Bioquimica Rocha

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BIOQUÍMICA 2º EDICIÓN

Ediciones Universidad de la Frontera

Héctor Rocha L.

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INFORMACION SOBRE EL AUTOR

Héctor A. Rocha L. es Profesor Asociado de la Universidad de La Frontera, Temuco. Posee el título de Bioquímico de la Universidad de Chile (1973) y trabajó durante 1974 en el Laboratorio de Reproducción de la Sede Norte de la Facultad de Medicina, Santiago. Posteriormente obtuvo una beca de perfeccionamiento otorgada por el Medical College of Georgia, USA (Georgia’s Health Sciences University) donde se desempeñó como Research Fellow hasta 1979. A continuación ingresó a la Escuela de Graduados en dicha Universidad parta obtener el grado de Ph.D. en 1983. En cuanto a su experiencia científica esta comprende aislamiento y caracterización de proteínas, enzimología, transporte de aminoácidos, técnicas de ADN recombinante, producción de anticuerpos monoclonales, junto a la caracterización química y biológica de efluentes tóxicos industriales. A la vez su experiencia docente data desde 1974 y en la actualidad se encuentra participando en los Módulos de Bioquímica Médica y Genética junto a Fundamentos Moleculares de los Procesos Biológicos, para las carreras de Medicina y Tecnología Médica.

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IV

PREFACIO

La Bioquímica debe reunir los conocimientos de Física, Biología y Química para intentar explicar las reacciones químicas propias de los seres vivos. Por esta razón es de interés para el autor entregar en esta segunda edición un alcance más completo de esta ciencia para los estudiantes de las áreas biológicas. En este texto no solo se hace hincapié en el metabolismo del hombre, sino que se le compara al de otras especies para así obtener una idea del contexto molecular donde este se halla inmerso. El libro se encuentra dividido en diecisiete capítulos donde se analizan las moléculas que darán origen a las proteínas y la interacción de estas con su medio, junto a las funciones y características que presentan. Posteriormente se continúa con el metabolismo intermediario de Hidratos de Carbono, Lípidos y Aminoácidos para así terminar con los Ácidos Nucleicos, el Control de la Expresión de los Genes y dar un vistazo a algunas técnicas empleadas en el trabajo con los Ácidos Nucleicos. También se dará un vistazo a la Bioquímica vegetal. En la parte final de este libro se incluye una sección de ejercicios y otra de Aprendizaje Basado en Problemas. En esta sección se encuentra una técnica de aprendizaje centrada en el alumno donde este debe interaccionar con su grupo, formado por nomás de diez personas analizando un problema expuesto como un caso clínico. Este se debe analizar desde distintos puntos de vista que incluyen las áreas de: Conocimiento, Socio-Económico y Comportamiento. Esto supone la distribución de las distintas tareas de búsqueda de información de los miembros del grupo en bibliotecas, entrevistas a especialistas y empleo de recursos en INTERNET, para luego complementarlos entre los miembros del grupo y así resolver los objetivos planteados por cada problema.

No es el propósito de este libro el analizar las técnicas y las experiencias por las cuales se ha llegado al nivel de conocimiento bioquímico actual, sino que explicar como ocurren las distintas reacciones de síntesis y degradación que mantienen al organismo dentro de un relativo estado estable. Agradezco la participación del Profesor Eduardo Gutiérrez Da'Forno M.Sc. y al Dr. Gabriel Nuñez B. por la corrección del manuscrito así como sus comentarios y sugerencias sobre el mismo. Vayan mis agradecimientos al personal académico y administrativo del Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad de la Frontera.

Héctor Rocha Lohs, Ph.D. Bioquímico

V

CONTENIDO

VI

ERRNVPHGLFRVRUJ Capítulo 1 Capítulo 2 Capítulo 3 Capítulo 4 Capítulo 5 Capítulo 6 Capítulo 7 Capítulo 8 Capítulo 9 Capítulo 10 Capítulo 11 Capítulo 12 Capítulo 13 Capítulo 14 Capítulo 15 Capítulo 16 Capítulo 17

El Agua y sus Propiedades

3

Los Aminoácidos y sus Características

49

Las Proteínas su Estructura y Función

61

Las Enzimas y sus Propiedades

135

Las Vitaminas

194

Bioenergética

328

Metabolismo de los Hidratos de Carbono

341

Ciclo Tricarboxílico

403

Fotosíntesis

431

Metabolismo de los Lípidos

480

Metabolismo de los Aminoácidos

551

Cadena de Transporte de Electrones y Apoptósis

605

Ácidos Nucleicos

653

Ciclo Celular y Control de la Expresión de los Genes

738

Principios de Medicina Molecular

797

Problemas

859

Aprendizaje Basado en Problemas

932

VII

VIII

Héctor Rocha L.

Aprendizaje Basado en Problemas

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

CONTENIDO DEL CAPITULO 1 1) CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DEL AGUA 5 a) Características Reactivas del Oxígeno 5 b) La distribución electrónica de la molécula de agua 7 c) Características del enlace hidrógeno 10 2) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DEL AGUA 13 a) Cambios de la densidad del agua con la temperatura 13 b) Propiedades físicas del agua comparada con otros líquidos 14 Temperaturas 24 c) Punto Triple del agua 16 d) El agua como un buen solvente 16 e) El agua como responsable de la interacción hidrofóbica 17 f) El agua es capaz de ionizarse 20 3) IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL AGUA 20 a) Compatibilidad del agua con la vida a bajas temperaturas 22 b) Como se adaptan las proteínas a las bajas temperaturas 24

c) Adaptación de las bicapas de fosfolípidos a las bajas temperaturas 25 d) Compatibilidad del agua con la vida a altas temperaturas 28

e) Adaptación de las proteínas a las altas temperaturas 28 f) Adaptación de las bicapas de fosfolípidos las altas temperaturas 30

3

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

4) LA VIDA SIN AGUA O ANHIDROBIOPSIS 30 5) PRODUCTO IONICO DEL AGUA 31 6) AMORTIGUADORES O TAMPONES 32 7) Disociación y Curva de Titulación del Aminoácido Glutámico 8) ACIDOSIS Y ALKALOSIS Ecuación de Henderson Haselbalch

a) Causas de Acidosis b) Causas de Alcalosis

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AGUA 1) CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DEL AGUA. El agua es un líquido de excepcionales características físico-químicas y constituye uno de los elementos esenciales para la vida. Es a la vez capaz de participar en las reacciones biológicas y actuar como un medio de soporte para las distintas transferencias de energía y materia en los organismos vivos. a) CARACTERÍSTICAS REACTIVAS DEL OXÍGENO. La molécula de agua esta formada por son elementos de cualidades opuestas dentro del Sistema Periódico. El Oxígeno por un lado se ubica a la derecha en el Grupo VI A y según la escala empírica de electronegatividad (Pauling: escala de 1 a 4) atrae electrones con un valor de 3,5. Por otro lado el Hidrógeno, se ubica a la izquierda en el Grupo I A y es capaz de donar electrones, ya que su electronegatividad es igual a 1. Las particularidades de Oxígeno con 6 electrones por átomo se deben a la disposición particular de sus electrones en la capa más externa 2P (fig. 1-1). Tanto en 2Py como en 2Pz, posee un electrón y ambos se encuentran con el mismo espín y por consiguiente no apareados. Esta propiedad lo convierte en un biradical, que es afortunadamente poco reactivo con aquellas moléculas orgánicas que poseen ambos espínes apareados. Sin embargo puede reaccionar fácilmente, con elementos con un solo electrón con espín opuesto (fig. 1-1). Si no ocurriera de esta manera, el Oxígeno sería como el Fluor y reaccionaría espontáneamente con todo el Hidrógeno posible. En general, las oxidaciones serían mucho más espontáneas de lo que ya lo son.

σ* Pz

Px

π*x

Py

π*y Py

Px

Pz

• : electrones no apareados

πx

electrones apareados

πy σ

.. s

σ*

s

σ

O Orbital Atómico

O2

Orbital Molecular

O Orbital Atómico

O ..

.• .

•

..

O

..

Ambos átomos de Oxígeno comparten un par de electrones y presentan el otro par no apareado. Generan así una molécula Paramagnética

Fig. 1-1. Orbitales atómicos y moleculares del Oxígeno.

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En base a lo anterior, para que el Oxígeno reaccione se pueden seguir dos caminos: a) Primero, se necesita elevar su energía para invertir uno de los espines y pasar desde Oxígeno triplete a Oxígeno singlete. Oxígeno triplete es el Oxígeno basal donde en los orbitales Px, Py, Pz, ambos espines pueden presentar tres posibilidades o arreglos: 1) ambos espines en el mismo sentido, 2) ambos espines en sentidos opuestos, 3) ambos espines no apareados y en sentidos opuestos. Orbitales p en el triplete

3)

2)

1) Px Py

Pz

Px

Py

Pz

Px

Py

Pz

Por otro lado, el Oxígeno singlete es aquél oxígeno activado que presenta en su última capa Py, un par de electrones apareados con espín opuesto. Esta característica le permite reaccionar con los compuestos orgánicos con pares de electrones también apareados. Orbital p en el singlete

Px

Py

Pz

b) Segundo, mediante activación por reducción monovalente, es decir electrón por electrón. El primer electrón entra con un espín opuesto en una reacción endergónica que lo transforma en Superóxido (O2·), luego mediante otro electrón y una reacción exergónica pasa a Peróxido de Hidrógeno (HO-OH), que sucesivamente se transforma mediante un tercer electrón en Superhidroxilo o radical Hidroxilo (OH.) y finalmente con la adición de un cuarto electrón pasa a formar Agua (Fig.2-1).

Energía

+ Electrón

.O-O. Triplete O2 basal

. O – O: Superóxido + Electrón

H:O-O:H Peróxido

+ Electrón H : O. Superhidroxilo + Electrón

H:O:H Agua

Fig. 2-1. Reducción monovalente de electrón por electrón.

Este tipo de reducción es el que se emplea biológicamente adicionando un electrón a la vez, para así generar tanto energía como agua metabólica en la Mitocondria. Sin embargo, es

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necesario evitar que se liberen los intermediarios (Superóxido, Radical Hidroxilo y Peróxido de Hidrógeno) que son altamente tóxicos al organismo. En base a lo anterior se puede concluir que el agua se forma a partir de dos moléculas biatómicas con propiedades extremas como son el Oxígeno y el Hidrógeno. Uno de estos elementos es considerado como un agente oxidante y el otro como un agente reductor. Ambos a la vez presentan moléculas biatómicas (H-H y O-O) de igual electronegatividad, de manera que la energía para romper el enlace es similar (103 y 106 Kcal/mol). La molécula de Hidrógeno, es la más simple de todas y presenta dos electrones apareados en un orbital molecular 1s2. La energía para romper este enlace covalente H-H es de 103 Kcal/mol, mientras la energía para romper el enlace entre ambos oxígenos atómicos (que no es doble ni simple) es de 58 Kcal/mol por enlace, dando un promedio de 116 Kcal/mol. A su vez en la reacción para formar 2 moléculas de agua se forman 4 moles de enlaces O-H, que tienen alta diferencia en electronegatividad y 110 Kcal/mol en cada uno con un total de 440 Kcal/mol, mientras que el total de la energía para romper las moléculas biatómicas de H2 y O2 será de 322 Kcal/mol, produciendo una diferencia de 118 Kcal/mol de agua que se liberan mediante una reacción exergónica: Energía consumida : Energía liberada por ruptura de dos moles de H2O :

2 H2 + O2 = 2 H-O-H + 118 Kcal/mol 2 x 103 + 116 = 322 Kcal/mol 4 x 110 = 440 Kcal/mol 440 – 322 = 118 Kcal/mol

En el fondo, las características tan dispares entre Oxígeno e Hidrógeno se conjugan en el agua para formar una molécula con un momento dipolar, que le entrega la capacidad de ser el solvente único por excelencia. Volver al inicio b) LA DISTRIBUCION ELECTRONICA DE LA MOLECULA DE AGUA LA ASEMEJA UN TETRAEDRO.

A

La molécula de agua presenta sus orbitales distribuidos en la forma de un híbrido entre un orbital s y tres orbitales p denominado sp3. Los dos orbitales externos del Oxígeno (2py, 2pz) se encuentran cada uno ocupado por un electrón con espín en un mismo sentido y reciben los electrones de los dos átomos de Hidrógeno. Al mismo tiempo los dos pares de electrones no enlazantes que ocupan los orbitales inferiores (2s2, 2px2) forman orbitales más anchos y cercanos del Oxígeno por ser este electronegativo. La presencia de estos pares de electrones induce una repulsión de los pares que sí forman enlace con el Hidrógeno, induciendo a estos últimos a presentar una nube larga y angosta (Fig. 3-1). Por lo tanto, los cuatro pares de electrones no se encuentran distribuidos de forma similar y generan un tetraedro imperfecto con una distribución asimétrica de los electrones (Fig. 3-1). El ángulo entre los Hidrógenos es de 104.5o en comparación a los 109.5o entre los vértices de un tetraedro perfecto como el Metano.

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Dada las características anteriores es posible asumir que la nube electrónica alrededor de la molécula de agua posee diferenciales de carga: 2 diferenciales negativos para el Oxígeno y 1 diferencial positivo para cada Hidrógeno. Son estos los que entregan el carácter PARES SOLITARIOS INTERIORES

H2 O

C H4 H

δ-

C

δ-

H

H

H

H δ+ 104.5

H

H δ+ Tetraedro imperfecto

109.5

Tetraedro perfecto

Fig. 3 - 1. Ángulos de los Tetraedros del Agua y Metano.

dipolo a la molécula de agua (Fig. 3-1). Por lo tanto el agua tiene la capacidad de orientarse en un campo eléctrico, lo que se mide por el Momento Dipolar. Los vectores que corresponden a las componentes del Momento Dipolar se pueden observar en las figuras 3-1 y 4-1. Por otro lado, al observar las distancias entre el Oxígeno y el Hidrógeno vemos que es de 0,097 nm y el radio desde donde empieza la interacción Van der Waal es de 0,120 nm,

Componentes y resultantes de los momentos dipolares

2 O H

+

104.5º

H

+

Vector del momento dipolar

Fig. 4 - 1. La densidad electrónica es mayor sobre el átomo de Oxígeno.

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mientras que la distancia entre ambos Oxígenos pertenecientes a dos moléculas que interaccionan por medio del enlace hidrógeno es de 0,280nm. Una molécula de características opuestas al agua se encuentra en la molécula de Metano (fig. 5-1). El carbono tiene solo 4 electrones no compartidos en su capa externa y necesita de otros 4 que en este caso serán aportados por el Hidrógeno. La electronegatividad para el Hidrógeno es de 2,1 mientras que para el Carbono es de 2,5. Este hecho indica que son similares y la repulsión entre los pares de electrones que se encuentran formando el enlace covalente es igual en todos, ellos generando una nube electrónica más larga y delgada dirigida por igual, hacia los vértices de un tetraedro sp3 perfecto con un ángulo entre los enlaces C-H de 109,5o. A su vez los componentes del momento dipolar en el CH4, se encuentran representados por flechas que se cancelan unas a otras debido a la distribución simétrica de la nube electrónica. Otra molécula con una estructura intermedia entre el H2O y el CH4, es el amoníaco NH3 (fig. 5-1). En ella el Nitrógeno con electronegatividad de 3,1 posee 5 electrones de valencia en su capa externa y necesita tan solo de 3 para completar el octeto. Al unirse los tres Hidrógenos restantes con electronegatividad de 2,1, generan un tetraedro sp3, levemente asimétrico, ya que la molécula de Amoníaco solo tiene un par de electrones no enlazantes. Este último par forma una nube electrónica más ancha y pegada al átomo de Nitrógeno que las otras tres. El ángulo entre los hidrógenos es aquí de 107,3o (fig. 5-1).

δ–

H

AMONIO NH3

METANO CH4 N

C

δ+

H

H

H H δ+

109,5º

H

δ+

H

107,3º δ–

δ– AGUA H2O δ+

O δ– δ+ H

δ+

104,5º

H

H

F δ– δ – AC. FLUORHÍDRICO HF

Fig. 5 – 1. Representación tetraédrica de las moléculas de Metano, Amonio, Agua y Ác. Fluorhídrico. Los momentos dipolares se encuentran representados por flechas y se muestran los diferenciales (δ) de carga.

El Ác. Fluorhídrico HF (fig. 5 -1), es otra molécula capaz de formar un fuerte dipolo debido a que el Flúor es altamente electronegativo 4,1 en la escala de Pauling. El Fluor tiene 7 electrones en su capa externa y requiere de solo un Hidrógeno para completar los 8

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electrones. El Ác. Fluorhídrico forma un tetraedro sp3, altamente distorsionado que cuenta con tres pares de electrones internos, cuya nube repele fuertemente al par de electrones que forma el enlace covalente polar con el Hidrógeno. Debido a esta particularidad, las moléculas de HF se pueden adicionar formando largas cadenas de enlaces hidrógeno. Volver al inicio c) CARACTERISTICAS DEL ENLACE HIDROGENO. Debido a la peculiar distribución de los electrones en la molécula de agua y a su carácter dipolo, la asociación entre los centros de carga opuestos entre distintas moléculas de agua, recibe el nombre de enlace o puente hidrógeno. Esta interacción, es en realidad puramente electrostática y ocurre entre el átomo de hidrógeno pobre de electrones perteneciente a una molécula de agua con aquellos dos pares de electrones no compartidos situados en el Oxígeno de otra molécula. De esta manera una molécula puede interactuar con otras 4 vecinas, (fig. 6-1). Esta propiedad le confiere al agua un alto grado de cohesión interna que se refleja en su punto de fusión, pto. de ebullición, calor de vaporización, calor de fusión (Tabla 21) y tensión superficial, comparada con otras m0oléculas como el Sulfuro de Hidrógeno o el Amonio. Las uniones por enlace hidrógeno son de baja energía: se necesita de 3 a 7 Kcal/mol para romperlas y este tipo de interacción responde a las fluctuaciones térmicas ambientales, formándose o rompiéndose a distinta velocidad contrastando con las interacciones por enlaces covalentes que son muy estables y se rompen solo al aplicar energía por sobre las 110 Kcal/mol. Si consideramos que la máxima intensidad del enlace hidrógeno entre dos moléculas de agua ocurre cuando los tres átomos O-H---->O están alineados en un ángulo de 180º,

Fig. 6 - 1. Interacción de una molécula de agua con otras 4.

sucede que en el Ác. HF se encuentran 3 pares de electrones libres que no participan en el enlace covalente con el Hidrógeno y tan solo un par de electrones uno del hidrógeno y otro

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del Flúor, se encuentran involucrados en este enlace. En base a esta distribución es posible pensar que se formarían 4 enlaces hidrógenos, pero en la realidad en 100 moléculas tan solo 100 enlaces hidrógenos serán aquí posibles, sería algo así como un collar de 100 moléculas de HF. En el caso del NH3, se tienen 3 Hidrógenos unidos mediante tres enlaces con electrones compartidos y se tiene solo 1 par de electrones libre pertenecientes al Nitrógeno solamente. En este caso con 100 moléculas, también se formarán solo 100 enlaces hidrógenos en un collar. Tanto el NH3 como el HF son casos opuestos, en el primero se tienen tres diferenciales de carga positivos y uno negativo, mientras que en el segundo se encuentran tres diferenciales de carga negativos y uno positivo, por eso en ambos casos con 100 moléculas, se tiene un promedio de 100 enlaces hidrógeno. Este efecto también se traduce en la formación de cadenas o anillos de moléculas unidas por enlace hidrógeno. Al continuar con el mismo razonamiento, ocurre que el agua tiene dos Hidrógenos con dos pares de electrones compartidos y dos pares de electrones libres propios del Oxígeno, por lo tanto es más probable que forme un promedio de solo 2 enlaces hidrógeno por molécula de H2O. Esto es parcialmente válido, ya que el agua fluida está constantemente formando y rompiendo enlaces hidrógenos, mientras que congelada debido a su falta de agitación térmica interacciona al máximo, es decir una molécula de agua con otras cuatro vecinas. Compuestos

Pares de ē Compartidos

Pares de ē Libres

HF H2O NH3 CH4

1 2 3 4

3 2 1 0

Entre las moléculas que forman tetraedros el Metano (CH4) es la excepción, no posee pares de electrones libres y tiene un momento dipolar nulo, por lo tanto no forma este tipo de enlace (figs. 3-1 y 5-1). Por otro lado, el enlace Hidrógeno se manifiesta en otras moléculas como proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, etc. Siempre que en una estructura exista un dador y un aceptor de Hidrógenos con las siguientes características: 1) Un enlace covalente con un momento dipolar en la estructura. 2) Al menos un par de electrones libres que no estén involucrados en el enlace covalente de la estructura. 3) Un átomo de Hidrógeno proveniente de otra molécula que se pueda aproximar al par anterior sin que sea rechazado.

En la Tabla 1-1 se observan los posibles dadores y aceptores de Hidrógeno que se encuentran presentes en moléculas o estructuras distintas al agua, como pueden ser proteínas y ácidos nucleicos.

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Tabla 1 Dador de Hidrógeno

Aceptor de Hidrógeno

N

H

O

C

O

H

O

C

O

H

N

N

H

N

O

H

O

N

H

O

S

H

O

C

Volver al inicio

2) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DEL AGUA.

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La molécula de agua en estado sólido o hielo interactúa con otras cuatro moléculas y estas a su vez con otras tantas hasta formar una red tridimensional en que el ángulo O-H---->O, es de 180o. En esta estructura se alternarán las formas silla y bote dejando grandes espacios

Estructura Tridimensional del Hielo

X

O H O

Bote

H

O

O

H

H

H

H

H

H

O

H

O

H Silla

O

O

H

H

O

180º

H

O

O

O H H

H H O

H

H

H O

O

H

H H

H

H

H

Z

H

H O

H

O

H

Silla

O

O

O

H

Silla

O

H O

Silla

H

Y Fig. 7 - 1. Representación 3D de la Estructura del Hielo. En ella se observan estructuras silla y bote.

vacíos a 0oC (fig. 7-1). De esta manera se obtiene un gran volumen con pocas moléculas, lo que se traduce en una menor densidad. Posteriormente al subir la temperatura, el ángulo entre O-H---->O es menor de 180o y las moléculas se acercan entre sí. La distancia entre los Oxígenos de las distintas moléculas se hace menor y se produce una compactación de las moléculas por lo que aumenta la densidad. En otras palabras, el líquido se contrae de 0 a 4oC aumentando su densidad y luego de los 4 a los 100oC se expande aumentando la distancia O-HO y disminuyendo esta vez su densidad (fig. 8-1).

a) CAMBIOS DE LA DENSIDAD CON LA TEMPERATURA. El agua es un elemento fluido y posee dos tipos de movimiento: los de agitación térmica, influidos por el medio externo y los vibratorios, que son propios de los enlaces internos entre los átomos de la molécula. A baja temperatura la agitación térmica no es muy violenta y esto permite orientar los ángulos O-H---->O a 180o, lo que es óptimo para que se forme un cristal de hielo o su centro de nucleación.

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Densidad 1 gr/cc

0

4

100 Temperatura

C

Fig. 8 - 1. Curva Densidad versus Temperatura.

Posteriormente, a la temperatura de 4oC (Fig. 8 -1), ambos movimientos tanto el de agitación térmica como el vibratorio se encuentran en la misma fase y se cancelan el uno al otro. Este hecho permite una mayor aproximación entre las moléculas con el consiguiente aumento de la densidad del agua. De esta manera sobre los 4oC ambos movimientos se encuentran fuera de fase por lo que se suman algebraicamente ambas ondas y se producen agrupaciones oscilantes con una vida media de 10-12 segundos. Así las interacciones se forman y se destruyen rápidamente dando origen a las agrupaciones oscilantes. Esto permite que en el agua fluida la interacción sea en promedio de 1 molécula con otras 3,7. Volver al inicio b) PROPIEDADES FISICAS DEL AGUA COMPARADAS CON OTROS LIQUIDOS COMUNES. Los sucesivos cambios de estado sólido a líquido y de líquido a vapor en cada unas de las moléculas de la Tabla 2-1, dependerán del grado de cohesión que existe entre ellas al ser comparadas con el agua. El Calor de Vaporización es la cantidad de calorías necesarias para evaporar 1 gr de agua líquida, siendo mayor la del agua al ser comparada a otros líquidos. Este efecto indica que el agua actúa como un buen reservorio de energía, ya que puede absorber unas cuantas calorías antes de evaporarse. Por otro lado, se puede disipar una gran cantidad de calor por la vaporización del agua. Este efecto, es empleado para mantener la temperatura del cuerpo constante por medio de la perspiración insensible en el reposo y la transpiración como consecuencia de la actividad física. La Capacidad Calórica del agua, es la cantidad de calorías necesarias para aumentar la temperatura de un gramo de agua de 15 a 16oC y corresponde al valor de 1. El agua en comparación con las otras moléculas tiene una de las mayores capacidades siendo sobrepasada solo por el Amoníaco. Este índice es una medida de la capacidad del agua para amortiguar bruscos cambios de temperatura, ya que puede absorber calor sin cambiar

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de temperatura. Es decir, un tejido puede desprender una tremenda cantidad de energía calórica debido a su metabolismo, sin embargo su temperatura no sube al absorber el agua de la circulación más los líquidos intra y extracelulares esta energía. Tabla 2- 1 Punto de Fusión AGUA METANOL ETANOL ACETONA CLOROFORMO AMONIACO ACIDO FLUORHIDRICO BENCENO HEXANO METANO

ºC 0 - 98 -114 - 95 - 83 - 78 - 92 ------------- 183

Punto de Ebullició n ºC 100 65 78 56 61 - 33 19 --------------- 162

Calor de Vaporización Cal/Mol 540 263 204 125 59 327 360 94 --------------

Capacidad Calórica Cal/gr ºC 1.000 0.600 0.581 0.528 0.226 1.120 -------------------------

Calor de Fusión

Constante Dieléctrica

(adimensio Cal/mol nal) 80 80 22 33 24.9 24 23 21.4 -------5.1 84 -------54.7

--------

-------------------

4.6 1.9 --------

El Calor de Fusión, significa que al congelarse un mol de agua se liberan 80 Kcal, las que representan la resistencia del agua para cambiar de la fase líquida a la fase sólida. Esta propiedad contribuye a la estabilización biológica de los organismos y es empleada en aquellos casos extremos en que se congela parcialmente una parte del agua extracelular, para así extraer calorías y poder mantener a la célula aún fluida y funcional. En la Tabla 2-1, aparece el Amoníaco como una excepción y se asemeja en parte al agua en su Calor de Vaporización, Capacidad Calórica y Calor de Fusión. Esto se debe a su capacidad de formar enlace Hidrógeno, ya que es una molécula asimétrica similar a la del agua. A diferencia de ella, cuenta con un solo par de electrones sobre el Nitrógeno, siendo capaz de formar en promedio un enlace hidrógeno por molécula y no dos como es el caso del agua. La elevada Tensión Superficial del agua favorece la formación de gotas y capas protectoras de la humedad. En este caso la interacción H2O-H2O es mayor que la interacción H2O-aire, evitando así su rápida evaporación. Esta característica se asocia a la Capilaridad, que es la capacidad del agua para ascender, al interaccionar electrostáticamente con las paredes de los vasos capilares. Esta propiedad se emplea en la naturaleza para subir agua desde las raíces hasta la copa de los árboles con 30 o más metros de altura. A la vez la evaporación del agua en las hojas superiores expuestas al sol provoca la concentración de las sales, produciendo un gradiente osmótico el cual es suficiente para tirar de las moléculas de agua hacia arriba como los eslabones de una cadena.

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El valor de la Constante Dieléctrica (D), hace del agua uno de los solventes más polares, ya que puede aminorar las fuerzas atractivas o repulsivas de los iones de una sal al interponerse entre las cargas. Esta propiedad contribuye al plegamiento de las proteínas solubles contribuyendo a que alcancen una conformación determinada. Volver al inicio c) PUNTO TRIPLE DEL AGUA (fig. 9-1). El agua presenta un punto de triple coexistencia para el estado sólido, líquido y gaseoso. Presión ( Atm )

evaporación Líquido

1.000

Vapor condensación

100

A

fusión

Líquido

Hielo

congelación

10 1.0

sublimación

1 atm

C

Hielo

Líquido

0,1

Vapor

0,01

0,00603 atm

B

0,001 0,0098 ºC

- 20

0

20

40

60

Temperatura ( ºC ) 80 100 120

Fig. 9 – 1. Gráfico presión versus temperatura del agua.

A 0,0098 ºC y 0,00603 atm se encuentra el punto triple del agua, donde puede coexistir como sólido (hielo), gas (vapor) y líquido. En la curva A coexisten Hielo y Líquido, mientras que en la B Hielo y Vapor, finalmente en la C coexisten Líquido y Vapor. En el punto triple el hielo se puede fundir, evaporar y sublimar ( paso de sólido a vapor ) al mismo tiempo. Volver al inicio

d) EL AGUA COMO UN BUEN SOLVENTE.

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La disolución en el agua de cualquier molécula dependerá del delicado equilibrio entre la energía entrópica del agua (tendencia a la disolución) y la energía de formación y ruptura del enlace hidrógeno mismo. De esta manera las substancias POLARES, con o sin carga o solo diferenciales de carga, se disuelven en el agua al tratar de igualar su concentración en el volumen total de solvente en que se encuentran. Este efecto se logra por medio de su interacción con el agua, lo que significa que estas moléculas son más estables termodinámicamente cuando se encuentran disueltas, que cuando ambos iones de una sal interaccionan consigo mismo. De esta manera las fuerzas electrostáticas en la molécula de sal al interponerse el agua se hacen menores que las interacciones Catión-Agua y Anión-Agua. La constante D es una medida de lo que se interpone entre dos cargas que se atraen o repelen y se encuentra considerada en la Ley de Coulomb, como un factor inversamente proporcional a la fuerza de atracción o repulsión entre las cargas de la ecuación 1-1: 1 F=

------D

Q1 x Q2 --------------------r2

ECUACION 1-1

F: Fuerza con que se atraen o repelen cargas de distinto o igual signo Q1 y Q2 : Cargas de igual o distinto signo r2: El cuadrado de la distancia entre las cargas D: Constante Dieléctrica AGUA

+H

SAL

_

+

_

2

+

O

H

+

_

_

+

Fig. 10 - 1. El agua se interpone entre las cargas positivas y negativas de una sal.

Cuando D = 1, las cargas están en el vacío y nada se interpone entre ellas. Sin embargo al adicionar moléculas de agua la fuerza de atracción o repulsión entre las cargas de una sal disminuirá, ya que cada ion estará solvatado o hidratado con una o varias capas de moléculas de agua interpuestas entre las cargas. El Oxígeno del agua estará más próximo al ion de carga + y los Hidrógenos estarán más cerca al ion de carga - (fig. 10 -1). Volver al inicio

e) EL AGUA ES RESPONSABLE DE LAS INTERACCIONES HIDROFOBICAS. Las moléculas hidrofóbicas no presentan interacción de ningún tipo con el agua, pues no poseen diferenciales de carga, ni cargas puntuales. Al entrar en contacto con las

17

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

moléculas de agua, restringen el movimiento de estas e impiden su libertad de agitación, rotación, traslación, etc. En presencia de varias moléculas hidrofóbicas, se intensifica este efecto y el agua no puede continuar con sus agrupaciones de carácter oscilante que persiguen la máxima entropía u desorden. Como la capacidad para dispersarse o desordenarse de las moléculas de agua fluida disminuye, lo que es termodinámicamente anormal. La única manera de volver al desorden anterior, es mediante una nueva agrupación o distribución de menor energía. De esta manera se logra la estabilización entre las moléculas de agua y las moléculas hidrofóbicas amfipáticas (moléculas con una parte

Acido Graso _ O

O

C

H

C C

H

H H

H

H

C C C

H

H H H

C

H H

H

H H

C C

H

C C C

H H H

C

H

C C

H H

C

H

H

C

H

H

H H

C H

H H

H C

H

C H

H H

H H

C

H

H H

C

H

C

C C

H

O

O

O

O

H

H

C

H

Parte polar del Acido Graso _ _

C

H H

H

C

H

H

O

O

C

H H

Acido Graso _

C C C

H H H

Fig. 11 - 1. Al agruparse las moléculas de ácido graso permiten que las moléculas de agua ganen en libertad.

hidrofóbica y otra polar). Se agrupan estas últimas escondiendo la parte hidrofóbica, que no interactúa con el agua y dejan expuesta solo la parte polar (fig. 11-1). Esta nueva agrupación, es la solución a la búsqueda del equilibrio y permite ganar en libertad a las moléculas de agua, para así aumentar el número de moléculas en desorden, ya que la superficie expuesta por una agrupación de moléculas hidrofóbicas es menor que la suma de las superficies individuales (fig. 11-1). Por ello el término de interacción hidrofóbica es más preciso, que hablar de enlace hidrofóbico. Este último en realidad no existe, debido a que la agrupación de moléculas hidrofóbicas se produce solo por incremento de la entropía del agua y no por enlace entre las moléculas. En las estructuras correspondientes a bicapas de fosfolípidos se produce un acoplamiento entre la interacción hidrofóbica del ácido graso y el enlace hidrógeno del agua. La primera de ellas tiene una entalpía positiva (Tabla 3-1), es decir toma energía del medio para estabilizarse y la segunda como lo es el enlace hidrógeno, entrega energía hacia el medio para ganar estabilidad. De esta manera ambas interacciones alcanzan el equilibrio termodinámico acoplándose entre sí (fig. 11-1). Un a vez en contacto los Lípidos se produce la interacción Van der Waals que examinaremos a continuación. Tabla 3-1. ENTALPIA DE LAS INTERACCIONES DEBILES

18

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

INTERACCIONES

Entalpía de formación Kcal / mol

VAN DER WAALS

-1

ENLACE HIDROGENO

-3 a -7

ENLACE ELECTROSTATICO

-5

INTERACCION HIDROFOBICA

+1 a +3

Entre las interacciones que tienen importancia biológica (Tabla 3-1), existe una con aproximadamente diez veces menor energía que el enlace hidrógeno y de muy corto radio de acción, esta interacción es la llamada fuerza de Van der Waals (fig. 12-1).

Energía Repulsión

Atracción

Radio Van der W aals Fig. 12 - 1. La Interacción Van der Waals ocurre entre ambas nubes electrónicas y su radio indica cuanto se pueden aproximar ambos átomos antes de que se repelan. Mientras más abajo se prolonaga el pozo de energía, la interacción será más estable y mientras más ancho sea este, la distancia entre uno y otro átomo será mayor.

Su existencia se debe a las fluctuaciones de carga que ocurren entre las nubes electrónicas de las moléculas de Fosfolípido en estrecha proximidad. Así las variaciones que ocurren en la densidad electrónica de la nube producen pequeñas variaciones en la carga. Por esta razón el sitio más probable en que se encuentran los electrones tendrá una densidad de carga negativa y el sitio menos probable tendrá una densidad de carga positiva A temperatura ambiente este tipo de interacción electrostática es muy débil para mantener una estructura, a menos que se trate de polímeros de gran tamaño. Esto sucede en aquellas estructuras denominadas bicapas y micelas. Por ejemplo en una bicapa cerrada las moléculas hidrofóbicas se ordenan primero de acuerdo a la contribución del agua y posteriormente se refuerza esta estructura por la interacción Van der Waals (Fig. 13 -1 ).

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Volver al inicio f) EL AGUA ES CAPAZ DE IONIZARSE. La molécula de agua se encuentra en equilibrio con uno de sus hidrógenos, es decir este puede unirse o soltarse de la molécula en una proporción muy baja. Sin embargo, esta es suficiente para permitir la transferencia de carga o conducción no solo por el movimiento de difusión de los iones H+ y OH-, sino que también por efecto túnel. Este último efecto se detectó debido a que las cargas se desplazan por el agua más rápido de lo que difunden sus iones. Es decir, el hidrógeno unido covalentemente al Oxígeno puede dejar su electrón con este último y saltar al siguiente átomo de Oxígeno uniéndose por enlace Hidrógeno. De esta manera se produce una molécula negativa que posee el electrón y que se llama ion Hidroxilo y otra molécula positiva que le falta el electrón llamado ion Hidrógeno, que cuando esta hidratado se llama ion Hidrónio (fig. 14 -1).

_

+ H - O + H - O

H - O

H - O

H

H

H

H

Io n e s =

H - O – H

+

H -O

H H id ro n io

e

H id ro x ilo

Fig. 14 - 1. Ionización del agua.

La transferencia de protones en el agua ocurre entonces por efecto túnel (fig. 14-1), el cual es de suma importancia dentro de los mecanismos celulares, ya que permite la generación de gradientes quimiosmóticos a través de membranas tanto en la Mitocondria como en el Cloroplasto y a la vez es un factor que contribuye a bajar la barrera de energía en el caso de las reacciones catalizadas enzimáticamente. Volver al inicio 3) IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL AGUA.

Fig. 13 - 1. Fosfolípidos en contacto con el agua se agrupan en bicapas, micelas y liposomas.

Bicapa

20

Micela

Liposoma

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

En esta sección se observarán los distintos mecanismos por los cuales algunas macromoléculas han evolucionado químicamente en contacto con el agua y a la vez han llegado a adaptarse para ser biológicamente funcionales a temperaturas extremas. El agua contribuyó al desarrollo de la vida a nivel macromolecular, ya que en los mares tanto primitivos como actuales sirvió de reservorio y amortiguador de la energía calórica evitando los cambios bruscos de clima. Por otro lado, contribuyó a nivel microscópico donde mediante su interacción mantuvo la integridad funcional y estructural de las macromoléculas biológicas permitiendo la evolución química de estas. La debilidad del enlace hidrógeno entre las mismas moléculas de agua y entre ellas y los grupos funcionales de las macromoléculas, la hace responsable de la actividad dinámica. Esta última les permite cambiar de conformaciones ajustándose a sus distintas actividades biológicas. Por lo tanto grupos con uniones lábiles como: -C=O---H-N- , -O-H---O=C- , -S-H----O=Cson bastante comunes tanto entre proteínas como ácidos nucleicos. Contrario a lo anterior es la total rigidez estructural hallada en los cristales de grafito y diamante debido al enlace covalente del carbono. Estas formas son incapaces de cambiar de conformación y por lo tanto incompatible con la vida. En resumen podemos concluir que el agua es:

H

+ O

H O

H

H

H

H

+ H O

O

H

H

H

H

-

H

O

O

H

O H

-O

H 0.8 A 2.8 A

H

o o

Fig. 15 – 1. Efecto de transferencia de carga en el agua.

1) Un Dipolo.

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

2) Interacciona con otras moléculas y consigo misma por medio del enlace Hidrógeno. 3) Es un buen solvente ya que se interpone entre las interacciones polares. 4) Es responsable de las interacciones hidrofóbicas. 5) Es capaz de ionizarse transfiriendo cargas positivas y negativas al formar los iones Hidronios(+) e Hidroxilo(-). 6) Presenta efecto túnel mediante el cual las cargas se mueven más rápido que los iones (fig. 15-1). 7) Todas las moléculas que son parte de los organismos han evolucionado químicamente en contacto con el agua o apartándose de ella. Las interacciones entre el agua y las macromoléculas son necesarias para la función de estas últimas. 8) Sin la presencia de agua no existe la formación de estructuras dinámicas complejas, aunque se puede mantener latente estructuras aún viables que han sido formadas previamente en contacto con el agua, como sucede en la anhidrobiosis. Volver al inicio a) COMPATIBILIDAD DEL AGUA CON LA VIDA A BAJAS TEMPERATURAS. La aparición de la vida en el planeta Tierra se desarrolló sobre la base de las propiedades del agua. Esta molécula permite la vida a las temperaturas que consideramos normales y también a aquellas temperaturas consideradas extremas, como son bajo los 0oC y por sobre los 90oC. De esta manera tenemos como ejemplo los mares árticos, donde en vez de restringirse la vida por una esperada “baja flexibilidad molecular”, junto a una pérdida de fluidez experimentada tanto por proteínas y membranas biológicas respectivamente, se encuentra la mayor proliferación de especies, entre ellas el Plancton. Esto se debe a que tanto proteínas como membranas han evolucionado en estos organismos para ser tan “flexibles” a una menor temperatura tan como a una temperada. Otra de las propiedades que permite la vida en estas condiciones es que el hielo flota debido a su baja densidad, junto al hecho de que los gases como el Oxígeno, son más solubles en los mares fríos que en los tropicales, permitiendo una rica oxigenación bajo su superficie. Al bajar la temperatura a 0oC el equilibrio entre las distintas agrupaciones de moléculas de agua, que alternan en las proporciones 1/1,1/2,1/3, 1/4, se desplazan hacia la ¼, que es la más rígida. De esta forma por ausencia de agitación térmica, las moléculas generan un cristal de agua pura, que se propaga y crece con una densidad 10% menor que la del agua líquida. Solamente a -1.9 oC se forma hielo en el mar, debido a la presencia de las sales que se interponen entre las moléculas de agua. La interacción agua-sal retarda la interacción progresiva agua-agua, que lleva a la formación del cristal de hielo. Por otro lado, en los Polos y sus cercanías, las temperaturas pueden alcanzar los -20oC y aún ser compatibles con la vida, como se ha demostrado en aquellos organismos que no poseen sangre caliente. En estos especimenes la vida se desarrolló o se adaptó a las

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

características del agua, mediante mecanismos que retardan o disminuyen la cristalización de esta. En algunos casos se ha observado que los líquidos corporales de algunos insectos en Alaska o Siberia, soportan hasta –55°C sin formar hielo. El origen de esta propiedad se atribuye a la presencia de ciertas moléculas especiales, que actúan como inhibidores de la formación de cristales y que no se hallan presentes en los organismos de zonas temperadas. Al analizar algunos de los mecanismos que mantienen la viabilidad de los sistemas biológicos a bajas temperaturas nos encontramos con varias sorpresas. Entre ellos se encuentra como una primera barrera las Propiedades Coligativas, que dependen de la cantidad de soluto que se encuentra en una disolución y permiten bajar la temperatura hasta los -1,9oC sin formar hielo. A mayor concentración de soluto en los líquidos biológicos menor será el punto de congelación alcanzado, debido a que el agua como dipolo prefiere interaccionar mucho más con un soluto con carga que consigo misma. Sin embargo existe el inconveniente de que si se aumenta la concentración de sal para permitir una temperatura aún menor a los -1,9oC, las sales pueden contribuir a precipitar a las proteínas retirando el agua de la superficie de estas. Sin embargo, es posible sortear esta barrera con otros mecanismos como se verá más adelante. Para analizar el primer mecanismo involucrado se debe considerar la distribución del agua en tres fracciones (fig. 16 -1):

+

Los solutos polares capturan moléculas de agua y disminuyen el % de agua estructurada (¼) por lo que bajan el punto de congelación como sucede en el agua de mar

+

Na

Na

Distribución al azar Cl

La distribución del agua en las distintas proporciones de 1/1,1/2, 1/3 y 1/4 ocurre en el agua fluida

-

+

Na

Cl

-

1/2 1/1

1/3

+

Na

1/4

Cl

-

Agua de solvatación

Cl

-

La propagación del agua estructurada (1/4) o formación de hielo en el mar ocurre a -1,9 ºC a causa del NaCl en la conc. de 32 gr/lt

Fig. 16 - 1. El agua se distribuye en distintas fracciones. El equilibrio entre las fracciones dependerá de la temperatura y concentración del soluto, en este caso NaCl.

1) el agua que forma parte del hielo como agua pura. 2) el agua fluida que forma agrupaciones alternantes.

23

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

3) el agua que solubiliza o interacciona con los iones o proteínas en su superficie, llamada también agua de solvatación. Las moléculas de agua se encuentran distribuidas entre estas tres fracciones y sucede que al bajar la temperatura, se incrementa el agua estructurada o la agrupación correspondiente al hielo. Sin embargo, cuando una sal se encuentra disuelta en el medio lo hace con menos facilidad, debido a la competencia que ocurre entre las moléculas de agua por agruparse con los cationes y aniones de la sal (fig. 16 -1). Volver al inicio b) COMO SE ADAPTAN LAS PROTEINAS A LAS BAJAS TEMPERATURAS.

Distribución al azar en el agua fluida

Gran número de moléculas de agua retenidas por proteína altamente polar

+

+ + + _

+ _

Agua 1/4

Distintas fracciones que forman el agua fluida

_ _

Las moléculas de agua retenidas por la proteína polar adoptan fácilmente la proporción de ¼ formando hielo y denaturando a la proteína polar por compresión mecánica

Proteína parcialmente hidrofóbica que retiene menos moléculas de agua y no favorece la formación de cristales

20ºC

0ºC

DISMINUCIÓN DE LA TEMPERATURA Fig. 17 - 1. El agua interacciona con la carga superficial de una proteína.

Al continuar extendiendo el punto de congelación por debajo de lo permitido por las propiedades Coligativas, debemos considerar como sería el comportamiento de una proteína normal y otra adaptada a este ambiente. En el primer caso tenemos una proteína soluble en agua cuya temperatura óptima es de 37oC, en ella se encontrará una capa de hidratación externa especialmente en los sitios donde se asoman los residuos de los aminoácidos con carga y mientras más polar sea mayor es su interacción con el agua y a la vez será más soluble. Por lo tanto al bajar la temperatura, se producirá una mayor interacción entre las moléculas de agua ya que

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permanecerán inmovilizadas en su superficie. Estas moléculas participarán en la formación de centros de nucleación o estructuras donde la interacción entre las moléculas es de ¼. Este centro de nucleación contribuye a la formación y crecimiento del cristal de hielo (fig. 17 1). Posteriormente la expansión de estos cristales comprimirá a la proteína denaturándola. En el caso contrario, cuando una proteína logre adaptarse a las bajas temperaturas, deberá ser capaz de permitir cambios conformacionales compatibles con su función y a la vez buscar una manera de disminuir el exceso de hidratación "paralizante" en su superficie. Este efecto se puede lograr aumentando levemente su carácter hidrofóbico en la superficie, pero no lo suficiente para salir de la solución y precipitar. Esto se logra con el cambio de un aminoácido polar por otro hidrofóbico en un lugar crítico de la proteína. De esta manera se puede disminuir la capa de hidratación disminuyendo el número de moléculas de agua inmovilizadas cerca de las cargas superficiales debido a un vecindario de residuos de carácter hidrofóbico. Por otra parte, la proteína en su interior debe disminuir la interacción interna entre los residuos de los aminoácidos, así se hace más flexible para experimentar cambios conformacionales frente a un medio menos dinámico, como lo es el agua a baja temperatura que disminuye los choques contra la macromolécula. En resumen, cuando una proteína se adapta para ser funcional a bajas temperaturas disminuye el grado de interacción interna y aumenta su hidrofobicidad superficial. Volver al inicio c) ADAPTACION TEMPERATURAS.

DE

LAS

BICAPAS

DE

FOSFOLIPIDOS

A

Adaptaciones moleculares de los fosfolípidos R

O O

CH2 CO

CH O

P

CH2 O

O O

R

Fosfato CO

CO

O CH2

CH

CH2

Glicerol

O

O

O

CO

P

O O

Eteres

R

R

O

O

O

O

Unión Eter Las ramificaciones de los ácidos grasos permiten aumentar la fluidez

de

Acido Graso

LAS

glicerol

AcidoGraso insaturadoCIS

O

BAJAS

O

Se gana rigidez por la unión de las colas de los ácidos grasos

CO O

2HC

O O

P

O CH

CH2

O CH

O O

O O

CO O

CO P

O CH2

O

O

O O

2OH C

BICAPA

R

O

MONOCAPA

R

R

R

CRIOPFILOS

O

CO

MESOFILOS

TERMOFILOS

Fig. 18 - 1. Los Fosfolípidos pertenecientes a las bicapas aumentan su tamaño y se hacen más saturados a medida que el organismo al que pertenecen se adapta a mayores temperaturas.

25

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

De similar modo a las proteínas, si una bicapa de fosfolípidos pretende ser fluida a baja temperatura, deberá disminuir su interacción interna disponiendo de ácidos grasos poliinsaturados cis y de cadena corta. De esta manera podrá disminuir el estrecho empaquetamiento que favorece a la interacción Van der Waals y que a la vez aumenta el grado de interacción lateral entre las cadenas de los ácidos grasos. Por otro lado, aquellos ácidos grasos de cadena corta e incluso con insaturaciones tipo Cis, presentan una menor contribución del agua a la agrupación estilo bicapa y la superficie de contacto entre las colas de los ácidos grasos es menor (baja interacción Van der Waals). Por ello la estructura se hace más fluida con una capacidad de cambio conformacional compatible a sus funciones, (fig. 18 -1). En cambio los ácidos grasos de cadena larga son más hidrofóbicos, ya que reciben una mayor contribución del agua para tomar la forma de micela o bicapa y presentan mayor interacción lateral (Van der Waals) con sus moléculas vecinas similares. Todos estos factores harán que a baja temperatura las bicapas de ácidos grasos largos y saturados sean rígidas, poco fluidas e incompatibles con la vida. Un segundo mecanismo que permite la vida a bajas temperaturas lo constituyen la presencia de sustancias crioprotectoras. Los polioles, compuestos orgánicos de bajo peso molecular polihidroxilados de formula R-(OH)n, que participan del enlace hidrógeno por su lado OH y bloquean la continuación o adición de nuevas moléculas de agua al cristal con su lado R. Estas substancias impiden el crecimiento de los cristales de hielo y entre ellas se encuentran el Glicerol, Sorbitol y la Trealosa (fig. 19 -1). CH

2

OH

CH

HC OH

OH

OH

2

O

OH

HO CH HO

C

HO CH

2

H

CH

2

OH

CH

HC OH CH

2

OH

2

OH

O

OH HO

GLICEROL

OH O

HC OH

SORBITOL

OH

TREALOSA

Fig. 19 -1. Los Crioprotectores se interponen entre las moléculas de agua y reducen la capacidad para formar enlaces hidrógenos. Con ello impiden la formación de agua estructurada en la forma de hielo.

Algunas de las especies que cuentan con estas defensas viven en el circulo polar Ártico como és el caso de algunos peces y moluscos, que poseen un metabolismo celular lento con acumulación de glucógeno (polímero polihidroxilado de la glucosa) en los tejidos, ya que esta molécula es rica en OH por un lado y grupos R por el otro. El glucógeno es a la vez una fuente de energía que puede fermentar anaeróbicamente.

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Un tercer mecanismo de adaptación a las temperaturas bajo 0oC aparece en las ranas, tortugas, peces e insectos que hibernan a temperaturas inferiores a los - 10oC. Estos organismos corren un riesgo calculado que consiste en permitir la formación de hielo, pero de manera controlada y solo en los espacios extracelulares. Se logra este objetivo mediante proteínas de pequeño tamaño altamente polares que actúan como centros de nucleación (lugar donde se inicia la cadena de unión de las moléculas de agua) en los espacios extracelulares. La formación de los cristales de hielo es controlada en su crecimiento por otras proteínas y polipéptidos. Estos últimos cubren la superficie del cristal (fig. 20 -1) e impiden la adición de nuevas moléculas de agua a la estructura cristalina. Por otro lado, el calor de fusión liberado por la cristalización controlada o modulada, se puede transmitir al espacio intracelular para mantener a este último de manera fluida y funcional. Cerca del 65% del agua corporal, es capaz de ser congelada por este mecanismo, especialmente en los moluscos que sobreviven a la baja marea y quedan expuestos por horas a temperaturas de - 20oC o inferiores. La disminución del agua extracelular fluida debido a la formación de cristales, plantea en este caso un problema extra que se relaciona con el control del volumen interno de la célula. Como existe en el espacio extracelular menos agua para mantener a las distintas sales allí presentes en forma soluble. Estas últimas se concentran y producen un shock osmótico, sacando agua intracelular y permitiendo la entrada de sales a la célula. Para evitar este problema, es importante la cantidad de hielo extracelular permitido por estos organismos. Es necesario que los cristales de hielo sean frenados en su crecimiento y alcancen un tamaño determinado antes de que provoquen un shock osmótico.

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Por otro lado, estos organismos deben ser aptos para sobrevivir sin aporte de oxígeno y a la

LEC CRIS TA L . . .

. .

.

.

Proteínas que actúan como centros de Nucleación

. .

.

. .

. .

. .

.

. .

. .

.

. .

Capa de Trealosa ( disacárido) que se une a la carga - de los Fosfol'ipidos disminuyendo su interacción con el agua.

. .

. . .

.

. LIC . .

.

.

.

Polioles

.

.

.

. .

. . .

.

. .

Proteínas que . impiden la propagación del cristal de hielo

.

.

GLICEROL En el interior impide la congelación

L E C : Líquido extracelular LIC

: Líquido intracelular

Fig. 20 - 1. Algunas proteínas actúan como centros de nucleación mientras que otras cubren el cristal para que no crezca demasiado.

vez eliminar los productos tóxicos formados en sus tejidos. Para suplir esta carencia, algunas de sus vías metabólicas anaeróbicas se encuentran exacerbadas. Entre las proteínas resistentes al frío se ha encontrado que algunas de ellas son capaces de inducir la formación de cristales en su superficie, debido a que poseen un 40% de su composición con aminoácidos hidrofílicos, tal como Glu, Gln y Thr. Por otro lado aquellas proteínas que limitan el crecimiento del cristal al cubriendo la superficie de este, aún no ha sido determinada. Sin embargo, deben tener un carácter dual. Por un extremo deben unirse a la superficie del cristal mediante enlaces electrostáticos como el enlace hidrógeno y por el otro extremo, deben ser capaces de repeler moléculas de agua al exhibir grupos hidrofóbicos. De esta forma el cristal de agua no puede continuar agregando nuevas moléculas para crecer ya que se encuentra bloqueado y se evita el incremento de la osmolaridad del medio.

Volver al inicio d) COMPATIBILIDAD DEL AGUA CON LA VIDA A ALTAS TEMPERATURAS.

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Parece ser que la temperatura más alta tolerada por los pluricelulares es de 60oC, donde proliferan algunos protozoos, algas y champiñones. En cambio los procariontes pueden desarrollarse normalmente a temperaturas de 95oC y en algunos casos como las Archeobacterias a temperaturas superiores a esta. Para predecir como se adaptarán las macromoléculas hay que entender el comportamiento del agua a altas temperaturas. Si la agitación térmica del agua aumenta con la temperatura, la fracción de moléculas que forma agrupaciones alternantes disminuye, hasta que todas las moléculas se encuentran agrupadas al azar y finalmente pasan en grupos a la fase vapor, ya que la energía de agitación es mayor que la energía de los enlaces hidrógenos que retienen a las moléculas en la fase líquida. En realidad la vida en el mar a temperaturas superiores a 95oC ocurre a grandes profundidades. En dichos ecosistemas la agitación molecular del agua a la presión de 265 atmósferas, no tiene la intensidad suficiente como para denaturar una proteína o una bicapa lipídica.

Volver al inicio e) ADAPTACION DE LAS PROTEINAS A ALTAS TEMPERATURAS. Si una proteína tiene una actividad óptima entre 37 y 42oC, significa que tiene capacidad para cambiar de conformación a pesar de la influencia ejercida sobre ella por su capa de hidratación externa. Existirán diversos espesores en la capa de hidratación según el grado de solubilidad que tenga la proteína y a la vez esta capa podrá variar de un sector a otro de su estructura, según la distribución de las cargas presentes en la superficie. Por otro lado, en el interior de la proteína existirán tanto interacciones hidrofóbicas, como interacciones electrostáticas, enlace hidrógeno, puentes disulfuro y probablemente coordinación con algún metal. Todas estas interacciones son del tipo débil a excepción del puente disulfuro (Tabla 3-1). En otras palabras los tirantes que mantienen la estructura de la proteína en solución no son todos iguales y algunos están sometidos a mayor tensión que otros, existiendo puntos críticos para mantener la conformación óptima para cumplir con una función específica a una temperatura determinada (fig. 21 -1). Es por esta razón, que las distintas interacciones débiles contribuyen mucho más que los enlaces covalentes, durante el proceso que ha permitido la adaptación de las proteínas a distintas temperaturas. El cambio adaptativo experimentado por las distintas especies ha permitido que las interacciones débiles sean substituidas por otras más resistentes del mismo tipo (enlace hidrógeno por puente salino). De esta manera algunas mutaciones han seleccionado la existencia de proteínas y bicapas que mantienen la capacidad funcional a altas temperaturas. Este análisis es válido al comparar la misma proteína o enzima en bacterias Criófilas (0 - 4oC), Mesófilas (temperatura ambiente) y Termófilas (90 - 97oC). Resumiendo, el aumento de la capa externa de agua junto a los sutiles reemplazos de aminoácidos, como Glutamina (Gln) por Glutámico (Glu) y en otros casos de Treonina (Thr) por Lisina (Lys) en lugares críticos de la estructura, permite que las interacciones por enlace hidrógeno sean sustituidas por interacciones electrostáticas. Este efecto confiere mayor rigidez estructural a la proteína, para así tolerar la elevada agitación molecular del agua y a la vez le permite ser una entidad dinámica compatible con la vida. Hasta la fecha no se ha observado en las proteínas un aumento de las interacciones fuertes como es el enlace

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

covalente, como mecanismo adaptativo para adquirir mayor tolerancia a las altas temperaturas.

Cam bio de Gln por Glu Aum ento de la Tem peratura

H is

H is

G ln

G ln

G lu

Lys Proteína

Glul u G Lys

Sim ilar proteína a la

inestable a 70 oC

anterior estable a Enlace Hidrógeno

70 oC

Interacción Electrostática

His

G ln

H is

G lu

G ln

Lys

G lu

Lys

Fig. 21 - 1. La proteína aumenta sus interacciones internas para tolerar el mayor número de choques con el agua a mayor temperatura.

Volver al inicio f) ADAPTACION DE LAS BICAPAS DE FOSFOLIPIDOS A LAS ALTAS TEMPERATURAS. Una bicapa tendrá ácidos grasos de cadena mucho más larga y saturada permitiendo una mayor interacción de tipo Van der Waals, para conservar la estabilidad a altas temperaturas. Los ácidos grasos insaturados, cortos de tipo cis son más libres y no están en estrecho contacto, por lo que no pueden tolerar un aumento del número de choques con la suficiente rigidez estructural y terminan por separarse. Para superar este problema, se favorece la presencia de ácidos grasos largos y saturados. En algunos casos se les ha encontrado ramificados y unidos por la cola en una monocapa. (fig. 18 -1) De esta manera la monocapa (antigua bicapa) podrá tolerar una mayor temperatura de fusión al estar formada por ácidos grasos de tamaño doble con dos cabezas polares, debido al aumento de la interacción Van der Waals entre las superficies de estos. Estas moléculas se encuentran agrupadas en estrecho contacto debido a sus ramificaciones laterales. Estos cambios permiten aún la fluidez necesaria para llevar a cabo sus funciones a altas

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Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

temperaturas, considerando el efecto contrario al incremento de rigidez causado por los choques de las moléculas de agua sobre la unión en monocapa.

Volver al inicio 4) LA VIDA SIN AGUA O ANHIDROBIOSIS El agua es extremadamente importante para las Proteínas, Lípidos y estructuras anexas. La falta de agua conduce a la pérdida de la estabilización de ellas, es decir se abren y muestran sus zonas hidrofóbicas denaturándose, sin embargo semillas de trigo guardadas por miles de años en las pirámides, aún son fértiles a pesar de que se encontraban totalmente secas. Por otro lado huevos o quistes de Artemia Salina (crustáceo que prospera en salares), carecen totalmente de agua, al ser esta evaporada por el Sol y extraída por la osmolaridad de la sal, sin embargo una vez devueltos al agua se hidratan y pasan a ser fértiles. El mecanismo por el cual se preservan las estructuras tanto en las semillas como quistes, se debe a que el agua que rodea las zonas hidrofílicas de las estructuras, ha sido reemplazada en estos casos por grupos OHs, provenientes de Trealosa (dos moléculas de Glucosa) y Sucrosa (una Glucosa y una Fructosa). Ambos disacáridos se encuentran presentes en gran cantidad en aquellos organismos anhidrobióticos latentes junto al Glicerol, el cual es un alcohol polihidroxilado. De esta forma es posible mantener los enlaces hidrógeno y con ello preservar las estructuras para que permanezcan viables. A pesar de que estos organismos desecados, no realizan metabolismo de ningún tipo, son capaces de mantener sus estructuras intactas y se les considera como vivos, aunque latentes gracias al reemplazo de los grupos Hidroxilos del agua por aquellos de los Hidratos de Carbono, que comprenden moléculas como almidón, glicógeno y polialcoholes.

Volver al inicio

5) PRODUCTO IONICO DEL AGUA. Como hemos visto anteriormente, el agua también puede disociarse y existe un determinado equilibrio regido por la ley de acción de masas entre el agua como molécula y sus productos de disociación: H2O H + + OH No ocupamos aquí, la denominación de ion Hidrónio H3O+ que en la realidad se encuentra tetrahidratado como H9O4 +, sino que emplearemos al ion H + por comodidad. El otro ion del agua es el OH - que también se encuentra hidratado. Para calcular la constante de equilibrio de la disociación del agua debemos considerar primero: a) la concentración del agua [H2O] en el agua dentro del volumen de un litro, que es 1000gr/18 peso molecular agua = 55,6 moles/litro.

31

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

b) la concentración de los iones H+ y OH -, será la probabilidad de encontrar uno de los dos iones libres del agua en la concentración molar del agua, este producto entrega un valor de 0,0000001 moles /litro y para cada ion es de 10-7 M. El Equilibrio entonces, será de: Keq = (0.000000001)x(0.000000001)/55,6 Keq = (10-7 M x 10-7 M)/55,6 M o

Keq = 1.8 x 10 - 16 moles/litro

Como 55,6 M es constante se incorpora entonces al valor de Keq, para dar Kw o el producto de solubilidad del agua que es: Kw = Keq x 55,6 = 1,01 x 10 - 14 Kw, expresa la relación de concentraciones de los iones H+ y OH - en solución acuosa. El ion hidrógeno puede disminuir y el ion hidroxilo aumentar o viceversa, sin embargo mantendrán siempre la misma proporción de 1,01 x 10 - 14: Kw = [H+ ] x [OH -] = 1,01 x 10 - 14 La Kw es la base para determinar la concentración de iones Hidrógenos en una solución o el factor conocido como pH. Todas las sales al disociarse en el agua liberan o atrapan una cierta cantidad de protones aumentando o disminuyendo la concentración de estos. En el primer caso las soluciones son consideradas como ácidas y en el segundo como básicas. La concentración de los iones hidrógenos se ve alterada, desde la neutralidad a 10 - 7 moles/litro [H +] o bien desde pH 7, hasta la concentración real de los nuevos iones presentes en el agua. El concepto de pH permite evitar la expresión con tantos ceros para la concentración del ion hidrógeno y emplear solamente el exponente de la potencia que solo representa el valor de la concentración del ion hidrógeno. De esta manera la concentración de 0.0001 tiene un pH de 4 y la concentración de 0.001 tiene un pH de 3 y así sucesivamente. La expresión que relaciona el valor de la concentración del ion hidrógeno con su exponente esta dada por la ecuación: [H+] = 10 -

pH

pH = log 1/[H+] = - log [H+] Así tenemos que:

[H+]M 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5

32

[H+]M 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001

pH 1 2 3 4 5

etc.

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Volver al inicio 6) AMORTGUADORES O TAMPONES. Los tampones son sustancias que mantienen el pH o la concentración de los iones hidrógenos constante en una solución. Esta función es llevada a cabo por medio de un mecanismo que permite liberar protones cuando el medio se pone básico y atrapar protones cuando el medio se pone ácido. Por ejemplo, un aminoácido puede ser considerado como un anfótero que puede donar o aceptar protones, más aún puede ser considerado como un ácido débil que puede entregar varios protones a medida que el pH del medio sube desde el valor 2 hasta 10. El aminoácido Glutámico (Glu) a pH = 7 por ejemplo, puede ser representado en solución por la siguiente especie química: H + ( α-Amino) H3N - C(α) - COO (α-Carboxilo) CH2 ( Residuo CH2 γ – Carboxilo) COO A este pH vemos que sus tres grupos están ionizados siendo un aminoácido de carácter polar y su carga es en estas condiciones será de -1, ya que se anulan la carga positiva con la negativa. El mismo aminoácido presenta a pH 1 la siguiente especie química:

+

H H3N - C(α) - COOH CH2 CH2 COOH

Esta especie se encuentra totalmente protonada con una carga de +1. +

El aminoácido Glutámico a su vez posee tres grupos: α-COOH, α-NH 3 y γ-COOH que pueden conferirle el carácter de un ácido débil, ya que puede entregar tres protones con distintas constantes de disociación:

K1= 0 , 0 0 5 0 1 (α-Carboxilo) α- COOH (α-Carboxilo ) α– COO - + H + K2=0 , 0 0 0 0 6 3 (Residuo-γ-Carboxilo) γ-COOH (Residuo-γ- Carboxilo) γ-COO - + H+

33

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

K3 =0 , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 9 (α-Amino) α- NH+3 (α-Amino) α– NH 2 + H+ El K1=0,00501 es del α-Carboxilo que libera el primer protón por ser más ácido, en seguida sale el segundo del grupo γ-Carboxilo con una K2=0,000063 y finalmente sale el tercero perteneciente al grupo α-Amino con una K=0,00000000199. En general los aminoácidos ácidos, como Glutámico y Aspártico pueden ionizarse al cambiar la acidez del medio desde pH 1 a 10. El grupo más ácido o de menor pKd (mayor Kd), tenderá a entregar el ion H+ primero (α-COOH), luego vendrá el segundo (γ-COOH) de Kd intermedio y finalmente el menos ácido de todos (α-NH3+) o de menor Kd (mayor pKd), que entregará el protón cuando el medio sea francamente básico. Lo anterior significa que cada uno de los grupos ionizables tiene una constante de disociación distinta: Kd

pKd

α-COOH γ-COOH α- NH3

: K1=0.00501 : K2=0.000063 : K3=0.000000000199

= 5.01 x 10-3 = 6.3 x 10-5 = 1.99 x 10-10

= 2,19 = 4,25 = 9,67

Como es un tanto difícil hablar de cantidades decimales con tantos ceros, es mucho más ventajoso expresar solo los exponentes de base 10. Con este propósito se emplea el término de pK. Así tenemos que: 1 pK = log ---- = - log Kd Kd De esta manera una: K1 = 0.00501 o 10 –2 ,3 corresponde a un pK de 2.3 y con similar tratamiento: K2 = 0.000063 corresponde al pK de 4.2 y para: K3 = 0.000000000199 el pK corresponde a 9.7

Los residuos de aminoácidos con bajo pK serán ácidos y los con alto pK serán básicos. En las figuras que aparecen en 22-1 a, b y c, podemos apreciar las especies químicas formadas junto a las curvas de titulación del aminoácido Glutámico, desde pH 1 a pH 10. Al analizar sus tres pKs empleando la ecuación de HENDERSON-HASSELBALCH, es posible caracterizar cada una de las etapas de disociación o la salida de cada protón determinada por su pK específico (fig.22a-1).

34

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

La titulación del ácido Glutámico se empieza con NaOH ecuación (2-1): [ Glu o] pH = 2,3 + log----------[ Glu +]

(2-1) o su equivalente

a pH 1 en base a la

[ AH2º] pH = 2,3 + log ---------[AH3+]

En la figura 22c -1, se observa en el gráfico de [especie química] vs pH, la especie de carga + o [Glu +], que es igual a AH3+ . Este disminuye su concentración inicial, apareciendo al mismo tiempo la especie neutra [Glu o] o AH2º, que aumenta de concentración a medida que la primera entrega su protón. A continuación se emplea la segunda ecuación (3-1), para describir el proceso donde la especie neutra en su concentración máxima de [ Glu o], dona su segundo protón con un pK de 4,2 y disminuye su concentración aumentando paralelamente la especie de carga negativa - , [Glu -] o AH-. [ Glu - ] pH = 4,2 + log-----------[ Glu 0 ]

(3-1) o

[ AH- ] pH = 4,2 + log ---------[AH2º]

Finalmente, en la tercera ecuación (4-1), que ocurre en medio básico a pH 9,7 sale el tercer protón de la especie química de carga - , [ Glu - ] con un pK de 9,67 y desde la máxima concentración disminuye al transformarse en la especie de doble carga negativa - - , [Glu - - ] o A - - , la que aumenta hacia el final de la titulación a pH 10: [ Glu - - ] pH = 9,7 + log -----------[ Glu - ]

[ A - -] (4-1) o pH = 9,7 + log ---------[ AH -]

La ecuación de Henderson Hasselbalch se puede resumir en general por: [especie química que ha dado protones] pH = pK + log --------------------------------------------------[especie química que entrega protones] Se puede concluir que después de esta titulación los aminoácidos a bajo pH < 2 tendrán carga +, mientras que a alto pH > 10 tendrán carga - . Mientras que a un pH intermedio alcanzarán su punto isoeléctrico o pI, donde la carga neta será 0. En este punto el número de cargas positivas es igual al número de cargas negativas. El pI se puede calcular sumando los pKs de los protones que se liberan en la reacción anterior y en la reacción posterior a cuando la especie isoeléctrica se encuentra en mayor concentración. En el caso del aminoácido Glutámico el pI deberá ser de: 2,3 + 4,2 pI = ------------- = 3,25 2 La curva de titulación y la curva correspondiente a la variación de la concentración de las especies químicas se observan en las figuras 22b -1 y 22c-1 respectivamente. En ellas se aprecian los cambios que ocurren en la carga y las concentraciones del aminoácido Glutámico al pasar por cada pK de su titulación.

35

Héctor Rocha L. Agua y sus propiedades

En el gráfico 22b-1, se observa que las regiones tampón estarán dadas por los "plateau" o mesetas de la curva de titulación. En este lugar la concentración de la especie química que entrega protones y la concentración de la especie que acepta protones es igual o muy cercana la una a la otra. En las tres mesetas o "plateau" de la curva de titulación de la figura 22b-1 se observa, que a pesar de la gran cantidad de equivalentes de OH agregados a la solución, solo ocurre un pequeño cambio en el pH. Este efecto significa que existen tantas zonas tampón como pKs tenga el aminoácido.

36

22 b)

22 ) Disociación y Curva de Titulación del Aminoácido Glutámico

pH

Volver al inicio COOH CH 2 CH 2

+ 3

HN

2.3 + 3

C COOH H

AH3

3HN C COO H

4.2

+

3HN

+

3HN

C COO H

AH

-

-

9.7

C COO - + H

COO CH2 CH2 2HN

A

--

2.3 AH2º = AH-

H

AH + H

-

+

AH3+ = AH2º meq de NaOH

+ Especie química

-

C COO H

+

AH- = A- -

+

-

-

AH2º COO CH2 CH2

+ H

AH2º + H COO CH2 CH2

4.2

+

HN C COO H

+

COOH CH2 CH2

+

COOH CH2 CH2

9.7

Curva de titulación a)

Curva de titulación b)

2,3 -

+H

+

AH3+

AH3+ = AH2º

H+

Fig...22a-1. Especies químicas que se forman durante la titulación Fig. 22b-1 y 22c-1. Curvas de titulación

9.7

4.2 AH-

AH2 AH2º = AH-

AH3+

22 c)

AAH- = A- -

AH2º

pH

Capítulo I El agua y sus propiedades

Al extrapolar este comportamiento a una proteína soluble que cuenta con residuos polares en su superficie, se puede deducir que será titulable y que actuará a la vez como un tampón (fig. 23 -1). En este caso los pKs individuales de cada grupo de la proteína variarán un tanto por el entorno polar de los otros residuos vecinos. En esta proteína hipotética, solo los residuos que se muestran al exterior serán titulables, aunque al cambiar sus cargas durante la titulación la proteína sufrirá también de cambios conformacionales, donde podrá mostrar u ocultar algunos otros grupos. La temperatura a la cuál se lleva a cabo la titulación será otro factor que afecte la estructura y la presencia de grupos titulables en la superficie de la proteína.

Proteína polar soluble en agua.

+

+ + +

_

+

_

+

_ +

_ +

+

+

+

+ +

+

_

_

_ +

_ +

+

+ +

+

Fig. 23 - 1. Las proteínas solubles en agua presentan carga superficial debido a los residuos de aminoácidos. Estas cargas pueden cambiar según el pH a que se encuentre el medio.

