lo que se refiere a los casos que hubieran requerido tratamiento prenatal previo al diagnóstico molecular por estar éste indicado, hemos de reseñar que en dos de los casos se trató de niños afectos: una niña afecta recibió tratamiento unicamente a partir de la 21 a semana (momento en que se contactó con nuestro laboratorio para el estudio molecular y en ella no se pudo prevenir la virilización; el otro fue un varón en el que se hubiera retirado el tratamiento y en el que el diagnóstico molecular permitió prevenir el síndrome pierde-sal al nacimiento). Los estudios prenatales se realizaron por dos abordajes distintos y complementarios que permiten una mayor fiabilidad de los resultados, ambos han de ser concordantes para marcar la actitud a seguir: un análisis directo del gen (13,19) y un análisis indirecto mediante microsatélites en la región HLA (22). Estos marcadores fueron desarrollados por nuestro grupo para solventar algunos de los problemas que presentaban los tradicionales marcadores indirectos, antígenos HLA. La utilidad de estos microsatélites se describe en Ezquieta et al. (22). La heterocigosidad (probabilidad de que un individuo presente dos alelos distintos) de estos marcadores es muy elevada (0,62-0,76) y por ello, su informatividad. El análisis indirecto permite seguir aquellos alelos no caracterizados pero además es útil como elemento independiente de confirmación del diagnóstico que se hace por análisis directo. La alta heterocigosidad de estos marcadores ha permitido la detección de contaminación con tejido materno de una de las muestras prenatales estudiadas. Los errores descritos en el diagnóstico prenatal de 21-OH a nivel molecular hasta el momento han sido atribuidos a distintos motivos como la contaminación de la muestra prenatal con tejido materno o la recombinación entre el gen mutado y los marcadores HLA utilizados. Los marcadores de tipo microsatélite pueden ayudar a reducir o solventar estos problemas. Su gran informatividad permite que puedan seguirse los cromosomas no caracterizados, detectar contaminación de tejido materno y recombinaciones. Sin olvidar la utilidad adicional de permitirnos definir el diagnóstico prenatal mediante dos abordajes independientes, solventando los problemas de errores en el diagnóstico directo de 21-OHD por alelos no amplificables así como errores de la PCR de 21-OH, que también han sido descritos

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(Donohue et al (10). De cualquier forma, ambos abordajes análisis directo e indirecto han de aplicarse para un correcto diagnóstico de enfermos, portadores y muestras prenatales. Estos datos en conjunto muestran que el análisis del gen 21-OH es de gran utilidad en la HSC también en población española, tanto en diagnóstico de portadores como prenatal; que la distribución y frecuencia de alelos mutados es similar a la encontrada en otras poblaciones aunque presenta algunas peculiaridades que ponen de manifiesto la existencia de un mecanismo de distribución de alelos por «efecto fundador», ya sugerido por otros autores, que junto al mecanismo de conversión génica, contribuiría a la elevada frecuencia de alelos mutados para esta deficiencia. También se ha podido comprobar la existencia de una fuerte correlación genotipofenotipo y la utilidad diagnóstica del análisis. Bibliografía 1. Oliver A, Gussinyé M, Ezquieta B. Hiperplasia Suprarrenal Congénita. En: Argente J, Carrascosa A, Gracia R, Hierro, (eds.). Tratado de endocrinología pediátrica y de la adolescencia. 2.a (ed.). Barcelona: Doyma 2000. 2. White PC, Speiser PW. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Endoc Rev 2000; 21: 245-291. 3. Witchel SF, Lee PA, Suda-Hartman M, Hoffman EP. Hyperandrogenism and manifesting heterozygotes. Biochem Mol Med 1997; 62: 151-158. 4. White PC. New Ml. Genetic basis of endocrine disease. 2. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1992; 74: 6-11. 5. Miller WL. Clinical Review 54: Genetics, Diagnosis and management of 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78: 341-346. 6. New MI, White PC, Pang S, Dupont B, Speiser PW. The adrenal hyperplasias. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly, WS, Valle D, (eds.). En: The metabolic basis of inherited disease. New York: MacGraw-Hill, 1989; 1881-1918. 7. Azziz R, Dewailly D, Owerbach D. Clinical Review 56 Nonclassical adrenal hyperplasia: current concepts. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78: 810-815. 8. Witchel SF, Lee PA, Suda-Hartman M, Trucco M, Hoffman P. Evidence for a heterozigote advantage in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endoc Metab 1997; 82: 2097-2101. 9. Ezquieta B, Oyarzáabal M, Oliver A, Jariego C, Varela, JM, Rubio F et al. Efecto fundador en la diseminación de algunas mutaciones del gen de la esteroide 21-hidroxilasa ¿ventaja de los heterocigotos portadores? Anales Españoles Pediatría 1998; supl 111, 69. 10. Donohue PA, Parker K, Migeon CJ. Congenital adrenal hyperplasia En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS. Valle D. (eds.). The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7.a (ed.). New York: McGraw Hlll. 1995; 2929-2966. 11. Speiser PW, Dupont J, Zhu D, Serrat J, Buegeleisen M, Tusie Luna MT et al. Disease expression and molecular genotype in congenital adrenal hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency. J Clin Invest 1992; 90: 584-595. 12. Wedell A, Thilén A, Ritzen E, Stengler B, Luthman H. Mutational spectrum of the steroid 21-hydroxylase gene in Sweden: Implications for genetic diagnosis and association with disease manifestation. J Clin Endoc Metab 1994; 78: 1145-1152.

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19 Terapia celular de la diabetes mellitus B. Soria Escoms

Introducción La diabetes mellitus consiste en un conjunto de síndromes metabólicos cuya característica común es el aumento de la glucosa sanguínea, se trata de una enfermedad crónica que tiene tratamiento pero no tiene curación. Tanto en la diabetes tipo 1 (insulino-dependiente) como en la tipo 2 (no-insulino dependiente) hay un déficit en la liberación de insulina. Dicho déficit es especialmente grave en la tipo 1, en la que por un proceso autoinmune hay una pérdida de la población celular beta de los islotes de Langerhans. Los diabéticos tipo 1 son subsidiarios del tratamiento con insulina durante toda su vida. Los estudios de tipo prospectivo y epidemiológico (DCCT (1), UKPDS (2)) han demostrado que el control intensivo de la glucemia disminuye de forma significativa la aparición de complicaciones microvasculares (retinopatía, nefropatía, neuropatía). El tratamiento intensivo intenta reproducir el control fisiológico (permanente, preciso y regulado) de la glucemia sanguínea, para ello el paciente debe someterse a un control permanente de la glucemia y a la administración intensiva (4-6 veces día) de insulina, la tarea que el páncreas endocrino realiza de forma continua es sustituida por la conducta de un paciente entrenado y motivado, como afirma María de Alva (3), diabética y Presidenta de la International Diabetes Federation: «my brain is my pancreas». Sin embargo, este tratamiento precisa de pacientes muy motivados. La curación de la diabetes tipo 1 sólo puede venir de la reposición de la población celular beta. Hasta ahora, el trasplante de islotes pancreáticos había tenido un éxito limitado, sin embargo, la introducción de un nuevo tratamiento inmunosupresor es capaz de resolver la dependencia de insulina por períodos de más de doce meses (4). Este nuevo protocolo supone un claro avance en el trasplante de islotes, sin embargo deja dos puntos abiertos: en primer lugar los diabéticos trasplantados necesitan terapia inmunosupresora continua y en segundo lugar, para cada diabéti-

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co se necesitan de dos a tres donantes. Dado que las cifras de donantes, incluso en países como España, con un alto nivel de donación de órganos, nunca alcanzarán las necesidades de la población de diabéticos tipo 1, se impone la necesidad de buscar otras fuentes de células beta para poder ser trasplantadas. Dichos procedimientos terapéuticos utilizan los conceptos, métodos y conocimientos que pueden englobarse en lo que entendemos por ingeniería celular.

¿Qué es la ingeniería celular? La ingeniería celular es un nuevo campo interdiciplinar que aplica los principios de la ingeniería y de las ciencias de la vida a la obtención de sustitutos biológicos para restaurar, mantener o mejorar la función tisular (5). Los avances considerables en Ciencia de los Materiales, Genética Molecular, Biología del Desarrollo, Biología Molecular y Celular, junto con un conocimiento más profundo de la fisiología de las células, tejidos y órganos, han permitido que por primera vez se plantease la obtención de células y tejidos para su implante en humanos. En muchas ocasiones la ingeniería celular imita los procesos biológicos del desarrollo intrauterino o de la reconstrucción fisiológica de tejidos para la consecución de sus objetivos. Las técnicas de ingeniería celular han permitido hasta el momento la obtención de piel artificial, tendones, ligamentos, etc. Cabe preguntarse si las nuevas técnicas de ingeniería celular pueden ser útiles para generar nuevas células beta que trasplantadas al paciente consigan normalizar la glucemia y evitar las complicaciones de la enfermedad.

Obtención de células beta artificiales mediante técnicas de bioingeniería Ingeniería de células de origen tumoral Las primeras propuestas consistieron en transfectar líneas de origen tumoral con los genes de aquellas proteínas que no se expresan adecuadamente y por lo tanto, normalizar un fenotipo defectuoso. Por ejemplo, es muy frecuente que las líneas tumorales presenten un umbral demasiado bajo para la glucosa (en el rango sub mM), esto es debido a que expresan las isoformas I-III de la hexokinasa, que posee una mayor afinidad por glucosa. La transfección con el gen de la glucokinasa (hexokinasa IV) permite obtener un patrón de respuesta a la glucosa en el rango fisiológico. Existen varias líneas celulares de origen tumoral derivadas a partir de la célula beta por irradiación (células RINm5F, INS-1, etc.) o por transformación viral mediante SV40 acoplado al promotor de la insulina (células `TC). También pueden utilizarse líneas tumorales de origen neuroendocrino, que comparten con la célula beta una serie de propiedades, como por ejemplo, el procesamiento, almacenamiento y secreción de péptidos. La línea AtT-20, derivada de la adenohipófisis de

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ratón, puede ser transfectada con el gen de la insulina, con lo que se obtiene la línea AtT-20 ins (6). La facilidad con la que ciertas líneas celulares pueden ser transfectadas de forma reiterada permite la «ingeniería iterativa», es decir, la transfección con otros genes como el de la glucokinasa y el del transportador GLUT-2 (7). Mediante este procedimiento se ha generado una línea celular que responde a la glucosa en el rango fisiológico, si bien posee una cinética de secreción sin primera fase (Fig. 19.1). Las líneas tumorales presentan, no obstante, una serie de problemas no bien resueltos, como por ejemplo, la inestabilidad del fenotipo, la expresión de genes no deseados, y sobre todo su proliferación incontrolada ya que son de origen tumoral. Con el fin de controlar la proliferación se ha propuesto la utilización de genes cuya expresión es sensible a la presencia de un determinado ligando, como la tetraciclina (8), o a la temperatura.

Producción de insulina en otros tejidos La producción de insulina en otros tejidos (producción ectópica) puede conseguirse mediante la transfección de células no beta con el gen de la insulina humaAtT-20 hlns

Glut-2

GK

Sólo 2.a fase

0 Tiempo, min

30

Insulina

Insulina

Línea celular secretora de insulina

5

10 Glucosa, mM

15

Figura 19.1. Bioingeniería de líneas celulares neuroendocrinas. La línea celular AtT-20 procedente de la pituitaria anterior es tranfectada de forma progresiva («iterative engineering») con el gen de la insulina humana (hIns), el del transportador de glucosa (Glut-2) y el de la glucoquinasa (GK). La nueva línea celular responde a glucosa a concentraciones fisológicas aunque no está presente el primer pico de la secreción bifásica de insulina.

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na. Por ejemplo, se pueden tomar fibroblastos de un paciente, transfectarlos con el gen de la insulina y reinyectárselos al propio paciente. Este sistema genera una liberación basal, constitutiva y no regulada, de insulina. Siempre que no se alcancen niveles muy altos de insulinemia basal (peligro de hipoglucemia), la insulinemia basal no permite enfrentarse a los aumentos de glucemia postprandial pero quizás le permita el mantenimiento de la glucemia basal. Es decir, la dependencia de insulina no desaparece, pero puede utilizarse alguna insulina rápida, incluso de las nuevas formulaciones de insulina inhalada, en el control de la glucemia postprandial. La ventaja de estos procedimientos es que no necesitan inmunosupresión. Los inconvenientes son: no se ha conseguido una expresión estable por periodos prolongados, el fibroblasto carece de los enzimas para transformar la proinsulina en insulina y, lo que es más importante, el fibroblasto carece de la maquinaria para procesar, almacenar y secretar insulina, por lo que la secreción no es una secreción regulada. El peligro de un aumento no controlado de la insulinemia basal, y de hipoglucemia severa, es una de las complicaciones más graves del tratamiento mediante insulinas. Quizás, el problema más difícil de resolver en la terapia celular de la diabetes mellitus es la reproducción de la liberación finamente regulada de la insulina en respuesta a las variaciones de glucosa. A diferencia de otras endocrinopatías carenciales en las que la presencia de la molécula puede considerarse aceptablemente buena para un rango amplio de concentraciones en el caso de la insulina el mecanismo es extraordinariamente preciso y debe ajustarse a lo que en cada momento necesita el organismo. Este planteamiento hizo que se pensase en la utilización de otras estrategias para conseguir la secreción regulada de insulina en estructuras ectópicas. Por ejemplo, la transfección de hepatocitos con un gen quimérico consistente en la fusión del promotor de la piruvato quinasa o de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa con el gen estructural de la insulina. Dado que la expresión de ambos enzimas hepáticos está regulada por glucosa, los aumentos extracelulares de glucosa se traducirían en la expresión hepática de insulina. La principal dificultad de esta propuesta terapéutica es que lo que está regulado por la glucemia es la expresión del gen y no la liberación de la hormona. Como la síntesis de proteínas es un proceso lento (30-60 min) en la práctica el sistema de retroalimentación funciona como un «loop» demasiado lento generando periodos de hiperglucemia e hipoglucemia intensas. Esta dificultad puede resolverse mediante la transfección de células endocrinas intestinales en las que la liberación hormonal esté regulada por glucosa, como ocurre con las células K encargadas de la liberación de GIP (polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa) en presencia de glucosa. El gen quimérico resulta de la fusión del promotor del GIP con el gen estructural de la insulina. Este procedimiento impide la progresión de la diabetes experimental en ratones (9). No obstante, el epitelio intestinal está en continuo recambio lo que impide una acción prolongada de la terapia. Alternativamente, puede conseguirse el control farmacológico de la secreción proteica mediante un procedimiento que permite la liberación rápida y pulsátil de proteínas terapéuticas (10). Para ello se diseña el precursor proteico de

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forma que se almacena formando agregados en el retículo endoplásmico. La secreción puede estimularse mediante un fármaco que produzca desagregación y permita la acción de las furinas, proteasas ubicuas que rompen el enlace peptídico que une la proteína terapéutica al dominio de agregación condicional. Por último, la observación casual de que las células eucariotas pueden capturar DNA crudo del ambiente e incorporarlo a su maquinaria de producción de proteínas ha hecho que se empiece a utilizar la inyección de ADN crudo en la musculatura esquelética. La electroporación puede utilizarse in vivo para facilitar la incorporación del gen de la insulina al músculo esquelético. Este procedimiento posee en este momento las mismas dificultades descritas para la transfección de otros tipos celulares como los fibroblastos.

Ingeniería celular de precursores. Estímulo y control del crecimiento, regeneración y neogénesis de islotes La masa celular ` aumenta por diferenciación a partir de células precursoras del epitelio ductal del páncreas, aunque parece ser que tras el nacimiento la replicación de células beta preexistentes es el principal mecanismo de aumento de la masa celular. La posibilidad de que ambos mecanismos coexistan en el adulto ofrece la posibilidad de aprovechar dicha capacidad en la prevención o en el tratamiento de la diabetes. Susan Bonner-Weir et al (11) han desarrollado un protocolo de cultivo que permite la obtención de islotes pancreáticos a partir de las células ductales de páncreas de donantes. En síntesis, consiste en cultivar las células en monocapa durante 1-2 semanas en un medio que contiene factor de crecimiento de queratinocitos, nicotinamida e ITS (insulina + transferrina + selenio) hasta que las células estén casi confluentes. A continuación son transferidas a un medio con una preparación de matriz extracelular (Matrigel®) durante 1-7 semanas. El principal obstáculo de este procedimiento es que se consigue una proliferación muy limitada y por lo tanto no se alcanza la cantidad de material necesaria para un trasplante. Otros autores han utilizado células beta procedentes de neonatos con PHHI, hiperinsulinemia e hipoglucemia persistente de los neonatos. En este cuadro clínico debido a una mutación del canal de potasio regulado por ATP (12), las células beta están permanentemente despolarizadas, lo que provoca la entrada continua de calcio y la liberación persistente de insulina. Desgraciadamente el canal mutado es insensible a diazóxido por lo que los recién nacidos con este cuadro precisan de una pancreatectomía del 95% para resolver la hipoglucemia en la que se encuentran. A partir de las células beta obtenidas tras la pancreatectomía se ha desarrollado una línea celular que responde a concentraciones fisiológicas de glucosa (13). El procedimiento incluye la transfección con el gen del canal K ATP y con el gen que codifica el factor de transcripción PDX-1. PDX-1 es un factor de transcripción que juega un papel central en la diferenciación de la célula beta pancreática y en la regulación de la expresión de la insulina.

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Clonación terapéutica y diferenciación in vitro de células beta El descubrimiento de que la información contenida en el ADN de una célula adulta puede ser reprogramada, de forma que se puede desarrollar un mamífero superior a partir de la información contenida en el núcleo de una célula de una oveja adulta (14), ha cambiado el paradigma existente hasta el momento. Las células adultas-diferenciadas mantienen su estado diferenciado gracias a que han silenciado muchos de sus genes, se supone que por procesos de metilación. Una célula diferenciada sólo expresa un determinado menú de su repertorio de genes, sin embargo, una célula totipotencial puede aún expresarlos todos y, por lo tanto, dar lugar a cualquier tipo celular de los aproximadamente 200 que existen en un organismo adulto. En el caso de Dolly se consiguió la totipotencialidad, el núcleo transferido dio lugar a todos los tipos celulares, incluyendo las células germinales. La clonación reproductiva permite la obtención de transgénicos para la producción de sustancias con aplicaciones biotecnológicas (péptidos hormonales, etc.) o de órganos para su trasplante en humanos (xenotrasplante). En la actualidad y, dado el número de malformaciones asociadas al proceso, puede afirmarse que intentar la clonación reproductiva humana sería una aberración criminal e irresponsable. No así la clonación terapéutica que abre la posibilidad de obtener in vitro células y tejidos que pueden ser utilizados en terapia celular de enfermedades como la diabetes, el Parkinson, etc. Nuestro grupo ha demostrado que es posible obtener células que contengan y liberen insulina a partir de células embrionarias de ratón. Dichas células normalizan la glucemia en animales diabéticos (15). En síntesis, la clonación terapéutica consta de cuatro pasos: a) Transferencia del núcleo de una célula procedente de un paciente (por ejemplo de un fibroblasto o de la piel) a una célula receptora que puede ser un ovocito humano, no humano (se ha ensayado con éxito los ovocitos de ternera) u otros tipos celulares con pluripotencialidad suficiente; b) Diferenciación in vitro hacia el tipo celular deseado; c) Selección clonal; y d) Maduración y diferenciación terminal. En teoría, la diferenciación in vitro puede promoverse generando unas condiciones ambientales similares a las del desarrollo embrionario. Por ejemplo, la polaridad, los factores de crecimiento o la presencia de matriz extracelular (16). Sin embargo, la obtención de poblaciones celulares puras exige la utilización de técnicas de selección clonal eficientes. En general, los métodos de selección clonal se basan en la expresión de determinadas proteínas en la membrana celular y la selección mediante FACS («fluorescence activated cell sorting»). Se puede conseguir una selección más específica utilizando la selección en base a la expresión de marcadores genéticos representativos del tipo celular que se desea seleccionar (17,18). La metodología, que nosotros hemos adaptado para la selección de células que contengan insulina consiste en transfectar las células con un gen quimérico formado por la fusión funcional del promotor de la insulina acoplado a un gen de resistencia a la neomicina (Fig. 19.2). Así, aquellas células que contengan el complejo de transcripción que activa la expresión de dicho gen, tendrán también activado la expresión del gen de resistencia a la neomicina. Este procedimiento ha permitido

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la obtención de cardiomiocitos (17) y de precursores neurales (18) a partir de células madre embrionarias.

Trasplante de células beta obtenidas a partir de células madre embrionarias El método descrito previamente ha permitido la obtención de una línea celular que no sólo contienen insulina, sino que posee secreción regulada de la misma. El procedimiento de obtención que se sumariza en la (Fig. 19.2), y consiste en: a) Transfección mediante electroporación o lipofección de células madre embrionarias con un constructo similar al descrito en la (Fig. 19.2). Dicho constructo está diseñado para que exprese el gen de resistencia a la neomicina sólo en aquellaos tipos celulares que expresan insulina. b) Selección mediante higromicina de las células transfectadas. c) Diferenciación in vitro con formación de cuerpos embrionarios y cultivo en monocapa. d) Selección de clones resistentes a neomicina (y que por lo tanto están expresando insulina). e) Maduración de clones que expresan insulina (2 semanas en 10 mM nicotinamida y alta glucosa 25 mM + 5 días en 10 mM nicotinamida y 5 mM glucosa). f) Caracterización del clon en términos de contenido de insulina, secreción y liberación de la misma en respuesta a distintos secretagogos. g) Trasplante a animales diabéticos. El clon que se seleccionó en este estudio tenía un contenido de insulina correspondiente aproximadamente al 80 % del contenido de insulina de islotes de ratón (15). Se comprobó además, que la incubación en bajas concentraciones de glucosa aceleraba el proceso final de maduración, ya que el contenido de insulina de los islotes y las respuestas de secreción basal e inducida por concentraciones estimulatorias de glucosa (16,7 mM) o tolbutamida (100 μM), iba aumentando con los días de incubación en glucosa. Al final, obtuvimos unas células cuya liberación basal de insulina era la mitad de la de los islotes de raton, y que en respuestas a secretagogos, tenían una secreción de insulina que correspondía aproximadamente al 55 % de la secreción de islotes de ratón. Cuando estas células se trasplantaron en un modelo de animal se comprobó que eran capaces de mantener normoglicémicos a dichos animales desde los primeros dos días del trasplante y durante todo el tiempo que duró el estudio (19). En base a lo anteriormente expuesto (20), pueden postularse las siguientes predicciones en relación con el trasplante de islotes pancreáticos y el uso de células madre en ingeniería celular y diabetes mellitus:

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R1 mESC

Transfección h Ins prom

B-geo

PGK/Hygro

+ Higromicina

Clones resistentes a higromicina Diferenciación in vitro

+ Neomicina

Clones resistentes a Neomicina

Células con bajo contenido en insulia

2 semanas Nic Maduración

5 días Nic-baja glucosa

Células con alto contenido en insulina

Figura 19.2. Diagrama de flujo del proceso de diferenciación desde células madre embrionarias pluripotenciales (mESC) a células que contienen insulina. NIC: nicotinamida (modificado de Soria et al (20).

1. En un futuro próximo se observará un aumento en los trasplantes de islotes para el tratamiento de la diabetes tipo 1. 2. A corto y medio plazo se desarrollarán nuevos métodos para la obtención in vitro de células beta, bien a partir de precursores, como las células ductales, o a partir de células madre.

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3. La clonación terapéutica, autorizada ya en países como el Reino Unido, EEUU. y Japón, se extenderá a otras regiones permitiendo el tratamiento de la diabetes mellitus mediante células ` producidas «a medida». 4. A medio plazo se dispondrá de métodos para la diferenciación a partir de células madre del adulto. Una vez resuelta la expansión necesaria para generar una masa notable de células beta será factible tanto el alotrasplante como el autotrasplante. 5. La ingeniería celular permitirá la modificación de las células con el fin de hacerlas más resistentes al ataque inmunitario, a la apoptosis, etc. 6. Se desarrollarán terapias inmunosupresoras que permitirán suprimir la respuesta autoinmune en la diabetes tipo 1, lo que permitirá el trasplante de células beta con efectos secundarios mínimos. 7. El desarrollo de técnicas de encapsulación permitirá la tolerancia al alotrasplante de células beta pancreáticas. En suma, junto con la biología molecular y el conocimiento de la estructura y función del genoma humano, la ingeniería celular puede convertirse en la nueva revolución biomédica del siglo XXI.

AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido realizado, en parte gracias a Ayudas del Ministerio de Ciencia y Tecnología (PM99-0142), Fundació Marató TV3 (99-1210), Fundación Salud 2000 y Juvenile Diabetes Foundation (1-2000-575).

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20 Aproximación genética a los pseudohermafroditismos M. L. Gaspar

Determinación y diferenciación sexual. Pseudohermafroditismos El proceso de determinación sexual de un feto comprende aquellos eventos genéticos que producen un desarrollo gonadal masculino o femenino. La diferenciación sexual se refiere a los siguientes eventos morfogénicos y fisiológicos que finalmente establecen la funcionalidad sexual, el dimorfismo sexual y las características sexuales secundarias. Los genitales se desarrollan durante el primer trimestre de vida intrauterina, bajo la influencia de hormonas esteroideas sexuales, por lo que como consecuencia de alteraciones en la síntesis o acción de estas hormonas pueden existir cambios en el desarrollo sexual normal del feto. Prácticamente todas las etapas de la diferenciación sexual están determinadas genéticamente, por lo que cada una de ellas puede fallar como consecuencia de la mutación de los genes correspondientes. Estas mutaciones ocasionan cuadros de indefinición sexual en grados diversos, que conllevan la aparición de pseudohermafroditismo. Se llama pseudohermafroditismo o estado intersexual a aquellas entidades en las que los genitales externos del individuo son ambiguos o son discordantes con el sexo gonadal o el cromosómico del sujeto. El pseudohermafroditismo masculino es una patología de la diferenciación sexual en la que se produce una incompleta diferenciación de los genitales masculinos (ductos genitales y/o genitales externos) en presencia de gónadas masculinas Abreviaturas utilizadas: Dihidrotestosterona (DHT); Factor inhibidor de tumor de Wilms («Wilms tumor inhibiting factor», WT-1); Factor esteroidogénico («steroidogenic factor-1», SF-1); Hiperplasia adrenal congénita (HAC); Hipoplasia de células de Leydig (HCL); Hormona antimulleriana («mullerian inhibiting substance», MIS); Hormona gonadotropina coriónica (HCG); Hormona luteinizante (HL); Reacción de polimerasa en cadena (PCR); Receptor de andrógenos (RA); Receptor de HL (RHL); Secuencias de reconocimiento esteroideo (SER); Síndrome de Feminización Testicular (Tfm).