Volver al inicio

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ACIDOSIS Y ALKALOSIS EJEMPLO DE UN AMORTIGUADOR BIOLÓGICO EN MEDIO ACUOSO Para mantener un pH normal de 7,4 en la sangre participan distintos órganos como: a) los pulmones, que manejan el CO2 en la sangre mediante la hipo o la hiperventilación. b) los riñones que controlan la remoción del -HCO3 desde la sangre c) el corazón que con su ritmo es capaz de regular el tiempo de intercambio de gases en los pulmones. Durante el ejercicio los músculos emplean el Oxígeno para convertir la energía química almacenada en la Glucosa en energía mecánica. Esta última se emplea en contraer los músculos y ejecutar movimiento. El O2 empleado con este fin, proviene de la Hemoglobina en la sangre, mientras que el músculo libera los subproductos del metabolismo como son los ácidos Láctico y Pirúvico, que junto al CO2 contribuyen a bajar el pH. Si el pH es inferior a 7,4 se desarrolla una condición denominada Acidosis y si es superior a este se produce una Alcalosis. En aquellos casos donde se baja a pH 6,8 o se sube a pH 7,8 se producen graves alteraciones, ya que una serie de procesos catalíticos requieren de un determinado pH y fuera de este no se encontrarán con su desempeño óptimo. Por lo tanto, es necesaria la presencia de amortiguadores en la sangre, destacándose entre ellos el Bicarbonato que se describirá a continuación. La reacción de equilibrio del Bicarbonato es la siguiente: K1 K2 H2CO3 HCO3 CO2 + H2O

+

H+

Al respirar dentro de una bolsa aumenta la presión parcial de CO2 en los pulmones provocado por la inspiración y expiración de aire viciado. Esta condición se denomina hipoventilación y el equilibrio de la reacción se desplaza a la derecha para liberar protones y bajar el pH. Por otro lado, al hiperventilar por un estado de histeria, durante un ejercicio severo o ante un baño muy caliente, se baja la presión parcial de CO2 en los pulmones. En este caso el equilibrio se desplaza a la izquierda, donde la reacción toma protones del medio subiendo el pH. La ecuación tampón de Henderson – Hasselbalch (H-H) que se deriva de aquí es la siguiente: ( H2CO3 ) K1 =--------------------------( CO2 )

y

( H+) ( HCO3 - ) K2 =--------------------------( H 2CO 3 )

38

Capítulo I El agua y sus propiedades

Luego: H+

( H2CO3 ) K2 = ------------------------------------( HCO3 - )

y al reemplazar el ( H2CO3 ), tenemos: H+

( CO2) K2 K1 = ------------------------------------( HCO3 - )

al invertir y multiplicar por -1: 1 1 ( HCO3 - ) - -------- = - ------------------------------------K1 K2 ( CO2) H+ Se convierte en la ecuación H-H, donde el Riñón maneja el Bicarbonato ( HCO3 - ), el pulmón maneja el anhídrido carbónico (CO2) y como consecuencia se mantiene el pH constante en la sangre: ECUACIÓN HENDERSON - HASELBALCH SANGRE

( HCO3 - ) p H = pK + Log ------------------------------( CO2)

RIÑÓN PULMÓN

Ahora, como el pK del ác. Carbónico ( H2CO3 ) es de 6,1 la reacción se encuentra normalmente desplazada a la derecha en condiciones normales de pH = 7,4 en la sangre. De esta manera, la relación H2CO3 / -HCO3 se desplaza desde 50/50 % a pH 6,1 hasta la proporción de 5/95% o de 1/20 a pH 7,4: (5%) H2CO3

CO2 + H2O

pK = 6,1

-

(95%) HCO3

+

H+

Debido a lo anterior se cuenta con una mayor concentración de Bicarbonato ( -HCO3 ) capaz de tamponar a los protones que se liberen del metabolismo en los tejidos. Cuando ocurre eliminación del Bicarbonato (–HCO3) o el aumento de Anhídrido Carbónico (CO2) en la sangre, se produce una variación concomitante entre la relación de ác Carbónico es a Bicarbonato en la Ecuación de H-H:

K1

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K2

Capítulo I El agua y sus propiedades

CO2 + H2O

-

H2CO3

HCO3

Eliminación

+

H+

Aumento

Este nuevo reacomodo de la ecuación en equilibrio conduce a una Acidosis con una baja de pH en la sangre: (- HCO3 ) pH = pK + Log ------------------( CO2) Volver al inicio

a) CAUSAS DE ACIDOSIS

En general la Acidosis, se produce a causa de enfermedades como la Diabetes mellitus, la inanición o una dieta de alto contenido graso. Todos estos factores estimulan la producción de los Cuerpos Cetónicos (ác. Acetoacético y el β-Hidroxibutirato) cuyo pK es alrededor de 3,5 ( ver capítulo de Metabolismo de los Lípidos). Por otro lado se puede provocar una Acidosis mediante el ejercicio físico sostenido o cuando se producen fallas en la circulación (isquemias). La ingestión de drogas o la producción de toxinas por alguna bacteria infecciosa son capaces de estimular la producción de ác. Láctico o evitar su remoción y debido a ello se puede acumular en la sangre (Ver Capítulo de Hidratos de Carbono) bajando el pH. Existen otros tipos de acidosis atribuidos a defectos congénitos del metabolismo (Ver capítulo sobre el metabolismo de los Aminoácidos), donde algunos catabolitos de los aminoácidos se acumulan en la sangre por fallas enzimáticas. La ingestión de Salicilatos, Metanol, Etilen Glicól, Isoniazida, Hierro, Paraldehido, Azufre, Tolueno y Cloruro de Amonio pueden provocar acidosis químicas. Volver al inicio

b) CAUSAS DE ALCALOSIS

40

Capítulo I El agua y sus propiedades

Por el otro lado, existe la Alcalosis. Esta se produce cuando el Bicarbonato aumenta forzando al sistema previamente en equilibrio a sacar protones de la sangre causando que el pH suba. En general, puede ser causado por ingerir Bicarbonato como antiácido, exceso de vómitos por nauseas mal contenida o por hiperventilación que disminuye el CO2:

CO2

+

H2O

-

H2CO3

HCO3

+

H+

(- HCO3 ) pH = pK + Log ------------------( CO2) Como una aplicación de la Ecuación de H-H en los casos de Alcalosis, es posible hacer que los corredores de maratón aprendan a controlar su respiración. De esta manera se les enseñará a disminuir la hiperventilación para que no baje tanto el CO2 y se provoque una Acidosis que neutralice a la Alcalosis. En el extremo opuesto se encuentran aquellas personas que practican carreras cortas, pero intensas junto a los nadadores. Ambos tipos de deportes son propensos a producir grandes cantidades de ácido en corto tiempo. Este efecto los hace susceptibles de fatiga y calambres, sin embargo se puede retardar este desarrollo mediante la hiperventilación previa por 30 o 40 segundos. Así se introducen condiciones de Alcalosis en la sangre que ayudarán a neutralizar la acidez producida por el ácido Láctico. Aportado por

CO2 + H2O

H2CO3

-

HCO3 +

TEJIDOS HCO3 + H+

H+

Cuando uno hiperventila, el CO2 y H2O que se elimina suben el pH, sin embargo los protones son reemplazados por bicarbonato y otros protones más que provienen de los tejidos. Los pulmones y el riñón son los encargados de mantener el pH de la sangre constante. El pulmón puede responder hipo o hiperventilando rápidamente, mientras que el riñón demora días en llevar el pH a valores normales nuevamente. Cuando el pH sube (Alcalosis) los riñones remueven bicarbonato de la sangre y el equilibrio se desplaza a la derecha, aumentando la concentración de hidrógeno (bajando el pH) hacia valores normales: CO2 + H2O

41

H2CO3

-

HCO3

+

H+

Capítulo I El agua y sus propiedades

Riñón Por otro lado cuando el pH en la sangre baja (Acidosis), el riñón no remueve bicarbonato y este es aportado por los tejidos acumulándose, por lo que se une al ión Hidrógeno con lo que el equilibrio se desplaza a la izquierda y el pH sube:

CO2 + H2O

-

H2CO3

HCO3

+

Aportado por TEJIDOS HCO3

H+

Riñón no remueve bicarbonato Uno de los factores que se ha obviado hasta ahora es la velocidad con que se bombea la sangre a los pulmones. Durante el ejercicio violento, la velocidad de la sangre que pasa por los pulmones es de tal magnitud que no hay tiempo de intercambio de Oxígeno por CO2 con lo cual se obstaculiza la eliminación del CO2 y la subida del pH. Este efecto se ve exacerbado por los niveles del ác. Láctico y Pirúvico producido por el metabolismo. Por lo tanto aquellos deportistas que pueden controlar de alguna manera su ritmo cardíaco (meditación trascendental) estarán en ventaja sobre aquellos que no posean esta cualidad. La reacción de equilibrio entre el CO2 y el bicarbonato, se puede verificar fácilmente cuando se abre una bebida gaseosa y se controla su pH. ¿Cuándo es más ácida?. Cómo respuesta se puede precisar que recién abierta o cuando estuvo cerrada, la concentración de CO2 disuelto en el líquido es mayor y el equilibrio se desplaza a la derecha liberando protones y bajando el pH. CO2 + H2O

-

H2CO3

HCO3

+

H+

¿Cuándo es menos ácida? Después de un momento de estar abierta, cuando gran parte del gas CO2 disuelto en el líquido se ha volatilizado y el ion hidrógeno se ha unido al Bicarbonato desplazando el equilibrio hacia la izquierda.

CO2 + H2O

-

H2CO3

HCO3

+

H+

Existen otros tampones en la sangre, pero tienen menor relevancia y uno de ellos es el Ác. Fosfórico, cuyo pK le permite funcionar más cerca del pH de 7,4: pK = 6,8 H3PO4

-

H2PO4

+

H+

Otro de ellos es la Hemoglobina con su efecto Bohr (Ver Capítulo de Proteínas):

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Capítulo I El agua y sus propiedades

Hb (O2)4 + 4H+

Hb H4 + 4O2

donde se observa que la Hb es capaz de tomar y liberar protones según las condiciones del medio.

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REFERENCIAS. Química Orgánica de los Compuestos Biológicos. R. Barker., España, Ed. Alhambra, 1975.

43

Capítulo I El agua y sus propiedades

La Liason Hydrogene. Y. Marechat., La Recherche, Vol 20,480-488,1989. Cómo Sobreviven los Animales a la Congelación. K.B. Storey y J.M., Mundo Científico, Vol 9,482-489, 1989. La Vie a Haute Temperature. T.D. Brock, La Recherche, Vol 19, 476-485, 1988. Role of Water in some Biological Proceses. P.M. Wiggins, Microbiol. Rev., Vol 54, 432-449, 1990 The Hydrophobic Effect and the Organization of Living Matter. C. Tanford, Science,Vol 200, 1012-1018, 1978. Water, a wonder molecule. The Hindu, Thursday , Febraury 12, 1988 SECTION :Science & Tech. http://www.webpage.com/hindu/daily/980212/08/08120001.htm

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Capítulo I El agua y sus propiedades

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

INICIO:

1) LOS AMINOACIDOS 51 2) EXISTENCIA DE LOS AMINOACIDOS 52 a) Primera Hipótesis 52 b) Segunda Hipótesis 53 c) Tercera Hipótesis 54 d) El RNA como molécula precursora de DNA y proteínas 55 3) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS 56 a) Solo L - Aminoácidos participan en la formación de las proteínas 57 b) Clasificación de los Aminoácidos según su grupo R 59 c) Absorción de luz ultravioleta 61 d) Ionización de los aminoácidos 61 e) Influencia de los grupos vecinos sobre la Ionización de los Aminoácidos en las Proteínas 63 4 ) SEPARACIÓPN DE AMINOÁCIDOS 63 a) Cromatografía de Intercambio iónico 63 b) Electroforesis 66 c) HPLC 66

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

1) LOS AMINOACIDOS. En la estructura de los aminoácidos se encuentran los principales componentes de la vida, como son Carbono, Hidrógeno, Oxígeno, Azufre y Nitrógeno. Su estructura se caracteriza por un Carbono-α central con una estructura tetraédrica de hibridación sp3. A este carbono central, se le unen un grupo Amino, un grupo Carboxilo, un átomo de Hidrógeno y un residuo o grupo R, cuya naturaleza entrega la individualidad a cada aminoácido. De los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, solo la Glicina no es quiral ya que posee como grupo R, un hidrógeno similar a su otro Hidrógeno α. Por otro lado el aminoácido Prolina, posee un grupo R formado por una cadena alquílica, cuyo Carbono-δ interacciona con su grupo α- Amino, formando un anillo y produciendo un aminoácido extremadamente rígido para la torsión. (Tabla. 1 - 3). En general los grupos R por Residuo, se encuentran

R-

: Residuo del aminoácido que confiere la individualidad

R

Residuo α

C

+

HN

H

3

α - Amino

COOH α - Carboxilo

Los grupos funcionales y el átomo de H que se encuentran en el rectángulo son iguales para los 20 aminoácidos exceptuando a la Prolina.

Fig. 1 - 2. El carbono α es asimétrico.

formados por grupos funcionales como Aminos, Carboxilos, Tioles, Hidroxilos e Imidazoles. Por otro lado, aquellos aminoácidos en que los grupos Amino y los residuos R están en los carbonos β o γ, no forman parte de las proteínas. El Carbono central es asimétrico o quiral cuando presenta cuatro sustituyentes diferentes y por lo tanto da origen a enantiómeros o isómeros ópticos (imágenes especulares no superponibles). El proceso por el cual los gases primitivos se combinaron para generar algunos Aminoácidos, Bases Nitrogenadas y precursores de los Hidratos de Carbono, es aún un tanto oscuro, sin embargo se puede seguir la pista de como pudo haber ocurrido la reacción que les dio origen (Ver Capítulo de Bioenergética). Para entender mejor este paso, podemos analizar la siguiente analogía. Si disponemos de un juego con dados y una de las caras pesa más que las otras, al ser lanzados al aire darán en alta proporción un valor determinado. Es decir, el número que se encuentra opuesto a la cara más pesada. Esta última será atraída hacia la superficie de la meza un mayor número de veces comparadas con las otras caras. No importa la forma en que se lancen, siempre se obtendrá un número importante de aciertos. De similar manera, una reacción química que cuenta con una disposición particular de los orbitales en cada uno de los átomos o moléculas. Siempre será capaz de generar productos iguales o similares, a pesar de las distintas

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

condiciones de presión, temperatura y proporción en que se encuentren. En la actualidad se dice que la vida partió de un conjunto de reacciones químicas termodinámicamente factibles y que a la vez tenían la capacidad de auto replicarse y evolucionar. En otras palabras eran capaces de reproducirse, haciéndose cada vez más eficientes en su medio (Ver capítulo de Bioenergética). Volver al Inicio

2) EXISTENCIA DE LOS AMINOACIDOS a) PRIMERA HIPOTESIS Hace ya algún tiempo (1920) en un experimento en que se recreó la atmósfera primitiva, se combinaron entre sí las moléculas de NH4, CH4, H2, y H2O. A continuación mediante una descarga eléctrica (Fig. 2 - 3) se produjo la reacción en que se generaron algunos de los 20 aminoácidos, una base nitrogenada y un precursor de los hidratos de carbono.

Electrodos

Síntesis de compuestos orgánicos con actividad biológica a partir de

Gases Matraz de Reacción

gases presentes en la CHISPA

atmósfera primitiva LLaves para sacar muestras

Condensador

Producto condensado de la reacción

Fig. 2 - 2. El conocido experimento de Miller y Urey en el que se simula la atmósfera primitiva capaz de producir moléculas de importancia biológica por medio de una chispa.

La razón por la cuál se formaron estas moléculas precisas y no otras al azar se debe fundamentalmente a la disposición de los orbitales electrónicos de las moléculas de gas en la mezcla. Esta disposición favorecería siempre un determinado tipo de reacción haciendo la barrera de energía menos costosa para la síntesis de precursores con importancia biológica y no así la de otros compuestos al azar que no serían parte de la estructura viva. En la actualidad solo se encuentran formando parte de la materia viva las moléculas "triunfadoras", sin descontar otras que durante la evolución química, han sido descartadas por ser incompatibles con lo que en la actualidad llamamos vida. Es interesante

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

hacer notar que también, aquellos compuestos orgánicos sintetizados por el hombre denominados xenobióticos, no se relacionan con la vida y generan grandes trastornos a los seres vivientes al provocar en ellos cáncer u otro tipo de enfermedades. Por lo tanto aquellas reacciones primitivas entre los distintos gases, pudieron haber dado origen a la evolución química de las moléculas y a su vez sentar las bases para una posterior evolución biológica. Bajo un simple análisis desde el punto de vista termodinámico, podemos considerar que la reacción del compuesto A con el compuesto B debe remontar una barrera de energía para formar un compuesto final A--B. Se debe uno preguntar si el compuesto A--B tiene más o bien menos energía que cada una de las moléculas originales A y B por separado. En el evento de que la unión de A con B sea posible, se necesitará aporte de energía desde el medio o entorno para que A y B pasen la barrera. Una vez alcanzada la barrera A y B pueden generar una molécula liberando energía hacia el medio y ganando estabilidad o bien puede suceder que aún necesiten de mayor cantidad de energía para unirse entre sí. Esta última, también puede ser tomada o cedida del medio o entorno. Ahora, si la molécula A-B se ha formado, sucede que existen distintos caminos o posos de energía que permitirán ganar mayor o menor estabilidad a la nueva molécula. Esto dependerá de la forma en que se unan: A-B, B-A, A2B, AB2, A2B2, etc., pero aquí intervendría la naturaleza de sus orbitales y la influencia del medio sobre estos. Por lo tanto al combinarse entre sí, favorecerían una acomodación que permita dar origen a futuras moléculas, mucho más complejas que las originales tomando o cediendo energía hacia el medio. Estas apreciaciones se encuentran de acuerdo con la segunda ley de la termodinámica que "a priori" se puede considerar como: ORDEN = DESORDEN + ENERGIA Esta simple ecuación, significa que las estructuras complejas pueden descomponerse en sus componentes básicos, liberando la energía almacenada en ellas. Al mismo tiempo la energía liberada puede emplearse de manera acoplada, para construir otras estructuras aún más complejas y evolucionadas que las anteriores. Por supuesto que esto, siempre ocurre bajo la condición de que se libere algo de energía extra al entorno o al medio. Volver al Inicio

b) SEGUNDA HIPOTESIS Este nuevo enfoque supone la llegada de meteoritos portadores de aminoácidos a la Tierra. La particularidad de estos aminoácidos traídos de forma tan peculiar, es que en vez de Hidrógeno presentan en sus moléculas el isótopo Deuterio. Además, al ser aislados y cristalizados, se encontró que forman una mezcla racémica. Este hecho significa que su síntesis ha sido mediante reacciones químicas y que no provienen de algún ser vivo como se verá más adelante. Más aún, el Deuterio, presente en sus estructuras es un isótopo del Hidrógeno muy poco reactivo y no es compatible con la vida. Sin embargo, como muchos meteoritos cayeron al mar, se produjo aquí un lento intercambio de Deuterio por Hidrógeno que duró millones de años, resultando en la existencia de aminoácidos funcionales de características biológicas. Esta hipótesis ha sido parcialmente comprobada por algunos astrónomos al descubrir en los espectros de luz proveniente de las nubes estelares, algunas bandas de emisión que

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corresponden a la presencia de moléculas orgánicas, entre las cuales se encontrarían los aminoácidos deuterados. Volver al inicio

c) TERCERA HIPOTESIS En este caso destacamos la importancia de las arcillas formadas por cristales de AlúminoSilicato. Estos cristales tienen la capacidad de actuar como ordenadores y catalizadores de su microambiente y se caracterizan por ser polimórficos. Entre sus características se ha observado que ejercen una cierta influencia sobre su microambiente mediante interacciones débiles. De esta manera los cristales de Alúmino-Silicato serían capaces de catalizar, ordenar y facilitar reacciones químicas entre moléculas primitivas (Fig. 3 - 3). Esta propiedad les permitiría a las moléculas precursoras alcanzar un determinado grado de complejidad y variedad. A la vez, este hecho contribuyó a la formación de algunos precursores de las moléculas biológicas actuales. La existencia de este proto-organismo con un gen inorgánico o cristal de Alúmino-Silicato, sería a la vez transitoria ya que con el tiempo se generaría un nuevo gen con los productos del anterior y esta vez de factura orgánica. Este nuevo gen ordenadorcatalizador, sería capaz de almacenar una mayor cantidad de información y tendría una mejor capacidad para influir en su microambiente, desplazando al cristal primitivo de su nicho ecológico por ser más eficiente en preservar la información.

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Nuevos genes más eficientes que generan un fenotipo específico

Aparición de nuevo tipo de genes

Genes desnudos o primitivos. Control del medio inmediato por medio de los genes primitivos.

Los genes originales desaparecen como habría sucedido con los cristales de alúmino - silicato Creación de un fenotipo elaborado

Fig. 3 - 2. Transmutación génica. En la parte inferior, se observa como se crea bajo la influencia de un gen primitivo, un nuevo gen que es más eficaz y desplaza al antiguo haciéndolo desaparecer.

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d) EL RNA COMO MOLECULA PRECURSORA DE DNA Y PROTEINAS. En la actualidad se reconoce al RNA, como a una de las moléculas más primitivas y se le han observado, tanto características de almacenador de información como también de catalizador de reacciones. Es decir actúa de ambas maneras, tanto como DNA y a la vez como una Enzima proteica. El RNA se encuentra involucrado en el proceso de Transcripción de la información contenida en los genes discontinuos de Eucariontes, específicamente en la maduración de los transcritos primarios o RNA heteronuclear (RNAhn) de gran tamaño que posee tanto exones (codificantes) como intrones (no codificantes). Este RNA heteronuclear debe sufrir un procesamiento donde se descartan los intrones y se forma el RNA mensajero con solo exones. Pues bien, los mismos intrones que posee el transcrito primario (RNAhn) son capaces de catalizar su propio proceso de corte y empalme de los exones formando el RNA mensajero. Además, son capaces de catalizar aisladamente la formación de pequeños polímeros de su misma naturaleza en el tubo de ensayo. Por estas razones el RNA aparece en la actualidad como una molécula dual, que actúa en ciertos sectores de su secuencia estructural, como enzima y que a la vez guarda la

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información en otros sectores para la síntesis de una proteína. macromolécula intermedia entre el DNA y las Proteínas.

El RNA sería una

El sistema basado en la molécula de RNA, se creó en sus comienzos desde una serie de bases nitrogenadas que incluyen a la Adenina, Guanina Citosina, Uracilo y Timina. Todas ellas, más las que aparecen en las vitaminas Riboflavina y Niacina, demostraron que eran capaces de combinarse fácilmente con azucares y fosfato formando mono y binucleótidos. Desde aquel momento solo aquellas moléculas con solo Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo se seleccionaron y amplificaron, siguiendo la evolución química (azar y competencia) lo que permitió la existencia del RNA y la posterior selección molecular actual. La energía para las reacciones anteriores pudo en un principio haber sido obtenida por compuestos denominados Tioésteres (R-CO-S-R). Estas moléculas fueron más comunes antes de que apareciera el Oxígeno en el ambiente y se pasara a emplear energía desde fosfoésteres (R-OPO3R) como se hace en la actualidad. El orden seguido para la aparición de la vida se puede resumir en la siguiente cronología. La Tierra se solidificó cerca de 4.1 x 10 12 años, mientras que las 12 primeras evidencias de vida son de los 3.5 X 10 años. En ese tiempo aparecieron las primeras formaciones denominadas Estromalitos. Estas estructuras fueron dejadas por las Cianobacterias, lo que se confirma con el hallazgo de los primeros fósiles bacterianos (3.4 X 10 12 años). Durante los 0.6 x 1012 años de diferencia entre la solidificación de la Tierra y las evidencias de Estromalitos, pudieron haber ocurrido una serie de hechos que se plantean en la hipótesis de la Evolución Química. Esta última acepta la generación abiótica de pequeñas moléculas orgánicas, influenciadas por la temperatura más la atmósfera reductora (con H2 y sin O2) y en presencia de una elevada radiación UV. Bajo estas condiciones se formarían algunos monómeros como aminoácidos, azúcares simples y precursores de bases nitrogenadas. Parte de estos hechos se encuentran confirmados por los experimentos de Oparin y Haldane en 1920 y posteriormente por los experimentos de Urey y Miller en 1953. Al continuar con la evolución de las moléculas, se pasó de la química inorgánica a la química orgánica y posteriormente se generaron mediante estas reacciones moléculas precursoras de aquellas involucradas en la vida. De esta forma al agregarse las moléculas pertinentes, generaron Proteinoides. Estos últimos se encuentran constituidos por algunos aminoácidos que pudieron reaccionar entre sí, lo que se corrobora por los experimentos de Sydney Fox. Este produjo polipéptidos al gotear soluciones de aminoácidos sobre piedras calientes. Más aún durante la evolución química, ahora con moléculas orgánicas agregadas, en especial aquellas que participarían de la vida, produjeron a los Protobiontes o conjunto de moléculas de origen abiótico capaces de mantener un ambiente interno y exhibir algunas propiedades de la vida, tal como selección y evolución química. Entre los protobiontes podríamos tener a las Microesferas, formadas por los Proteinoides en contacto con el agua, a los Liposomas o bicapas cerradas de fosfolípidos con agua por ambos lados y a los Coacervados, constituidos por gotas coloidales de proteinoides, ácidos nucleicos y polisacáridos. La unión entre ciertas propiedades ventajosas que detentaban algunas de estas agrupaciones, necesitaba también de un mecanismo que preservara sus

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características óptimas, para así tener éxito en aquel ambiente. Además esto les permitiría repetir y optimizar sus tareas de sobrevivencia. Por lo tanto, esta última capacidad recayó en el RNA, molécula capaz de preservar información, autoreplicarse y catalizar reacciones. Posteriormente a esto, las diversas funciones del RNA, se delegaron en macromoléculas específicas como son DNA y Proteínas. Aparte de las anteriores, otra de las hipótesis acerca del origen de la vida la constituye la Panespermia. Esta considera la importación de los organismos primigenios por meteoritos y cometas. Recientemente se ha observado que la vida pudo haber comenzado en las profundidades del mar, precisamente en los respiraderos marinos o sistemas hidrotermales, donde existe un ecosistema que prospera en la actualidad a 370ºC. Por último, se ha encontrado en 1998 discutidos restos de microfósiles bacterianos en un meteorito proveniente de Marte, denominado ALH 84001. Sobre la base de este hecho es aún posible teorizar, que la vida surgió de ese planeta y fue capaz de colonizar accidentalmente la Tierra. En general, aún restan muchas incógnitas en las hipótesis anteriores y estas tienen uno que otro punto débil.

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3) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS. a) SOLO L - AMINOACIDOS PARTICIPAN EN LA FORMACION DE LAS PROTEINAS. Como se señaló anteriormente a excepción de la Glicina, todos los aminoácidos presentan al menos un carbón asimétrico o quiral Alfa, con Hibridización sp3 y que posee 4

C H O

O H C

C

C

HO

H

H

C H2 OH

D - G lic e ra ld e h id o

L - G lic e ra ld e h id o

C O O H

H O O C

C 2H N

R L - A m in o ác id o

OH H O 2H C

C H

H

NH2

R D - A m in o á c id o

Fig. 4 - 2. C asimétrico o quiral significa que sus 4 sustituyentes son distintos, solo el aminoácido Glicina no es quiral.

sustituyentes diferentes. Esto hace que cada aminoácido pueda tener una imagen especular no superponible y por convención son comparados a una molécula de Gliceraldehído que posee un carbono 2 asimétrico o carbono central también asimétrico (Fig. 4 - 2). El Gliceraldehído, será la molécula patrón para designar a los aminoácidos L o D. Así tenemos, que es posible alinear el grupo OH del Gliceraldehído con el grupo NH2 del aminoácido, a su vez el grupo CHO del gliceraldehído se alinea con el Carboxilo del aminoácido y el grupo CH2OH del Gliceraldehído con el grupo correspondiente al Residuo R del aminoácido. De esta manera el Hidrógeno ocupa la cuarta posición coincidente en ambos. Ahora, al respetar esta configuración podemos decir que un aminoácido L tiene el grupo Amino al lado izquierdo y un aminoácido D al lado derecho. En la actualidad es bien conocido que las estructuras biológicas ocupan tan solo L-aminoácido, basado en la configuración del L-Gliceraldehído. Por otro lado, con el fin de observar la pureza de una preparación de aminoácidos se emplea la Rotación Específica, que consiste en la rotación del plano de la luz polarizada. Esta medición hace incidir sobre una solución del aminoácido luz polarizada, cuya característica principal es que vibra solo en un plano, ya que la luz normal vibra en múltiples planos (Fig. 5b - 2). Al aplicar luz polarizada sobre la solución del aminoácido, la luz emergente tiene el plano de vibración o polarización desplazado. Si sigue las manecillas del reloj se denomina + (dextrorotatorio). En el sentido contrario al reloj es - (levorotatorio). Los prefijos + por dextrorotatorio) y – por levorotatorio o d y l minúsculas, no se relacionan con D y L en mayúsculas. Dextrógiro (+) o levógiro (-) se determinan por el plano de rotación de la luz polarizada y la denominación L o D, se hace mediante la

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comparación con la estructura del Gliceraldehído (fig.4 - 2). Además, puede suceder el caso de que una misma configuración L tenga valores de signo + o -. En aquellos casos donde el plano de luz polarizada emergente que proviene desde el aminoácido no se desplaza a ningún lado, se dice que se tiene una mezcla racémica o el mismo número de enantiómeros o isómeros ópticos + y - del aminoácido en particular. En este caso coinciden las designaciones L, D con levógiro y dextrógiro, pero no siempre lo que se presta para una confusión. Aquellos aminoácidos sintetizados químicamente producen este tipo de mezcla. En el caso de que un aminoácido presenta más de un carbono asimétrico se emplea el prefijo Alo (Fig. 5a - 2). Todos los aminoácidos que provienen de estructuras biológicas son del tipo L en base a la molécula patrón Gliceraldehído. No se encuentran aminoácidos D en las proteínas. Por otro lado los monosacáridos de importancia biológica son del tipo D. La causa por la que se ha favorecido esta determinada configuración L en los aminoácidos y la configuración D en los monosacáridos, puede ser parcialmente explicada de la siguiente manera: En física cuántica se describen cuatro tipos de fuerzas, la gravitacional, la electrostática, la fuerza nuclear fuerte entre protones y neutrones y la fuerza nuclear débil que aparece entre los electrones. Esta última es la que entrega el carácter de quiral, en este caso a los electrones. De esta manera se puede decir que existen electrones dextrógiros y electrones levógiros. Ambos poseerían cargas de tipo opuesto en que los dextro son atraídos al núcleo y los levo repelidos por la fuerza nuclear débil. Así, cuando un electrón 5a ) COOH

COOH

C

C

1

Luz que vibra en todos los planos

2

Luz polarizada que vibra en un solo

5b )

plano

HN 2 H

H

C

OH

H HO

COOH

HO

C CH

1

3 D - Treonina

3 L - Treonina

C

2

H H

3 L - Alo -Treonina

(+)

COOH H

2

H CH

CH

HN 2

NH C

C

NH 2

C

OH

H CH

3

D - Alo - Treonina

4

3

3

(-)

Desviación del plano de la luz polarizada después de pasar por el

4

aminoácido

Fig. 5a - 2. La luz polarizada cambia el plano de rotación con los aminoácidos. Fig. 5b - 2. Con más de un carbono asimétrico se denomina Alo.

esta cerca del núcleo, su dirección de movimiento esta parcialmente alineada con su eje vector de espín, siendo por lo tanto D y cuando esta lejos, se encuentra

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

desalineado con el eje vector de espín y es del tipo L. En base a ello, una molécula tendrá diversa quiralidad electrónica, según la proporción de electrones que se encuentren cerca o lejos del núcleo. En otras palabras la quiralidad dependerá de la distribución de la nube electrónica y se necesitará mayor o menor energía de formación para uno u otro de los enantiómeros. El enantiómero que necesite menos energía de formación, será el más favorecido y en este caso corresponde al tipo L para los aminoácidos. Se puede concluir finalmente que a causa de la fuerza débil, se infringe el principio de la paridad y se rompe la simetría ya que favorece la existencia de Levoaminoácidos y Dextrosacáridos como moléculas que constituyen a los seres vivos, por ser menos costosa su síntesis. Volver al inicio

b) CLASIFICACION DE LOS AMINOACIDOS SEGUN SU GRUPO R. Existen cuatro grupos de aminoácidos según la identidad de su grupo R. Así tenemos que en primer lugar encontramos a los: HIDROFOBICOS que se caracterizan por tener grupos R de cadenas alifáticas y aromáticas. En segundo lugar se encuentran los POLARES SIN CARGA con grupos hidroxilos (OH), tioles (SH) y amidas (-CONH2) que son capaces de formar un número limitado de enlaces hidrógenos con el agua. En tercer lugar se encuentran los POLARES DE CARGA ( - ) que se caracterizan por poseer un grupo carboxilo R (-COO-) y se disuelven fácilmente en agua. De similar manera tenemos a los POLARES DE CARGA (+) que constituyen el cuarto grupo. Estos últimos poseen un grupo R representado por un amino (-NH3+), un guanidino (NH-CNH2+-NH2) o un grupo imidazol. En la Tabla 1 - 2, se pueden observar las estructuras de los distintos residuos R de los aminoácidos. Los aminoácidos pueden aún ser sometidos a otras clasificaciones, si tomamos en cuenta algunas otras propiedades. Entre los aminoácidos hidrofóbicos de cadena alifática tenemos a la Alanina, Leucina, Valina e Isoleucina y a los aromáticos a Fenilalanina, Triptófano y uno polar sin carga, como la Tirosina. Por otro lado existen aminoácidos con Azufre, probablemente evolucionaron antes de que apareciera el Oxígeno en la Tierra y son Metionina y Cisteína. El primero de ellos es considerado como hidrofóbico y el segundo de ellos es considerado como polar sin carga.

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

Tabla 1 - 3.

Hidrofóbicos

R e s i d u o s de a m i n o á c i d o s .

C H Alanina 3 CH 3 HC Valina

Polares sin carga H

CH 3

H O CH Serina 2

CH Leucina 3 HC CH CH C H3 2 C H 3

CH CH Treonina 3 OH

C H C H CH 2 3 C H3 Isoleucina H2 C

CH Fenilalanina 2

Triptófano

CH S CH CH 3 2 2

CH 2

O O

O

O

HN CH CH CH CH 2 2 2 2 3

Aspártico C CH 2

O

Asparregina HN 2 C CH 2 O HN 2

CH 2 N

H S C H Cisteína 2

HO Tirosina

HC COO 2 C HC Prolina 2 N H H

Polares de carga negativa

Glicina

Polares de carga positiva Lisina +

C CH CH 2 2 Glutámico

HN C NH CH CH CH 2 2 2 2 NH Arginina + 2

HC C C H 2 HN NH + C H Histidina

Glutamina C CH

2

CH 2

Metionina

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

c) ABSORCION DE LUZ ULTRAVIOLETA. Existen tres aminoácidos que absorben luz Ultravioleta a 280 nm y son Triptófano, Fenilalanina y Tirosina (Fig. 6a - 3). Si la ley de Lambert-Beer establece que A = k c, es decir que la absorción de luz incidente por una solución es proporcional a la concentración de esta. Significa que mientras más concentrada esté una solución menor será la luz que pase por ella. Una proteína que tenga estos tres aminoácidos podrá absorber luz UV y podrá tener distintas absorciones cuando este a distintas concentraciones. Sin embargo, a una concentración constante la mayor o menor absorbancia que experimente, será una medida del despliegue o empaquetamiento que experimente la proteína al mostrar o esconder estos aminoácidos frente a los cambios de conformación que experimente ya sea por efecto de la temperatura o el pH del medio (fig. 6b - 2).

a)

b)

Trp

40 Abs.

o C

Abs.

Tyr 20 o C

Phe 240

260

280

Absorción de luz por los tres aminoácidos

( nm )

220

240

260

280

( nm )

La misma proteína a mayor temperatura se encuentra desplegada parcialmente y presenta mayor absorción al exhibir en mejor forma los residuos de los aminoácidos Phe , Tyr y Trp.

Fig. 6a - 2. Los tres aminoácidos presentan distinta absorción a igual concentración. Fig. 6b - 2. La misma proteína se despliega con la temperatura.

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d) IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS Los aminoácidos son capaces de ionizarse en solución, es decir pueden actuar como ácidos débiles donando hidrógenos al medio o como bases débiles tomando hidrógenos del medio.

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

Mientras mayor sea la capacidad para donar protones, un residuo carboxilo será más ácido y tendrá un pK menor, en cambio un residuo amino mientras menor sea su capacidad para donar un protón, será más básico y su pK mayor (Tabla 2 - 2). De esta manera tenemos que entre los aminoácidos hay grupos que difieren en su capacidad para donar o aceptar protones y entre estos grupos se encuentran los α-Carboxilos, α-Aminos y los residuos α-R, que caracterizan a cada aminoácido.

Tabla 2 – 2

Grupos Glicina Alanina Leucina Serina Treonina Glutamina Aspártico Glutámico Histidina Cisteína Tirosina Lisina Arginina

pK1 pK2 ∝ - COO− ∝ - NH3 + 2,34 9,60 2,34 9,69 2,36 9,60 2,21 9,15 2,63 10,43 2,17 9,13 2,09 9,82 2,19 9,67 1,82 9,17 1,71 10,78 2,20 9,11 2,18 8,95 2,17 9,04

pK3 ∝-R ------------------------------3,86 4,25 6,0 8,33 10,07 10,53 12,48

Al analizar la Tabla 2-2 se observa que la carga de los aminoácidos cambia cuando ceden o toman protones del medio. De esta manera todos los aminoácidos son positivos bajo pH 2, ya que todos los α-Carboxilos y aquellos otros Carboxilos del residuo R, con un pK entre 2.0 y 4.2 se encuentran protonadados a este pH y sin carga. Por lo tanto, a bajo pH, los aminoácidos presentarán solo grupos aminos protonados con carga positiva (– NH3+), ya que tienen un pK igual o por sobre 9. Por otro lado a un pH por sobre 12,5 todos los aminoácidos son negativos ya que los grupos α-Aminos y los residuos R básicos, pierden su protón desde pH 9.0 a 12.5 quedando sin carga positiva. En este caso los grupos α-Carboxilos, permanecen con carga negativa por haber perdido su protón entre los pHs 2.3 y 4.2. Entre ambos extremos de pH todos los aminoácidos presentan una especie química, con carga neta 0 y se denominan en este punto como: neutros, isoiónicos o isoeléctricos. En esta región de pH, el número de cargas positivas es igual al número de cargas negativas. El punto isoeléctrico se calcula aquí sumando los pKs a ambos lados de la especie isoiónica y dividiéndolos por dos (Fig. 9-2).

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

e) INFLUENCIA DE LOS GRUPOS VECINOS SOBRE LA IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS. En la figura 7 – 2, se observa una proteína en que los grupos vecinos al grupo carboxilo afectan su pK. El grupo carboxilo se encuentra encuadrado para distinguirlo mejor. Cuando el carboxilo se encuentra junto a un grupo vecino del tipo -NH3+ , aumenta su pK. El grupo vecino atrae electrones y lo hace menos ácido. En cambio el carboxilo enmarcado junto a los grupos que donan electrones, como -OH, -SH y -NH2, disminuye su pK y se convierte en más ácido. A bajo pH el pK del

A pH alto el protón se desprende facilmente.

carboxilo sube y le cuesta desprenederse al protón

El pK se hace menor

+ -+ HN 3 C OH

O

O

-+ C OH

PROTEINA

2

PROTEINA

C + C OH O

.. H N

O

C

O

C O

El pK del carboxilo disminuye frente a las cargas

y el protón sale más fácil

O

+ + OH HO

Si el medio es ácido , el pK del carboxilo se hace mayor

Fig. 7 - 2. El pK de los residuos cambia según el microambiente que los rodea.

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SEPARACION DE AMINOACIDOS. Entre las técnicas clásicas para separar aminoácidos se encuentran la Cromatografía de Intercambio Iónico y la Electroforesis de alto voltaje, por otro lado entre las técnicas modernas se destaca la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). a) Cromatografía de intercambio iónico La Cromatografía de intercambio iónico emplea una fase estacionaria formada por una resina o polímero de cargas negativas o positivas en una columna de elución. Sobre este polímero se hace pasar una mezcla de aminoácidos en un solvente orgánico que se mezcla con un tampón. De esta manera los aminoácidos de la fase móvil se separarán por la atracción o repulsión que experimenten entre la fase estacionaria y la fase móvil .

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Héctor Rocha L. Los Aminoácidos y sus Características

La carga de los aminoácidos podrá variar según el pH del medio o fase móvil y se tendrá una población de aminoácidos positivos, otros negativos y algunos tendrán carga neta 0 (Fig. 8 - 2). Los negativos del mismo signo que la fase estacionaria, eluirán más rápido que el resto. Mientras que otros con carga positiva serán mayormente retenidos en la columna debido a las cargas opuestas. Aquellos aminoácidos que se encuentren en su punto isoeléctrico debido al gradiente de pH, serán eluídos entre los retenidos y repelidos. En algunos casos es útil emplear un gradiente de pH para mejorar la resolución o separación de los aminoácidos en la columna. En la figura 8 - 2, se aprecian las distintas especies químicas que se forman entre los aminoácidos Glutámico y Lisina al enfrentar distintos pHs. Cada una de las especies químicas tiene una carga determinada según el pH. Se emplea aquí una columna llena de resina con carga negativa, donde a pHs inferiores a 2,7 ambos aminoácidos son positivos y se unen a la resina. Por otro lado, al emplear una resina de carga + los aminoácidos serán repelidos al mismo pH anterior y solo se unirán a ella a pHs superiores a 10. Los pKs del Glutámico son 2,3 para el α-Carboxilo y 4,25 para el residuo γ-Carboxilo, Glutámico con Carga – desde pH 4,25 a 9,67

Abs. Resina de Intercambio catiónico

Gradiente de pH

Lisina con Carga – desde pH 9,67 hacia arriba

11 p H

1 Vol. de elución

_

_

Glutámico _

_ _

p H R - NH2 + H+ [R - NH2] pH = 9,7 + log -------------[R - NH3+] Al analizar la superficie de la proteína soluble encontramos que un grupo funcional puede recibir la influencia de sus vecinos y cualquier cambio en la posición de estos o de su identidad puede inducir a cambios de pK sobre los grupos que se encuentran en su esfera de influencia. Así tenemos que un residuo esencial para la actividad de una proteína no tiene siempre un pK similar al del mismo aminoácido, sino que es diferente (Fig. 18 - 4). Con vecino de carga +, el pK del grupo sube y cuesta más que salga el protón

A pH alto el protón se desprende Facilmente. El pK es menor

O -+ + HN C OH 3

O -+ C OH

PROTEINA

C + O OH

.. H2 N

PROTEINA

C O

O

Con vecino de carga -, el pK del carboxilo baja y el protón sale más fácil

+ C OH O

C

O

O H + Si el medio es ácido, el pK se hace mayor

Fig. 18 - 4. El pK de los residuos cambia según el microambiente que los rodea.

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b) INFLUENCIA DE LOS GRUPOS VECINOS SOBRE LA IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

En la figura 18 - 4, se observa una proteína en que el grupo carboxilo encuadrado, es afectado en su pK por los grupos o residuos vecinos en la estructura. El carboxilo junto a un grupo vecino del tipo -NH3+ aumenta su pK, ya que este último grupo atrae electrones y lo hace menos ácido. En cambio el carboxilo encuadrado junto a los grupos que donan electrones, como -COO-, -OH, -SH y -NH2, disminuye su pK y se convierte en más ácido.

HC

H N

HC

N

HC

+

C

CH

CH

+H N

H N N H

+ CH

2

CH

3

p K d e l Im id a z o l 6 ,9 2

N

C O OH

+

NH

C O

+H

O

N

+

NH

. . N H

H

p K d e l g r u p o R Im id a z o l 7 -8 p K d e l g r u p o R Im id a z o l 5 -6

p K g r u p o R im id a z o l 6 ,0

Fig. 19 - 4. Comportamiento ácido base del grupo Imidazol

Otro ejemplo puede ser el aminoácido Histidina (His) (Fig. 19 - 4), que posee un grupo Imidazol que tiene un pK de 6,92 cuando se encuentra solo. Sin embargo, este grupo pasa a tener un pK de 6,0 cuando se encuentra en el aminoácido, en otras palabras se hace menos básico y cuesta menos que salga el protón. Por otro lado cuando se encuentra el aminoácido involucrado en un enlace peptídico en la estructura de un polipéptido, el pK es de 6,5 con un valor intermedio entre ambos casos anteriores. Este mismo grupo cuando se encuentra en una proteína adyacente a otro grupo del tipo -COOH que se caracteriza por entregar un protón, su pK sube a 7 u 8 y en el caso contrario, cuando se encuentra adyacente a un grupo -NH2 que entrega electrones, su pK baja y fluctúa entre los valores de 5 a 6. En la Figura 20 - 4, se observa una proteína globular y su comportamiento en una gráfica de Solubilidad vs pH. Bajo pH 2,3 la proteína tiene carga positiva y las distintas moléculas se repelen entre sí permaneciendo soluble aunque denaturada o inactiva. Sobre pH 9,7 las moléculas tienen carga negativa, permanecen solubles y también pueden estar denaturadas o inactivas. Mientras que en el pH 6,5 se encuentra el punto Isoeléctrico (pI) donde la proteína precipita, ya que es insoluble al presentar una carga neta de cero. En este punto los residuos con cargas positivas de un lado de la proteína, pueden interaccionar con otra molécula similar. Especialmente con el lado que tenga residuos de carga negativa, atrayéndose entre sí unas a otras y precipitando. Algunas proteínas según su composición aminoacídica pueden o no denaturarse en su punto isoeléctrico. En general se puede decir que el pH del medio afecta al microambiente alrededor de la proteína, ya que esta requiere de un cierto número de cargas en su superficie para mantener su conformación nativa. Si la proteína no es capaz de tamponar los cambios de pH, tolerando un cierto grado de desaparición o aparición de nuevas cargas, es entonces susceptible de entrar en un proceso de denaturación. La nueva distribución de cargas provocará en ella cambios conformacionales que distenderán su andamiaje sobrepasando el efecto cooperativo de todas las otras interacciones débiles para mantener su estructura.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Proteína a bajo pH que presenta solo cargas positivas. Se produce denaturación y repulsión entre las moléculas

Proteína en el Punto Isoeléctrico (pI), es insoluble por su carga neta igual a 0. Cómo es un dipolo las moléculas se atraen y precipitan

+ --

+

+

+ +

Proteína a alto p H solo con cargas negativas. Se produce denaturación y repulsión entre las moléculas

Proteína a pH óptimo con la conformación adecuada y soluble

-

+

-

+

+

-

+

+

-

-

S O L U B I L I D A Dmg/ml

Actividad pI

2,3

6,5

7,8

9,7

pH

Fig. 20 - 4. El pH cambia la conformación y la solubilidad de la proteína.

Por ejemplo la enzima digestiva Tripsina es funcional a un pH cercano a 1, para lo cual se ha adaptado presentando en su superficie muchos grupos carboxilos que le permiten atrapar protones y tamponar su microambiente para no denaturarse. Similar cosa sucede con aquellas proteínas que son funcionales a altos pHs, lo que se hace posible debido a que poseen muchos grupos aminos que liberan protones, como es el caso de la Lisozima con un pH óptimo de 9.

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c) EFECTO DE LA TEMPERATURA. La temperatura se puede visualizar como agitación térmica. Una solución proteica tendrá mayor o menor agitación según la temperatura. Así una proteína normalmente plegada a 37o C sufrirá un mayor número de choques de parte del agua a medida que aumenta la temperatura, ya que las moléculas de agua se agitarán cada vez más violentamente descubriendo a las cargas superficiales y haciendo que las interacciones internas (interacciones débiles) de la proteína, no puedan mantener la estructura hasta que se denatura desplegándose. En el caso contrario al bajar la temperatura a unos 10oC, el agua se agita cada vez menos y la proteína no experimentará un número de choques suficientes de parte del agua para tener un grado de flexibilidad compatible a su función. Al mismo tiempo sus capas de agua aumentarán y se hará más rígida y poco funcional (Fig. 21 - 4). A baja temperatura la falta de movimiento del agua facilita la cristalización

-

A temperatura normal el agua interacciona con las cargas y cubre a la proteína con una capa

+

-

-

+

-

+

-

+

A alta temperatura el agua se agita demasiado para cubrir las cargas

+

-

+

Centro de nucleación

s

Fig. 21 - 4. Las proteínas se denaturan a las temperaturas donde el agua se agita mucho.

Los cambios conformacionales que provoca la temperatura en las proteínas pueden ser visibles por medio de las siguientes técnicas: a) Titulación de los residuos expuestos al medio. La primera técnica dará distintas curvas de titulación a distintas temperaturas. Mediante esta técnica se podrá demostrar el movimiento de los residuos y su grado de exposición al medio donde algunos de los residuos se expondrán al medio en la superficie de la proteína y otros serán capaces de ocultarse, (Fig. 22-4).

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C u r v a s h ip o t é t ic a s d e t it u la c ió n d e u n a p r o t e í n a X , la c u a l e s s o lu b le p H A m e d id a q u e s e d e s p lie g a la p r o t e í n a

25 o C

35

o C

45 o C

a m a yo r te m p e ra tu ra a p a re c e n n u e v o s a m in o á c id o s t it u la b le s

e q u iv a le n t e s d e O H

Fig. 22 - 4.Al desplegarse una proteína puede presentar un mayor número de aminoácidos titulables al medio.

b) Espectro Ultravioleta. En este otro caso la absorción de la luz ultravioleta por una solución proteica variará según se exponen los residuos aromáticos o no. Este efecto podrá emplearse para observar los cambios conformacionales de una proteína. Mientras más se muestren los residuos aromáticos, mayor será la absorción como se observa en el caso b del gráfico Abs. vs Longitud de onda y mientras más se oculten la absorción será menor como en el caso a del mismo gráfico (Fig. 23 - 4).

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d) ADAPTACION DE LAS PROTEÍNAS A LAS ALTAS Y BAJAS TEMPERATURAS EN EXTREMÓFILOS Las proteínas de aquellos organismos que han experimentado cambios de temperatura ambiental durante su evolución han podido adaptarse a ello a través de miles de años, debido a las distintas modificaciones estructurales que han experimentado como resultado del proceso evolutivo y adaptativo. En ellas se han cambiando aminoácidos de su superficie o su interior para regular así el grado de interacción interna entre sus residuos o la interacción entre los residuos de la superficie con el medio externo o el solvente que las rodea. Cuando han sido expuestas a un aumento de la temperatura, han respondido con un aumento del número de cargas superficiales, logrando con ello un incremento en el número de capas de hidratación, que protegen como un escudo frente al creciente número de choques o aumento de entropía ΔS del agua. Al mismo tiempo, es posible que la proteína aumente el grado de interacción interna o ΔH (Entalpía) haciéndose más rígida. Esto se logra al cambiar uno que otro aminoácido en posiciones críticas de la estructura. De esta forma, ambos efectos contribuirán a hacer a la proteína más rígida. Sin embargo, el número de choques sobre la proteína ejercen un efecto físico tal, que se comporta como una similar a temperatura normal 25 – 42ºC. De esta manera su capacidad de efectuar cambios conformacionales o su valor de ΔG, se mantiene dentro del marco adecuado a las condiciones biológicas necesarias para la vida (fig. 24a - 4). En el caso de que una proteína normal experimente una baja de temperatura, el agua que la rodea se mueve cada vez menos (disminuye su ΔS) y tiende a formar centros de nucleación con los residuos cargados de la superficie. La proteína experimenta menos choques de las moléculas de agua, ya que se forma una gran capa de hidratación en su superficie. Esta capa a medida que baja aún más la temperatura facilitará la formación de cristales que comprimirán a la proteína denaturándola. Para evitar este proceso, una proteína adaptada a las bajas temperaturas, se libera de las capas de agua durante el proceso evolutivo,

a

b

25

oC

Abs

b

a

45 o C

nm Io I =I o e L Io = k c I A = kc

I -kc La proteína en b esta a mayor temperatura por lo tanto esta más abierta y muestra mejor los residuos que absorven luz U V. En el caso a estos se encuentran escondidos debido al plegamiento de la proteína a o25C

Fig. 23 - 4.La temperatura o el pH pueden alterar la conformación de la proteína lo que se refleja en un espectro de absorción distinto.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

mostrando menos carga en la superficie y se hace a la vez menos rígida al disminuir la interacción interna o su Entalpía (ΔH) (fig. 24b - 4). La proteína asoma ahora algunos grupos hidrofóbicos para disminuir su capacidad como centro de nucleación para las moléculas de agua.

C a p a c id a d d e C a m b io C o n fo rm a c io n a l o Δ G

S u b e la te m p e ra tu ra

a)

G ra d o d e in te ra c c ió n in te rn a o ΔH

10

20

30

40

50

6 0 T ºC Nº de Choques del Agua o ΔS

b)

B a ja l a te m p e ra tu ra

40

30

20

10

0

T ºC

Fig. 24a y 24b - 4. Las proteínas adaptadas a otras temperaturas fuera de lo normal (25 -42ºC) mantienen su conformación nativa o ΔG (energía de la conformación en equilibrio con el medio).

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e) EFECTO DE LA FUERZA IONICA.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

La fuerza iónica es una medida de las cargas existentes en solución. Así que a igual concentración [C] de [NaCl] y de [(NH4)2SO4], la sal con el anión de carga (Z) = -2 (SO4= ) presentará la mayor fuerza iónica al elevarse a la potencia de 2: 2 I = 1/2 ∑ [(C) (Z)] 2 2 I = 1/2 ∑ [(Na+ )(+1) + (Cl_ )(-1)] I = 1/2 ∑

[2(NH4+

2 2 = )(+1) + (SO4 )(-2)]

Los aniones y cationes de una sal interaccionarán con el agua y cada uno de ellos puede tener una mayor o una menor capa de hidratación, según la carga que posean. Este efecto conduce a la formación de complejos moleculares hidratados, los que intercambiarán moléculas de agua con cualquiera proteína que se encuentre en solución. Como aplicación de este fenómeno encontramos que una mezcla de proteínas que se encuentre deshidratada y en estado sólido, no entrará fácilmente en solución a menos que el agua se interponga entre las cargas que se atraen entre una y otra superficie de proteína. En este caso es sabido que una leve concentración de sal ayuda a la proteína a entrar en solución. El efecto dipolo del agua se magnifica con la sal al interponerse esta vez los iones hidratados entre las cargas de las proteínas y disminuir así su efecto de atracción. Una vez que la proteína se encuentra en solución, al continuar aumentando la fuerza iónica por un incremento en la concentración de la sal, los cationes y aniones de la sal capturan el agua de hidratación de la proteína para poder solvatarse, entrar en solución o solubilizarce ellos mismos. De esta manera la proteína disminuye el agua en sus capas de hidratación y se dice que finalmente la proteína sale de la solución (Fig. 25 - 4). En otras palabras la proteína precipita por no poder retener las moléculas de agua que la mantenían soluble y ahora exhibe sus cargas, por lo que puede interaccionar con otras proteínas formando un agregado insoluble. Mientras más polar sea una proteína más costará que precipite con el aumento de la fuerza iónica. Al contrario mientras menos polar sea la proteína, perderá su agua de hidratación más fácilmente a expensas de la sal. Por otro lado mientras más carga tenga la sal o en otras palabras a menor volumen atómico y mayor radio de hidratación, atraerá un mayor número de moléculas de agua (Fig. 25 - 4). De esta manera las proteínas para mantenerse solubles requieren de un soluto que no sea muy facilitador de la entrada en solución y a la vez no muy sacador de la solución en que se encuentra la proteína. En general, la sal no debe hacer entrar a la proteína en solución denaturándola, debido a su fuerte interacción entre la proteína y el soluto (sal), ni deberá hacerla tan insoluble que precipite al formar esta un agregado de si misma, por remoción casi total de su agua de solvatación. Las sales que estabilizan proteínas promueven la hidratación de estas y se unen débilmente a ellas, mientras que aquellas sales que desestabilizan, promueven deshidratación y se unen fuertemente a ellas. Este balance debe ser mantenido entre los solutos inorgánicos y orgánicos de la célula. En la Tabla 1-3, podemos observar la distribución entre los solutos inorgánicos estabilizantes como el KCl capaz de precipitar a la proteína sin denaturarla y aquellos como el SCN- de carácter destablizante que solubilizan a las proteínas denaturándolas.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

La sal compite por el agua de solubilización junto a la proteína.

+

NH

+

SO 4

NH

4

4

SO 4 O O

+ H3 N

C

PROTEINA

PROTEINA

H3 N +

C O O O

C O

+ H3 N

O C O

+ H3 N

C O

C O

O

O

SO 4

+

NH

+

NH

4

SO 4

4

Fig. 25 - 4. La sal competirá con la proteína para atrapar agua de hidratación.

Con respecto a los solutos inorgánicos es sabido que una sal neutra como KCl facilita el empaquetamiento de una proteína. Facilita el ocultamiento interior de los residuos hidrofóbicos haciendo a la proteína más rígida y menos funcional. De esta manera microorganismos que prosperan en lugares de alta salinidad deben disminuir sus interacciones hidrofóbicas internas para mantener su capacidad de cambio de conformación dentro de los límites tolerables a su función activa. Otro hecho de singular importancia biológica que permite ahora ser explicado, reside en la razón por la cual las células prefieren K+ en el interior y Na+ al exterior. El agua de hidratación del K+ es menor que la que requiere el Na+, de tal manera que este ión permitirá en el citoplasma un mayor número de proteínas solubles que el Na+ que se encuentra en el espacio extracelular. En otras palabras a igual concentración de Na+ y K+, el Na+ retiene más agua que este último restando de esta manera moléculas de agua necesarias para la solubilidad de las proteínas. Una de las proteínas que más retiene agua en los capilares es la Albúmina del plasma, es una proteína muy soluble, interacciona bien con el agua y de ella depende la presión oncótica de los tejidos. Compite con el Na +, en el líquido extracelular y captura moléculas de agua por difusión hacia el interior. Cuando se pierde esta proteína al líquido extracelular, por exceso de presión hidrostática (hipertensión), trauma (golpe) o presión negativa en el exterior (escaladores de montaña), se ocasiona un edema (hinchazón del tejido) al atraer consigo agua. Por otro lado, entre las moléculas orgánicas estabilizadores de proteínas tenemos a Prolina, Glicina y Glicerol que estabilizan las estructuras proteicas sin interaccionar directamente con

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

ellas. Este efecto ocurre por el lado de la regulación osmótica. Los solutos orgánicos determinan o fijan la fracción de moléculas de agua que son libres de interaccionar con las proteínas solubles. Aquellos aminoácidos como Lys (Lisina) y Arg (Arginina) desestabilizan la estructura proteica. La Arg posee un grupo Guanidino de carga (+) y la Lys un grupo Amino también de carga (+). Este último aminoácido, cuando se encuentra libre en solución es conocido por disminuir la capa de hidratación de las proteínas de tal manera que algunos organismos marinos lo transforman en Octopina (Lys + ác. pirúvico) para evitar el problema.

Tabla 1 - 4 Serie Liotropica. Destabilizante

Estabilizante Aniones F salting out

PO 4

3

2 SO CH COO 4 3

Cationes (CH) N+ (CH) N+ 3 4 3 2

N H+ 4

Cl

Br

+

K

+

Na

CNS

I

+

Cs

+

Li

salting in +2 + 2 Ba + 2 Ca Mg

Solutos intracelulares con efecto en la estructura de las proteínas Solutos orgánicos no perturbadores o estabilizantes

+ CH O H + CH NH H 2 H N 3 3 O O 3 CH C H+N C H C OH C H C H+N C H C R C C O O 2 2 3 2 3 O O CH C H CH O H H H 3 2 2 +H AMNIACIDO TRIMETILAMINA N SARCOSINA BETAINA SO GLICEROL 2 O 3 N - OXIDO H N C N CH C H C H C H C TAURINA 2 2 2 2N O H OCTOPINA H C CH 3 PERTURBADORES DELA ESTRUCTURA C NH HN + + 2 O O NH + 2 NH 2 HN C C O O 3 2 H N C N C H CH C H C H C HN 2 2 2 2 NH O 2 2 GUANIDINA H ARGININA UREA CH 3 + CH N O 3 CH 3

Entre los compuestos orgánicos estabilizantes se encuentran las Metil Aminas que incrementan el punto de denaturación térmica de las proteínas mediante la estabilización de las capas acuosas de hidratación en la superficie de la proteína. Se necesita mayor temperatura para agitar las moléculas de agua que forman la capa de hidratación de la proteína y contribuyen a la estabilidad de su conformación. Por otro lado entre los compuestos orgánicos destabilizantes de la capa de hidratación, se encuentra la Urea. Esta molécula es capaz de bajar el punto de denaturación térmica a las proteínas o en otras palabras disminuye su capa de hidratación haciéndolas más susceptibles a los choques con las moléculas de agua libre. De similar manera la Guanidina denatura a las proteínas al disminuir la contribución de la capa de agua que las rodea.

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f) EFECTO DE LA CONSTANTE DIELECTRICA La constante dieléctrica (D) es una medida de lo que se interpone entre dos cargas de distinto signo que se atraen o dos cargas de igual signo que se repelen. La fuerza que se desarrolla entre dichas cargas esta dada por la ecuación de Coulomb: F = 1/D x [ q(-) x q(+)] / r2 El valor de la constante dieléctrica (D) es de 1 en el vacío y aproximadamente 80 en el agua. En el vacío las cargas experimentan su mayor atracción o repulsión mientras que en el agua se disminuye este efecto, ya que se ordenan las moléculas de agua y forman enlace hidrógeno alrededor de las cargas puntuales, por lo que las cubren. Una solución proteica disminuirá su solubilidad al agregar al medio compuestos como Metanol, Etanol o Acetona, ya que estas moléculas con su reducida capacidad para formar enlace hidrógeno reemplazarán parcialmente a las moléculas de agua que cubren las cargas puntuales de la proteína, dejándolas cubiertas por su extremo polar capaz de formar enlace hidrógeno mientras que con su otro extremo hidrofóbico dirigido hacia el medio acuoso interaccionarán hidrofóbicamente con otras proteínas en igual situación y las podrán precipitar por agregación (Fig. 26 - 4). Como los solventes orgánicos tienen una baja Constante dieléctrica D no cubren bien las cargas de una proteína y estas pueden interaccionar con las cargas de otra, atraerse y precipitar.

+

+ C H 3CH 2 O H

-

-

+

+

-

-

+

+

Fig. 26 - 4. La molécula de Etanol se interpone entre las moléculas de agua y como no hace enlace hidrógeno por uno de sus lados, deja las cargas al descubierto. Estas se atraen o repelen denaturando y/o precipitando a la proteína.

Por otro lado los solventes orgánicos disminuyen la contribución del agua a la conformación de la proteína "hidrofílica por fuera, hidrofóbica por dentro". De esta forma la proteína no esconderá sus residuos hidrofóbicos y los pondrá en contacto con el solvente orgánico al abrirse y denaturarse. El grado de hidrofobicidad que presentan los solventes orgánicos debido a su cadena alifática, afecta a las proteínas que poseen superficies hidrofóbicas aumentando en este

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

caso su solubilidad. Por esta última razón se emplean mezclas de solventes orgánicos para extraer proteínas de las bicapas lipídicas.

Volver al inicio 7) EJEMPLOS DE PROTEINAS FIBRILARES. Estas proteínas se encuentran formadas solo por estructuras primaria y secundaria, ya que forman largas fibras destinadas al tejido estructural de sostén. En estas agrupaciones la repulsión estérica se minimiza y los enlaces hidrógenos se producen al máximo. Pueden alcanzar las estructuras del tipo α - hélice (Fig. 27 - 4) o β - plegada que se mantienen por medio del enlace hidrógeno. Las hélices más comunes son las 3.613 r, lo cual significa que tienen 3,6 residuos de aminoácidos por vuelta y 13 átomos involucrados en una vuelta con una torsión hacia la derecha (r por rectum). La distancia del enlace hidrógeno es de 2,8 a 3,0 A0. La hélice del tipo 310 r aparece solo en proteínas globulares y al final de una hélice normal.

a) α-KERATINAS

Fig. 27 - 4. La estructura α- hélice se mantiene por los enlaces hidrógeno intracadena.

Las proteínas que poseen las estructuras fibrilares descritas anteriormente, son conocidas como las Alfa-Keratinas (Figs. 28 y 29 -4), mientras que los aminoácidos más comunes entre ellas se observan en la Fig. 30 - 4. Sus principales exponentes son el pelo, las uñas, las garras, las plumas, las escamas, los cachos, los cascos y el caparazón de las tortugas. En la proteína que forma el pelo, tres alfa hélices interaccionan entre sí lateralmente por medio de los puentes disulfuros formando paquetes que se entrelazan con una torsión hacia la izquierda (Figs. 28 - 4 y 29 - 4). De esta manera se forman superhélices capaces de tolerar una mayor tensión con un estrecho empaquetamiento.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

-S-S-S-S-

-S-S- S - S -- S -S -SS - S --S-

-S-S-

-S-

-S-S-S-S-

-S-S-

-S-S-S-S-

Fig. 28 – 4. Estructura molecular del pelo.

Triple Alfa Hélice

Cordon superenrrollado mantenido por puentes disulfuro Protofibrilla

Microfibrilla

Fig. 29 - 4. Los puentes disulfuro mantienen las Hélices unidas.

La distribución de los aminoácidos que forman las estructuras tanto fibrilares como globulares es algo diferente aunque en algunos casos no es del todo rigurosa. Son elementos disruptores de α-Hélice, los residuos de Pro, las cargas y el tamaño de los grupos adyacentes. Las interacciones entre los aminoácidos espaciados por 3 o 4 residuos

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

aparte o las que ocurren en la vuelta de la hélice junto a la identidad de los aminoácidos que se encuentran en la secuencia al final o al inicio de la estructura determinan también su estabilidad. En la Fig. 30 - 4 se observa que la α -Keratinas presenta en mayor proporción los aminoácidos Glu, Cys y Ser, mientras que los aminoácidos His, Met e Ile junto a Lys y Phe N A m in o a c id o s

L a n a b ru ta 100

50

Ser

G lu

C y s P ro

G ly L e u

A s p A r g T h r A la V a l T y r L y s P h e I le H is M e t

Fig. 30 - 4. En este gráfico se puede apreciar la distribución de los aminoácidos que forman una proteína fibrilar.

están en menor cantidad. Por otro lado en las proteínas globulares (Fig. 31- 4) solubles en agua como la Seroalbúmina de Bovino, los aminoácidos que se encuentran en mayor proporción son Glu, Leu y Lys y en menor proporción Met, Ile y Gly. Cys y Ser justifican su presencia en las α - Hélices por las interacciones laterales por puentes disulfuro y por tener el residuo R de pequeño tamaño y sin carga, mientras que Glu y Lys son propios de una proteína soluble, ya que ambos poseen carga. M ol %

α K e r a t in a S e r o a lb u m i n a B o v in a

10

5

S er

G lu

C y s P ro

G ly

Le u

A sp

A rg

T h r A la

V al T yr Lys P he

I le H i s M e t

Fig. 31 - 4. Se observa una diferencia en la distribución de los aminoácidos de la proteína globular soluble en agua y la fibrilar insoluble.

Volver inicio b) β - KERATINAS

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al

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

La estructura β-plegada (fig. 32 - 4), forma filamentos flexibles como la Fibroina de la seda y las telas de araña conocidas por su flexibilidad y capacidad de tolerar la tensión. La distribución de las cadenas puede ser paralela o antiparalela afectando la dirección de los enlaces hidrógeno intercadena. Las hebras paralelas poseen los enlaces hidrógenos en ángulo mientras que en las antiparalelas son totalmente perpendiculares. En la estructura β -plegada el esqueleto polipeptídico se encuentra en forma de Zig-Zag a diferencia de la α -Hélice y todos los Carbonilos e Iminos de los enlaces peptídicos participan de los enlaces, mientras que los grupos R se encuentran sobre o bajo el plano. Ala y Gly son muy repetidos en la seda natural ya que poseen un grupo R pequeño.

R C

O C

N C C

O

R R

CR C

N

R

C

N

O

C

R

N

R N C

R

C C

R

R C

C

C

O

N

O

O

C

N

C

N

CC

C

R

C

C

C

O

O

R

O

N

N C

O

C

R

Fig. 32 - 4. Estructura β - plegada. Los grupos R están por sobre y bajo el plano plegado

Volver al inicio 8) ALGUNAS CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LAS ALFA Y BETA PLEGADAS a) La vuelta β, (Fig. 33a - 4) que es una estructura formada por el orden de aminoácidos -XGly-Pro-Y- (X e Y son cualquier aminoácido). Esta estructura se produce cuando una cadena polipeptídica gira 180o cerca de la superficie de una proteína. Se dice que cerca de un tercio de los aminoácidos de una proteína están involucrados en vueltas o codos cerca de la superficie. b) Se denomina estructura Supersecundaria, a los plegamientos que pueden ocurrir entre las mismas cadenas que forman las estructuras β -plegadas o bien a los plegamientos que ocurren entre las cadenas de las estructuras α - Hélice y que incluso agrupan dentro de esta categoría a las estructuras mixtas, donde las α - Hélices se encuentran intercaladas con las β -plegadas. No todas las estructuras β -plegadas tienen apariencia normal y pueden ocurrir en ellas ciertas anomalías como se observa en la Figura 33b - 4:

110

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Recodos del tipo β Exteror O

R

H

R C

C C N C

C O

C O H N

b)

R H R

R

C C N C H N

Estructuras super secundarias

a)

O

H N

C

O

C O H N

Interior

C

C

R

C R

R

Se producen cuando los elementos de estructura secundaria alcanzan la superficie de las proteínas

c)

Elementos de estructura secundaria α o oβ que no alcanzan a completar una estructura terciaria

Anoma lías en las estructuras tipo β

d)

antiparalela paralela

Torcedura hacia la derecha por tres polipéptidos en la estructura β plegada

Esteructura β antiparalela con un residuo extra que provoca una distorsión

Fig. 33 - 4. Se puede observar en la parte superior algunas particularidades de las estructuras del tipo Beta junto a algunas anomalías que también se presentan en la parte inferior de la figura.

c) Distorsión en abanico, (Fig. 33c - 4) esta estructura ocurre cuando las cadenas β a pesar de ser plegadas no corren interaccionando de manera horizontal unas con otras y se distorsionan formando una especie de abanico. Esta estructura se debe a una deformación del Nitrógeno del enlace peptídico que trata de tomar la conformación tetraédrica causando de esta manera una pérdida de la planaridad para así optimizar los enlaces hidrógenos. d) Abultamientos o jorobas, (Fig. 33d - 4) a causa de la presencia de un residuo extra intercalado entre las hebras beta plegadas, también se les llama bulto o joroba Beta.

Volver inicio 9) COLAGENO.

111

al

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

El colágeno Tipo I (Tabla 2 – 4) es la proteína ESTRUCTURAL de origen animal QUE SE ENCUENTRA EN MAYOR CANTIDAD EN LA TIERRA. Se le halla en los huesos, tendones, dentina, cartílagos, piel, vasos sanguíneos y la córnea. En los animales jóvenes el colágeno es muy flexible e incluso soluble, ya que tiene escasa formación de enlaces cruzados. Sin embargo, a medida que el animal envejece aumentan los enlaces cruzados entre sus fibras y los huesos se hacen menos flexibles llegando a quebrarse fácilmente. La hebra básica de colágeno es del tipo 3,310s. Tiene 3.3 residuos con diez átomos de la cadena central por vuelta y se enrolla hacia la izquierda (sinister). En ella cada tercer residuo es Glicina y la secuencia es del tipo X - Gly - Pro -, donde X es cualquier aminoácido. Uno de sus genes Col1A1 que forma el colágeno Tipo I tiene 52 exones y 18 kilobases (kB). Los polipéptidos que forman parte de las hebras y que posteriormente dan origen a las distintas triple hélices se denominan: α1(I), α2(II), α3(III), α4(IV) y α2, ya que difieren algo en su composición aminoacídica. En la Tabla 2 - 4 se describe la identidad de las hebras individuales de la molécula de Tropocolágeno y su distribución en los distintos tejidos.

Tabla 2 - 4 ALGUNAS DE LAS HEBRAS QUE CONSTITUYEN EL COLAGENO Tipo

Composición

I

[α1(I)]2 α 2 (dos cadenas α1 y una α2)

II

[α1(II)]3

III

[α1(III)]3

IV V

[α1(IV)2α2(IV) [α1(V)]2α2(IV)

Tejido Cornea, tendón, hueso, piel Discos intervertebrales, cartílago Sistema cardiovascular, piel fetal, fibras reticulares Membrana basal Placenta

El Colágeno se sintetiza en los Fibroblastos y se le considera una Glicoproteína insoluble que es parte de todos los tejidos conectivos. Existen más de 20 genes responsables de su síntesis y esta empieza con una molécula de PreProColágeno (1464 aas.), que lleva la información Pre para entrar al Retículo Endoplásmico Rugoso de parte de los Ribosomas asociados a la superficie (Fig. 34 - 4). Una vez en el interior se rompe el péptido señal y pasa a ser Procolágeno. Cada una de las hélices se estabiliza individualmente por la repulsión que existe entre los anillos de las Prolinas (Pirrolidinas) que se encuentran dirigidos hacia el exterior. A medida que la vesícula viaja al Golgi, ocurren una serie de modificaciones químicas, consistentes en Hidroxilación y Glicosilación. La Hidroxilación ocurre por medio de las enzimas Prolil y Lisil Hidroxilasa. Los grupos Hidroxilos servirán posteriormente para la interacción intercadena mediante enlace hidrógeno. A continuación la enzima Glucosil y Galactosil Transferasa, une monosacáridos a las unidades de Lisina hidroxiladas que se encuentran en la cadena. Una vez terminada la modificación química se produce la asociación de 3 de los Propéptidos empezando por el lado Ct por medio de puentes disulfuros, mientras que los

112

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

extremos Nt interaccionan entre sí mediante cargas formando un ovillo al azar, que finalmente ayuda con su acción al ensamblaje triple. Las tres hebras que individualmente se enrollan hacia la izquierda sé ensamblan en una triple hélice (Fig. 34 - 4) y sufren una torsión hacia la derecha, al interaccionar por medio de los enlaces hidrógenos intercadena. De esta manera se gana una mayor capacidad para tolerar tensiones y queda formada la unidad de Procolágeno.