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o de tejido testicular en individuos genotípicamente varones (46,XY). Está causado por fallos en el proceso secuencial de desarrollo embrionario del testículo. Normalmente durante la vida embrionaria en presencia de un testículo funcional los conductos de Muller regresan por acción de la hormona antimulleriana (o «mullerian inhibiting substance», MIS) y los conductos mesonéfricos y el sinus urogenital se diferencian hacia genitales externos e internos masculinos por acción de la testosterona y la dihidrotestosterona (DHT). Si en este periodo de la vida embrionaria no se produce una adecuada exposición a hormonas testiculares (testosterona y MIS), o el individuo es genéticamente incapaz de responder a ellas, el proceso de diferenciación de genitales masculinos no se produce o lo hace parcialmente, ocasionando la aparición de pseudohermafroditismo masculino. La causa más frecuente de pseudohermafroditismo masculino en ausencia de gónadas disgenéticas es el Síndrome de feminización testicular (Tfm) o Síndrome de insensibilidad a los andrógenos, ocasionado por mutaciones en el gen que codifica para el receptor de andrógenos (RA) (1). La segunda causa más frecuente de pseudohermafroditismo masculino es el déficit de 17` hidroxilasa, que ocasiona un defecto en la biosíntesis de testosterona, lo que produce un cuadro de pseudohermafroditismo incompleto con insuficiencia adrenal (2). El pseudohermafroditismo femenino es una patología de la diferenciación sexual en la que se produce una diferenciación de genitales externos masculinos en ausencia de tejido testicular, en individuos que son genotípicamente hembras (46,XX). En estos pacientes se encuentran genitales internos femeninos junto con grados diversos de virilización en genitales externos. Está producido por exposición del feto femenino a un exceso de ambiente androgénico durante el embarazo. De esta forma, los andrógenos masculinizan los genitales externos, pero el feto conserva sus ovarios, y derivados mullerianos. La causa más frecuente de este cuadro es la hiperplasia adrenal congénita (HAC) producida por déficit de 21 hidroxilasa (3), y la segunda causa más frecuente se debe a un exceso materno de andrógenos, generalmente a consecuencia de tumores ováricos. Las principales causas de pseudohermafroditismo se resumen en la Tabla 20.1. En todos estos cuadros se produce la mutación en alguno de los genes relevantes en alguna etapa concreta de la síntesis o acción de los andrógenos y/o la MIS. El cuadro clínico que presenta cada uno es muy variable, pero el patrón de niveles hormonales de los pacientes afectados es orientativo del diagnóstico, que finalmente se confirma por la detección directa de las mutaciones correspondientes. La presencia de las mutaciones de alguno de estos genes se determina por técnicas de biología molecular, como son el análisis de polimorfismo conformacional de ADN de cadena sencilla (SSPC), o la reacción de polimerasa en cadena (PCR), que permite amplificar el ADN de los distintos exones, intrones y regiones promotoras de los genes, que son posteriormente secuenciados. Por último, la función anómala de la proteína mutada se demuestra por la introducción del ADNc portador de la mutación correspondiente en células carentes de la proteína nativa, o por la producción de animales transgénicos con el ADNc mutado.

APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS

Tabla 20.1.

291

Causas genéticas de pseudohermafroditismo

1) Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica y a la hormona luteinizante. (por mutaciones en su receptor). 2) Déficit enzimáticos en la biosíntesis de cortisol/testosterona. 3) Anomalías en la acción de los andrógenos. a) por defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona. b) por resistencia a la acción de los andrógenos (mutaciones en su receptor). 4) Defectos síntesis o acción de la h. antimulleriana.

Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica y a la hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor El desarrollo sexual masculino está regulado por la hormona gonadotropina coriónica (HCG) y la hormona luteinizante (HL), que actúan en la gónada indiferenciada del feto por unión al receptor de HL (RHL) presente en las células de Leydig. Mutaciones que inactivan el RHL causan una inadecuada diferenciación fetal de células de Leydig en el testículo, lo que ocasiona una aplasia o hipoplasia de estas células (Hipoplasia de células de Leydig, HCL). La HCL es una patología autosómica recesiva, causada por mutaciones en el gen que codifica para el RHL. Se han localizado mutaciones a lo largo de todo el gen de RHL, que incluyen mutaciones puntuales, inserciones y delecciones (4). El RHL es una proteína transmembrana, con un gran dominio extracitoplásmico, siete dominios transmembranales unidos por tres lazos intracelulares y tres extracelulares, y una cola intracitoplásmica. Esta proteína está codificada en el cromosoma 2p21, y consta de 11 exones. Los 10 primeros codifican todo el dominio N-terminal extracelular, que es donde se encuentra el lugar de unión a la hormona, mientras que el exón 11 codifica la región C-terminal, que comprende el resto de los dominios. La mayoría de las mutaciones descritas en el gen de RHL, sobre todo las inserciones y delecciones, o las mutaciones puntuales ocasionando cambios sin sentido, ocasionan diversos grados de pérdida de actividad del RHL, desde su total falta de función hasta una menor capacidad de unión a sus ligandos (4). En general corresponden a mutaciones en el dominio extracelular del RHL que afectan al sitio de unión de la HL o la HGC con el receptor y al anclaje de la proteína a la membrana. La extensión de la mutación correlaciona con el cuadro clínico porque las manifestaciones clínicas en pacientes homocigóticos correlacionan con la actividad residual de sus correspondientes RHL (5). El cuadro clínico de los sujetos 46,XY afectos, es por tanto de espectro variable, que va desde formas leves de hipogonadismo masculino, que se presentan como niños varones con falo hipoplásico e hipospadias al nacimiento, o como adultos con micropene, a formas graves, con cuadros completos de pseudohermafroditismo masculino, con genitales externos femeninos y criptorquidia, junto con ausencia de derivados mullerianos y de células de Leydig maduras en los testículos. Las alteraciones analíticas características incluyen bajos niveles séricos de testosterona, incluso tras estimulación con HGC, con niveles normales de precursores esteroideos y niveles elevados de HL. En mujeres homocigotas las

292

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Tabla 20.2.

Manifestaciones clínicas de mutaciones del gen del RHL

Mutaciones Activadoras

Individuos 46, XY

Individuos 46, XX

Pubertad precoz familiar o esporádica

Asintomáticos

Inactivadoras Defectos severos

Hipoplasia de células de Leydig

Amenorrea u oligomenorrea Poliquistosis ovárica

Defectos leves

Micropene y/o hipospadia

No descrito

mutaciones del RHL causan cuadros de hipogonadismo hipergonadotrópico, con amenorrea u oligomenorrea primaria, ovarios quísticos e infertilidad (4). Algunas mutaciones del gen del RHL, que pueden ser esporádicas, producen activación constitutiva del RHL. En general estas mutaciones ocasionan cambios puntuales de aminoácidos del 6.o dominio transmembrana y del tercer lazo intracelular del RHL (codificado por el exón 11). Esta activación constitutiva del RHL ocasiona pubertad precoz en niños, esporádica o familiar (pubertad precoz familiar en varones, autosómica dominante). En la Tabla 20.2 se resumen las manifestaciones clínicas de las diversas mutaciones del gen del RHL (4). Por último, recientes descripciones de casos de HCL que muestran un RHL normal, aportan evidencias sobre una posible heterogeneidad genética, aún por caracterizar, en esta entidad (6).

Déficit enzimáticos en la biosíntesis de andrógenos Producidas por mutaciones de genes de enzimas que participan en la biosíntesis de la testosterona, que tiene varios pasos en común con la del cortisol, y que ocasionan diversos cuadros de pseudohermafroditismo femenino o masculino, con alteraciones fenotípicas muy variables, y que en general se asocian con defectos en la síntesis de otras hormonas esteroideas, lo que ocasiona adicionalmente otras patologías asociadas. Los principales defectos enzimáticos en la síntesis de cortisol/testosterona se resumen en la Tabla 20.3. Todos aquellos en los que se produce un defecto final en la síntesis de cortisol (3` hidroxiesteroid-dehidrogenasa, 17_ hidroxilasa, 21 hidroxilasa, 11` hidroxilasa) causan incremento en la secreción de ACTH y excesivo crecimiento adrenal, junto con un aumento en la producción de andrógenos, produciendose así distintos síndromes de hiperplasia adrenal congénita (HAC) (3), que presentan importante patología de insuficiencia adrenal o distintos grados de nefropatía, junto con cuadros de pseudohermafroditismo femenino (las cuatro enzimas) y masculino (21 hidroxilasa, 11` hidroxilasa). De entre estos defectos enzimáticos, señalaremos aquí únicamente la hiperplasia adrenal congénita producida como consecuencia de mutaciones del gen de la

Hormona deficitaria

Hormona acumulada

Anomalía en la diferenciación sexual En varones (46, XY)

Principales defectos en la síntesis de cortisol/testosterona

Cortisol y aldosterona

Cortisol y aldosterona

Cortisol y aldosterona

17_ hidroxilasa

21 hidroxilasa

11` hidroxilasa:

11-Desoxicortisol

17OH-progesterona

Corticosterona y desoxicorticosterona

Dihidro –epiandrosterona

Asintomáticos

Asintomáticos, pubertad precoz

Feminización variable, hipogonadismo y ginecomastia

Feminización, ginecomastia

Testosterona

Testosterona

17/20 liasa

17` hidroxiesteroid –dehidrogenasa:

Androstenediona

17OH-progesterona

Fenotipo femenino, neonatal, virilización en pubertad

Genitales ambiguos en neonato o feminización

Cuadros que cursan con pseudohermafroditismo masculino únicamente

Progesterona

3` hidroxiesteroid –dehidrogenasa

Cuadros que cursan con hiperplasia adrenal congénita y pseudohermafroditismo

Enzima deficitaria

Tabla 20.3.

Asintomáticas

Asintomáticas

Virilización

Virilización

Fenotipo prepúber con amenorrea

Hirsutismo

En mujeres (46, XX)

Hipertensión

Insuf. Adrenal

Hipertensión, alcalosis hipocaliémica

Nefropatía con pérdida de sal

Patología asociada (ambos sexos)

APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS 293

294

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

21-hidroxilasa, que es la primera causa de pseudohermafroditismo femenino (95% de los casos) (3). La incidencia de formas graves de la enfermedad es de 1 en 10.000, pero la de formas leves llega hasta 1 en 1.000. Se han descrito mutaciones que van desde grandes delecciones del gen hasta mutaciones puntuales, incluyendo aquellas que afectan a regiones reguladoras que impiden la transcripción. La HAC por déficit de la 21-hidroxilasa es una enfermedad autosómica recesiva, en la que está alterada la síntesis de cortisol y aldosterona y se produce un acúmulo de 17-hidroxiprogesterona, que se deriva hacia una anómala producción de testosterona. Las enfermas afectas presentan un cuadro clínico de insuficiencia adrenal grave y pseudohermafroditismo femenino, con grados variables de virilización. Resulta fundamental el diagnóstico temprano de la entidad, que en los casos severos tiene una importante tasa de mortalidad debido a la insuficiencia adrenal que se produce en las primeras semanas de la vida. Este diagnóstico se hace mediante determinación por RIA de la 17-hidroxiprogesterona, junto con ecografía abdominal/pélvica, para iniciar tratamiento sustitutivo con corticoides y mineralocorticoides que evite la insuficiencia adrenal. La mejora en el manejo clínico de estas enfermas ha elevado el número de ellas que llegan a presentar embarazos con fetos heterocigotos normales, por lo que se comienza a plantear el tratamiento muy temprano (incluso prenatal) de los fetos femeninos que portan estas enfermas, para evitar la insuficiencia adrenal y prevenir la ambigüedad genital (7). En sujetos varones homocigotos se producen manifestaciones de insuficiencia adrenal, junto con cuadros de pubertad precoz en grado variable (3). Algunos de los defectos enzimáticos en la síntesis del cortisol/testosterona cursan con pseudohermafroditismo masculino, que se presenta en ausencia de otras patologías (17/20 liasa, 17` hidroxiesteroid-dehidrogenasa) (2,8), o junto con cuadros de insuficiencia adrenal o nefropatía pierde sal e hipertensión (3` hidroxiesteroiddehidrogenasa, 17_ hidroxilasa). Todos ellos se transmiten en forma autosómica recesiva, y en general se presentan como cuadros de genitales ambiguos al nacimiento, con grados variables de virilización/feminización en la pubertad, que a menudo condicionan cambios de sexo en ese momento o tratamientos quirúrgico/hormonales.

Anomalías en la acción de los andrógenos a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona: mutaciones del gen de la 5_ reductasa-2. La testosterona es sintetizada en el testículo, pero en sus células diana es convertida en un metabolito más activo, la dihidrotestosterona (DHT), por acción del enzima 5_ reductasa-2. Mutaciones en el gen de este enzima impiden la formación de DHT a partir de testosterona (8). Como la testosterona regula negativamente la producción de HL en la hipófisis, ésta presenta también niveles normales, y no se produce un exceso ni de testosterona ni de estrógenos. La presencia de niveles norma-

APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS

295

les de testosterona y la ausencia de DHT y de hiperestrogenismo son los que condicionan el fenotipo del cuadro, ya que la testosterona es responsable de la formación durante la vida embrionaria de estructuras testiculares (epidídimo, vasos deferentes y vesícula seminal) a partir de los conductos wolffianos mientras que la DHT es la responsable de la masculinización de genitales externos y de los derivados del seno urogenital, que en su ausencia tienen aspecto femenino. Así, estos pacientes tienen un fenotipo externo general femenino con una falsa vagina, clítoromegalia/hipospadias y testículos abdominales o inguinales, pero en ausencia de útero y trompas de Fallopio y en ausencia de ginecomastia. En la pubertad estos sujetos pueden presentar un grado variable de virilización en respuesta a la testosterona producida, que pueden condicionar cambios de sexo (si fueron educados como niñas) y/o tratamientos hormonales y quirúrgicos en ese momento. Los pacientes presentan niveles normales de testosterona, HL y estrógenos, y ausencia o bajo nivel de DHT. La actividad enzimática reducida puede demostrarse en biopsias tisulares o en cultivos de fibroblastos, y la presencia de mutaciones puede mapearse directamente por aislamiento y secuenciación del ADN de los 5 exones del gen, siendo las mutaciones más frecuentes cambios puntuales localizados en cualquiera de los exones. b) Resistencia a la acción de los andrógenos: mutaciones del gen de su receptor Mutaciones del gen del RA causan una resistencia a la acción de los andrógenos, y ocasionan el llamado síndrome de feminización testicular (Tfm) o de insuficiencia androgénica (1). El gen del RA se encuentra en el cromosoma X, por lo que los cuadros clínicos de pseudohermafroditismo masculino producidos por mutaciones del gen de RA se presentan como cuadros ligados al sexo, con afectación clínica únicamente en varones y siendo las hembras portadoras asintomáticas. Las mutaciones del gen del RA afectan la diferenciación sexual masculina andrógeno-dependiente en diversos grados (9). Existen cuadros severos de insensibilidad de andrógenos que presentan un fenotipo externo femenino completo, incluyendo una vagina corta y cerrada. Se encuentran testículos, que pueden ser abdominales, inguinales o en los labios mayores, en ausencia de otros órganos sexuales internos. En los casos parciales el fenotipo varía en un espectro desde cercano al femenino hasta el masculino normal con signos de poca virilización, que incluyen o no la presencia de ginecomastia, junto con hipospadias y criptorquidia. Estas formas parciales pueden dividirse en varios cuadros según la forma de presentación, que van desde el síndrome de Reifenstein hasta formas que se presentan únicamente como varones con azoospermia, o muy leves como varones normales fértiles con baja virilización. El grado de afectación está en relación con la actividad del RA: en las formas graves el RA está completamente inactivado, y en las parciales o leves existe una actividad residual variable (1). Sin embargo, se han descrito diferentes niveles de afectación clínica entre sujetos de la misma familia que portan diferentes mutaciones, o en individuos no relacionados que presentan la misma mutación. Existen también descripciones de cuadros de pseudohermafroditismo 46,XY oca-

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

sionados por una mutación puntual en el RA producida de novo en el individuo afectado, que presenta un mosaicismo tisular (10). Se han descrito también casos de mutaciones somáticas del gen RA en cáncer de próstata metastásicos, en los que se produce un RA con afinidad más relajada, y que puede ser anormalmente estimulado por otros ligandos (9). Finalmente, aunque no produce un cuadro de pseudohermafroditismo, es también relevante la demostración de que la anormal expansión de una determinada región de poliglutaminas en el primer exón (dominio de transactivación) del RA es la causante de la atrofia muscular espino-bulbar ligada al sexo (síndrome de Kennedy ) (11). En pacientes con mutaciones en el RA existe un defecto de inhibición de la producción hipofisaria de HL por la testosterona circulante. El patrón hormonal característico incluye por tanto niveles plasmáticos elevados de HL, que produce un excesivo nivel de testosterona y de estrógenos. La actividad del RA presente in vivo en pacientes afectos de IA se comprueba de diversas formas, que incluyen el cálculo de la asociación máxima A-RA y de las constantes de asociación y disociación (Bmax, la Kd) del andrógeno al RA, así como el cálculo de la termolabilidad de la formación de los complejos A-RA. La mutación se demuestra, como en el caso de los otros defectos genéticos, aislando el ADN de los exones/intrones del RA mediante técnicas de PCR y por posterior secuenciación de los fragmentos amplificados. Por último, la introducción y expresión de la forma mutante del receptor en células eucariontes (que no lo expresan espontáneamente) permite la demostración final de la causalidad de la mutación. El receptor de andrógenos es una proteína nuclear, que actúa como un factor de transcripción, y que pertenece a la familia de los receptores esteroideos. Se trata de una familia de proteínas que presentan una estructura similar. Están compuestas por diferentes dominios que guardan una importante homología entre los distintos componentes de la familia: Un dominio carboxi-terminal para la unión a sus correspondientes ligandos (dominio de unión hormonal), un dominio central, para la unión al ADN (dominio de unión al ADN, con dos regiones «Zinc finger») a través de secuencias específicas de reconocimiento que se encuentran en sus genes diana (secuencias de reconocimiento esteroideo, SRE), y un dominio amino-terminal, más variable, para la unión de diferentes factores de transcripción que modulan o regulan su actividad (dominio de transactivación). Estos receptores actúan como dímeros (en general homodímeros), o tetrámeros. Los receptores esteroideos se encuentran normalmente en el núcleo de las células diana, donde las hormonas esteroideas llegan por difusión a través de la membrana. La unión a sus ligandos produce un cambio conformacional en los receptores, que exponen los sitios específicos para dimerización y para unión al ADN, de forma que el receptor adquiere así su forma activa, capaz de activar los genes que presenten sus SRE. Existen modelos animales del síndrome de feminización testicular. En concreto las mutaciones del RA causantes de estos cuadros en rata (12) y en ratón (13) fueron descritas y caracterizadas en el momento de identificarse la secuencia de los genes correspondientes, y son representativas de dos de los posibles tipos y localizaciones de las mutaciones humanas. En el caso del modelo de rata (12), la mutación se encuentra en

APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS

297

la región de unión al ligando, afecta a un residuo crítico en esta unión y produce un cuadro de feminización, en presencia de una proteína con muy baja afinidad por sus ligandos. Un buen número de las mutaciones descritas en humanos son semejantes a ésta, aunque afectan a diferentes residuos de aminoácidos, lo que condiciona si se mantiene una cierta actividad hormonal residual y el fenotipo correspondiente. En el caso del modelo de ratón (13), la mutación se encuentra en la región amino-terminal de transactivación de la proteína, y se trata de una deleción puntual de una base que produce un corrimiento en el marco de lectura y origina una proteína truncada, que carece de región de unión a la hormona y al ADN. Sin embargo, se ha demostrado que el ARN mensajero (ARNm) que presenta esta mutación es capaz de traducir una proteína más corta originada por iniciación interna de la traducción en un lugar de la secuencia del ARNm posterior al codón de terminación. Este dato concuerda con la descripción de una proteína RA más corta en el ratón Tfm y con el hecho de que en sujetos normales se ha demostrado la presencia de una proteína RA más corta, en cantidades muy inferiores a la forma completa, y con menor actividad funcional (14). Estas mutaciones han sido también encontradas en humanos, aunque el tipo (inserción o deleción con cambio en la fase e interrupción de lectura, o mutación puntual con cambio de residuo) y posición de la mutación son variables, lo que condiciona la actividad residual del RA y por tanto su fenotipo. De hecho, existe una base de datos en la que se reflejan todas las mutaciones descritas en humanos hasta la fecha, a la que se puede acceder por internet (15). En el caso de mutaciones puntuales con cambio de residuo, si la mutación está en el dominio de transactivación la proteína resultante puede unir los ligandos normalmente y reconocer las SRE en sus genes diana, pero no ser capaz de activarlos. Si la mutación está en el dominio de unión a los ligandos o al ADN de sus genes diana, tampoco podrá activarlos o lo hará ineficientemente. En el caso de proteínas truncadas, la posible actividad del RA dependerá de la presencia de la forma corta del RA, que a su vez solo será posible si la mutación de parada se encuentra en el primer exón antes del lugar de reiniciación interna.

Mutaciones de los genes implicados en la acción de la hormona antimulleriana En el feto masculino los derivados del conducto de Muller regresan durante la vida fetal por acción de la MIS, producida por las células de Sertoli fetales. Los defectos en el gen de esta hormona o en el de su receptor causan cuadros característicos en los que estas estructuras han diferenciado hacia trompas y útero. Se trata de varones con fenotipo externo masculino, que virilizan en la pubertad, pero que presentan adicionalmente útero y trompas, y constituyen el llamado síndrome de conductos mullerianos persistentes (16). Los testículos pueden ser intraabdominales o estar en el canal inguinal, en el escroto o en hernias inguinales. Estos sujetos presentan niveles normales de HL, testosterona y estrógenos. La enfermedad se produce en forma familiar (autosómica recesiva) o por mutaciones esporádicas en sujetos sin historia familiar.

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Recientemente se han descrito otras mutaciones que afectan la producción de MIS. La transcripción de MIS está regulada positivamente por el receptor nuclear SF-1 (steroidogenic factor-1). La unión de este factor al gen de MIS es activada a su vez por el factor WT-1 (Wilms tumor inhibiting factor), e inhibida por acción del factor DAX-1 (Dossage sensitive sex reversal gene 1). Defectos en los genes de los factores SF-1 y WT-1 condicionan una menor transcripción de MIS. El factor SF-1 controla también el desarrollo de los ejes hipotalámico-pituitariogonadal y adrenal, y su mutación produce en ambos sexos insuficiencia adrenal, junto con el cuadro de pseudohermafroditismo masculino (17). El gen WT-1 está compuesto por 10 exones que codifican una proteína con cuatro motivos «Zinc finger» con actividad reguladora transcripcional positiva de ciertos genes y reguladora negativa de tumores. Se pueden producir cuatro isoformas por edición (splicing) diferencial, una de las cuales (producida edición alternativa en el intrón 9) presenta tres aminoácidos extra entre dos de los dominios «Zinc finger» (isoforma KTS). Las mutaciones en el gen WT-1 se asocian a patología neoplásica (tumor de Wilms, mesotelioma, leucemias, carcinoma de mama) o no neoplásicas, dando lugar a cuadros sindrómicos característicos. Entre éstos destacaremos: 1) el Síndrome de Denys Drash, que asocia nefropatía mesangial difusa precoz, con cuadros de pseudohermafroditismo masculino y tumor de Wilms y que está ocasionado por mutaciones puntuales heterocigotas del gen WT-1, en los exones 8 y 9 (región Zinc finger 2 y 3), que producen proteínas truncadas que se comportan como dominante negativo, como se demuestra en el modelo de ratón transgénico en el que el animal heterocigoto reproduce la enfermedad (18); y 2) el Síndrome de Frasier, que asocia glomeruloesclerosis focal-segmental, gonadoblastoma y pseudohermafroditismo masculino, y que está ocasionado por mutaciones en el sitio de edición del exón 9 de la proteína WT-1, impidiendo la producción de la forma KTS de la proteína (19). Finalmente, se ha demostrado también la presencia de este tipo de mutaciones del gen WT-1 en niñas heterocigotas que presentan cuadros de glomeruloesclerosis focal-segmental de aparición temprana (20).

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APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS

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21 Patología molecular de la neoplasia endocrina múltiple (MEN-1, MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma medular de tiroides M.a J. Lorenzo Benayas

Introducción La neoplasia endocrina múltiple (MEN) (1) es un síndrome cancerígeno que se caracteriza por la presencia de tumores en dos o más glándulas endocrinas en el mismo paciente. En un principio se conocía con el nombre de adenopatia endocrina múltiple, pero debido a que algunos pacientes desarrollan verdaderos tumores o hiperplasia de la glándula endocrina afectada, finalmente se denominó MEN. Existen dos tipos principales de neoplasia endocrina múltiple, la de tipo 1 (MEN 1) y la de tipo 2 (MEN 2) que se diferencian en las glándulas endocrinas afectadas (Tabla 21.1). El MEN 1, también denominado síndrome de Wermer, se caracteriza por el desarrollo de hiperplasia o tumores en las glándulas paratiroideas, en las células de los islotes pancreáticos y en la pituitaria anterior (1,2). El MEN 1 se hereda de una forma dominante, se localiza en el cromosoma 11q13 (3), y el gen responsable se ha identificado recientemente (4). El MEN 2, también conocido con el nombre de síndrome de Sipple, se caracteriza por la presencia de tumores en las células C de tiroides (carcinomas medulares de tiroides, MTC), en la médula adrenal (feocromocitomas, Pheo) e hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH) (1,5). El gen que predispone al MEN 2 es el proto-oncogen ret, localizado en el cromosoma 10q11.2, que codifica a un receptor de membrana con actividad tirosina quinasa (57). Aunque el MEN 1 y el MEN 2 son síndromes diferentes, en algunos pacientes se ha descrito la presencia de tumores asociados a ambos síndromes, por ejemplo, tumores pituitarios y feocromocitomas. No se sabe si esta coincidencia se debe al azar (8) o si es un nuevo tipo de MEN “mixto”.

302

Tabla 21.1.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Glándulas endocrinas afectadas en el síndrome MEN

MEN 1

MEN 2

Paratiroides

Células C del tiroides

Pituitaria anterior

Médula Adrenal

Islotes pancreáticos

Paratiroides

Corteza adrenal

Neoplasia endocrina múltiple de tipo 1 Características clínicas Las manifestaciones clínicas del MEN 1 se relacionan con la glándula en la que se va a desarrollar la hiperplasia o los tumores y a sus productos de secreción (2,9,10). El hiperparatiroidismo primario es la característica clínica más común y aparece en más del 95 % de los pacientes con MEN 1. La incidencia de tumores en las células de los islotes pancreáticos en pacientes con MEN 1 varía de un 30 % a un 80 % dependiendo de las series de pacientes analizados. La mayoría de estos tumores producen cantidades excesivas de hormonas, como por ejemplo, gastrina, insulina, glucagón o péptido intestinal vasoactivo (VIP) y están asociados con distintos síndromes clínicos. Los tumores secretores de gastrina, los gastrinomas, representan cerca del 50 % de los tumores de los islotes pancreáticos asociados a MEN 1 y son la principal causa de muerte en pacientes con MEN 1. Los tumores de las células secretores de insulina, los insulinomas, representan el 30 % de todos los tumores pancreáticos que presentan los pacientes con MEN 1. Y, en menor proporción, los pacientes con MEN 1 pueden también desarrollar tumores secretores de glucagón, los glucagonomas; tumores secretores de VIP, VIPomas y tumores secretores de polipéptido pancreático, Ppomas. La incidencia de tumores pituitarios en pacientes con MEN 1 varia entre un 15% a un 90 % dependiendo de la serie de pacientes estudiada (9). Aproximadamente el 60 % de los mismos secretan prolactina, el 25 % secretan hormona de crecimiento, el 3 % secretan adrenocorticotropina y el resto son no funcionales. Además de estos tumores, los pacientes con MEN 1 pueden desarrollar tumores carcinoideos en el bronquio, tracto gastrointestinal, páncreas y timo; tumores en la corteza adrenal, lipomas, tumores tiroideos, angiofibromas faciales y colagenomas.