Retículo Endoplásmico Rugoso formación del PREPRO COLAGENO

Acción de la PROLIL HIDROXILASA y Vitamina C

Acción de la LISIL HIDROXILASA OH

OH

+

+ -

-

S

OH

+ -

S OH

OH

S

S

OH

Membrana plasmática

O H Glucosil

Galactosil OH Transferasa

OH

OH

OH

OH OH OH OH

Transferasa

OH OH

OH

S S S S S

OH OH

S OH

S

S

Triple Hélice ensamblada forma la unidad de PROCOLAGENO

Fig. 34 – 4. La síntesis de Procolágeno ocurre en el RER y se ensambla en el medio Extracelular.

Una vez que la triple hebra se ha ensamblado se le denomina Procolágeno y es secretada al exterior donde sufre la acción de la enzima Procolágeno Peptidasa. Esta última hidroliza los péptidos de 15kD en el Nt y de 30kD en el Ct. Ambos extremos fueron de utilidad para el reconocimiento entre las hebras y su aproximación. Finalmente queda solo una triple Hélice de 95 kD llamada TROPOCOLAGENO. Su largo es ahora de 3000Ao y su peso molecular es de 285 kD (Fig. 35 - 4) y tiene 338 repeticiones de Gly-X-Y, donde X e Y es a menudo Pro. El efecto de las interacciones débiles como son los enlaces hidrógenos dentro de su contexto cooperativo confieren una gran resistencia térmica al colágeno. De esta manera el número de residuos Pro + HO-Pro presentes en el colágeno serán una función de la temperatura corporal a la que el espécimen prospera. Por esta razón el Colágeno presenta una temperatura de fusión determinada, que también es conocida como la temperatura a la que se desarma la triple hélice de Tropocolágeno y aumenta con el % de Pro-HO-Pro generando una estructura más resistente en el animal de sangre caliente que la de un pez. Al retomar nuevamente la síntesis del Colágeno encontramos que la molécula de Tropocolágeno se ensambla de forma escalonada en el exterior, cerca de la superficie de las células mediante la presencia de enlaces cruzados. En este sitio la enzima Lisil Oxidasa (que requiere de Cu+2, PALP y es inhibida por Latirógenos) es fundamental para crear la unión Aldólica y también la unión Hidroxipiridina entre los residuos de LISINA (Fig. 36 – 4).

113

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Una vez dispuestas las unidades de Tropocolágeno de forma escalada se depositan entre ellas los cristales de hidroxiapatita que contribuirán a dar mayor resistencia a la fibra de colágeno.

Nt Nt

OH

Nt

OH

S

OH

La falla de PROCOLAGENO PEPTIDASA en el líquido extracelular, se encuentra caracterizada por el síndrome de EHLER DANLOS En los animales la misma enfermedad se denomina DERMATOSPARAXIS, ambas se caracterizan por la presencia de piel LAXA

Ct

S

S Ct S Ct

. OH

Nt

OH

OH

Ct

Molécula de TROPOCOLAGENO en el LIQUIDO EXTRACELULAR OH

Nt

.

OH

Nt Nt

OH OH

OH

OH

Ct

OH

OH

Ct

OH

Ct

Los enlaces cruzados se producen por residuos de LISINA modificados

Disposición escalonada de las moléculas de Tropocolágeno por medio de enlaces cruzados intermoleculares e intramoleculares para formar una microfibrilla Fig. 35 - 4. El ensamble del Tropocolágeno en microfibrilas ocurre mediante la formación de los enlaces cruzados

En los animales la ingesta de las semillas conocidas como "arvejilla" produce el Latirismo, enfermedad caracterizada por la inhibición de la enzima Lisil Oxidasa a causa de los compuestos químicos o Latirógenos producidos por la planta del género Lathyrus. Además, estos compuestos son neurotóxicos y pueden afectar a las neuronas motoras paralizando las extremidades posteriores.

114

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

FORMACION DE UNIONES DENTROY ENTRE LAS MOLECULAS DE TROPOCOLAGENO Acción de la Lisil Oxidasa extracelular en la formación de enlaces cruzados

Consecuencias de la acción de la Lisil Hidroxilasa intracelular en la formación de enlaces cruzados H N - H C - H C - ( CH2)2 -

- ( CH ) - CH - CH - N H 22

H N - ( CH2) 4 -

- ( CH) - N H3 2 4

3

LISIL Cu+ 2 OXIDASA PALP EXTRACELU LAR - ( CH) - C H - C 2

2 2

O

O

Residuos de Lisina pertenecientes a los extremos de las Hélices

3

2

2

22

O

3

2

3

22

2

OH

OH NH

2 2

CH

3 2

CH 2 ( CH )

22

UNIONENTRE DOS OH- LISINAS Y UNA LISINA PARA FORMAR LA HIDROXIPIRIDINA

H O

2 2

C

H N - CH- H C- ( CH ) -

- ( CH ) - CH-CH-N H

H - ( CH ) - C H - C C - ) CH ( 2 2 2

2

LISIL HIDROXILASA INTRACELULAR

Eliminación del Amonio del carbono Epsilon y oxidacón de este Carbono en un Aldehído

CONDENSACION ALDOLICA

2

3

C - C H - ) CH ( -

H

H

2

- ( CH) -

H

+N -CH- HC- ( CH2)

2 2

2

Unión Aldol ( CH )

22

2

OH

Hidroxipiridina

Fig. 36 - 4. Formación de los enlaces cruzados en el colágeno.

Volver

al

inicio 10) ANOMALÍAS EN LA SÍNTESIS DEL COLAGENO Como se ha visto la síntesis de Colágeno es algo compleja y a la vez susceptible de experimentar algunas anomalías entre las cuales se encuentran enfermedades de origen distinto y que pueden ser: a) Falta de enlaces cruzados en el colágeno por algún defecto genético. b) Represión de la síntesis de algunas de las moléculas de colágeno.

115

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

a) ESCORBUTO La falta de vitamina C o ác. Ascórbico produce la enfermedad denominada Escorbuto (Ver Capítulo 6), que ocurre tanto en el hombre como en los Conejillos de Indias. Sus síntomas aparecieron en los navegantes de la antigüedad durante las grandes travesías a vela. La enfermedad se caracteriza por hemorragias capilares, articulaciones dolorosas e hinchadas, caída de los dientes, manchas y llagas en la piel, que son de una lenta recuperación junto a una baja capacidad para combatir infecciones. A pesar de estas terribles manifestaciones se observó posteriormente que una dosis diaria de algún cítrico curaba rápidamente estos síntomas. La vitamina C como se ha determinado en la actualidad es necesaria para el correcto funcionamiento de las enzimas Prolil y Lisil Hidroxilasa. En general el ácido ascórbico es requerido para el funcionamiento normal de fibroblastos y osteoblastos durante la formación de las fibras normales del colágeno y su posterior glicosilación. La vitamina C es también necesaria para la síntesis de mucopolisacáridos del tejido conectivo, las proteínas que forman la dentina y la elastina de los capilares. Más aún la vitamina C parece estar involucrada en otras hidroxilaciones como ocurre durante el metabolismo de los esteroides, el paso de Fenilalanina a Tirosina, la hidroxilación del Triptófano en la vía destinada a la síntesis del neurotransmisor Serotonina y la de otros compuestos aromáticos. Por lo tanto a causa de las razones anteriores, la inactividad de las hidroxilasas impide las interacciones laterales por medio de enlace hidrógeno entre los grupos OH de los residuos de OH-Prolina e OH-Lisinas tanto en las cadenas Alfa o Beta de la macromolécula de colágeno propiciando su inestabilidad.

Volver al inicio b) EHLER-DANLOS Es un amplio nombre para desórdenes del tejido conectivo que pueden tener muchas causas moleculares, pero siempre relacionadas con la síntesis del Colágeno, ya sea en la secuencia misma del colágeno o en las enzimas que participan en sus modificaciones químicas. En general Ehler Danlos resulta de fallas en la síntesis de Procolágeno Tipo I y II o fallas en los enlaces cruzados. Tiene 10 diferentes subtipos y se caracterizan por fragilidad de la piel, formación anormal de cicatrices, excesiva marcas de golpes, articulaciones hipermóviles y algunas veces ruptura de vísceras y arterias. Por ejemplo la enfermedad de Ehler-Danlos tipo VI, se caracteriza por deficiencia de la enzima Lisil Hidroxilasa, al producirse hebras con bajo contenido de hidroxi-lisina que posteriormente no formarán enlaces cruzados por medio de los anillos de hidroxipirimidina.

Ehler Danlos, Tipo IIse produce la Por otro lado, cuando ocurreTipo la deficiencia de la enzima Lisil Oxidasa Ehler Danlos, I enfermedad molecular denominada Ehler-Danlos Tipo V caracterizada por piel delgada y 116

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válvulas cardíacas defectuosas y presencia de hernias. Más aún, cuando la enzima Procolágeno Peptidasa no está presente o bien no corta los péptidos en los extremos terminales del Procolágeno, a causa de la presencia de una mutación que impide reconocer el sitio de corte, se desencadena la enfermedad recesiva denominada Dermatosparaxis en los animales y que se caracteriza por la presencia de piel inmadura, frágil y colgante.

TABLA 3 -4 ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA SINTESIS DEL COLAGENO Enzima Prolil Hidroxilasa ubicada al interior de la célula Lisil Hidroxilsa ubicada al interior de la célula Galactosil y Glucosil Transferasas ubicadas al int. de la célula Procolágeno Peptidasas ubicadas fuera de la célula

Cofactores Fe+2, Vitamina C

Lisil Oxidasa

Cu+2, PALP

Vitamina C o Ascórbico en polipéptido --------------

-------------

Función Formación de la 4 OH-Prolina en el Polipéptido ác. Formación de la 5 el OH-Lys en el polipéptido Glicosilación de la cadena naciente en la 5 OH- Lisina Cortan extremos Nt y Ct de la triple hebra de pro- colágeno para completar su ensamblaje Elimina el grupo Amino del carbono Epsilon (ε) de la Lisina y oxida a este carbono en un aldehído

Falla Escorbuto Escorbuto, Ehler Danlos Tipo VI

-

-----------

Ehler-Danlos Tipo VII En animales Dermatosparaxis

Latirismo (falla enlace entre colágeno y elastina) En los animales Producido por el inhibidor enzimático β- Amino-propionitrilo, que se encuentra en la planta denominada “arvejilla”. La enfermedad se desencadena con dietas deficientes en Cu. En humanos se denomina EhlerDanlos Tipo V.

En humanos en cambio, la misma causa molecular produce la enfermedad denominada Ehler-Danlos Tipo VII, que se caracteriza por una piel laxa y apariencia añosa. La enfermedad de Ehler Danlos tipo IV se debe a defectos en la fibra de Procolágeno Tipo III y en este caso las personas presentas riesgos de ruptura de vasos o intestino.

117

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Volver al inicio c) OSTEOGÉNESIS IMPERFECTA Esta enfermedad del Colágeno se debe a la expresión defectuosa de las cadenas de Procolágeno del Tipo I. Puede ocurrir debido a una mutación puntual de Transversión (Timina por Guanina) en el Procolágeno que impide la remoción de los péptidos terminales por la enzima Procolágeno Peptidasa: 987 988* 989 Alelo CCT GGT CCT Normal Pro Gly Pro Alelo Mutante

CCT TGT CCT Pro Cys Pro

En esta anormalidad ocurre el cambio de una Gly por una Cys en la posición 988* de la cadena Alfa I de la triple hélice, por esta razón se abre el extremo Ct a una excesiva hidroxilación y glicosilación que impide su corte enzimático y posterior ensamble durante la maduración del Tropocolágeno, lo que se traduce en la aparición de fracturas a nivel del hueso. Mutaciones en la Triple hélice son causantes de distintos grados de Osteogénesis Imperfecta, ya que forman una joroba por falta de interacción con sus vecinos de las otras hélices, impidiendo el empacamiento cerrado de las triple hélices.

Osteogénesis Imperfecta Volver al inicio

d) GANGRENA GASEOSA Entre las otras enfermedades que sufre el colágeno es interesante mencionar la acción del Clostridium Histoliticum. Este microorganismo ataca enzimáticamente la secuencia X - Gly Pro - Y durante la infección denominada GANGRENA GASEOSA. De esta manera degrada los tejidos y penetra fácilmente en ellos propagando la infección. Una enzima similar a esta,

118

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

pero de origen endógeno es empleada por algunos animales durante la metamorfosis para la reabsorción de algunos tejidos que serán reemplazados por otros.

e) RESUMEN DE CONCEPTOS SOBRE LA SÍNTESIS DEL COLÁGENO: 1) La triple hélice de Colágeno se enrolla a la derecha, mientras que las hebras individuales se enrollan individualmente hacia la izquierda 2) La Hidroxilisina se encuentra solo en el Colágeno 3) La Hidroxilación de Lisina y Prolina requiere de Vitamina C, O2y Alfa-Cetoglutarato 4) La Vitamina C mantiene al Fierro como +2 5) La inhibición de la Hidroxilación de la Prolina resulta en inhibición de la formación de la triple hélice y en una molécula no funcional. 6) Las triples hélices se encuentran unidas de forma escalonada por residuos de lisina y enlace cruzado de aldol 7) Todos los tipos de colágeno se encuentran compuestos de cadenas Alfas 8) Desmosina e Isodesmosina se encuentran solo en la Elastina 9) Osteogénesis imperfecta resulta a partir de defectos en el colágeno Tipo I 10) El síndrome de Ehler-Danlos resulta de de defectos en Procolágerno Tipo I y Tipo III o los enlaces cruzados 11) El síndrome de Marfan es por falla de la Fibrillina 12) Latirismo resulta de la ruptura del enlace covalente entre colágeno y elastina Volver al inicio 9) ELASTINA La ELASTINA es otra proteína del tejido conjuntivo y al igual que el colágeno es rica en aminoácidos hidrofóbicos con poquísimos aminoácidos polares. Se le encuentra de preferencia en ligamentos y en las paredes de los vasos sanguíneos que tienen la facultad de estirarse y volver a su forma original (Fig. 39 - 4). El precursor de esta molécula es la subunidad de Tropoelastina con subunidades de 30 y 100 kD. Además, posee enlaces cruzados debido a la acción de la enzima Lisil Oxidasa entre los residuos de Lisina, donde cataliza la formación de radicales como Lisil y Lisil Semialdehidos, que dan origen a los aminoácidos derivados Desmosina y Lisina-norleusina (Fig. 40 - 4). Ambos aminoácidos se emplean como anillos de unión para anclar las distintas cadenas polipeptídicas.

119

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura Fig. 39-4. Estructura de la Elastina. α –Hélices unidas por Desmosina-

La Elastina contiene cantidades elevadas de Glicina y Prolina, pero carece de Cisteína y Triptófano. Sin embargo, contiene pocos aminoácidos polares y no contiene OH-Lisina. La cantidad de Hidroxi-Prolina necesaria para la estructura normal de la molécula es también afectada por la falta de vitamina C que afecta a la enzima Prolil Hidroxilasa.

H

H

H

O

N

C

C

(C H ) 2 2 CH

N

H C CH CH 2 2 O C

CH + N CH (CH

2

CH

2

N

H

C

H

C

DESMOSINA

O

2 2

)

C

C

N

O

H

H

3

H N H C O

(C H2 )3

CH 2

H

H

N

C

C

H

CH 2

(C H2 ) 2

N

H

C

H

C

O

LISONORLEUSINA

Fig. 40 - 4. El aminoácido Desmosina actúa como anillo de unión para las cadenas de elastina.

Tanto en animales como el hombre la formación de enlaces cruzados es defectuosa cuando la dieta es pobre en Cu afectando la síntesis enzimática de los aldehídos necesarios para formar enlaces cruzados o anillos de anclaje como la Desmosina. Por esta razón se produce un ensanchamiento de la aorta debido a la perdida de su elasticidad. En esta arteria se encuentra la mayor cantidad de Elastina (30gr/100gr de peso seco) junto al Colágeno (20 gr/100gr de peso seco). De esta manera frente a una falta de enlaces cruzados a consecuencias de una baja actividad en la enzima Lisil Oxidasa (Amino Oxidasa-Cu dependiente) el tejido se distiende y no vuelve a su forma original. La Elastina es resistente a la hidrólisis por colagenasas del Clostridium Histoliticum. Entre las enfermedades que afectan a esta proteína se encuentra también la presencia de Latirógenos que provocan una falla en la maduración de la Tropoelastina en los tejidos al inhibir a la Lisil Oxidasa.

Volver al inicio 10) PROTEINAS GLOBULARES.

120

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Se caracterizan por tener un centro hidrofóbico en su interior y una superficie hidrofílica expuesta al medio acuoso. Pueden estar formadas por una o varias subunidades y a su vez cada una de ellas por varios módulos o dominios. Las subunidades pueden interaccionar entre ellas por medio del enlace hidrógeno, electrostático, hidrofóbico y puentes disulfuro. Las interacciones entre los residuos laterales mantienen la estructura tridimensional de la proteína. Desde el punto de vista termodinámico su conformación esta dada por la suma algebraica de todas sus interacciones débiles. En otras palabras, así como hay interacciones que liberan energía para ganar estabilidad, también hay otras que toman energía para la misma causa. Si la suma total de la energía tanto liberada como absorbida por las distintas interacciones es cercana a 0, la estructura plegada de la proteína se encontrará en equilibrio con el medio y su conformación puede ser denominada como nativa.

C O O

--

+ H N 3

Leg hem oglobina vegetal 146 am inoacidos

N H

--

+

C O O

3

--

β- Hem oglobina 155 am inoacidos

--

M ioglobina 153 am inoacidos

C O O N H

3

Fig. 41- 4 Las proteínas Leghemoglobina, α o β hemoglobina y Mioglobina están emparentadas entre sí.

Por supuesto que esta es una definición simplista, ya que existen proteínas muy estables que pueden tomar energía del medio sin denaturarse y otras que pueden liberarla de manera similar. La Mioglobina y la Hemoglobina son dos proteínas bastante conocidas desde hace algún tiempo ya que fueron estudiadas por Perutz y Kendrew empleando la técnica de Difracción de Rayos X. Ambas proteínas intervienen en el transporte de oxígeno. A ellas se agrega otra proteína de función similar que se denomina Leghemoglobina (Fig. 41 - 4). Esta proteína se encuentra en las raíces de las Leguminosas y presenta una estructura terciaria similar a las otras dos.

a) LEGHEMOGLOBINA. Es considerada como otra integrante de la familia de las Globinas. Su nombre proviene de la unión de las palabras Leguminosa con Hemoglobina y se caracteriza por tener como grupo

121

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

prostético a una Protoporfirina IX (Heme) en su única cadena polipeptídica con un de PM 16 kD. Se le encuentra en gran concentración en los nódulos de las raíces de las Leguminosas como la Soja y el Lupino. En este sitio actúa transportando O2 a los microorganismos asociados simbioticamente a la planta, como el RHIZOBIUM y el BRADYRHYZOBIUM, cuya función es la fijación del Nitrógeno. A medida que el Oxígeno compite con el Nitrógeno por el sitio activo del complejo enzimático de la Nitrogenasa, el papel de la Leghemoglobina no solo sería de enriquecedor de la concentración de Nitrógeno, sino que también como sensor del O2 molecular en las raíces. El grupo Heme de la proteína es sintetizado por la bacteria y la Globina por la célula vegetal infectada. Es indudable que el origen de estas proteínas Mioglobina, Hemoglobina y Leghemoglobina es común y se remonta a cerca de 1500 millones de años atrás, cuando se produjo la división entre el reino animal y el vegetal. El origen común se atribuye a la presión selectiva causada por la aparición del Oxígeno en la atmósfera que seleccionó a este conjunto de aminoácidos, ubicados en la secuencia de una cadena polipeptídica (formada por distintos segmentos de α-Hélice), como la mejor forma de atrapar O2 con un grupo Heme. Por lo tanto se ha conservado la estructura terciaria tanto en plantas como animales a pesar de las variaciones experimentadas por la secuencia aminoacídica que dependen del medio interno en que se encuentra la proteína.

Volver

al

inicio b) MIOGLOBINA. La Mioglobina se encuentra en el músculo y tiene 8 segmentos de α - hélice que se encuentran plegados formando una estructura compacta y globular. Su interior es hidrofóbico y su exterior es polar, el Oxígeno mismo se une a un bolsillo hidrofóbico donde se encuentra alojado el grupo Heme formado por una Protoporfirina IX y un Fe+2. El grupo Heme interacciona con 16 residuos de aminoácidos y el Fe con los cuatro nitrógenos de los anillos de pirrol de la Protoporfirina más una Histidina proximal (situada en la hélice F con posición 8) y una distal que no esta ligada al grupo heme. Por lo tanto la sexta posición de coordinación esta libre de ser ocupada por el Oxígeno. La proteína tiene un gen que cuenta con tres exones (secuencia discreta de aminoácidos con una función específica) y dos intrones, donde el exón central interviene en la unión al grupo Heme y al Oxígeno.

Volver al inicio c) HEMOGLOBINA.

122

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

La Hemoglobina presenta cuatro subunidades, 2 subunidades α con 141 aminoácidos y 7 segmentos helicoidales cada una más las dos subunidades β (Fig. 42 - 4) con 146 aminoácidos y 8 segmentos helicoidales. Las cadenas α, β son similares a la Mioglobina. El peso molecular total del tetrámero es de 64 kD.

Las interacciones no covalentes estabilizan la unión entre las subunidades

Fig. 42 - 4. Las cuatro cadenas interaccionan entre sí formando un tetraedro.

Las 4 subunidades se agrupan en los vértices de un tetraedro y contienen 4 grupos prostéticos Heme (Fig. 42 - 4). Este grupo es una Protoporfirina IX con Fe+2 en su centro y se encuentra ubicada al igual que en las proteínas anteriores en un bolsillo hidrofóbico de la estructura. El Fe del grupo Heme coordina con cuatro nitrógenos en el plano del anillo de la Protoporfirina IX más una Histidina proximal que cede electrones estabilizando al Fe. En ausencia de Oxígeno el Fe está a 0,6 Ao sobre el plano de la Protoporfirina y en presencia de Oxígeno, baja y se sitúa en el mismo plano. Este cambio de posición arrastra a la His proximal lo que produce un cambio en la estructura terciaria que se transmita a la estructura cuaternaria facilitando la entrada de nuevas moléculas de Oxígeno a las otras subunidades de la Hemoglobina. La otra Histidina que se encuentra en la posición distal conocida como E7 (se encuentra en la hélice E en la posición 7), no interacciona directamente con el Fe del grupo Heme (Fig. 43 - 4), pero protege de la unión al monóxido de carbono (CO) bajando su afinidad en 125 veces a causa del impedimento estérico que crea al oponerse a la ubicación de la molécula de CO sobre el plano del grupo Heme.

123

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

En general la estructura de la Hemoglobina es hidrofóbica por dentro y polar por fuera. Su estructura cuaternaria permite una modulación de su actividad por medio de los cambios conformacionales transmitidos de una subunidad a otra, cosa que no ocurre con la Mioglobina que es rígida. De esta manera la afinidad de la Hemoglobina por el Oxígeno se puede variar al pasar la sangre desde los pulmones a los tejidos que efectúan trabajo metabólico. Esta modulación es llevada a cabo por efectores como el pH, la presión parcial de CO2 (poco) y el metabolismo 2,3 Difosfo-Glicerato (2,3 DPG). Todos ellos actúan afectando la conformación de las subunidades y la interacción entre ellas hace cambiar la

a)

b) 1 C

N Hélice E 7

CH

HC

A

F

His de la

H

N H

DISTAL

E C N

Fe

N

N

B

G

B

C

G

E

D H

N

F

A

1

N His de la

HC

CH

Hélice F 8 PROXIMAL

N

C

CONTACTOS DE EMPAQUETAMIENTO CONTACTOS DE DESLIZAMIENTO CON

2

2

Fig. 43 - 4. El Fe interacciona con los nitrógenos de los pirroles y la His proximal. Fig. 43 - 4. Los sectores de Alfa hélice se ordenan de la A hasta la D.

afinidad. El mecanismo por el que ocurre se examinará en el próximo capítulo de Enzimas.

Volver al inicio 11) CONTACTOS ENTRE LAS SUBUNIDADES DE LA HEMOGLOBINA Las hélices de la Hemoglobina presentan distintos tipos de contacto como son los contactos de empaquetamiento (Fig. 43 - 4), que ocurren entre las hélices α 1- β 1 y las α 2 - β 2 implicando a las hélices de los sectores B, G, H y el codo GH. Luego están los contactos de deslizamiento entre las subunidades α 1 - β 2 y la α 2 - β 1 que involucran a las hélices de los sectores C, G y el codo FG. De esta manera el tetrámero se encuentra formado por dos protómeros asimétricos α 1 - β 1 y α 2 - β 2. Al unirse el Oxígeno, el dímero α 1 - β 1 rota 15o sobre el dímero α 2 - β 2 deslizándose sobre los contactos α 1 - β 2 y α 2 β 1. Los contactos y movimientos aquí descritos son necesarios para modular la afinidad de esta macromolécula proteica por el Oxígeno bajo las distintas situaciones en que se encuentra el organismo.

124

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

De la figura 44 - 4, se puede apreciar la disposición antiparalela entre las cuatro cadenas de las Globinas y sus interacciones por puentes salinos. Las cadenas α 1 y α 2 interaccionan de forma antiparalela por medio de sus Argininas 141 y Aspártico 126. Mientras que sus Ct y Nt también lo hacen en los extremos de cada cadena. La Lisina 40 de las cadenas α interacciona a su vez con los Ct de ambas cadenas β, cuyos residuos Aspártico e Histidina interaccionan entre sí.

Interacciones electrostáticas entre las cadenas α y β de la Hemoglobina .

β2

α1

α2

β1

+

+ H3 N

Asp

His

94

146

+ OOC

+ H3 N

+

Arg 141

126

3

+

Asp

Arg

40

126

141

146

NH

40

+

His

+

Lis

Asp

Lis

+

OOC

COO

COO

+

Asp

NH

3

94

Fig. 44 - 4. Las cuatro cadenas se unen por puentes salinos o interacciones electrostáticas.

Estas interacciones son del tipo puente salino, lo que significa que están mediadas por las cargas presentes, tanto en los distintos residuos de aminoácidos cómo en sus extremos terminales. Volver al inicio 12) SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD). Esta enzima (Fig. 45 - 4), cataliza la dismutación de los Superóxidos:

O2- + O2- + 2 H+ ------> H2O2 + O2 Es decir, a partir de dos moléculas idénticas de Superóxido se producen dos compuestos diferentes, una molécula de Peróxido de Hidrógeno y otra de Oxigeno. La enzima se encuentra formada por solo una subunidad con 4 cadenas Beta plegadas por el lado anterior y cuatro cadenas Beta plegadas por el lado posterior. Todas sus cadenas se encuentran en

125

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

la disposición antiparalela. Los polipéptidos que conectan las cadenas α- plegadas anterior y posterior solo presentan una conformación de ovillo al azar. A diferencia del grupo de las Globinas que poseen en su estructura espacial solo α-Hélice, esta proteína que interacciona con el Oxígeno en la forma de Superóxido O2-, tiene una estructura terciaria totalmente distinta a las anteriores. E nzima formada por estructura β -plegada antiparalela y dispuesta en la forma de una capa superior y una inferior

O villo al A zar

O villo Zn

N t

Cu

al Azar

-S -S -

C t Superóxido D ismutasa Fig. 45 - 4. Estructura terciaria formada por cadenas β-plegadas en la Superóxido Dismutasa. Zn tiene un papel solo estructural.

El sitio de unión al Superóxido es el átomo de Cu que se encuentra ubicado en el centro de la proteína donde se coordina por los nitrógenos de cuatro histidinas simulando un grupo Heme distorsionado. Finalmente al analizar algunas de las proteínas globulares que interaccionan con el Oxígeno se puede concluir que existen estructuras del tipo α y estructuras del tipo β. Las primeras como la Leghemoglobina, Hemoglobina, Mioglobina están formadas exclusivamente por estructura secundaria α-Hélice, plegada entre sí con grupos Heme. Son como resortes enrollados con distintos segmentos corriendo en una y otra dirección. Por otro lado, las proteínas Beta de las que se entrega solo el ejemplo de la Superóxido Dismutasa (Fig. 45 - 4), están formadas por estructuras β-plegada que corren de manera antiparalela en dos tandas, una capa anterior de cuatro hebras y una capa posterior también de cuatro hebras interaccionando entre sí. Ambas capas sirven de marco para la unión de un grupo seudo grupo Heme distorsionado que se forma por distintas Histidinas de la secuencia para unirse al Cu. El Zn solo tiene papel estructural, mientras que el Cu participa en la catálisis. En la tabla 4 – 4, aparece la secuencia parcial de 4 proteínas conocidas por unirse al Oxígeno mediante el grupo Heme. Aquellos aminoácidos pertenecientes a estructuras

126

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

críticas para la función permanecen en todas ellas, mientras que el resto es poco conservado. Todas ellas presentan la misma conformación tridimensional. Solo cambios de aminoácidos de un tipo por otros del mismo tipo les permite mantener su estructura terciaria y adaptarse a los distintos medios internos donde llevan a cabo su función. Son comunes a todas ellas Val (V) 1 o Amino terminal, Pro (P) 38, Phe (F) 44, His (H) 65 y la His (H) 100, necesarios para la estabilización del complejo Proteína-Grupo HemeOxígeno.

Tabla 4 - 4 Homología de las secuencias parciales en cuatro proteínas con un ancestro común

SECUENCIA

Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena αHemoglobina βHemoglobina Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena αHemoglobina βHemoglobina Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena αHemoglobina βHemoglobina

10

20

30

40

VAETEKQDAL

VSSSFEAFKA

NIPQYSVVFY

TS I LEKAPAA

VXLSEGEWQL

VLHVWAKVEA

DVAGHGQDIL

I RLFKSH PET

VXLSPADKTN

VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL

ERMFLSPPTT

VHLTPEEKSA

VTALWGKVNX

GRLLVVYPWT

XVDEVGGEAL

50

60

70

80

KD I FSELANX

GVDXPXXTNP

KLTGHAEKLF

ALVRDSAGQL

LEK FDRFKHL

KTEAEMKASE

DLKKHGVTVL

TALGAILKKK

KTY FPHFXDL

SHGSAXXXXX

QVKGHGKKVA DALTNAVAHV

QRF FEBFGDL

STPDAVMGNP

KVKAHGKKVL

90

100

110

120

GAFSDGLAHL

KASGTVVADA

AXXXXLGSVH

AQKAVTDPXQ

FVVVKEALLK

GHXXXXXXEA

EXLKPLAQSH

ATKHK I PI KY

LEF I BEAI I H

DXXXXXXDMP

NALSALSDLH

AHKLRVDPVN

FKLLSHCLLV

DXXXXXXNLK

GTFATLBELH

CDKLHVDPEN

FRLLGNVLVC Volver al inicio

13) ENVEJECIMIENTO DE LAS PROTEINAS.

127

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Las proteínas tienen una vida media que se puede caracterizar por un recambio metabólico lento o rápido. Entre las primeras tenemos a las proteínas que se requieren para la integridad de una estructura, como lo son colágeno y elastina y entre las segundas o rápidas tenemos a las enzimas y hormonas peptídicas, cuyos niveles se pueden ajustar para regular la catálisis de una sola reacción de una vía metabólica o el desempeño total de la misma vía. Además, dentro de la población de proteínas se deben considerar aquellas proteínas anormales, 2

+--

C O -- N H2

+

1 2HN ----

1 --- S --- S ---

4

+

son N H 3

1 H S ---

1

---

OH

COO

Reducción

3 Fosforilación 4 Glicosilación

2

O --- O -- P -- O ----

3 +

+

O

2 Deaminación

NAT I VA

+

O OH OH

2

--- S H

CH 2 O H

4 C O -- N H 2

+

--COO

HO ----

3

+

2

O

---

DENAT URADA

_ son C O O

Fig. 47 - 4. Las proteínas sufren cambios químicos para los cuales no fueron diseñadas alterando su conformación activa.

tanto por su origen, como aquellas que han sido modificadas por mutaciones o que han adquirido una modificación química a lo largo de su vida media. Más aún, es bien conocido que dentro de una población de proteínas de un mismo tipo, deben existir algunas recién sintetizadas y otras envejecidas. Esto último significa que las proteínas sufren a lo largo de su vida útil distintas modificaciones que afectan su estructura y las aleja paulatinamente de su actividad biológica normal. A continuación podremos observar algunas de las condiciones intracelulares que dañan a las proteínas:

1) Temperaturas por sobre los 37ºC que faciliten la agitación térmica 2) Presencia de enzimas que modifican a otras proteínas como son las Proteasas y Quinasas 3) Formación de pequeñas moléculas reactivas que provocan Metilación, Deaminacíon, Adenilación, Aminación, Fosforilación, Reducción de Puentes disulfuro, Glicación o Glicosilación (unión del grupo aldehído de la Glucosa al grupo Amino terminal de las proteínas) entre otras (Fig. 47 - 4), Nitrosilación, etc. 4) Concentraciones elevadas de sal que generan un ambiente hostil para las enzimas induciendo su disociación en algunos casos. 5) Liberación de ácidos grasos desde las bicapas de la membrana, que pueden actuar como detergentes facilitando la apertura del centro hidrofóbico de las proteínas

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

solubles en agua y a la vez facilitando la salida de las proteínas integrales de membrana. 6) Presencia de proteínas parcialmente plegadas o subproductos de la hidrólisis, como polipéptidos de distintos tamaños y aún polipéptidos nacientes o mutados que pueden arrastrar a las proteínas normales a formar agregados insolubles. En general el medio interno celular no es lo suficiente apto para que una proteína sobreviva por un largo tiempo sin la presencia de algunas moléculas protectoras. Es sabido que las proteínas sufren más de 100 modificaciones mayores y menores después que han sido sintetizadas. Estas modificaciones afectan a proteínas en su actividad, estabilidad y especificidad de interacción, lo que altera a los procesos críticos de la célula como son: síntesis y degradación de DNA y proteínas, traducción de señales, organización del citoesqueleto y componentes de la matriz extracelular, eliminación de desechos y otros más. En la actualidad se logrado determinar que existe correlación entre envejecimiento y acumulación de proteínas anómalas, especialmente aquellas que han sufrido estrés oxidativo, consistente en oxidación y fragmentación, mientras que otras sufren modificaciones del tipo físico como lo es el estrés estructural. Ambos factores hacen notar que dichas proteínas no se encontraban evolutivamente diseñadas a su máxima capacidad. Cualquier efecto capaz de inhibir los procesos anteriores extiende la vida de los sujetos de experimentación y viceversa. Además muchas de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la edad (Alzheimer), se caracterizan por presentar acumulación de proteínas parcialmente oxidadas. Detrás de estos mecanismos, existe un delicado balance entre la síntesis de proteínas y su degradación que se rompe con la edad. Por lo tanto, la extensión de este daño dependerá de los factores que alteren el balance, como son la presencia de compuestos pro-oxidantes, antioxidantes, la reparación, el reemplazo y la eliminación de las proteínas dañadas. En cuanto a la senescencia celular podemos decir que tanto la velocidad de síntesis como la degradación se ven afectadas por tales efectos. Así tenemos que durante la síntesis, el Factor de Elongación 2 (EF-2), es susceptible de ser oxidado y sufrir fragmentación produciendo una declinación en la aparición de nuevas proteínas. De lo anterior se deduce que con la edad o senescencia celular, puede existir una disminución progresiva del reemplazo de proteínas envejecidas por otras nuevas y que a causa de ello se produzca un aumento en la concentración de proteínas dañadas debido a la falta de nuevas moléculas de enzimas proteolíticas responsables de los mecanismos de degradación. Durante la vida normal, antes de la senescencia celular el organismo emplea distintas vías para eliminar la carga de las proteínas envejecidas y reciclar sus aminoácidos. Estos mecanismos se dividen en (Fig. 49-4): a) Sistema Ubiquitina-Proteosoma b) Sistema de las Calpaínas reguladas por Calcio c) Degradación Lisosomal

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

VELOCIDAD DE RECAMBIO

SISTEMA UBIQUITINA/ PROTEOSOMA SISTEMA CALPAÍNA/ CALPAESTATINA ACTIVADO POR ++ Ca

vida media de las proteínas

VIAS LISOSOMICAS MULTIPLES Fig.49 – 4. La vida media o velocidad de recambio de una proteína depende de la velocidad de síntesis y degradación de esta.

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a) SISTEMA UBIQUITINA-PROTEOSOMA

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Esta Vía se encuentra mediada por unos pequeños polipéptidos denominados Ubiquitinas

POLIRIBOSOMA DNA

ATP

PROTEÍNA NATIVA

RNA

COMPLEJO + PROTEÍNAUBIQUITINA

PP E3 HSP 40 HSP 70 HSP 40

UBIQUITINA

HSP 70

E2-UBIQUITINA

PERDIDA DE LA CONFORMACIÓN NATIVA

E1 + A T P + UBIQUITINA

26 S-PROTEOSOMA

HIDRÓLISIS Fig. 50 - 4. Las UBIQUITINAS se asocian a las proteínas para que estas últimas sean hidrolizadas por los complejos de proteasas o proteosomas 26S existente en el citoplasma. E1 : Enzima activadora de la Ubiquitina E2 : Enzima transportadora de la Ubiquitina E3: Enzima necesaria para la unión de la Ubiquitina a las proteínas blanco

(Fig. 50 - 4). Estos polipéptidos son de bajo peso molecular y cuentan con solo 76 aminoácidos. Su activación ocurre por medio de la enzima E1-SH pasando a formar un tiolester en su carboxilo terminal. A continuación son transportados por medio de una unión similar por la enzima E2-SH para interactuar con la proteína blanco, la cual ha sido previamente activada por la enzima E3. La Ubiquitina se une a la proteína blanco y la marca para ser hidrolizada por un Complejo de Proteasas o Proteosoma 26S (Fig. 50 - 4), existente en el citoplasma. Se ha demostrado que con la edad no varía la capacidad hidrolítica del Proteosoma, pero sí la Ubiquitinización o marcación por lo cual se reduce la capacidad para degradar proteínas.

Volver al inicio ++ b) SISTEMA DE LAS CALPAÍNAS Y CALPAESTATINAS REGULADO POR Ca

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

El sistema formado por las Calpaínas y Calpaestatinas su inhibidor fisiológico, consiste en la regulación de una proteasa citosólica con un grupo tiol, dependiente de la presencia de Calcio (Fig. 51-4). La Calpaína activada como proteasa, degrada especialmente proteínas de membrana como lo son algunas enzimas y parte estructural del citoesqueleto. Se cree que se encuentran involucradas en la degeneración neuronal y la proteólisis anormal que se observa en la enfermedad de Alzheimer (Ver más adelante) Algunos de los cambios que se producen con la senescencia de las células, se atribuyen a las proteínas de las membranas que se hacen más susceptibles al ataque por proteasas. Estas atraen a una mayor cantidad de Calpaínas, mientras que la actividad protésica de la Calpaína permanece incólume.

PROTEÍNA DE MEMBRANA

Ca

CALPASTATINA

++

CALPASTATINA

Ca

++

Ca FACTOR DE ACTIVACION

CALPAÍNA

++

CALPAÍNA Ca

++

Fig. 51- 4. Sistema de proteasas regulado por Calcio que degrada proteínas de membrana

Volver al inicio c) FUNCIÓN DE LOS LISOSOMAS EN CÉLULAS SENESCENTES. Los Lisosomas son organelos que cuentan con un poderoso arsenal de proteasas, peptidasas e hidrolasas capaces de degradar macromoléculas intra y extracelulares. Son responsables del recambio basal de las proteínas de vida media larga. Su actividad se ve retardada con la edad y como consecuencia aumentan en número y tamaño, sin embargo su función disminuye y se observa ante ello una serie de cuerpos o agregados de almacenamiento o depósitos insolubles. Los diferentes mecanismos por los cuales las proteínas son transportadas al interior de los Lisosomas constituyen (Fig. 52 – 4): fusión de vesículas por endocitosis cuando se invagina la membrana plasmática y forma una vesícula que posteriormente se funde con un lisosoma y la crinofagia que es cuando se funde un lisosoma con una vesícula proveniente del Aparato de Golgi.

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Otros tipos de procesos son la Macroautofagia y Microautofagia, donde regiones de distinto tamaño del citoplasma son envueltos por una doble membrana que posteriormente se funde con un Lisosoma y se degrada. Esta actividad disminuye con la senescencia de la célula.

Lisosoma

Endocitosis

transporte mediado por hsc 73, chaperona citosólica

Endosoma

Crinofagia

Microautofagia

Macroautofagia

Aparato de Golgi

Fig. 52 - 4. Distintos mecanismos Lisosomales de degradación de proteínas intra y extracelulares.

Un mecanismo adicional consiste en el transporte directo de ciertas proteínas hacia la membrana del Lisosoma para ser vertidas en su interior y posteriormente degradadas (Fig. 20 – 4). Una proteína que se debe degradar posee una cierta secuencia de consenso que es reconocida por una Chaperona Citosólica hsc-73 de 73 k Da. Esta unión dirige el complejo a la membrana donde la glicoproteína de membrana, que actúa como receptora y denominada lgp 96 por tener 96 k, forma un complejo Prot. sustrato- hsc 73 - Igp96. Posteriormente la proteína sustrato es traslocada al interior del Lisosoma mediante la unión de la Chaperona intralisosomal Lys-hsc73 y la salida del complejo de la Chaperona citoplasmática hsc73. En el interior la proteína sustrato es posteriormente degradada.

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14) ENCAFALOPATIAS ESPONGIFORMES En la actualidad se ha observado que algunas de las Encefalopatías (Fig. 53 – 4), más comunes han sido provocadas por los Priones (PrP por “prion protein” o “proteinaceous

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infectious particle”), conocidos como agentes infecciosos de naturaleza proteica. Estas partículas no están constituidas por ácidos nucleicos y a la vez no presentan ninguna envoltura como aquellas presentes en las partículas virales. Las encefalopatías son enfermedades neurodegenerativas transmisibles y heredadas, que parecen tener su origen a partir del “scrapie” o enfermedad neurodegenerativa de las ovejas. Esta última se ha transmitido a las vacas por contaminación de los nutrientes y se le ha llamado “enfermedad de la vaca loca”, que no es más que una encefalopatía del tipo espongiforme. Este último término se debe a que el cerebro adquiere forma de esponja, dejando ciertos vacíos debido al ataque de los Lisosomas sobre los depósitos de agregados proteicos.

PrPc Ct

Nt

Región globular con α-Hèlice

La región con ovillo al azar hacia el extremo Nt, se pliega para incrementar la estructura β-plegada

Encefalopatías Espongiformes: cerebro post mortem con grandes vacuolas en el cortex y cerebelo. Humanos: CJD : enfermedad de Creutzfeld-Jacob GSS : síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker FFI : Insomnio Familiar Fatal Kuru : parece CJD en Nueva Guinea Síndrome de Alpers: niños Animales: Scrapie : en Ovejas TME : Encefalopatía del Mink CWD : “Cronic wasting disease” o enfermedad crónica debilitante BSE : “Bovine Spongiform Encephlopaty” en vacas

Fig. 53- 4. Región Globular y de ovillo al azar de la proteína responsable de las encefalopatías espongiformes.

Esta enfermedad se puede transmitir a los humanos por ingestión de vísceras y tejido nervioso de bovino, pasando ahora a llamarse enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. Otros de sus nombres en humanos es el “Kuru”, que se producía en la isla de Papúa, Nueva Guinea. El Kuru se produjo debido a la ingestión de cerebros humanos a consecuencias de la lucha entre tribus rivales. Esta enfermedad no afectaba a mujeres y niños que se alimentaban solo del tejido muscular de las victimas.

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

En la actualidad después de acuciosos estudios se ha logrado determinar que el agente infeccioso es una proteína (PrPc) la cual posee normalmente una isoforma que tiene 42% de α - Hélice y casi ninguna estructura β -plegada (Figs. 53, 54 - 4). Esta proteína es capaz de transformarse por algún medio, en una proteína anormal (PrPsc), con una isoforma de 30% de α - Hélice y 43% de β - plegada. Tanto en el cerebro de rata con Alzheimer o con la variedad que aparece en la oveja denominada “scrapie”, así como en humanos con encefalopatía Creutzfeldt–Jacob, se han encontrado anomalías asociadas a la internalización de estas proteínas. Esto ocurre por medio de vesículas que forman endosomas y que a la vez se encuentran asociadas a la proteína chaperona hsp70. Estas vesículas tienen algún receptor que las hace capaces de reaccionar inmunológicamente con la enzima β-Glucoronidasa de los lisosomas y también con los agregados de proteína marcada para su destrucción con Ubiquitina.

ENFERMEDAD DE KREUTZFELD -JACOB EN HUMANOS

"KURU" EN HUMANOS

"SCRAPIE" EN OVEJA

ENCEFALOPATÍA ESPONJIFORME EN

Fig. 47- 4. Preparaciones de tejido nervioso donde se aprecia claramente la formación de huecos o tejido esponjoso.

Aquellas proteínas del citoplasma que tienen la secuencia aminoacídica KFERQ (Lys-PheGlu-Arg-Gln) y que se unen a la hcs 73 (proteínas parientes de hsp 70), son internalisadas al sistema endosoma-lisosoma, pero la proteína infecciosa PrPsc no tiene esta secuencia y permanecerá en la superficie del sistema endosoma–lisosoma, donde la hsp constitutiva hcs73, puede favorecer su plegamiento erróneo con el paso de PRPc a PrPsc. De esta

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

manera, parece ser que el cambio se produce durante el proceso de internalización de las PrPc. Por otro lado se ha observado que la estabilidad de las secuencias en la PrP, desde el aminoácido 96 al 167 y 215 al 230 son esenciales para la unión a una proteína X que propiciaría el cambio a PrPsc. En general los endosomas – lisosomas, muchas veces se repletan de Priones anormales o PrPsc haciendo colapsar la membrana del lisosoma y provocando a la vez con sus enzimas digestivas la destrucción de las neuronas y células gliales, dejando huecos que dan el aspecto de espongiforme. PrP con estructura αhélice

PrPc con estructura αhélice más β- plegada

Fig. 54 - 4. Diferencias en las conformaciones de la PrP y PrPc

Ciertas enfermedades se caracterizan por extensos depósitos de proteína en tejidos determinados, especialmente en el tejido nervioso donde se observan enredos de neurofilamentos y a la vez láminas neuríticas, especialmente en el cerebro de pacientes con Alzheimer. Estos agregados se encuentran formados por tan solo una proteína determinada. En la búsqueda de una explicación a este problema se ha notado que no todas las proteínas nacientes se pliegan por su cuenta y que en algunos casos requieren de la ayuda de otras proteínas denominadas chaperonas, más aún antes de alcanzar su conformación nativa las proteínas nacientes pasan por una serie de estados intermedios de plegamiento que pueden ser afectados por la temperatura y que a consecuencias de ello se dirijan al plegamiento equivocado con la formación de agregados entre unidades de la misma proteína. Una mutación haría más estable el plegamiento parcial de la proteína seleccionando la conformación con la que se genera el agregado. De similar manera cuando una proteína sé denatura, lo hace parcialmente a través de sucesivas etapas hasta alcanzar el estado de totalmente denaturada, sin embargo uno de

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

sus estados intermediarios es capaz de interaccionar con otra de sus copias en similar proceso y formar a la vez los agregados insolubles (Fig. 54 - 4). En la Tabla 5-4 se observan algunas enfermedades producidas por proteínas mal plegadas, ya sea por mutaciones u otras causas que afectan el plegamiento.

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15)

ENFERMEDADES

CAUSADAS

POR

PROTEÍNAS

MAL

PLEGADAS

TABLA 5 - 4 ENFERMEDAD FIBROSIS CÍSTICA

PROTEINA AFECTADA Proteína transmembrana que actúa de canal iónico

SÍNDROME DE MARFAN DIABETES INSÍPIDA NEFROGÉNICA

Fibrilina Receptor de Vasopresina o Canal de agua aquaporina

ENF. CREUTZFELDJACOB ENF. DE ALZHEIMER

Proteína infecciosa o Prion

ENF. DE PARKINSON

Proteína Tau

ENF. De HUNTINGTON

Proteína anormal con largos trechos de Poliglutamina

Proteína β-Amiloide

DEFECTO MOLECULAR Proteína mal plegada POR ERROR GENÉTICO, que es retenida en el RER para ser degradada Proteína mal plegada Proteína mal plegada es retenida en el RER para ser degradada Forma agregados insolubles intra y extraneuronales Forma agregados fibrilares o placa amiloide entre las neuronas Agregación de proteínas en citoplasma neuronal dopaminérgico Núcleos neuronales y citoplasma

Algunos de los cambios que sufren las proteínas las hacen aún más susceptibles a la degradación, sin embargo esto no es una regla general y puede ocurrir todo lo contrario, es decir las proteínas se hacen más resistentes a la degradación por aquellas enzimas proteolíticas encargadas de degradarlas, como ocurre con la enfermedad de Alzheimer (Ver más adelante). La enfermedad de Alzheimer o demencia senil es un desorden neurodegenarativo que destruye paulatinamente la capacidad de la persona para razonar, recordar e imaginar. Esta enfermedad afecta aproximadamente a una persona de cada diez sobre la edad de 65 años y toma entre 3 y 18 años en desarrollarse totalmente. Molecularmente se caracteriza por la presencia en el cerebro, de las llamadas placas o láminas seniles (placas amiloideas) en el espacio intercelular junto a enredos o agregados de fragmentos neurofibrilares de una cierta proteína Tau (τ.), que transporta vesículas al interior de las neuronas y es parte del citoesqueleto. La proteína responsable de formar estos agregados es un péptido de 4kD denominado β Amiloide (β-A4) por su estructura β-plegada y tiene este nombre por su semblanza a la

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reacción del Almidón con el Yodo (Amiloide), que produce un material homogéneo y esponjoso de color rosado que se dispone a manchones. N O RM AL

ALZHEIMER AG REG ADO S NEURO FIBRILARES

NEURO NAS

PLACAS AMILO IDEAS

Fig. 54 - 4. Neuronas normales comparadas a aquellas que sufren la enfermedad de Alzheimer, caracterizada por depósitos de proteínas amiloideas y agregados neurofibrilares causados por la fosforilación errónea de la proteína Tau.

En este caso el material se encuentra formado por una glicoproteína que se deposita extracelularmente y se tiñe con rojo Congo, (Fig. 54-4). El material amiloide en general, es común a los mielomas múltiples, donde se encuentran acumulaciones de las cadenas livianas de los anticuerpos provenientes de clonos de células plasmáticas cancerígenas. En los depósitos de proteína Amiloide formando las placas seniles en cerebros de pacientes con Alzheimer y teñidos con rojo Congo, se encuentran dos péptidos similares, uno de 40 aminoácidos (βA40) y otro de 42 aminoácidos (βA42), siendo de mayor carácter amiloidogénico la forma βA42 que sirve como centro de nucleación para los sucesivos agregados que se forman. Por otro lado, la proteína de la cual provienen estos péptidos, se deriva de una proteína de membrana denominada Proteína Precursora Amiloide (APP), cuya función es mediar tanto la adhesión celular como la acción de receptor o blanco, para aquellos factores que estimulan el crecimiento de las neuritas. APP (Fig. 55 – 4), es una glicoproteína transmembrana que tiene varias isoformas con 695, 751 y 770 aminoácidos, además posee varios azúcares unidos al Nitrógeno y al Carbono con un peso molecular que varía entre 110 y 130 kD. Su dominio extracelular es de gran tamaño y tiene en su lado Nt una región de 200 aminoácidos rica en Cisteína, seguida por otra región rica en residuos de aminoácidos ácidos (Glu y Asp). Esta última región es a su vez seguida en dirección al extremo Ct, por una secuencia inhibidora de una proteasa en especial denominada proteasa de Kunitz ( proteasa con aminoácido Asp en el sitio activo) y/o un dominio con homología a la proteína OX-2 (Glicoproteína de membrana que parece inhibir el estado de inflamación en el cerebro).

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

La proteína β–A4-Amiloide, es la secuencia del dominio que esta justo por encima de la membrana y que a la vez se encuentra parcialmente embebida en esta en dirección al extremo Ct.

PROTEÍNA APP βA4

Zona rica en Cisteínas Región Acídica Ci í

Región inhibidora de Proteasas tipo Kunitz Región similar a proteína Ox2

BICAPA

Secuencia Amiloidea

Fig. 55 - 4. Diferentes regiones de la proteína precursora amiloide con el fragmento βA4. Proteasa Kunitz, es una dependiente de Ser en su sitio activo.

La síntesis de la PPA se lleva a cabo en el Retículo Endoplásmico Rugoso (RER) y luego es transportada al Aparato de Golgi (AG). En este lugar se cree que la proteína chaperona denominada Presenilina (proteína que atraviesa la membrana y que tiene 7 dominios transmembrana localizada dentro del RE y el AG) une la PPA a los microtúbulos lo cual ayuda al tráfico de la PPA hacia la membrana celular. Se ha logrado determinar que las mutaciones en las variantes de Presenilinas PS1 y PS2, junto a aquellas mutaciones en la APP, son capaces de influenciar por que vía se produce la degradación de esta proteína, encausándola en dirección a la formación de péptidos amiloideos que dan origen a la placa senil. Una vez en la superficie de la célula el PPA, después de cumplir con su vida media, es internalizada y reciclada produciéndose varios cortes en ella mediante unas proteasas que se denominan como Secretasas y que son responsables de la formación de los péptidos amiloideos βA4. La forma como ocurren estos cortes pueden ser siguiendo dos tipos de vías de procesamiento, (Fig. 56-4). Una de ellas es la No Amiloidogénica y consiste en cortes sucesivos por la α- Secretasa (Zn–metaloproteinasa) ubicada cerca de la membrana citoplasmática, seguida de la γSecretasa (podrían ser las Presenilinas) dando origen a un fragmento PPAα soluble y un fragmento de pequeño tamaño p3, también soluble y que no genera agregados moleculares. Sin embargo, los cortes pueden seguir otra vía del tipo Amiloidogénica, donde cortes sucesivos por la β-Secretasa (Aspartil proteasa) seguida de la γ-Secretasa (enzima influenciada por las mutaciones en PS1 y PS2) generan un gran fragmento PPAβ soluble y uno pequeño insoluble o βA4 (Aβ) constituido de βA40 y/o βA42. Este último actúa agrupándose entre sí y precipita con sus similares para formar la placa amiloidea. A esta proteína también se le llama Aβ y constituyen una familia de polipéptidos que van desde 39 a 43 aminoácidos.

139

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Procesamiento de la Proteína Precursora Amiloide (PPA) β-A4

PPA α-secretasa 90%

β-secretasa 10%

β-A4

P3 PPAs

γ-

PPAs

Γ-secretasa 10%

t β-A4 o Aβ

P3

3 fragmentos en Vía Amiloidogénica

2 fragmentos en Vía No Amiloidogénica

Fig. 56 – 4. Dos vías para el procesamiento de la PPA. La de la β y γ Secretasa que producen el fragmento βA4 y la vía de la α y γ- Secretasas que produce el fragmento Aβ.

Uno de los factores que influencian la aparición temprana (40 años) de esta enfermedad son los niveles de la proteína Apo E4 y HLA-A2 soluble. Las mutaciones en el gen de la PPA se han relacionado a un pequeño número de casos de Alzheimer, sin embargo mutaciones del gen de las APP en conjunto con el de las Senilinas resultan en una mayor producción de fragmento βA42 y formación de placa. Por otro lado la formación de agregados neurofibrilares que ocurre dentro de las neuronas parece ser gatillada por fosforilaciones anormales de la proteína Tau, la cual se presenta con tres variables patológica llamadas Tau 55, Tau 64 y Tau 69 de acuerdo a los kD de sus pesos moleculares. La fosforilación anormal provoca la depolimerización de los microtúbulos, la degeneración neurofibrilar y la muerte neuronal. Otra hipótesis sobre esta enfermedad reconoce a la Proteína Precursora de Alzheimer (PPA) como parte de un receptor NOTCH, constituido por una proteína transmembrana de mayor tamaño que es requerida como regulatoria del desarrollo celular (Fig. 57-4). Esta es una proteína receptora de la superficie de la célula, que transmite señales desde el exterior al interior. Este receptor es sintetizado en el Retículo Endoplásmico Rugoso y viaja en una vesícula que se ubica en la membrana citoplasmática. Luego, cuando esta entra en contacto con otra célula vecina, la fracción de la proteína receptora que atraviesa la membrana sufre un corte y el fragmento viaja en otra vesícula al núcleo de la célula para desencadenar una respuesta. Ahora, como se corta el péptido señal y porqué proteasas se lleva a cabo es aún un misterio que parece tener algo en común con las enzimas del tipo Secretasas y sus distintas vías, tales como la Amiloidogénica y no Amiloidogénica.

140

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

α-SECRETASA VIA TIPO 1

VESICULAS

MEMB. CELULAR

NUCLEO

RETICULO ENDOPLASMICO Y LOCALIZACIÓN DE LAS PRESENILINAS

Receptor NOTCH

PROTEÍNA PRECURSORA SOLUBLE

APARATO DE GOLGI

β-SECRETASA

ENDOSOMAS

γ-SECRETASA PLACA AMILOIDE Fig.- 57 – 4. Síntesis, transporte y procesamiento del receptor NOTCH que produce la PPA y subsecuente formación del polipéptido Aβ que se agrega en la placa amiloide

Los resultados obtenidos por inmunización contra el fragmento Aβ y los fármacos que inhiben las vías Amiloidogénicas a nivel de las Secretasas, han tenido a nivel humano un cauto resultado debido a algunas complicaciones terapéuticas.

Volver al inicio 16) CONCLUSIONES GENERALES SOBRE EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS BASADO EN LAS ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES. 1) Las proteínas alcanzan rápidamente su conformación nativa a expensas de adquirir otras conformaciones anómalas. 2) Una de las conformaciones anómalas es también patológica y se conoce como la placa Amiloide 3) La placa Amiloide se encuentra constituida por agregados estructurales de la forma β-plegada 4) La placa amiloide contiene fibras proteicas que se adhieren entre sí

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Agregado desordenado

Agregado desordenado

Ensamble anormal de Oligómeros como ocurre en Anemia Falsiforme y Cataratas

Fibra

Síntesis del polipéptido

Forma intermedia Cadena desplegada con secuencia pro fibra amiloide en su centro

Forma nativa por ensamblaje biológico

Especies Prefibrilares con centros de nucleación Agregado desordenado

Fragmentos degradados. La proteína no aparecerá en su sitio de acción (Marfan, Fibrosis cística)

Cristal de estructura ordenada

Fibrilla o Placa Amiloide formado por una serie de hojas beta que se disponen perpendiculares al eje del filamento.

Fig. 54 – 4. La sección que da origen a la fibra Amiloide se encuentra en la proteína globular al centro de ella y no en el exterior, por lo tanto durante un plegamiento anómalo puede que se muestre a otra de sus similares en otra molécula arrastrando al conjunto a asociarse unas con otras para formar pequeños agregados o centro de nucleación insolubles que se ensamblan en especies prefibrilares que posteriormente darán origen a fibras maduras o fibrilla amiloide insoluble

5) Al observar las estructuras de la placa amiloide se determinó que eran las responsables de las Encefalopatías espongiformes. 6) Aquellas proteínas que no se pliegan de la manera correcta no aparecen en su lugar de acción (son degradadas) y son capaces de provocar otras enfermedades 7) Entre estas últimas tenemos a la Fibrosis Cística (falta el regulador de la conductancia intermembrana o canal de cloro y el Síndrome de Marfan, donde falta la Fibrilina lo que deja a la Elastina sin un lugar de anclaje. Volver al inicio

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

17) PROTEOMICA. Una de las últimas iniciativas dentro del estudio de las proteínas lo constituye la Proteómica. Se pretende bajo esta palabra explicar el porqué los cerca de 30.000 genes que se expresan en un ser humano cuentan una contrapartida de cerca de 1.000.000 de proteínas. El estudio de las siguientes etapas puede arrojar alguna luz sobre el tema: a) Registrar todas las secuencias humanas conocidas hasta ahora b) Registrar todas las proteínas similares a las humanas, pero encontradas en animales, principalmente en animales de laboratorio como el ratón y la rata. c) Conocer todos los polimorfismos posibles de las proteínas humanas a nivel de sus secuencias como son aquellos polimorfismos de un solo nucleótido y los polimorfismos de un solo aminoácido que aparecen en las proteínas. d) Lo que es más importante en una proteína es saber todos los cambios post- traducción que sufren, tales como eliminación de secuencias señales, la presencia de secuencias de transito que indican a la proteína a que organelo dirigirse o la existencia de prosecuencias que condicionan su eliminación a la actividad de la proteína. Saber en que condiciones se elimina la Metionina del lado Amino terminal de una proteína y aquellas modificaciones químicas, que sufren como son las metilaciones, adenilaciones, fosforilaciones, etc. Al mismo tiempo se debe conocer como se adicionan otras moléculas complejas constituidas por Hidratos de Carbono o Lípidos para formar Glicoproteínas o Lipoproteínas. Por otro lado, será también necesario aprender las modificaciones que resultan mediante la aparición de enlaces cruzados entre subunidades de proteína como son los puentes disulfuro, condensaciones aldólicas, bases de Shiff, etc. En general se conocen cerca de 100 modificaciones post-traducción que pueden sufrir las proteínas y cada día aparecen unas cuantas más. Todo esto se complica aún más al considerar aquellos cambios post-transcripcionales que ocurren en los transcritos primarios del RNA de gran peso molecular. Este se corta y empalma de formas distintas combinando exones de distintas características. Así como la Genómica buscaba estudiar la naturaleza de todos los genes se creo esta nueva ciencia con el fin de justificar la diferencia entre el número total de proteínas y los genes correspondientes, así como la función de todas las proteínas encontradas y por encontrar. Un organismo puede tener una composición de genes constante, sin embargo genera distintas proteínas según su desarrollo o etapas de diferenciación, por lo tanto la Proteómica es bastante más dinámica que la genómica. En general durante el ciclo de vida de un organismo existen muchas proteínas que aparecen y desaparecen y deben ser estudiadas durante estas etapas para poder pesquisarlas. en la forma adecuada.

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143

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

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Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

Módulos móviles en la evolución de las proteínas R. F. Doolittle and P. Bork., Investigación y Ciencia, Diciembre, 22 - 29, 1993. Hemoglobinas vegetales M. Becana., Investigación y Ciencia, Febrero 1995, 16-23. The Dynamics of Proteins. M. Karplus, y J.M. McCammon. , Sci. Amer. 254, 42-51, Molecular Chaperons R.J. Ellis and Van der Vies., Ann. Rew. Biochem., Vol 60, 321-347, 1991 The Ubiquitin System for Protein Degradation., A. Hershko and A. Crechanova., Ann. Rew. Biochem., 761-807,1992 Molecular chaperons in cellular protein folding., F. Ulrich Harti, Nature, Vol 381, 571-580, 1996 Nature Insight: Protein misfolding 884-905 Nature 18/25 December 2003

145

Héctor Rocha L. Las Proteínas y su Estructura

146

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

ENZIMAS 1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS 137 2)CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO 139 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES 144 4) MECANISMOS PARA DISMINUIR LA BARRERA DE ENERGIA 145 5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 147 6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION 154 7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS 156 a) Efecto del pH 156 b) Efecto de la Temperatura 158 8) MECANISMOS ENZIMATICOS 159 9) CINETICA ENZIMATICA 161 10) INHIBICION COMPETITIVA 166 11) INHIBICION NO COMPETITIVA 169 12) INHIBICION ACOMPETITIVA 171 13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO 175 14) ENZIMAS ALOSTERICAS 178 15) COMPORTAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA 179 16) EXPRESION DE HILL 181 17) MODULACION DE ENZIMAS ALOSTERICAS 185 18) PURIFICACION DE ENZIMAS 186

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de las reacciones químicas pertenecientes al metabolismo intermediario. Para ello cuentan con una o varias estructuras del tipo terciario, que mantienen el despliegue de uno o más sitios activos. El sustrato a su vez, debe aproximarse a la enzima en una posición espacial complementaria al sitio activo, para que mediante el contacto con este en al menos tres puntos sea reconocida su isomería. Posteriormente, una vez aceptado el sustrato este es modificado químicamente por los residuos catalíticos del sitio activo y transformado en producto. Este último abandona el sitio activo. Entre las enzimas, en su mayoría de naturaleza proteica se encuentran algunas excepciones como aquellas denominadas por el nombre de Ribozimas. Estas son moléculas de RNA, conocido heteropolímero lineal que actúa generalmente como portador de información. A pesar de ello se le ha encontrado una nueva facultad, al ser posible su plegamiento en una estructura tridimensional, capaz de catalizar la unión o polimerización de varios otros nucleótidos. El mecanismo de las reacciones enzimáticas se puede explicar en parte, al compararlo con aquél que ocurre en las reacciones químicas más simples. En ellas la velocidad de reacción puede ser aumentada con la temperatura. Esta última, incrementa el movimiento, la vibración o la energía cinética de las moléculas de sustrato. Se aumenta el número de choques entre ellas y en este estado, son capaces de superar la barrera de energía produciendo las interacciones necesarias consistentes en formar nuevos enlaces o romper los antiguos para formar producto (Fig. 1a - 4). A diferencia de la temperatura, un catalizador biológico no aumenta la excitación de las moléculas de sustrato, sino que se limita a reducir la barrera de energía. De esta forma a una misma temperatura, una fracción mayor de moléculas de sustrato logra pasar por el estado de transición y se transforma en producto (Fig. 1b - 4). El incremento de la energía cinética inducido por la temperatura provocaría en este caso, tanto la agitación del sustrato como de la enzima, dificultando la interacción entre ambos. Se haría más difícil la formación de un complejo enzima-sustrato entre ambos, aunque a una determinada temperatura denominada temperatura óptima, se favorezca cinéticamente la conformación de la enzima para lograr el encuentro con el sustrato. Al analizar lo que ocurre en el estado de transición, se puede decir que este dependerá de la concentración del intermediario de transición X* (Fig. 1b - 4). Este será capaz de pasar por la barrera de energía. Este compuesto es el más inestable de todos entre sustratos y productos. La diferencia de energía entre el sustrato S y este intermediario inestable X*, formado en el complejo enzima-sustrato, constituye la energía del estado de transición. Mientras más alta la barrera de energía para el estado de transición más lenta será la reacción. Para entender este planteamiento, se puede hacer una aproximación considerando que la reacción entre sustrato S e intermediario X* es inestable o reversible. La constante de equilibrio de esta reacción, debe estar dada por la ecuación: K*= X* / S y al proceder a despejar X* tendremos que X* = K* S. Por otro lado, debemos asumir que la formación del producto P dependerá de la velocidad con que se descompone el intermediario inestable X* o v = k X* y desde aquí sustituyendo en X* tenemos que finalmente v = k K* S (1). Por otro lado, al aplicar la antigua relación termodinámica entre ΔG* y la K* de equilibrio de esta reacción parcial, tenemos que: ΔG* es igual a - RT Ln K*. Lo que al reordenar con el exponente del logaritmo de base e y sustituir en la ecuación (1), nos entrega la siguiente ecuación de velocidad de reacción:

137

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

v = k (e

- ΔG* / RT

)S

De esta ecuación se deduce que las enzimas, aumentan la velocidad de una reacción si disminuyen ΔG*. Además, si la reacción no se dirige nuevamente hacia el sustrato y se estabiliza en el complejo, la energía del estado de transición disminuye. Por ello, la energía eliminada al unirse el sustrato a la enzima se puede emplear para aumentar la velocidad de reacción. Esta aproximación energética permite explicar que el aumento de la velocidad de reacción no se relaciona con el otro componente, denominado ΔGº´(reacción). = ΔGº´(sustratos) ΔGº´(productos) = - RT Ln Keq(reacción) (Fig. 1b – 4). Este depende de la reacción misma, es decir de la energía entre sustratos y productos por separado y no unidos a la enzima. a ) Sin Enzima

b ) Reacción con enzima

BARRERA DE ENERGIA

Nº

Energía ΔG* del estado de transición

X*:intermedia rio inestable

T1

T2

DE M O L E C U L A S

Reacción no catalizada

E N E R G I A

T2 > T1 temperatura

X*

ΔG* S

Reacción catalizada

Gº´(S) : Energía del Sustrato S

BAJA

P

COORDENADA DE REACCIÓN

ALTA

ENERGIA ENERGIA

Gº´(P) : Energia del Producto P

ENERGIA

Los niveles de energía del sustrato Gº´(S) y del producto Gº´(P) se mantienen igual con o sin enzima

Fracción de moléculas que pueden reaccionar a mayor temperatura

ΔGº´ reacción = Gº´(S) - Gº´(P) ΔGº´ reacción = - RT Ln Keq reacción exergónica

Fig. 1a - 4. Aumento de la velocidad de reacción por la Temperatura. Fig. 1b - 4. Aumento de la velocidad de reacción por disminución de la barrera de energía a temperatura constante .

Se observa un poco de confusión cuando se emplea la misma ecuación ΔGº´= RTLn Keq para explicar tanto la barrera de energía como la naturaleza de la reacción misma. Esta puede ser exergónica o endergónica, basándose en la energía que poseen sustratos y productos. En general, las Enzimas no hacen posible las reacciones químicas. Tampoco convierten reacciones que toman energía en otras que liberan energía. Las enzimas no cambian los niveles energéticos de las moléculas de sustrato o producto. Las Enzimas solo se limitan a bajar la barrera de energía para aumentar la velocidad de reacción en uno u otro sentido, que ha sido determinado previamente por la energía que poseen sustratos y productos. En síntesis, las enzimas

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

no cambian la constante de equilibrio de una reacción química. Esta llega al equilibrio en un año sin la enzima o en un milisegundo con la enzima, pero siempre alcanzan la misma proporción entre sustratos y productos. Volver

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inicio 2)

CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO.

Algunos de las expresiones anteriores se detallan a continuación al caracterizar algunas de las reacciones enzimáticas pertenecientes al metabolismo intermediario: a) LA ENZIMA NO CAMBIA LA Keq DE UNA REACCION: Una reacción química no enzimática puede proceder hasta alcanzar el equilibrio sea este > 1, igual a 1 o < de 1. Esto no significa, que el equilibrio es necesariamente 50 % de Producto (P) y 50% de Sustrato (S), sino que puede ser 10% (S) / 90% (P), 30% (S) / 70% (P) u 80% (S) / 20% (P), etc. Es decir, cualquiera proporción final entre sustrato S y producto P, después que estos han tomado o liberado energía del medio. La constante de equilibrio de una reacción no se altera por la presencia de un catalizador. La reacción en presencia de la enzima debe alcanzar el mismo equilibrio, pero en mucho menos tiempo. Por ejemplo en una reacción química: Concentración de Sustrato [S] y Producto [P] Tiempo de la reacción:

t0 inicio " " " " tx término

[S] -------------> [P] 100 mM 0 mM 80 20 60 40 40 60 20 mM

80 mM

Se puede partir de 100 mM de sustrato [S] y 0 mM de producto [P] o viceversa y se llega siempre a la misma constante de equilibrio: Keq = 4, ya sea con o sin enzima. La reacción en este último caso se hará mucho más rápida, ya que solo aumenta la velocidad con que se llega al equilibrio.

b) LA ENZIMA NO CAMBIA LA ENERGIA DE FORMACION DEL SUSTRATO NI DEL PRODUCTO: Cuando el contenido energético del sustrato es superior al del producto (Fig. 2a - 4), la reacción procede hacia el equilibrio químico con o sin enzima. La única diferencia como se

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

dijo anteriormente, será el tiempo que le tome alcanzar el equilibrio químico. Este es mucho menor en presencia de un biocatalizador. Cuando el contenido energético del sustrato es menor que el del producto (Fig. 2b - 4), la reacción no ocurre con enzima o sin enzima. No importa si se le agrega más enzima a esta reacción, nunca será posible a menos que otra fuente externa entregue la energía que le falta al sustrato para proceder a transformarse en producto. En este último caso se demorará más sin enzima que con enzima.