Bases moleculares del MEN 1 El gen causante del MEN 1 está localizado en el cromosoma 11q13 (3). Es un gen supresor de tumores, está formado por 10 exones con una región codificadora de

PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA NEOPLASIA ENDOCRINA MÚLTIPLE

303

1830 pb y codifica a una proteína de 610 aminoácidos, a la que se ha denominado MENIN4. Hasta la fecha se han descrito 262 mutaciones diferentes en el gen responsable del MEN 1 (11). El 56 % de estas mutaciones se deben a pequeñas delecciones o inserciones, de las cuales el 48 % producen un desplazamiento en la pauta de lectura. El 22 % son mutaciones puntuales con cambio de sentido y el 5 %, restante, se caracterizan por ser mutaciones que modifican los sitios de corte y empalme. El 75 % de estas mutaciones producen la inactivación del gen, lo que sugiere que el gen responsable del MEN 1 es un gen supresor de tumores. Por otra parte, las mutaciones presentes en el gen MEN 1 no sólo se caracterizan por ser muy diversas sino también por encontrarse muy repartidas a lo largo del gen. Diferentes estudios clínicos han puesto de manifiesto que no existe una correlación entre las diferentes mutaciones presentes en el gen MEN 1 y las manifestaciones clínicas asociadas al MEN 1. Así, por ejemplo, un estudio realizado en 5 familias con MEN 1, caracterizadas por la presencia de la misma mutación en el gen MEN 1 (una delección de 4 pares de bases en los codones 210 y 211), demostró que aunque todos los miembros de las diferentes familias desarrollaron tumores de las paratiroides, sólo los miembros de las familias 1, 3, 4 y 5 desarrollaban gastrinomas, mientras que los miembros de la familia 2 desarrollaban insulinomas. Por otra parte, toda las familias, excepto la 1, presentaban prolactinomas, mientras que sólo los miembros de la familia 1 desarrollaron tumores carcinoideos. Por otra parte, también se ha mostrado que miembros pertenecientes a una misma familia pueden desarrollar tumores diferentes.

La proteína MENIN El gen causante del MEN 1 codifica a una proteína denominada MENIN formada por 610 aminoácidos, de localización nuclear (12) y de función desconocida. La mayoría de las mutaciones en el gen MEN 1 originan proteínas MENIN truncadas, es decir, más cortas e inactivas, y carentes de las señales de localización nuclear presentes en el extremo carboxilo terminal. Como ya hemos mencionado la función de la proteína MENIN se desconoce, pero su localización nuclear hace pensar que esta proteína tenga un papel cómo regulador de la transcripción o que intervenga en la replicación del DNA o en el ciclo celular.

Detección del MEN 1 Aunque el MEN 1 es una enfermedad poco común, su diagnóstico es importante ya que al heredarse de una forma autosómica dominante el 50 % de la descendencia de un paciente con MEN 1 tiene la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Aunque se puede realizar el análisis genético del MEN 1 para identificar a los individuos portadores de la mutación y, en consecuencia, con un elevado riesgo de

304

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

padecer la enfermedad, la ausencia aparente de correlación entre el genotipo y el fenotipo, junto con la gran diversidad de mutaciones presentes en la región codificadora del gen MEN 1 hace que el análisis mutacional para el diagnóstico de MEN 1 no se esté llevando a cabo. En consecuencia, su diagnóstico se está realizando mediante estudios clínicos, bioquímicos y radiológicos.

Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 Características clínicas La neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 (MEN 2) es un síndrome cancerígeno que se hereda de una forma autosómica dominante y que se caracteriza por la presencia de tumores y de anomalías en el desarrollo en cuatro tejidos diferentes: las células “C” del tiroides, la médula adrenal, las paratiroides y el plexo nervioso autonómico intestinal. Dependiendo del tejido afectado, el MEN 2 se ha subdividido en tres variedades clínicas diferentes, el MEN 2A, el MEN 2B y el cáncer medular de tiroides familiar (FMTC) (5,13) Tabla 21.2. El MEN 2A se caracteriza por la presencia tumores en las células “c” del tiroides denominados carcinomas medulares de tiroides (MTC), en las células de la médula adrenal denominados feocromocitomas (PHEO) y por el desarrollo de hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH). El MEN 2B se caracteriza por la presencia de MTC, de PHEO y de determinadas anomalías asociadas al desarrollo Tabla 21.2. Finalmente, el FMTC se caracteriza sólo por la presencia de MTC. Todos los pacientes con MEN 2 desarrollan MTC. Los feocromocitomas se desarrollan en un 50 % de los pacientes con MEN 2A y MEN 2B y solo un 25 % de los pacientes con MEN 2A desarrollan hiperparatiroidismo.

Tabla 21.2.

Variedades clínicas del MEN 2

Tumores asociados

Fenotipo MEN 2A

MEN 2B

FMTC

MTC

+

+

+

PHEO

+ (50 %)

+ (50 %)

–

PTH

+ (25 %)

–

–

AD

–

+

–

* Hiperplasis del ganglio entérico, neuromas de la mucosa oral y conjuntiva. anomalias músculoesqueléticas.

PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA NEOPLASIA ENDOCRINA MÚLTIPLE

305

Bases moleculares del MEN 2 El gen causante del MEN 2 es el proto-oncogen ret que se encuentra localizado en el cromosoma 10q11.26. Mutaciones germinales en el proto-oncogen ret se han encontrado en la mayoría de los pacientes con MEN2 (6,7,14,15). El proto-oncogen ret está formado por 21 exones y codifica a un receptor de membrana con actividad tirosina quinasa denominado RET (Fig. 21.1). RET está formado por una región extracelular, una región transmembrana y una región intracelular. La región extracelular se caracteriza por poseer un dominio de homología a cadherinas (Cad) y una región rica en el aminoácido cisteina (Cys). La región intracelular contiene el dominio con actividad tirosina quinasa, que se encuentra dividido en dos regiones TKa y TKb mediante un pequeño péptido formado por 28 aminoácidos. Estudios clínicos ponen claramente de manifiesto que las variedades clínicas del MEN 2 están fuertemente asociadas a diferentes mutaciones puntuales presentes en el proto-oncogen ret, que producen la sustitución de aminoácidos específicos. Todas las mutaciones son dominantes a escala celular y producen la activación constitutiva del receptor (16).

Codón Mutado

Variedad Clínica

Cad MEN 2A MEN 2B FMTC Cys

609, 611, 618, 620, 630, 631, 634 98% (634)

-

88%

-

+ (4%)

TM

TKa

TKb

768,790/791, 804,844,891

-

883

-

3%

-

918

-

94%

-

Figura 21.1. Características principales de la proteína codificada por el proto-oncogen ret y localicación de las mutaciones germinales en las diferentes variedades clínicas del MEN 2. Cad, dominio parecido a cadherinas; Cys, región rica en cisteinas; TM, región transmembrana; TK, dominio con actividad tirosina quinasa

306

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Las mutaciones presentes en el proto-oncogen ret se pueden dividir en tres grupos (Fig. 21.1): a) Mutaciones que afectan a los residuos de cisteínas, presentes en el dominio extracelular del receptor, y que están codificadas por los codones 609, 611, 618, 620, 630 y 634. Estas mutaciones son las responsables del 98 % de los casos de MEN 2A y de la gran mayoría de los casos de FMTC. b) Mutaciones que afectan a los codones 768, 790, 791, 804, 844 y 891, presentes en el dominio con actividad tirosina quinasa del receptor y que son responsables de aproximadamente un 4% de los casos de FMTC. c) Mutaciones que afectan a los codones 883 y 918, presentes también en el dominio con actividad tirosina quinasa del receptor, y que están asociadas exclusivamente a pacientes con MEN 2B. Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2 Estudios bioquímicos y moleculares utilizando construcciones de DNA que contenían el gen ret normal y el mutado en el MEN 2A (Cys 634 Arg) o en el MEN 2B (Met 918 Thr) han puesto de manifiesto que estas mutaciones conducen a la activación constitutiva del receptor (16,17). Las mutaciones en cisteinas presentes en el MEN 2A activan al receptor porque causan la dimerización del mismo en ausencia del ligando (16,17). Estudios clínicos, muestran que existe una gran correlación entre el codón de cisteina mutado y el fenotipo asociado al MEN 2A (14). De hecho, las mutaciones que implican al codón 634 están presentes en la mayoría de los pacientes con MEN 2A que desarrollan, además de MTC, feocromocitomas e hiperplasia de las paratiroides, mientras que mutaciones presentes en los codones 609, 611, 618 y 620 son más frecuentes en familias con MEN 2A que desarrollan MTC e hiperplasia de las paratiroides o en familias con FMTC. Las mutaciones presentes en el dominio tirosina quinasa de ret , también activan al receptor en ausencia del ligando, pero en este caso no producen la dimerización constitutiva del mismo (16,17), sino que conducen a cambios en su conformación responsables de su activación. La mutación Met 918 Thr, que tiene lugar en la mayoría de los pacientes con MEN 2B, no sólo activa de forma constitutiva al receptor, sino que también cambia su especificidad por el sustrato (18). Así, se ha comprobado que RET 2B fosforila de forma preferente a sustratos específicos de proteínas citosólicas con actividad tirosina quinasa, mientras que el RET normal fosforila a sustratos específicos de receptores de membrana con actividad tirosina quinasa (18). Aunque en la actualidad no se conoce el por qué diferentes mutaciones en ret están asociadas a diferentes fenotipos, se piensa que puede ser debido a uno o varios de estos mecanismos: a) Activan a RET con diferente intensidad. b) Activan a RET en un tiempo erróneo.

PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA NEOPLASIA ENDOCRINA MÚLTIPLE

307

c) Activan a RET en un tejido no adecuado. d) Activan rutas de transducción de señales diferentes. De hecho, estudios realizados in vitro sugieren que el fenotipo asociado a pacientes con FMTC puede estar relacionado con una pequeña activación del receptor, capaz de inducir solamente el desarrollo de MTC. Por otra parte, se ha descrito que las mutaciones presentes en pacientes con MEN 2A y MEN 2B son capaces de producir una gran activación del receptor, lo que induciría posiblemente la aparición de feocromocitomas en estos pacientes. Finalmente, las anomalías asociadas al desarrollo presentes en pacientes con MEN 2B se explicarían por la capacidad que tiene el receptor mutado, RET 2B, de activar nuevas rutas de señalización. Lo que carece de explicación es la ausencia de hiperparatiroidismo en pacientes con MEN 2B.

Detección del MEN 2 Ya que el número de mutaciones distintas en ret responsables del MEN 2 son pequeñas, el análisis genético es el método más efectivo y menos invasivo para detectar a los portadores genéticos asintomáticos (19,20), siendo éste el método de diagnóstico que se utiliza preferentemente en clínica. Siempre se aconseja que el análisis genético se realice a niños de corta edad. Con la realización de este test genético, los miembros no portadores de la mutación, así como sus descendientes, podrán ser excluidos de los estudios bioquímicos a los que tienen que ser periódicamente sometidos todos los miembros pertenecientes a familias con un historial de MEN 2 claramente definido. Por otra parte, los portadores genéticos se considerarán de alto riego de desarrollar un MTC, y estarán sujetos a las decisiones médicas pertinentes.

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308

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

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22 Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congénito. Terapia génica en enfermedades tiroideas Pilar Santisteban

Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congénito El hipotiroidismo congénito primario es una enfermedad con una incidencia de 1/ 3.000-4.000 recién nacidos. Antes de 1974, el hipotiroidismo congénito era una de las causas más frecuentes de retraso mental en los niños. La introducción de programas de screening ha llevado al diagnóstico precoz y al tratamiento con hormonas tiroideas con la consiguiente reducción del daño mental. Todos los casos de hipotiroidismo congénito cursan con niveles elevados de tirotropina (TSH) como consecuencia de la producción de niveles reducidos de hormonas tiroideas. Aunque existen casos de hipotiroidismo congénito causados por defectos hipotalámicos o hipofisarios, en esta revisión nos vamos a centrar sólo en las alteraciones de la propia glándula y más concretamente en la disgenesia tiroidea ya que el 85% de los casos de hipotiroidismo congénito son debidos a este problema. Dentro de los casos de disgenesia, un 35-40% corresponde a ausencia de la glándula (agenesia tiroidea), un 30-45% a una glándula pequeña y situada sublingualmente (ectopia tiroidea) y en un 5% la glándula es extremadamente pequeña (hipoplasia tiroidea). La mayoría de estos casos son esporádicos, aunque se han descrito algunos casos de disgenesia hereditaria familiar. Los fenotipos observados en la disgenesia sugieren como causa principal alteraciones en la organogénesis de la glándula tiroidea. La morfogénesis de esta glándula comienza con la formación de un brote de origen endodermal en la región posterior del suelo de la faringe. Esta formación, que va a dar lugar a las células foliculares productoras de hormonas tiroideas, migra dorso-caudalmente hasta

310

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

alcanzar la pared anterior de la tráquea, donde emerge con otros tipos celulares. Como causas más específicas de la disgenesia se han definido las alteraciones en el desarrollo del tiroides y las alteraciones en los genes que afectan a la síntesis de las hormonas tiroideas. El conocimiento que se tiene actualmente sobre las causas de las disgenesias tiroideas ha surgido como consecuencia de la identificación y clonación de los genes que codifican por los factores de transcripción tiroideos. Para entender la implicación de estas proteínas en la morfogénesis tiroidea vamos a dividir este trabajo en tres apartados: 1) Factores de transcripción específicos de tiroides, 2) Su expresión durante el desarrollo de la glándula tiroidea, 3) Función de los factores de transcripción tiroideos: Generación de ratones knock-out y 4) Factores de transcripción tiroideos en el hipotiroidismo congénito.

Factores de transcripción específicos de tiroides Los factores de transcripción son proteínas nucleares cuya función es esencial en la regulación de la expresión génica uniéndose a secuencias específicas de ADN en los promotores de los genes que regulan. Tres factores de transcripción específicos de tejido tiroideo han sido identificados y clonados (1-3). Estos factores denominados Thyroid Transcription Factor 1, 2 (TTF-1, TTF-2) y Pax-8 se unen a secuencias de ADN de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina (Tg), Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y el transportador de yodo dependiente de sodio (Sodium Iodide Symporter o NIS) (Fig.1). Su característica más importante es que son genes homeóticos que pertenecen a familias de proteínas con dominios de unión al ADN muy conservados y que tienen una importancia decisiva en procesos de desarrollo, proliferación y diferenciación celular.

1. Factor de transcripción TTF-1 Este factor de transcripción tiroideo fue el primero en clonarse (1). Se une a los promotores de los genes Tg, TPO, TSH-R y NIS activando su transcripción (Fig.22.1). Por ello su expresión es decisiva para que estos genes se expresen en las células foliculares tiroideas. Aunque inicialmente se identificó solo en tiroides (1), hoy se sabe que se expresa también en las células parafoliculares (células C) y en las paratiroideas (4), en el cerebro embrionario de rata y en el pulmón embrionario y adulto (5, 6). El hecho de que este factor se expresase en otros tejidos, hizo a los investigadores de las distintas áreas estudiar más en detalle su función. En las células C regula la expresión del gen de la calcitonina y se ha descrito como un posible sensor de calcio (7). La función extratiroidea más importante de este factor es la que ejerce en el pulmón. Se ha demostrado que este factor se une a los promotores de los genes que codifican por las proteínas surfactantes de pulmón (SP) A, B y C y por la proteína secretada por las células de la Clara (CCSP) activando su transcripción (6).

MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN EL HIPOTIROIDISMO…

–1950

–170

–100

+1

Pax-8

A UF

TTF-1 –5500

Pax-8

TTF-1

–5200

–150

–4200

–3100

Tg

TATAAAA

TTF-1 –120

TTF-2 –90

TTF-1 –60

Pax-8

TTF-1

+1

–30

NF-1 TTF-1

311

TPO

TATATG

TTF-2 HNF3`

–210 –200

TTF-1 –100

–68 TSH-R

TTF-1 TTF-1 TTF-1 TTF-1 CREL-BF –2495 –2260

IRE TTF-1 CREB SSBPs –550 –420

–245

+1

–124

rNIS

AATATAT

Pax-8

Pax-8

A UF

NTF-1

TTF-1

CREB

NTF-1

NF-1

CREL-BF

TTF-1

TTF-2

IRE

Pax-8

SSBPs

Figura 22.1. Representación esquemática de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina (Tg), Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y Transportador de yodo (NIS). Se indican las posiciones a las que se unen tanto los factores de transcripción específicos de tiroides (TTF-1, TTF-2 y Pax-8) como factores ubicuos (UFA, NF-1) y factores dependientes de la inducción por insulina (IRE) o AMPc (CREL-BF y CREB). Para mas información véase referencias 9 y 20.

El desarrollo proximal del tiroides y el pulmón, junto con su procedencia común de origen endodérmico, sugiere que la expresión de TTF-1 pueda ser la respuesta a una activación posicional específica del endodermo anterior. El gen del factor TTF-1 es un gen homeo-box que se ha denominado Tift -1 y que se localiza en el cromosoma 14 humano y en el cromosoma 2 de ratón. 2. Factor de transcripción TTF-2 El factor TTF-2, a diferencia de TTF-1, se une y transcribe sólo los genes de Tg y TPO (Fig.1). Su clonación (2) y los diferentes estudios de expresión han indicado que este factor se expresa en el tiroides embrionario y adulto solo en las células foliculares y no en las células C. También se expresa, durante el desarrollo embrionario, en la hipófisis anterior. El gen del factor TTF-2 es un gen de la familia fork-head que se ha denominado Tift-2 y se localiza en el cromosoma 9 humano y en el cromosoma 4 de ratón. 3. Factor de transcripción Pax-8 Este factor se une a los promotores de Tg, TPO y NIS, compartiendo las secuencias de unión con TTF-1 (Fig.22.1). Además de en tejido tiroideo, se

312

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

expresa en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y en el sistema excretor (riñón) de embriones y adultos. Al igual que TTF-2, el gen Pax8 no se expresa en las células C del tiroides. El gen del factor Pax-8, es un gen paired-box que se localiza en el cromosoma 2 humano y en el cromosoma 2 de ratón.

Desarrollo de la glándula tiroidea y expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 Como se comentó en la introducción, las células foliculares tiroideas proceden de la invaginación del endodermo faringeo a partir del día 8-8.5 del desarrollo embrionario del ratón y de la rata (8). El primordio tiroideo migra hasta alcanzar su destino final delante de la traquea entre los días 13-14 del desarrollo embrionario de ambos animales. Solamente en el día 15 embrionario (E15), una vez completado el proceso de migración, las células foliculares se diferencian y comienza a detectarse la función tiroidea. Los estudios de expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en rata, demuestran que estos factores se expresan muy al comienzo de la morfogénesis tiroidea en el día embrionario (E) 8.5, en aquellas células epiteliales cilíndricas que forman una invaginación en el suelo de la faringe primitiva al nivel del primer y segundo arco branquial y que posteriormente proliferan y migran hacia abajo. Sin embargo, en contraste con la aparición temprana de los anteriores factores, la expresión de sus genes dianas Tg, TPO, TSH-R y NIS aparece varios días después en el día embrionario E15 (5). Así podemos decir que la expresión de los factores de transcripción específicos de tiroides antecede a la expresión de los marcadores específicos de la función tiroidea. Ello les ha definido como los genes responsable no solo en la organogénesis del tiroides sino también de los procesos de diferenciación (9). El retraso temporal entre la expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 y la de sus genes diana durante el desarrollo del tiroides en la rata sugiere que deben de existir otra serie de eventos adicionales, aún no identificados, que ayuden a la determinación del fenotipo tiroideo diferenciado. Esos eventos deben ocurrir entre los días E13 y E15. En humanos, el proceso de organogénesis también está bien definido y en la Tabla 22.1 se recoge un resumen del conocimiento que se tiene actualmente sobre la expresión de los anteriores factores de transcripción y el proceso de organogénesis [tomado de Macchia et al. (10)].

Función de los factores de transcripción tiroideos: Generación de ratones knock-out El estudio de la función de estos factores in vivo ha sido consecuencia de la reciente generación de ratones knock-out. Generando ratones en los que se anula la expresión de los factores de transcripción tiroideos se puede conocer su fun-

28 d

6-7 s

8s

13-14 s

E 9.5

E 11.5

E 15.5

E 17.5

Expansión de la población de células diferenciadas

Final de la migración. Inicio de las funciones diferenciadas

Supervivencia/Proliferación de las células precursoras

Migración

+

+

+

+

–

TTF-1

+

+

+

+

–

Pax-8

(+?)

+

+

+

–

TTF-2

+

+

–

–

–

Genes tiroideos

+

+

–

–

–

Diferenciación funcional

Expresión de los factores de transcripción tiroideos durante la organogénesis del tiroides. E: Estado embrionario. d: día, s: semana. Los genes tiroideos son Tg, TPO, TSH-R y NIS. La expresión de los factores de transcipción se ha estudiado sólo en ratón. La interrogación significa que en el caso de TTF-2 quedan estudios por hacer y que se ha descrito una down-regulación en ese periodo embrionario (Ref. 2) de la que aún no se conoce en detalle su significado.

20 d

E 8.5

Formación

Formación de la bolsa primitiva tiroidea

Organogénesis del tiroide.

Estado embrionario Ratón Humano

Tabla 21.1.

MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN EL HIPOTIROIDISMO… 313

314

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

ción estudiando el fenotipo del ratón al que se le ha anulado el gen motivo de estudio. Así la generación de un ratón en el que el gen del factor TTF-1 se ha anulado (knock-out de TTF-1) (11) ha indicado la importancia decisiva de este factor en la morfogénesis del tiroides. El ratón homocigoto nulo para TTF-1 (Tift1 -/-) presenta agenesia de tiroides y falta total de desarrollo pulmonar con desarrollo anormal de las áreas ventrales del cerebro y ausencia de hipófisis. El animal se desarrolla en el útero materno y muere al nacer por falta de proteínas surfactante y por tanto incapacidad para respirar. La agenesia de tiroides, tanto de células foliculares como parafoliculares, demuestra la importancia decisiva de esta factor en el desarrollo del tiroides. De la misma manera, la generación de un ratón en el que se ha anulado la expresión de Pax-8 (Pax-8 -/-) ha indicado que esta factor es decisivo en la formación de las células foliculares y que no afecta al desarrollo de las células parafoliculares. Su expresión es siempre concomitante con la de TTF-1. El fenotipo de los ratones knock-out de Pax-8 muestra un retraso en el crecimiento y son hipotiroideos. Los animales cuando nacen presentan hipoplasia tiroidea y no se detectan folículos, muriendo al destete (12). Si durante las primeras semanas después del nacimiento se les administra hormonas tiroideas la vida de las camadas se alarga varias semanas más. Finalmente la generación de un ratón nulo para TTF-2 (Titf2 -/-) demuestra que la función de este factor es la de controlar la migración del primordio tiroideo desde su posición sublingual inicial hasta su posición final en la traquea reprimiendo la diferenciación final de las células tiroideas hasta que la migración haya tenido lugar. Hay que destacar que los ratones nulos para este factor de transcripción presenta disgenesia tiroidea (tanto ectopia como agenesia) y además paladar hendido, lo que les impide succionar durante la lactancia y mueren por falta de alimentación (13).

Factores de transcripción tiroideos en el hipotiroidismo congénito En los últimos años se ha estudiado la implicación de los factores de transcripción en patología tiroidea humana, tanto en trastornos hereditarios de la génesis glandular como en procesos de malignización y desdiferenciación tiroideos. La premisa de que TTF-1 era el principal regulador de la transcripción de Tg llevó a estudiar su posible participación patogénica en un caso familiar de bocio congénito por defecto de síntesis de Tg. Es bien conocido que los bocios congénitos son muchas veces consecuencia de defectos en el gen de Tg. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto otra de las causas posibles de la bociogénesis congénita: la expresión reducida del factor de transcripción TTF-1 (14). La paciente portadora de este defecto, estudiada a los 15 años por primera vez, presentaba un bocio de características compresivas e hipotiroidismo. Su desarrollo físico y mental habían sido, sin embargo, normales. Dos hermanos presentaban una clínica similar, lo que sugería una naturaleza recesiva de la enfermedad. Los estudios bioquímicos y molecu-

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lares del tejido tiroideo demostraron niveles muy reducidos del ARN mensajero de Tg junto a niveles virtualmente indetectables de TTF-1. Se comprobó, además, la incapacidad de las proteínas nucleares de este tejido para unirse a la secuencia consenso para el factor TTF-1 en el promotor de Tg. De forma compensatoria y a través del efecto estimulador de la TSH, los niveles de expresión de TPO se encontraban muy elevados. Si bien las causas moleculares últimas de la falta de expresión de TTF-1 no fueron determinadas. Este trabajo establece que los defectos de transcripción tiroideos pueden ser la causa de trastornos dishormonogénicos, como lo es el defecto de síntesis de Tg y no solo de defectos de disgenesia tiroidea. También se ha publicado que la haploinsuficiencia de TTF-1 (deleción de 1 de los 2 alelos del gen) origina una disfunción tiroidea leve junto a distrés respiratorio neonatal (15). El recién nacido, que presentaba una glándula in situ de tamaño normal, era eutiroideo pero mantenía niveles de TSH elevados, por lo que recibió tratamiento sustitutivo. El problema respiratorio neonatal con infecciones y atelectasias pulmonares durante la infancia, se explica por una síntesis disminuida de proteínas surfactantes del pulmón, de las que TTF-1 es un potente inductor. Son varios los trabajos que se han comenzado con objeto de estudiar el posible papel de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en los trastornos disgenésicos del tiroides que conducen a hipotiroidismo congénito. Como acabamos de explicar, el estudio del fenotipo tiroideo de los ratones a los que se ha delecionado artificialmente cada uno de estos factores de transcripción ha demostrado que los tres desempeñan un papel esencial en la morfogénesis del tiroides (11-13). Por este motivo y gracias al conocimiento actual de la secuencia completa de los genes que codifican tanto TTF-1 como Pax-8 y TTF-2, se ha comenzado el screening de mutaciones en casos de disgenesia tiroidea (agenesias, ectopias e hipoplasias) detectados en el screening neonatal del hipotiroidismo congénito. La técnica utilizada es el SSCP o detección de polimorfismos conformacionales en el ADN de cadena simple. Los primeros resultados en relación a TTF-1 han sido negativos en un total de 76 pacientes incluidos en 2 estudios distintos (16, 17). Sin embargo, recientemente se ha comunicado que mutaciones en el gen de Pax-8 son la causa de algunos casos de ectopia tiroidea e hipoplasia (18). Se estudiaron 149 pacientes con hipotiroidismo congénito y 120 controles. Uno de los pacientes con hipoplasia y tiroides sublingual presentaba niveles altos de TSH y normales de T4. Los niveles de Tg circulante eran altos lo que sugería un defecto en la organización folicular del tiroides. Era heterocigoto para una mutación en el codon 108 del exon 3 del gen Pax-8. Esta mutación crea un codon de terminación (stop codon) lo que predice la síntesis de una proteína truncada que contiene solo los 100 primeros aminoácidos del dominio paired de la proteína Pax-8. Es una mutación de novo ya que ni los padres ni los hermanos la presentaban. Un segundo paciente con hipoplasia tiroidea, altos niveles de TSH y bajos de T4 era heterocigoto para una mutación en el codón 31 del exón 2 de gen Pax-8. Los demás miembros de la familia no estaban afectados y eran homocigotos para el codón del gen normal. Finalmente se ha descrito tres miembros de una familia afectados de hipoplasia severa que tienen la misma mutación en el codón 62.