E n e r g í a

REACCIONES INDIVIDUALES

a)

Proceso exergónico Reacción Posible

4

Representación Gráfica de las Reacciones K eq > 1

4 Coordenada de Reacción

b)

E n e r g í a

Proceso endergónico

3

Reacción Imposible

K eq < 1 3 Coordenada de Reacción

REACCION ACOPLADA

c)

Exergónica

E n e r g í a

+

Endergónica

+

SUMA

EXERGONICA

ALGEBRAICA DE AMBAS ENERGIAS

+

+

ENDERGONICA

+

+

Coordenada de Reacción

Existe un intermediario en común para ambas reacciones

Fig. 2a - 4. Reacción que libera energía. Fig. 2b - 4. Reacción que necesita energía del medio. Fig. 2c - 4. Reacción acoplada.

c) EL APORTE DE SUSTRATO Y REMOCION DE PRODUCTO IMPULSA A LAS REACCIONES TANTO ENZIMATICAS COMO NO ENZIMATICAS:

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Si la reacción que ocurre de S a P es reversible, ya que cuenta con una Keq cercana a 1. El desplazamiento de la reacción de izquierda a derecha se verá facilitado por el aporte de sustrato S, desde el precursor R y la remoción del producto P, a medida que este se transforme en Q. E R ----------> S P ------> Q Este efecto ocurrirá en presencia o en ausencia de la enzima E y si el producto P se acumula por no pasar a Q, la reacción se desplazará en reversa de P hacia S. De esta manera es posible explicar aquellas vías metabólicas que son reversibles. Degradan sustratos de reserva en ayunas y lo reponen o sintetizan después que el individuo se ha alimentado. La enzima no hace posible la reacción en ambos sentidos, solo aumenta la velocidad en que ocurre. d) EL ACOPLAMIENTO CON OTRA REACCION QUE LIBERA ENERGIA Y PRESENTA UN SUSTRATO EN COMUN, IMPULSA A LAS REACCIONES ENZIMATICAS Y NO ENZIMATICAS. Aquellas reacciones endergónicas que necesitan energía para proceder de izquierda a derecha (fig. 2c - 5), serán capaces de proceder en ese sentido solo cuando estén acopladas con una reacción exergónica, cuyo producto sea uno de los sustratos de la reacción endergónica. Este fenómeno de acoplamiento también ocurrirá con o sin enzima en la reacción. e) LAS REACCIONES QUE LIBERAN DEMASIADA ENERGIA EN UN SOLO SENTIDO NECESITARAN DE VARIOS PASOS ENZIMATICOS PARA INVERTIR LA REACCION EN EL SENTIDO OPUESTO. Cuando una reacción es demasiado exergónica en un sentido, ya no es reversible y puede emplear varias etapas catalizadas por otras enzimas para ganar en energía e invertir esta reacción La reacción principal catalizada por la enzima E s (fig. 3 – 4), es muy exergónica y requiere de tres reacciones, más la energía de un ATP para volver a su estado inicial. Por otro lado en aquellas reacciones que no son demasiado exergónicas, encontramos a la misma enzima catalizando la reacción inversa, dependiendo de los niveles de sustrato y producto que se acumulen en uno u otro sentido.

E a

A

E s

E p

P

S E 3

X E

R

1

Q ATP

ADP + P E

2

Fig. 3 – 4. Se requiere de 4 reacciones y ATP para remontar esta reacción.

141

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

f) LA ENZIMA PROPORCIONA AL SUSTRATO TODOS LOS EFECTOS CATALÍTICOS INDIVIDUALES QUE PUEDEN OCURRIR EN SOLUCIÓN, CON LA DIFERENCIA QUE LO LLEVA A CABO AL MISMO TIEMPO Y EN EL MISMO LUGAR.

HIDROLISIS DE UN ESTER COMO EJEMPLO DE CATALISIS ENZIMATICA

a)

+ HOH AGUA

O

R1

C O

CH 2

R2

O

C

R1

[ H+]

b) R1

+ O H

+

CATÁLISIS ÁCIDA

CH 2

O

O C

R1 O

H R2

E N E R G I A

Reacción normal sin catálisis

COORDENADA DE REACCIÓN

H O CH 2

O H

R2

C O

CH 2

R2

Residuo Catalítico

c)

R1

+ C

O

C O O H+

O

CH 2

-

OH + NH3

[O H ] O

CATÁLISIS BÁSICA

C

R1

+

Reacción con catálisis química

H

R2 O CH 2 O H SITIO ACTIVO DE UNA ENZIMA ( ESTERASA ) La catálisis ocurre por la presencia de dos residuos del sitio activo de la enzima que se encuentran + posicionados para entregar H y OH al mismo tiempo O R2

R1

C

+

H O

O H

Residuo

BAJA LA BARRERA POR CATÁLISIS ÁCIDA O BÁSICA

CH 2

R2

+

Catalítico

Fig. 4a - 4. El éster se hidroliza solo con agua. Fig. 4b - 4. Hidrólisis por catálisis ácida o básica. Fig. 4c - 4. Hidrólisis enzimática. Baja la energía del estado de transición.

Al observar la figura 4 - 4 y comparar los casos a), b) y c), encontramos que la hidrólisis del éster a) aumenta de velocidad en ambos casos, ya sea por la catálisis ácida o la básica b), mientras que durante la catálisis enzimática c), el sitio activo aporta un residuo de aminoácido que actúa entregando un protón, como ocurre en la catálisis ácida y a la vez otro residuo de aminoácido remueve un protón del agua para dejar libre un hidroxilo en el lugar adecuado, es decir como ocurre durante la catálisis básica. Por lo tanto ambas catálisis son aplicadas aquí simultáneamente y producirán un desmesurado incremento en la velocidad de reacción. g) Todas las reacciones biológicas conocidas hasta ahora pueden ser catalizadas por las siguientes enzimas: 1) OXIDOREDUCTASAS :Actúan donando o removiendo átomos de Hidrógeno sobre grupos químicos A -1

+

B

------------------

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A

+

B -1

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2) TRANSFERASAS: Transfieren grupos funcionales entre moléculas aceptoras o donadoras. A–B

+

C --------------------

A +

B-C

3) HIDROLASAS: Donan agua a un enlace hidrolizándolo A-B

+

H2O ------------------------- A - H

+

B-H

4) LIASAS: Agregan agua, amonio, o dióxido de carbono a los dobles enlaces o extraen estos mismos compuestos dejando dobles enlaces X Y I I A - B ------------------------------

A=B

+

X-Y

5) ISOMERASAS: Cambian grupos químicos de la Configuración L a la D o bien cambian grupos de su posición en una molécula X Y Y X I I I I A - B ------------------------------ A - B 6) LIGASAS: Catalizan reacciones de unión o ligación entre uno y otro grupo químico empleando la energía del ATP. A + B ------------------------------

A - B

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inicio 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES. Importancia de la estructura tridimensional de la enzima: a) Todas las enzimas enfrentan al sustrato en el sitio activo desde al menos tres puntos en el espacio al mismo tiempo. De esta manera la enzima, puede distinguir la configuración L o D del sustrato. (Fig. 5 - 4) . Este efecto primario de posicionamiento del sustrato y su posterior catálisis en el sitio activo, hace necesaria una cadena polipeptídica lo suficientemente larga. Solo de esta manera contará la enzima con los pliegues espaciales suficientes, para formar una estructura terciaria adecuada que le permita entrar en contacto con al menos tres residuos catalíticos en las coordenadas espaciales X, Y, Z para interactuar con el sustrato (Fig. 5 - 4).

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

U SUBSTRATO

C X x

Z z

Y y SITIO ACTIVO

Fig. 5 - 4. Los tres puntos de unión por parte del sitio activo permiten a la enzima distinguir la quiralidad del substrato.

En el caso contrario, si los tres aminoácidos catalíticos estuvieran, unidos por enlace peptídico uno a continuación del otro. No se lograría la posición tridimensional adecuada durante la etapa de reconocimiento junto al posicionamiento adecuado del sustrato. De esta manera unos pocos aminoácidos unidos covalentemente o tan solo una estructura secundaria del tipo secundaria o fibrilar no son suficientes para lograr la conformación espacial necesaria. A consecuencias de los requerimientos espaciales anteriores, al enfrentar al sustrato la estructura primaria de una proteína debe tener un largo mínimo para alcanzar a plegarse y enfrentar en tres dimensiones al sustrato. De esta manera, el sitio activo contará con la disposición espacial adecuada entregando afinidad y especificidad durante la catálisis. Como es lógico suponer, el andamiaje de la enzima no es rígido y es capaz de sufrir ajustes y desajustes, para así controlar la afinidad por el sustrato y por ende la actividad química con que se lleva a cabo la reacción. b) Otro factor que depende del tamaño de la estructura terciaria de una enzima radica en la posibilidad de que el sustrato se contacte al azar con la enzima en lugares ajenos al sitio activo. Sin embargo, es posible que desde estos lugares el sustrato sea orientado y guiado hacia el sitio activo por medio de interacciones débiles. Estas últimas se encuentran ubicadas en la superficie de la enzima. La estructura enzimática actuaría como un embudo virtual canalizando las moléculas de sustrato hacia el sitio activo. c) Los aminoácidos de la superficie de la enzima son además capaces de ayudar a ubicar a la enzima en la célula y se emplean también durante la interacción y reconocimiento con otras enzimas u otras estructuras. d) El tamaño promedio de las proteínas individuales en E.Coli (Procarionte) es de 25 kD mientras que en la línea de células HeLa (células de una línea cancerígena que se cultivan in vitro) es de 31,7 kD. Las proteínas pequeñas < 20 kD en Eucariontes son

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

hormonas o proteasas extracelulares y las grandes > 80 kD son generalmente proteínas estructurales o enzimas multifuncionales. Aquellas enzimas que cuentan con varias subunidades, son generalmente regulatorias del metabolismo intermediario y requieren de un complejo ajuste entre las subunidades del tipo regulatorio y las del tipo catalítico e) Uno de los factores que rige el tamaño de las enzimas con varias subunidades, es el área mínima de interacción con otra subunidad. Esta área alcanza a los 1000 A2 (A= Angstrom) cuando se trata de una interacción iónica débil en la superficie de una proteína esférica . Por otro lado, en el caso de proteínas con PM 10 kD, el área alcanza a los 1500 A2, lo que es aún poco. Sin embargo, en una enzima regulatoria el área no es lo suficiente para transmitir cambios conformacionales de una estructura proteica individual a otra y debe extender su cadena polipeptídica hasta al menos los 50kD obteniendo con ello una superficie de 7500 A2. Esta superficie sería el mínimo necesario para mantener las interacciones incluyendo una coordinación de las actividades con aquellas otras subunidades adyacentes en el caso de una enzima multimérica (varias subunidades). Otro factor a considerar consiste en que a mayor tamaño de la subunidad enzimática se incrementa la masa respecto a la superficie. Este factor puede limitar el tamaño y peso de cada subunidad en una enzima multimérica del tipo regulatorio. Volver

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inicio 4) MECANISMOS EMPLEADOS POR LAS ENZIMAS PARA DISMINUIR LA BARRERA DE ENERGIA. Como en los sistemas biológicos no se puede aumentar la presión o la temperatura para catalizar una reacción, se recurre a bajar la barrera de energía mediante los siguientes mecanismos: Primero, las reacciones ocurren en espacios confinados donde el choque entre las moléculas de sustrato y enzima es más probable. A menor volumen mayor es la concentración. Segundo, existen muchas copias de una enzima para aumentar la posibilidad de un encuentro con el sustrato. En algunos casos las enzimas se encuentran particuladas, formando parte de membranas. Estas últimas actúan como un embudo canalizador de sustrato, mientras que otras enzimas pertenecen a un complejo multimolecular, donde el producto de una reacción pasa fácilmente a la enzima siguiente y así sucesivamente. Todos estos mecanismos están destinados a facilitar la interacción. Tercero, los residuos de la enzima permiten la orientación adecuada del sustrato para encajar en los residuos catalíticos del sitio activo. Este efecto se conoce como Proximidad y Orientación. Cuarto, la cercanía del sustrato a la enzima puede provocar un cambio conformacional en el sitio activo o bien en el sustrato mismo, para aumentar la superficie de interacción entre ambos. Quinto, el sitio activo es relativamente hidrofóbico lo cual impide que el agua se interponga entre las cargas del sustrato y la enzima. Mientras que otras enzimas con sustratos hidrofóbicos emplean la contribución del agua para atraerlo hacia este. Sexto, la catálisis por los residuos del sitio activo puede ser Ácida General, donde los residuos de aminoácidos ácidos como Glutámico y Aspártico entregan protones o Básica General, donde los residuos de aminoácidos básicos como Lisina e Histidina toman protones del agua dejando iones hidroxilos.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Séptimo, la catálisis por los residuos de aminoácidos puede ser Electrofílica, donde un metal (Me+2) complejado a la enzima atrapa electrones o Neutrofílica, en que los residuos con grupos (-OH, -SH, -NH2) entregan electrones al sustrato. En la actualidad aún no se conocen o comprenden bien, todos los mecanismos existentes por los cuales una enzima disminuye la barrera de energía o aquella energía necesaria para alcanzar el estado de transición.

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inicio

5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. Las enzimas pueden regular su actividad para coordinar el metabolismo sin que existan normalmente acumulaciones de sustratos o productos entre las etapas de síntesis y degradación. La regulación de la actividad enzimática es llevada a cabo por algunos de los mecanismos ilustrados en la Figura 6 - 4: a) Aporte de sustrato y remoción de producto ( Fig. 6a – 4). Este tipo de regulación es el más común y se pueden encontrar varios ejemplos a lo largo de cualquiera vía metabólica. Las reacciones son generalmente reversibles y cuando el flujo de izquierda a derecha se ve alterado por acumulación del intermediario X, la reacción se invierte de P a S:

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

E1 E2 E3 ASP [ X ]  En este tipo de enzimas, al graficar Velocidad de reacción versus concentración de sustrato se observa una curva cinética del tipo Hiperbólico, la que será analizada más adelante.

b) Retroalimentación positiva y negativa en enzimas alostéricas ( Fig. 6b – 4). Las enzimas alostéricas, son aquellas que poseen un sitio extra distinto al sito activo y que se denomina sitio alostérico. En este lugar ubicado en la superficie de la enzima, se pueden unir sin sufrir transformación química tanto el sustrato como el producto de la reacción, así como cualquiera otro intermediario de la vía metabólica a la cual pertenece la enzima. En este sitio alostérico la unión de la molécula mediante interacciones débiles, provoca cambios conformacionales que son transmitidos por la estructura y a su vez afectan ajustando o desajustando la posición espacial de los residuos del sitio activo o su actividad química. Es decir, se modifica la actividad catalítica sobre el sustrato. c) Enzima modificada covalentemente por la unión de un grupo y que como resultado puede ser activada o inhibida

a) Esta Enzima puede catalizar una reacción reversible

SITIO MODIFICADO COVALENTEMENTE

SITIO ACTIVO ENZIMA

MODIFICADOR QUE SE UNE DE FORMA COVALENTE

ENZIMA SUSTRATO SITIO ACTIVO

b) Enzima presente al inicio de una vía metabólica ENZIMA

d) A mayor número de copias mayor posibilidad de encontrarse con el sustrato

SITIO ACTIVO S

SITIO ALOSTERICO

S

P

S

SUSTRATO

Fig. 6a – 4. Aporte de sustrato y remoción de producto Fig. 6b – 4. Enzima regulada por sitio alostérico Fig. 6c – 4. Enzima regulada por modificación covalente Fig. 6d – 4. Enzima regulada por el número de copias

Las moléculas de sustrato o producto que se unen al sitio alostérico se denominan moduladores. Por lo tanto un modulador es considerado positivo cuando aumenta la actividad de la enzima en el sitio activo. Con ello se incrementa la velocidad con que es

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

transformado el sustrato en producto. En algunos casos la primera enzima de una vía metabólica es la modulada positivamente, por su mismo sustrato e inhibida o modulada negativamente por el producto final de la vía metabólica (fig.7 – 4). De esta manera es posible mantener la concentración constante de los intermediarios, como se observa en el ejemplo al pié de la página. Las enzimas no regulables que se encuentran en el medio de esta vía funcionan solo por aporte de sustrato y remoción de producto. En estas enzimas ocurre que si el producto tiene mayor concentración, catalizan la reacción inversa de producto a sustrato y por eso es

+

A

E4 E2

E1

B

E3

C

P

D E5

Q

Fig 7 – 4. Retroalimentación negativa y activación necesario mantener el control del gradiente con el sustrato inicial o bien el producto al final de la vía. La enzima final de una vía metabólica es también susceptible de regulación especialmente cuando el producto final sufre una bifurcación hacia dos o más vías distintas. Las enzimas regulatorias cuentan con varias subunidades y algunas pueden ser del tipo catalítica al contener el sitio activo y otras del tipo regulatorio, al contener el sitio alostérico. La cinética de las enzimas alostéricas es del estilo Sigmoideo, ya que al graficar 1/Velocidad vs 1/Concentración (dobles recíprocos) no producen una recta, pero sí una curva. Esta cinética se explica tanto por los modelos de tipo simétrico como los de conformación inducida que serán vistos más adelante. c) Enzimas modificadas covalentemente (Fig. 6c – 4). La primera enzima al inicio de una vía metabólica, puede ser la reguladora de la degradación de un polímero complejo que se emplea como almacenador de energía. Este puede ser Glicógeno o un depósito de Tracilgliceroles. La enzima encargada de la degradación debe responder a señales externas a la célula o bien a señales provenientes del metabolismo interno de la célula. Así puede aumentar o disminuir su actividad según sea la necesidad de energía. Por ejemplo, la descarga de epinefrina en la sangre a causa de un estímulo repentino, produce un cambio metabólico en la célula sin entrar en ella. Esto se logra mediante una cadena de reacciones desde un receptor celular donde se une la epinefrina, hasta la modificación covalente de la enzima que regula la degradación del Glicógeno.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

El mecanismo ocurre al ser gatillado por la epinefrina que actúa sobre un receptor ubicado en la superficie de un miocito. Este último mediante un cambio conformacional activa a un transductor conocido como Proteína G. Esta proteína navega por la cara interna de la bicapa para entrar en contacto con la enzima Adenil Ciclasa. Esta última al ser activada, produce AMP cíclico a partir de ATP. Esta molécula conocida como “segundo mensajero” (AMPc) actúa a su vez sobre una enzima denominada Proteína Quinasa, que es capaz de fosforilar, activando o inhibiendo a una enzima efectora. De esta manera se regula y amplifica la degradación de la macromolécula Glicógeno. Bajo este mecanismo se liberan unidades de Glucosa fosforilada, que posteriormente donarán su energía formando el ATP necesario para la contracción muscular. En este caso fuera de hacer posible esta vía por activación, mediante la modificación covalente, se procede también a amplificar en cascada para liberar muchas moléculas de Glucosa desde el Glicógeno a partir de una sola molécula de Epinefrina.

d) Enzimas que regulan su número de copias (Fig. 6d – 4). Los mecanismos vistos anteriormente tenían respuestas que duraban solo milisegundos, en este nuevo mecanismo que afecta al número de copias, la respuesta es en horas.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

E4

A

E2

E1

E3

B

C

P

D E5 E1

E1

Q E1

RNA pol

A +

Receptor Inhibidor

PROMOTOR

[

]

GEN E1

A Fig. 8- 4. Inducción o represión de la expresión de un gen en una enzima

Este caso se puede ilustrar con la administración de una dieta pobre en un determinado sustrato A. Como consecuencias de ello los niveles de las enzimas que procesan al sustrato A disminuyen, por la falta de expresión de uno o más genes que codifican a las enzimas necesarias para esta vía metabólica. Este efecto ocurre debido a la presencia de una proteína receptora del sustrato A, ubicada en el núcleo como se puede observar en el ejemplo (Fig. 8 - 4). Cuando este receptor específico del sustrato A, se encuentra por si solo ejerce un efecto inhibitorio de la expresión del gen. Para ello, desencadena un mecanismo en que se bloquea la unión de la RNA pol a la región promotora e impide la transcripción del gen. Por otro lado, al producirse una acumulación de A, la proteína receptora se une al sustrato A y ahora no puede unirse al sitio del promotor compitiendo con la RNA pol. De esta manera se produce la transcripción del gen y un aumento del número de copias de la enzima que procesa a este sustrato. La proteína que interacciona con el sustrato A puede ser un factor de transcripción que interviene en la preparación de la doble hebra de DNA para la unión de la RNA pol. e) Zimógenos o enzimas que se activan al eliminar parte de su secuencia (Fig. 9 – 4). Algunas enzimas se activan al eliminar parte de su secuencia y este mecanismo se puede ilustrar ampliamente al observar la acción de las enzimas digestivas tanto en el estómago como en el intestino.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Para empezar tenemos que la hormona Gastrina estimula, no solo la salida del HCl desde las células parietales en el estómago, sino que también la salida de Pepsinógeno formado por una cadena polipeptídica de 40kD. Este Zimógeno o proenzima, al ser escindido en un polipéptido de 42 aminoácidos desde su región Amino terminal, se activa y pasa a llamarse ahora Pepsina de 33kD. La pepsina hidroliza enlaces peptídicos en las proteínas de la dieta donde el aminoácido del lado amino terminal es Phe, Tyr o Trp. Activación de un ZIMOGENO -S

S-

-S

S-

245

Quimotripsinógeno -S

S-S

-S 15

1

S16 1

Arg

-S

S-

Ser - Arg 14 15

-S 13

Leu

245

Ile S-S

1

S-

S16

Ile

-S

146

-S y

Quimotripsina activa

S-

Thr - Asn 147 148

S-

149

Tyr

Ala

S-S

-S

245

Quimotripsina activa

S-

Los polipéptidos que forman la enzima activa quedan unidos por puentes disulfuro

Fig. 9 - 4. La Quimotripsina se desprende de dos dipéptidos para alcanzar su conformación activa.

Posteriormente, al pasar el contenido al Duodeno, se neutraliza por la secreción de bicarbonato desde el páncreas, que ha sido estimulado por la hormona secretina. Esta se encuentra en la sangre y es liberada por el bajo pH proveniente del estómago. Por otra parte, la presencia del contenido estomacal en el duodeno estimula también la secreción de Colecistokinina. Esta hormona, a su vez estimula la secreción pancreática de Tripsinógeno, Quimotripsinógeno y Procarboxipeptidasa desde el Páncreas, junto a una secreción de carácter alcalino, ya que posee Bicarbonato. El Tripsinógeno es convertido luego a Tripsina por la Enteropeptidasa de las células intestinales (Fig. 9 – 4). En el caso de la Tripsina, se produce la hidrólisis de péptidos de la dieta cuando los aminoácidos del lado Ct (carboxi terminal) son Lys y Arg. El paso de Quimotripsinógeno a Quimotripsina y de Procarboxipeptidasa a Carboxipeptidasa es también catalizado por la Tripsina. La Quimotripsina a su vez hidroliza enlaces peptídicos cuando el lado Ct de estos, presenta alguno de los aminoácidos como son Phe, Tyr o Trp. La Carboxipeptidasa por su lado remueve sucesivamente residuos en el extremo Ct de polipéptidos cortos. El mecanismo implicado en los Zimógenos o proenzimas evita la autodestrucción del páncreas durante la síntesis de estas enzimas. De esa manera las enzimas digestivas se hacen activas tan solo en el lugar adecuado que incluye el lumen intestinal y frente a los polipéptidos de la dieta.

151

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

f) Aquellas enzimas que catalizan la misma reacción, pero con distinta afinidad y velocidad son conocidas por el nombre de Isoenzimas y/o Aloenzimas. Estas enzimas tienen distinta estructura molecular lo que se traduce en una distinta Kaf (afinidad) y Vmáx (saturación). Ambas son las constantes que definen a las enzimas (Fig. 10a – 4). En este caso se observa como el metabolismo se adapta a los distintos niveles de sustrato, ya que existirán isoenzimas adaptadas para los períodos de ayuno o de baja concentración de sustrato. Para ello presentan una alta afinidad, mientras que otras enzimas presentan una baja afinidad para los períodos de exceso de sustrato. Una de las isoenzimas más conocidas es Lactato Deshidrogenasa, que cataliza el paso de Piruvato a Lactato y que se encuentra presente en grandes cantidades en el músculo esquelético. Posee 4 subunidades H (Heart), típicas del corazón y 4 subunidades M (Muscle), típicas del músculo esquelético. En el resto del organismo hay combinaciones de H y M como son H3M, H2M2, HM3 más las originales H4 y M4. El PM aproximado de cada subunidad es de 33,5kD. Los diferentes parámetros de afinidad (Kaf) y grado de saturación (Vmáx) conque se cataliza el paso de piruvato a lactato, se ajustan a las particularidades aeróbicas o anaeróbicas de cada tejido. Estas isoenzimas aparecen en la sangre en el caso de lesiones musculares. Otra enzima ampliamente conocida es la Creatina Kinasa, que cataliza la formación de ATP a partir de Creatina-Fosfato. Constituye el medio más rápido de obtener energía durante la contracción muscular, aún antes de entrar a funcionar el metabolismo anaeróbico seguido posteriormente por el aeróbico. Esta isoenzima posee subunidades M y B junto a combinaciones de M2, MB, B2. ISOENZIMAS CON DISTINTA Vmáx y Km E1 K m = 10 mM V m = 1 mmol/min a) K m = 1 mM E2 V m = 10 mmol/min K m = 10 mM V m = 10 mmol/min

E3 S

P AT EC

b)

MT

Enzimas del complejo multienzimático

AT MT EC PTA KR DH ER TE

: : : : : : : :

Acetil Transferasa Malonil Transferasa Enz. Condensante Prot. Transport. de Acilo Cetoacil reductasa Deshidrogenasa Enoil reductasa Tio esterasa

DH

CYS

SH

HS HS TE

TE

E RKR PTA

CYS PTAKR

ER

MT

DH

SH

EC

AT

ACIDO GRASO SINTASA

Fig. 10a - 4.De las tres isoenzimas habrá mayor formación de producto en E2 que tiene menor Km o mayor afinidad y a su vez mayor velocidad. E1 y E2 catalizarán solo con mayor concentración de sustrato. Fig. 10b – 4. Complejo de la Ácido Graso Sintasa

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Las Aloenzimas se caracterizan por catalizar la misma reacción, pero con distinta velocidad o afinidad y provienen de alelos distintos por ejemplo uno paterno y otro materno. Pueden variar su afinidad y nivel de saturación con el sustrato. g) Complejos Multienzimáticos. Existen varios complejos multienzimáticos como el de la Piruvato Deshidrogenasa, la AlfaCetoglutarato Deshidrogenasa y la Ácido Graso Sintasa (Fig. 10b - 4). Los dos primeros emplean un ácido graso de 8 carbones conocido como Ác. Lipoico que posee dos grupos SH y sirve para trasladar al sustrato de una enzima a otra en el complejo. El complejo de la Ácido Graso Sintasa emplea con este mismo fin una coenzima de cerca de 77 aminoácidos conocida como Proteína Transportadora de Acilos que posee tan solo un grupo SH en su extremo para unirse al sustrato. La ventaja de un complejo multienzimático es obvia, ya que consiste en tomar al sustrato y pasarlo por las distintas enzimas, hasta que después de sucesivas modificaciones químicas se convierte en el producto final que es liberado nuevamente al medio. De esta manera se evitan las perdidas por difusión de los intermediarios. h) Enzimas unidas a membrana. Las enzimas unidas a membrana actúan acopladas a algún sistema de transporte que facilita el paso de un sustrato a algún compartimiento en especial. Su función en algunos casos es activar al sustrato para su unión al transportador o modificar al sustrato para que no difunda hacia fuera del compartimiento una vez que ha entrado. En otros casos las membranas sirven de embudos para canalizar el sustrato hacia la enzima.

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al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION. La conformación o forma espacial de una proteína esta íntimamente ligada a su función. De esta manera, basta un pequeño cambio en el acomodo de los residuos en la estructura, para que los tres puntos de contacto con el sustrato se vean alterados. En este caso no solo el reconocimiento y la eficiencia de la unión serán afectados sino que también la eficiencia de la catálisis misma (Fig. 11 - 4). En consecuencia la alteración de la Conformación se emplea para regular la actividad En una enzima los residuos de aminoácidos tienen distinta importancia. Algunos estarán destinados a mantener la conformación. Otros estarán destinados al posicionamiento del sustrato y otros serán necesarios para la actividad catalítica

Residuos necesarios

Residuos que posicionan al sustrato

para mantener la conformación entre ambas subunidades

Residuos destinados a mantener la ubicación de los residuos catalíticos

Fig. 11 - 4. No todos los residuos de una enzima tienen igual importancia para la función de esta.

catalítica de las enzimas alostéricas y de esta manera controlar a las vías metabólicas. Una enzima expuesta a ambos sustratos L y D, elegirá aquel que corresponda a una menor barrera de energía durante el proceso de unión, lo que ocurrirá en algunos casos con el isómero L o con el isómero D. La estructura tridimensional de la enzima posee ciertos aminoácidos críticos para interaccionar con el sustrato y un cierto número de otros aminoácidos en posiciones espaciales muy determinadas. Estos últimos serán necesarios para mantener una conformación destinada a catalizar una reacción específica. Aquellos lugares críticos en la estructura hacen el papel de bisagras para amplios sectores de la proteína. Cuyo resto puede estar formado por aminoácidos susceptibles de ser reemplazados de una especie a otra, sin mayores cambios en la catálisis. Por otro lado, aquellos sitios específicos para la catálisis no experimentan cambios adaptativos, ya que se han agrupado evolutivamente como los mejores aminoácidos para llevar a cabo una determinada reacción química y no es necesario cambiarlos posteriormente. Podemos tomar como ejemplo de lo anterior, a la enzima Superóxido Dismutasa (Tabla 1 - 4) que tiene un rol crítico al disminuir el riesgo de la presencia de Superóxidos durante el metabolismo aeróbico. En ella existen ciertos residuos de aminoácidos que son imperturbables, a pesar de pertenecer a 6 especies distintas. Los residuos conservados son

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de preferencia los de carácter catalítico y están formados por 4 His en el sitio activo, más 40 residuos en otras posiciones claves de la estructura. Estos últimos se encuentran destinados a la aproximación y orientación del sustrato Superóxido sobre el sitio activo. Si este sustrato toca alguna parte extra de la enzima, es capaz de denaturarla por su condición de fuerte Reductor y Oxidante. Otros residuos de la estructura tienen cierta variación de especie en especie y son cerca de 100. Entre ellos se puede cambiar de naturaleza sin perder la conformación original de la enzima y solo ayudan adaptarla a los distintos medios internos de cada especie. TABLA 1 - 4 Regiones de homología encontradas en las secuencias alineadas de la enzima Superóxido Dismutasa perteneciente a 5 especies distintas

BOVINO HUMANO CABALLO

HUMANO 140

CABALLO 138

PEZ ESPADA 123

LEVADURA 94

BACTERIA 42

133

116 117

94 98

39 42

95

44

PEZ ESPADA LEVADURA

40

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155

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. a) EFECTO DEL pH. Existen enzimas que expresan su actividad fuera del rango normal de pH, como lo es entre 4 y 8. Algunas tienen catálisis óptima a pH 1,8 como en el caso de la Pepsina. esto se debe a que cuentan con un gran número de grupos carboxilos hacia el exterior (Fig. 12 - 4). Otras tienen un pH óptimo de 9 (Tripsina) por el predominio de los grupos amino hacia el exterior.

Pepsina

Tripsina

A c t i v i d a d 2

4

6

8

10

pH

Fig.12 - 4.Efecto del pH sobre algunas proteasas.

En general, el pH interviene al controlar en una enzima: a) las interacciones con el sustrato b) las interacciones con sus moduladores c) los pasos catalíticos de la secuencia de reacciones destinadas a formar producto d) las transiciones estructurales que acompañan la modulación de la enzima y su catálisis. Una enzima soluble presenta residuos al exterior con cargas y/o residuos polares sin carga neta. Estos últimos poseen diferenciales de carga y son capaces de formar enlaces hidrógeno con el agua. Por otro lado, aquellos grupos con carga, son titulables y podrán aceptar o donar protones cambiando la carga neta de la proteína y por consecuencia se afectará la conformación y solubilidad de esta. También los residuos del sitio activo serán capaces de aceptar o donar protones, o de cambiar su disposición espacial por el mismo efecto. Esto a su vez se traducirá en un cambio de Km (la constante de Michaelis), que es aproximadamente el valor recíproco de la constante de afinidad y/o un cambio en el número total de moléculas activas o viables, lo que afectará a la actividad o Velocidad máxima de la reacción. Por tanto las enzimas tendrán una actividad que dependerá del pH (Fig. 13 – 4). La enzima Láctico Deshidrogenasa en el músculo, necesita tener protonado al menos el 50% de su His 159. Esta última es necesaria para la unión al sitio activo del Piruvato. Sin embargo, la misma His 159 debe estar sin el protón para unirse al Lactato. En otras palabras debe encontrarse a pH básico en el músculo, durante la modalidad aeróbica y a pH ácido o protonada, lista para unirse al Piruvato durante la modalidad anaeróbica del metabolismo.

156

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Músculo aeróbico LDH Lactato + NADH + H+----------->Piruvato + NAD Músculo anaeróbico LDH Piruvato + NAD ------------->NADH + H+ Láctico De esta manera se llevará a cabo la catálisis a un pH óptimo donde la enzima se encontrará en la mejor condición posible para adoptar una conformación espacial que permita el subsecuente posicionamiento y protonación (unión de protones). Este efecto entregará la carga correspondiente a los residuos catalíticos. Fuera de este pH óptimo, la catálisis no se encontrará con la disposición espacial adecuada y disminuirá la velocidad de reacción o la afinidad por el sustrato.

SITIO ACTIVO DE LA LACTATO DESHIDROGENASA

Cofactor

NADH

H i s 195

+H N

H

Piruvato

H C 3

H

A r g 171

O

C

Se requiere de bajo pH para que la His 195 se encuentre siempre protonada. Su grupo Imidazol debe tener carga ( + ), para que se una al Carbono del Pirtuvato

N H

C O

O

H

H

N

+N

H

C

N H

Para unirse al Lactato se requiere de un pH elevado y que la His 195 se encuentre sin protón

Fig. 13 - 4. La enzima Láctico Deshidrogenasa necesita estar 50% protonada para unir Piruvato y 50% deprotonada para unir Lactato.

Volver inicio b) EFECTO DE LA TEMPERATURA.

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al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

La temperatura óptima de una enzima es aquella que le permite llevar a cabo la catálisis en las mejores condiciones de afinidad y velocidad de reacción con el sustrato. La temperatura óptima permite a la enzima adquirir su mejor conformación para desarrollar la actividad máxima. Existen varias curvas cinéticas (Fig. 14 - 4), que describen los distintos procesos que tienen lugar al aumentar la temperatura de una reacción enzimática. Todas estas curvas se combinan para dar una velocidad única que se puede explicar de la siguiente manera:

Caso a) Sin considerar la enzima, el aumento de la velocidad de reacción (Fig. 14 - 4), dependerá en parte del aumento de energía o agitación molecular del sustrato mismo, la que se alcanza a una mayor temperatura. Esta energía de activación le permitirá alcanzar el estado de transición, que se encuentra en la cúspide de la barrera de energía. Según la ecuación de Arrhenius a mayor temperatura y menor energía del estado de transición (Δ G* /RT: energía necesaria para pasar la barrera a temperatura T) mayor será la velocidad de una reacción. Ahora, cuando la enzima se encuentra presente se alcanza la conformación óptima y más allá de esta se denatura por la agitación térmica. Por otro lado, mientras más se agite el sustrato por el aumento de temperatura, mayor será la afinidad que la enzima necesite para unirse a este. Por esta misma razón, no será posible un mayor incremento en la velocidad de reacción a causa de que a la enzima le costará a su vez más energía desprenderse del producto, al final de la catálisis.

Caso b) La cinética de denaturación térmica de la enzima (Fig. 14 - 4), se manifiesta como Caso a: Aumento de velocidad sin enzima V e l o c i d a d

Caso b: Reacción con Enzima. Cinética de la Denaturación Térmica de la Enzima

Arrhenius: - ΔG*/RT

V=ke T

Fig. 14 - 4. La V combinada aumenta hasta que la Enzima se denatura

perdida de la afinidad de la enzima por el sustrato. La estructura enzimática empieza a sufrir una alteración de su conformación a causa de la elevada agitación del medio en que se encuentra inmersa. De esta manera se provoca una paulatina degradación de la enzima por el número de choques con el medio. En el caso de aquellas enzimas que se adaptan a la baja temperatura, como sucede en los peces árticos. Se ha producido en ellos un aumento del valor de la Km (fig. 15 - 4), es decir ha disminuido su afinidad por el sustrato, ya que este

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

se agita menos. Por otro lado en los animales adaptados al clima tropical, donde el sustrato se agita más. La Km ha disminuido aumentado la afinidad por el sustrato. A baja temperatura el sustrato se agita poco y la enzima no requiere de una gran interacción para atraerlo y retenerlo en el sitio activo, al contrario de lo que sucede a alta temperatura. Por otro lado, al liberar el producto costará menos a baja temperatura y bastante más en alta. En el primer caso se rebaja la barrera de energía y en el segundo se aumenta. En el caso de las iguanas, una vez que han alcanzado su temperatura de actividad corporal, ocurre que el sustrato se agitará más y deberá ser retenido de forma más intensa por la enzima. A causa de este efecto, la barrera de energía sube y la enzima es menos eficiente (fig. 15 - 4).

Km peces árticos

mamíferos iguanas Disminuyen las K ms

0

45

TºC

Fig. 15 – 4. Variación de la Km con la temperatura en distintas especies. Volver

al

inicio 8) MECANISMOS ENZIMATICOS. Uno de los mecanismos enzimáticos mejor conocido es la participación de la enzima Quimotripsina durante la hidrólisis de enlaces peptídicos. Esta es una enzima de 25 kD, que se encuentra formada por tres polipéptidos conectados por puentes disulfuro. Se observan en su estructura regiones tipo Beta antiparalela y Alfa-Hélice. Su papel, es hidrolizar enlaces peptídicos en sustratos proteicos, donde el lado Carbonilo del enlace pertenece a un aminoácido aromático como Fenilalanina, Tirosina o Triptófano. En algunos casos también puede ser Metionina. Los aminoácidos críticos del sitio activo son la Ser 195 y la His 57, como se puede observar en la figura 13 - 4. Cuando el sitio activo esta vacío (fig. 16a - 4), existe un puente hidrógeno entre el Asp 102, la His 57 y la Ser 195. Cuando el sustrato entra al sitio activo se transfiere un protón desde la Ser 195 a la His 57, produciéndose una interacción electrostática entre la His y el Glu (fig. 16b-4). Enseguida se desarrolla el ataque del grupo hidroxilo de la Ser 195 sobre el carbonilo del enlace peptídico y a consecuencias de esto se forma el enlace. Por otro lado, la unión Carbono - Oxígeno queda reducida a solo el enlace Sigma (se pierde el enlace Pí), quedando el Oxígeno con carga negativa. A continuación se forma un arreglo

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

tetraédrico de transición mantenido por los residuos 195 y 193 de la cadena polipeptídica de la enzima. El enlace peptídico se rompe y se forma el intermediario Acil-enzima, como se observa en la figura 16c - 4, quedando el lado Imino unido al hidrógeno de la His 57. En la sección d) de la Figura 17 - 4, el lado amino del polipéptido, empleado como sustrato ha difundido fuera del sitio activo y entra una molécula de agua para deacilar la enzima. La a)

H R

O C

N

1

Asp 102

H

N

N

C

CH

H

R O

O

C

CH

2

O

H

O

H

Asp 102

O C

R

O

H

CH

CH

N 195 cadena de la enzima H N

193 2

2

Ser 195

O

1

H

N

C

N

N

H

O

C

CH

CH

C

N

N

His 57

R

N

1

CH

C

Ser 195

O

+

Asp 102

c)

H

H

2

O

CH O

b)

R

C

R

CH

2

2

Ser 195

His 57

Fig. 16a - 4.Mecanismo de acción de la Quimotripsina con aminoácidos Asp 102, His 57 y Ser 195. Fig. 16b - 4.Interacción con residuos Ser 195 y Glicina 193 Fig. 16c - 4.Ruptura enlace peptídico y formación del Intermediario Acil-Enzima e)

d) H

O

O

CH

C O

H N

Asp 102

C

H

N

H

O C O

R 2

CH

CH

C O

+H N

Asp 102

C

Ser 195

His 57

O C

O

2

195 cadena de la H N

CH

His 57

N

H O

CH

CH

O R 2

enzima

H N 193

2

Ser 195

f) H O O C O

Asp 102

C

CH H N C

His 57

N

H

CH

O

O R 2

CH

2

Ser 195

Fig. 17d - 4. Entrada de molécula de agua y salida de lado amino del polipéptido Fig. 17e - 4. La molécula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo Fig. 17f - 4. Salida del extremo carboxilo del polipéptido

molécula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo en un nuevo estado de transición tetraédrico de la figura 17e - 4, que es mantenido por otros residuos de la enzima como lo son el 195 y 193. Enseguida se rompe la unión con la Ser 195, quedando el lado acilo del

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

polipéptido sustrato libre, para que finalmente la Ser 195 interaccione nuevamente con la His 57 alcanzando el estado de reposo (fig. 17f – 4). Volver

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inicio 9) CINETICA ENZIMATICA. El análisis de la cinética enzimática fue llevado a cabo por Leonor Michaelis y Maud Menten. Estas personas relacionaron la concentración de sustrato con la velocidad de reacción bajo los siguientes principios: Estado k1 activado k3 E + S [ES] --------------> E + P k2 La enzima se une al sustrato para formar un complejo que alcance el estado activado y luego puede descomponerse para formar nuevamente sustrato más enzima sin cambio alguno o bien puede descomponerse para formar enzima y producto. La enzima queda finalmente inalterada ya que es solo un catalizador. Los principios del análisis de Michaelis-Menten son los siguientes: 1) La velocidad con que se forma el complejo ES es igual a la velocidad con que se destruye. v1 = v2 + v3 k1 [E]l [S] = k2 [ES] + k3 [ES]

(1)

2) La enzima total [E]t será igual a la enzima libre [E]l, más la unida al complejo enzima substrato [ES]. [E]t = [E]l + [ES] (2) 3) La velocidad de la reacción inicial dependerá de la concentración del complejo ES. A medida que este se descompone se formará producto o sustrato nuevamente. v1 = k3 [ES]

(3)

4) La velocidad máxima (Vmáx) de la reacción se obtendrá cuando la concentración del complejo [ES] sea igual a la concentración total de la enzima E. Vmáx = k3 [E]t cuando [E]t = [ES]

(4)

5) La Constante de Michaelis será la relación que exista entre las constantes de la velocidad de la reacción en uno y otro sentido. k2 + k3

(5)

161

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Km = --------k1 Si k3 es muy pequeño, la Km será inversa a la constante de afinidad (Kaf) por el substrato. A mayor Km entonces menor afinidad por el sustrato. Al reemplazar las ecuaciones 2, 3, 4 y 5 en 1 se obtiene la ecuación general de MichaelisMenten que relaciona la velocidad de reacción con la concentración de substrato: Vmáx [S] v = -----------Km + S El significado de Vmáx y Km es el siguiente. La Km cuando v = 1/2 Vmáx, es la concentración de substrato para saturar el 50% de los sitios activos presentes (uno por molécula de enzima) y se relaciona como se dijo anteriormente con la afinidad de la enzima por el substrato. A mayor afinidad menor Km y a menor afinidad mayor Km. La Vmáx se relaciona con el número de moléculas de enzima activas o la concentración total de la enzima viable bajo 100% de saturación con el sustrato, ya que pueden existir moléculas de enzima no activa o inhibidas de actuar. La Vmáx dependerá no solo de la concentración de enzima, sino que del número de recambio conocido como el número de moléculas de substrato que pasarán por el sitio activo transformándose en producto. Al graficar la ecuación de Michaelis-Menten, encontramos que la curva formada, es una hipérbole que consta de tres partes. La primera indica que la reacción es de orden 1 o proporcional a la concentración de sustrato (Figs. 18a - 4, 18b – 4 y 18c - 4), donde la enzima aumentará la velocidad de reacción a medida que llegue más substrato al sitio activo: v = k1 [S] o dS/dt = k1 [S] o S = S0 e-kt donde k es la constante de la velocidad, luego: Log S0/S = kt/2.303 Con ello se puede calcular el tiempo medio en que ocurre una reacción de primer orden, el cual es independiente a la concentración de substrato: t /2 = 0.693/k

162

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

El tiempo medio es independiente de la concentración inicial de sustrato. a)

b)

E S

E

E S

P

E c)

E E

S

P

P

E

E

E

P

S

P

P

S

P

S

E

E

P

E

S

S

S

E d)

E P

S

E

P

E

Fig.18 - 4. En a) una molécula de substrato por cuatro de enzima, en b) dos moléculas y en c) tres moléculas, para estar finalmente saturada con cuatro moléculas en d).

v = V max v v = K (s

) (s )

v = V max v 1 v = Vmax 2 (s )

Km

Fig. 19 - 4.Ambos gráficos representan la velocidad respecto a la concentración de sustrato.

163

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

La segunda parte está representada por la zona curva y es de orden indeterminado ni 0, ni 1 y la tercera parte se encuentra representada por la recta horizontal que es de orden 0, donde se alcanza la velocidad máxima en forma independiente a la concentración de substrato y la velocidad en este momento solo dependerá de la concentración de Enzima o el número de moléculas de enzima activas (Fig. 18d - 5): a) v = Vmáx si [ES] = [E]t b) Vmáx = k3 [ Et ] De la ecuación b) se puede calcular el Número de Recambio que es el número de moles de substrato convertidos a producto por minuto por mol de enzima. En este momento la Velocidad solo dependerá de la concentración de enzima solamente, la velocidad será máxima si el substrato está saturante. Por lo tanto la Ecuación de Michaelis-Menten está formada por dos rectas (Fig. 19 - 4) donde la velocidad es proporcional a la concentración de substrato y la otra en que la velocidad es independiente de la concentración de sustrato durante la saturación total de la enzima. Debido a que la ecuación de Michaelis - Menten representa una curva, el cálculo de Km y Vm para cada enzima se hace complejo y se necesitan muchos puntos para determinar los valores con exactitud. De esta manera se hizo un arreglo matemático por la dupla Lineweaver-Burk para convertir la curva en una recta, que solo puede ser definida por al menos 2 puntos (Fig. 20b - 4), comparada a la Michaelis-Menten (Fig. 20a-4) que necesita muchos puntos de definición. De esta manera se cambió la expresión, pero no el análisis y se hizo mucho más fácil la determinación gráfica de Km y Vmáx.

a)

V m. [ S ]

b)

v = Km + [S ]

1 v

Km . Vm

=

[S]

Vm

Vm

Km/Vm

1/V m

- 1/K m

Km c)

1

Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten 2

+

1/v

Vm 1

1

Vm

1/[ s ]

v Eadie -

-Km

v

=

- Km

v [S]

+

Vm

Hofstee

v / [S ] Fig. 20 - 4.Tres formas distintas de expresar el mismo planteamiento central de a) MichaelisMenten, b) Lineweaver-Burk y c) Eadie-Hofstee.

164

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Expresión de Lineweaver-Burk: 1 Km 1 --- = ---------- + v Vmáx [S]

1 -----Vmáx

puede ser homologada con la ecuación de la línea recta: y=mx+n Al graficar 1/v vs 1/S se obtiene la pendiente m = Km/V y el intercepto en el lado positivo del eje 1/v es n = 1/Vmáx, mientras que el intercepto en el lado negativo del eje 1/S es -1/Km (Fig. 20b - 4). Otra forma de expresar el análisis de Michaelis-Menten en una recta, fue ideado por la dupla Eadie-Hofstee (Fig. 20c - 4) donde: v v = - Km --- + Vmáx [S] La ecuación puede ser homologada a la recta de pendiente negativa: y=-mx+n La gráfica corresponde aquí a v versus v/S y se obtiene una recta de pendiente negativa m = - Km y un intercepto n = Vmáx en el eje v. La descripción de Michaelis-Menten es una de las más simples, pero la interacción entre una enzima y un sustrato puede presentar algunas otras variantes que se describirán a continuación. Primero, cuando existen moléculas similares, pero no idénticas al substrato que compiten por el sitio activo junto a este. Segundo, cuando existen moléculas que se pueden unir a la superficie de la enzima libre y también al complejo ES inhibiendo su actividad. Tercero, cuando una molécula que no es el substrato se une exclusivamente al complejo ES. Estos tres casos son sucesivamente conocidos como, inhibición competitiva, inhibición no competitiva e inhibición acompetitiva respectivamente y pueden ocurrir en el metabolismo intermediario. También estos mecanismos se emplean en el dominio de la farmacología para controlar algunas vías metabólicas o la síntesis y secreción de neurotransmisores. Muchas drogas han sido diseñadas para interactuar con receptores o enzimas provocando alteraciones como las aquí señaladas en el transcurso de su acción.

Volver inicio

165

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

10) INHIBICION COMPETITIVA. La inhibición competitiva puede ocurrir cuando existe una competencia entre una molécula estructuralmente similar al sustrato denominada inhibidor y el sustrato por el sitio activo (Fig. 21 - 4):

I nhibición Competitiva .

E

ES

E S

S

+ +

+ I

P

E+ +

S

ES

E+ P

I

EI EI I

Fig. 21 - 4. El substrato y el inhibidor son similares y pueden entrar al sitio activo.

La constante de disociación del inhibidor I es la siguiente: Kd = k2/k1 = [E] [I] / [EI] = Ki cte. del inhibidor y 1/Km = Kd, mientras que Km = [E] [S] / [ES] en Km / [S] = [E0] / [ES] - [ES] / [ES] -[EI] / [ES] Km / [S] = [E0] / [ES] - 1 - [E] [I] / Ki Km / [E] [S] donde: [Eo] / [ES] = Km / [S} + 1 + Km[I][E] / [E]Ki[e] Si:

166

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

[Eo] / [ES] = Vm / v Vm / v = Km / [S] + Km [I] / [S] Ki + 1 Al multiplicar por [S]: Vm[S] / v = Km (1+ [I] / Ki) + [S]) donde:

v = Vm [S] / Km( 1 + [I] / Ki) + [S]

o en la forma Michaelis-Menten: v =

Vmáx [S] ---------------------Km ( 1 + [I] ) + [S] --Ki

o en la forma Lineweaver-Burk: 1 --v

=

1 --v

=

"Km aparente" ----------Vmáx Km ---Vmáx

1 --- + [S]

1 --Vmáx

[I] 1 (1 + ----) --Ki [S]

+

1 --Vmáx

La Km que se obtiene en presencia del Inhibidor se denomina "Km aparente" y su valor aumenta con la concentración del inhibidor. Kmaparente = Km ( 1 + [I] / Ki) Los siguientes puntos son de consideración: 1) El grado de inhibición causado por un inhibidor competitivo dependerá de [S], [I], la Km y la Ki. 2) Cuando la concentración de sustrato aumenta a [I] constante, la inhibición disminuye. 3) Cuando la concentración de inhibidor aumenta a [S] constante, el grado de inhibición aumenta. 4) A menor concentración de [S] y a mayor Ki, mayor será la inhibición. 5) Cuando la [S] sea mayor o igual a 100 veces la Km aparente, se tendrá que v = Vm. En este caso la Km por el sustrato original S, aumenta al incrementar la concentración del inhibidor I. Por ejemplo si la enzima Fólico Reductasa produce la forma activa del ác. Fólico denominada ác. Tetrahidrofólico y se la pone en contacto con los compuestos análogos Aminopterina o Metopterina (Fig. 22 - 4). Ocurre que se produce una inhibición de tipo competitivo donde la Km por el ác. Fólico aumenta disminuyendo la afinidad por el sustrato natural a medida que aumenta la concentración del compuesto análogo inhibidor, Ejemplo:

167

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Ác. Fólico Ác. Fólico + Aminopterina Ác. Fólico + 2[Aminopterina] Ác. Fólico + 3[Aminopterina]

Km

Vm

10 uM 15 20 30

50 um/min 50 50 50

Igual cosa sucede con las Sulfonamidas, en los Streptococus Fecalis. Estos se pueden reproducir cada 20 minutos, ya que pueden sintetizar el ác. Fólico de novo o a partir de 0, sin embargo la enzima que une el ác. p-aminobenzoico, puede equivocarse y tomar a las Sulfonamidas que tienen similar estructura para ensamblar el ác. Fólico, por lo que se producirá una inhibición competitiva.

E structuras Similares Provocan Inhibición Competitiva . 2-Amino-4-Hidroxi

Ac.Para-Amino Benzoico

6 - M e t i l P t e r i n a.

OH N N

H N 2

H N 2

N

N N

H2 N

A c. F O L I C O

AMINOPTERINA

N

H N 2

N

Empleados en Quimioterapia

O

C H3

2

N

H

C N C C H2 C H2 C O O H H COOH

2

H

C N C C H2 C H2 C O O H

C H2 N

O C NH 2 N

O

H CH N

H N

N

H C N C C H2 C H2 C O O H H COOH

CH N 2

N

NICO TINAM IDA

O

H N

Ac.Glutamico.

H COOH

O C

N N H 2 H

N IS ON IA Z IDA

tratamiento de la tuberculosis

METOPTERINA

N H

H N

O S

NH R

desinfectante

O

SULFONAMIDA

Fig. 22 - 4. Los análogos del ác. Fólico actúan inhibiendo la síntesis de ács. Nucleicos en humanos, mientras que las Sulfas inhiben la síntesis de ács. Nucleicos en las bacterias del intestino al igual que los antibióticos y la coenzima NAD.

Volver inicio 11) INHIBICION NO COMPETITIVA.

168

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Ocurre cuando el Inhibidor se une tanto a la superficie de la Enzima libre como a la Enzima unida al sustrato (Fig. 23 - 4) y las siguientes consideraciones deben ser tomadas en cuenta para este tipo de inhibición: 1) El grado de inhibición en presencia de un inhibidor no competitivo depende solamente de [I] y KY. 2) En presencia de un inhibidor no competitivo pareciera existir menos enzima de la que se encuentra presente. 3) La Velocidad aparente es siempre una fracción constante de la Vmáx, independiente de [S] y de Km. De lo anterior se deduce que: E + ES + I = EI + ESI si E + I = EI

Inhibición No Competitiva . E

E

ES

+

S

S

+

+

I

+

I

P E + S

I

I

EI

EIS

+

+

I

I

EI + S

+

ES

E + P

EIS

S

S

Fig. 23 - 4. El substrato y el inhibidor no se relacionan estructuralmente. El inh. se une solo a la superficie de la enzima.

simplificando: EI + ESI = EI Luego: Ki = [E] [ I ] / [EI] = ( [E] + [ES] ) [ I ] / [EI] (a) La enzima se encuentra durante esta inhibición de 3 formas:

169

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

[Eo] =[E] + [ES]+[EI] sustituyendo: [E] + [ES] en a, tenemos que: Ki [EI] = [E0] [ I ] - [EI] [ I ] Ki [EI] + [EI] [ I ] = [E0] [ I ] Luego, despejando [EI]: [EI] = [E0] [ I ] / Ki + [ I ] Como Vmáx = k [E0] y v en presencia de substrato e inhibidor no competitivo es v = k([E0 [EI]) Vmáx/v = [E0] / [E0-[EI] Vmáx/v = [E0] / [E0-[E0] [ I ] / [E0] - [E0] [ I ] / Ki + [ I ] finalmente: v = Vmáx ( Ki / Ki + [I] ) y "Vaparente" = Vmáx / (1 +[ I ] / Ki) y la ecuación final estará dada al estilo Lineweaver-Burk por: 1 Km [I] 1 1 [I] --- = --- ( 1 + --- ) --- + --- ( 1 + --- ) v Vmáx Ki [S] Vmáx Ki En este caso la Km permanece igual ya que no se afecta el sitio activo, pero la Vmáx disminuye, ya que el número de moléculas totales de enzima activa decrece a causa de la unión con el Inhibidor. Un ejemplo de este tipo de inhibición son los excesos de metales pesados, como el Cobre, Hierro, Plomo y Mercurio, este último es de reconocida toxicidad y se le emplea en algunas preparaciones desinfectantes. Estos metales se unen a los grupos tioles de las Cisteínas que se asoman al exterior en la superficie de las enzimas. La unión a ellos paraliza a la enzima que puede estar libre o unida al sustrato, de esta manera algunas moléculas de enzima no catalizarán la reacción disminuyendo la Vmáx. Volver inicio

12) INHIBICION ACOMPETITIVA (Fig. 25 – 4).

170

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

En este caso el Inhibidor se une solo al complejo ES, a diferencia de la inhibición NO COMPETITIVA donde también se une a la enzima libre. Su efecto se puede analizar de la siguiente manera: ES + I === EIS I: Inhibidor [ES] [ I ] Ki = ----------[EIS]

Si Consideraciones Generales.

1) En los gráficos de Lineweaver-Burk se observan en este caso rectas paralelas a concentraciones crecientes del inhibidor 2) En presencia del inhibidor disminuye Km y Vm 3) La Ki pude ser calculada gráficamente.

Inhibición Acompetitiva .

E

ES

+

E S

S

+ E

+

S

ES

E

+ P

+

I

P

+ I I EIS

EIS S

Fig. 25 - 4. El inhibidor I se une solo al complejo Enzima-Substrato.

En la Figura 26 - 4, se pueden observar las expresiones de Michaelis-Menten y LineweaverBurk para los tres tipos de inhibiciones. Durante la Inhibición Competitiva la Km disminuye y la Vmáx continúa igual, ya que las moléculas de inhibidor entran al sitio activo de la enzima desplazando al substrato debido a su similaridad estructural. En la Inhibición No Competitiva, la Km permanece inalterada y la Vmáx disminuye debido a que el inhibidor elimina moléculas de enzima libre o unida al substrato durante la reacción, mientras que en

171

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

la Inhibición Acompetitiva ambos parámetros disminuyen Km y Vmáx, debido a que el Inhibidor solo se une al complejo Enzima-Substrato. En la figura 27- 4, están representadas gráficamente las inhibiciones en el estilo de Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee. En los tres tipos de gráficos la concentración del inhibidor aumenta desde la letra a hasta la letra c. Los gráficos representados por rectas parecen ser los más precisos para clasificar el tipo de inhibición y calcular los valores de Km y Vmáx, además cualquier comportamiento anormal de las rectas podrá ser interpretado como la presencia de una enzima modificada alostéricamente por el inhibidor o el substrato y su cinética deberá expresarse mediante otro tratamiento como es la expresión de Hill.

SIN

IINHIBICION COMPETITIVA

Km

V máx

AUMENTA

CAMBIO

v

V máx

= Km

[S]

[I]

1+

+

1

[S]

Km

IINHIBICION NO COMPETITIVA

1

1+ V máx

v

Ki

1

[I]

=

+ [S]

Ki

SIN

Km

V máx

V máx

DISMINUYE

CAMBIO

[S ]

V máx v

= 1+

[I]

Km

1 (Km + [ S ] )

Ki

v

V máx v

Ki

[S]

Km

V máx

[S]

DISMINUYE

V máx

[I] Ki

DISMINUYE

[S]

= Km +

1+

+

V máx

INHIBICION ACOMPETITIVA

1

1

[I]

1+

=

1+

[I]

1

Km

1

= v

Ki

V máx

[S]

1 1+

+ V máx

[I] Ki

. Fig. 26 - 4. En el lado izquierdo aparece la expresión para Michaelis-Menten y en el derecho para Lineweaver-Burk.

172

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

M i c h a e l i s - M e n t e n L i n e w e a v e r- B u r k e Inhibición Competitiva a

v

Km

b

Vm CTE

Km ap.

1/v

c

s

Inhibición Nocompetitiva

a b c

Km CTE Vm

s

v Vm

s

1/v

c

a = Sin Inhibidor b = Con Inhibidor

v

c = Con 2 x inhibidor

a

b c v/s

1/s v

b a

c

b

c b a

1/v

1/s

a v/s

1/s

Inhibición Acompetitiva

a b c

Km

Km ap.

b a

v

Km= Km ap.

c

Eadie-Hofste

v

a b c v/s

Fig. 27 - 4. Se puede observar aquí los tres tipos de inhibiciones expresadas en los gráficos estilo Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee.

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

RESUMEN DE LAS CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS 1) Son en su mayoría proteínas que bajan la barrera de energía actuando como catalizadores. 2) No afectan la constante de equilibrio de una reacción, solo las velocidades con que estas ocurren. 3) Presentan dependencia de la concentración ya que en pequeñas cantidades producen grandes cambios de velocidad de una reacción. 4) Forman complejos reversibles con el sustrato. 5) No se consumen o modifican en la reacción, es decir se pueden emplear varias veces. 6) Muestran especificidad de reacción esa decir enzimas distintas para distintos sustratos. 7) Son engañadas por los inhibidores, en especial aquellos usados en la quimioterapia. 8) Cada enzima muestra una actividad óptima que depende de temperatura, pH, fuerza iónica, etc. 9) Muchas requieren de cofactores como las vitaminas... 10) Existen de 2000 a 3000 diferentes en cada célula y cada célula de un tejido tiene un conjunto distinto de enzimas. 11) Se involucran en los múltiples pasos del metabolismo intermediario. 12) Se pueden regular por retroalimentación y algunos otros mecanismos. 13) La producción es controlada por los genes. 14) Las enfermedades genéticas son el resultado de la falla de una o más enzimas de una vía metabólica. Volver inicio

174

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO. Las enzimas Láctico Deshidrogenasa (LDH), Glutamato Piruvato Transaminasa (GTP), Glutamato Oxaloacetato Transaminasa (GOT), Creatina Kinasa (CK), son ampliamente utilizadas en el diagnostico clínico (Fig. 28 - 4). En un suero normal no se encuentran presentes estas enzimas, sin embargo la actividad enzimática medida aparece como producto de algunas patologías como son las Lesiones musculares, Infarto al miocardio y otras patologías hepáticas o musculares. En general las enzimas aparecen en la circulación como producto de un aumento indiscriminado en su síntesis o una determinada proliferación celular, un aumento de la permeabilidad de las membranas y por necrosis celular o lisis como se indica en el esquema.

Proliferación Celular

Aumento de la Síntesis

Necrosis celular y Lisis

Activación Enzimática

Actividad enzimática medida

Excreción Urinaria

Inactivación y degradación

Inhibición Enzimática

Aumento de la Permeabilidad de la membrana celular

Remoción metabólica o catabolismo

Por otro lado la actividad enzimática en el plasma, puede ser alterada por factores de activación como algunos metabolitos o fármacos y de inactivación, como es su inhibición o degradación. Entre las enzimas más comunes en el plasma tenemos a: LDH CK GOT GPT GOT GPT

Lesión Muscular Oclusión Coronaria, primera en aparecer Oclusión Coronaria, a las 12 hrs. Oclusión Coronaria, a las 24 hrs. Lesiones Hepáticas, intoxicación con líquidos orgánicos, Hepatitis, Traumas.

Para su determinación se emplean sustratos sintéticos que producen color al reaccionar a concentraciones saturnales y se determina su actividad mediante gráficas de Absorbancia (Densidad Óptica) versus tiempo. De la pendiente de estas curvas se obtiene la velocidad de reacción en DO/t o micromoles de Producto/t. Posteriormente estos datos sé grafican versus las alícuotas de enzima o la concentración de la enzima y el resultado pueden ser

175

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

expresados en Unidades Enzimáticas (UE). Una UE es la cantidad de enzima que forma un micromol de producto en un minuto a 25oC. De esta manera se obtienen las Unidades de actividad enzimática en la alícuota en que se hizo la determinación. La isoenzima que se encuentra en el Corazón es la Creatina Kinasa - Músculo, Cerebro o CK-MB, mientras que la que se encuentra en el músculo esquelético es la CK-MM y la que se encuentra en el cerebro CK-BB. A pesar de que aumenta cerca de un 90% después de un infarto ( 4 a 6 hrs.) llega a un máximo a las 24 hrs. y vuelve a valores normales a los 3 o 4 días, también aumenta ante algún trauma muscular (CK-MM), ejercicio físico, estado postoperativo, cuando hay convulsiones y delirio. LDH también se encuentra en Corazón, pero es menos específica ya que está presente en músculo esquelético, hígado, eritrocitos, riñón y algunos neoplasmas. También puede aumentar por enfermedades a cualquiera de los órganos mencionados y hemólisis. Aumenta a las 24 hrs después del infarto, llega a un máximo a los 3 días y baja a niveles normales en 8 a 9 días. Curso de las enzimas indicadores después de un infarto

CK – MB: Creatina Kinasa isoenzima mixta miocardio - cerebro

Troponina N ode veces que aumenta X7

CK: Creatina Kinasa CK - MB

GOT GOT: Glutámico Oxaloacético Transaminasa

CK

X6 HBDH

X5

HBDH: Deshidrogenasa hidroxibutírica

X4

LDH

X3

LDH: Láctico Deshidrogenasa

X2 Normal

1

2

3

4

5

días

Fig. 28 - 4. Variación de los niveles enzimáticos durante un infarto al miocardio.

Isoenzimas: LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5

presente en Corazón, eritrocitos y corteza renal en sistema Retículo Endotelial presente en pulmones presente en placenta, riñón y páncreas en músculo esquelético e hígado

Últimamente se ha recurrido a detectar la presencia de Troponina I, una proteína contráctil de la miofibrilla que no es una enzima. La isoforma cardíaca es muy específica

176

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Aumenta de 4 a 6 hrs. después del daño, al máximo en 12 a 16hrs y permanece elevada por al menos 10 días.

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14 ) ENZIMAS ALOSTERICAS.

177

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Estas enzimas son moduladas mediante el control de su Km o Vmáx por medio de algún compuesto que se encuentra al inicio o al final de la vía metabólica como lo son las moléculas efectoras que cambian de concentración según el estado del metabolismo (CO2, 2,3 DPG). Al tener varias subunidades la cinética de interacción con el sustrato es regida por una curva sigmoídea que se puede explicar tanto por el modelo Simétrico o el Secuencial que se observa a continuación. El MODELO SECUENCIAL (Fig. 29 - 4) indica que la enzima de varias subunidades al unirse progresivamente a distintas moléculas de substrato, cambia su conformación paulatinamente haciendo que las nuevas moléculas de substrato entren cada vez más fácilmente hasta saturarla. La primera molécula de sustrato entra lentamente, la segunda más fácil y así sucesivamente hasta ocupar todos los sitios activos de la enzima. El MODELO SIMETRICO (Fig. 29 - 4) supone la existencia de dos conformaciones en la enzima, una tensa T con poca afinidad por el sustrato y la otra relajada R de alta afinidad por el sustrato. A medida que el sustrato se une a la forma relajada R que se encuentra en baja concentración, el equilibrio se desplaza hacia esta forma que se une más fácilmente al sustrato hasta convertir toda la forma T en R. MODELO SECUENCIAL

+S

S

+S

S S

+S

S S S

+S

S S

S S

La enzima Oligomérica cambia de conformación al unir sucesivamente a las moléculas de substrato.Cada molécula de substrato que se une a la enzima facilita la entrada de la otra hasta saturarla.

MODELO SIMETRICO CONCERTADO

T

R +

S

S

+

S S S

+S

S S

S

+

S

S S

S S

La enzima Oligomérica existe en dos formas , una relajada R y la otra tensa T el substrato S desplaza el equilibrio hacia la forma relajada que es a la cual se unen sucesivas moléculas de substrato hasta que toda la enzima esta en la forma R y saturada.

Fig. 29 - 4.Ambos modelos explican la cinética del tipo Sigmoideo.

Volver inicio 15) COMPORTAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA

178

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

La Desoxihemoglobina presenta una estructura Tensa debido a los puentes salinos formados por los grupos terminales de sus cuatro cadenas (Ver capítulo de proteínas). En presencia del Oxígeno la estructura tiende a pasar al estado Relajado, en este momento se presenta el efecto cooperativo que se desencadena por la entrada de la primera molécula de Oxígeno. Este efecto hace bajar al Fierro que se encuentra por sobre el plano del anillo Heme, arrastrando con ello a la His proximal. El movimiento provoca un cambio en la estructura terciaria y luego un deslizamiento en la estructura cuaternaria debido a la ruptura de las interacciones electrostáticas entre los grupos terminales de las cuatro cadenas. De esta manera se desplaza el equilibrio del tetrámero hacia la forma Relajada. Este mecanismo aumenta la afinidad de los grupos Heme que se encuentran aún vacíos, después de unirse la primera molécula de Oxígeno favoreciendo la entrada de la segunda y luego de la tercera hasta completar las cuatro. La afinidad por el Oxígeno de la Hemoglobina puede ser modulada a la vez por los cambios de pH, la PpCO2 y la concentración de 2,3 DPG como se dijo en el capítulo de las Proteínas. En la Figura 30 - 4 sé observa el gráfico de la fracción de saturación (Y = v/Vmáx) de la molécula de Hemoglobina versus la presión parcial de Oxígeno (PpO2). Una fracción Y de 1 significa 100% de saturación de la molécula de Hemoglobina y una fracción Y de 0.5 significa 50% de saturación. La curva de saturación es del estilo sigmoídeo y muestra un desplazamiento a izquierda o derecha cuando varían los niveles de los moduladores. Así tenemos que la Hemoglobina desplaza su curva de saturación a la izquierda aumentando su afinidad por el Oxígeno en condiciones de pH 7.6, baja PpCO2 y a la vez baja concentración de 2,3 DPG en el pulmón.

PULMON

Sin DPG

Y

MUSCULO EN ACTIVIDAD

p H = 7,6

p H = 7.2

PpCO 2

PpCO2 2,3 D P G

2,3 D P G

1.0

Fracción de

En ERITROCITO con DPG

Saturación 0.5

20

40

Pp O2 torr

60

Fig. 30 - 4.Curvas de saturación sigmoideas donde se observa el comportamiento de la Hemoglobina a distintos pHs.

El desplazamiento de la curva de saturación hacia la derecha en la figura 30 - 4 indica una disminución de la afinidad por el Oxígeno al liberarse hacia los músculos en condiciones de pH 7.2, a causa de la acumulación de Ác. Láctico como producto final del metabolismo anaeróbico. La PpCO2 es aquí también elevada junto al nivel de 2,3 DPG que es un subproducto del metabolismo de la Glucosa en los tejidos.

179

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

El modulador 2,3 DPG se une a las tres cargas positivas de los residuos de aminoácidos His 2, Lys 82 e His 143 que son aportados por la cadena Beta en la hendidura Beta-Beta o cavidad central del tetrámero. La unión del Oxígeno y el 2,3 DPG son exclusivas, ya que la cavidad central se hace muy pequeña en la Oxihemoglobina como para aceptar al 2,3 DPG: Hb(O2)4 + DPG Hb-DPG + 4O2 La PpCO2 en los tejidos durante el metabolismo intenso se encuentra aumentada con lo que se produce una baja de pH por la reacción: H2O + CO2 HCO3- + H+ DESOXIHEMOGLOBINA OXIHEMOGLOBINA + Hb(H )2 + 4O2 Hb(O2)4 + 2H+ La Desoxihemoglobina presenta mayor afinidad por los protones ya que tiene en ambas cadenas Beta, la Histidina 146 con un pK elevado a consecuencia de la cercanía de un Aspartato. En cambio en la Oxihemoglobina ambas Histidinas en la posición Beta 146 se encuentran libres y su pK baja soltando un protón. De esta manera al disminuir el pH disminuye la afinidad por el Oxígeno y se suelta este hacia los tejidos. Esta particularidad es conocida como el Efecto Bohr. A pesar de que el CO2 se transporta en la sangre como HCO3- parte de este se combina con la hemoglobina y también actúa como modulador alostérico. De esta manera el CO2 interacciona con los grupos Amino terminales no ionizados de la Desoxihemoglobina formando Carbamatos. Estos aductos estabilizan la estructura tensa al formar nuevas interacciones electrostáticas: Hb-NH2 + CO2 Hb(NHCOO-) + H+ Si por alguna mutación la Hemoglobina disminuye el grado de interacción interna se hace más relajada y se une más fácilmente al Oxígeno y su curva sigmoídea se desplaza a la izquierda y se comprime a hiperbólica. Si la unión interna se hace más rígida por otra mutación o como lo es cuando se une al 2,3 DPG, la molécula se hace más tensa y disminuye su afinidad por el Oxígeno y la curva sigmoidea se estira hacia la derecha (Fig. 30 - 4). El comportamiento cinético de la Hemoglobina es claramente mostrado por su efecto Cooperativo que se representa por las diversas curvas sigmoídeas y se puede concluir que esta proteína se comporta en general como el Modelo Simétrico con una cinética susceptible de ser analizada por medio de la expresión de Hill. Volver

al

inicio 16) EXPRESION DE HILL. La cinética de las enzimas alostéricas es del tipo Sigmoídeo. Estas enzimas cuentan con varias cadenas polipeptídicas y a la vez varios sitios activos. El comportamiento de las

180

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

enzimas alostéricas se explica mediante los modelos secuencial o simétrico vistos anteriormente. En este caso se analizará el comportamiento de la Hemoglobina comparado al de la Mioglobina. Ambas no son enzimas, sin embargo se comportan como si lo fueran en su interacción con el Oxígeno. Una de ellas es todo o nada (Mioglobina) y la otra (Hemoglobina) es del tipo modulado. Especialmente por: a) El incremento de 2,3 DPG (2,3 Di-Fosfo-Glicerato) que se une a un bolsillo central con cargas positivas, b) El aumento de la PpCO2 o CO2 que en la forma de bicarbonato –HCO3 se une a los grupos Amino terminales de las cadenas liberando protones para el efecto Bohr y a la vez aumentando la interacción por puente salino al introducir dos cargas negativas. c) La baja en el pH, que también modifica las cargas de los grupos terminales. En general, todos estos efectos hacen a la Hemoglobina más rígida y con menos afinidad por el Oxígeno. Al comparar la cinética de la Mioglobina (fig. 31 – 4), de una sola cadena polipeptídica con la de la Hemoglobina, se puede apreciar las ventajas de tener múltiples subunidades. Estas permiten variar la afinidad o la velocidad máxima de reacción. De esta manera es posible ajustarse a las distintas situaciones que ocurren durante el metabolismo. Las curvas sigmoídeas pueden ser reemplazadas por rectas, para que estas requieran menos determinaciones y puedan ser fácilmente graficadas. De esta manera se resumirá su comportamiento que se encuentra representado por la acción de los distintos sitios activos y sus sitios alostéricos. El Oxígeno se une a la Hemoglobina lentamente al principio para continuar rápidamente hasta alcanzar finalmente en forma lenta la saturación. Esta cinética es indicadora de un comportamiento modulado y la presencia de varios sitios de unión.