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Todas estas mutaciones conducen a una proteína Pax-8 no funcional incapaz de unirse a los promotores de los genes Tg y TPO y por tanto incapaz de transcribirlos. El 100% de concordancia entre las mutaciones de Pax-8 y la existencia de disgenesia (18) sugiere un papel causal de este gen en el hipotiroidismo congénito aunque en una minoría de los casos examinados (5 de 149). Se ha publicado recientemente, en dos hermanos no gemelos, la primera mutación de TTF-2 (19). Estos hermanos presentan además de agenesia de tiroides, paladar hendido, atresia bilateral de coanas, epiglotis bífida y cabello "erizado". Los padres eran sanos y no estaban emparentados entre si. Al recibir T4 desde el nacimiento el desarrollo físico e intelectual eran normales. La mutación detectada es una mutación sin sentido (misssense mutation) en el nucleótido 196 del codón 65 del gen humano de TTF-2. Este codón da lugar a un aminoácido muy conservado en el dominio forkhead de unión al ADN de la proteína TTF-2. Esta mutación da lugar a una proteína TTF-2 no funcional incapaz de unirse y transcribir a los promotores de los genes que regula (Tg y TPO). Hay una relación causal entre ésta mutación y la agenesia de los pacientes, siendo esta causa genética de agenesia la primera y única descrita hasta el momento. La identificación y caracterización de esta serie de factores de transcripción que participan en la génesis inicial del tiroides abre el camino hacia el conocimiento detallado del complejo programa de expresión de genes necesarios para la formación y maduración funcional de la glándula tiroidea. En conclusión, los trabajos resumidos en esta revisión sugieren que el hiportiroidismo congénito puede ser una enfermedad hereditaria. Además teniendo en cuenta los estudios de las mutaciones encontradas en los factores de transcripción TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en pacientes con hipotiroidismo congénito, junto con la generación de las lineas de ratones en las que se ha anulado la expresión de estos genes hace pensar en una estrecha relación entre estos factores como causa del hipotiroidismo congénito. Aunque es obvio que faltan por clonar nuevos genes y realizar nuevos estudios para aclarar el origen de esta enfermedad. Otro aspecto que deberá estudiarse en un futuro próximo es el origen multigénico de esta enfermedad. Esta hipótesis está siendo estudiada originando lineas de ratones que son heterocigotos múltiples para alelos nulos de Titf1, Titf2 y Pax8, ninguno de los cuales en heterocigosis produce fenotipo anormal tiroideo.

B. Terapia génica en enfermedades tiroideas Uno de los objetivos más actuales en terapias génicas para el tratamiento de carcinomas es la búsqueda de nuevas aproximaciones experimentales que impliquen la menor toxicidad posible. Los cánceres con alta recurrencia después de tratamientos con radio- o quimioterapìa representan clínicamente un reto para la búsqueda de nuevas terapias. En este sentido se tiende a desarrollar tratamientos más localizados y efectivos que sustituyan a tratamientos más tóxicos que puedan afectar al organismo entero. Para conseguir este objetivo, se están explorando aproximaciones

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moleculares basadas en transferencia selectiva a células tumorales de genes terapéuticos o de promotores específicos para localizar la expresión del transgen en células tumorales. Estas aproximaciones experimentales están en fase de desarrollo con resultados muy prometedores. Actualmente se está desarrollando una nueva terapia basada en el uso del gen tiroideo NIS. Este gen codifica por la proteína responsable de la captación de yodo, una característica específica de la célula epitelial tiroidea y el primer paso en la síntesis y secreción de hormonas tiroideas (20). Tras la clonación en 1995 de este transportador (21), el estudio de la expresión de este gen y su uso en terapia génica han revolucionado muchos aspectos de esta tecnología. La expresión de este gen se describió inicialmente como específica de tejido tiroideo, aunque se ha demostrado posteriormente que también se expresa en la glándula salival, mamaria y en la mucosa gástrica (20). Basándose en la función de la proteína NIS de captar iodo, estudios muy recientes han estado encaminados a la sobre-expresión del transportador NIS en células tumorales y tratarlas posteriormente con I123 o con Tecnecio Tc99 para diagnóstico por imagen. Adicionalmente, si la expresión de NIS en células tumorales puede exceder a la expresión existente en células tiroideas diferenciadas, la acumulación de I 131 puede resultar en más de 50.000 cGy de dosis de radiación ionizante. De esta forma la radioterapia con I 131 debería eliminar específicamente las células que expresan el transportador de iodo. Con esta idea trabajos recientes han expresado el tranportador NIS en células tumorales de varios orígenes (melanoma, mama, colon etc.) obteniendo resultados muy prometedores. La forma de expresión de NIS ha sido usando vectores retrovirales (22) o adenovirales (23). Ambos tipos de vectores tienen ventajas e inconvenientes, aunque actualmente el uso de ambos está bien aceptado. Con el uso de estos vectores se han expresado altas concentraciones de NIS en células tumorales comprobándose que dichas células captaban iodo radiactivo. De esta manera se ha podido hacer un seguimiento por imagen del tumor, tras inyección de las células que sobre-expresan NIS a ratones atímicos y posteriormente se han tratado los animales con I131 con resultados muy prometedores en cuanto a la desaparición de tumores que sobre-expresan NIS (22, 23). Este tipo de terapia se ha usado, como se ha mencionado, en varios tipos celulares (22, 23) y puede ser también usada en células tumorales tiroideas. Una parte de los tumores diferenciados de tiroides retienen cierta capacidad de concentrar yodo, lo que permite el uso de radioyodo como tratamiento para los pacientes que presentan cáncer recurrente y metastásico. Sin embargo, un alto porcentaje de los tumores de tiroides diferenciados, así como los dediferenciados, pierden la capacidad de concentrar yodo. Este hecho reduce considerablemente las posibilidades de ser tratados de forma efectiva. Por ello se está usando también en cáncer de tiroides, la terapia alternativa de sobre-expresión de NIS con el uso de vectores virales, aunque no hay de momento trabajos publicados al respecto.

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16. Lapi P, Macchia PE, Chiovato L, Biffali E, Moschini L, Larizza D, et al. Mutations in the gene encoding thyroid transcription factor-1 (TTF-1) are not a frecuent cause of congenital hypothyroidism (CH) with thyroid disgenesis. Thyroid 1997; 7: 383-387. 17. Perna M, Civitareale D, De Filipis V, Sacco M, Cisternino C, Tassi V. Absence of mutations in the gene encoding thyroid trancription factor-1 (TTF-1) in patients with thyroid dysgenesis. Thyroid 1997; 7: 377-381. 18. Macchia PE, Lapi P, Krude H, Pirro MT, Missero C, Chiovato L, et al. PAX8 mutations associated with congenital hypothyroidism caused by thyroid dysgenesis. Nature Genetics 1998, 19: 83-86. 19. Clifton-Bligh RJ, Wentworth J M, Heinz P, Crisp MS, John R, Lazarus JH, et al. Mutation of the gene encoding human TTF-2 associated with thyroid agenesis, cleft palate and choanal atresia. Nature Genetics 1998; 19: 399-401. 20. De la Vieja A, Dohan O, Levy O, Carrasco N. Molecular analysis of the sodium/Iodide symporter: Impact on thyroid and extrathyroid pathophysiology. Physiological Reviews 2000; 80: 1083-1105. 21. Dai G, Levy O, Carrasco N. Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter. Nature 1996; 379: 458-460. 22. Mandell RB, Mandell LZ, Link Jr. CJ. Radioisotope concentrator gene therapyusing the Sodium/iodide Symporter gene. Cancer Research 1999; 59: 8661-668. 23. Boland A, Ricard M, Opolon P, Bidart JM, Yeh P, Filetti S et al. Adenovirus-mediated transfer of the thyroid sodium/iodide symporter gene into tumors fo a targeted radiotherapy. Cancer Research 2000; 60: 3484-3492.

Índice analítico

ERRNVPHGLFRVRUJ 5-alfa-reductuasa-2, 294 mutaciones del gen, 295 Ácidos, desoxirribonucleico,1 nucleicos, 1, 2 Ribonucleico mensajero, 1 Activación de los aminoácidos, 57 génica, 107 Activator-Recruited Cofactor (ARC), 51 Actividad estrella, 159 peptidiltransferasa, 62 Activinas, 238 Adaptadores de policlonaje, 184 ADN, 1, 69 circular, 167 conformaciones del, 7 copia, 162 de cadena sencilla, 167, 170 de doble cadena, 163, 167 desenrollamiento, 8 dominio de unión al, 72 estructura dimensional del, 7 exonucleasa, 161 ligasa, 162, 186 lineal, 167 mitocondrial, 13 polimerasa(s), 22, 157, 178 de T7, 161 I, 157, 161

III, 20 replicación, 15, 16 superenrollamiento, 8 vectores de, 183 ADNasa I, 157 ADNcopia (ADNc), 158, 162, 163, 176, 182, 183, 185 ADNcs, 157, 158, 168 ADNdc, 157, 158, 168, 173, 182, 184, 185 ADNpol I, 158 ADNr, 142, 143, 144, 155, 155, 156, 181, 190, 216 Aminoácidos, activación de los, 57 AMV polimerasa, 162 AN, de cadena doble, 168, 169 de cadena simple, 168 secuanciación, 172 Andrógenos, déficit enzimáticos en la biosíntesis, 292 Anemia de Fanconi, 250 Aneuploidías, 150 Animales transgénicos, 223 Anomalías postreceptor de GH, 252 Antibióticos, 62 Anticuerpos, 90 antiinsulina, 95 antitiroideos, 97 contra células de los islotes (ICA), 95 monoclonales, 142, 144

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Antígeno, 83, 84 mayor de histocompatibilidad (MHC), 238 T, 237 Antioncogenes, 108 Apoptosis, 115, 117, 119, 120, 124 ARC (Activator-Recruited Cofactor), 51 ARN, clases de, 28 de cadena mixta, 158 sencilla, 170 simple, 157, 158 de transferencia (ARNt), 29, 35, 55, 56, 57, 59, 60 procesamiento, 36 degradación del, 39 estructura, 27 mensajero (ARNm), 1, 29, 30, 55, 56, 59 molde, 162 poliadenilado, 167 polimerasa, 42, 43, 163 II, 43, 46, 51, 131 procesamiento del, 29 ribosómico (ARNr), 1, 29, 37 transferencia (ARNt), 1 transporte del, 39 ARN molde, 162 ARNasa H, 162 I, 176 P, 176 T1, 176 U2, 176 ARNdc, 168 ARNpol, 160 ARNpolia, 163 Autotolerancia, 81 Azul de metileno, 168 Bacillus subtilis, 188 Bacteriófagos, 184, 185 Bad, 122 Batch, 204, 205 record, 212 Bax, 121, 122, 123 Bc12, 121, 122, 123, 125, 126 BCLR, 90 BCLRL (receptor de la célula B), 84 Bclxl, 121

Biorreactores, 198 airlift, 199 de fibra hueca, 200 de lecho fluido, 201 Biosíntesis de proteínas, 59 Botellas rodantes, 222 BrEt, 178 Bromuro de etidio, 166, 168, 169, 170 BTK, 244 Cáncer, 99 de colón familiar, 111 CAP (Catabolite gene Activator Protein), 49 Carcinoma medular de tiroides, 301 Caspasas, 120, 125 Catabolite gene Activator Protein (CAP), 49 Cebador, 162, 163, 174 Cebadores, 175, 178 Célula(s), B16, 149 beta, artificiales, 280 clonación tarapéutica y diferenciación, 284 obtenidas a partir de células madre embrionarias, 285 trasplante de, 285 C127, 216 CHO (Chinese Hamster Ovary), 145, 222 citolíticas naturales, 82 de origen tumoral, ingeniería de, 280 dependientes de anclaje (ADC), 150 diana, 137 eucariotas, 63, 148 eucarióticas de mamífero, 189 hospedadoras, 187, 190 musculares, 76 pluripotenciales mesenquimales, 137 CHO, 146 Citosinas, 82 Citocromo c, 121, 122, 126, 176 Citoquinas, 100, 123 Clonaje, 181 posicional, 176 Cloranfenicol, 63 Cluster de la GH, 245 Coactivadores, 51, 53 Código genético, 55, 56, 189

ÍNDICE ANALÍTICO

Codón, 55, 59, 60, 171 Codones, 56, 62 Complejo de Golgi, 66 de iniciación, 59, 60 principal de histocompatibilidad (MHC), 86, 93 Concatameros, 234 Conformaciones del ADN, 7 Control, de la actividad proteica, 70 de la degradación de los ARNm, 70 de la transcripción, 70 del procesamiento postranscripcional, 70 del transporte de los ARN mensajeros, 70 traducional, 70 Correpresores, 51 Cósmidos, 184, 185 Cre-loxP, 234 Cremallera de leucina, 72 Cribado, 190 Cromatina, 10, 22, 131 Cromatografía, de filtración molecular, 220 de intercambio iónico, 220 Cultivo(s), 151 batch alimentado, 152 o discontinuo, 151 semi-continuo, 152 continuo, 151, 152 in vitro, 147 procariotas, 195 DAGH, 11, 247 1A, 246 1B, 247 IA, 246 IB, 247 II, 247 III, 247 Dedos de zinc, 72 Deficiencia, aislada de GH familiar, 246 combinada de hormonas hipofisarias, 248 de 21-OH, 263 análisis genético molecular, 274 diagnóstico prenatal, 275

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genética, de hormona de crecimiento, 244 Déficit de 21 hidroxilasa, 290 Deleción clonal, 91 Desenrollamiento del ADN, 8 Desnaturalización, 178 Diabetes mellitus, terapia celular, 279 tipo I, 95 Dietil-aminoetil-sephadex (DEAE), 201 Diferenciación, celular, 69, 73 etapa de, 77 Dimerización de proteínas, 73 dominio de, 72 Displasia, septo-óptica, 250 Dominio de transactivación AF-2, 51, 53 Dominio Visagra, 51 Downstream, 217, 220, 222 DRIP (vitamine D Receptor Interacting Proteins), 51 E. coli, 157 ECOtPA, 146 EGF, 149 EGTA; 158 Elastasa pancreática del tipo I, 236 Electroporación, 186 Endonucleasa, 158, 159, 161 de ADN, 157 de restricción, 158 Enfermedades, autoinmunes, 94 de Graves, 97 tiroideas, terapia génica, 316 Enhancers, 229, 239 Envejecimiento, 13 Enzima(s), de restricción, 158, 159, 160, 173 de tipo II, 159, 182 Sau3A, 182 inmovilizadas, 144 T4 polinucleótido, 176 quinasa, 173, 176 Er, importación al, 65 Eritromicina, 63 Eritropoyetina, 177 Escherichia coli, 145, 188 Estado estacionario, 152