Y Hemoglobina

Mioglobina

10 20 30 40 50

PpO2

Fig. 31 - 4. Curva hiperbólica de la Mioglobina y sigmoídea de la Hemoglobina

La expresión para graficar el comportamiento de estas moléculas, se obtiene de la ecuación de Michaelis – Menten. En ella la concentración de sustrato se puede reemplazar por la PpO2, que se puede elevar al número n, de sitios activos o de aquellos sitios susceptibles

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

a que se una la molécula de O2. Este exponente se representa por el símbolo n, conocido también como factor de interacción. n n Vmáx [S] Vmáx [PpO2] v = ----------= -----------------n n Km + [S] PpO250 + [PpO2] La constante Km de Michaelis-Menten se puede homologar por la presión parcial de Oxígeno necesaria para saturar el 50% de la molécula de Hemoglobina con sus cuatro subunidades o PpO250. Al despejar la ecuación anterior, obtenemos: n n v PpO250 + v [PpO2] = Vmáx [PpO2] n n v PpO20 = Vmáx [PpO2] - v [PpO2] n v PpO250 = [PpO2] ( Vmáx - v ) n v [PpO2] ----------------------- = -----------------------( Vmáx - v )

PpO250

En esta ecuación la relación entre la velocidad a cualquiera PpO2 y la Velocidad máxima a PpO2 saturante, se conocerá como Fracción de Saturación, que puede estar representada por Y:

v Fracción de Saturación:

Y = ------Vmáx

Después de este cambio nos dará: Y (Oxihemoglobina) -------------------------------------------1 - Y (Desoxihemoglobina)

n [PpO2] = -----------------------------PpO250

Cuando n es igual a 1, se obtiene la curva hiperbólica de la figura 31-4 y cuando n va de 1 a cerca de 4 se obtiene la curva sigmoídea. Después de estas aproximaciones es posible aplicar logaritmo a toda la ecuación anterior, empezando por la relación entre las moléculas de Oxihemoglobina (Y) y las moléculas de Desoxihemoglobina (1-Y), que también pueden considerarse como el equilibrio químico entre

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Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

las moléculas de Oxígeno que se unen a la Hemoglobina y las que se sueltan. De esta manera se obtiene final mente la ecuación o expresión de Hill:

Log

Y 1-Y

= n Log PO2 – Log P50

La expresión de Hill se encuentra en el gráfico de la figura 32 – 4.

GRAFICO DE HILL Log

Y 1 - Y Mioglobina n=1

n=2.8 Hemoglobina

L o g p O2

Fig. 32 - 4. Gráfico para Mioglobina y hemoglobina junto a la expresión de Hill

Esta expresión se encuentra en función de n veces el logaritmo de la diferencia entre la presión parcial de Oxígeno (PpO2) y la presión parcial necesaria para saturar el 50% de los sitios de la Hemoglobina (PpO250). Una vez deducida la expresión de Hill se puede aplicar en ambas proteínas (Fig. 32 - 4) y se observa que n tiene un valor de 1 para la Mioglobina con un sitio de unión por molécula, mientras que la Hemoglobina en vías de saturación muestra un exponente de 2,8 a 3 y nunca un valor de 4, ya que se obtiene solo un promedio entre las moléculas de Oxígeno que se unen y se sueltan de la Hemoglobina al mismo tiempo. Cuando el valor de Y/1-Y es igual a 1 o cuando se encuentra la Hemoglobina a 50% de saturación entonces el Log Y/1-Y es igual 0 y se obtiene el valor de la PpO250. Este mismo valor es el que cambia bajo el control de los moduladores pH, PpCO2 y 2,3 DPG. En la Figura 33 - 4 se aprecia la aplicación práctica de la expresión de Hill en una enzima alostérica cualquiera. En el ejemplo se determinó el valor del exponente n denominado coeficiente de interacción u orden aparente de la reacción y que es función del número de sitios de unión presentes en la molécula de enzima (n). Las siguientes consideraciones se deben tener en cuenta frente a la expresión de Hill: a) Si la enzima se une con alta afinidad al sustrato el coeficiente de interacción deberá ser igual al número de sitios activos presentes y si la interacción es débil o la enzima no es alostérica su valor será de 1.

183

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

b) Por otro lado si la enzima tiene varios sitios el coeficiente tendrá diversos valores frente a los distintos moduladores que afecten a la enzima. c) Cuando la enzima se encuentra 50% saturada (v = 1/2 Vmáx) o cuando v / Vm - v = 1, el logaritmo de v / (Vmáx - v) es 0 y n log [S]50 = log K 50 dejando finalmente K50 = [S]50n .

Expresión de Hill para una enzima alostérica v Log

Vm

_

v

=

n Log

[S] _

L o g K 50

Determinación de n con una Tabla de Datos obtenida de la interacción de una enzima alostérica con su sbstrato. V m = 500 [S] 5 10 6 10

-4 -4

-4 8 10 10

-3 -3

1 . 5 10 -3 2

10

Log [S]

v

L o g v/Vm - v

- 3.301

55

- 0.914

-3.222

90

- 0.660

-3.097

170

- 0.288

-3.000

250

0

- 2.824

385

0.481

- 2.699

445

0.903

Log

v/Vm - v

1 n = 3.12 0

-1 - 3,5

S 50

Log

- 2,5

[S]

Fig. 33 - 4. Estudio de la cinética de una enzima alostérica con la expresión de Hill.

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17) MODULACION DE ENZIMAS ALOSTERICAS (Fig. 34 - 4).

184

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Cuando el modulador es el mismo sustrato y activa a la enzima aumentando su afinidad por el mismo en el sitio activo o disminuyendo la Km o K50, el efecto se denomina Cooperativo Homotrópico y si es otro compuesto distinto al substrato y también aumenta la afinidad se denomina Cooperativo Heterotrópico. En el caso de que el modulador inhiba a la enzima el efecto es Antagonista y puede ser Homotrópico o Heterotrópico. La modulación puede también afectar a la Vmáx donde esta puede aumentar o disminuir.

v

Aum ento de la

D isminuci[on de la

c onc entrac ión

concen tració n del modulador -

del m odulador +

v

A um enta la Vm

Aum ento de la c onc entrac ión del m odulador +

D isminuci[on de la concentración del modulador -

D ism inuye la V m

D ism inuye la K m

Aum enta

( s )

( s )

la K m

Fig. 34 - 4.Curvas cinéticas producidas por los moduladores.

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18) PURIFICACION DE ENZIMAS.

185

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Al purificar una enzima o una proteína se debe tener claramente definida la actividad biológica que la caracteriza y sus condiciones óptimas de ensayo, tales como pH y temperatura. Si fuera una toxina habría que buscar un ensayo biológico donde manifestara su toxicidad, como ser la dosis letal 50 (Mortalidad del 50% de los especimenes sometidos al ensayo). Este valor se determinaría para evaluar los distintos grados de purificación de la muestra inicial y por lo tanto debiera disminuir a medida que se purifica. Es decir, con una preparación más pura se mata el 50% de los especimenes con menor cantidad de material puro. Por otro lado en el caso de la purificación de una enzima que se encuentra mezclada con varias otras proteínas y enzimas, se puede distinguir del resto siempre que lleve a cabo una reacción específica sobre un determinado substrato. De esta manera no se puede descartar la existencia de otras enzimas como las isoenzimas y aloenzimas. Para distinguir la individualidad de la enzima y su grado de purificación se recurre a los siguientes parámetros: 1) Cuantificación de la proteína en mg/ml. Consiste en emplear un método colorimétrico por el que se determina la cantidad de proteína, de tal manera que se conozca el total de mgs e proteína en la preparación y en cada una de las etapas de purificación. 2) Definición de la Unidad Enzimática, como la cantidad de enzima que catalizará la transformación de una cantidad de sustrato específico en producto bajo ciertas condiciones definidas de temperatura y pH. Por lo tanto 1 U = 1 micromol de substrato consumido/ mg de proteína de la preparación enzimática. 3) Definición de la Actividad Específica como los micromoles de sustrato consumido en un minuto por un miligramo de enzima [1 micromol de substrato consumido por min. X ml o bien se puede expresar como la Unidad de enzima X mg de proteína (1 Unidad = 1 micromol substrato consumido/min). 4) Actividad Total de la enzima expresada como los micromoles de sustrato consumido/min en los mg totales de proteína. 5) El Rendimiento se conoce como la relación entre la actividad enzimática obtenida por cada uno de los pasos de purificación y la actividad total obtenida en la primera etapa. Se obtiene al comparar porcentualmente las Actividades Totales del inicio hasta el final de la purificación. 6) El número de veces que la enzima se ha purificado es la relación entre la actividad específica de la primera etapa de purificación con cada uno de los pasos sucesivos.

TABLA DE PURIFICACION DE UNA ENZIMA GENERICA

186

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Homogenizado Precipitación Cromatografía de Intercambio Iónico –DEAE Cromatografía de Filtración en Gel Electrofocación Isoeléctrica

Volumen Total (ml) 2000 250

Proteína Total (mg) 5000 1000

Actividad Actividad Nº de Puri- % rendiEspecífica Total ficaciones miento (U*/mg) (U*) 10000 2 1 100 4000 4 2 40

50

80

3000

10

10

2000

10

5

1500

37,5

18,8

33,3

200

100

20

300

150

15

U * = Unidad Enzimática = 1 micromol/min a 25 0C. La enzima ejemplo fue aislada en una cantidad de 5 mg y con una purificación de 150 veces y un rendimiento del 15%. El homogenizado inicial se lleva a cabo según el tipo de tejido, en el caso de que este sea fibroso como el músculo se procede en un homogenizador estilo juguera (fig. 35a - 4) o si es blando como riñón se procede en un homogenizador estilo Potter que consiste en un cilindro central que gira dentro de un tubo de vidrio aplastando el tejido contra la pared. En el caso de un tejido blando como hígado, también se emplea un homogenizador formado por un émbolo central y un cilindro (estilo Dounce). Por otro lado se puede recurrir a una prensa donde se pasa el tejido impulsado por un émbolo por dos láminas con múltiples perforaciones, pero de distinto tamaño para retener el tejido conjuntivo. El homogenizado debe permanecer a 4ºC en un tampón al pH adecuado a la enzima. En cada una de las subsecuentes etapas se extraen alícuotas para determinar la concentración de la proteína y su actividad específica. Se debe tener el cuidado de no formar espuma durante la preparación ya que significa proteína denaturada. La precipitación del homogenizado se efectúa mediante una solución saturada de sulfato de amonio y la enzima puede estar en la fracción precipitada o sobrenadante. Si la enzima está en el precipitado se procede a dializar para extraer el exceso de sulfato de amonio junto con tomar las alícuotas respectivas y prepararse para la columna de intercambio iónico en la siguiente etapa de purificación. El DEAE -Celulosa (fig. 35b - 4) es una matriz de celulosa con grupos Dietilaminoetilo de carga positiva y por lo tanto se fijarán a la columna todas las proteínas de carga negativa a un determinado pH.

187

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

HOMOGENIZADORES

a)

HOMOGRNIZADORES

Potter

b)

Dounce

Blendor

Prensa

Cromatografía de Intercambio Iónico

c)

Cromatografía de Filtración en Gel

CH

2 5

Celulosa

N

+

CH

2 5

CH 2

Partícula de Dextrano

5

DEAE - Celulosa

d)

Electrofocación Isoeléctrica

e)

Electroforésis -

+ pH

-

+

3 4 5 6 7 8 9

+

Fig. 35 - 4. a) Homogenizadores b) Cromatografía de Intercambio Iónico c) Cromatografía de Filtración en gel. d) Electrofocación Isoeléctrica e) Electroforesis.

La elución se lleva a cabo variando el pH o cambiando la concentración salina del tampón de elución de esta manera el cambio de carga en la superficie de la enzima como respuesta al pH o los iones de la sal que se interponen entre las cargas permiten la salida fraccionada de las proteínas, entre las cuales estará la enzima. Esta última puede ser detectada al analizar los distintos fracciones eluídas. Suponiendo que la enzima se ha purificado un cierto número de veces, pero que aún no está pura del todo se procede a la cromatografía de filtración en gel (Fig. 35c - 4) donde se produce la separación de las proteínas por su distinto tamaño molecular. La fase sólida de la columna está formada por partículas de Dextrano o Acrilamida que son polímeros de cadena larga que a su vez se pliegan sobre sí mismo, formando huecos de distintos tamaños para que pasen las proteínas. Las proteínas más grandes pasarán por fuera y eluirán antes de la columna, mientras que aquellas de menor tamaño pasarán por los huecos y tendrán un camino más largo que recorrer separándose de las anteriores. De esta manera si la enzima salió de la columna de intercambio iónico mezclada con otras proteínas de igual carga, ahora se podrá separar ya que debe tener un tamaño distinto al de las proteínas contaminantes. Por último se procede con la Electrofocación Isoeléctrica (Fig. 35d - 5) donde se emplea una matriz sólida formada por Dextrano la que se encuentra cargada con distintos tampones para obtener un gradiente de pH desde el valor 3 a 9. Se aplica la mezcla de proteínas a purificar en el centro a pH 7 y luego se conecta un campo eléctrico en ambos extremos del gradiente.

188

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

Las proteínas migrarán de acuerdo al campo eléctrico y a la carga que posean deteniéndose cuando se muevan sobre un pH que las haga alcanzar su punto isoeléctrico. De esta manera se producirán distintas bandas, tanto de proteínas contaminantes que han alcanzado su punto isoeléctrico como de la enzima que se pretende aislar. La enzima se supone purificada cuando a pesar de sucesivas etapas de purificación la actividad específica permanece igual. Por otro lado se puede ratificar la pureza mediante la técnica de Electroforesis (Fig. 35e - 4). Esta última consiste en la separación de proteínas a un determinado pH en una matriz sólida polimerizada formada por Acrilamida o Agarosa, la que se encuentra embebida en un tampón. Estas matrices son sometidas a un campo eléctrico donde se obtiene la separación de las proteínas debido a sus cargas y tamaño molecular. Cuando se detecta solo una banda de proteína como responsable de la actividad enzimática se asume como purificada.

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189

al

Héctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

15) REFERENCIAS Enzimología, O. Viratelle. Ediciones Omega, Barcelona 1976 Outlines of Biochemistry Conn,E.E. ,Stumpf ,P.K. Bruening,G. and Doi, R. H., John Wiley & Sons , 1987 Problemas e Exercícios em Bioquímica, Emilio y Ottilia Mitidieri, Editorial Interciencia (Brasil). Río de Janeiro, Brasil, 1978. Energy, Enzymes and Catalysis Problem Set http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/energy_enzymescatalysis/energy_enzymes-catalysis.html

190

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

AMINAS DE LA VIDA VITAMINAS 195 IMPORTANCIA DE LAS VITAMINAS EN EL CEREBRO 196 CLASIFICACIÓN DE LAS VITAMINAS 196 VITAMINAS HIDROSOLUBLES 196 1) NIACINA O VITAMINA PP O B3 197 2) RIBOFLAVINA O VITAMINA B2 200 3) TIAMINA O VITAMINA B1 203 4) BIOTINA O VITAMINA H 206 5) COBALAMINA O VITAMINA B12 208 6) AC. FOLICO O VITAMINA Bc O B9 7) PIRIDOXINA O VITAMINA B6

217

8) AC. ASCORBICO O VITAMINA C VITAMINAS LIPOSOLUBLES 1) VITAMINA A

213

219

221

221

2) VITAMINA D 224 3) VITAMINA E 226 a) EL OXIGENO COMO FUENTE DE RADICALES LIBRES

229

b) LOS LÍPIDOS COMO BLANCO DE LOS RADICALES LIBRES 4) VITAMINA K

232

193

230

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

VITAMINAS.

194

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

El metabolismo intermediario de plantas y animales presenta una serie de reacciones de distinta naturaleza durante la degradación y síntesis de las moléculas. Algunas de estas reacciones pueden ser de Carboxilación, Oxidación, Fosforilación, etc. Todas ellas se caracterizan por ser catalizadas enzimáticamente, es decir una proteína con un sitio activo catalítico se une a un substrato bajando la barrera de energía de la reacción con lo cual aumenta la velocidad del proceso hacia la formación de un producto, siempre que la reacción sea termodinámicamente factible. En algunas de estos casos las reacciones necesitan de moléculas que aporten energía y en otros casos de moléculas que tomen la energía disipada por la reacción. A pesar de los principios enunciados anteriormente, aún no son posibles algunas reacciones a pesar de ser termodinámicamente factibles y de que cuentan con la enzima adecuada, la concentración de substrato y las condiciones de pH y temperatura necesarias. Parece ser en estos casos, que el sitio activo de la enzima requiere de una cierta capacidad extra, que no posee el conjunto de aminoácidos que lo forma a pesar de su disposición espacial para enfrentar al substrato. En otras palabras, existe la carencia de una cierta actividad extra requerida por el sitio activo y esta falta es suplida por la presencia de una pequeña molécula, denominada COENZIMA. La Coenzima participa de la catálisis en el sitio activo y permanece al final de la reacción inalterada. Esta molécula no se encuentra estructuralmente relacionada con los aminoácidos y solo se asocia al sitio activo por medio de enlaces que pueden ser de tipo covalente, electrostático o enlace hidrógeno. Sus funciones son bastante variadas y puede participar en la transferencia de protones, tanto en la Oxidación como la Reducción del sustrato, así como también puede inducir su polarización electrónica o transferir un grupo químico desde un sustrato a otro. Es posible que la coenzima también intervenga en la introducción de nuevos grupos funcionales al sustrato, etc. Las Coenzimas se necesitan a todo nivel metabólico y son sintetizadas por bacterias, levaduras y plantas, pero no en los mamíferos con la excepción de los rumiantes, donde la flora bacteriana de sus estómagos segmentados es capaz de sintetizar suficiente vitamina para sus necesidades. En humanos y algunos animales las vías metabólicas de la síntesis de estos compuestos no están representadas por genes ya que estos últimos se han perdido total o parcialmente, debido a que las vitaminas han estado presentes en la dieta durante gran parte del proceso evolutivo. A su vez las Coenzimas son derivados de las VITAMINAS que se encuentran distribuidas en los alimentos y a la vez se encuentran presentes en el organismo, si es que la dieta es balanceada. Todas las vitaminas al ser empleadas como Coenzimas requieren de algunas modificaciones en su estructura, que comprenden reacciones de fosforilación, adenilación, metilación, etc. El nombre de VITAMINA fue puesto por Kasimer Funk al descubrir que una Amina cuaternaria en la cáscara del arroz, era esencial para la vida. Su carencia se produjo a consecuencias de la revolución industrial a principios del siglo XX, cuando se crearon máquinas que permitían sacar la cáscara al arroz. Como la dieta de los Orientales consistía mayormente en arroz, se provocó la enfermedad denominada Beri-Beri, que se curaba al beber una infusión de la cáscara misma. Otra enfermedad conocida desde tiempos antiguos y que afectaba principalmente a marineros y piratas durante la época de los barcos a vela, fue el Escorbuto. Esta dolencia se erradicó durante el siglo XIX mediante el consumo de jugo de limón por los tripulantes durante sus largas travesías. Volver al inicio IMPORTANCIA DE LAS VITAMINAS EN EL CEREBRO.

195

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

El cerebro por su metabolismo, es el órgano que hace mayor consumo de vitaminas tanto por sus neuronas como sus células gliales. Así tenemos que la Tiamina (B1), Riboflavina (B2), la Niacina (PP o B3) junto al ácido Pantoténico son necesarias en los procesos bioquímicos relacionados con la degradación de la Glucosa y producción de ATP, durante su funcionamiento normal. Por otro lado durante la vida fetal son indispensables el ácido Fólico (B9) y la Cobalamina (B12), que intervienen en la síntesis de DNA y consecutivamente en el crecimiento del cerebro. Durante la etapa de mielinización, las células ya no se dividen, pero es necesaria la vitamina B12. Por otro lado el Ác. Fólico interviene continuamente en la transferencia de Metilos durante la síntesis de neurotransmisores como la Dopamina, Serotonina y Epinefrina. De esta manera, la falta de Vitamina B12 y ácido Fólico (Vitamina B9) acarrea trastornos nerviosos tanto al cerebro del individuo en desarrollo como el adulto, por falta de mielinización y carencia de neurotransmisores. La vitamina B1 o Tiamina es necesaria para la síntesis de la Acetil Colina y ocurre que durante la enfermedad denominada Beri-Beri los niveles de este neurotransmisor se encuentran disminuidos, siendo en parte responsable de los trastornos neurológicos que la acompañan. La vitamina B6 o Piridoxina es la responsable de la síntesis de otros neurotransmisores como Dopamina, Serotonina y GABA (γ-Amino-Butírico). Su falta provocada por la presencia de anticonceptivos orales que actúan como antagonistas de la vitamina, puede provocar convulsiones por déficit de estos neurotransmisores. Más aún se ha detectado que las vitaminas C y E protegen a las estructuras del cerebro de la acción de los Superóxidos (O2-) y Superhidroxilos (OH.) conocidos como radicales libres. Estos compuestos son capaces de destruir estructuras celulares especialmente lípidos poliinsaturados, como aquellos que se encuentran en la mielina. Volver

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inicio CLASIFICACION DE LAS VITAMINAS En la actualidad las Vitaminas han sido identificadas en su totalidad junto a su mecanismo de acción, pero aún persisten moléculas similares consideradas candidatos a vitaminas como son la Colina, el Inositol, ácido Lipoico, etc. Las Vitaminas se dividen en dos grupos: a) Solubles en agua: 1) Niacina 2) Riboflavina 3) Tiamina 4) Biotina 5) Cobalamina 6) Ác.Fólico 7) Ác. Ascórbico 8) Piridoxina

b) Insolubles en agua:

196

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

1) Vitamina A con sus vitámeros o formas similares conocidas como Retinal, Retinol y Retinoico. 2) Vitamina D con sus vitámeros Ergocalciferol, Colecalciferol, 1,25-di-OH-Colecalciferol. 3) Vitamina E o α-Tocoferol. 4) Vitamina K con vitámeros como Filoquinona o Menaquinona. Volver

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inicio VITAMINAS HIDROSOLUBLES 1) NIACINA o B3. En 1912 Funk lanzó la hipótesis de que el factor conocido desde 1867 por los químicos como Ác. Nicotínico, curaba un mal denominado Pelagra (del italiano “pelle agra”, que significa piel agria). Esta enfermedad era conocida desde el siglo XVIII en Italia y se caracterizaba por la presencia de las 3 Ds, Dermatitis (úlceras cutáneas escamosas), Diarrea (inflamación de la mucosa intestinal) y Demencia (esquizofrenia o falta de procesamiento correcto de la información). La Pelagra se difundió, en Europa desde que se llevó el trigo del Nuevo Mundo y se le empleó como cereal. El problema aparece cuando durante su tratamiento para hacerlo comestible, no se empleó el agua de cal como se hace en México haciendo biodisponible al aminoácido Triptófano precursor de la Niacina, antes de preparar las tortillas. El Ác. Nicotínico recibe el nombre actual de NIACINA y su otra forma con un grupo amido es denominada NIACINAMIDA (Fig. 1 - 5).

H

H O

C HC

C

C

HC

OH HC

+

O

C C

C N H2

CH

HC

N

+

CH

N

Ac. Nicotínico

Nicotinamida

NIACINA

NIACINAMIDA

Fig. 1 - 5. Estructura de la Niacina y la Niacinamida.

En la forma de Coenzima, la Niacinamida (Fig. 2 - 5) se encuentra unida a otras moléculas como un Dinucleótido: NIACINAMIDA-RIBOSA-FOSFATO-FOSFATO-RIBOSA-ADENINA y se denomina NIACINAMIDA DINUCLEOTIDO o NAD.

197

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Otra forma de la Coenzima se encuentra unida a un grupo fosfato en el carbono 2' de la Ribosa del Ác. Adenílico y se denomina NADP o NIACINAMIDA DINUCLEOTIDO FOSFATO. Ambas moléculas NADP y NAD con y sin el grupo 2´- Fosfato respectivamente, participan en reacciones de oxido-reducción y se caracterizan por tomar o donar protones a los substratos en reacciones catalizadas por las siguientes enzimas: ENZIMAS VIAS METABOLICAS 1) Glutámico Deshidrogenasa 2) 3-P-Gliceraldehido Deshidrogenasa 3) Láctico Deshidrogenasa 4) Piruvato Deshidrogenasa 5) Isocitrato Deshidrogenasa 6) α-Cetoglutarato Deshidrogenasa 7) Malato Deshidrogenasa 8) L (+) Beta -OH Acil-SCoA Deshidrogenasa 9) β-Cetoacil-SCoA Reductasa 10) α,β- Acil-SCoA Reductasa 11) Glutámico Deshidrogenasa

BASE NITROGENADA

Metabolismo Aminoácidos Glicólisis Glicólisis Entrada al Ciclo Tricarboxílico Ciclo Tricarboxílico Ciclo Tricarboxílico Ciclo Tricarboxílico Beta Oxidación de Ácidos Grasos Síntesis de Ács. Grasos Síntesis de Ács. Grasos Metabolismo de los Aminoácidos

H O

C HC HC O FOSFATO

O

P

CH

O

2

H O O

OH

HO

FOSFATO

P

O

O

CH 2

+

NH2

CH

N

BASE NITRO NITROGENADA

H

NH

H

H

O

C

C

N

C

H

N

C

C

H O H

o NADP

: Niacinamidadenin dinucleótido :

N

H

H HO

NAD N

RIBOSA

O

2

C

Niacinamidadenin dinucleótidoFosfato

O O

P

O

RIBOSA

O HH

Fig. 2 - 5. Estructura de las Coenzimas NAD y NADP.

198

AL ADICIONAR FOSFATO AL 2' OH

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

La Coenzima NADP se reduce, tanto en la Vía de las PENTOSAS, como en la reacción catalizada por la enzima Málica (Pág. 277, Fig. 12 - 9). Posteriormente se oxida, en la síntesis de ácidos grasos y colesterol. En cambio la coenzima NADH + H entrega directa o indirectamente protones al Complejo I de la Mitocondria representado por la NADH Deshidrogenasa en la Cadena de Transporte de Electrones. En este lugar debido al elevado potencial de Oxido-Reducción (-0,32 volt), conque se oxida NADH + H, la reacción es lo suficientemente exergónica para generar a lo largo de la cadena un gradiente quimiosmótico entre un compartimiento y otro, el que finalmente disipa parte de su energía como calor y el resto la emplea en la síntesis de ATP. El aminoácido Triptófano mediante una vía que emplea PALP puede ser convertido a Niacina en el hombre, de tal manera que la ingesta repetitiva de alimentos faltos en triptófano, como el maíz, empleado en algunas culturas nativas (México), puede acarrear la enfermedad conocida como Pelagra. La falta de Piridoxina y la subsecuente Coenzima PALP también puede acarrear pelagra ya que 60 mg de Trp son necesarios para producir tan solo 1 mg de Niacina. En cambio los cereales no refinados, la levadura y las carnes de vaca, cerdo y conejo son ricas en Triptófano y por ende en Niacina. La forma oxidada de la Coenzima en su anillo piridínico tiene carga + y puede aceptar un Hidrúro o Hidrógeno con carga negativa, es decir acepta dos electrones. Las posiciones a ocupar pueden ser la 2, 4 o 6 (Fig. 3 - 5), pero durante la estabilización por resonancia del compuesto, se prefiere la posición 4. Mientras que el segundo protón del sustrato queda siempre en solución. HIDRURO

H

H H

H O C HC

C

C

HC

H O C

C

C

NH HC + C H N

2

CH

HC

NH 2

N

Fig. 3 - 5. Mecanismo de acción de la Coenzima NAD o NADP.

En el animal la carencia de esta vitamina produce una inflamación y ulceración de mucosas del hocico y del esófago con una pigmentación azul oscura en la punta y borde de la lengua. Se produce también una deformación de los huesos de las patas y una anemia normocítica. En el hombre, la enfermedad de Hartnup por ejemplo se caracteriza por un sarpullido en la piel, que se hace sensible a la luz, además de hiperqueratosis, ataxia cerebelar, inestabilidad emocional y aminoaciduria. Se observa una disminución de la absorción del Triptófano junto a otras α-aminoácidos, debido a problemas en su abosorción tanto en el intestino como durante la reabsorción que se efectúa en el riñón.

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199

al

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

2) RIBOFLAVINA o B2 Esta vitamina se identificó por la década de 1930 y esta formada por un triple anillo nitrogenado de Isoaloxacina denominado Flavina, el que es inestable a la luz UV y se encuentra unido a una Ribosa o Ribitol, que es un alcohol polihidroxílico (Fig. 4 - 5). Ambas moléculas al estar unidas forman la Riboflavina. Se le encontró primero en la leche, luego en la cáscara de los cereales, carne de vacuno, pescados y huevos. Esta vitamina es sintetizada originalmente por plantas y microorganismos. O

H C

HC 3

C

C C

N

C

HC 3

C

C

C

N H

C

Isoaloxacina

C

N

N

O

H

RIBOFLA -

H

C

H

VINA

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

C H

Ribitol O O

2

P

Fosfato

O H

OH

Fig. 4 - 5. Coenzima Flavina Mononucleótido.

F A D : Flavin Adenina dinucleótido O

H HC 3

HC 3

C C

C

C

C C

C

N

C

N H

C

C

N

N

Isoaloxacina O

H

RIBOFLA -

H

C

H

VIN A

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

C H

2

N H2

Ribitol O O

N

O

P

O

P

O

C H

N

2

C C

N

C

C N

OH

OH

O

Fosfatos

Adenina

H HO

OH

Ribosa Ac. Adenílico

Fig. 5 - 5. Estructura de la Coenzima FAD

200

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

La forma molecular de la Vitamina puede ser fosforilada, (Fig. 4 - 5) para formar a la Coenzima denominada Flavina Mono Nucleótido (FMN). Esta última puede ser también adenilada para constituir una nueva Coenzima de nombre Flavinadeninadinucleótido (FAD) (Fig. 5 - 5). Ambas Coenzimas participan en el metabolismo intermediario en reacciones de Oxido-Reducción, capturando dos protones y dos electrones de los sustratos, los que se guardan en el anillo de Isoaloxacina, (Fig. 6 - 6).

La parte activa de la molécula se encuentra en el recuadro oscuro HC 3

C C

C

C HC 3

N

C C

H

O

H C

C NH

C N

O

H

+ + 2H + 2e

C N

HC 3

C C

C C

HC 3

O

H

N

C C

C C

NH

C N

C N

O

H H

R

R REDUCIDAES INCOLORA

OXIDADAES COLORAMARILLO

Fig. 6 - 5. El anillo de la Coenzima acepta reversiblemente dos protones y dos electrones.

Tanto FMN como FAD son agentes oxidantes superiores a NAD y NADP+ . Pueden participar en reacciones con Radicales Libres, con metales e incluso directamente con el Oxígeno a nivel de los Peroxisomas, durante la Oxidación de ácidos grasos (Ver Cap. Metabolismo de Lípidos). Algunas de las enzimas en que interviene la Coenzima FAD son: ENZIMAS

VIAS METABOLICAS

1) Succinato Deshidrogenasa

Oxidación α, β de Ács Dicarboxílcos en el Ciclo Tricarboxílico 1ª Etapa de la β-Oxidación de Ács. Grasos Oxidación a la entrada del Ciclo Tricarboxílico De Hemiacetal a Lactona o desde β-D-Glucosa más O2 a D- Glucono-1,5 Lactona más H2O2

2) Ácido graso Deshidrogenasa 3) Piruvato Deshidrogenasa 4) Glucosa Oxidasa

5) Glicolato Oxidasa

Desde un Alcohol a un Aldehído

6) Aminoácido Oxidasa

Desde un D-Amino a α-Iminoácido y posteriormente a α- Cetoácido

7 ) Diaforasa

Desde NADH o NADPH a NAD o NADP respectivamente

201

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Las coenzimas FMN y FAD se encuentran también como grupos prostéticos de los transportadores denominados Flavoproteínas, que después de tomar los protones de una reacción de oxidación los pasan al Complejo III de la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria. Parece ser que el Potencial Redox (Eº´) (Ver Cap. Cadena de Transporte de Electrones) o la capacidad de donar u aceptar protones y electrones por la Coenzima FAD, no es fija y varía según esté unida a una enzima o se encuentre libre. Esta propiedad depende a su vez de la resonancia de los electrones pertenecientes al triple anillo (fig. 6 - 6). Al estar reducida la capacidad de resonancia se pierde. Su Eº´ depende entonces, de la cantidad de resonancia que perdure después de la unión a una enzima. Si la forma oxidada (FAD) se une débilmente y la reducida (FADH2) fuertemente, tiende a permanecer reducida en comparación con la Coenzima FAD libre y el Potencial Redox (Eº´) será menos negativo o con menos capacidad de donar electrones. Si la forma Oxidada (FAD) se une fuertemente y la reducida (FADH2) débilmente a una enzima, la Coenzima tiende a permanecer oxidada o con más capacidad de donar electrones al compararse con la coenzima libre. Esto ocurre en la reacción del complejo de la Piruvato Deshidrogena. En este caso dona protones y electrones al NAD, en vez de recibirlos de este (Ver más adelante en la Vitamina Tiamina). En el hombre la carencia de Riboflavina se debe a la falta de consumo de productos animales y se asocia a trastornos cutaneomucosos con lesiones en las zonas de unión entre la piel y mucosas. En la cara aparece una dermatitis seborreica y en los labios se forma una costra exudativa acompañada de una lengua color rojo magenta. Sin embargo, estos signos no son específicos y pueden encontrarse en otros tipos de avitaminosis. En el animal también aparecen lesiones cutáneo mucosas, inhibición del crecimiento, hipersalivación y lagrimeo acompañado de sensibilidad a la luz, conjuntivitis, calambres y elevada mortalidad neonatal.

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202

al

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

3) TIAMINA Fue aislada por Funk en 1910 de la cutícula del arroz, sin embargo la enfermedad que produce su carencia, el beri-beri se conocía en China desde el 2600 AC. La vitamina esta formada por una Piridina unida por medio de un Metileno a un anillo Tiazólico, (Fig. 7a - 5). NH 2 Metileno C

a) N

C

C

C

HC 3

H C

S

CH N 2 C

C

+

CH

N

O CH CH 2 2

O–P–O–P–O O

3

4 - METIL - 5 – HIDROXI ETILTIAZOL

2,5 DIMETIL- 4 AMINOPIRIMIDINA

O

O

Pirofosfato

b) PIRUVATO CON DIFERENCIALES DE CARGA + Y O δR

C δ+

OH

COOH H+

R1

+N

C C

ACETALDEHIDO

ACETALDEHÍDO ACTIVADO

R

C

+

C

S C

R2

R1

CH 3

O

OH COOH S

N C

C

R2

CO 2

R

C

+

C

S

C

C

R1 N

CH 3

CH 3

Carbanión en el Anillo TIAZOLICO

R2

R1

H

R

C H

+N

C

S

C

C

R2

CH 3

Fig. 7a - 5. Estructura de la Vitamina B1 o Tiamina. La coenzima presenta un Pirofosfato en el extremo OH del anillo Tiazólico y se denomina Tiamina Pirofosfato o TPP. Fig. 7b - 5. Mecanismo de acción de la Coenzima TPP. Eliminación del grupo Carboxilo como CO2

La coenzima participa en descarboxilaciones (Fig. 7b - 5) y transcetolaciones. La TPP puede ser considerada como una coenzima portadora de aldehídos activados. Su mecanismo de acción es por medio de la formación de un Carbanión en el anillo tiazólico al soltar este un protón, enseguida este carbanión se une a los grupos Cetos, debido al diferencial de carga positivo en el carbón Ceto y este diferencial de carga negativo en el Oxígeno electronegativo. Una vez formado el aducto este pierde el CO2 quedando el 2-hidroxietil derivado que abandona la coenzima como un aldehído quedando esta última inalterada como al principio. En la reacción del Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa, (Fig. 8 - 5) la enzima Piruvato Descarboxilasa emplea a la Coenzima TPP en la reacción de descarboxilación para formar un Acetaldehído transitorio. Este es posteriormente entregado al ácido Lipoico para que lo pase a otra Coenzima conocida como la Coenzima A. Una reacción similar a esta es la descarboxilación del Ác. α-cetoglutárico en el CTC donde participa la misma coenzima TPP.

203

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa CH-CO-COOH 3

T P P

1 CO 2

CH-CO - S 3 HS

OH

2

CH-C-T P P 3

2 : 3 :

H S

S L

H

1 :

L

L

H S

S

Piruvato

3

Descarboxilasa

FADH

FAD

2

Dihidrolipoil Transacetilasa

NAD

NADH + H

Dihidrolipoil Deshidrogenasa

Fig. 8 - 5. Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa en la mitocondria.

En el hombre la Tiamina es parcialmente sintetizada por las bacterias del intestino, pero la cantidad no es suficiente para satisfacer las necesidades y por lo tanto debe estar en la dieta. La forma activa de la coenzima es la fosforilada o la conocida como Tiamina Pirofosfato (TPP). La Tiamina se encuentra en la mayoría de los tejidos animales y vegetales. Su déficit produce acumulación de Ác. Pirúvico e incluso de Ác. Láctico en la sangre, acarreando una serie de trastornos en el metabolismo de los Hidratos de Carbono. La carne de pescado crudo posee una enzima conocida como Tiaminasa, que destruye a la vitamina y en aquellos países donde se le consume de esta forma se observa una elevada incidencia de Beri-Beri. El síndrome de Wernicke-Korsakoff es un desorden autosómico recesivo que es más común en los Europeos que en los Asiáticos, ya que estos últimos son aún capaces de resistir dietas deficientes en Tiamina. Ocurre aquí que los pacientes presentan fibroblastos con una menor afinidad por la Tiamina y se les debe suministrar una mayor cantidad de la vitamina, ya que la Transcetolasa (fig.9 - 5) de la Vía de las Pentosas la une con 10 veces menos afinidad que la normal. En estos casos, no se pueden reintegrar a la Vía de la Glicólisis como Fructosa-6-P, el exceso de productos de la vía de las Pentosas (Ribulosa-5-P transformada por Epimerasa en Xilulosa-5- P y Ribosa-5-P) tanto en el Hígado como en el Tejido Adiposo y Glándula mamaria. Este síndrome también afecta a los Alcohólicos, lo cual se debe a dietas generalmente ricas en carbohidratos que aumentan la demanda de Tiamina durante su metabolismo y a la

204

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

inhibición por el alcohol de una ATPasa implicada en la absorción de la vitamina desde el intestino. En general la persona aquejada presenta confusión, daño en el sexto nervio ocasionando oftalmoplejia (parálisis en el nervio motor del ojo) y nistagmus u oscilación rítmica de los ojos, todo esto es acompañado de psicosis, temblores en las manos, labios caídos, mirada extraviada e incapacidad para desplazarse correctamente y retener en la memoria hechos cotidianos.

Transcetolasa + Tiamina Profosfato

CH2OH H-

=O

=O

O H-

HO - - H

+ H - - OH CH2PO3 Xilulosa-5-P

H - - OH

Eritrosa-4-P

5 Carbones

+

Xilulosa-5-P

CH2PO3

O

HO - - H H - - OH

+

H - - OH -2

CH2OH

H - - OH -2

CH2PO3

-2

H - - OH -2 CH2PO3

Gliceraldehido-3-P Fructosa-6-P

4 3 Carbones Carbones Transferencia de 2 Carbones

Eritrosa-4-P

6 Carbones

+

Gliceraldehido-3-P Fructosa-6-P

Fig. 9 – 5. Transcetolasa de la Vía de las Pentosas

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205

al

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

4) BIOTINA. Se la aisló de la yema de huevo en 1931 y se la sintetizó en 1942, (Fig. 10 - 5). En 1940 se demostró que un factor termolábil presente en la clara de huevo, la glicoproteína Avidina presentaba una gran afinidad por la biotina de la yema impidiendo las reacciones enzimáticas en que participaba la biotina. Por lo tanto la ingestión de huevo crudo no aporta provecho vitamínico en este aspecto. La Biotina se encuentra asociada a una serie de enzimas que intervienen en la carboxilación de los sustratos como se muestra aquí: ENZIMAS 1) Piruvato Carboxilasa 2) Acetil CoA Carboxilasa 3) Propionil CoA Carboxilasa

VIAS METABOLICAS Gluconeogénesis Síntesis de Ács. Grasos Entrada de los restos de Ács. Grasos de cadena impar al Ciclo Tricarboxílico Catabolismo de la leucina

4) β-Metil Crotonil CoA Carboxilasa

La Biotina es importante para el metabolismo de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas al intervenir en reacciones de carboxilación y transcarboxilaciones.

La parte activa de la molécula aparece con un recuadro O C H

N

N

H

H

C

C

H

HC 2

CH S

CH

CH

(

CH 3

)

2

C OOH O

BIOTINA TIPO α

C H

N

N

H

H

C

C

H

HC 2

CH S

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

C OOH

BIOTINA TIPO β

Fig. 10 - 5. Estructura de la Biotina Alfa en la clara de huevo y de la Biotina Beta en

la carne de vacuno.

206

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

La Coenzima se une covalentemente a una Lisina de la enzima huésped mediante su grupo carboxilo y durante la reacción toma un grupo carbonilo activado con ATP en la forma de Carbonil-Fosfato para ser luego entregado al sustrato de la reacción (Fig. 11 - 5) Su carencia es caracterizada por dermatitis escamosa con una piel grisácea acompañada de sequedad piel y mucosas. La carencia se asocia con anorexia, náuseas y postración. O

ATP

HCO 3

+

Mn

HO P

O

O

ADP

+

O C O

Parte activa de la molécula

O

O

O O

C

C

C

H

N

N H

H

C

C H

HC 2

S

BIOTINA

O

+

C H C H C H (C H) 3 2 CO NH

H

H O P O

O O

C O

N

N H

C

C

HC 2

CH S

BIOTINA

ENZIMA

H C H C H (C H) 3 2 CO NH ENZIMA

BIOTINA cargada con un carbonilo

Fig. 11 - 5. Mecanismo de acción de la Biotina.

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5) COBALAMINA.

207

al

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Solo en 1955 se logró determinar su estructura química, aunque se le conocía desde 1925 como un factor aislado a partir de hígado de ternera capaz de curar la anemia perniciosa. La Cobalamina es una vitamina sintetizada exclusivamente por las bacterias intestinales de los rumiantes, siendo posteriormente almacenada en el hígado. La ingesta de una dieta que incluye carne de rumiantes, leche y queso, se considera adecuada como fuente de vitamina B12 en el hombre. Los vegetales no tienen vitamina B12. La estructura de la vitamina consiste en un núcleo tetrapirrólico con un átomo de Co en su centro unido por cuatro nitrógenos. A esta estructura se le denomina anillo de CORRINA. El Co se encuentra coordinado por debajo de este anillo, a uno de los Nitrógenos pertenecientes al complejo formado por la 5,6-Dimetil-Bencimidazol Ribosa Fosfato. El otro punto de unión de este complejo al anillo es lateral y ocurre por medio del 3' Fosfato y el Aminoisopropanol, unido a uno de los anillos pirroles (Fig. 12 - 5).

H

H O OH OH N

5' Deoxiadenosina

N H

N

H

CH

2

O

N

NH C

O HN 2

N H2

C CH 2

2

CH 2 CH 2

HC 3

O

H CH CH

O

Anillo

CH C

de Corrina o

2 2 HC 3

Tetra -

N

CH 3

CH CH 2

2

CH

2 CH

2

O

2 C NH

CH 3

CH

N H2

H

3

O C

5 , 6 - Dimetil - Beicimidazol Ribosa Fosfato

CH

+3 Co

H

CH

HN 2

C

N N N

HN 2

pirrol

3

O N N

H

O OH

3

P

O

Amino

CH O

O

C H

CH 3

Iso - Pro panol

H CH OH

2 H

H

Fig. 12 - 5. Estructura de la vitamina B12 o Cobalamina Deoxiadenosina.

cargada con una

5´-

Para la absorción de esta vitamina se requiere del factor intrínseco, que es una glucoproteína secretada por las células parietales del estómago. Cada molécula de glucoproteína fija dos moléculas de vitamina B12, evitando la degradación de esta. Una vez fijada, pasa al intestino donde se une a receptores específicos del ileón. En esta porción del intestino se libera y entra a la célula intestinal pasando enseguida a los microsomas donde se transforma en coenzima B12 o 5-deoxicobalamina.

208

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

O H C O P

O

H O H

O HC P

N H

H

O

P

F o rm il -

R ib o n u c le ó tid o

3

P

O

C

H

H

O

O H

- 4 - c a rb o xa m id a

O

H N 2

H O H

im id a zo l

O H O H G lic in a m id a R ib o n u c le ó tid o

7, 8 D ihid ro F o la to T im id ila to S inta s a

T H F

N 10 F o rm il TH F

N

O

H C

N - F o rm ila m in o

P

P

N

2

P

P

O

O H

N AD P H + H

O

H N 2 P

N H

O

H C 2

H

5 - A m in o im id a zo l

N 10 F o rm il TH F

H C O

O

H C 2

R ib o n u c le ó tid o

+

dTM P

N

H

O H

N H

O

H N

P

T H F

G lic in a m id a

N

H N 2

CHO

C

O

H C 2

S IN T S . P IR IM ID N A S

S IN T S .P U R IN A S

N H

H

O

P

dU M P

P

N 5 ,N 1 0 M e tile n TH F

N AD P

O H

4 - C a rb o xa m id a R ib o n u c le ó tid o

T H F

N 5 ,N 1 0 -M e te nilTH F NH4 N 5 - F o rm i – m ino -T H F

N AD P H + H

+

T H F

G lu F orm im ino G lu T rans feras a

H is

T H F

M et

M TH F R e d uc ta s a

N 5 – M e til T H F

B 1 2 H o m o C y s te in a

H om oc is teína M etil T rans feras a o M etionina S intas a

N 5, N 10 M e tile n TH F S er-T rans H idroxim etilas a

G ly

CO2 + NH4 + NADH+H

Ser G lic ina D es c arboxilas a

G ly + NAD+

Fig. 13 - 5. Importancia de la Vitamina B12 y el Ác. Fólico en la disponibilidad de Purinas, Pirimidinas y en el metabolismo aminoacídico. 210

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

La falta de la vitamina B12 provoca la aparición de anemia megaloblástica caracterizada por un bajo recuento de eritrocitos acompañados de un gran tamaño. La vitamina B12 y el Ác. Fólico actúan en conjunto y se necesitan para la síntesis de los ácidos nucleicos. Intervienen en la síntesis de Purinas y Pirimidinas, necesarias para la formación de Nucleótidos que se necesitan para la síntesis de ácidos nucleicos disponibles para la división celular durante la maduración de las células sanguíneas Como se observa en la figura 16 - 5, en la vitamina conocida como Folacina o ác. Fólico, existen dos Nitrógenos denominados N5 y N10 que es donde se unen los grupos a transportar. Por lo tanto el grupo Metilo unido al N5 se denomina N5-Metil Tetrahidrofólico (N5-Metil -THF) y al ser entregado a la Cobalamimna, el ácido Fólico queda libre como THF. Ahora la Metil-Cobalamina transfiere el grupo Metilo a la Homocisteína para finalmente formar Metionina (fig. 14 - 5). En caso contrario, no se libera ác. Fólico y se acumula como N5-Metil –THF, por falta de Cobalamina o B12. Cómo consecuencia de ello se debilita el metabolismo de los aminoácidos en aquella reacción que se dirige de Homocisteína a Metionina (Met) y también desde Histidina (His) a Glutámico (Glu). La acumulación del N5-Metil – THF afecta los niveles de N5-N10Metilen-THF, N10-Formil-THF y por consiguiente, la síntesis de las Purinas y Pirimidinas. Ambas son necesarias para la formación de los ácidos nucleicos en aquellas células precursoras de los eritrocitos. Por otro lado, la síntesis de Glicina (Gly) a partir de Serina (Ser), también se ve afectada (fig. 13 – 5). En el hombre la forma activa de la vitamina B12, es la Metil Cobalamina (CH3-Cobalamina) y la 5-Desoxiadenosil o 5-Deoxiadenosil Cobalamina. La primera de ellas, se emplea en la conversión de Homocisteína a Metionina por la Homocisteína Metil Transferasa junto al N5-Metil-THF en el citoplasma, como sé observa en la figura 14 – 5. La segunda de ellas aparece involucrada en el reordenamiento del compuesto L-MetilMalonil-SCoA, producto de la β-Oxidación de los ácidos grasos impares en la Mitocondria y del metabolismo de los aminoácidos ramificados a Succinil-SCoA para entrar al CTC (Fig. 15 – 5).

C H3 S C H2 C H2 C H N H2 COOH

Acumulación de N5-Metil THF Treonina, Metionina, Isoleucina, por falta de B12 Acs. Grasos Impares CH

N5 - THF 3 CH3-CH2-CO-SCoA, Propionil-SCoA

THF por falta D - METILMALONIL de B12- SCoA

ATP +Homocisteína Metil Transferasa COBALAMINA o B12

COBALAMINA o B12

THF CO2 + ATPC H 3 – ScoA Bajo Propionil nivel de Carboxilasa

Metionina

COBALAMINA

o Metionina Sintasa

5´- Desoxiadenosil Metil-Cobalamina SH CH CH

COOH

C H2 Cobalamina Homocisteína

3 COOH

C H2 C H N H2 C OMutasa OH

C H2 C H2

D – metil C O S Co A C O S Co A Malonil - SCoA Racemasa Succinil - SCoA Valina L - Metilmalonil CoA Fig. 14 - 5. La Metilcobalamina interviene en la síntesis de la Metionina por metilación de la Homocisteína. Fig. 15 - 5. La deoxi o desoxicobalamina interviene en el reordenamiento de la L-Metil211 Malonil-SCoA

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

La falta de B12 en los animales jóvenes produce un retraso en el crecimiento y una falta de coordinación en los movimientos junto a procesos inflamatorios del hígado y la lengua. En las aves, fuera del retraso en el crecimiento se observa una reducción en la capacidad de incubación de huevos con numerosas malformaciones. Volver inicio

212

al

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

6) ACIDO FOLICO. En 1945 se determinó su estructura química y se procedió a sintetizar esta vitamina, pero se le conocía desde 1935 como un factor que se encontraba presente en el hígado y las levaduras, cuya carencia provocaba anemia Macrocítica o Megaloblástica. A c . Fólic o

P T E R IN A

G lutám ic o

P A m ino B enzoico R

O H

5 N

O

10 C H

2

C O O H

C

N H

N H

2 C H2

N H N

N

N

M etileno

C

E l grupo transportado R puede estar unido a los N itrógenos 5 o 10 e incluso am bos N itrógenos al m ism o tiem po R =

C H C H

- C H O - C H O

A c. N 5 - Form il T H F A c N 10 - Form il T H F

- C H = N H

A c. N 5 - Form im ino TH F

- C H = C H -

A c. N 5 - 10 M etilen T H F

-C H 3

O

A c. N 5 - 10 M etenil T H F A c. N 5 - M etil T H F

Fig. 16 - 5. Estructura del Ácido Fólico y Grupos transportados en N5 y/o N10.

TABLA QUE INDICA LA UNIÓN DE LOS GRUPOS A TRANSPORTAR CH2 | CH - CH2 – N 10- C

/ N5 H

H THF

CH2 | CH - CH2 –N 10 - C

/ N5

CH

O N10-Formil THF

CH2 | CH - CH2 – N 10- C

/ N5

CH3 N5-Metil THF

CH2 | CH - CH2 – N 10- C

/ N5

CH NH2

CH2 | CH - CH2 – N 10 - C

/ N5

CH2

N5,N10- Metilen THF

213

N5- Formimino THF

CH2 | CH - CH2 – N 10 - C

/ N5

CH N5, N10 Metenil THF

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Su estructura se observa en la figura 16 – 5, junto a los grupos que transfieren mediante su enlace a uno u ambos Nitrógenos N5 y N10, como se observa en la Tabla que la acompaña. El ác. Fólico esta formado por una Pterina que se encuentra unida por un metileno al ác. para-Aminobenzoico, formando entre ambos el ác. Pteróico. Este a su vez se une al grupo Amino del ác. Glutámico formando el ác. Pteroilglutámico. En la forma natural la molécula de ác. Pteróico se une a un Poliglutamato, es decir no es tan solo una molécula de ác. Glutámico sino que varias de 3 a 7 unidades. Los grupos transferidos por el Ác. Fólico intervienen en una serie de reacciones, como la formación de dTMP a partir de dUMP (fig. 13 - 5), en la síntesis de Metionina a partir de Homocisteína donde el radical N5- Metil-THF transfiere el Metilo a la Cobalamina y esta como Metilcobalamina lo entrega a su vez a la Homocisteína para formar finalmente Metionina (Fig. 17 - 5). También se le encuentra en el catabolismo de la Histidina a Ác. Glutámico y en la interconversión de la Serina y la Glicina por la Transhidroximetilasa (Fig. 13 - 5): Serina Transhidroximetilasa Glicina + Hidroximetil THF Serina + THF El Ác. Fólico se encuentra en las hojas de espinaca o los vegetales verdes, hígado, huevos, queso, leguminosas y carne de vaca. Su carencia en el hombre produce anemia megaloblástica asociada a una leucopenia y es imposible de distinguirla de la carencia de vitamina B12. Los eritroblastos incapaces de llevar a cabo la mitosis presentan una fase S muy larga y mueren en la médula ósea. Si la mejoría se obtiene rápidamente con dosis fisiológicas de ác. Fólico, se atribuye la anemia a la carencia de esta vitamina. Si la deficiencia es de vitamina B12 el paciente no se repone con las dosis normales de ác. Fólico y se la denomina Anemia Perniciosa. .

ATP

METIONINA

S- ADENOSIL - METIONINA CICLO S–Adenosil Metionina 3 Pi

HOMOCISTEÍNA

CISTATIONINA SINTASA

COBALAMINA O B12 METIONINA SINTASA

N5,N10-METILEN THF METILEN -THF REDUCTASA

N5-Metil THF

METIL COBALAMINA

Gly

CICLO FOLATO

THF

Ser

CISTATIONINA CISTEÍNA Fig. 17 – 5. Cadena por medio de la cual se transfiere el grupo Metilo desde la Ser hasta la SAdenosil Metionina, con la ayuda del Ác. Fólico y de la Vitamina B12. La S- Adenosil Metionina es empleada para Metilar diversos compuestos.

214

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

En la Fig. 17 – 5, se observa la formación de la S - Adenosil Metionina mediante la intervención del ác. Fólico y la vitamina B12. La S- Adenosil Metionina transfiere el grupo Metilo a las Bases del RNAt, a los aminoácidos de las proteínas, a la Fosfatidil Etanolamina para formar Fosfatidil Colina, a la Adenina o la Citosina del DNA, al ác. Guanidino acético para formar Creatina y a la Noradrenalina en la síntesis de Adrenalina. Es el principal agente metilante. Cualquiera falla en la enzima Cistationina Sintasa produce acumulación de Homocisteína que aparece luego en la orina. Una falla en las otras enzimas Metionina Sintasa o MetilenTHF Reductasa, también pueden conducir a la acumulación de Homocisteína.

Formato

Metionina

THF

B12 Homocisteína

N5–Formimino Glu

His Serina

FADH2

N10-Formil THF

dTMP

N5 Metil THF

Nucleótidos de Purina

B12

Glu

N5- Formimino-THF

dUMP Glicina

FAD

N5, N10 Metilen THF

N5, N10 Metenil THF

NADPH + H

NADP

Fig. 18 - 5. Distintas interconversiones del ác. Fólico en el metabolismo de los aminoácidos Gly, Ser, His, Glu, Met y los Piridín Nucleótidos

En la figura 18 – 5, se observan en un cuadro resumen las distintas interconversiones del Ác. Tetrahidrofólico junto a la vitamina B12 o Cobalamina y el metabolismo de los aminoácidos junto a su intervención en la síntesis de Purinas y Pirimidinas incluyendo el paso de dUMP a dTMP.

215

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La falta de ác. Fólico en mujeres durante la gestación produce defectos en el tubo neural de los recién nacidos conocido como espina bífida o abierta, debido a que las vértebras no cubren bien el tubo neural y el cerebro no se desarrolla totalmente. En el animal después de un tratamiento con sulfamidas y antibióticos que matan la flora intestinal se produce una falta de Ác. Fólico que acarrea trastornos del crecimiento, anemia y desnutrición, caída de pelo, despigmentación, trastornos en la reproducción, lactancia y malformaciones fetales

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216

al

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7) PIRIDOXINA O VITAMINA B6. La Piridoxina fue reconocida en la década de 1930 como un derivado de Pirimidina con tres grupos distintos en la posición 4, la Piridoxina o Piridoxol, el Piridoxal y la Piridoxamina (Fig. 19 - 5). CH OH 2 HO CH

3

CH OH 2

N CHO

Piridoxina

CH OH 2

HO CH

3

N CH NH 2 2

Piridoxal

CH OH 2

HO CH

3

N Piridoxamina

Fig. 19 - 5.Tres formas o vitámeros de la vitamina B6.

Se le encuentra en las levaduras, gérmenes de cereal, verduras, frutas, yema de huevo, leche, carnes rojas e hígado. Su función se caracteriza por estar asociada a enzimas como:

1) Transaminasas, donde el grupo amino de un aminoácido pasa a un Cetoácido, en este caso el primero se transforma en un Cetoácido y el segundo en un aminoácido, (Fig. 20 5). Son importantes la Glutámico Pirúvico Transaminasa (GPT) y la Glutámico Oxaloacético Transaminasa (GOT). GPT Alanina + Ác. α-Cetoglutárico Ác. Glutámico + Ác. Pirúvico

217

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NH O H

C

C H O

C H

3 C H NH2 COOH

HO

P

CHO 2

OH

3 O

C

OH

HC 3

Alanina

C H

Pirúvico

PALP

C H

CH 2 C COOH

O HC 3

Ac. Alfa - Cetoglutárico

P

OH

OH N Piridoxaminafosfato

O C

COOH

2

O

CH2 HO

O CHO 2

NH2 COOH

2

HO HC 3

COOH

N

2

CHO 2

P

H O

CH2 OH

HO

CH 2 C H

OH N

NH

2

COOH Ac. Glutámico

Piridoxaminafosfato

HC 3

CHO 2

P

OH

OH N Piridoxalfosfato

Fig. 20 - 5.Reacción de transaminación por la enzima Glutámico Pirúvico Transaminasa.

GOT Ac. Aspártico + Ac. α-Cetoglutárico Ác. Glutámico + Ác. Oxaloacético 2) Transformación de ciertos aminoácidos en aminas o neurotransmisores por descarboxilación en las reacciones tipo: R-CH-NH2-COOH ----> R-CH2-NH2 + CO2 3) Desaminasas, deaminación oxidativa de la Serina y de la Treonina en el Hígado. 4) Degradación del triptófano. 5) Síntesis del Ác.γ-Amino-Butírico. En el hombre su falta es difícil de diagnosticar, pero se caracteriza por Dermatosis seborreicas, acné, calambres, etc. En el animal se produce retraso del crecimiento, formación de costras, pelaje sin brillo, pelo hirsuto y edemas en los ojos. Se observa en aves una disminución de la puesta y gran mortalidad embrionaria.

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218

al

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8) AC. ASCORBICO O VITAMINA C. Su carencia se conoce desde hace más de 2000 años y se manifestaba principalmente por la enfermedad denominada Escorbuto (fig. 22 – 5). Esta dolencia era conocida por los navegantes de largas travesías. En 1928 Szent-Giorgy logró aislarla y su estructura se determinó en 1932. La vitamina C se identificó como el ác. L-ascórbico, (Fig. 21 - 5).

1

O

2

C C

OH

C

OH

O

3 4

H

C

5

HO

C

6

H

CH OH 2

Fig. 21 - 6. Estructura del ác. Ascórbico. Sus átomos de carbono aparecen numerados.

Estructuralmente se define como la lactona de un ácido hexurónico que consta de un grupo alcohol primario en C6, y de un grupo alcohol secundario en C5 más un radical lactona que une los carbones 1 y 4. Su región funcional es el doble enlace entre los carbones 2 y 3 donde se entregan o se aceptan dos protones por medio de una oxidación reversible. El Ascorbato es capaz de potenciar la acción de la vitamina E al reaccionar con el radical Tocoferil (Fig. 25 - 5) y regenerar a la vitamina E formando el radical estable Ascorbil A-. Se le encuentra en vegetales y frutas cítricas, pero se destruye en parte por la cocción. El ác. Ascórbico interviene en la Hidroxilación de la Prolina durante la síntesis del Colágeno, por lo tanto durante el escorbuto el tejido conectivo pierde su rigidez ya que faltan los enlaces hidrógenos entre los aminoácidos hidroxilados (Ver Capítulo de proteínas). Otra de las funciones de la vitamina C es como antioxidante al proteger contra los compuestos tóxicos formados por el Oxígeno como lo es el Superóxido. Junto a la vitamina E estaría protegiendo a los ács. grasos poli-insaturados presentes en las bicapas celulares. También interviene en el metabolismo del hierro, donde es necesaria para su absorción y en el metabolismo de la Tirosina. Solo en el cobayo se puede inducir como modelo un escorbuto con atrofia muscular y ausencia de movimiento, inhibición del crecimiento y retraso en los procesos de cicatrización.

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Fig. 22 – 5. Presencia de llagas atribuidas al Escorbuto

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220

al

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B) VITAMINAS LIPOSOLUBLES. Estas vitaminas son derivadas de Isopreno, no son solubles en agua y se las puede considerar también como lípidos. Se encuentran en el Hígado de los animales y en las semillas oleaginosas. Las megadosis de estas vitaminas son tóxicas y se acumulan en el tejido graso y en el hígado del hombre. Su absorción ocurre en la mucosa intestinal y es similar a la de un lípido requiriendo de secreción biliar. En otras palabras pasan por el sistema linfático hasta entrar a la sangre y unirse a las lipoproteínas del plasma. Estas vitaminas liposolubles se identifican por los nombres de: 1) Vitamina A con tres vitámeros o formas distintas de la misma vitamina: a) Retinal b) Retinoico c) Retinol 2) Vitamina D, con varias otras formas, Ergocalciferol de origen vegetal y Colecalciferol de origen animal. La forma más activa es el 1,25-Dihidroxi-Colecalciferol. 3) Vitamina E, cuyo nombre es Tocoferol 4) Vitamina K, conocida como Filoquinona o Menaquinona según la identidad de su cola hidrofóbica. Volver

al

inicio

1) VITAMINA A Desde la antigüedad se suministraba Hígado para sanar algunas enfermedades humanas, conocidas ahora como asociadas a la carencia de las vitaminas liposolubles, pero no fue hasta la década del 30 y el 40 cuando se logró sintetizar los factores responsables de la cura. Los compuestos como Retinol, Retinal y Retinoico provienen del β- Caroteno, pigmento vegetal que se encuentra en zanahorias y tomates. Este se absorbe en las paredes del intestino y posteriormente durante su metabolismo es degradado por uno de sus extremos (Fig. 23 - 5). Es conocido como Pro-vitamina A y puede inactivar al Oxígeno singlet (Oxígeno reactivo de alta energía) al atrapar su energía para convertirse de la forma cis a la forma trans. Con ello impide las reacciones tóxicas causadas por el Oxígeno aberrante y tiene un efecto anticancerígeno. La vitamina A se puede encontrar en sus tres formas como Retinal, Retinol y Retinoico en el aceite de hígado de pescado, hígado de mamíferos, mantequilla, leche, queso y huevos.

Importancia en la visión. El Retinal forma parte de un pigmento visual en las células en bastón, que se denomina Rodopsina formado por la unión entre la proteína Opsina y el Retinal, (Fig. 24 - 6). Cuando la luz ilumina las células en bastón de la retina, la proteína Rodopsina se separa del retinal que

221

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pasa de la forma cis a la trans en la insaturación del C 11, pero en la oscuridad se regenera pasando nuevamente el C 11 a la forma cis y se une nuevamente a la Opsina para completar otro ciclo visual. La reconversión del Retinal en la oscuridad ocurre por medio de una Isomerasa que transforma la forma alcohol o Retinol 11 trans a Retinol 11 cis, pero la enzima tiene un Km alto y necesita el aporte de Retinol en la dieta para llevar a cabo la isomerización adecuadamente (Fig. 24 - 5). Una Oxido Reductasa es la encargada de pasar reversiblemente Retinal a Retinol.

17

20

19

16 7

15

13

11

9

1 2

6

3

5

10

8

14

12

4

Caroteno

18

8' C HO

apo 8 ' CAROTENAL 12 ' C HO

A partir del precursor

Caroteno

Se forman tres VITAMEROS de la APO !2 ' CAROTENAL

VITAMINA A

C HO

Retinal o Vit A 17

16 7

COO

20

19

13

11

9

15

Retinoico o Vit A

1 6

2

8

5

3

10

12

14

C HO H 2

Retinol o Vit A

4 18

Fig. 23 - 5.Degradación de la molécula de Beta-Caroteno.

La falta de retinal produce ceguera nocturna, que se caracteriza por la falta de percepción de los contornos en los objetos al oscurecer. La Rodopsina al recibir un fotón cambia su configuración y activa catalítica mente a las moléculas de una proteína intermediaria denominada Transducina, para empezar una amplificación estilo cascada. La Transducina activa una enzima que rompe al segundo mensajero GMPc con lo que se cierran los poros de entrada al ion Sodio polarizándose la membrana. Si se restauran los niveles de GMPc se abren nuevamente los poros y la membrana se despolariza disparándose un potencial de acción. El Ác. Retinoico es también de importancia en la síntesis de las glicoproteínas que actúan como lubricante en las mucosas.

222

Héctor Rocha L. Las Vitaminas

Su mecanismo de acción parece ser el de facilitar el transporte de Hidratos de Carbono al Lúmen del retículo endoplásmico rugoso por medio del movimiento Cis - Trans que facilitaría la entrada de Hidratos de Carbono para la síntesis de las Glicoproteínas.

Luz Rodopsina

Rodopsina

Retinal - 11 - cis

Retinal - 11 - trans

17

19

16 7

17

5 4

1 2 6

13 14 18

3

15

8

12

Retinol o Vit A

18

Retinol Deshidrogenasa

CHO

14

5 4

CHO

Opsina

10

15

13

11

9

12 10

20

19

16 7

8 3

11

9

1 2 6

Opsina

Retinal Isomerasa Retinol - 11 - cis

Retinol - 11 - trans

DIETA

Debido al alto Km de la Enzima se requiere del aporte de la dieta para saturarla Fig. 24 - 5. Ciclo Visual.

Si las proteínas no sé Glicosilan no se lubrican las mucosas y se resquebrajan entrando en ellas las infecciones. Esta enfermedad se denomina Xeroftalmia y afecta no solo al ojo provocando la opacidad de la córnea, sino que a otros lugares como, lengua, tubo digestivo, etc. La forma alcohólica de la vitamina denominada Retinol presenta analogía con el mecanismo de acción de los esteroides sexuales, ya que aumentaría la fertilidad y podría actuar en el control de la expresión de algunos genes. La carencia de esta vitamina en animales especialmente hembras produce Hiperqueratosis metaplásica de las mucosas, atrofia de los ovarios y disminución de la tasa de puesta y fecundación, mientras que en los fetos su falta produce malformaciones y muertes embrionarias. Volver inicio 2) VITAMINA D.

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El raquitismo (fig. 25 - 5) es conocido desde la antigüedad, ya que el empleo del aceite de hígado de bacalao y la luz solar como paliativos a esta enfermedad, no tuvieron importancia hasta el siglo XVIII o XIX. Solo desde 1930 en adelante se aisló la vitamina D y se pudo realizar su síntesis.

Fig. 25 - 5. Piernas arqueadas producto del Raquitismo

La incidencia de luz UV en la dermis del hombre provoca la ruptura del anillo B en el 7 deshidrocolesterol, produciendo la molécula de Colecalciferol o vit. D, (Fig. 26 - 5). La otra forma denominada Ergosterol es sintética. Si esta vitamina no se encuentra en la dieta de una persona que recibe una adecuada cantidad de luz UV, se le puede considerar como una hormona. En general la Vit. D es un esteroide ciclopentanofenantrénico que difiere en sus formas por la cadena lateral hidrocarbonada.

224

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La Hipofosfatemia o la Hipocalcemia gatillan el mecanismo que estimula la formación del PIEL

DIETA

2H C

Colecalciferol

HO

HO

Colecalciferol

HIPOFOSFATEMIA

Luz

7 - Deshidrocolesterol

25 - Hidroxilasa OH 25

HIGADO

2H C

HIPOCALCEMIA HO

25 - OH - Colecalciferol 1 - Hidroxilasa RIÑON

OH 25 1HO

HO

1,25 - Di - OH - Colecalciferol

Absorción de Calcio

INTESTINO

CALCEMIA

TUBULO CONTORNEADO DEL RIÑON

FOSFATEMIA

Se disuelve hueso para liberar Calcio Fig. 26 - 5.Formas activas de la Vitamina D y su metabolismo.

metabolito más activo de la vit. D. El 1,25-Dihidroxi Colecalciferol que estimula en el túbulo contorneado del riñón la reabsorción de Ca junto con incrementar la asimilación de Ca en el intestino y a la vez la liberación de Ca por el hueso mediante la acción de los osteoclastos. Este sistema se regula a su vez produciendo el intermediario 24,25-Dihidroxicolecalciferol de bajísima actividad. Una vez restaurado los niveles de Ca y Fósforo normales, el mecanismo de liberación de Ca se detiene al ser controlada por retroalimentación la hidroxilación del vitámero 1,25 Dihidroxicolecalciferol. En los animales jóvenes su falta provoca inhibición del crecimiento, pérdida de peso corporal y disminución del apetito junto a algunas crisis tetánicas, como es el caso de los lechones. Por otro lado, se puede observar también una deformación de los huesos del esternón en pollos junto a la columna vertebral y huesos de la pelvis en mamíferos. En las aves su falta se caracteriza por la producción de huevos con cáscara delgada, embriones mal formados y trastornos posturales. En los humanos se producen niños con las piernas arqueadas hacia fuera. Volver inicio

225

al

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3) VITAMINA E Es ampliamente conocida como un agente estabilizador de membranas y a la vez antioxidante. Se le sintetizó en la década del 30 y se la identificó como un α-Tocoferol. La Vitamina se encuentra formada por un anillo sustituido de Benzoquinona (Hidroxicromona) con una cadena fitil saturada (Fig. 27 - 6) o insaturada (Tocotrienol). La parte activa es el grupo hidroxi, ubicado en los anillos centrales y que puede romperse homolíticamente generando el radical Tocoferilo (TO• ) con un electrón no apareado. C H

3

H O C H H C 3

3

C H 3

O C H

3

C H

3 C H 3

C H 3

D L α -T O C O F E R O L

o

R a d ic a l T o c o fe rilo

R Fig. 27 - 6. Estructura de la vitamina E junto al radical Tocoferil.