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Estreptomicina, 63 Estructura dimensional del ADN, 7 Estudios farmacogenómicos, 177 Eucariotas, 45, 53, 57 Exo III, 158 Exones, 156 Exonucleasa(s), 157, 158, 161 5 ‘flecha 3’, 161 III, 157 h, 157, 158 Expresión génica, 70, 73 Extensión, 178

Factor(es) IX, 142 VIII, 142 VIII, 143 de crecimiento epidérmico (EGF), 189 de transcripción, 77, 104, 310 Pax-8, 311 TTF-2, 311 TFII-B, 46 de coagulación, 143 de crecimiento, 103, 149 receptores de, 103 de progresión, 100 de terminación, 62 musculares reguladores, 77 FADD (Fas activating death domain), 119, 120 Fago h, 157, 185 Fagocitos, 82 Fanconi, anemia de, 250 Fas activating death domain (FADD), 119, 120 Fibroblastos, 74 Fibrosis quística, 129 Fragmento Klenow, 158 de la ADNpol I Secuenasa, 161, 174

Gen(es), APC, 111 de GHRH, 245 de IGF-I, deleción del, 253 de la 21-hidroxilasa, en población española, 268 de la 21-OH, 265

de la esteroide 21-hidroxilasa, análisis indirecto, 269 resultados y discusión, 270 de la somatostatina, 245 del factor de transcripción hipofisario número 1, 246 del receptor de GHRH, 243, 246 estructural, 223 eucarióticos, 130, 156 GHI, 243 mutadores, 112 p53, 111, 112 procarióticos, 156 Rb9, 110 SHOX; 254 supresores, 108 tiroideo NIS, 317 Genotecas, 145, 162, 182, 183 de ADNc, 182, 183 GMP (Good Manufacturing Practices), 191, 211 Golgi, complejo de, 66 Gonadotropina coriónica, 291 déficit de respuesta testicular a la, 291 Graves, enfermedad de, 97 Guía de fabricación, 212 Harvest, 218, 220, 222 Helicasa(s), 17, 19, 24 Hélice-bucle-hélice, 72 Hélice-giro-hélice, 71 Hemoglobina, 176 Heterocariosis, 150 HGH, 143, 146 Hibridación, 168, 169, 170, 172, 174, 178, 179 de los AN, 191 Hipercrecimiento, 243 Hiperplasia adrenal congénita, 263, 268, 290, 292 tratamiento, 268 Hipocrecimiento, 243, 244 de origen prenatal, 254 por anomalías en genes de los gonosomas, 253 por resistencia genética a la hormona de crecimiento, 251 Hipotiroidismo congénito, 309 terapia génica, 309

ÍNDICE ANALÍTICO

Histona(s), 10, 21 acetilasa, 22 desacetilasa, 22 HLA, 87, 92 Holoenzima, 42, 44 Holoprosencefalia, 249 Hormona(s) antimülleriana, 297 mutaciones de los genes implicados en la acción de la, 297 de crecimiento, 177, 243, 243 deficiencia genética, 244 hipocrecimiento por resistencia genética a la, 251 recombinante, 216 hipofisarias, deficiencia combinada, 248 luteinizante, 291 déficit de respuesta testicular, 291 tiroideas, 49, 72, 309 Hospedadores, eucarióticos, 189 procarióticos, 188

ICAM-1, 92 IGF, 149 IGF-I, resistencia a, 253 Importinas, 65 Inflamación, 82 Información genética, 6 Ingeniería de células de origen tumoral, 280 Inhibina, 238 Inmunidad, adaptativa, 82, 88 adquirida, 81 innata, 81, 88, 90 Inmunodeficiencia severa combinada (SCID)- X1, 129, 137 Inmunoglobulinas, 82, 84, 107 Insulina, 142, 143, 146, 176, 177 producción en otros tejidos, 281 Interacción hidrofóbica, 220 Interferón _ humano, 189 Interferones, 176, 177 Interruptores moleculares, 70-71 Intrones, 33, 156, 188 Isosquizómeros, 160

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Klenow, fragmento, 158 Knock-out, 224, 238 de Pax-8, 314 de TTF-1, 314 Layout, 203 Lentivirus, 134, 135 Leucemia, linfoblástica aguda, 108 mieloide crónica, 108 Levaduras, 189 Ligasas, 159, 164 de ADN, 159, 163 Linfocitos, 93 B, 85, 86, 88, 90 T, 74, 86, 87, 89, 90, 95 T citotóxicos, 123 T y B, 83 Linfoma de Burkitt, 107 Liposomas, aniónicos, 187 catiónicos, 187 Lisosomas, importación a los, 66

MAP quinasas, 106 Marcadores fenotípicos de selección, 184 Master cell bank, 192, 217 Mastocitos, 82 Matriz nuclear, 22 MCB, 217 Médula ósea, 84, 93, 137, 139 MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2), 77 MEFs (muscle Enhacer Binding Factors), 78 MEN 1, bases moleculares del, 302 de tipo I, 302 MEN 2, bases moleculares, 305 Metástasis, 100 MhC (complejo principal de histocompatibilidad), 87, 93 Microcarriers, 200 Microinyección pronuclear, 223 Microportadores, 200 Microsatélites, 113 Mioblastos, 76, 77 MioD, 74, 77, 78

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Miogénesis, etapas de, 75 Miogenina, 77, 78 mitocondrias, importación a las, 65 MMLV polimerasa, 162 Mrf4, 77 Mrf4, 78 Multitray, 200 Muscle Enhancer Binding Factors (MEFs), 78 Mutágenos, 101 Myf5, 77, 78 Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF-2), 77 Naranja de acridina, 168 Necrosis, 115 Neogénesis de islotes, 283 Neoplasia endocrina múltiple, (MEN) de tipo 1, 302, 304 de tipo 2, 304 patología molecular, 301 NIS, 310 NO, 125, 126 sintasas, 124 Normas GMP, 192 USP, 202 Northern, 168, 170 Nucleasa(s), 157 BA131, 158 SI, 157 Núcleo, importación al, 65 Nucleosoma(s), 10, 21, 22, 117, 131 Oncogén(es), 99, 101, 102, 123 c-H-ras, 236 supresores, 109 Oncoproteína, 103 Oncorretrovirus, 132, 135 Operón lactosa, 48 Óxido nítrico, 124 P53, 123 Patología molecular, 263 Pax-8, 310 PCR (Polymerase Chain Reaction), 11, 162, 175, 177, 178, 179, 205, 223 PDGF, 149

Peroxinitrito, 125, 126 Pfu polimerasa, 162 Pigmeos, 253 Plásmidos, 184, 185 Poli-A polimerasa, 163, 176 I, 16 II, 16 III, 16, 19 Polimerasa(s), 15, 16, 162 5 ‘flecha 3’, 161 I, 16 II, 16, 19 de ácidos nucleicos, 189 de ADN (ADNpol), 160 de AN, 162 eucarióticas, 23 termorresistentes, 162 Polinucleosomas, 22 Primers, 178 cebadores, 183 Procariotas, 57 Poliferación/migración, etapa de, 77 Promotores, 163, 229, 239 Proteínas, 55 antiapoptóticas, 104 biosíntesis de, 59 con homeodominio, 71 del complemento (CR), 82 dimerización de, 73 reguladoras, 75 transportadoras de péptidos, 89 Tus, 20 Proto-oncogén(es), 99, 101, 103, 105, 107 activación de, 105 ras, 236 Providentia stuartii I (PstI), 160 Pseudohermafroditismos, aproximación genética, 289 determinación y diferenciación sexual, 289 femenino, 290 masculino, 289 PstI (Providentia staurtii I), 160 Puromicina, 69 Quimeras, 234 Quimiostato, 152

ÍNDICE ANALÍTICO

Quinasas, de ácidos nucleicos, 164 del fago T4 (T4 quinasa), 164 Radioiodo, 317 Ratón(es), enanos Snell y Jackson, 248 knock-out, 234 nulo para TTF-2 (Titf2), 314 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 11, 177, 179 Receptor, del antígeno de las células T (TCR), 86 de retinoides, 50 interating protein (RIP), 119 Receptores, nucleares, 50 huérfanos, 50 Regeneración, 283 Regulación, de todo o nada, 203 PID, 203 Regulación de la iniciación, 48 Replicación del ADN, 15, 16 Replisoma, 19 Represores, 47 Respuesta inmunitaria, 83 Retinoblastoma, 110 Retinoides, 149 Retrovirus, 133 R-hFSH, 142, 222 R-hGH, 142, 221 Ribonucleasa A (ARNasa A), 158 H (ARNasa H), 158 T1, 176 Ribosoma(s), 59, 63 RIP (receptor interacting protein), 119 RNA polymerase Associated Protein, 47 Roller bottles, 217 cell, 219 Salmonella, 188 Sau3AI (staphilococus aureus cepa 3AI), 160 Screening, 190 del ADN, 173

327

Secuenasa, 161, 174 Secuenciación, automática con fluorocromos, 175 de ácidos nucleicos, 172 del ADN, 175 del ARN, 175 enzimática, 174 por degradación enzimática, 176 por el método de degradación química, 175, 176 por el método enzimático, 175 por hibridación, 175 Secuencias reguladoras, 223 Selección clonal, 83 Sensores biológicos, 144 SHOX, 244 Síndrome(s), de Aarskog, 251 de Bloom, 251 de conductos müllerianos persistentes, 297 de Denys Drash, 298 de ectrodactilia-displasia ectodérmicalabio leporino, 250 de feminización testicular, 290 de Frasier, 298 de insensibilidad primaria a la GH, 251252 de Laron, 251, 252 tipo b o c, 252 de Morsier, 250 de resistencia primaria a la GH, 251 de rieger, 250 de Russell-Silver, 254, 255 de Turner, 254 Sistema(s) Cre/lox P, 224 de perfusión, 152 HLA, 87 inmune, 81, 90, 99, 137, 139 principal de histocompatibilidad (MHC), 87 Sondas, 145 SOP (Standard Operating Procedures), 212 Southern, 168, 170, 191 blot, 223 Spiracel, de Sterilin, 200 Splicing de ARNm, 216 Standard Operating Procedures (SOP), 212 Staphilococus aureus cepa 3AI (Sau3AI), 160

328

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA

Subclonaje, 181, 183 Superenrollamientos del ADN, 8 Sybr-Green, 168, 169, 178 T3R_, 50 T3R`, 50 Taq polimerasa, 162 TATA, 47, 131 TCR, 87, 90, 91, 92 (Receptor del antígeno de las células), 86 Telomerasa, 25 Terapia génica, 129, 137, 139, 177 en enfermedades tiroideas, 316 hipotiroidismo congénito, 309 Terapia proteica, 177 Termocicladores, 179 Testosterona, 294 Tetraciclina, 63 TFII A, 47 B, 47 Thermus aquaticus, 162 Thyroid hormone receptor Associated Proteins (TRAP), 51 Thyroid receptors responsive elements, 50 Thyroid transcription factor, 310 Timo, 93 Tiroides, carcinoma medular de, 301 TLCR, 86 TNF-RI associated death domain (TRADD), 119 Tolerancia adaptativa, 90 Tolerancia B, 93 Topoisomerasa(s), 9, 17 II, 19, 20 TRADD (TNF-RI associated death domain), 119, 120 Transcripción, 41, 131 inversa, 136 Transcriptasas reversas, 162

Transducción, 187 Transferasa terminal, 157, 162 Transferencia, 132 génica, 130 horizontal, 102 vertical, 102 Transformación, con bacteriófagos, 186 con CaCl2, 186 con fosfato cálcico, 186 Trasgén, 223 Trasgénico(s), 144, 229 Transportador de yodo dependiente de sodio, 310 Transportador NIS, 317 TRAP (Thyroid hormone Associated Proteins), 51 Tripsinizaciones, 218 TTF-2, 310 Tth polimerasa, 162 Upstream, 217, 222 Utilities, 203 Vector(es), 132, 133, 134, 139 de ADN, 183 de clonaje, 183 de expresión, 183 virales eucarióticos, 184 virales para células eurcarióticas, 185 Vent polimerasa, 162 Virus eurcarióticos modificados, 185 Virus SV40, 237 WCB, (working cell bank), 192, 217 Xenotrasplante(s), 226, 227

Este libro es el resultado final de un curso sobre introducción a la biotecnología, que tuvo lugar en la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense. En el mismo se pretende hacer una puesta al día de los conceptos básicos de la «nueva biotecnología» para los profesionales biosanitarios, dada la importancia creciente que está adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan refrescar y poner al día toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente un repaso a la bioquímica de los procesos que conducen a la síntesis proteica, con un breve recuerdo a las bases de la información genética, con especial hincapié en el ADN y su replicación, a la estructura del ARN, la traducción del mensaje genético y la regulación del mismo. Ésta parte es necesaria para entender el lenguaje del resto del contenido. Para completar la primera parte del libro, hay un capítulo sobre el reconocimiento de antígenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes mutadores, otro sobre apóptosis y su regulación génica y finalmente, uno sobre las bases de la terapia génica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expectativas. Todos los autores de ésta parte, son profesores de bioquímica y biología molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la Universidad Autónoma de Madrid. En el segundo gran capítulo del libro, se hace una introducción a la biotecnología. Hay dos lecciones sobre ingeniería genética y otras dos más sobre la producción industrial de fármacos recombinantes. Estas lecciones están escritas por los responsables de la planta de producción de GH, por técnicas de ADN recombinante en células de mamíferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia pesonal en los temas que tratan. La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades endocrinas y abarca, desde las técnicas generales para crear ratones transgénicos o KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algún gen de su genoma) que permiten la constatación de las actividades potencialmente pleyotrópicas de los mismos, a la descripción individualizada de los aspectos genéticos de una serie de enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del crecimiento a la Hiperplasia Suprarrenal Congénita, la Diabetes Mellitus, los pseudohermafroditismos, las Neoplasias Endocrinas Múltiples (MEN) y el hipotiroidismo congénito.

ISBN 84-7978-543-8

9 788479 785437