La vitamina E se localiza en las membranas celulares con el anillo hacia el medio acuoso interior o exterior de la célula y la cadena fitilo hacia el centro, en contacto con las colas del resto de los Fosfolípidos de tal manera que puede difundir lateralmente. A consecuencias de ello inhibe la destabilización de las membranas y sus Fosfolípidos, al contribuir a la unión de los ácidos grasos que se puedan encontrar libres, ya que estos últimos actúan muchas veces como detergentes de las membranas provocando la disrupción de la bicapa. Por otro lado, el Tocoferol es también capaz de provocar estabilización del complejo LDL-Colesterol, impidiendo su oxidación y posterior degradación. De esta manera se impide el depósito de Colesterol en las arterias y el inicio de la enfermedad cardíaca. El Tocoferol se encuentra en el aceite de trigo, maíz y semillas oleaginosas, mientras que en los animales se le halla en hígado, huevo y productos lácteos. Su metabolismo se ha relacionado con el control de la síntesis de los grupos HEME, el manejo del Fe y el estado de oxidación de la Coenzima Q entre otras cosas. La carencia de Tocoferol provoca en animales distrofia muscular y degeneración de la fibra muscular cardíaca, carencia de espermios y anomalías en los tejidos fetoplacentarios. Antes de analizar las reacciones en que interviene el Tocoferol, es necesario considerar algunas características de los Radicales Libres. Estas especies químicas poseen una alta reactividad, ya que son producidas por ruptura homolítica de un enlace covalente. Los Radicales Libres se caracterizan por tener uno o más electrones desapareados en su capa más externa y pueden ser clasificados como reductores (donan electrones a una molécula aceptora y esta se reduce) o como oxidantes (aceptan electrones de una molécula donante y la oxidan). A su vez son capaces de atacar macromoléculas claves

226

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del metabolismo celular, como son los Fosfolípidos de membrana, Proteínas y Ácidos Nucleicos, es decir son los causantes del estrés oxidativo en la célula. En la Tabla 1 – 5, se observa de forma genérica las etapas de Iniciación, Propagación y Terminación de las reacciones en cadena producidas durante el ataque por un Radical Libre- Oxidante • , a una membrana (LH: Lípido reducido, L•: Radical metileno y LOO• : Lípido peroxidado o Radical Alquil Peroxilo) junto al efecto protector de un Antioxidante-H: TABLA 1 - 5 LH + Oxidante • ------ L• + Oxidante – H L• + O2-------- LOO• LOO• + LH ----- L• + LOOH L• + L• ---- eliminación del radical L• + LOO• ---eliminación del radical LOO• + Antioxidante-H--- LOOH + Antioxidante •

Iniciación Ciclo de Propagación Ciclo de Propagación Terminación Terminación Terminación de la reacción en cadena Siempre que se pueda atrapar el Radical la reacción en cadena termina.

A continuación en la Tabla 2 – 6, se observan los Potenciales de Reducción (Eº´) a pH 7,0 de las distintas parejas Redox, cuyos Radicales se encuentran ordenados desde el más Electropositivo al más Electronegativo. TABLA 2 – 5. Pareja Redox HO •, H+ / H2O (Radical Hidroxilo / Agua) LOO •, H+ / LOOH (Radical Peroxilo/ Alquilo reducido) o Alquil peroxilo GS • / GS(Radical Glutatión / Glutatión reducido) Ác. Graso Ác. Graso Poli-insaturado •, H+ / Poli- insaturado-H (Radical metileno / Ác. Graso reducido) TO •, H+ / TOH (Radical Tocoferilo / Tocoferol) H2O2, H+ / H2O, HO • (Peróxido de Hidrógeno / Radical Hidroxilo) Ascorbato •-, H+ / Anión Ascorbato Radical Ascorbato / Ascorbato monoanión O2 / O2 • (Oxígeno/ Oxígeno Superóxido)

Eº´ Volt + 2,310

+ 1,000

+ 0,920 + 0,600

+ 0,480 + 0,320 + 0,282 - 0,330

El radical Tocoferilo por su posición en la Tabla 2 – 5, es capaz de atrapar los radicales libres y disipar su energía. Su Potencial Redox (Eº´ = + 0,480 volt), le permite actuar

227

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concertadamente con la Vitamina C o Ascorbato (Eº´= + 0,282 volt) formando una Cadena de Transporte de Electrones protectora. El orden en que reacciona el Tocoferol (TOH) con un Radical Alquil Peroxilo (LOO • ) sería el siguiente: LOO • + TOH Ascorbato • + TO•

LOOH + TO• Ascorbato + TOH

Los compuestos de más arriba en la Tabla 1 – 5, sacan electrones a los de más abajo, de esta manera se elimina al Radical Peroxilo ( LOO•) dejando un Radical Tocoferilo ( TO• ). Éste último puede ser reciclado por Ascorbato. De esta manera un radical que se encuentra en un bicapa lipídica es sacado a un medio acuoso, donde se encuentra el radical Ascorbato que recupera el Tocoferol. Por lo anterior es posible asumir que ambas vitaminas E (Tocoferol) y C (Ascórbico) parecen actuar de manera concertada. En la figura 28 - 5, se observa la cadena por la cual NADH soluble es el reductor final que regenera al ác. Ascórbico de la cadena. Los Lípidos reducidos LH de la membrana en presencia de un compuesto X y Oxígeno, pueden dar origen a los radicales L• (radical metileno) y LOO• ( radical peroxilo). Ambos producen reacciones en cadena dando origen a otros radicales (Fig. 31 - 5). Sin embargo su acción puede ser frenada mediante la acción del Tocoferol TOH. Este último es capaz de entregar radicales H• y TO•, capaces de cancelar las reacciones de propagación por medio del electrón faltante. Por otro lado el ác. Ascórbico o Vitamina C, puede recuperar al radical TO • al reducirlo nuevamente a TOH. A su vez el ác. Ascórbico como radical C• , se recuperará por medio del NADH +H.

NADH

X

LH

NAD

C•

C

O2 TOH

TO•

XH

L•

LOOH

LOO •

LOOH

LH

Fig. 28 - 5. Formación de radicales libres por acción de un compuesto X y peroxidación con O2

Fuera de actuar como antioxidante y proteger los Ácidos Grasos insaturados, Proteínas y DNA, la vitamina E o Tocoferol estabiliza la estructura de las membranas y

recientemente se le atribuye un rol en la transducción de señales. Volver inicio

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a) EL OXIGENO COMO FUENTE DE RADICALES LIBRES La fuente de Radicales Libres es generalmente el Oxígeno. Aunque este es esencial para la vida y normalmente poco reactivo, puede ser convertido en una serie de compuestos aberrantes, cuando es reducido de manera secuencial (fig. 29 – 5). Es decir, electrón por electrón hasta aceptar finalmente un total de 4 electrones para formar agua. La adición de un primer electrón al Oxígeno forma Superóxido ( O2 - ). Este al recibir un segundo electrón forma Peróxido de Hidrógeno (H2O2), que no es un radical libre, sin embargo es un fuerte de compuesto oxidante. A continuación al recibir tres electrones el Oxígeno genera el Radical Hidroxilo ( OH . ), que es altamente reactivo. Estos compuestos intermediarios decaen en energía a medida que son reducidos y algunos de ellos son aún capaces de generar compuestos potencialmente tóxicos para las células como el Radical Perhidroxilo ( .OOH) a partir del Superóxido ( O2 - ).

:

•O − O Superóxido

O − O: Oxígeno Singlete

+hν = + 22 Kcal/mol

+7 ,6 Kcal/mol

•O − O• Oxígeno Triplete (estado basal)

Energía Libre Estándar Δ Gº´

− O:H

Radical Perhidroxilo

- 21,7 Kcal/mol

+e +e

•O

H :O − O : H Peróxido de Hidrógeno

+e

- 8,8 Kcal/mol

:

++ H :O:H

H O• Radical Hidroxilo

Agua

- 53,7 Kcal/mol

+e

H :O:H Agua

Fig. 29 – 5. Ubicación de las formas aberrantes del Oxígeno según su energía y estado de reducción.

El Oxígeno triplete o basal se denomina así, ya que genera tres bandas cuando es sometido a la técnica de EPR (Electrón Paramagnetic Resonance). Esta consiste en aplicar un fuerte campo magnético que desplaza a la nube electrónica hacia un polo del enlace y luego la hace resonar o agitar con un haz de microondas. Una fracción de esta energía es absorbida por la molécula y la otra es emitida, lo que permite estudiar las interacciones que ocurren en ella. En el caso del Oxígeno singlete, este nombre (del inglés single: único, solo) se refiere a una forma activada del Oxígeno por medio de radiación (h x ν) y presenta tan solo una banda a diferencia del triplete con tres bandas.

229

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inicio

b) LOS LÍPIDOS COMO BLANCO DE LOS RADICALES LIBRES

Entre las moléculas atacadas por los radicales libres, encontramos que son especialmente susceptibles los ácidos grasos poli-insaturados (fig. 30 – 5). Estos poseen grupos Metilenos ( – CH2-) cuyos Hidrógenos pueden ser removidos fácilmente debido a la presencia del doble enlace en el átomo de carbono adyacente. El radical Hidroxilo, OH• (reducido con tres electrones), es uno de los compuestos aberrantes más eficientes en empezar el ataque, en otras palabras es la chispa que inicia el fuego, mientras que el Superóxido O2• - no es lo suficientemente reactivo. Así tenemos que el ataque por el radical Hidroxilo (OH•), sobre un ácido graso poli-insaturado como el Araquidónico, se produce en tres etapas bien definidas: La primera de ellas es la de Iniciación, donde se retira un hidrógeno junto con un electrón (de manera homolítica) del grupo Metileno, formando un radical libre del mismo Ácido Graso. Éste se denominado ahora Radical Metileno. El electrón desapareado tiene resonancia y puede cambiar de posición al trasladarse por la cola del ácido graso considerado como un dieno conjugado. El Radical Metileno, puede reaccionar directamente con el Oxígeno triplete u Oxígeno común, que también puede ser considerado como un biradical con dos electrones desapareados (•O : O•). De esta manera, se extrae nuevamente un electrón al ácido graso para transformarlo en el Radical Peroxilo (LOO• ). Este ácido graso convertido ahora en Radical Libre, puede sustraer otro protón a una nueva molécula intacta de Ác. Araquidónico, entrando en un Ciclo o Etapa de Propagación, el que termina por destruir gran parte de una bicapa lipídica. Sin embargo, la presencia de Tocoferol (Fig. 31 – 5), puede detener la Propagación, mediante una nueva Etapa de Terminación, es decir cuando se dona de manera homolítica un protón y un electrón por el Tocoferol al Radical del ácido graso poliinsaturado, se forma nuevamente el ácido graso reducido. A su vez el radical Tocoferilo ( TO• ), puede reaccionar consigo mismo para formar un dímero incapaz de causar daño o bien puede reaccionar con el Ascorbato.

El Radical Tocoferilo, es también capaz de hacer perder energía al Oxígeno singlet (fig. 29 – 5), aportando electrones con un espín opuesto cancelando su estado activado.

230

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AC. ARAQUIDÓNICO Sustracción de un H y formación de un Radical Metileno

• OH

O || C − FOSFOLÍPIDO

• Dieno conjugado

O || C − FOSFOLÍPIDO FOSFOLÍPIDO - • Radical Metileno

ETAPA DE INICIACIÓN

O || C − FOSFOLÍPIDO

• O2

Radical Peroxilo

O - O•

O - OH

Hidroperóxido

O || C − FOSFOLÍPIDO

O || C − FOSFOLÍPIDO

FOSFOLÍPIDO – H Poli-insaturado ETAPA DE PROPAGACIÓN

FOSFOLÍPIDO - • Radical Metileno Formación de un nuevo Radical Metileno al sustraer el Radical Peroxilo un Protón. El Radical Metileno formado entra a un Ciclo de Propagación

Fig. 30 – 5. Etapa de Iniciación con el radical hidroxilo ( OH•) y formación de un dieno conjugado que formará a su vez un radical peroxilo (ROO•) mediante la acción del Oxígeno basal. El radical Peroxilo propaga la reacción a otro fosfolípido con formación de un Hidroperóxido y otro radical Metileno que entran nuevamente a la misma vía.

Radical Metileno

O || C − FOSFOLÍPIDO

HO - Tocoferol

• ETAPA DE TERMINACIÓN Ác ARAQUIDONICO INTACTO

O || C − FOSFOLÍPIDO

Radical Tocoferilo

2

•O – Tocoferol

•O – Tocoferol

Dímero inactivo Tocoferol – O • •O – Tocoferol

Fig. 31 – 5. Etapa de Terminación auspiciada por el Tocoferol, cuyo radical Tocoferilo se puede desactivar formando un dímero consigo mismo o reaccionar con el Ascorbato para recuperar su estado original.

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al

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4) VITAMINA K Se la conoció a principios de siglo como factor antihemorrágico y se consiguió sintetizar en 1939. Su núcleo es un 2 metil-1,4 naftoquinona (Fig. 32 - 5) y se la conoce también como Menadiona. Cuando posee una cadena lateral cuya metilación puede variar, forma varios vitámeros como el K1 o 2-metil 3-fitil Naftoquinona y el K2 o 2-metil 3-difarnesil-1,4 Naftoquinona. Su mecanismo de acción esta involucrado en la coagulación de la sangre al interactuar con los factores de la coagulación. La vitamina K actúa junto a una carboxilasa que introduce grupos carboxilos en el residuo aminoacídico del Ác. Glutámico, perteneciente a la secuencia de alguno de los factores de la coagulación. El glutámico recibe un carboxilo en el carbono γ (Gama) y de esta manera tendrá dos carboxilos libres con dos cargas negativas a las que se puede unir el Calcio para disparar el proceso de coagulación. Se le encuentra presente como K1 en las hojas verdes de los vegetales y como K2 en la flora intestinal. La terapia prolongada con antibióticos disminuye su presencia. O H

Menadiona o 1 , 4 Naftoquinona CH 3

O

O

CH 3

Filoquinona

CH 3

CH 3

CH 3

K1

CH 3 2 - Metil - 3 - Fitil - 1 - 4 - Naftoquinona CH 3 CH 3

O

H

K2

2 - Metil - 3 - Difarnesil - 1 - 4 - Naftoquinona

n Ca

O

O COO CH

OOC

2

O

CH

CH

CO 2

C H2 C

COO

C

H

O

CH

C

C

O

CH

Ca +2

C H2

N

O

+2

C H2 N

C

H

O

CH

N H

Fig. 32 - 5. Estructura de los vitámeros de la Vitamina K. Los compuestos de la figura 33 - 5 son derivados de la Hidroxicumarina y poseen una estructura algo similar a la vitamina K, por lo que se convierten en inhibidores competitivos y se emplean como anticoagulantes. La carencia de vitamina K provoca en el animal hemorragias de las mucosas acompañada de astenia y en los pollos una coloración subictérica. El trébol descompuesto por hongos (mal ensilado) produce una molécula similar a la vitamina K denominada Hidroxicumarina. Esta bloquea la acción de la vitamina K, competitivamente y provoca hemorragias en el ganado.

232

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OH

OH

H C H O

OH

CH 2

CO

CH 3

CH

OO

O O

DICUMAROL

O

VARFARINA CH OH

3

CH 2

O

CH O FENILINDANEDIONA

O O FENIL - PROPILHIDROXICUMARINA

Fig. 33 - 5. Compuestos antagónicos a la Vitamina K empleados como anticoagulantes. En el hombre la medida del tiempo de coagulación de la sangre, será una buena forma de comprobar la existencia de obstrucción biliar causada por un cálculo o una inflamación del colédoco, que impiden la secreción biliar necesaria para absorber lípidos como la Vitamina K. Volver inicio

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al

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REFERENCIAS. Las Vitaminas. , J. Leboulanger. , Publicación de Laboratorios Roche. Para qué sirven las vitaminas?., P.Langley-Danysz., Mundo Científico, Vol 80, 548-557,1988. ,Respuesta de los fotorreceptores a la luz J.L. Schnapf y D.A. Baylor., Investigación y Ciencia, No 129, 20-28,1987. La Biochimie de L'oxygène C. Deby., La Recherche, Vol 22, 56-64, 1991.

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Héctor Rocha L. Bioenergética

BIOENERGÉTICA

327

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1) EJEMPLO DE SITUACIONES TERMODINAMICAMENTE FAVORABLES 330 2) INTRODUCCIÓN A LA BIOENERGETICA 333 3) PRINCIPIOS Y LEYES TERMODINAMICAS 336 4) EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y EQUILIBRIO TERMODINÁMICO 340 5) REACCIONES ENDERGÓNICAS Y EXERGÓNICAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO 343 6) CARACTERÍSTICAS DEL CATABOLISMO 348 7) CARACTERÍSTICAS DEL ANABOLISMO 349 8) ENFOQUE ACTUAL DE LA TERMODINÁCA APLICADA A LA EXISTENCIA DE LAS MACROMOLÉCULAS 352 9) CONCLUSIONES GENERALES 356 10) EL ATP 357 11) SÍNTESIS DE ATP

359

a) TRANSFERENCIA DE GRUPOS FOSFATOS

359

b) TRANSFERENCIA DE PROTONES Y ELECTRONES 12) GLOSARIO 369

328

363

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1) EJEMPLOS DE SITUACIONES TERMODINAMICAMENTE FAVORABLES. En nuestro caso la aplicación de la termodinámica a los procesos biológicos consiste en llevar la estricta cuenta de la energía y materia que entra y sale de los procesos metabólicos.

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A su vez, estos procesos ocurrirán en compartimientos que se pueden considerar como abiertos, cerrados y/o aislados que podrán estar representados por organelos, citoplasma o células. Al emplear esta aproximación termodinámica, será posible enfocar desde una macromolécula hasta un individuo completo, junto a las influencias que el entorno ejerce sobre este y a su vez las que el individuo ejerce sobre el entorno e incluso se puede llegar ha desarrollar conceptos ecológicos. Sin embargo, en este capítulo, nos referiremos a los procesos que ocurren en una célula y estos podrán incluir reacciones metabólicas de activación o degradación de sustratos, transferencia de energía en forma acoplada desde una reacción a otra, generación de gradientes de concentración y carga, etc. En resumen, para entender como ocurren los procesos bioquímicos desde el punto de vista termodinámico, será necesario entender previamente varios ejemplos relacionados con aquellos eventos u fenómenos que suceden espontáneamente o que son considerados como, termodinámicamente favorables o factibles y que ocurren inadvertidos durante la experiencia cotidiana. En general a este tipo de fenómenos no se les presta mayor atención y se aceptan como si fueran procesos garantizados de que siempre procederán de la misma manera. Dentro de este ámbito podemos analizar como ejemplo, lo que sucederá con un proceso caracterizado por la dispersión de moléculas de perfume desde una botella (Fig. 17). Si dejamos una botella de perfume abierta dentro de una porción del espacio o en un sistema aislado, que se considera a presión, volumen y temperatura constante. Sin duda que al cabo de un tiempo, el lugar terminará por estar igualmente perfumado en todas sus direcciones. En otras palabras las moléculas que estaban en el medio líquido de la botella y a corta distancia unas de otras pasarán a estar separadas, ocupando el volumen total del espacio. Las moléculas de perfume tratan de encontrar la mayor distancia entre sí. PROCESOS Estado Sistema aislado

ESPONTANEOS

A

Estado B

ORDEN

DESORDEN DE

PERFUME

Solo aplicando energía se puede devolver

Fig 1 – 7. Las moléculas se separan espontáneamente al salir de su recipiente.

Es obvio que no todas las moléculas de perfume, volverán a agruparse en un pequeño volumen del espacio constituido por la botella. Este último proceso no es espontáneo y para invertirlo, habría que suministrar energía externa al sistema o trabajo desde afuera del sistema en consideración. Este consistirá en comprimir el aire, para luego destilarlo y separar sus componentes. Una vez aislado se retornará a su respectivo recipiente. Otro ejemplo práctico similar al anterior, puede ser visualizado al poner en contacto dos soluciones con distinta concentración de Sacarosa (Fig. 2 -7). A tiempo 0, ambas soluciones se encuentran separadas por medio de una interfase formada por su desigual densidad. Posteriormente en la solución más concentrada, difunde el soluto hacia la menos concentrada o bien el agua de la solución más diluida tiende a difundir al interior de la solución más concentrada. Después de un tiempo determinado x, ambos compartimientos

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permanecerán con igual concentración. Lo sucedido anteriormente, constituye un proceso espontáneo, no depende de la cantidad de tiempo transcurrido, podría ser mucho o poco, sin embargo el resultado final siempre será igual. Para invertirlo tendríamos que gastar nuevamente energía para evaporar el agua y concentrar la solución resultante. Esto significa aplicar energía desde el exterior del sistema. Esto indica que el proceso inverso no es espontáneo o termodinámicamente favorable.

Tiempo 0

Tiempo X

soluto sin carga 5M

3M

1M

Equilibrio Osmótico

Fig 2 -7 . La Sacarosa difunde hasta igualar la concentración en el recipiente.

Un tercer caso (Fig. 3 – 7), puede estar representado por un compartimiento que tiene una determinada solución de NaCl y que se encuentra separado de otro lleno de agua pura. La membrana que los separa es solo permeable a los iones positivos de Na+, pero no a los iones de Cl-, ya que se comporta como una bicapa lipídica.

Δψ C1, ψ1

ψ2,C2

C1, ψ1

C1 > C2 ψ1 > ψ2

C2, ψ2

ΔC = C1 - C2 Δψ = ψ1 - ψ2

Fig 3 - 7. El gradiente de concentración y potencial o voltaje se oponen.

A medida que migran los iones Na+ desde el compartimiento más concentrado al más diluido o izquierda a derecha. Ocurre que el compartimento 2 de igual volumen al 1 se hace positivo, mientras que el 1 se hace negativo. El proceso se detiene cuando algunos iones positivos son empujados nuevamente al compartimiento 1, hasta alcanzar una cierta distribución. Es interesante notar, que no se produce la electroneutralidad (igualdad de iones positivos y negativos) en ambos compartimientos, ya que la concentración y distribución de los iones no es igual. Esta particular distribución genera una diferencia de potencial Δ ( ψ1 – ψ2 ), que se opone a la posterior migración de nuevos iones positivos al compartimiento 2.

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Existe aquí una imparidad entre la distribución de concentración y carga a ambos lados de la membrana. La tendencia espontánea a difundir desde el compartimiento más concentrado (1) al más diluido (2) determinado por C1> C2, se contrapone a la tendencia de moverse en la dirección opuesta debido a las cargas negativas del compartimiento 1 y las positivas del 2. Las distintas fuerzas opuestas que se enfrentan aquí, tanto la producida por la diferencia de potencial como la producida por la diferencia de concentración son capaces de llegar al equilibrio. Desde el punto de vista energético este efecto se reduce a la expresión: ΔGº´c =

ΔGº´p

La energía en base a la diferencia de concentración, esta dada por la ecuación: ΔGº´ c = 2,3 RT Log C1/C2 log e = 2,3 Log 10 R: CTE de los gases T: tº absoluta en º Kelvin La energía en base a la diferencia de voltaje o potencial a ambos lados, está dada por la ecuación: ΔGº´p = z F Δ ( ψ1 – ψ2 ) Z: Carga de los iones F : Constante de Faraday Cuando ambas tienden a igualarse, se tiene la ecuación de Nernst: Δψ = ( ψ1 – ψ2 ) =

2,3 RT Log C1/C2 --------------------------------zF

Esta última ecuación indica el potencial al cual no existe paso de iones positivos a través de la membrana. Se le conoce también como el potencial de reposo ( Δψ ), equilibrio o de relajación entre concentración y voltaje a ambos lados de la membrana. Por otro lado al continuar con nuestro análisis, a pesar de que podemos encontrar en que dirección migran los sistemas no es posible determinar el camino por el que lo hacen, es decir la forma en que una molécula de perfume, la molécula de Sacarosa o un ión recorren una trayectoria, desde la zona más concentrada a la mas diluida. Este camino no se conoce, ni tampoco se debe considerar el tiempo que se demoran en hacerlo, tan solo el estado inicial y final es el importante. Los tres ejemplos de los casos anteriores ocurren en lo que se llama sistemas aislados del exterior. No intercambian materia ni energía con el entorno. Volver al inicio 2) INTRODUCCION A LA BIOENERGETICA.

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Ahora, al analizar sistemáticamente los ejemplos anteriores desde el punto de vista termodinámico, podemos considerar que un evento o proceso, debe ser considerado dentro de una porción del espacio denominado sistema (Fig. 4-7). Este mismo sistema se encuentra a su vez rodeado por el entorno y todo ello, se halla contenido en un espacio que se denomina Universo. Al continuar con la misma línea de pensamiento, podemos decir que el proceso que ocurre dentro del sistema puede ser de tres tipos: aislado, cerrado y abierto (Fig. 4 – 7). UNIVERSO A

NO HAY INTERCAMBIO DE ENERGÍA (E) NI DE MATERIA (M)

Sistema Aislado

UNIVERSO B

INTERCAMBIO DE ENERGÍA (E) SOLAMENTE

Sistema Cerrado E

ENTORNO

ENTORNO

UNIVERSO C

INTERCAMBIO DE ENERGÍA (E) Y MATERIA (M)

Sistema Abierto E

M

ENTORNO

Fig. 4 - 7. En los tres Universos A, B y C se observan tres tipos de sistemas

En los sistemas aislados no hay intercambio de materia ni energía con el entorno y pueden ser considerados como ejemplo, aquellos procesos que ocurren dentro de un recipiente de doble pared reflectante y con vacío entre ambas paredes. Aquí no se permite la entrada o salida de calor (botella térmica). Es decir, no hay intercambio de materia y energía. Si una botella térmica con 500ml de agua a la temperatura de t1= 90ºC, recibe 500ml de agua a la temperatura t2 = 10ºC, la temperatura interna descenderá hasta alcanzar un equilibrio entre ambas masas de líquido (40ºC), siguiendo el principio de Le Chatelier-Brown. Este equilibrio no será con la temperatura que existe al exterior de la botella o su entorno, sino que la temperatura final estará dada por la ecuación Q = m x c x t ( m = masa de ambos volúmenes de líquido, c = calor específico del agua, t = temperatura, aplicada a cada una de las masas de agua) Qt (final) = Q ( 90ºC) - Q (10ºC) (m1 + m2 ) x c x Δt (final) = m1 x c x t1 – m2 x c x t2 si c es igual en ambos: m1 x t1 – m2 x t2 Δt (final) = ------------------------------------------------ = 40º C ( m1 + m2 )

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Los procesos que ocurren al interior de un organelo, pueden ser también considerados como pertenecientes a un sistema aislado. Si en el interior del organelo existe una enzima, que requiere de cierto pH para manifestar su actividad. Cualquier cambio de este, provocará un cambio en la conformación de la enzima tomando energía desde el entorno o liberándola hacia el entorno. Este cambio en su conformación afectará su sitio activo y por lo tanto su actividad enzimática. Al continuar con la descripción de los sistemas, encontramos que estos pueden ser del tipo cerrado cercano al equilibrio o cerrado lejos del equilibrio. En un proceso cerrado se intercambia energía con el entorno y si es cercano al equilibrio, se puede considerar como ejemplo, lo que ocurre en el agua al bajar la temperatura. Esta pasa desde un estado amorfo o desordenado a un estado cristalino u ordenado. Aquí se produce una disminución de la entropía o desorden y una disminución de la energía contenida en la masa o volumen de agua. El agua se organiza en una estructura ordenada, cuando libera el calor de fusión que es de 80 cal/gr. Este proceso no es espontáneo o favorable, pero la baja de temperatura permite una menor agitación de las moléculas y a la vez se libera energía al entorno lo lleva la lleva hasta ese límite. En este punto la agitación molecular que mantiene a las moléculas separadas, es sobrepasada por la fuerza de atracción entre las moléculas de agua que actúan entre sí como dipolos débiles. Este efecto las conduce a formar una red cristalina de moléculas estáticas con una estructura ordenada que se denomina hielo. En el otro caso, un sistema cerrado lejos del equilibrio, se puede incluir como ejemplo a un depósito aislado que sirve como calentador eléctrico de agua. En este sistema, se mantiene en el interior una temperatura constante mayor que la del entorno, mediante el flujo de electricidad hacia una resistencia la cual produce calor. Otro de estos mismos ejemplos, puede incluir a un refrigerador con una temperatura de 4ºC en su interior y de 25ºC en el entorno. En este caso existe un compresor que gasta energía eléctrica licuando el gas refrigerante. Posteriormente, al circular en forma de líquido por las cañerías en el interior del refrigerador se expande y atrapa el calor, el que se disipa en un radiador externo antes de ser comprimido nuevamente con gasto de energía. En ambos casos anteriores, para mantener al agua caliente en el calentador y la temperatura baja en el refrigerador, se requiere de un buen aislamiento en ambos. Si este fuera un 100% efectivo se mantendrá la temperatura constante en el interior de ambos y el sistema se puede considerar como cerrado lejos del equilibrio. Sin embargo a pesar de ello, ambos sistemas tratarán siempre de alcanzar el equilibrio con la temperatura del entorno debido a que su aislamiento no es del todo perfecto (nunca lo será). Si no hay flujo eléctrico en el calentador de agua, este transfiere su calor al entorno y se enfría o en el caso del refrigerador, entra calor desde el entorno hasta igualar su temperatura con el exterior. En ambos casos, sino se aporta energía se alcanzará el equilibrio termodinámico o la misma temperatura del entorno. Una aproximación biológica a un sistema cerrado lejos del equilibrio, puede ser un sistema transportador de Glucosa del tipo mediado, donde una proteína reconoce específicamente a la Glucosa y mediante un cambio conformacional acoplado a la hidrólisis del ATP, lleva Glucosa al interior de la célula en contra de un gradiente de concentración. Este proceso ocupa ATP como energía para concentrar Glucosa adentro del compartimiento. Si no hay suministro de ATP, la Glucosa puede difundir al exterior e igualar las concentraciones en ambos lados. En este caso la molécula de ATP debe proveer de energía suficiente para mantener el gradiente, más otra porción de energía que se debe disipar hacia el entorno, para que el proceso sea termodinámicamente favorable.

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Por último, los casos anteriores han servido para visualizar a un nuevo sistema, reconocido como abierto donde se mantiene un orden lejos del equilibrio, mediante un flujo constante de energía y materia. Un automóvil recibe combustible o energía química en la forma de un líquido con una masa determinada. Este a su vez se oxida o combustiona con el Oxígeno del aire. Como resultado se produce una mezcla de gases a una alta temperatura que se encuentra constituida por moléculas más pequeñas y desordenadas (CO, CO2 y H2O), cuyo calor se pierde por el escape. Del total del calor producido por la combustión interna se emplea una parte en el desplazamiento mecánico del automóvil y la otra parte, se pierde o disipa hacia el entorno por el radiador y escape. Mientras exista combustible el sistema se mantiene en equilibrio de estado estable, es decir produciendo trabajo (desplazamiento) y calor, lejos del equilibrio con el entorno. Por otro lado, sin combustible el sistema toma la temperatura del entorno y no hace trabajo entrando ahora al equilibrio de tipo termodinámico. Un automóvil con el tiempo es presa de la entropía, es decir sufre un desgaste mecánico, que se puede medir en ciertos miligramos de metal que se desprenden de su motor y en aquellas partes donde ocurra roce entre metales. Un ser vivo también se encuentra sometido a las mismas fuerzas externas, pero se autorepara hasta que este último sistema cae también bajo la entropía. Otro ejemplo similar de sistema abierto estaría constituido por un dispositivo calentador de agua conectado a una red domiciliaria. Este aparato entrega energía calórica que proviene de la combustión del gas empleado como combustible, a una masa de agua que entra fría y sale caliente. Este sistema es capaz de intercambiar energía y masa a la vez. Si consideramos al gradiente de Glucosa planteado anteriormente como un sistema abierto, este puede mantenerse en equilibrio de estado estable. Siempre que se aporte Glucosa desde el exterior y se ocupe en su interior de producir ATP, manteniendo así un flujo continuo que dependerá del empleo de la energía producida como ATP para su transporte y degradación. La particularidad de este sistema biológico, es que la misma Glucosa al degradarse, genera la suficiente energía en la forma de ATP, tanto para activar a la molécula de Glucosa, como para permitir que se continúe degradando a medida que lleguen nuevas moléculas intactas. Además parte de la energía producida se debe ocupar en algún tipo de trabajo útil, que puede ser la síntesis de otras moléculas o la contracción muscular. Más aún, parte de esta misma energía deberá disiparse hacia el entorno, para satisfacer el segundo principio de la Termodinámica y permitir que el sistema considerado como abierto migre o se relaje en una determinada dirección y sentido. Volver al inicio 3) PRINCIPIOS Y LEYES TERMODINÁMICAS Cuando se hace un balance de las energías de un proceso como lo haría un contador con los haberes y deberes de una compañía, se observa que ninguna de las transferencias de energía ocurre con un 100% de eficiencia y una fracción siempre se pierde hacia el medio u entorno para que la transferencia sea factible. Es decir, se debe pagar un impuesto a cada transferencia de fondos. Por ejemplo, los distintos componentes de la ENERGIA TOTAL DE UN SISTEMA (100%) pueden ser desglosados en 30% de ENERGIA QUIMIOSMOTICA (capaz de crear un gradiente a ambos lados de una membrana), un 30% de ENERGIA QUIMICA (capaz de sintetizar una molécula) y finalmente un 40% de ENERGIA CALORICA la que se pierde hacia el entorno, impidiendo la eficiencia 100%.

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Como se ha observado anteriormente una molécula química tiene una cierta cantidad de energía interna representada por los diversos tipos de interacciones como son los enlaces covalentes e interacciones débiles, número de dobles enlaces, número de estructuras resonantes, repulsión electrostática, tensión de los enlaces. A la vez se encuentran otros tipos de energías, como son la de vibración y rotación exceptuando la energía nuclear. Por lo tanto, parte de la energía interna de una molécula puede ser modificada químicamente, como se observa a continuación en la molécula ejemplo: A-A-A-A. Esta se puede descomponer y dar origen a 4 moléculas de A, liberando una cierta cantidad de energía. Se debe tener en cuenta que la energía liberada es igual a la que se gastaría en sintetizarla nuevamente, más una cierta cantidad para hacer la reacción viable. Es decir parte de ella debe disiparse al entorno debido a las consideraciones entrópicas. De esta manera el proceso será factible, posible o favorable: A-A-A-A

------------- A + A + A + A +

Energía

Siempre se esta perdiendo energía hacia el entorno, tanto en la degradación como en la síntesis de una molécula. La energía antes y después del proceso se define como: ΔE = E antes - E después = Q – W. Aquí el término Q lo podemos emplear con signo positivo o + Q, que viene siendo el calor que se absorbe o se transfiere desde el entorno al sistema con un aumento de la Energía interna ΔE, mientras que de la forma - Q o con signo negativo, se libera o se transfiere al entorno y es cuando ΔE disminuye. Por otro lado, + W es el trabajo que se hace sobre el entorno y que disminuye la energía interna. Solo cuando W lleva signo negativo como – W, es el trabajo que el entorno hace sobre el sistema y en este caso ΔE puede aumentar. De esta manera ΔE solo representa el calor que se maneja en el sistema durante el estado inicial y el estado final en el curso de una transformación química. Así tenemos, que si oxidamos un mol de Glucosa en el organismo vamos a producir calor manteniendo la temperatura corporal y vamos a ejercer varios tipos de trabajos. Entre ellos tenemos el trabajo quimiosmótico para mantener la constancia de nuestro medio interno, el trabajo mecánico efectuado por los músculos cuando nos desplazamos de un lugar a otro o bien el trabajo para mantener la conducción nerviosa o atrapar algo de la energía en otra molécula química, etc. Son todos estos, ejemplos de transformación energética de un tipo a otro. Por lo tanto, el cambio de energía interna de un mol de Glucosa, se desglosa en la cantidad total de calor que puede producir menos el trabajo que puede efectuar una vez que se haya oxidado, es decir: ΔE = Q - W W = P ΔV

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y y a la vez

P ΔV = n R T

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La ecuación: ΔE = E (estado inicial sistema) - E (estado final sistema) = Q – W simboliza el primer principio de la termodinámica e indica que la diferencia de energía interna de un sistema, es decir la energía entre su estado inicial y final después que ha ocurrido un proceso, dependerá del contenido total de su energía calórica Q ( la energía contenida en su interior por las interacciones internas) menos el trabajo que el entorno realiza sobre el sistema o el sistema sobre el entorno. De esta forma, se indica que la energía se transforma de un tipo en otro o de calórica a mecánica o de mecánica a eléctrica. Es decir, la energía no se crea, ni se destruye y los cambios de energía interna ΔE, dependerán exclusivamente de los estados iniciales y finales del sistema definidos por sus condiciones de P, V y T. ΔE es una función de estado (inicial y final) Por ejemplo, si oxidamos un litro gasolina se deberá definir el estado de una molécula desde su condición inicial, inalterada y completa, que puede ser en estado sólido, líquido o gaseoso hasta su oxidación total a CO2 gas y H2O líquido. Se incluye aquí su cambio de estado, es decir el sistema puede pasar desde líquido a gas por lo que se debe considerar el cambio de volumen ΔV a Presión constante. Como Δ W puede estar representado por P ΔV significará que el sistema puede efectuar una cierta cantidad de trabajo moviendo algún pistón. Por el contrario, los cambios en los sistemas biológicos son de un volumen muy pequeño y las reacciones no ocurren con gases sino que en solución, no se empujan pistones aquí y no se le dará importancia a P ΔV, ya que las reacciones se llevan a cabo a presión constante. En los sistemas biológicos tendremos que el calor liberado por la oxidación de un mol de Glucosa equivale solamente a la energía interna del sistema o ΔE, que representa la energía que poseen la moléculas debido a sus interacciones internas como enlaces covalentes, energía vibracional y rotacional antes del proceso de oxidación y después que esta se ha oxidado y convertido a CO2 y se encuentra en la forma de ión soluble - HCO3 y H2O. Por lo tanto, tendremos que ΔE será igual a ΔQ o el calor total liberado, que será igual al contenido de energía de la molécula. A su vez, este calor puede ser disipado y parte de él será atrapado químicamente por otras moléculas que se encuentran en proceso de síntesis u formación. Por lo tanto es necesario aplicar aquí una nueva función de estado que se conoce como Entalpía o ΔH. Esta se aproxima o es equivalente a ΔE cuando W es 0. Es decir, no se efectúa trabajo sobre el medio ni este aplica trabajo sobre el sistema. Aquí no se emplea PΔV y para medir los cambios de energía de un proceso se ocupará aquella forma de energía conocida como calor. Luego, tenemos que ΔH = ΔE a W = 0 y Presión constante, considerando que ΔV es muy pequeño en cualquier proceso biológico. Por otro lado, un cambio de entalpía ΔH, no tiene que ver con que una reacción sea espontánea o no. En otras palabras no hay compatibilidad entre espontaneidad y el

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valor de cambio de la energía interna. Al disolver NaCl en agua se produce un proceso endotérmico donde ΔH aumenta, lo que indica que se toma energía del medio. Esta disolución enfría las paredes del vaso que la contiene al tomar energía del entorno y aumenta el desorden al separar los iones Sodio de los iones Cloro. Por otro lado cuando se mezcla Ác. Sulfúrico con agua, se libera calor al entorno lo que caracteriza a un proceso exotérmico y ΔH disminuye. Aquí se produce una rápida = elevación de la temperatura debido a la interacción agua - SO4 y la interacción + + agua –ión H , para producir ión Hidrónio H3O . Ambos iones liberan energía al romper las interacciones agua-agua y formar las interacciones agua-ion, haciendo que en todo caso aumente también el desorden, acompañado de corrientes de convección, vapor y turbulencia. En ambos procesos anteriores el agua se interpone entre los iones tanto de una sal (NaCl) como de un ácido (H2SO4), para ello se rompen las interacciones que mantienen la identidad de la sal y el ácido, para formar nuevas interacciones con el agua. Como esta es un dipolo hidrata y recubre a los iones disminuyendo sus cargas netas superficiales. Ambos procesos migran hacia un estado donde se toma o se libera energía del entorno dependiendo del balance de energía necesario para romper las interacciones consigo mismo y formar nuevas con el agua. La única fuerza que los mueve es la separación de los iones o aumento del desorden o entropía: a) Baja la temperatura (toma energía)) Energía del Entorno + Sal de NaCl + H2O ---------------- Na—H2O + Cl---H2O b) Sube la temperatura (entrega energía) H2SO4 + H2O ---------------------------------- H+----H2O + SO=4 ----H2O + Energía al Entorno Después de analizar estos ejemplos se puede pasar al segundo principio de la termodinámica, que especifica que todo proceso será del tipo espontáneo cuando camina, migra o se relaja en la dirección del aumento de la entropía u desorden: ΔG = ΔH - TΔS Como ΔS no puede ser medido, nos referiremos a ΔG que indicará de manera indirecta cuando una reacción sea espontánea o no. Si ΔG es negativo se dice que es exergónico y si es ΔG es + será endergónico. Cuando ΔG es igual a 0, el sistema se encontrará en equilibrio termodinámico. Mientras que ΔH permanecerá como el contenido total de energía del sistema. Al aplicar el enfoque la segunda ecuación de la termodinámica a las moléculas biológicas, encontramos que algunas se degradan en otras más simples y desordenadas, mientras que otras toman la energía de las primeras y se ordenan. Se comportan de manera acoplada entre síntesis y degradación o catabolismo y anabolismo mediante una molécula intermediaria transportadora de energía entre uno y otro proceso como lo es el ATP. La síntesis no es un proceso espontáneo o termodinámicamente factible, ya que introduce

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orden en las estructuras moleculares que se crean y este proceso requiere de energía química en la forma de ATP. Por otro lado, parte de la energía que se gasta en la síntesis debe perderse al entorno, para así lograr siempre un aumento de la entropía del Universo o en otras palabras hacer la distribución de la energía más uniforme. La energía interna de las moléculas puede ser ahora representada por ΔH, que se denominaba anteriormente como el contenido energético o calórico de una sustancia. Sin embargo, ahora pasará a ser o representar el orden interno de la molécula conocido como ΔE. La cantidad que se libere dependerá de la cantidad de desorden o entropía que se produzca cuando el sistema tienda al equilibrio o ΔG tienda a ser igual a 0. En este caso tendremos que: ΔH = ΔE = TΔS o en otras palabras: Orden = Contenido interno de energía = Desorden para salir de el estado actual o dirigirse en uno u otro sentido, es necesario tomar o dar energía y la ecuación anterior se puede aproximar empíricamente a: Orden = Desorden + Energía que es homóloga a: ΔH =

TΔS

+

ΔG

Como ejemplo tenemos las siguientes reacciones: Glucosa + 6O2 = 6CO2(gas) + 6H2O(líquido) + Energía

o o

Glucógeno + nO2 = nCO2(gas) + nH2O(líquido) + Energía Triacil Gliceroles + nO2 = nCO2(gas) + nH2O(líquido) + Energía

También puede ocurrir el caso contrario, al invertir la ecuación anterior : Energía + Desorden = Orden ΔG

+

TΔS

= ΔH

que en su forma biológica es homólogo a la Fotosíntesis: o

Energía Radiante + nCO2 (gas) + nH2O (líquido) = Celulosa nATP + nCH3COO-S-CoA = Ácido Graso + nH-S-CoA.

o bien de otra manera: SINTESIS = DEGRADACION + ENERGIA o aún:

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ANABOLISMO = CATABOLISMO + ENERGIA o: REDUCIDO = OXIDADO + ENERGÍA La degradación, el desorden y el estado oxidado son espontáneos, proceden en la dirección en que liberan energía hasta alcanzar un nivel en que entran en equilibrio con el entorno. Cuando su energía se hace igual a la del entorno, se detienen. Por lo tanto, para activarlos nuevamente se necesitará de una fuente de energía externa que al ser aplicada al sistema degradado, desordenado u oxidado, lo lleve nuevamente a formar una estructura o molécula compleja. Este proceso del tipo no espontáneo requiere de energía. Si la que se sintetiza es una macromolécula con una sola unidad que se repite muchas veces, bastará con que otra molécula se degrade en forma acoplada para generar orden y energía. Volver al inicio 4) EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y EQUILIBRIO TERMODINÁMICO En la figura que aparece a continuación (fig. 5 – 7) se puede observar como varias moléculas individuales de un sustrato metabólico, entran a un compartimento de una célula y a través de varios pasos sucesivos se ordenan progresivamente en una molécula de tres unidades. Estas posteriormente se unen entre sí generando una macromolécula de mayor tamaño por medio de una sucesiva adición de unidades de tres. Posteriormente ante un requerimiento energético de la célula, la macromolécula de almacenamiento se descompone progresivamente, hasta liberar la molécula unitaria original. Esta última es posteriormente degradada en otras de menor tamaño aún y finalmente eliminada del compartimiento.

La reacción a, que introduce sustrato en contra de un gradiente de concentración, es seguida por b, c y x. Son en general todas aquellas que producen orden, no son espontáneas o favorables desde el punto de vista termodinámico, mientras que las reacciones u, v junto a w, si son todas favorables, ya que tienden al desorden. En otras palabras, las primeras son endergónicas y las segundas exergónicas, mientras que el sistema se mantiene en equilibrio de estado estable. Las reacciones x, z, u, v deben producir energía para que las otras reacciones a, b, c y d procedan de izquierda a derecha. Además, debe disiparse parte de esta energía al entorno para que el sistema en conjunto proceda desde la molécula unitaria en el exterior hacia la molécula degradada y posteriormente eliminada fuera del compartimento.

MOLÉCULA DEGRADADA

MOLÉCULA UNITARIA a

b

c

d

x 340

z

u

v

w

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MACROMOLÉCULA

En

Fig. 5 – 7. Síntesis y degradación de una macromolécula. Al profundizar en estos conceptos, podemos aplicarlos a las moléculas biológicas como lo son Glicógeno, Almidón o Celulosa e incluso a la formación de las bicapas de fosfolípidos y micelas. Encontramos aquí, que las macromoléculas se encuentran en equilibrio de estado estable entre dos tendencias. Una de ellas es la tendencia al orden, como es la síntesis que la lleva a un estado energético por sobre el equilibrio termodinámico con el entorno. Es decir, se debe gastar energía en extender la macromolécula al agregar nuevas unidades. La otra tendencia es al desorden, donde se libera energía hacia el entorno en base a la degradación de la macromolécula en sus unidades (Fig. 5 -7). Las moléculas de Glucosa que constituyen las unidades del Glicógeno se encuentran unidas mediante enlaces covalentes. Estos enlaces se forman por medio de una reacción de transferencia de energía con gasto de ATP. Es decir, se activa a la molécula de Glucosa por unión al nucleótido UTP quedando como UDP-Glucosa. De esta manera cuando se agregan nuevas moléculas de Glucosa la reacción se convierte en exergónica y favorable. A su vez un gasto de un UTP equivale a un gasto de un ATP. Por medio de este mecanismo se extiende y crece la molécula de Glicógeno generando un determinado orden, aunque repetitivo. Este proceso de crecimiento no es espontáneo o favorable y debe ser acoplado a otro proceso que sí lo sea. Esta labor, como se observa recae en la hidrólisis del ATP, que aporta energía y a su vez se desordena al hidrolizarse. El proceso aquí descrito, es siempre posible mientras se disipe una parte de la energía del ATP al entorno, de esta manera es posible que se mantenga lejos del equilibrio termodinámico.

341

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MOLÉCULA MÁS COMPLEJA EN EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y LEJOS DEL EQUILIBRIO TERMODINÁMICO

E N E R G I A

ORDEN DESORDEN

ADP + P

H2O MOLÉCULA MENOS COMPLEJA

ATP DESORDEN

ORDEN

ENERGÍA BASAL EN EQUILIBRIO TERMODINÁMICO CON EL ENTORNO

Fig 6 - 7. Las moléculas se sintetizan y permanecen en estado estable y luego se degradan

Por otro lado, la macromolécula de Glicógeno sola, fuera del contexto de la síntesis tiende a degradarse, a liberar energía o bien equilibrar su energía con la del entorno. Este proceso puede ocurrir mediante su hidrólisis que la puede llevar a su descomposición total en sus unidades de Glucosa. En resumen, para mantener a la macromolécula con un determinado tamaño y orden. Se debe contar con un aporte continuo de energía en la forma de ATP y otro de materia prima como es la Glucosa. En caso contrario la energía acumulada en la macromolécula de Glicógeno se disipará hacia el entorno, dejando subproductos desordenados y de menor tamaño. Otro ejemplo biológico a considerar es la compleja estructura de las bicapas de fosfolípidos que forman membranas cerradas alrededor del citoplasma, núcleo y organelos (Fig 7- 7). Estas membranas cuentan con una particular disposición, que se puede entender como ordenada y repetitiva. El extremo polar de cada molécula se halla en contacto con el agua mientras que el otro extremo, el apolar se oculta de esta. Como sabemos esta particular disposición, se debe a que los residuos alquílicos de los fosfolípidos no son capaces de interaccionar con un dipolo débil como es el agua y a la vez restringen la capacidad de las moléculas de agua para moverse en todas las direcciones coartando su libertad de desplazamiento. En otras palabras, el agua pierde su fluidez. Por consiguiente, la única manera de que el agua recupere su estado de libertad y desorden, es agrupando a los fosfolípidos de la manera que presenten la menor superficie dirigida hacia el agua. De esta forma las moléculas de agua ganan en desorden y las moléculas de fosfolípidos ganan en orden, generando un sistema acoplado que a su vez libera cierta cantidad de energía hacia el entorno para que el proceso sea favorable.

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MOLECULAS DE FOSFOLÍPIDOS SEPARADOS O EN DESORDEN

MOLÉCULAS DE FOSFOLÍPIDOS EN ORDEN EN BICAPAS O MICELAS

+ MOLÉCULAS DE AGUA EN DESORDEN O EN FORMA MÁS FLUIDA

MOLÉCULAS DE AGUA EN ORDEN O MENOS FLUIDO

Fig 7 - 7. Formación de una estructura ordenada en micela o bicapa mientras las moléculas agua ganan en desorden o el agua se hace más fluida.

de

Volver al inicio 5) REACCIONES ENDERGÓNICAS Y EXERGÓNICAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO Las constantes de equilibrio de las reacciones bioquímicas y las energías que estas toman o entregan al medio se han medido siempre, en sistemas aislados en condiciones estándar (pH 7, Temperatura de 25º C, Presión 1 atm), donde se conserva la materia y la energía. En este enfoque, se tratará de hacer una aproximación a la forma real en que ocurren los procesos bioquímicos en un sistema abierto, sin pretender alcanzar la explicación total de estos procesos en la realidad. La ecuación que relaciona la tendencia real ( ΔG ) de un sistema que puede ser exergónico, en equilibrio o endergónico con la tendencia natural ( ΔGº ) dada por la constante equilibrio, junto a la otra tendencia ( 2,3 R T log P/S ) dada por las concentraciones reales de sustrato ( S ) y producto ( P ) de la misma reacción, cuando esta es parte de una vía metabólica, se encuentra dada por la ecuación general: P ΔG = ΔGº + 2,3 R T log --- ( 1 ) S ΔGº´ = - 2,3 R T log Keq

(2)

;

P Keq = ---- ( 3 ) S

En la ecuación 2, cuando la concentración de Sustrato S es igual a la de Producto P, se tiene que la Keq es igual a 1 y que ΔGº´ es igual a 0. la reacción se encuentra en equilibrio termodinámico. Se dirige tanto de derecha a izquierda como de izquierda a derecha. Se la puede desplazar a uno y otro lado solamente si pertenece a una cadena de reacciones donde S y P son sustratos o productos de otras reacciones y cada una de ellas influirá en la que se ha considerado. A continuación se explicarán estos conceptos.

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El valor de ΔG0' indicará la tendencia natural de la reacción. De esta manera cuando obtenemos un valor ΔG con signo negativo significa que la reacción llega al equilibrio con más producto que sustrato. Esta reacción es denominada Exergónica o termodinámicamente favorable y cuando se obtiene un valor ΔG con signo positivo llegará al equilibrio termodinámico con más sustrato que producto. En este caso será denominada Endergónica o termodinámicamente desfavorable. Cuando una reacción alcanza su equilibrio químico, no necesariamente debe estar en una relación P/S = 1, sino que puede alcanzar distintas proporciones mayores o menores de 1. En este momento se dice que el sistema ya no progresa más es decir, se encuentra estable. Este sistema pudo efectuar trabajo en su camino hacia la estabilidad o hacia el equilibrio y una vez alcanzado este, no toma ni entrega energía. El equilibrio termodinámico se diferencia del equilibrio de estado estable en que este último es dinámico o capaz de continuar por medio de otras reacciones que aporten continuamente sustrato y a la vez remuevan producto de la reacción sacándola del equilibrio con el entorno o el equilibrio termodinámico. A continuación se pueden observar algunos ejemplos de reacciones individuales que alcanzan su equilibrio termodinámico: CASO 1 Condición inicial a tiempo 0: S-------------->P 100mM 0mM Condición final a tiempo indefinido: S--------------->P 50mM 50mM Cuando se llegó al equilibrio, la relación entre substrato y producto alcanzó la proporción 50/50. En este caso cuando la Keq = 1, ΔGº´ es también = 0. CASO 2 Condición inicial a tiempo 0: S--------------->P 100mM 0mM Condición final a tiempo indefinido: S--------------->P 20mM 80mM En este caso al alcanzar el equilibrio la Keq = 80/20 = 4 o bien ΔGº´ = - 1357 log 4 = - 817 cal/mol y es exergónica. En general se dice que una reacción química es Exergónica cuando libera energía, la Keq es > 1 y ocurre desde una molécula de alta a una de baja energía o bien de una molécula estructuralmente compleja a varias otras moléculas

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estructuralmente simples o más oxidadas. La reacción procede aquí de izquierda a derecha. CASO 3. Condición inicial a tiempo 0: S-------------->P 100mM 0mM Condición final a tiempo indefinido: S-------------->P 80mM 20mM La constante de equilibrio Keq = 20/80=0.16, lo que entrega un valor de: ΔGº´ = - 1357 log 0.16 = + 1080 cal/mol con signo positivo. Se dice aquí, que una reacción química es Endergónica cuando toma energía del medio y para que ocurra se le debe suministrar energía. Esto sucede cuando la Keq es < 1 y la reacción procede desde moléculas simples u oxidadas a una molécula reducida, compleja y de alta energía o una molécula con varios grupos fosfatos en su estructura. ¿Cómo es posible empujar una reacción Endergónica? Durante el metabolismo intermediario el producto de una reacción es el sustrato de la siguiente, por lo que las concentraciones no se mantienen constantes y las energías finales de una vía metabólica son la suma algebraica de las reacciones parciales acopladas con signo negativo o positivo. Por lo tanto si acoplamos una reacción Exergónica con una Endergónica es posible que esta última ocurra, ya que la energía que necesita la tomará de la primera siempre y cuando exista una cantidad extra de energía que se entrega al entorno. Si solo toma la justa energía que necesita quedará solo en equilibrio ( ΔGº´ = 0 ) y hacia donde se desplace la reacción dependerá de la cantidad de substrato o producto presente. Si estos son a la vez tomados por otra reacción posterior o aportados por una reacción previa, este par de reacciones tomará el mismo sentido en que se aporte sustrato o se remueva el producto. Al analizar el caso de una reacción que se encuentra en medio de una vía metabólica donde el sustrato es el producto de la reacción anterior y a su vez el producto es el sustrato de la reacción que la precede. Es posible concluir que puede variar en uno u otro sentido de manera independiente a las tendencias individuales de la reacción central. La energía no solo dependerá de la concentración de sustratos y productos, sino que también dependerá de la energía que tenga la estructura molecular involucrada como sustrato o como producto. En la Tabla 1- 7 se puede ilustrar cuando una reacción esta lejos del equilibrio y en que sentido puede proceder, basándose en la ecuación general: ΔG = - 2.3 R T Log Keq + 2.3 R T Log P/S si

ΔG0' = - 2.3 R T Log Keq

TABLA 1 - 7 345

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ΔG a) b) c) d) e)

f) g) h) i) j)

+

ΔG0'

Log Keq

Keq

2.3 R T Log P/S Log P/S

P

S

4071 2714 1357 0 1357

-1357 - 1357 - 1357 - 1357 - 1357

1 1 1 1 1

10 10 10 10 10

- 2714 - 1357 0 + 1357 + 2714

-2 -1 0 1 2

1 1 5,5 10 100

100 10 5,5 1 1

+ 4071 + 2714 + 1357 0 - 1357

+ 1357 + 1357 + 1357 + 1357 + 1357

-1 -1 -1 -1 -1

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

+ 2714 + 1357 0 - 1357 - 2714

2 1 0 -1 -2

100 10 5,5 10 1

1 1 5,5 100 100

Esta ecuación explica el caso en que S y P, son intermediarios de otras reacciones y su concentración puede variar independientemente a la Keq de la reacción para S y P: AB[S][P]CD En el caso descrito en la Tabla 1- 7 a), la Keq es de un valor de 10, lo que significa que la reacción será exergónica con -1357 cal/mol y más aún en condiciones reales en que por aporte de B en la cadena de reacciones la concentración del sustrato S pase a ser 100 veces mayor que la del producto P que pasa a C. La reacción S---->P se hace más exergónica aún, dando un total de - 4071 cal/mol. En el caso c), la tendencia natural de la reacción dada por su Keq y su ΔGo´ , la mantiene exergónica aunque la concentración real de S y P es igual a 5,5 / 5,5 debido al efecto de B y C. En este caso no hay contribución ninguna por la variación de la concentración de S y P en la vía metabólica y la reacción central permanece exergónica. En el caso d), la ΔG final de la reacción es de 0 o bien se encuentra en equilibrio, ya que su tendencia natural a ser exergónica es balanceada por la distribución de S y P debido a la contribución aportada por B y C. Finalmente en e) la reacción se torna endergónica por la gran acumulación de P = 100. En los casos desde f), en adelante la reacción es endergónica en su tendencia natural debido a su baja Keq, sin embargo a medida que las concentraciones reales aportan S y remueven P por el efecto de B y C, ocurre que en los casos sucesivos g y h, se hace menos endergónica y más exergónica para llegar al caso i donde esta en equilibrio, para finalmente llegar a j, donde se torna nuevamente exergónica. En la siguiente figura se puede observar un gráfico de energía libre de la reacción versus logaritmo de la relación P/S.

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+ 4071

ΔG

Keq = 10

+ 2714 + 1357 -2

-1

0

1

2 log (P)/(S)

- 1357 Keq = 0,1

- 2714 - 4071

Fig 8 – 7. Gráfico ΔG versus log P/S.

En este gráfico se puede emular una recta similar a la ecuación y = m x + n, donde m es la pendiente igual a 2,3 RT y n es el intercepto igual a – 2,3 RT log Keq o ΔGº´. Entonces se puede graficar ΔG que pasa a ser la variable Y junto a la variable X que pasa a ser la relación log P/ S.

(P) ΔG = ± ΔGº´ + 2,3 RT log ---------(S)

Y = n (intercepto) + m (pendiente) X

Se observa que ambas reacciones con distinta constante de equilibrio pueden pasar de exergónicas al equilibrio con ΔG =0 y posteriormente a endergónicas a medida que el producto se acumula y no sea removido. Volver al inicio

6) CARACTERISTICAS DEL CATABOLISMO.

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La secuencia de reacciones destinadas a la producción de energía parte con reacciones de activación de las respectivas moléculas que se pretenden degradar u oxidar. De esta manera hay que gastar algo de la energía para llevar las moléculas de sustrato a un nivel más elevado, donde sean susceptibles de sucesivas modificaciones químicas que liberen la energía contenida en sus interacciones internas. Para degradar Glucosa, Ácidos Grasos o Aminoácidos y obtener ATP, hay que llevar estas moléculas a un estado de inestabilidad estructural mediante la excitación de la molécula. Debemos incrementar su estado vibracional o aumentar su densidad electrónica, para luego romperla en moléculas más pequeñas que entreguen más energía que la originalmente gastada en destabilizar la molécula original. Por otro lado, para continuar con este proceso se debe producir más energía que la necesaria para impulsar las reacciones desfavorables, como lo son aquellas reacciones de síntesis de macromoléculas, contrarias a la degradación. Las reacciones de síntesis no son termodinámicamente factibles o espontáneas y son del tipo endergónico. Más aún parte de la energía producida en la degradación se debe disipar al entorno para así aumentar la entropía y hacer que todo este sistema sea factible. Esto significa que siempre existirá un equilibrio dinámico entre degradación y síntesis, con algo de energía perdida hacia el medio externo como es el calor, para que un proceso sea termodinámicamente favorable. El catabolismo se puede comparar con el desorden, la oxidación o la degradación de las moléculas para producir energía. , , Molécula Activada

Energí a de Activaió Energía adquirida en la Dieta

ATP

Energía disipada al Entorno

+

Energía ocupada en la Síntesis

4

DEGRADACIÓN DE MOLÉCULAS: PROCESOS EXERGÓNICOS

Energía de la Degradación

=

Energía ocupada en la Activación

: Unidades de moléculas biológicas

SINTESIS DE MOLÉCULAS: PROCESOS ENDERGÓNICOS

+

COORDENADA DE REACCION

Energía ocupada en la Síntesis

+

Energía disipada al Entorno

Fig. 9 - 7. El catabolismo produce suficiente energía química para impulsar a las reacciones no espontáneas del anabolismo más una cantidad extra que debe perderse hacia el medio.

El catabolismo se puede estudiar analizando lo que sucede al degradarse la molécula de Glucosa (Ver Capítulo 7). El primer paso consiste en aplicar energía a la molécula para

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destabilizarla y este proceso será eficiente siempre que la energía aplicada sea menor que la extraída. La Glucosa puede ser llevada a remontar la barrera de energía para hacerla más inestable y liberar parte de su energía mediante las siguientes modificaciones que se enlistan a continuación: a) Transformar su anillo de seis miembros en uno de cinco. (La nube electrónica se encuentra de esta manera forzada a contener los mismos electrones en un menor espacio). b) Adición de grupos cargados en zonas opuestas de la molécula. (Al tener similar carga estos grupos se repelerán unos a otros introduciendo estrés estructural.) c) Llevar la molécula de la forma silla (relajada) a la forma bote (comprimida). De esta manera las nubes electrónicas se encuentran más próximas. d) En el caso de la oxidación de otras moléculas como los ácidos grasos se recurre a la activación con CoASH y ATP para excitar los orbitales. Todo este manejo se emplea para el cebado de la Glucosa y se realiza mediante reordenamientos estructurales catalizados por varias enzimas en reacciones parciales no espontáneas que necesitan de ATP para ser termodinámicamente favorables. Por otro lado, es necesario reafirmar que el hecho de que se empleen enzimas no garantiza que una reacción suceda en una dirección u otra, solo garantiza la velocidad con que tomará una u otro dirección. Las enzimas no impulsan a las reacciones desfavorables o favorables, solo las hacen más rápidas y se demoran menos en alcanzar el equilibrio. Volver al inicio 7) CARACTERISTICAS DEL ANABOLISMO. Para crear una molécula durante el anabolismo, es necesario entregar energía. Cada una de las unidades que componen una estructura compleja se debe agregar aportando energía no solo a la estructura, sino que a la reacción misma para que esta sea posible. En el fondo las estructuras químicas no son más que una representación material de una fracción de la energía empleada en su síntesis. Cada molécula que se adiciona a una macromolécula durante la síntesis, debe traer consigo algo de energía extra. No solo para poder integrarse a un sistema más complejo como el de la macromolécula, sino que para hacer su integración termodinámicamente favorable. Esta energía también puede ser aportada por el ATP. Como a esta altura se domina el concepto de catabolismo y anabolismo, es necesario pasar a explicar como se relacionan ambos mediante el equilibrio de estado estable. De esta manera es posible mantener una integridad estructural capaz de efectuar trabajo como ocurre con el metabolismo intermediario. Para graficar el significado de este concepto podemos recurrir a la siguiente analogía. Si disponemos de tres recipientes a distintas alturas donde cae el agua desde el superior al inferior, el recipiente del medio tendrá un nivel o volumen constante, siempre que el flujo de entrada sea igual al de salida. La entrada puede considerarse como anabolismo y la salida como catabolismo y si ambos presentan igual flujo, se mantiene el equilibrio de estado estable. Este ejemplo se puede trasladar a un sistema cerrado donde se sintetizan moléculas nuevas y a la vez se destruyen moléculas de la dieta para obtener energía. Sin embargo, para que ambas series de reacciones ocurran termodinámicamente, es sabido que se debe de perder algo de energía hacia el entorno o al medio circundante. Algunas estructuras se desordenan emitiendo energía al medio y solo parte de ella puede ser atrapada como energía química o ATP y esta puede ser ocupada en

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la síntesis. La eficiencia no es nunca 100%, por eso la energía liberada durante el catabolismo es mayor que la empleada en los procesos de síntesis (anabolismo). La célula en sí, es un sistema abierto donde parte de la energía pasa al medio externo para permitir que ocurran ciertos procesos internos. Es interesante destacar aquí que los organismos vivientes se encuentran a presión y temperatura constante. Ninguno de ellos lleva a cabo reacciones bioquímicas remontando barreras de energía mediante alta presión, como podría suceder durante la compresión de gases por un pistón en un cilindro o aumentando la energía térmica a voluntad para alcanzar el estado activado en las reacciones moleculares.

Mamiferos Energia

Barreras de Energia

Reptiles

Coordenada de Reaccion

Fig 10 - 7. Los reptiles son más eficientes que los mamíferos.

Dentro de la naturaleza de los seres vivos y desde el punto de vista macromolecular, se pueden considerar como más eficientes termodinámicamente a los reptiles (Fig 10 -7), ya que no controlan su temperatura interna y deben esperar hasta alcanzar una temperatura óptima. Este proceso ocurre por medio del empleo de la energía radiante externa, con ella suben su temperatura y las enzimas son capaces de adquirir la conformación óptima para catalizar sus reacciones. Al mismo tiempo como no tienen que luchar contra una agitación térmica constante como los mamíferos, sus enzimas toman más débilmente a los sustratos y los sueltan como productos con una mayor facilidad, lo que redunda en una barrera de energía menor para las mismas reacciones comparadas a las de un mamífero (Fig. 10 - 7). Sin embargo, las reacciones bioquímicas poseen las mismas constantes de equilibrio en ambas especies. Por otro lado, las plantas no ingieren moléculas complejas y solo se alimentan de CO2, H2O y sales, pero sintetizan moléculas tanto o más complejas que las de los animales. Por lo tanto en las plantas se debe impulsar una serie de reacciones desfavorables (no espontáneas) con energía de alguna fuente. Esta última es la energía radiante del Sol (Fig. 11 - 7).

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FOTOSINTESIS ENERGIA RADIANTE

ATP NADPH

Energía radiante

Energía radiante empleada en la síntesis de ATP

SINTESIS DE NUEVAS MOLÉCULAS

ETAPA CLARA excitación de electrones del Fotosistema y generación de gradiente electroquímico

Glucosa

ETAPA OSCURA

CO2, H2O

Energía necesaria para impulsar las reacciones endergónicas de síntesis

ANABOLISMO

ENERGIA RADIANTE

=

ENERGIA QUÍMICA

+

ENERGIA QUE SE PIERDE AL ENTORNO

Fig 11- 7. La energía radiante se transforma en energía química para impulsar las reacciones endergónicas de síntesis más lo que se pierde al entorno.

En la planta existe un sistema transductor de energía denominado Cloroplasto. En el ocurren los procesos destinados a almacenar la energía radiante en las estructuras químicas. El sistema biológico dentro del Cloroplasto dispone de electrones de alta energía bombeados por la absorción de la energía radiante. Esta ocurre por medio de varios pigmentos distintos. Posteriormente, los electrones excitados entregan paulatinamente su energía a través de un sistema quimiosmótico destinado a producir moléculas de alta energía como ATP y NADPH. A continuación mediante una serie de reacciones químicas de reducción con NADPH e impulsadas por la energía del ATP, se obtiene finalmente almidón y el crecimiento de complejas estructuras. Durante la noche cuando los Cloroplastos no reciben luz y no pueden actuar como atrapadores y transformadores de energía, el metabolismo procede a degradar las complejas moléculas sintetizadas durante el día en el interior de otros organelos conocidos como Mitocondrias. Estas estructuras se encuentran especializadas en la producción de energía por oxidación con O2 mediante la degradación de moléculas complejas. Durante este proceso se destruye lo que se sintetizó en el día para así obtener ATP, pero ahora en la Mitocondria. Volver al inicio

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8) ENFOQUE ACTUAL DE LA TERMODINÁCA APLICADA A LA EXISTENCIA DE LAS MACROMOLÉCULAS. Nuevos enfoques termodinámicos han visualizado la existencia de un equilibrio jerárquico (por rangos) en la organización de los sistemas vivientes. Este equilibrio se desarrolla con una complejidad progresiva, desde una simple molécula hasta un organismo superior e incluso alcanza al medio ambiente donde este organismo prospera, es decir su nicho ecológico. Cada uno de los distintos grados de complejidad, que van desde molécula, estructura supramolecular, organelo, célula, etc., presentan a la vez una componente temporal y espacial. Así las moléculas ocupan un espacio dado y tienen una vida media menor que la estructura o molécula que componen y a su vez cada estructura ocupa otro espacio y tiene a su vez una vida media de menor tiempo, que el organelo al cual pertenecen y así sucesivamente. El grado de organización y compartamentalización de estas agrupaciones de moléculas, se debe a la creación de nuevas estructuras cada vez más estables y complejas unas de otras. Si consideramos la relación que existe entre el DNA y las proteínas. Asumimos que el DNA debe ser estable con una función específica, mientras que las Proteínas muestran una variedad de funciones específicas, que se adaptan y relacionan con el medio. En otras palabras el DNA es en la actualidad, una molécula considerada como sinónimo de orden, información y complejidad, tanto en su función como en la preservación del código genético, mientras que las proteínas podrán ser consideradas como representantes de la complejidad y efectoras de las más diversas funciones. En general, los organismos son coherentes y no se comportan como un motor movido por calor (máquina a vapor, motor de combustión interna, motor diesel, motor Stirling, etc.). Los organismos son sistemas isotérmicos que transfieren la energía desde una estructura compleja a otra desordenada y a la vez el desorden lo transforman en coherencia u orden y complejidad mediante mecanismos acoplados. Es posible observar que un sistema biológico se desordena (ingesta de comida) y libera energía (catabolismo) para que aquel otro sistema acoplado al primero, se ordene (anabolismo) y mantenga su jerarquía estructural tanto en el espacio como en el tiempo. Por otro lado, como se ha vislumbrado a lo largo de este Capítulo, el término de Orden es algo más complicado y en realidad debiera de significar dentro de los seres vivos, el grado de complejidad jerárquica que alcanzan sus estructuras supramoleculares. Una molécula de Glicógeno o una de Celulosa, pueden ser consideradas como ordenadas, pero no complejas mientras que una Proteína sí es compleja, ya que no repite constantemente sus subunidades, sino que están dispuestas siguiendo la información guardada en el DNA. Por ejemplo, un conjunto de letras puede estar desordenado y no significar nada, sin embargo si pertenecen a uno de los muchos idiomas y se agrupan entre sí mediante ciertas reglas gramaticales, dan origen a un significado. Igual cosa sucede con un ácido nucleico, el ordenamiento de un grupo de nucleótidos y posteriormente de los distintos grupos de aminoácidos en una secuencia puede no significar absolutamente nada, respecto a cumplir una función determinada. Una palabra en un idioma significa algo y en otro nada. Por lo tanto, en un principio se pudieron crear innumerables

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secuencias y combinaciones, mientras no se impusieran las leyes evolutivas que seleccionaron solo determinados significados como beneficiosos para la sobrevivencia de un lenguaje. Este último pasó entonces a ser complejo. Igual cosa pudo haber sucedido con las macromoléculas complejas como las Proteínas y el DNA. (Fig. 12 ). Estas moléculas pasaron desde aminoácidos y nucleótidos a macromoléculas complejas de gran tamaño y fueron capaces de portar información. El Glicógeno es una molécula tan solo ordenada y no compleja, donde una estructura básica se repite constantemente. Una bicapa de Fosfolípidos es otra agrupación de moléculas ordenadas a diferencia del DNA y las Proteínas, donde se encuentra una secuencia compleja de unidades, ya sea de aminoácidos o nucleótidos que portan información. Las moléculas portadoras de información son aquellas que han sobrevivido en el tiempo y han sido seleccionadas mediante cuellos de botella evolutivos. A su vez han reaccionado bajo distintos cambios evolutivos impuestos por las leyes de la herencia y como producto de ello han logrado alcanzar mayores y múltiples grados de complejidad, haciendo aparecer nuevas proteínas mediante procesos que se encuentran en la actualidad siendo investigados por la ciencia de la Proteómica ( ver capítulo XX), etc. Muchas líneas de evolución molecular ocurrieron en paralelo dentro de un determinado periodo de tiempo. De esta manera se unieron desde los nucleótidos innumerables polinucleótidos, para así formar distintas secuencias. Dentro de estas se preservaron y/o tuvieron éxito aquellas macromoléculas que portaban información correspondiente al cumplimiento de una función específica impuesta por el ambiente y que entregaba una ventaja a su portador. Aquellas propiedades que entregan al DNA la capacidad de portar información y a las Proteínas el ser una molécula que puede cumplir una determinada función, pudo ser originada por la delegación de ambas características desde el RNA. Esta última macromolécula puede tener ambas funciones, pero a medias y es posible que se necesitara una división de las funciones o especialización, que hizo viables tanto al DNA como a las Proteínas. Se requirieron por lo tanto distintas presiones selectivas para lograr un tipo determinado de organismo adaptado a su ecosistema. Bajo estas premisas es posible intentar subir un peldaño desde la ecuación anterior: Orden = Desorden + Energía a la forma de: Compleijidad = Información + Orden + Energía El paso de Orden a Complejidad ha sido bastante debatido en la actualidad e incluye nuevos conceptos, como aquel que considera la aparición de los sistemas emergentes como resultado de una serie de situaciones ambientales, que se explicará a continuación. Por ejemplo, en la siguiente figura (fig. 12 – 7) se hace una comparación entre la aparición del lenguaje y la generación de moléculas complejas.

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ORDEN DESORDEN sonidos y letras al azar

Letras del abecedario a, x, b, z, u v, r , t s, u , w, , m ,o , etc.

Palabras al azar, pero con significado en cualquier idioma

agua, water, eau, wässer, aqua, soup, campo, esta,camión, sopa, siente crudo, caliente este, etc.

COMPETENCIA

COOPERACIÓN

GLUCOSA, FOSFOLÍPIDOS

COMPLEJIDAD Información mediante frases con sentido y significado

un IDIOMA determinado

“Esta sopa parece agua”

COMPETENCIA

COOPERACIÓN

GLICÓGENO MICELAS Y BICAPAS Macromoléculas repetitivas, son como una palabra que se

ÁTOMOS DE C, H, O, N, S, P

SISTEMA EMERGENTE: COMUNICACIÓ N

COMPETENCIA

AMINOÁCIDOS NUCLEÓTIDOS

RNA molécula que contiene información y es efectora de la información a la vez

COOPERACIÓN Fig. 12 – 7. Evolución de un idioma y el traspaso de información bajo la influencia de las presiones del entorno.

354

PROTEÍNAS Moléculas especializadas efectoras de la información DNA moléculas especializadas que contienen solo información

Héctor Rocha L. Bioenergetica

Los gritos guturales que alguna vez emplearon los primates y otras especies para advertir de ciertas conductas e intenciones a su grupo, frente a la existencia de amenazas, comida o llamados de apareamiento, pasaron por un cuello de botella evolutivo mediante la competencia y cooperación entre los individuos de una misma especie. En el caso de los ancestros humanos, estos redujeron un sonido determinado a una representación gráfica constituida por los ideogramas. Posteriormente, los ideogramas dieron paso a las letras que representaban o describían a este ideograma, en base a una convención de símbolos que a su vez representaban un idioma y permitían una mayor riqueza a la descripción. Las palabras se emplearon entonces para describir una característica o una acción determinada y a medida que pasó el tiempo las exigencias de la comunicación generaron una conexión coherente entre las palabras para así formar frases. Estas últimas pasaron información de un individuo a otro. Sin embargo, existen distintos idiomas y lo que en un idioma determinado o una agrupación de palabras significa algo en base a la convención de símbolos empleados, en otro idioma no significan absolutamente nada. Por lo tanto, los cuellos de botella evolutivos crearon los distintos idiomas y fueron capaces de adicionar información al mensaje transmitido o lograron hacer una diferencia entre las frases coherentes y aquellas que no llevaban significado alguno. De esta manera el entorno fue un forjador de las distintas combinaciones de letras primero y luego de palabras, para lograr constituir un idioma y contribuir al traspaso de la información que entrega nuevas pautas de conducta y ventajas para el individuo informado comparado al desinformado. Lo que distingue a una frase coherente es que un cierto grupo de letras al azar han llegado a simbolizar un significado complejo. De esta manera es posible pasar desde el desorden o azar a la complejidad de un idioma en el traspaso de la información. Un idioma constituye un sistema emergente y ocurre su aparición cuando se desarrollan nuevas estructuras, pautas y propiedades complejas, como resultado de las interacciones del entorno y entre los individuos de una determinada especie como son competencia y cooperación. La aparición de una propiedad emergente no puede ser predicha con anterioridad. Una bandada de pájaros o un cardúmen de peces, se comporta distinto a un individuo e igual cosa un grupo de palabras que constituyen una frase con un cierto significado. Por ejemplo, el mercado de valores es un sistema emergente con un cierto grado de complejidad regulado por la demanda y oferta del petróleo, terrorismo, consumismo, estación del año, etc. Al considerar a las macromoléculas como DNA y Proteínas, dentro de este análisis encontramos que solo el 3 % de todo el DNA humano es informacional o realmente complejo. Gran parte de este cerca del 97% se encuentra formado por repeticiones al azar de distinto tamaño, denominado DNA satélite. El 3 % es estrictamente informacional y codifica al menos para cerca de 30.000 genes. Dentro de los genes, la información más valiosa corresponde a la disposición espacial de los distintos sitios activos de las enzimas, ya que distintas especies cuentan con enzimas con los mismos sitios activos para reacciones similares. A su vez las enzimas son capaces de catalizar determinadas reacciones del metabolismo intermediario cruciales para la sobrevivencia del individuo. Sin embargo, tan solo aquellas secuencias que acompañan a los sitios activos, poseen una mayor variedad y azar entre ellas. Es decir, estas secuencias pueden cambiar en distintas especies considerando el medio interno y externo que cada uno de las distintas especies hace uso, sin generar alteraciones en las vías metabólicas. Mientras que las secuencias cruciales para la disposición del sitio activo en el espacio y los residuos catalíticos mismos,

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no cambian ya que son los mejores aminoácidos para llevar a cabo una función determinada y se encuentran los mismos aminoácidos seleccionados en distintas especies. Por otro lado, es conocido que existen más proteínas que genes, ya que se cree que alcanzan a un número cercano al millón. Por lo tanto existen mecanismos subyacentes estudiados por la ciencia de la Proteómica, donde se ha observado el empleo de los mismos dominios especializados en distintas proteínas. De esta manera es posible aumentar la variedad con distintas combinaciones de dominios proteicos. Volver al inicio 9) CONCLUSIONES GENERALES. Finalmente, al analizar las reacciones bioquímicas encontramos que se pueden dividir en TRES tipos generales: a) Exergónicas o espontáneas o termodinámicamente favorables, ocurren de izquierda a derecha cuando el sustrato tiene mayor energía que el producto. Liberan la energía almacenada en la estructura del sustrato hacia el producto. Su constante de equilibrio es >1. b) Endergónicas o no espontáneas o termodinámicamente desfavorables, cuando ocurren de derecha a izquierda ya que el sustrato tiene menos energía que el producto. En caso de ocurrir de izquierda a derecha deben tomar energía del medio o de otra reacción. La constante de equilibrio es ADP + P -7300 cal/mol -7300 = - 2.3 R T Log Keq 7300/1357 = Log Keq Keq = ( ADP)( P )/ (ATP) = 239.614,7 Por lo tanto, la única manera de invertir esta reacción es enfrentándola a otra que sea mas exergónica que ella y posea a la vez un ión común a ambas reacciones, como lo es el ion Fosfato. Por ejemplo, en la serie de reacciones que se observa en la Tabla a continuación, todos los compuestos se hidrolizan liberando ion Fosfato. Algunos de ellos son más exergónicos que otros y se encuentran ordenados al azar. Para saber entre qué reacciones se desplazará el Fosfato, se debe tomar en cuenta su energía libre estándar o

ΔGº´. TABLA 2 REACCIONES

→ + H2O → + H2O→ + H2O → + H2O →

C - P + H2O

C+P

D- P

D+P

M- P N- P Y- P

M+P N+P Y+P

ΔGº´ Kcal/Mol - 3,7 + 2,1 0,0 - 5,0 + 4,2

La más exergónica o inestable de las reacciones de la Tabla anteriores será la que produce o libera 5 Kcal/mol con signo negativo y las más endergónica será la que toma 4,2 Kcal/mol con signo positivo. Entre ellas el ion Fosfato se desplazará de reacción en reacción como se indica en la siguiente figura (Fig. 14- 7).

359

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ΔG Kcal/Mol - 6,0 - 5,0 - 4,0

N-P -1,3 Kcal/mol C-P

- 3,0 - 2,0

-3,7 Kcal/mol

- 1,0 0,0

coordenada de reacción

M-P

1,0

-2,1 Kcal/mol D-P

2,0

-2,1 Kcal/mol

3,0 4,0

Y-P

Fig.14 -7. Gráfico de energía versus coodenada de reacción, donde se observa el desplazamiento del Fosfato entre los pares de reacciones acopladas.

Se liberaron en total 9,2 Kcal/mol, desde N-P hasta Y-P y se transfirió el grupo fosfato de molécula en molécula por medio de reacciones en pares acoplados desde la reacción más exergónico a la más endergónica. Otro ejemplo más, se puede considerar en la siguiente serie de reacciones, donde algunas de ellas son exergónicas (b, c y d), mientras que otras no son ni lo uno y ni lo otro y se encuentran en equilibrio como la a y la e. La ida principal es observar como se pueden acoplar unas con otras para sintetizar ATP. ΔGº´ a) Succinil - SCoA + Pi ---------------Succinil – Pi + CoASH 0,0 Kcal / mol b) Succinil - P + H2O ---------------- Succinato + Pi - 11,5 Kcal/mol c) GTP + H2O ------------------------------- GDP + P - 7,3 Kcal/mol d) Creatina-P + H2O ---------------------- Creatina + P - 10,5 Kcal/mol e) GTP + ADP ---------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol ------------------------------------------------------------------------------------------------------------El intercambio de la Coenzima CoA-SH por Pi ocurre entre dos compuestos de alta energía en la reacción a), que ocurre en el C.T.C. de la Mitocondria. Lo que se gana aquí es el ión común Fosfato (Pi), que puede impulsar las otras reacciones posteriores. El intercambio de energía ocurre en una dirección o en otra ya, que esta reacción posee una Keq = 1. A continuación la reacción b) indica que la hidrólisis del grupo fosfato es 360

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muy exergónica y libera energía al entorno. Por lo tanto parte de ella se puede aprovechar al acoplarla a la reacción c), que al invertirla será endergónica y podrá ser empujada por el ion común Pi. Finalmente una vez generado el GTP, su grupo Fosfato se puede traspasar al ADP en otra reacción con Keq = 1, para formar finalmente ATP. Al agrupar las reacciones desde la más exergónica hasta la más endergónica tenemos que: ΔGº´ a) Succinil-SCoA + Pi -----------------Succinil – Pi + CoASH 0,0 Kcal /mol b) Succinil – P + H2O -------------------- Succinato + Pi - 11,5 Kcal/mol c) GDP + P ------------------------------- GTP + H2O + 7,3 Kcal/mol e) GTP + ADP ----------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Succinil-SCoA + Pi + ADP---------- Succinato + ATP + CoASH - 4,2 Kcal/ mol Finalmente, se observa que la energía mantenida por la unión de la CoASH al Succinilo es liberada para acoplar el ion Fosfato al ADP y formar ATP. La reacción que ocurre en el CTC y forma Succinil-SCoA es también parecida a la formación de Acetil-SCoA. En ambos casos se forman Tioésteres o uniones entre grupos Tioles (-SH) y Grupos Carboxilos (-COOH) en la forma R- CO – S – R´ . Estas uniones son de alta energía debido a la disminución de la capacidad de resonancia entre el Carbono y el Azufre. De esta manera se eleva el nivel de energía en compuestos con cadenas alquílicas, para su posterior oxidación como ocurre con los ácidos grasos o bien para activar moléculas cortas (AcetilSCoA, Cuerpos cetónicos) para su unión a otras moléculas, como el Oxaloacetato y la formación de Citrato, primera reacción del C.T.C. Otra combinación de reacciones similar a la anterior, ocurre cuando se dona un Fosfato de alta energía al ADP en el músculo para generar ATP. La unión N-P en la Creatina es de alta energía ya que el grupo Fosfato limita las formas resonantes de la Creatina individual: ΔGº´ d) Creatina-P + H2O ---------------------- Creatina + P - 10,5 Kcal/mol c) GDP + P ---------------------------------GTP + H2O + 7,3 Kcal/mol e) GTP + ADP ----------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Creatina-P + ADP ------------------------- Creatina + ATP - 3,2 Kcal/mol En ambos casos anteriores, se observa que la reacción menos exergónica se invierte y se acopla a la más exergónica, mientras que el grupo Fosfato (Pi) actúa como ión común. A la vez, en la reacción acoplada final se libera energía al entorno para satisfacer la segunda ley de la termodinámica. Después de las descripciones anteriores, es posible entender como se vuelve a restaurar un grupo Fosfato en el ADP mediante el empleo de reacciones acopladas. En el proceso Glicolítico, durante la degradación de la Glucosa aquellas reacciones que se encuentran dedicadas a este propósito, emplean como moléculas dadoras de Fosfato al 1,3Difosfoglicerato y al Fosfoenol-Piruvato (Fig. 15 - 7). Ambas moléculas son de alta energía, ya que están constituidas por un anhídrido y un éster fosfato respectivamente. La energía estructural la han adquirido por oxidación parcial de la Glucosa y sucesivos reordenamientos moleculares (Ver Capítulo 8). El 1,3-Difosfoglicerato es un anhídrido y al hidrolizarse libera 11,8 Kcal/mol mientras que el éster Fosfoenol-Piruvato libera 14,8 Kcal/mol. Ambas moléculas tienen uniones con electrones deslocalizados y cargas negativas que las hacen propensas a su hidrólisis con

361

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gran liberación de energía y la formación de productos con un número mayor de formas resonantes y altamente solubles en agua e hidratables cómo el ion Fosfato mismo. El Fosfoenol-Piruvato presenta tautomería entre una forma Enol y otra forma Ceto. La forma Enol es 10 a 12 Kcal/mol menos estable que la forma Ceto y la adopta principalmente con la unión del grupo Fosfato, una vez eliminado el Fosfato pasa a la forma Ceto de baja energía. OH ‫׀‬ CH2= C - COOH Enol (Menos estable)

O ‫װ‬ CH3 - C - COOH Ceto (Más estable)

Volver al

Fosforilación a nivel de Sustrato ANHÍDRIDO FOSFATADO O

O

C

C O P O HO

C H

+ ADP

O

O CH O P O

2

O O

HO C H

O

+

ATP

CH O P O

ΔGº´

O

O

1, 3 - Difosfo - Glicerato

- 11,8 + 7 ,3 - 4 ,5 Kcal/mol

3 -Fosfo-Glicerato

O

O C O ÉSTER FOSFATADO C O O C O PO ADP C O O CH 2 CH

+

Fosfo - Enol -Piruvato

+

3 Piruvato

ATP ΔGº´

- 14 ,8 + 7 ,3 - 5 ,8

Kcal/mol

Fig. 15 - 7. El ADP toma energía en forma acoplada a la defosforilación del 1,3-Difosfo-Glicerato y el Fosfo-Enolpiruvato.

inicio b) TRANSFERENCIA DE PROTONES Y ELECTRONES

362

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Otra forma de extraer energía como ATP, es apelar a la capacidad de algunas moléculas para reducirse u oxidarse reversiblemente, es decir para tomar y donar protones y electrones. Estas moléculas constituyen pares, ya que coexisten parte oxidadas y parte reducidas. Estos pares se denominan Redox y consecuentemente tienen una Constante de Equilibrio, hacia la cual migran en distinta proporción, estando finalmente una parte de ellos más “cómodos” en la forma reducida, mientras que otra parte se encontrará más “cómoda” en la forma oxidada. En el equilibrio, un porcentaje de las moléculas se encontrará finalmente reducido y otro porcentaje oxidado, incluso habrán algunos pares en que el 50% se encuentre oxidado y el otro 50% se encontrará reducido con una Keq = 1 o un Potencial Redox igual a 0. De esta manera una serie de compuestos pueden formar Pares Redox o moléculas que pueden coexistir, ya sea tanto oxidadas como reducidas al donar o tomar reversiblemente protones y electrones. Como ejemplo tenemos a los pares A/AH2 (+0,50 volt, electropositivo) y X/XH2 (-0,30 volt, electronegativo) que aparecen en la Tabla 3. Es posible medir la tendencia para donar u aceptar protones y electrones mientras se dirigen al equilibrio a través de un sistema formado por dos celdas (Fig. 16 – 7), donde se hacen circular los electrones al aplicar una determinada diferencia de potencial o voltaje. Por convención, la diferencia de potencial con valor de 0 es atribuido al par estándar del Hidrógeno en sus formas 2H +/ H2. El resto de los otros pares se le atribuye por convención un potencial negativo si tienden a dar electrones y protones y positivo cuando tiendan a atrapar electrones y protones. Al atrapar electrones se dificulta el flujo de estos para cerrar el circuito y cuando el par tiende a entregar se facilita el flujo de electrones y se completa el circuito. El puente salino entre ambas celdas (tubo con solución saturada de sal), es para mantener la electroneutralidad a ambos lados, mediante paso de iones positivos y negativos en una u otra dirección. En la siguiente Tabla aparece un grupo de compuestos ordenados al azar donde se entrega su Potencial Redox (εº´) Estándar:

TABLA 3

εº´

Potenciales Redox

→ AH + 2 ē → XH + 2 ē → UH + 2 ē → WH + 2 ē → ZH

A + 2 H+ + 2 ē

2

X + 2 H+

2

U + 2 H+ W + 2 H+ Z + 2 H+

2 2

2

363

Volt + 0,50 - 0,30 + 0,45

+ 0,65 - 0,10

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batería ē

voltímetro ē

iones + y -

ē ē A + 2 ē + 2H+→

ē

AH2 Fig. 16 - 7. Los electrones recorren el circuito y participan con mayor o menor facilidad de la reacción de reducción u oxidación. Este es el efecto que se mide en el Voltímetro.

Por convención el par con Potencial Redox más negativo (X/XH2 = X + 2H + 2 ē ---- H2 = - 0,30 volt), será el que tienda a dar electrones cuando se invierta la forma en que se encuentra actualmente expresado, que es de oxidado a reducid. Pasando a expresar ahora su tendencia natural, la que en realidad es de reducido a oxidado (XH2-----X + 2H + 2 ē) al entregar electrones, mientras que su Potencial Redox ( εº´) tendrá un valor positivo de + 0,30 Volt:

εº´

→ X + 2 H+ + 2 ē Z + 2 H + 2 ē → ZH XH2

+ 0,30 Volt

+

- 0,10 Volt 2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------XH2 + Z

→ ZH2 + X

+ 0,20 Volt

ΔGº´ = - n Z Δεº´= - 2 x 23000 x (+ 0,20) ΔGº´ = - 9200 cal/mol Sí calculamos la Keq de la reacción mediante la ecuación: - 9200 = - 2,3 RT log Keq, será de aproximadamente 5 x 10 6. Esto indica que se encuentra desplazada hacia la formación de producto ZH2. El valor de - 9200 cal/mol, significa que la reacción de oxidación de X y reducción de Z es exergónica. La energía así liberada se puede disipar como calor al entorno o bien ser atrapada en parte en la forma de un gradiente de concentración y carga o más aún como energía química en una molécula de ATP. Al ordenar todos los pares de la tabla anterior tenemos en la figura 17, una cadena de Transporte de Electrones y Protones. Los electrones fluyen desde el par XH2/X al par al final de la cadena de transporte de electrones WH2/W. Algunas de las reacciones de transferencia de electrones son muy exergónicas como de ZH2 a U, donde se liberan 25,3 Kcal/mol, mientras que otras solo liberan una fracción de esta energía, como la hace el par UH2 hacia AH2. Los electrones “parecen” fluir desde el par con un valor Redox más electronegativo de - 0,50 a + 0,50 volt.

364

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ΔEº´Volt

ΔG Kcal/Mol 30 20

-0,50

XH2

- 9,2 Kcal/mol - 0 ,40 ZH2

- 0,30 - 0,20

10.

-25,3 Kcal/mol

0

coordenada de reacción

10 -2,3 Kcal/mol

0 0,10 0,20

UH2 20

- 0,10.

0,30

AH2

0,40

-6,9 Kcal/mol WH2

0,50

Fig 17-7. Gráfico de Energía libre y Potencial Redox versus coordenada de reacción. Se indica como proceden los electrones en una cadena de reacciones.

Sin embargo, el par XH2/X se encuentra más relajado o se encuentra más desplazado hacia el equilibrio o en otras palabras, es más estable en la forma oxidada X que en la forma reducida XH2, por lo tanto entrega electrones y protones. Mientras que el último par WH2/ W, adquiere mayor estabilidad desplazándose a la forma reducida WH2. Luego, los electrones se desplazan siempre desde el par que se encuentra más estable en la forma oxidada que por convención tiene un Potencial Redox de -0,30 volt o electronegativo al par que se encuentra más estable en la forma reducida y con Potencial Redox de +0,65volt o electronegativo. De la misma forma que el sistema anterior, ocurre la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria. Esta cadena de reacciones se abastece de moléculas de alta energía previamente reducidas (Coenzimas NADH y FADH2), que se producen durante la oxidación de los sustratos metabólicos. Posteriormente hace que estas Coenzimas trasfieran sus protones y electrones desde el par con un Potencial Redox más electronegativo al par más electropositivo, por supuesto que con la misma salvedad empleada en la cadena dada anteriormente como ejemplo ( NAD/NADH -0,32 volt; FAD/2FADH2 -0,22 volt; CoQ 0,04; ½ O2 +2H+ +0,82). De esta manera la energía química se libera etapa por etapa, para formar un gradiente de concentración y carga a ambos lados de la membrana interna en la Mitocondria. Una vez formado este gradiente, se acopla a la síntesis de ATP.

365

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La Niacina o Niacinamida Adenina Dinucleótido. tiene un anillo que puede participar en las reacciones de Oxido-Reducción. Puede remover dos protones de otra molécula y uno de ellos permanece en el anillo de Niacinamida y el otro en solución.

PARTE ACTIVA DE LA MOLÉCULA H

NIACINAMIDA HC HC O FOSFATO

O

P

CH O

2

O

P O

CH

OH

CH 2

BASE NITROGENADA

O H

C C

N

N

C

C

N

H

H

H HO

2

N

RIBOSA

O

NH2

NH

H HO

FOSFATO

+

C

H

H

H

O

C

N

O

O

C

O H

O O

RIBOSA

Niacinamidadenin dinucleótido

NAD

o NADP

Niacinamidadenin dinucleótido Fosfato AL ADICIONAR FOSFATO

P O

AL 2' OH

O HH

Fig. 18 - 7. Coenzimas NAD y NADP.

La energía total liberada la Cadena de Transporte de Electrones, que incluye al par redox inicial y final se puede calcular mediante su potencial de oxido-reducción, que es de - 0,32 volt para NAD/NADH+ H y de +0,82 volt para el par 2H+ /H2O:

εº´ NADH + H + 2e ----------------------------- NAD + 0,32 volt ½ O2 + 2H + 2e ----------------------------- H2O + 0,82 volt -------------------------------------------------------------------------------------NADH + H + ½ O2 ----------------- NAD + H2O + 1,14 volt Gº´ = - n F Δεº´ = 2 x 23000 cal/mol volt x (+ 1,14 volt) = 52000 cal /mol

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H R

H

H

C

C

H

H

SUST. RED.

O C NH2

R

+

O NH2 H

C +

+ N R

H

H

R

N

NAD OXIDADADO

C

C

+

R+ H

H

R

NAD REDUCIDO

+

SUST OXID.

+ PROTÓN LIBRE

Fig. 19 – 7. Transferencia de electrones y protones desde el sustrato a la Coenzima NAD. Cerca del 17% de las enzimas existentes emplean NAD o NADP. El Hidrógeno que reduce al anillo entra como un Hidruro ( H - ), mientras que el otro queda como ión Hidrógeno en solución. Los electrones son atraídos por el Nitrógeno positivo del anillo de la Piridina.

Esta energía se emplea en crear un gradiente de protones a ambos lados de la membrana con un pH de aproximadamente 6 para el espacio intermembrana y de 7 para la matriz mitocondrial que aplicado a la ecuación de Nernst, dará el Potencial de reposo o Џ: ЏN = 2,3 R T Δ pH / Z F

(1)

Por otro lado también se debe considerar la permeabilidad de cada uno de los múltiples iones existentes a ambos lados de la membrana y este otro potencial, se encontrará dado por la Ecuación de Goldmann que considera el grado de permeabilidad. Si este es máximo se convierte en la Ecuación de Nernst como ocurre para el ion H+: [Σ Permeabilidad ( Iones + ) afuera + Σ Permeabilidad (iones- ) adentro ] 2,3 RT Log -------------------------------------------------------------------------------------------------[Σ Permeabilidad ( Iones + ) adentro + Σ Permeabilidad (iones - ) afuera ] ЏG=----------------------------------------------------------------------------------------------------------------(2) zF Posteriormente, tenemos que al juntar las ecuaciones (1) y (2), el gradiente electroquímico dependerá de: Gradiente = Potencial de membrana dependiente ─ Potencial del gradiente electroquímico de la permeabilidad de cada ión de pH, dependiente de la dado por la Ecuación de Goldmann Ecuación de Nernst En los organelos especializados de la Mitocondria y Cloroplasto se produce ATP a expensas de un gradiente quimiosmótico que se genera por la cadena de transporte de electrones. Este gradiente cuenta con una alta concentración de protones a un lado de la membrana y una baja en el otro lado, junto a éste se produce un gradiente de carga de forma opuesta. La Cadena de Transporte de Electrones es un proceso exergónico que libera energía y que se emplea a su vez acoplado a este último sistema para capturar la energía producida por dicho gradiente por medio del Complejo V o ATP sintasa. Lo que resta de esta energía se pierde como energía calórica (Ver Capítulo 12).

367

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Fosforilación del tipo Oxidativa Espacio

Matriz

+ H

mitocondrial

intermembrana

ATP Fo F1 ATP asa ADP

+ H + H

Pi

H+ H+

H+

+ H

+ H + H

+ H H+

El gradiente de protones trata de alcanzar la electroneutralidad al pasar por la Fo F1 ATP asa La energía del gradiente de concentración y carga se emplea para sintetizar ATP

H pH = 6,0

pH = 7,0

Fig. 20 – 7. La energía del gradiente de concentración y carga se transforma en energía química contenida en el ATP

El total del sistema se asemeja a una planta Hidroeléctrica, donde se acumula el agua en un lago y luego se la libera cuesta abajo (gradiente) para que mueva los turbogeneradores. Estos últimos convierten la energía hidráulica en mecánica y esta última en eléctrica. En el caso de la mitocondria y el cloroplasto, el gradiente de protones y electrones sería el desnivel de agua y los turbogeneradores estarían representados por un canal iónico asociado a una enzima. Esta enzima es conocida por denominarse como la FOligomicina - F1 ATPasa (FoF1ATPasa) o mejor conocida como ATP sintasa. Este canal iónico tiene por objeto dejar pasar los protones y aprovechar la energía que se desprende de ello para ejecutar cambios conformacionales que permitan la síntesis del ATP (Fig 19 - 7). En realidad el proceso ocurre continuamente en estado estable es decir, se forma el gradiente y continuamente se colapsa produciendo ATP. Sin alcanzar nunca el equilibrio termodinámico o equilibrio que se produce cuando se agota el gradiente y no se sintetiza más ATP. En este Capítulo se han dado algunas de las reglas por las que se rige el metabolismo intermediario destinado a la producción y empleo de la energía tanto en su propio beneficio como para llevar a cabo alguna función dentro de la Naturaleza. A su vez los organismos se encuentran sometidos constantemente a las fuerzas entrópicas o del desorden, tanto a nivel de sus proteínas como en la información almacenada en los ácidos nucleicos. Por lo tanto, parte de su sobrevivencia dependerá de la vigilancia y reparación de los daños que paulatinamente lo alejan del estado estable, para hacerlo entrar finalmente en equilibrio termodinámico, es decir cuando fallezca y tenga el mismo nivel energético que el ambiente que lo rodea. Volver al inicio 368

Héctor Rocha L. Bioenergetica

12) GLOSARIO Entorno:

Es el medio que rodea a un proceso termodinámico.

Proceso:

Intercambio de energía entre un elemento y otro.

Sistema aislado:

No intercambia materia ni energía con el entorno.

Sistema cerrado:

Es aquel que no intercambia energía con el entorno.

Sistema abierto:

Intercambia materia y energía con el entorno

Equilibrio Termodinámico:

Cuando una reacción o proceso ocurre en la dirección en que agota su energía para quedar con la misma que tiene el entorno.

Termodinámica lejos del equilibrio:

Flujo de energía y materia de forma no lineal o predecible lejos del equilibrio. Sistema viviente.

Entropía:

Medida del desorden de un sistema

Orden:

Se puede crear espontáneamente según Darwin, en respuesta a fuerzas externas o del entorno como la evolución

Equilibrio de Estado Estable:

Reacción Exergónica:

Es un equilibrio dinámico en que la velocidad de síntesis de un compuesto es igual a su velocidad de degradación manteniendo un determinado nivel de energía potencial. Sin entrar en equilibrio con el entorno. Libera energía hacia el entorno o hacia otras reacciones a presión y temperatura constantes.

Reacción Endergónica:

Toma energía del entorno o de otras reacciones en condiciones de presión y temperatura constante.

Sistema emergente:

Es aquel que surge debido a las influencias del entorno. Por ejemplo la aparición de orden y complejidad pudiera ser en forma espontánea. Si se deja un sistema en manos del entorno como un trozo de arcilla en una corriente de agua forma final emergerá por la acción del flujo del agua arcilla.

la sobre la Complejidad: no jerárquica.

Se puede definir como la falta de linealidad en un fenómeno. Es decir no se puede extrapolar el resultado, es dinámica lineal. Puede comprender una estructura de tipo Volver al

inicio

369

Héctor Rocha L. Bioenergetica

370

Héctor Rocha L. Bioenergetica

REFERENCIAS 371

Héctor Rocha L. Bioenergetica

Qué es la vida? E. Schrödinger., Ed. Orbis, 1985 A New Look at Mechanisms in Bioenergetics, E. Racker, New York, Academic press, 1976 Entropy for Biologists: An Introduction to Thermodinamics , H.J. Morowitz, Academic Press Inc., New York, 1970 Non-Equilibrium Thermodynamics. Crossing Boundaries, VOL. 1 Nº 2- Spring 2002 Thermodynamic Theory of Biological Evolution and Aging. Georgi P. Gladishev http:// www.endeav.org/evolut The Hierarchical Equilibrium Thermodynamics of Living Systems in Action. Georgi P. Gladishev. http:// www.endeav.org/evolut Thermodynamics of Living Systems. http:// www. Idolphin.org/mystery/chapt7.html

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Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

HIDRATOS DE CARBONO

340

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Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

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1) METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO 343 2) FUENTES DE ENERGIA PARA LA CONTRACCION MUSCULAR 347 3) DISTRIBUCIÓN DE LAS FIBRAS MUSCULARES SEGUN EL ESFUERZO 350 4) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE METABOLISMO AEROBICO Y ANAEROBICO 352 5) LA GLUCOSA COMO SUSTRATO PREFERIDO POR LAS CELULAS 352 6) EFICIENCIA DE LA GLICOLISIS ANAEROBICA 353 7) ETAPAS DE LA GLUCOLISIS 354 8) DEGRADACION Y SINTESIS DE GLICOGENO 354 9) SECUENCIA DE REACCIONES QUE CONDUCEN A LA DEGRADACION DEL GLICÓGENO EN EL HIGADO Y EN EL MUSCULO. 354 10) SINTESIS DESDE GLUCOSA O GLICOGENESIS 360 11) RAMIFICACIÓN Y DESRAMIFICACIÓN DE LA MACROMOLÉCULA DE GLICÓGENO 361 12) ENFERMEDADES DEL ALMACENAMIENTO DEL GLICÓGENO Y PROCESAMIENTO DE LA GLUCOSA 364 13) ETAPAS DE LA GLICOLISIS 365 14 ) REGULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA GLICOLISIS 368 15) HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA EN LA SANGRE 16) TRANSPORTE DE LA GLUCOSA

370

372

17) OTROS HIDRATOS DE CARBONO QUE ENTRAN A LA GLICÓLISIS 18) SEGUNDA ETAPA DE LA GLICÓLISIS 376 19a) Lanzadera Glicerol-Fosfato 378 19b) Lanzadera Malato-Oxaloacetato 378

341

373

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20) VIA DE LAS PENTOSAS O VIA DEL FOSFOGLUCONATO 384 21) VISION GENERAL DE LA VIA DE LAS PENTOSAS 22) LA VIA DE LA PENTOSA FOSFATO Y LA GLICOLÍSIS EN ERITROCITOS 23) REVERSIBILIDAD DE LA GLICOLISIS 392 24) GLUCONEOGENESIS 393 25) LAS 3 REACCIONES MAS EXCERGONICAS DE LA GLICOLISIS NO SON COMPARTIDAS CON LA GLUCONEOGENESIS 394 26) PRINCPALES DIFERENCIAS ENTRE LA GLICOLISIS Y LA GLUCONEOGENESIS 397

1) METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO.

342

391

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

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La Glicólisis, también denominada vía de Embden-Meyerhoff, es una vía metabólica que se desarrolló como una forma de obtener energía química para los procesos metabólicos, mucho antes de la aparición del Oxígeno en la Tierra. Esta es una vía primitiva, que consiste en una oxidación anaeróbica y una reducción, es decir los protones que se arrancan a la Glucosa son empleados para reducir a los mismos productos de la degradación de esta (Fig. 1 – 8). No ocurre aquí una oxidación neta de la molécula de Glucosa, ya que hay tanto oxidación como reducción, siendo el NAD empleado como agente oxidante y a la vez como reductor en la forma NADH + H. En este caso, el aceptor final de los protones es una molécula distinta al Oxígeno y conocida como PIRUVATO. Cuyo origen se encuentra en la ruptura, oxidación y reordenamiento de la misma Glucosa. La molécula de PIRUVATO, luego de ser reducida por el NADH + H+, formará el compuesto final denominada Ác. LÁCTICO (Fig. 1 - 8) o bien LACTATO, cuando está disociado. OXIDACION ANAEROBICA DE LA GLUCOSA H CH3 – C - COOH OH AC. LACTICO

C6 H12 O6 GLUCOSA ATP ATP 2 ATP Activación

+ + +

2 ATP 2 ATP

2 NAD LA COENZIMA SE OXIDA Y REDUCE CÍCLICAMENTE

NETO: solo 2 ATPs SE PRODUCEN

2 NADH + 2H

4 ATP CH3 – CO - COOH AC. PIRUVICO

CH3 – CO - COOH AC. PIRUVICO

Fig. 1 - 8.La Coenzima reducida (NADH + H+) se recupera dentro de la misma vía metabólica y solo se emplea en la activación la mitad del ATP producido.

La formula empírica del Ác Láctico (2x C3H6O3 o 2x CH3- CH -COOH) corresponde OH a dos veces la molécula de Glucosa (C6H12O6). Esto demuestra que no ha ocurrido ningún cambio neto en el estado de oxidación de la Glucosa, excepto su división en dos moléculas de tres carbonos. Por lo tanto, la energía extraída en la Glicólisis Anaeróbica, proviene íntegramente de la ruptura estructural de la molécula de Glucosa de seis carbones en otras dos moléculas de tres carbones. Esta ruta degradativa se estudió originalmente en levaduras y también se la conoce desde muy antiguo por el nombre de Fermentación Alcohólica. En esta última, el producto final consiste en Etanol (CH3CH2OH) y Anhídrido Carbónico (CO2): Piruvato Descarboxilasa CH3-CO-COO- -------------------------> CH3-CHO + CO2 PIRUVATO ACETALDEHIDO

343

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Alcohol Deshidrogenasa CH3-CHO + NADH + H-------------------------> CH3-CH2-OH + NAD ACETALDEHIDO ETANOL La Glicólisis anaeróbica ha sido hasta ahora ampliamente estudiada en el músculo esquelético, donde representa la forma básica de obtener energía. En aquellos casos donde la circulación no aporta la cantidad suficiente de sangre oxigenada. El ATP obtenido por el proceso anaeróbico es bajo, solo dos moléculas de ATP por molécula de Glucosa, lo cuál representa solo un 5.3% de la energía total que se puede extraer aeróbicamente. Este último hecho hace necesario, que la oxidación anaeróbica disponga de una gran cantidad de sustrato almacenado. Esto se logra mediante una compleja molécula de alto peso molecular denominada Glucógeno, en los animales (Fig. 2 - 8) y Almidón, en las plantas. La Glucosa se LADO C4 No REDUCTOR

α1 - 6

C4

CH2O H

LADO No REDUCTOR

CH2 OH CH2O H C H2 O H

C H2O

C 4 LADO

CH 2 O H

U N IO N E S

No REDUCTOR

α1- 4

CH 2 O H

CH2 OH

CH2 OH

α1 - 6

CH2O H

CH 2 O H

C H2 O H

Lado R e d u c to r

C H2O CH2O H CH2 OH

CH2O H

H O H C 2

C H2O

C1

CH2 OH

H O H C 2

CH2 OH CH2 OH

CH2O H

α1 - 6

CH 2 O H CH 2 O H CH 2 O H CH2 OH

H O H C 2 H O H C 2

C4

CH 2 O H

LADO No REDUCTOR

S O L O U N A T E R M IN A C IO N R E D U C T O R A E N E L C A R B O N O 1 Y V A R IA S NO REDUCTORAS REPRESENTADAS POR EL CARBONO 4

Fig. 2 - 8. Parte de una molécula de Glicógeno mostrando un lado reductor libre y cuatro lados no reductores o Cs 4 donde se unen o se cortan moléculas de Glucosa.

une por enlaces glicosídicos α 1-6 y α 1- 4. Al considerar nuevamente el metabolismo del músculo, encontramos que este cuenta con varios tipos de fibras. Entre ellas encontramos a la fibra muscular blanca de tipo a y b, Tabla 1 – 8. Estas fibras son pobres en mitocondrias y aptas para el movimiento repentino que demanda alta energía. Su tipo sería deseable en la musculatura de un levantador de pesas o un deportista que corre los 100 mts planos. Las fibras blancas (llenas de Glicógeno), son comunes en animales capaces de atacar bruscamente, para luego permanecer inactivos metabolizando durante largos períodos su Ác. Láctico. Entre ellos tenemos a los Cocodrilos (Reptiles) y peces de las grandes profundidades (medio pobre en O2). Es de suponer que la vía metabólica anaeróbica sufrió un proceso evolutivo que favoreció la manera actual de obtener energía una vez que la Mitocondria hizo simbiosis con la célula y el Oxígeno apareció en la atmósfera a consecuencia de la acción de los Cloroplastos. Estos

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descomponen el agua impulsados por la energía solar. Así se pudo obtener energía más eficientemente y el Oxígeno constituyó el aceptor final de los protones. Antes de la aparición del Oxígeno, en los organismos unicelulares primitivos la cantidad de protones en el medio externo era demasiado alta debido a la difusión del ác. Láctico hacia el exterior como deshecho. Los protones formaron así un gradiente entre el exterior e interior de los microorganismos existentes y la difusión debió pasar a ser forzada, es decir se empleaba ATP para luchar contra el gradiente externo. Sin embargo, como todo gradiente los protones pretendían entrar desde el medio externo para igualar su concentración con el interior. Para evitarlo, se gastaba una gran cantidad de ATP y en un determinado momento, este sistema se invirtió permitiendo ahora la entrada de protones que se acoplaron esta vez al mecanismo energético de síntesis de ATP, en vez de hidrólisis y que es conocido hoy como el sistema de la ATP Sintasa o FoF1 ATPasa. (Ver capítulo 13). Los protones que entraron no afectaron al gradiente o bajaron el pH interno del organismo, ya que con la aparición del Complejo enzimático de la Citocromo Oxidasa (Ver capítulo 13), se unieron finalmente al O2 formando agua. Tabla 1 – 8 Características

Fibras Musculares Rojas

Superficie en micromts2 3,9 Velocidad de contracción Lenta Fuerza desarrollada * Rapidez en fatigarse * Metabolismo Aeróbico No de mitocondrias ** Capilares / fibra *** Conc. de GLICOGENO * *** Conc. de TAG∗. * Miosina-ATPasa Lenta Miosina TAG∗ : Triacilgliceroles

Fibras Musculares Blancas Tipo a Tipo b 4,2 5,2 Mediana Rápida * ** ** * Mixto Anaeróbico ** * ** * ** *** ** * *** *** Intermedia Rápida

Al observar la oxidación aeróbica de la Glucosa, vemos que aquí se emplean lanzaderas (Fig. 3 – 8), para transportar protones desde las coenzimas del citoplasma a la Mitocondria sin reducir el Piruvato a Ác. Láctico como ocurre en el proceso anaeróbico. Estas lanzaderas entran a la Mitocondria y entregan los protones a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), además el Piruvato del citoplasma entra a la Mitocondria (no se queda en el citoplasma para formar Ác. Láctico) y se oxida totalmente a CO2 y H2O mediante el Ciclo Tricarboxílico. Las Coenzimas NADH y FADH2 producidas es este Ciclo, se oxidan mediante la Cadena de Transporte de Electrones. Dando origen a un proceso conocido como Fosforilación Oxidativa (FOx.) en que el gradiente de protones formados se aprovecha en generar ATP por la ATP Sintasa. La producción total de energía corresponde en este caso a 36 -38 ATP por molécula de Glucosa (Fig. 3 - 8). Al volver nuevamente al metabolismo del músculo, encontramos que las fibras rojas son las responsables del movimiento sostenido, ya que son aeróbicas, ricas en Mitocondrias, Tabla 1 – 8. Estas fibras son deseables en el caso de un maratonista y son comunes en aquellos animales que capturan su presa mediante una carrera sostenida, como lo hace el Guepardo o aquellos peces de superficie conocidos como Atún y Salmón. La musculatura roja es

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aeróbica, rica en capilares sanguíneos, Mitocondrias y Citocromos y también se le halla en aquellas aves de tipo migratorio. En resumen, según el estado de oxigenación del músculo este producirá Ác. Láctico o CO2 y H2O. En el primero de los casos el Ác. Láctico, se dirige al Hígado donde nuevamente es transformado en Glucosa y esta abandona el Hígado para depositarse nuevamente en los músculos como Glicógeno. El Hígado es algo lento en realizar este trabajo por lo tanto es posible que se acumule Ác Láctico en la sangre y baje el pH estimulando la Hiperventilación, los calambres musculares y a la vez disminuya la capacidad de fijar el O2 por la Hemoglobina.

( 6 C ) GLUCOSA CITOPLASMA

-

2ATP

LANZADERA GLICEROL-P 2 FADH2

2 NADH + 2 H+

+

MATRIZ MITOCONDRIAL

CTE

F Ox

+ 2 ATP Fosforilación a nivel de Sustrato

2ATP

2 PIRUVICO

2 PIRUVICO

2 NADH +

+2H

2 NAD

2 NADH + 2 H+

2 CO2

CTE

F Ox

+ 6ATP

2 ACETIL-S-CoA 6 NADH + 6 H+ +2 FADH2

2LACTICO Este proceso no ocurre en la Glicólisis aeróbica

+ 4ATP

4 CO2

CTC

+ 22ATP

CTE

F Ox

TOTAL =

+ 2 GTP

+ 36ATP

Fig 3 - 8.La oxidación aeróbica de la glucosa emplea lanzaderas para enviar protones a la mitocondria, en vez de ocuparlos en el citoplasma durante la reducción de Piruvato a Láctico. CTE : Cadena de Transporte de Electrones, ubicada en la membrana interna de la Mitocondria. CTC: Ciclo Tricarboxílico, ubicado en la matriz mitocondrial. FOx.: Fosforilación Oxidativa, ubicada en la membrana interna de la Mitocondria

En base a las consideraciones anteriores un buen atleta debiera de tener las siguientes condiciones: a) Aumento en el tamaño y número de Mitocondrias. Mientras más Mitocondrias tendremos menos necesidad de Glicólisis anaeróbica o menos fatiga. El proceso de

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oxidación de los ácidos grasos ocurre íntegramente en la Mitocondria y es totalmente aeróbico produciendo una mayor cantidad de ATP que la Glucosa. b) Aumento en la capacidad de la Cadena de Transporte de Electrones, para disponer de una mayor cantidad de Coenzimas oxidadas y a la vez dar cuenta finalmente de los protones al ser estos recibidos por el O2 para formar agua. c) Aumento en el número de fibras rojas sobre las blancas d) Aumento de las enzimas que oxidan Ácidos Grasos en el interior de la Mitocondria. De esta manera los Hidratos de Carbono se pueden usar en etapas posteriores del ejercicio. e) Aumento del almacenamiento de Glicógeno en el músculo. f) Producción de menor cantidad de Ác. Láctico y un mejor tamponamiento de este, por el medio interno del músculo. Volver al inicio

2) FUENTES DE ENERGIA PARA LA CONTRACCION MUSCULAR El ATP necesario para la contracción muscular proviene de las fuentes que se señalan a continuación y su uso dependerá de la rapidez con que se necesite: a) Fosfo Creatina. b) Glicólisis Anaeróbica y Glicólisis Aeróbica. c) Oxidación Aeróbica.

a) Fosfo Creatina Es sabido que durante los primeros segundos de un esfuerzo físico la energía es principalmente aportada por la Creatina Fosfato. Esta es una molécula de almacenamiento de energía química que puede transferir su fósforo rápidamente al ADP para formar el ATP necesario para la contracción muscular (Fig. 4 - 8). La energía que contiene la molécula de Fosfocreatina se debe a la presencia de una nube de electrones deslocalizados entre el grupo Guanidino y el Fosfato. La experimentación ha demostrado que un músculo envenenado con Iodoacetato y CN-, donde se inhibe tanto el metabolismo anaeróbico (3-P-Gliceraldehído Deshidrogenasa) como el aeróbico (Citocromo Oxidasa) respectivamente, continúa contrayéndose bajo la acción de las descargas depolarizantes debido a la presencia de la Creatina-Fosfato como reservorio de energía. La formación de ATP para la contracción muscular en este caso, es catalizada por la enzima Cretina-Fosfoquinasa (CPK), cuya reacción es termodinámicamente favorable y perdurará hasta agotarse toda la Fosfocreatina almacenada (Fig. 4 - 8).

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Grupo Fosfato O H O

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Grupo Guanidino C H3

P N

C N CH 2 O NH 2 P-Creatina

H

CH 3 C N N CH 2 NH H 2

O C O

H2O

O

O C

O

O

P

OH

O

Creatina Go'=

ADP

P

Go'=

ATP

- 10.3 Kcal/mol 7.3 Kcal/mol

Creatina Quinasa O H O P N O

CH 3 C N CH 2 NH 2

H

O ADP

C O

CH

O 3 C H C N C N 2 O H N H2

ATP

Creatina

P-Creatina

Go'= final

3.0 Kcal/mol

Fig. 4 - 8. El ADP puede ser fosforilado por la enzima Creatina Kinasa.

Se ha observado que algunos atletas que requieren de grandes esfuerzos durante unos pocos segundos ingieren hasta 20 grs. de Creatina para potenciar sus músculos. Sin embargo, la cantidad normal en el organismo humano es de tan solo dos gramos. Por otro lado, existe una isoenzima de la Creatina Fosfoquinasa que es de origen mitocondrial y se encuentra unida al lado exterior de la membrana interna de la mitocondria, en el tejido muscular esquelético y cardíaco. Su principal característica es que transporta P de alta energía hacia la otra isoenzima citoplasmática. El sustrato que emplea es el ATP producido durante el proceso de Fosforilación Oxidativa de la Mitocondria. De esta manera el ATP citoplasmático cuyo P, provino de la Mitocondria y que fue traído por la Cretina-P pasará directamente a ser empleado en la contracción muscular. La anterior es una forma por la que el mecanismo Aeróbico complementaría las exigencias energéticas de un esfuerzo sostenido en el tiempo, a diferencia del mecanismo anaeróbico donde solo la acumulación de Creatina-P participaría como fuente de energía en los primeros segundos de un esfuerzo físico intenso y repentino (Fig. 5 – 8). La Creatina empleada puede ser metabolizada a Creatinina cíclica y aparece posteriormente en la orina como marcadora de esfuerzo físico. También se le emplea en la orina de colectada en 24 hrs. como índice de filtración glomerular o estado del riñón ya que se filtra, pero no se reabsorbe

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ADP

Rol aeróbico de la Creatina Kinasa

ATP Isoenzima Citoplasmática

C P K asa

Cr P

Cr

Membrana Externa

ADP

ATP C P Kasa Adenilato

Membrana Interna

Fo

Isoenzima Mitocondrial

Translocasa Pi

A T P SINTASA ( Fo F1 ATPasa )

ADP

F1

ATP

Matriz Mitocondrial

Fig. 5 - 8. Las isoenzimas CPKasa mitocondrial y citoplasmática se encuentran en el músculo cardíaco.

b) Glicólisis Anaeróbica y Glicólisis Aeróbica Al continuar con la descripción de las fuentes que aportan energía para un esfuerzo físico, después de la Fosfocreatina se emplea paulatinamente la oxidación anaeróbica de la Glucosa a partir del Glicógeno contenido en el músculo y con producción de Ác. Láctico, para entrar a los tres minutos al metabolismo aeróbico de tipo abierto. Es decir, este último requiere de la circulación sanguínea y la respiración pulmonar. En este momento la oxidación aeróbica mejora gradualmente por el aporte de Oxígeno que llega por todos los capilares y las Mitocondrias reciben el Piruvato proveniente de la Glucosa, que ya no actúa como aceptor final de protones formando Ác. Láctico al recuperar las Coenzimas reducidas, sino que se emplean ahora lanzaderas para llevar los protones de las Coenzimas a la Mitocondria y el resto de aquellas Coenzimas que se ocupan en la Oxidación total del Piruvato en la Mitocondria, se oxidan in situ por la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), (Fig. 3 – 8). Se produce ahora la formación de CO2 (Fig. 6 - 8) y H2O en la Mitocondria.

c) Oxidación Aeróbica Se emplea como sustrato una mayor proporción de Ácidos Grasos que de Glucosa. Los ácidos grasos llegan por la circulación unidos a la proteína Albúmina y han sido liberados

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por la acción hormonal de la Adrenalina, desde el tejido Adiposo. En el interior de la Mitocondria plenamente oxigenada y funcional se oxidan mediante el proceso denominado βOxidación con gran producción de ATP, CO2 y H2O. Si el esfuerzo muscular es intenso y de larga duración o mayor de tres minutos, las fibras SECUENCIA DE EMPLEO DE VIAS ENERGETICAS DURANTE LA CONTRACCION MUSCULAR

Cr-P

INTENSIDAD DE LA

Glic.-Anaeróbica

CONTRACCION

Ox.-Aeróbica

50

1

2

3

TIEMPO (min)

Fig. 6 - 8. En los primeros segundos de un ejercicio violento se emplea la CrP como fuente de energía, para continuar luego con el metabolismo anaeróbico y finalmente el metabolismo aeróbico.

blancas pasan el trabajo a las fibras rojas, sin embargo aún se emplean las blancas para los movimientos bruscos de alta intensidad (fútbol). Por lo tanto la cantidad de Ac. Láctico continúa aumentando y la capacidad tamponante del músculo se sobrepasa cuando el mecanismo de transporte del Ac. Láctico al hígado se satura y no se alcanza a remover todo el ácido producido. Este se acumula en las fibras musculares y acarrea calambres y posteriores desgarros. Volver al inicio

3) DISTRIBUCION DE LAS FIBRAS MUSCULARES SEGUN EL ESFURZO En los animales se puede observar claramente la representación de cada una de los tipos de fibras musculares según sea su modo de vida. Por ejemplo, los pectorales de las aves domésticas que se encuentran adaptadas a una vida sedentaria son solo aptos para vuelos cortos y ocasionales, requiriendo sucesivas detenciones por la gran acumulación de Ác. Láctico que en ellos ocurre. Esta es la típica fibra muscular blanca, rica en Glicógeno, blanda y apetecida em la meza. Las aves salvajes o migratorias en cambio tienen pectorales rojos, ricos en mitocondrias y abundante irrigación sanguínea que les permite mantener el vuelo por largos periodos de tiempo. Por otro lado los peces de las grandes profundidades cuentan

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con un metabolismo mayormente anaeróbico, que no les permite el esfuerzo prolongado y su estrategia de vida responde a estas condiciones. Al capturar solo presas inmóviles que no demanden un mayor gasto de ATP, ya que el agua a tales profundidades es pobre en Oxígeno disuelto. Algunos de estos peces eliminan mayormente Ac. Láctico por sus branquias (Tabla 2 - 8). Distinto es el caso de la trucha, que frecuenta las aguas correntosas y oxigenadas capturando solo presas en movimiento. Este tipo de comportamiento indica la presencia de una musculatura esencialmente aeróbica, aunque también necesita de un mecanismo anaeróbico que le permita bruscas aceleraciones y detenciones, como se puede apreciar en los datos de la Tabla 2 - 8.

Tabla 2 - 8 LACTATO DESHIDROGENASA*

CITRATO SINTASA**

MUSCULO ROJO

MUSCULO BLANCO

MUSCULO ROJO

MUSCULO BLANCO

Salmón U/gr Pez inactivo:

5,500

300

68,0

8,8

Hoplias U/gr

576

419

3,7

2,0

ENZIMAS

Pez activo:

(*) La Lactato Deshidrogenasa (metabolismo anaeróbico), es una enzima marcadora de la fibra muscular blanca y se encuentra en similar cantidad en la musculatura blanca y roja del Hoplias. Mientras que en el Salmón también se encuentra debido a su movimiento de tipo explosivo tras la presa. (**) La enzima Citrato Sintasa (metabolismo aeróbico), pertenece a la mitocondria y es marcadora del metabolismo aeróbico en la fibra muscular roja. Se le encuentra en mayor cantidad en el Salmón que en el Hoplias, ya que el primero habita aguas correntosas donde requiere de movimiento constante. Se puede concluir que un animal exitoso durante el movimiento explosivo y de corta duración, deberá tener un metabolismo anaeróbico que presente las siguientes características: 1) un elevado depósito de Glicógeno muscular 2) elevados niveles de enzimas glicolíticas 3) una capacidad tamponante adecuada del músculo para tolerar los distintos niveles de Ac. Láctico. Por otro lado para una oxigenación adecuada durante el metabolismo aeróbico de las fibras musculares se requiere considerar:

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1) El tamaño del animal. Un roedor de pequeño tamaño tendrá mejor oxigenación que un elefante o un cetáceo. Esto se debe al hecho de que al tener menos volumen su sistema circulatorio tiene una menor sobrecarga lo que redundará a su vez en un mayor número de fibras rojas bien oxigenadas. Por otro lado un animal de tamaño mayor deberá disponer de fibras blancas para contrarrestar una oxigenación lenta y poco eficiente. 2) La capacidad de su sistema corazón-pulmón junto al grado de irrigación capilar en cada músculo. 3) El número de mitocondrias que posee un tejido. Volver al inicio

4) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE EL METABOLISMO ANAEROBICO Y AEROBICO. 1) El metabolismo Anaeróbico es una fuente de energía autocontenida en el músculo para la actividad locomotora intensa, pero de corta duración. Se caracteriza por la síntesis explosiva de ATP con gran consumo del sustrato Glucosa, mientras que el metabolismo Aeróbico es para la actividad sostenida que no solo se mantiene por el Glicógeno del músculo, sino que también por las Grasas. Una vez que se agota el combustible presente en la célula muscular, se emplea el combustible proveniente del hígado como glucosa y triglicéridos junto al proveniente del tejido adiposo. Esta característica permite en el músculo un metabolismo abierto con la llegada de los substratos y la subsecuente salida de CO2 y H2O por medio del sistema circulatorio. La actividad del animal aeróbico durante este periodo dependerá del tamaño y trabajo que efectúe el sistema corazónpulmón. 2) La Creatina-P se emplea en la fibra muscular blanca como un reservorio capaz de donar P al ADP, sin embargo en la fibra muscular roja también sirve como lanzadera de Fosfato entre la mitocondria y el sarcoplasma de la fibra muscular roja (Fig. 5 – 8). Volver al inicio 5) LA GLUCOSA COMO SUSTRATO PREFERIDO POR LAS CELULAS. La Glucosa contiene oxígeno en su estructura y se puede decir que NO es uno de los substratos con mayor cantidad de energía química. Es en sí una estructura semioxidada, sin embargo soluble en agua y entre los azúcares de seis carbones, solo una pequeña fracción de sus moléculas se encuentra abierta en la forma de un aldehído. Los aldehídos son conocidos por unirse a los grupos amino terminales de las proteínas alterando su estructura. Por las razones anteriores la molécula de Glucosa es preferible, comparada a otros substratos de mayor energía. Tal es el caso de los ácidos grasos que por estar reducidos y formar largas cadenas, son de difícil manejo debido a su tamaño e hidrofobicidad y además requieren de ciertos mecanismos específicos para su transporte. Más aún, al considerar los 20 aminoácidos como fuente alternativa de energía, encontramos que no todos ellos son solubles en agua y además poseen nitrógeno, lo que es otro inconveniente. Este último debe eliminarse como Urea, Amonio o ác. Úrico cuando son empleados como fuente de energía. Esta complicación implica un costo extra de ATP que también disminuye la eficiencia de los aminoácidos como fuente de energía.

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Volver al inicio 6) EFICIENCIA DE LA GLICOLISIS ANAEROBICA. En general la Glucosa puede ser oxidada con y sin Oxígeno. Así tenemos que la energía total que se desprende por oxidación aeróbica en un calorímetro alcanza a 686 Kcal/mol de Glucosa, de las cuales se aprovechan 277.4 Kcal para sintetizar 38 ATPs por el metabolismo aeróbico animal, lo que arroja un rendimiento del 40.4 %. En cambio, por oxidación anaeróbica se produce a partir de la glucosa un total de 47.0 Kcal /mol hasta Piruvato y de ellas se aprovechan tan solo 14.6 Kcal/mol, que corresponden a solo 2 ATPs, con un rendimiento de solo el 31.0 %. El rendimiento neto comparado con la vía aeróbica es en este caso de 14,6/686 o 2,1 %. El resto de la energía continúa aún en la molécula de Piruvato. Al comparar ambas vías tenemos que la anaeróbica es solo un 5.2 % de la energía aeróbica ( 2/38 ), lo cuál significa poco aprovechamiento de la energía presente en la molécula de Glucosa, cuando no se cuenta con el Oxígeno como aceptor final de protones. La baja eficiencia energética del metabolismo anaeróbico es paliada a su vez por la gran cantidad de sustrato liberado por esta vía. 19 veces más Glucosa para proveer de ATP al mismo nivel que la oxidación aeróbica, Tabla 3 - 8. TABLA 3 – 8 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AEROBICO C6H12O6 + 6 O2----->6 CO2 + 6 H2O

ΔG0' = - 686 Kcal/mol ΔG0' = + 277.4 Kcal/mol

38ADP + 38Pi-----> 38 ATP

Rend. Aeróbico : 277.4/686 * 100 = 40.4 %

ANAERÓBICO C6H12O6 ------------->2 CH3CHOHCOOH

ΔG0' = - 47 Kcal/mol ΔG0' = +14.6 Kcal/mol

2 ADP + 2 Pi------->2 ATP

Rend. Anaeróbico : 14.6/47 x 100 = 31.0 % Comparación = 2/38 x 100 = 5.2 % ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

La energía total de la Glucosa extraída aeróbicamente es el 40,4%, mientras que anaeróbicamente se extrae solo un 2,1%: Comparación : 14,6/686 x 100 = 2,1%

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La oxidación anaeróbica de la Glucosa libera un poco menos de energía que la fermentación alcohólica, sin embargo ambas participan en la síntesis neta de solo dos ATPs: C6H12O6 ----------------> 2 CH3-CHOH-COOH

= - 47.0 Kcal/mol

C6H12O6-----------------> 2 CH3-CH2OH + 2 CO2

= - 50.3Kcal/mol

2 ADP +2 Pi-----------------> 2 ATP

= + 14.6 Kcal/mol

Esto se traduce en un rendimiento del 31% para la glicólisis anaeróbica y del 29.0% para la fermentación alcohólica. Ambas son mucho más eficientes que un motor de combustión interna (10-15%). Volver al inicio 7) ETAPAS DE LA GLUCOLISIS. La Glicólisis consta principalmente de dos etapas. En la primera se reúnen los azúcares simples, como la Glucosa del Glicógeno, la Fructosa y la Galactosa para activarlos con el gasto de dos ATPs y enseguida se rompen en dos moléculas de 3-Fosfogliceraldehído. En la segunda etapa se produce la óxido-reducción donde se produce ATP y sale Lactato. Durante la segunda etapa es cuando se libera energía por medio de las reacciones acopladas y se produce la fosforilación a nivel de substrato, mientras que los protones extraídos al 3-P-Gliceraldehido durante su oxidación son entregados al Piruvato para formar el ácido Láctico. Volver al inicio 8) DEGRADACION Y SINTESIS DEL GLICOGENO. I) DEGRADACION HASTA GLUCOSA. La Glicogenólisis es la degradación del Glicógeno contenido tanto en el hígado (4% peso hígado) como en el músculo (0.7% peso músculo) y consiste en la hidrólisis de la compleja estructura del Glicógeno a Glucosa controlada por la acción hormonal. El mecanismo por el que se degrada el Glicógeno consiste en un sistema de amplificación en cascada, ya que a partir del estímulo inicial provocado por una molécula de hormona en la membrana citoplasmática, se logran liberar del Glicógeno muchas moléculas de glucosa. Entre las hormonas que intervienen en el metabolismo de los Hidratos de Carbono se encuentran las producidas en el Páncreas, específicamente por los Islotes de Langherhans y son la Insulina en las células beta (β), el Glucagón en las células alfa (α) y la Somatostatina en las células gama (γ). La insulina estimula la permeabilidad de los tejidos a la Glucosa y su empleo, el Glucagón estimula la degradación del Glicógeno desde sus reservorios y también la Gluconeogénesis, mientras que la Somatostatina controla su metabolización. Ni el cerebro, ni los eritrocitos almacenan Glicógeno, por lo tanto el aporte de glucosa a estos tejidos por el hígado es fundamental para su buen funcionamiento. Es común en los

354

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

diabéticos que se inyectan Insulina, la rápida entrada de la glucosa a las células musculares y tejidos adiposos, produciéndose una hipoglicemia y posterior desmayo. El Glicógeno es un polímero de la Glucosa formado por las uniones glicosídicas del tipo α (1 – 4) y por las ramificaciones α(1 – 6). De esta manera constituye una molécula formada por muchas ramificaciones iguales y solo parcialmente soluble en agua (Fig. 7 - 8 ), tiene solo un lado reductor α -1-OH con un carbono epímero libre en un extremo e innumerables extremos opuestos con carbonos no reductores o posiciones 4-OH en las distintas moléculas de glucosa. En general se encuentra en casi todas las células, pero principalmente en el

Lado no Reductor CH2OH H

H

H

H

OH

H

H

OH

H

OH

CH2OH

CH2OH H

Unión

H

OH

H

Rama lateral

CH2OH

H

1

H

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

4

1 4 Cadena

1

4

Lado Reductor

6

CH2 H

1 6

H

OH

1 4

H

H OH

H

H

OH

H

1

con

Uniones

1

4

Fig. 7 - 8. Estructura parcial de una molécula de Glicógeno.

músculo esquelético e hígado. A continuación se describen los mecanismos de degradación y síntesis. Las hormonas como Glucagón, Adrenalina y ACTH actúan a nivel de receptores específicos ubicados en la cara externa de la membrana celular (Fig. 8 - 8). El Glucagón activa la degradación generalmente en el hígado y la Adrenalina en el músculo, sin embargo debido a su tamaño o carga, ambos no pueden entrar a la célula y deben ejercer su influencia de manera indirecta uniéndose a una proteína receptora específica ubicada en la membrana celular. En ella desencadenan un cambio conformacional que a su vez estimula a la Proteína G que se encuentra en el interior de la membrana. La proteína G debe su nombre a que interacciona con el nucleótido GTP y tiene tres subunidades denominadas alfa, beta y gama. La subunidad α, es la subunidad activa de la proteína G que se desprende para su acción de las subunidades β y γ. Esta subunidad se

355

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

une al GTP cuando es activada previa liberación de su GDP empleado en el ciclo de activación anterior, para que a continuación ambas moléculas (subunidad Alfa y GTP), se unan a la enzima Adenil Ciclasa. Esta enzima tiene por objeto generar el segundo mensajero o AMPc (Adenosina Monofosfato Cíclico) empleando como substrato ATP. Mientras la Hormona permanezca unida al receptor se formaran interacciones entre la subunidad α, GTP y Adenil Ciclasa, que amplificaran la señal induciendo la formación de AMPc. Una vez que la Hormona abandona el receptor, el GTP se hidroliza a GDP en la subunidad α y se libera de la unión activante con la enzima Adenilato Ciclasa, volviendo a

H H R R

G G

H H R R

AC AC

H : Hormona R : Receptor G : Proteína AC: Adenil Ciclasa FD : Fosfodiesterasa R : Regulatoria C : Catalítica

G

FD

ATP AMP AMPc Proteina r C r+C Quinasa act. inact. Fosforilasa Quinasa Fosforilasa

FQ -OH

FQ -OP

FQ -OH

FQ -OP

inact.

act.

HOHO-

F

- OH - OH

inact.

POPO-

GLICOGENO

F

-OP -OP

(n)

VIA ACTIVA solo con enzima fosforilada

act. GLUCOSA - 1 – P + GLICOGENO ( n - 1 )

Fig. 8 - 8. El mecanismo de regulación en cascada tiene por objeto amplificar el número de moléculas de glucosa liberadas por molécula de hormona.

unirse nuevamente con sus otras subunidades β y γ para formar la proteína G inactiva. Todas las moléculas de AMP cíclico que se han formado hasta este momento interactúan con la enzima Proteína Quinasa que tiene cuatro subunidades 2 reguladoras y 2 activadoras (Fig. 8 - 8). El AMPc se une a las subunidades reguladoras quedando libre las dos activadoras. Estas últimas en presencia de ATP fosforilarán a la enzima Fosforilasa Quinasa, la que activará por fosforilación en cadena a la Glicógeno Fosforilasa. Esta última enzima catalizará la degradación del Glicógeno para formar muchas moléculas de Glucosa1-Fosfato por medio de la reacción entre el Glicógeno, más varias moléculas de Fosfato inorgánico. De esta manera se amplifica el efecto de una molécula de hormona al producir la fosforilación de muchas moléculas de Glucosa como se observa en la Figura 9 - 8. Las presiones selectivas derivaron en este sistema de amplificación para producir energía disponible rápidamente, ya que si fuera la proporción de una molécula de Glucosa por

356

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

molécula de Hormona, habría que tener glándulas de mayor tamaño para producir más Adrenalina para el músculo o Glucagón para el Hígado, lo que redundaría en un peso mayor y dificultad de transporte. La Glucosa -1-Fosfato producida por la degradación del Glicógeno cambia de posición su fosfato a Glucosa-6-P por acción de una Fosfoglucomutasa. De esta forma la Glucosa6-Fosfato, puede continuar degradándose en la Glucólisis o puede entrar al sistema circulatorio previa hidrólisis del Fosfato en el Hígado, siendo llevada a los músculos u otros órganos como Glucosa.

Amplificación en Cascada. Glucagón Adenilato Ciclasa AMPc Proteina Quinasa Enzima Fosforilada Producto. Fig. 9 - 8. Existen distintos puntos de amplificación en la secuencia de reacciones destinadas a degradar el Glicógeno.

Volver al inicio

9) SECUENCIA DE REACCIONES QUE CONDUCEN A LA DEGRADACION DEL GLICÓGENO EN EL HIGADO Y EN EL MUSCULO. HÍGADO Hormona + Receptor----------------> Hormona-Receptor (H-R) H-R + Prot.G-GDP(inactiva)---------> H-R-Prot.G-GTP(activa) Prot.G- GTP(activa) + Adenilato Ciclasa---------> Adenilato Ciclasa(activa)

357

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Adenilato Ciclasa (activa) + ATP--------> AMPc + Proteína Quinasa + AMPc ----------> Proteína Quinasa (activa)-AMPc Fosforilasa Quinasa + Prot.Quinasa (activa)---------->Fosforilasa Quinasa(activa) Fosforilasa(inactiva) + Fosforilasa Quinasa(activa) + ATP------>Fosforilasa-P (activa) + ADP Glicógeno + Pi + Fosforilasa (activa) ----------------> (Glucosa-1-P)n

MÚSCULO Hormona + Receptor----------------> Hormona-Receptor (H-R) H-R + Prot.G-GDP (inactiva)---------> H-R-Prot.G-GTP(activa) Prot.G- GTP(activa) + Fosfolipasa C- γ(inactiva) -----> Fosfolipasa C- γ(activa) Fosfolipasa C- γ(activa) + Fosfatidil Inositol (PIP2) -----> Diacil Glicerol (DAG) + Inositol Fosfato (IP3) Inositol Fosfato (IP3) + Retículo Endoplásmico Liso -----> Salida de Ca +2 4Ca +2 + Calmodulina ------------------> Calmodulina (Ca +2 )4 Calmodulina (Ca +2 )4 +

Fosforilasa Quinasa (inactiva) -----> Fosforilasa Quinasa (activa)

Fosforilasa Quinasa (activa) + Fosforilasa(inactiva) + ATP -----> Fosforilasa-P(activa) Fosforilasa-P (activa) + Glicógeno + Pi -----------------> (Glucosa-1-P)n Por otro lado en la figura 10 – 8, se observa que en el músculo la amplificación en cascada es desencadenada por la Adrenalina y como segundo mensajero se emplea el Inositol Trifosfato ( IP3). Este es parte de uno de los Fosfolípidos de membrana denominado Fosfatidil Inositol-P (PIP2). El IP3 actúa sobre el Retículo Endoplásmico Liso que libera Ca +2, que por un lado estimula la contracción muscular y por el otro la liberación de sustrato Glucosa desde el Glicógeno para entregar energía a la misma contracción. El ion Ca +2, se une a la proteína denominada Calmodulina (PM 17.000kD) en 4 lugares cambiando la conformación de esta y uniéndose a la enzima Fosforilasa Quinasa. Esta última pasa de inactiva a activa y a su vez cataliza la activación de la Fosforilasa que finalmente cataliza el paso de Glicógeno a Glucosa-1 -P. La síntesis del Glicógeno es llevada a cabo por una enzima denominada Glicógeno Sintasa. Esta es una enzima reguladora de la vía de síntesis del glicógeno y es también

358

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

fosforilada por la Proteína Quinasa con lo que se inhibe en su accionar (Fig 11 - 8). De esta manera se evita un ciclo inútil o fútil de síntesis degradación que solo gastaría ATP. H

E S P A C IO EXTRACELULAR

R P IP 2

P L -C γ

G

E S P A C IO IN T R A C E L U L A R

+ DAG

IP 3

C a +2

R E T ÍC U L O E N D O P L Á S M IC O L IS O

C A L M O D U L IN A

F O S F O R IL A S A Q U IN A S A A C T IV A

F O S F O R IL A S A Q U IN A S A IN A C T IV A

F O S F O R IL A S A IN A C T IV A

( G L IC Ó G E N O )

N

P

F O S F O R IL A S A A C T IV A

Fig. 10 - 8. Cascada de amplificación en el músculo

G L U C O S A -1 -P + ( G L IC Ó G E N O ) N - 1

H R AC

G ATP Proteina Quinasa

AMPc R C

R +

C

Act.

GLICOGENO VIA ACTIVA solo con enzim a defosforilada

UDP-Glucosa

HO - GS GS - OH Glicógeno Sintasa Act.

PO - GS GS - OP Glicógeno Sintasa Inact.

Fig. 11 - 8.La Proteína Quinasa evita los ciclos inútiles al inhibir la vía Glucogénica durante la Glicólisis.

Volver al inicio 10) SINTESIS DE GLICÓGENO DESDE GLUCOSA O GLICOGENESIS.

359

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

La síntesis de Glicógeno empieza con la fosforilación de la glucosa por la Glucoquinasa formando Glucosa-6-P en el hígado, ya que esta enzima debido a su mayor Km funciona solo en condiciones de sobrealimentación. La Glucosa-6-P, pasa luego a Glucosa-1-P por acción de la Mutasa. A continuación la Glucosa-1-P es tomada por la UDP-Glucosa Pirofosforilasa que carga de energía a la Glucosa con UTP para formar UDP-Glucosa y unir la UDP-Glucosa mediante la Glucógeno Sintasa, en una reacción exergónica al extremo no reductor del Glicógeno (Fig. 12 - 8).

GLICÓGENO SINTASA

Lado no Reductor

CH2OH H

H

4

UDP

OH

H

Rama lateral

4

1 O

CH2OH

CH2OH

H

H OH

OH

OH

OH

H

CH2OH O

H OH OH H

O

H

P O

P O O

4

N 2

H OH

H

OH

H

H

H

OH

H OH

1 4

H

H

H

OH

H OH

1

4

Lado Reductor

6

CH2

H

H

OH

H

6

1

1

H

CH2OH

H

O

O

O

OH

Unión

H

H

CH2OH

H

H

1 4

H OH

H

H

OH

H

1

HC

O O

OH

UDP - GLUCOSA

H

H

OH

OH

N

Pi

FOSFORILASA

PPi 2Pi

UTP

CH2OH H

4

PIROFOSFORILASA

H OH

H

OH H

1

O - P

OH

Fig. 12 - 8. La molécula de glucosa debe activar su C-1 para unirlo al C-4 del Glicógeno. La liberación de una molécula desde el Glicógeno se lleva a cabo por fosforilación en el C-1 de la Glucosa.

La molécula de UDP-Glucosa se une al lado 4' de la Glucosa perteneciente a un extremo del Glucógeno conocido como el lado no reductor y no al extremo 1' del Glicógeno conocido como el lado reductor, donde se encuentra el carbono epímero. La Molécula de Glicógeno tiene un lado reductor (C 1') y muchos lados no reductores (C4'), donde se unen o se liberan nuevas moléculas de Glucosa. De esta manera se adicionan de 6 a 12 moléculas hasta que actúa sobre ellas una enzima ramificante que toma este grupo de moléculas enlazadas y forma una rama lateral en el carbón 6 de una de ellas. Esta enzima es una α (1 – 4) - α (1 – 6) Transferasa o Transglicosidasa (Fig 13 – 8), la que produce una unión α 1- 6 o rama lateral. Vía de Degradación:

360

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Glucógeno Fosforilasa Pi + GLICOGENO----------> GLUCOSA-1-P Vía de Síntesis: Pirofosforilasa GLUCOSA -1-P + UTP ------> UDP-GLUCOSA + PPi PPi --------------> 2Pi Glucógeno Sintasa UDP-GLUCOSA + GLUCÓGENO------> GLUCOSA( 1-4) GLICOGENO + UDP Regeneración del UTP UDP + ATP----->UTP + ADP 11) RAMIFICACIÓN Y DESRAMIFICACIÓN DE LA MACROMOLÉCULA DE GLICÓGENO. La enzima Fosforilasa rompe uniones α (1 - 4) en las ramas del Glicógeno, sin embargo cuando llega a 4 unidades de Glucosa de una ramificación del tipo α (1 - 6) se detiene y no FOSFORILASA O

O

O

O

O

O

O

2P- O O

O

O

O

O

O α(1-4) - α (1-6) TRANSGLICOSIDASA

O O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

α(1-4) - α (1-4) TRANSFERASA

O O

O

O

O O O

3 UDP O

GLICÓGENO SINTASA

3

O

O

O

O

O

α (1-6) GLUCOSIDASA O

- UDP O

O

O

O

O

O

O

O

Fig. 13 – 8. Ciclo de ramificación y desramificación del Glicógeno

avanza más. En este momento actúa una enzima denominada α (1– 4) a α (1 – 4) Transferasa, que lleva las tres unidades de Glucosa previas a la Glucosa de la unión α (1 – 6) a otra

361

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

rama, donde el grupo en posición 4 esta libre. De esta manera la Glucosa de la rama queda expuesta y es atacada por una α (1 – 6) Glucosidasa que la libera como Glucosa. Esta última enzima es también reconocida como Enzima Desramificante que rompe las uniones del tipo α (1 – 6).

Volver al inicio

12) ENFERMEDADES DEL ALMACENAMIENTO DEL GLICÓGENO y PROCESAMIENTO DE LA GLUCOSA.

362

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Existen algunas enfermedades denominadas de Almacenamiento del Glicógeno (Tabla 4 – 8) y también del transporte de la Glucosa que dejan a las células con cristales de Glicógeno. En algunos casos la Macromolécula no se pueda degradar y en otros almacenar. De esta manera se pierde el control para mantener una determinada concentración de Glucosa en la sangre y la disponibilidad de esta para liberar energía bajo requerimiento. Por otro lado, algunas moléculas transportadoras de Glucosa, son también susceptibles de fallas al no poder entregar sustrato a una enzima determinada provocando enfermedades similares a la carencia total o parcial de la misma enzima. Tabla 4 – 8 Volver al inicio

TI PO Ia

NOMBRE DE LA ENFERMADA D Von Gierke

Ib

II

Pompe

IIIa

Cori o de Forbes

IIIb

IV

Andersen

V

VI

Mc Ardle, SchmidtPearson Hers

VII

Tarui

VIb, VIII o IX XI

FanconiBickel

ENZIMA AFECTADA

ORIGEN

MANIFESTACIONES

Glucosa-6- Fosfatasa

Hígado

Glucosa-6-P Translocasa Microsomal α-1,4 Glucosidasa Microsomal y αGlucosidasa, también Maltasa Ácida

Hígado

Hepatomegalia Falla renal Hipoglicemia severa Disfunción trombocitaria Como Ia anterior con neutropenia e infección bacteriana

Enzima Desramificante. Hígado y Músculo Enzima Desramificante anormal en el Hígado Enzima del Músculo normal Enzima Ramificante

Forma infantil sobrevive hasta 2 años. La Juvenil produce Miopatía y en el adulto distrofia muscular. Se encuentra Glicógeno en los lisosomas Hepatomegalia en niños y Hígado Músculo Miopatía Esquelético y Estructura del Glicógeno alterada cardíaco En el hígado similar a IIIa Hígado Estructura del Glicógeno alterada músculo esquelético y cardíaco Músculo Esquelético y Cardíaco

Hígado y Músculo Músculo esquelético

Hepatoesplenomegalia, cirrosis. Estructura del Glicógeno alterada Fatiga y Calambres con ejercicio, Mioglobinuria

Fosforilasa en Hígado

Hígado

PFK-1 Músculo

Músculo, Eritrocito

Hepatomegalia, Leve Hipoglicemia, Hiperlipidemia y Cetosis, mejora con la edad Como V con anemia, hemolítica

Fosforilasa Kinasa

Hígado, leucocitos, músculo Hígado

Fosforilasa Muscular

Transportador de Glucosa-2( TGLU-2)

363

Como VI

Falla en el crecimiento, hepatomegalia, raquitismo, disfunción del túbulo contorneado proximal

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

13) ETAPAS DE LA GLICOLISIS. Se ha sugerido en la literatura que el rol de la Glicólisis en el hígado sería la transformación de Glucosa en ácidos grasos mientras que en el músculo sería la obtención de energía química en forma de ATP. A continuación se indican las etapas principales de la Glicólisis a partir de la Glucosa proveniente del Glicógeno o de la circulación periférica: a) ACTIVACION DE LA GLUCOSA 1) Fosforilación 2) Isomerización 3) Formación de las Triosas-Fosfato. b) RUPTURA DE LA GLUCOSA Y OXIDACION 1) Oxidación 2) Primera extracción de energía 3) Reordenamiento 4) Segunda extracción de energía 5) Reducción VIA GLUCOGENICA

CH2OH O

H HO

P

H

H

OH

Fructosa – 6-Pasa

GLUCOSA

OH

AT P ADP P

CH2O H

H OH

O

H OH

OH

H

H

GLUCOSA-6-P

H

H

OH H

OH

FRUCTOSA-6-P AT

Fructosa - 1,6 – Bi-Pasa P

Fructosa - 6 - P – Isomerasa

CH2OH

O

O 2HC

P

Hexoquinasa

H

HO

P

VIA GLICOLITICA

H

H OH

P

ADP O 2HC

O H

CH2 O H

H

OH OH

P

Fosfofructo Quinasa (PFK1)

H

FRUCTOSA-1,6 -Di-P

Fig. 14 - 8.Activación de la Glucosa con gasto de dos ATPs en la vía Glicolítica. De esta manera la molécula excitada será más fácil dividirla en dos. En la vía Glucogénica se liberan dos Fosfatos hasta Glucosa.

a) En la primera etapa de la Glicólisis se logra superar una barrera de energía por medio de la activación con una molécula de ATP, seguido de una isomerización de la molécula de

364

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Glucosa a Fructosa y a continuación una segunda activación con ATP (Fig. 14 - 8), para producir la Fructosa-1,6-bifosfato. Este tratamiento produce la destabilización posterior del anillo de la Fructosa-1,6-bifosfato, favoreciendo su forma abierta y la subsecuente ruptura de este para formar dos triosas fosforiladas (Fig. 15 - 8), como la Fosfo-Dihidroxicetona y el 3-Fosfo-Gliceraldehido. V IA G L U C O G E N IC A 6

P

O2H C 5

H

OH

H

3

4 OH

V IA G L IC O L IT IC A

1 C H 2O

O

2 OH

H

P

F ru c to s a – 1 ,6 -B i-P

A ld o la s a 3 CH OH 2 2 C O 1 CH O 2

+ P

P - D i - O H - C e to n a

4 HC

O

5

CH

OH

6

CH O 2

P

3 -P -G lic e ra ld e h id o

Fig. 15 - 8.Ruptura de la molécula de Fructosa activada por la Aldolasa. La reacción es reversible.

Debido a los dos ATPs iniciales que han cargado la molécula de energía al fosforilarla, la molécula se ha tornado más inestable y reactiva dividiéndose en dos nuevas moléculas de tres carbones cada una. En la primera etapa encontramos que la Glucosa presente en el sistema circulatorio es capaz de entrar a los tejidos (músculo, tejido adiposo) por medio de la Insulina y que la Glucosa endógena almacenada como Glucógeno puede ser liberada por las hormonas Glucagón (hígado) y Epinefrina (músculo). Las moléculas provenientes de ambas fuentes pueden converger en la formación de Glucosa-6-P. La Glucosa-1-P proviene de la acción de la Fosforilasa sobre el Glicógeno y posteriormente pasa a Glucosa-6-P por acción de una Mutasa ( Fosfoglucomutasa). La Glucosa libre no fosforilada que proviene del sistema circulatorio es el substrato de las enzimas que catalizan su fosforilación, llamadas Hexoquinasa Muscular (Km= 0,10 mM) y Glucoquinasa del Hígado (Km= 10,0 mM). Siendo la Hexoquinasa aquella con mayor afinidad o menor Km. La Glucoquinasa solo fosforila Glucosa en exceso dirigida a la Glicogénesis. Glucoquinasa Sangre Hexoquinasa Citoplasma Glucosa + ATP ----------> GLUCOSA-6-P + ADP Glicógeno Fosfoglucomutasa Glucosa-1-P ---------------> GLUCOSA-6-P Pi + GLUCOSA FRUCTOSA-6-P PFQ1 (Fosfofructo Quinasa) FRUCTOSA-6-P + ATP --------> FRUCTOSA-1,6-BI-P Fructosa-1,6-Bi-Fosfatasa FRUCTOSA + Pi Páncreas--->Glucagón--->Glucagón-Receptor---> Prot. G--->Adenil Ciclasa --->AMPc--->Prot. Quinasa Activa Prot. Quinasa Activa ATP + PFK2 activa -------------------------> ADP + PFK2 inactiva Fosforilada FBP2 inactiva FBP2 activa PFK2 inactiva o Fosforilada FBP2 activa P + Fructosa-6-P Disminución del modulador de la actividad alostérico Fructosa-2,6-BI-P en la PFK1 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------En el caso contrario en que ocurra una Hiperglicemia, se desencadena el mecanismo que retira glucosa del plasma y que se encuentra descrito en la Figura 18 - 8.

368

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Solo las reacciones exergónicas son susceptibles de ser controladas, no sucede así con las Aum ento de Transporte entrada de G lucosa extrahepática.

Insulina

H iperglicem ia

G lucagón

Dism inuyen

Fosforilasa a Act. G licógeno Sintasa D Inact.

En todos los Tejidos G lucosa Sangre

Aum entan

Fosforilasa b Inact. G licógeno Sintasa I Act.

G lucosa-6-P

UTP +

G lucosa-1-P

UDP-G lucosa + PP

UDP + ATP

i

G LICO G ENO + UDP

UTP + ADP

Fig. 18 - 8. Cadena de eventos para restaurar los niveles de Glucosa en la sangre.

reacciones endergónicas o cercanas al equilibrio. Estas últimas solo se regulan por aporte de substrato y remoción de producto. Volver al inicio

15)

HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA EN LA SANGRE

Dependiendo de la concentración de Glucosa en la sangre se liberan dos tipos de hormonas para mantener la concentración de Glucosa constante. Los sensores que detectan el aumento o la baja concentración de Glucosa se encuentran en el Páncreas. Estos receptores propician la liberación de Insulina o Glucagón, es decir cuando aumenta la Glucosa en la sangre, menos Glucagón y más Insulina se libera del Páncreas. Por otro lado cuando la Glucosa disminuye, menos Insulina y más Glucagón es liberado por el Páncreas. Ambas hormonas actúan a nivel del Hígado. El Hígado es la bodega de Glicógeno, por lo tanto la Insulina promueve la formación de Glicógeno a partir de la Glucosa que entra por la sangre. Por otro lado Glucagón estimula la formación de Glucosa a partir de Glicógeno (Fig. 19 – 8). La Diabetes es un trastorno relacionado con el manejo de la Glucosa. La Diabetes Mellitus se produce por la incapacidad de producir ADH y se promueve la retención de agua. Por otro lado la Diabetes Mellitus, se caracteriza por no producir suficiente Insulina por lo que la Glucosa no entra a los tejidos y no se convierte en Glicógeno, por lo que se acumula en la sangre causando una serie de alteraciones, ya que la Glucosa en mayor concentración y tiempo en los tejidos se abre y su grupo aldehído se une espontáneamente a los grupos amino de las proteínas alterándolas (cataratas en el cristalino, unión a la Hemoglobina, envejecimiento prematuro de riñón, etc)

369

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Superponiéndose al mecanismo anterior, se encuentra la Adrenalina secretada por las Suprarrenales, que en un caso de emergencia ( accidente, temblor, ejercicio repentino) prepara al organismo para luchar o arrancar. Esto se logra degradando Glicógeno y sacando Glucosa a la circulación, a la vez se aumenta el ritmo cardíaco y la velocidad de la respiración. Una vez que la emergencia ha pasado, los niveles de Adrenalina disminuyen y se impone el mecanismo anterior regulado por el Páncreas con sus receptores y la secreción de Insulina y Glucagón que regulan al Hígado. + INSULINA Receptor Pancreas

HIGADO

AUMENTO DE GLUCOSA

TOMA GLUCOSA DE LA SANGRE Glucosa a Glicógeno

Nivel Normal de Glucosa en la Sangre

Nivel Normal de Glucosa en la Sangre

DISMINUCIÓN DE GLUCOSA

ENTREGA GLUCOSA A LA SANGRE Glicógeno a Glucosa +GLUCAGÓN HIGADO

Receptor Pancreas Fig 19 – 8. Homeostasis de la Glucosa

Volver al inicio

16) TRANSPORTE DE LA GLUCOSA

370

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Glucosa y Fructosa deben atravesar membranas por medio de una familia de 5 proteínas transportadoras denominadas GLUT, ya que poseen cierta homología entre sí.

Tabla 6 - 8

NOMBRE DEL TRANSPORTADOR GLUT 1 GLUT 2

GLUT 3 GLUT 4 GLUT 5

TEJIDO

PROPIEDADES

MAYORÍA DE LAS CÉLULAS

ALTA CAPACIDAD Y BAJA AFINIDAD. Km 2 -3 mM ALTA CAPACIDAD, PERO BAJA AFINIDAD. Km MAYOR DE 5 mM

HÍGADO, CÉLULAS BETA, HIPOTÁLAMO, MEMBRANA BASOLATERAL, INTESTINO DELGADO NEURONA, PLACENTA, TESTÍCULOS MUSCULO ESQUELÉTICO Y CARDÍACO, TEJIDO ADIPOSO MUCOSA, INTESTINO DELGADO, ESPERMA

Km MENOR DE 1 mM ACTIVADO POR INSULINA ESPECÍFICO DE FRUCTOSA

En la Tabla 6 - 8, aparecen las proteínas que se encuentra a cargo del transporte facilitado desde lugares de alta concentración a los de baja concentración. La Glucosa se une a la proteína y esta hace un movimiento de “flip-flop” en la membrana liberando el azúcar al interior para recuperarse y repetir nuevamente el proceso. La cantidad transportada depende del gradiente de concentración y el número de transportadores Glut. El transporte también puede ser al exterior desde el tejido. En tejido Gluconeogénico como hígado y riñón la concentración de Glucosa intracelular excede la conc. de Glucosa de la sangre durante el ayuno. La exportación de Glucosa ocurre por medio de Glut2. Glut 4 es el transportador relacionado con la Insulina, se encuentra inactivo cuando está unido a la membrana del Golgi (Fig. 20 – 8). Llega a la membrana celular por un proceso que requiere de ATP y una vez empleado en la entrada de Glucosa, vuelve nuevamente al Golgi donde permanece inactivo. La insulina influencia el balance estimulando la Exocitosis y presentación de Glut4 para la entrada de Glucosa, posteriormente por Endocitosis desaparece el receptor de la superficie celular. La actividad muscular aumenta el número de Glut4 en la membrana plasmática por el mismo mecanismo. La actividad muscular sola puede controlar los niveles de Glucosa sin demasiada necesidad de Insulina.

371

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

R e c e p to re s a c tiv o s

E n d o c ito sis

E xo c ito s is

R e c e p to re s in a c tiv o s

GOLGY

Fig. 20 - 8. Reciclaje de receptores la Glucosa mediados por Insulina

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17) OTROS HIDRATOS DE CARBONO QUE ENTRAN A LA GLICÓLISIS Algunos Hidratos de Carbono (fig. 21 – 8), bastante comunes en los alimentos CH2O H

MALTOSA α- D – G lu c o p ir a n o s il (1 -4 ) β -D G lu c o p ir a n o s a

CH2O H O

O OH

OH β -D -G lu c o s a

CH2O H

CH2O H β

O

O OH

OH O

α

HO OH

OH

α - D – G lu c o s a LACTOSA β -D G a la c to p ira n o s il (1 -4 ) β -D G lu c o p ir a n o s a

O

β

OH

O O

OH β -D - G a la c to s a

Fig. 21 - 8. Maltosa, Sacarosa y Lactosa

372

CH2O H

β -D -F ru c to s a CH2O H

CH2O H HO

β

O

α OH α - D – G lu c o s a HO

SACAROSA α- D – G lu c o p ira n o s il (1 -2 ) β -D F ru c to fu ra n ó s id o

OH

OH

OH

OH

OH β -D - G lu c o s a

β

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

están representados por Maltosa (dos Glucosas unidas por enlaces α (1 - 4), Sacarosa (Una Glucosa y una Fructosa unidas por enlace (α 1 – β 2)) y Lactosa (Una Galactosa y una Glucosa unidas por enlace β (1 – 4).

α-D-Galactosa Glucosa-1-P UTP PP OH

Galactoquinasaa UDP-Glucosa Pirofosforilasa

α-D-Galactosa-1-P

UDP-Glucosa

α -D-Galactosa-1-P

Epimerasa

Uridil Transferasa

UDP-Galactosa OH Glucosa – 1-P Fosfoglucomutasa

Glucosa-6-P

Fig. 22 – 8. Inversión del grupo OH en el carbono 4 de la Galactosa.

Todos ellos son hidrolizados por las Maltasas, Sacarasas y Lactasas intestinales, dando lugar a las Hexosas, entre las cuales tenemos a la Glucosa, Galactosa y la Fructosa. La Fructosa es metabolizada al formar Fructosa-6-P, mientras que en el hígado pasa a Fructosa-1-P por la Fructoquinasa. Posteriormente se descompone por la Aldolasa B en Fosfodihidroxicetona y D-Gliceraldehido que finalmente se fosforila a Gliceraldehido-3-P. La Fructosa entra sin regulación por la PFK, así que se convierte fácilmente en grasa. La Galactosa para convertirse en Glucosa debe activar su carbono 4 y dar vuelta el grupo OH (fig. 22 – 8), por lo tanto se activa con Galactoquinasa y ATP para formar Galactosa-1-P, posteriormente reacciona con UDP-Glucosa, para alcanzar un mayor grado de energía como UDP-Galactosa. A continuación una epimerasa invierte el grupo 4-OH pasando a formar UDP–Glucosa. La UDP–Glucosa reacciona cíclicamente con una nueva molécula de Galactosa-1-P activándola y quedando ahora como Glucosa-1-P que puede continuar con la Glicólisis. Una vez que han entrado los distintos monosacáridos a la vía glucolítica y se encuentran activados como la Fructosa-1,6 di-P, se produce la ruptura del anillo de Fructosa que porta los dos centros con cargas negativas representados por el fosfato. La enzima Aldolasa por medio de una Lisina que se une al C5 de la Fructosa-1,6-bifosfato logra abrir el anillo, seguido de una polarización de los carbonos 3 y 4 y la subsecuente ruptura del enlace por escisión Aldólica y formación de las dos triosas fosfato. El equilibrio favorece a la formación de la Fosfodihidroxicetona, pero el 3-P-Gliceraldehido se forma en menor proporción y es

373

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

arrastrado rápidamente a la formación del 1,3- Difosfoglicerato, catalizado por la enzima Isomerasa. Aldolasa FRUCTOSA-1,6-BI-P -------> 3-P-GLICERALDEHIDO + P-DIHIDROXICETONA Isomerasa P-DIHIDROXICETONA ------------> 3-P-GLICERALDEHIDO En la Glándula mamaria lactante se produce la síntesis de la Lactosa (Fig. 23 – 8). Este es el azúcar de la leche y consta de una molécula de Glucosa y otra de Galactosa. Para ellos se debe tomar una molécula de Glucosa y la posición del grupo OH del carbono 4, por sobre el plano del anillo, es decir se debe efectuar una epimerización para así convertir la Glucosa en Galactosa. Posteriormente, se une a la Glucosa para formar una molécula de Lactosa.

GLUCOSA

GLUCOSA-6-P 1

GLUCOSA-1- P 2 UTP 3 4

5 LACTOSA

UDP-GALACTOSA

PPi UDP-GLUCOSA

Fig. 23 – 8. 1. Hexoquinasa. 2. Fosfoglucomutasa. 3.UDP-Glucosa Pirofoaforilasa. 4. UDP-Galactosa4-Epimerasa 5. Síntesis de Lactosa

El metabolismo de la Galactosa es algo conflictivo ya que se pueden producir algunas enfermedades caracterizadas por la falla de algunas de las enzimas de este metabolismo. Así tenemos las Galactosemias tipo I y II, caracterizadas por la pérdida total o parcial de la enzima Galactosa-1-P-Uridil Transferasa o la Perdida de la Galactoquinasa respectivamente. Los recién nacidos con este problema no crecen adecuadamente y después de ser amamantados se producen vómitos, diarrea y se comportan de forma indiferente. Se les denomina intolerantes a la Lactosa ( Glucosa-Galactosa). Se produce daño en el hígado que conduce a cirrosis, elevadas conc. en la sangre de azúcares reductores como galactosa (hipergalactosemia), pero no de glucosa. Estos síntomas se encuentran acompañados de Acidosis metabólica con hipercloremia, Galctitol urinario e hiperaminoaciduria. La Galactosa circulante es reducida por la enzima Galactosa reductasa que emplea NADPH y se encuentra presente en los tejidos neurales y en las lentes del ojo. El Galactitol produce hinchazón del cristalino por osmosis, ya que atrae el agua con una formación concomitante de cataratas. La /UDP- Galactosa epimerasa también puede fallar afectando en un caso solo a los eritrocitos y linfocitos, mientras que en el otro caso afecta a todos los tejidos con síntomas similares a la Transferasa.

374

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Volver al inicio 18 )

SEGUNDA ETAPA DE LA GLICÓLISIS

b) En la segunda etapa de la Glicólisis en la Figura 24 - 8, se procede a la oxidación y extracción de energía en base a los productos de ruptura de la Glucosa. Se empieza por las moléculas de 3-P-Gliceraldehido, ya que la molécula de Glucosa se rompió en dos. Una de estas triosas, la P-di-Hidroxicetona se isomerizó luego, por medio de la TriosaFosfato-Isomerasa en 3-P-Gliceraldehido. Se dispone de esta manera de dos moléculas de 3-P-Gliceraldehido que serán rápidamente oxidadas por NAD+, mediante la enzima 3Fosfogliceraldehído Deshidrogenasa. De esta manera se oxida con NAD para formar Ác. 3-P-Glicérico, el que reacciona con Fósforo inorgánico dando origen a un anhídrido altamente exergónico, que posee dos fosfatos con carga negativa. Ambos se encuentran a corta distancia uno del otro y uno de ellos posee una alta densidad electrónica, con menos formas resonantes que las encontradas en el producto de su hidrólisis. Esta molécula es el Ác. 1,3-di-Fosfo-Glicérico, capaz de liberar 11,8 Kcal/mol por hidrólisis y constituye la fuente de energía química para sintetizar ATP.

3-Fosfo-Gliceraldehído Deshidrogenasa

3-P-GLICERALDEHIDO + NAD+ -----------> 3-P-GLICERICO + NADH+H

3-P-GLICERICO + Pi --------> AC.1.3-DI-P-GLICERICO

El NADH + H+ que se obtiene como producto de la oxidación, podrá entregar al ácido Pirúvico sus protones, para formar ácido Láctico regenerándose la coenzima, como NAD+ , en la última reacción de la Glicólisis. En el caso de que fuera una oxidación aeróbica el NADH + H+ , se recuperaría con moléculas aceptoras de protones, tal como el Oxaloacetato o la P-Dihidroxicetona, que al reducirse forman consecutivamente Malato y Glicerol-P. Ambas moléculas llevan los protones a la mitocondria donde se oxidan nuevamente. Estos transportadores o lanzaderas de protones deben su existencia a que el NADH+H+ es impermeable a las membranas mitocondriales y no podría entrar a oxidarse y salir nuevamente. Las moléculas transportadoras o lanzaderas Malato y Glicerol-P, entregarán los protones a la Cadena de Transporte de Electrones en el interior de la mitocondria, para volver a salir nuevamente en búsqueda de otras unidades reductoras. Estas vías de transporte de protones son conocidas como Lanzadera Glicerol-P-Fosfodihidroxicetona (fig. 23 – 8) y Lanzadera Malato-Aspartato (fig. 24 – 8). Ambas son empleadas en la oxidación aeróbica de la Glucosa.

375

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

P – Dihidroxi- CH2 - OH HC O cetona C O + CH - OH CH2 - O-P

P-DHC Isomerasa

Gliceraldehido - 3- P

CH2 - O-P

HC O

X2

CH2 - O-P

O

NAD

NADH + H

C - O- P CH - OH

1,3 - B i – P ADP Glicerato Quinasa ATP

Gliceraldehido - 3- P

CH - OH

Pi 3- P– Gliceraldehido Deshidrogenasa

.

CH2 - O - P

1,3 - B I - P- Glicérico Molécula de alta nergía

O C – OH

3 - P - Glicerico

CH2 CH2 - O - P

Mutasa O

H2O

ADP

ATP

NADH + H

NAD O

C – OH

O

O

CH2 - O - P

C OH

C – OH

-

C – OH C

HO Enolasa C O - P C O Láctico Piruvato CH2 - OH CH3 Quinasa CH3 DeshidroCH2 2 - P - Glicerico P - Enol – Piruvico Ác. Piruvico genasa Ác. Láctico

Molécula de alta energía

Fig. 24 - 8.En la segunda parte de la Glicólisis se puede apreciar como se recicla la coenzima NAD reducida a oxidada.

376

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

Lanzadera Glicerol – P dirigida a la Mitocondria

Glicógeno

CH2- O - P

Glicerol - P

Glicerol - P

CH2O - P CH - OH

CH2O - P CH - OH

CH2 - OH

CH2 - OH

CH2 - OH

+

FAD

CHO

Gliceral -

NAD

Pi

1,3 Di - Fosfo Glic[erico

Glicerol - P CH2O - P CH - OH

CH - OH

3 - Fosfo dehido

.

CH2 - O - P CH - OH O O

Espacio Intermembrana.

N AD H + H+

C- O- P- O

C

2 H+

FADH2

CH2O - P

O

C.T.E.

2H

O

CH2 - OH P - Dihidroxicetona

+

CH2O - P C O

C

CH2 - OH

CH2 - OH

P - Dihidroxicetona

CH2O - P O

P - Dihidroxicetona

Piruvato

CITOPLASMA

Membrana Externa

Matriz

Membrana Mitocondrial Interna

Fig. 25 - 8. Los protones van directamente del 3-Fosfo-Gliceraldehido a la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria (CTE).

En resumen, la forma Anaeróbica de recuperar el NADH+H+ en el citoplasma es:

NADH + H + PIRUVATO----->LACTATO + NAD La forma Aeróbica, de recuperar el NADH+H+ en el citoplasma con ayuda de Lanzaderas y la Mitocondria es mediante: Volver al inicio 19 a) LANZADERA GLICEROL - FOSFATO 19 b) LANZADERA MALATO

377

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

La lanzadera Glicerol-P se encuentra principalmente en el músculo esquelético y cerebro (Fig.25 - 8), mientras que la lanzadera Malato-Aspártico se le halla en el hígado, riñón y corazón (Fig. 26 - 8). El Ácido Oxaloacético no puede salir de la mitocondria por lo tanto debe transaminar para formar ác. Aspártico que luego de otra transaminación en el citoplasma vuelve nuevamente a Ac. Oxaloacético.

Lanzadera Malato – Oxaloacetato dirigida a la Mitocondria Glicógeno 3 - p –Gliceraldehido

H

CH2- O - P

Malato

Malato

COO

COO

C

OH

CH2

CH - OH

COO

CHO

H

C

Malato COO H

OH

CH2 COO

CH - OH O

H+ H+ NADH + H

Glu

C–O - P- O O

O

COO C O

NAD

CT E

α-Cetoglutarato

COO COO Oxalo Acetato H - C - NH3

Piruvato

CH2 COO Aspartato

+ H

+ H+ H

CH2

COO H - C - NH3 CH2 COO Aspartato

OH

CH2

NAD

CH2 - O - P

C

COO COO Oxaloacetato

NADH + H+

C O CH2 COO

COO H - C - NH3

Glu

α-Cetoglutarato

CH2 COO Aspartato

Fig 26 - 8. Los protones viajan en el Malato a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE) mientras que el Oxaloacetato vuelve al exterior como Aspartato, después de transaminar con Ac. Glutámico.

Al continuar con la Glicólisis encontramos la primera reacción de fosforilación a nivel de sustrato donde se generan dos ATPs mediante una reacción exergónica con un ión común como el Fosfato. Quinasa 1,3-DI-P-GLICERICO + ADP ----------------> ATP + 3-P-GLICERICO Desde el ác. 3-P-Glicérico, se produce un reordenamiento y deshidratación por los que la molécula de sustrato vuelve a ganar energía transformándose ahora en Fosfoenol Piruvato,

378

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

molécula altamente exergónica de alta densidad electrónica con cargas negativas próximas entre sí. Mutasa 3-P-GLICERICO --------------> 2-P-GLICERICO Isomerasa 3-P-GLICERICO ---------------------------> P-ENOLPIRUVATO + H2O Quinasa P-ENOLPIRUVATO + ADP -------------------------> ATP + PIRUVATO Las dos moléculas de P-Enol Piruvato son capaces de generar un ATP cada una que junto a las dos anteriores darían un total de cuatro. Sin embargo, para desestabilizar la molécula de glucosa usamos dos ATPs, de manera que ahora restan solo dos ATPs para las funciones de la célula. A esta reducida eficiencia se debe la tremenda amplificación que ocurre durante la regulación en cascada, la cual tiene por objeto de aumentar el número de moléculas de ATP. Finalmente, la reacción en que se recupera la coenzima reducida ( NADH + H) produce Ac. Láctico y es catalizada por la Lactato Deshidrogenasa, que es una Isoenzima ampliamente distribuida en los tejidos con formas M4 (muscle) y L4 (liver) junto a otras combinaciones de M y L. Lactato Deshidrogenasa PIRUVATO + NADH + H ------------> LACTATO + NAD En la Figura 27 - 8, se puede apreciar la vía Glicolítica en su totalidad mientras que su balance es el siguiente: GLUCOSA + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD------------>2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 NADH + 2H 2 PIRUVATO +2 NADH +2 H----------->2 LACTATO + 2 NAD Si la concentración de Glucosa es 100mM, la concentración de ADP 20mM y la de Pi es de 2mM. ¿Cuándo se detendrá la reacción y cuál es el reactivo limitante? Esto no ocurrirá cuando se agoten los 2 mM de Pi ya que se regenera constantemente con la formación de lactato. La reacción solo se detendrá cuando se agoten los 20mM de ATP, los cuales consumirán 10mM de Glucosa dejando 90mM de ella y formando finalmente 20mM de ATP. En la Tabla 6 - 8, se pueden apreciar las reacciones individuales de la Glicólisis donde la energía de cada reacción ha sido calculada en base a la Keq como /\Go' y también como /\G total, que depende de las concentraciones reales en equilibrio de estado estable para cada substrato y producto en las distintas reacciones de esta vía. En base a los datos se puede concluir que muchas de las reacciones son desfavorables en el sentido de la formación de Piruvato y que se caracterizan por tener una Keq < 1 y un /\Go' positivo o endergónico, sin embargo se hacen exergónicas debido a la acumulación de substrato por la reacción anterior

379

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

o bien por la rápida remoción de su producto debido a la reacción posterior en la misma vía. De esta manera las reacciones exergónicas "empujan" o "tiran" respectivamente de las reacciones endergónicas al encontrarse entremezcladas en una misma vía. Este efecto no solo puede ocurrir entre dos reacciones vecinas a lo largo de la vía sino que en reacciones endergónicas y exergónicas que se encuentran bastante separadas entre si. En la Figura 28 - 8 aparecen los perfiles de energía obtenidos en base a las /\Go' y las /\G de la Tabla 7 - 8. Es interesante notar que al graficar los valores de /\Go' (Fig. 28 - 8) obtenidos en base a las Keq de cada reacción, se observa claramente las etapas señaladas anteriormente, empezando con el gasto de ATP para llevar a cabo las reacciones iniciales de tipo endergónico y remontar la barrera de energía que impone el destabilizar y romper la glucosa. En el gráfico se observa que la oxidación y la extracción de energía es claramente exergónica a excepción de los reordenamientos moleculares. Ambos perfiles, solo coinciden en que terminan a un nivel menor de energía que de donde empezaron.

380

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

CH2 OH H

HO

PP

A T

O

H

H OH

H

P

CH2 O

ADP

H

O

OH

H e x o q u in a s a

G lu c o s a

O

O 2HC

H

P

CH2 OH OH

H

H

A T

P

O

O 2HC

ADP

CH2 O

H

OH

P

OH

H

OH

OH

HO H

P

H

H OH

OH

.

H

OH

G lu c o s a - 6 - P Is o m e r a s a

OH

H

F ru c to s a - 6 - P

G lu c o s a - 6 - P

OH

F os fo fru c toQ u in a s a

H

F ru c to s a 1 ,6 - B i - P

A ld o la s a

P - D i h i d r o x i c e to n a

O

+

CH2 - O

P

C

C eton a

CH - OH

X2

N AD

O

CH - OH CH2 -

P i

+

P

O

CH2 -

HC

P - D H C - Is o m e r a s a

3 - P G lic e r a ld e h id o

O

HC

CH2 - OH

P

O -

3 - P - G lic e ra ld e h id o

N AD H

+ H

O

D e s h id ro g e n a s a

C - O

P

1 ,3 - B i - P

CH - OH

N AD

N AD H

O C HO

- O

H

C

CH3

+

H

C - O

C

O

C

O

O

CH3

P ir u v a t o

P

A T

ADP

H 2O O

D e s h id ro g e n a s a

L ac ta to

P

O

C

L á c ti c o

AT

ADP

P ir u v a t o Q u in a s a

CH2

E n o la s a

P - E n o l - P ir u v a t o

C

O

C

-O -

C

P

CH2 - OH

P

2 - P - G lic e r a t o

M u ta s a

1 ,3 - B i - P

O

G l i c e r a to

C H

O H

CH2

O

Q u in a s a

P

3 - P - G lic e r a t o

Fig. 28 - 8. La Glicólisis mostrando las fases de producción de ATP y formación de ác. Láctico.

381

G lic é r ic o O

O

O

P

CH2

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

TABLA 7 - 8

Reacciones Glucoquinasa Hexoquinasa A) GLUCOSA + ATP----> GLUCOSA-6-P + ADP + H Glucosa-6-P Isomerasa B) GLUCOSA-6-P----> FRUCTOSA-6-P FosfofructoQuinasa C) FRUCTOSA-6-P + ATP-->FRUCTOSA-1.6-DIFOSFATO + ADP + H Aldolasa D) FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO----> 3P-GLICERALDEHIDO + P- DIHIDROXICETONA P-Dihidroxicetona Isomerasa E) P-DIHIDROXICETONA---->3-P-GLICERALDEHIDO 3-P- Gliceraldehído Deshidrogenasa F) 3-P-GLICERALDEHIDO + P + NAD --> 1,3-BIFOSFOGLICERATO + NADH + H 1,3 Difosfoglicerato Quinasa G) 1,3-BIFOSFOGLICERATO + ADP--> 3-FOSFOLICERATO + ATP 3-Fosfoglicerato-Mutasa H) 3-FOSFOGLICERATO---->2-FOSFOGLICERATO 2-Fosfoglicerato-Enolasa I) 2-FOSFOGLICERATO---->FOSFOENOLPIRUVATO + H20 Fosfoenolpiruvato-Kinasa J) FOSFOENOLPIRUVATO + ADP + H----> PIRUVATO + ATP

ΔGo'

ΔG

-4.0

-8.0

+ 0.4

- 0.6

-3.4

-5.3

+5.7

- 0.3

+1.8

+ 0.6

+ 1.5

- 0.4

- 4.5

+ 0.3

+ 1.1

+ 0.2

+ 0.4

- 0.8

- 7.5

- 4.0

En el perfil en base a las Keq o ΔGº´, la parte intermedia presenta drásticos cambios de energía que ocurren de la reacción C hasta la G, sin embargo estos cambios se hacen menos evidentes en el perfil obtenido en base a las concentraciones reales en estado estable. Este cambio se debe al juego de concentraciones que ocurre en cada reacción individual donde la acumulación de sustrato o producto en algunas reacciones sirve para amortiguar lo exergónico de otras reacciones y a la vez para empujar reacciones demasiado endergónicas. Es decir, las concentraciones reales de los sustratos y productos se amortiguan unos a tros al proceder las reacciones en conjunto comparado con el perfil que muestra solo las reacciones individuales o tendencias individuales (ΔGº´o Keq) de cada reacción, sin estar acopladas unas con otras. En el perfil en base a las Keq o ΔGº´, se liberan en total - 8,5 Kcal/mol mientras que en el perfil obtenido en base a las concentraciones reales de sustrato y producto en cada reacción, se liberan - 18, 3 Kcal/mol. Esto indica que las concentraciones en estado estable favorecen la formación del compuesto final, que es el Piruvato.

382

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Perfil de Energía de la Glicólisis 15 ENERGIA .Kcal/mol10 5 0

Cambios de Energía ΔGº´, en base a la Keq de cada reacción

-5 -10 -15

Cambios de Energía ΔG, en base a las reacciones acopladas en Estado Estable

-20 -25 -30 -35

A

B

C

D

E

F

G

Las reacciones se encuentran en la Tabla 5.

H

I

J

Reacciones

Fig. 29 - 8. La curva superior muestra la distribución de la energía en base a la Keq y la curva inferior muestra la energía al alcanzar el equilibrio estado estable.

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20) VIA DE LAS PENTOSAS O VIA DEL FOSFOGLUCONATO. Esta vía se descubrió en el hígado, al no tener efecto la inhibición de la Glicólisis con fluoruro y iodoacetato sobre el empleo de la glucosa por la célula (El Fluoruro inhibe a la enzima de la Glicólisis conocida como Enolasa y el Iodoacetato inhibe a la enzima Gliceraldehido-3Fosfo-Deshidrogenasa de la misma vía). La Vía de las Pentosas es casi inexistente en el músculo esquelético. La vía de las Pentosas oxida a la Glucosa de seis carbones y la transforma en un azúcar de cinco, produciendo dos moléculas de NADPH + H. Esta última es una Coenzima requerida durante la síntesis de los Ácidos Grasos y Esteroides. Se la emplea aquí, como agente reductor de los grupos cetos, durante la síntesis de lípidos en el hígado, tejido adiposo, glándula mamaria y corteza adrenal. Las reacciones metabólicas prefieren en estos casos NADPH sobre NAD como agente reductor. Otra de las fuentes de NADPH es la Enzima Málica, ubicada en el citoplasma. Esta cataliza el paso de Malato a Piruvato con perdida de CO2 y pertenece al sistema (lanzadera) que saca Acetil-SCoA desde la mitocondria (Ver capítulo de Lípidos) al citoplasma.

383

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

La primera reacción se caracteriza por la oxidación de la Glucosa, mediante la enzima Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa que forma como producto 6-Fosfoglucono-δ-Lactona y la primera molécula de NADPH (Fig. 30 - 8).

O

O CH O P O 2 O O H H OH OH H +

Glucosa - 6 - Fosfo Deshidrogenasa + NADP

NADPH +

H

+ +

OH

H OH H β - D - Glucosa - 6 - Fosfato OH

H

OH H

H OH

H OH

6 - Fosfoglucono -δ Lactona

O CH O P O 2 O O H H OH + OH H

CH O P O 2 O O H H OH OH H

COOH 6-P GluconoLactonasa

H

C

HO C H O 2

OH H

H

C OH

H

C OH

O

C H O P O 2 O Acido 6 - Fosfoglucónico

6 - Fosfoglucono -δ-Lactona

Fig. 30 - 8. Formación del primer NADPH y el ácido Glucónico.

La reacción es inhibida por los Ácidos Grasos y el NADPH mismo. A continuación la Lactona es hidrolizada por la 6-Fosfo-Glucono-Lactonasa, aunque la reacción puede ocurrir también sin enzima, formando el ácido 6-Fosfoglucónico. Desde aquí en adelante la enzima 6-Fosfoglucónico Deshidrogenasa cataliza la descarboxilación del ácido 6 Fosfoglucónico con NADP para formar la D-Ribulosa-5-Fosfato, CO2 y la segunda molécula de NADPH (Fig. 31 - 8). Esta primera fase se considera irreversible por ser muy exergónica. A continuación la enzima Fosforiboisomerasa, cataliza el paso reversible desde D-Ribulosa-5-Fosfato a D-Ribosa-5Fosfato. En total se producen 2 NADPH más un CO2 y la Ribosa-5-Fosfato (Fig.31 – 8) La Pentosa formada por oxidación, puede ser dedicada a la síntesis de Nucleótidos o bien integrarse nuevamente al metabolismo de los Hidratos de Carbono. Esto último se logra mediante una serie de reacciones cíclicas que ocurren en el citoplasma de los tejidos que necesitan NADPH, produciendo un total de 12 NADPH y 6 CO2 por molécula de Glucosa que entra a este sistema (Fig. 32 - 8).

384

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

COOH H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

.

CH

Acido 6 - Fosfogluconico Deshidrogenasa

O P

C H 2

NADP

NADPH

+

H

+

+

C O2 +

O

C OH

H H

OH

O

C

OH

OH

H

C

OH

O P

O

O

D - Ribulosa - 5 - Fosfato

Fosforiboisomerasa

O

OH

O P

C H 2

C

O

C

C

H

C H O 2

H 2

O

O

Acido 6 - Fosfoglucónico

CH

C

Mn +

OH

2

C

O

H

C

OH

H

C

OH

H O

C OH C H O 2

O

D - Ribulosa - 5 - Fosfato

H I H - C –OH Fosfocetopentosa C= O Epimerasa HO- C- H O P

H- C -O-H O

C H2 - O H

O

D - Ribosa - 5 - Fosfato

XILULOSA

Fig. 31 - 8. Formación de un segundo NADPH, CO2 y la Ribosa - 5- Fosfato.

H

O CH H

H OH

2

O O H

OH H

P O O OH + + 2 NADP + H

HO 2

2 NADPH

OH

+

2 H+ +

C

O

H

C

OH

H

C OH

H

C OH C H 2

β -D - Glucosa - 6 - Fosfato

+ O O

P O

CO

2

O

D - Ribosa - 5 - Fosfato

Fig. 32 - 8. Balance final de la Vía de las Pentosas.

La primera reacción por la que se integra a la vía Glicolítica la Ribulosa-5-Fosfato es catalizada por una Fosfocetopentosa epimerasa (Fig. 31 - 8). En esta reacción la Ribulosa5-Fosfato pasa a Xilulosa-5-Fosfato por medio de un intermediario-2,3-enediol . A continuación la enzima Transcetolasa (Fig. 31 – 8), en presencia de la coenzima TPP y Mg, transfiere el Cetol de la Xilulosa-5-Fosfato al aldehído aceptor de la Ribosa-5-Fosfato para formar D-Sedoheptulosa-7-Fosfato y D-Gliceraldehido-3-Fosfato.

385

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

C H OH 2 C

C H OH 2 C

TRANCETOLASA

HO C H

CH O 2

Mitad Dihidroxiacetona

O

H

HO C H

O

H C OH

.

TRANSALDOLASA

H C OH

O

O

Mg

D - Xilulosa - 5 - Fosfato

O

H C OH TPP

CH O 2

P

CH

P

2

O

O

O

O

D - Sedoheptulosa - 7 - Fosfato

D - Eritrosa - 4 - Fosfato

H C

H C OH H C OH

CH O 2

O

CH OH 2

O

H C OH

H C OH

O

H C

O

H C OH

H C OH

O P

C

O P

O

C O

HO

H C OH

O

CH O 2

P

C H

H C OH O

O

O

D - Ribosa - 5 - Fosfato

O

H C OH

O

CH O 2

P

O

O

D - Gliceraldehido - 3 - Fosfato

D - Fructosa - 6 - Fosfato

Fig. 33 - 8. Acción de la Transcetolasa y Transaldolasa en la transferencia de un grupo cetol desde la Xilulosa-5-P a la Ribosa -5-P y desde la Sedoheptulosa-7-P al Gliceraldehido-3-P.

La siguiente reacción (Fig.33 - 8), es catalizada por la enzima Transaldolasa que transfiere la mitad Dihidroxiacetona desde la Sedoheptulosa-7-Fosfato al Gliceraldehído-3-Fosfato para formar Fructosa-6-fosfato y Eritrosa-4 Fosfato. Finalmente la Transcetolasa (Fig. 34 - 8), actúa transfiriendo el cetol desde la Xilulosa-5Fosfato a la Eritrosa-4-Fosfato de la reacción anterior o la que provenía de la Sedoheptulosa7-Fosfato. Con esta reacción se forma Fructosa-6-Fosfato y Gliceraldehído-3-fosfato, los cuales se pueden integrar a la Glicólisis y ser oxidados después de CO2 y H2O.

386

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

H

H

C

O

C

O H

H

TRANSCETO LASA

H

C

O H

H

C H

O

P

C

T P P

O

H

M g

O

H

O

C

HO

C H

2

O H H O

H O H

C H

O 2

P

O

O

O P

O

C

O H

2

C

O

C

O

C H

C H C

O H O

D - G lic e r a ld e h id o - 3 F o s fa to

D - E r it r o s a - 4 F o s fa to C H

O

O H

H

C

O H

H

C

O H

C H O 2

O

O P

O

O

D - X ilu lo s a - 5 - F o s f a t o

D - F ru c to s a - 6 - F o s fa to

Fig. 34 - 8. Acción de transferencia del Cetol desde la Xilulosa-5-P a la Eritrosa-4-P.

En general se puede decir que la Vía de las Pentosas: a) Es una Vía Citosólica que se deriva de la Glicólisis y ocurre principalmente en Hígado, Glándulas Suprarrenales, Tejido Adiposo, Glándula Mamaria y aquellos tejidos donde se lleva a cabo la proliferación celular. b) Es la vía primaria para la producción de NADPH + H que se emplea en la síntesis de Colesterol y sus derivados como son las Hormonas Esteroidales y las Sales Biliares. c) Otro de sus productos es la Ribulosa-5-P que se emplea en la síntesis de Nucleótidos que se dirigen a la síntesis de Ácidos Nucleicos d) Los intermediarios de esta vía se pueden restituir y ciclar a la Glicólisis por conversión de Fructosa-6-P y Gliceraldehído-3-P. En la Tabla 8-8, se puede apreciar el resumen de la Vía de las Pentosas.

Tabla 8 - 8

387

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

RESUMEN DE LA VIA DE LAS PENTOSAS Para volver a la Glicólisis 3 Pentosas (3XC5) (2XC6) y un Gliceraldehido-3-P (C3.).

se convierten en 2 Fructosas-6-P

3 X C6

ETAPA IRREVERSIBLE

ETAPA REDOX

PRODUCCIÓN DE PENTOSA-P Y NADPH

6 X NADP 3CO2

6 x NADPH + H

3 x C5 ETAPA DE INTERCONVERSIÓN REVERSIBLE

INTERCONVERSIÓN DE AZÚCARES

EL EXCESO DE PENTOSA-P VUELVE AL METABOLISMO CENTRAL

2XC6 final

C3 final

TRANSCETOLASA

TRANSALDOLASA

C6 final

RESUMEN Transferencia de carbones para reintegrar a la Glicólisis 2 Fructosas-6P (C6 final) y un Gliceraldehido -3-P (C3 final)

C5

C5

C5

C3

C6 final

C4

TRANSCETOLASA

C4

C7

C3 final

Volver al inicio

21)

VISION GENERAL DE LA VIA DE LAS PENTOSAS

388

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

En el paso X de la Figura 35 - 8 se encuentran las enzimas Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa, Lactonasa y Ácido-6-Fosfoglucónico Deshidrogenasa, mientras que en el paso Y se encuentran las enzimas Fosforiboisomerasa, Fosfocetopentosa Isomeras, Transcetolasa, Transaldolasa y nuevamente la Transcetolasa. Por medio del aporte de Fructosa-6-Fosfato y Gliceraldehído-3-Fosfato a las enzimas de la Glicólisis se produce un total de 12 NADPH, 6 CO2 y un Fosfato, sin permitir que la Pentosa fosfato se acumule en los tejidos que emplean NADPH + H. FORAMA 6H O 2

CICLICA

DE

LA

VIA DE LAS PENTOSAS

Glucosa - 6 - Fosfato 12 NADP

X

6 Ribulosa - 5 - Fosfato

5 Glucosa - 6 - Fosfato

y

6CO 2 + 12 NADPH + 12 H

+

ISOMERASA 4 Fructosa - 6 - Fosfato 5 Fructosa - 6 - Fosfato Gliceraldehido - 3 Fosfato

ISOMERASA Fructosa - 6 -Fosfato Dihidroxicetona Fosfato

Gliceraldehido - 3 - Fosfato

ALDOLASA

Pi

FRUCTOSA - 1,6 - BIFOSFATASA

Fructosa - 1, 6 -Bifosfato H O 2

Fig. 35 – 8. Visión cíclica de la Vía de las Pentosas

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22) LA VIA DE LA PENTOSA FOSFATO Y LA GLICOLÍSIS EN ERITROCITOS.

389

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Los Eritrocitos emplean la Glicólisis anaeróbica cuyo ATP sirve para activar las bombas que mantienen la Osmolaridad. Por otro lado, la Vía de las Pentosas produce NADPH + H que ayuda a mantener al Fe +3 de la Metahemoglobina como Fe +2, ya que algunas veces el Oxígeno abandona el grupo Heme llevándose un electrón y produciendo O2 -1 (Superóxido). Además, uno de los productos de la Glicólisis es el 2, 3-Bifosfoglicerato que es un modulador de la actividad de la Hemoglobina (fig. 36 -8).

G lucosa

G liceraldehído-3-P P

G liceraldehído-3-PD eshidrogenasa

N AD N AD H + H

1,3 –Bi-P-G licerato AD P + P AT P

Bi-P-G licerato mutasa

1,3 D i-PG licerato Q uinasa

2,3-Bi-P-G licerato

3-P- G licerato

P

2,3-Bi-P-G licerato F osfatasa

P iruvato Fig. 36 - 8. El 2,3-Bi-P-Glicerato proveniente de un tejido con actividad metabólica anaeróbica modula a la Hemoglobina, haciéndola más rígida para que libere Oxígeno.

En el eritrocito el NADPH + H de la Vía de las Pentosas se emplea para mantener reducido al Glutatión ( γ-Glutamil-Cisteinil-Glicina) en la forma G-SH. Este tripéptido se encuentra en su forma oxidada como G - S - S - G y es capaz de proteger a las membranas de la acción de los Peróxidos (H2O2), Superóxidos (O2 -1 ) y el radical OH . , que producen la Hemólisis. El H2O2, también produce Metahemoglobina que no es capaz de transportar O2. Por lo tanto, aquellas personas que sufren deficiencias en la producción de NADPH, sufren de una falta de estabilidad de sus Eritrocito. La importancia de este sistema se puede resaltar con una enfermedad de origen mediterraneo denominada Favismo. Esta proviene de la isla denominada Cerdeña y ocurre aquí, que se desencadena en la primavera por la ingestión de Habas o la aspiración del polen de dicha planta. Ocurre aquí que los subproductos de la digestión de las Habas, generan en el intestino sustancias extremadamente oxidantes o bien la aspiración de su polen, genera una reacción alérgica de tal magnitud que disminuye la vida media de los Eritrocitos por estrés oxidativo. Si la persona, no cuenta con los niveles de G-SH o NADH + H adecuados por falta o deficiencia de la Glucosa-6-P Deshidrogenasa, ubicada al inicio de la Vía de las Pentosas, se produce una marcada Anemia Hemolítica. Esta es una clara demostración de la conexión entre enfermedad, estrés oxidativo y la enzima Glucosa-6- P Deshidrogenasa.

390

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Esta última tiene su gen en el telómero del cromosoma X. Las hembras heterocigóticas son normales, mientras que en los varones la deficiencia se expresa completamente. Volver al inicio 23) REVERSIBILIDAD DE LA GLICOLISIS. La Glucólisis es también reversible y se denomina en este caso Gluconeogénesis (Fig. 37 – 8). Esta vía inversa ocurre principalmente en hígado y riñón. Los precursores de la Glucosa serán ahora aminoácidos, piruvato y glicerol. En esta vía se hace uso de algunos pasos en común con la Glicólisis, excepto en las etapas donde se encuentran las enzimas marcapasos o aquellas que imponen una elevada barrera de energía al proceso inverso. Aquí se comparten solo las enzimas que pueden catalizar en ambos sentidos, según la acumulación de sustratos y productos, además las reacciones de carácter reversible no son muy exergónicas o endergónicas (+ o – 3Kcal/mol). En estos casos las enzimas marcapasos como la Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y la Piruvato Quinasa se inhibirán controladamente, activándose otras enzimas que catalizarán la vía inversa y que hacen uso de ATP o GTP, para sortear las barreras de energía o bien emplearán la energía restante,

GLUCONEOGENESIS

GLUCOSA- 6 - Pasa

AAS

GLUCOSA - 6 -P + ADP FRUCTOSA - 1,6 -

: :

CTC

GLUCOSA + ATP

FRUCTOSA -6 - P + ATP

CICLIO TRICARBOXILICO AMINOACIDOS

FRUCTOSA -1,6 - DI -P + ADP

BIFOSFATASA

3 - P -GLICERALDEHIDO + P - DI - HIDROXICETONA 2x (

3 - P -GLICERALDEHIDO )

2 x ( 1, 3 - DI - P - GLICERICO+ ADP) 2 x ( 3 - P - GLICERICO

+ ATP )

PIRUVATO

2 x ( 2 - P - GLICERICO ) 2 x ( C O + GDP) 2

P - ENOL

2 x (P - ENOL IRUVATO+ GDP) 2 x ( PIRUVATO + ATP )

PIRUVATO CARBOXI QUINASA

ACETIL - S - CoA PIRUVATO CARBOXILASA PIRUVATO

+ ATP + C O2

2 x ( OXALOACETATO)

OXALOACETATO CITRATO

+

ADP

ISOCITRATO

MALATO

FUMARICO

2 x ( GTP )

CTC ALFA - CETO

SUCCINICO

2 x ( MALATO )

AAS

AAS

GLUCONEOGÉNICOS

GLUTARATO

SUCCINIL - S - Co A

GLUCONEOGENICOS

Fig. 37 - 8. Reposición de la Glucosa en ayunas por medio de la Gluconeogénesis. 391

AAS GLUCONEOGENICOS

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

que se encuentra aún presente en los intermediarios de la Glicólisis que antes eran productos y ahora serán sustratos. Volver al inicio 24) GLUCONEOGENESIS. La Gluconeogénesis tiene por objeto reponer la Glucosa ante un estado de ayuno, por medio de su síntesis a partir de Piruvato, Lactato, Glicerol y Aminoácidos Gluconeogénicos en el hígado (Fig. 34 - 8). El cerebro necesita diariamente 120 gr de Glucosa, mientras que otros tejidos como los eritrocitos y músculo, requieren de aproximadamente 40 gr diarios dando un total de 160 gr/día. La glucosa que satisface estas necesidades proviene de los fluidos corporales con 20 gr/día y del Glicógeno con alrededor de 190 gr/día, lo que arroja un exceso de 50 gr/día. Por lo tanto, los estados de sobrealimentación y la ayuna tenderán a inducir la Glicogénesis y la Gluconeogénesis respectivamente. Otra causal para la síntesis de glucosa es cuando se recupera la Glucosa gastada durante la actividad intensa y repentina desarrollada por el músculo esquelético (Fig. 35 - 8), Durante la actividad física extrema que ocurre al correr los 100 mts. planos, se requiere de ATP en forma repentina en un medio de baja oxigenación muscular, lo que lleva a formar una gran cantidad de Ác. Láctico. El nivel de NADH/NAD es elevado en el citoplasma en comparación al mismo nivel en la Mitocondria. El Ác. Láctico pasa como tal desde el músculo al sistema circulatorio siendo llevado posteriormente al hígado. La otra forma de transportarlo desde el músculo al hígado es como Alanina, la que se forma al transaminar Piruvato con Ac. Glutámico (Ver metabolismo de los Aminoácidos). Posteriormente en el hígado se transforma nuevamente en Glucosa a partir de Piruvato con la participación energética de la mitocondria, siendo luego incorporado como Glucosa a la circulación y retornando nuevamente al músculo en reposo donde se almacena la Glucosa como Glicógeno (Fig. 38 El músculo y el cerebro no tienen forma de sintetizar Glucosa y dependen del hígado para su recuperación. Otro órgano gluconeogénico es también el riñón, pero este proceso no ocurre

MUSCULO

SANGRE

[ GLICOLISIS ]

[ GLUCONEOGENESIS ]

Glicógeno

Glicógeno

Glucosa

HIGADO

Glucosa

Glucosa Citoplasma

Citoplasma Mitocondria Piruvato Ac. Láctico

Alanina

Ac. Láctico

Piruvato Ac. Láctico

Fig. 38 - 8. Flujo del Piruvato al Hígado como Ác. Láctico o Alanina para generar allí Glucosa y reponerla nuevamente en el músculo. 392

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

allí hasta la inanición. Este tráfico entre músculo e hígado se denomina el Ciclo de Cori (Fig 38 - 8). La degradación anaeróbica de una molécula de glucosa produce 2 ATPs, mientras que su síntesis por el Hígado emplea 6 ATPs más NADH + H+. El Oxígeno empleado por la mitocondria para eliminar al Ac. Láctico se denomina el Débito o la Deuda de Oxígeno. El hígado para sintetizar glucosa a partir de piruvato debe invertir tres reacciones exergónicas e irreversibles dirigidas hacia la GLICOLISIS, las que se examinarán a continuación. Volver al inicio 25) LAS 3 REACCIONES MAS EXERGONICAS DE LA GLICOLISIS NO SON COMPARTIDAS CON LA GLUCONEOGENESIS. 1) La reacción de Glucosa a Glucosa-6-P catalizada por la enzima Hexoquinasa de Km 10 mM ocurre en el músculo y es irreversible ya que no existe en este tejido la Glucosa-6Fosfatasa. En el hígado se encuentra la enzima Glucoquinasa con Km 0,1 mM, cuyo producto la Glucosa-6-P se puede hidrolizar para invertir la reacción con la enzima Glucosa-6-Fosfatasa presente en el retículo endoplásmico del hepatocito: Glucoquinasa Hexoquinasa GLUCOSA + ATP -----> GLUCOSA-6-P + ADP Glucosa-6-Pasa GLUCOSA-6-P + H2O --------> GLUCOSA + Pi

-2.9Kcal/mol

La Glucosa-6-Pasa no esta presente en músculo y cerebro que solo reciben glucosa, pero no son capaces de sintetizarla de novo. 2) La siguiente etapa irreversible es la reacción catalizada por la Fosfofructoquinasa que se invierte con la enzima Fructosa-1,6- Bifosfatasa, esta última es activada por ATP y Citrato e inhibida por AMP y ADP. Solo una de las vías es a la vez activa, sin embargo se ha visto que algunos insectos son capaces de producir ciclos inútiles o fútiles en esta etapa de la Glicólisis, con el fin de generar energía calórica por hidrólisis neta de ATP para elevar de esta manera su temperatura interna y emprender vuelo en los días fríos. Estos ciclos también se denominan ciclos de sustrato y pueden ser empleados como medios de regulación o amortiguadores de la formación de producto en una de ambas direcciones Glicólisis o Gluconeogénesis. FosfoFructo Quinasa FRUCTOSA-6-P + ATP------>FRUCTOSA-1,6-DI-P + ADP

-3.4 Kcal/mol

Fructosa-1,6-DI-Pasa FRUCTOSA-1,6-DI-P + H2O --------> FRUCTOSA-6-P + Pi

- 3.9 Kcal/mol

393

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

3) La etapa más exergónica, es de Fosfoenol Piruvato a Piruvato catalizada por la Piruvato

GLUCONEOGENESIS

GLICOLISIS O

Memb. Ext.

O

Matriz Mitocondrial

Memb. Int.

C O P O

ADP

O

HO C

O

ATP

CH 2

C O

FOSFO ENOLPIRUVATO CO 2 GDP FOSFO ENOL PIRUVATO CARBOXI QUINASA

C O CH 3

PIRUVATO C O+ ATP O C

2

O

C O

ADP + P i

CH 3

O

PIRUVATO O C O C O C H

C O

MALATO DHasa NADH + H

C O

NAD

O

AC. OXALOACETICO

(AOA)

C O

PIRUVATO CARBOXILASA

GTP

CTC

(AOA)

C H C O

O

O

C O

C

C OH

C OH

CH 2

CH 2

C

C O

O

O

O O

NADH + H

MALATO DHasa NAD

O

AC. MALICO

CITOPLASMA

AC. MALICO

MITOCONDRIA

CTC

Fig. 39 - 8. La reacción de Piruvato a Fosfoenol-Piruvato se invierte mediante 4 reacciones y con el gasto de 4 ATPs.

Quinasa (fig. 39 – 8), presenta una gran barrera de energía y se puede invertir por los siguientes cuatro pasos. Piruvato Quinasa 1) 2 P-ENOL-PIRUVATO + 2ADP-------> 2PIRUVATO + 2ATP

ΔGº´= -7.5 Kcal/mol

La Piruvato Quinasa es estimulada alostéricamente por la Fructosa-1,6-Bifosfato e inhibida por ATP.

Piruvato Carboxilasa

394

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

Biotina 2) 2 PIRUVATO + 2CO2 + 2ATP --->2 OXALOACETATO + 2 ADP + 2 Pi ΔGº´= - 1,0 Kcal/mol La Piruvato Carboxilasa requiere de la vitamina Biotina para la carboxilación y es estimulada indirectamente por el exceso de Acetil CoA mitocondrial e inhibida por ADP. Luego, el Oxaloacetato es reducido en el interior de la mitocondria para formar Malato. Ambos Oxaloacetato y Malato se mezclan con las mismas moléculas provenientes del CTC formando un mismo “pool”. Cómo la reacción procede en forma exergónica hacia Malato cuando el CTC se encuentra a baja velocidad, se acumula malato que sale de la mitocondria, se oxida en el citoplasma y con la enzima Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa y GTP logra formar Fosfoenol Piruvato, que se dirige hacia la síntesis de Glucosa. Malato Deshidrogenasa Mitocondrial 2 OXALOACETATO + 2 NADH + 2 H2 MALATO + 2 NAD ΔGº´= – 7,1 Kcal/mol

Malato Deshidrogenasa Citoplasmática 3) 2 MALATO + 2 NAD------->2 OXALACETATO + 2 NADH + 2 H

ΔGº´= + 7,1 Kcal/mol

Las reacciones de Oxaloacetato a Malato dentro de la mitocondria y de Malato a Oxaloacetato, fuera de la mitocondria en el citoplasma, ocurren impulsadas por los distintos niveles de NAD y NADH +H que hay en cada uno de estos lugares. Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa 4) 2 OXALACETATO + 2 GTP---->2 FOSFOENOLPIRUVATO + 2CO2 + 2GDP ΔGº´= +1,3 Kcal/mol ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 GTP --->2 FOSFOENOLPIRUVATO + 2 ADP + 2 GDP +2Pi 2 x(+ 0,3 Kcal/mol) Por lo tanto, la Gluconeogénesis en la dirección inversa y compartiendo algunas pasos con la Glicólisis a partir de Piruvato gasta el equivalente a 6 ATPs más dos moléculas de NADH +H 2 PIRUVATO + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 2H + 4 H2O ----> GLUCOSA + 4 ADP + 2 GDP + 2 NAD + 6 Pi /\Go' total = - 9 Kcal/mol La ecuación general es aún exergónica, debido al gasto de ATP y GTP los cuales invierten los pasos mas exergónicos de la Glicólisis, sin embargo sin este aporte de energía sería imposible sintetizar nuevamente la molécula de Glucosa y restaurar a la vez la energía perdida. Por lo tanto la Gluconeogénesis es endergónica.

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395

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

26) PRINCPALES DIFERENCIAS ENTRE LA GLICOLISIS Y LA GLUCONEOGENESIS. 1) La Glicólisis se lleva a cabo con reacciones que ocurren íntegramente en el citoplasma, mientras que la Gluconeogénesis a pesar de compartir algunas de ellas en el citoplasma, necesita del concurso de la mitocondria para su desarrollo. 2) La Glicólisis produce solo 2 ATPs netos por fosforilación a nivel de sustrato, mientras que la Gluconeogénesis necesita de 6 ATPs. La Glicólisis es exergónica mientras que la Gluconeogénesis es endergónica. 3) En la Glicólisis se produce una oxido-reducción con el empleo de la coenzima NAD. En la Gluconeogénesis se emplea NADH + H+ como reductor, además de la Biotina en la carboxilación del Piruvato y la Tiamina, en la descarboxilación del Oxaloacetato. 4) Las etapas irreversibles de la Glicólisis son las tres reacciones más exergónicas. Dos se invierten debido a que el producto aún tiene suficiente energía para proceder en forma inversa con otras enzimas (la Glucosa-6-P y la Fructosa-1,6-di-P), mientras que la tercera necesita de cuatro etapas para invertirse ya que es muy exergónica, dos de ellas ocurren en la mitocondria catalizadas por las enzimas Piruvato Carboxilasa y Malato Deshidrogenasa, mientras que las otras dos son catalizadas en el citoplasma por la Malato Deshidrogenasa Citoplasmática y la Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa. 5) Las enzimas marcapasos de la Glicólisis son a) Hexoquinasa b) Fosfofructo Quinasa y c) Piruvato Quinasa en cambio en la Gluconeogénesis son la a) Piruvato Carboxilasa , b) Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa, c) Fructosa-1,6-Bifosfatasa y d) Glucosa-6-Fosfatasa. 6) La Glicólisis es estimulada por AMP, ADP, Fructosa 2,6 Bifosfato y la Gluconeogénesis es estimulada por ATP, Citrato y Acetil-S-CoA. 7) Tanto la degradación del Glicógeno como su síntesis se efectúan por el lado no reductor. 8) Principales Enzimas marcapasos de la Glicólisis (Tabla 9 – 8): Tabla 9 – 8 Enzimas Reguladoras Hexoquinasa PFK 1

Activadores Alostéricos ------------AMP,

Inhibidores Glucosa-6-P

ADP, ATP,

Cofactores Alostéricos Mg ++, Mn ++

Citrato Fructosa-2,6-BI-P

Piruvato Fructosa-1,6-BI-P ATP, Alanina ---------Quinasa * Fosforilación por medio del Glucagón con disminución de la actividad

396

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

9) Principales enzimas Marcapasos de la Gluconeogénesis (Tabla 10 – 8) Tabla 10 – 8 Enzimas Reguladoras Glucosa-6-Pasa Fructosa-1,6Bi-Pasa 1 Fructosa-1,6 -bi-Pasa 2 Piruvato Carboxilasa Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa

Activadores Alostéricos ----------ATP,

Inhibidores Alostéricos ----------

Citrato ------------

-----------

------------

Acetil-S-CoA

ADP

-----------

ADP

Cofactores ------- producto Glucosa ----------

Inh. por el Pi, y

---------Biotina ----------

10) En la carboxilación del piruvato se emplea Biotina (Piruvato Carboxilasa) y en la descarboxilación del Ác. Oxaloacético Tiamina pirofosfato (Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa). 11) Hormonas involucradas en la liberación de glucosa desde el hígado y riñón a los tejidos. Glucagón: a) Estimula la liberación de Glucosa mediante la degradación de Glicógeno y la inhibición de la Glicólisis propiciando la Gluconeogénesis. Así se obtiene Glucosa por dos vías, una por síntesis y otra desde el Glicógeno. El Glucagón estimula directamente a la Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa y activa por fosforilación a la FBP2 disminuyendo los nivelas del activador alostérico de la PFK1, Fructosa-2,6-BI-P. 12) Hormona involucrada en la captación y metabolismo de la Glucosa por el músculo y tejido adiposo. Insulina a) Propicia el paso de la Glucosa desde la sangre a los músculos y tejido adiposo, también inhibe la síntesis de la Piruvato Carboxilasa, Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa, Fructosa 1,6 Bifosfatasa y Glucosa-6-Pasa mientras que el Cortisol aumenta su síntesis de novo propiciando la Gluconeogénesis a partir del catabolismo de las proteínas.

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397

Héctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono

.

REFERENCIAS Biochemical Adaptation , P. W. Hochachka & G. N. Somero, Princeton University Press , 1984. Biochemistry, L. Stryer, W.H. Freeman and Co, New York, 1988.

398

402

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

CICLOS TCA Y GLIOXÍLICO 1) CICLO TRICARBOXILICO 405 2) APORTE DE SUBSTRATOS Y SALIDA DE PRECURSORES EN EL CICLO 407 3) DESTINO DE LOS CARBONES EN EL CICLO 410 4) COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA 411 5) DESCRIPCION DEL CICLO 412 6) REACCIONES ANAPLERIOTICAS 415 7) HOMOLOGIA DE LOS PROCESOS OXIDATIVOS 415 8) DESCARBOXILACIONES DEL CICLO TRICARBOXILICO 417 9) REGULACION DEL CICLO TRICARBOXILICO 419 a) Síntesis de Hidratos de Carbono b) Síntesis de Ácidos Grasos

419

420

10) CONSIDERACIONES ENERGETICAS DEL CICLO 422 11) EL CTC EN DISTINTOS ORGANOS

423

12) CICLO GLIOXILICO EN PLANTAS 425 13) METABOLISMO EN LOS RUMIANTES

426

403

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

1) CICLO TRICARBOXILICO.

404

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

El Ciclo Tricarboxílico (CTC) es donde convergen los intermediarios de los Hidratos de Carbono, Ácidos Grasos y Aminoácidos desaminados, para su oxidación total a CO2. Este Ciclo es también conocido por los nombres de Ciclo del Ácido Cítrico y/o Ciclo de Krebs. Este último, fue quién lo descubrió al determinar la función de una serie de reacciones que ocurrían en la matriz mitocondrial y cuyo propósito era la descarboxilación oxidativa del Acetil-SCoA. Esta molécula se encuentra formada por la unión de dos carbones que forman el grupo Acetilo (CH3-CO-) a la Coenzima A que cuenta con el grupo tiol (-SH), formando un tio-éster. La Coenzima A, es conocida como transportadora y activadora de grupos de dos o más carbones que se encuentran representados por los Acetilos y los Acilos, estos últimos como derivados de los ácidos grasos (Ver Capítulo de las Vitaminas y Lípidos). Como aceptor del grupo Acilo, el Ciclo Tricarboxílico emplea a una molécula de cuatro carbones denominada Ác. Oxaloacético. De esta manera se produce una molécula mayor representada por el Ác. Cítrico, que posee seis carbones con tres grupos carboxilos. Esta molécula después de unos arreglos estructurales, es oxidada por la Coenzima NAD, cuya función es atrapar los protones desde los sucesivos intermediarios liberando a la vez CO2 durante el proceso. La molécula de cuatro carbones que se forma después de ambas oxidaciones o descarboxilaciones, es la Succinil-SCoA que libera energía para formar GTP y posteriormente se vuelve a oxidar de Succínico a Fumárico con FAD. Luego, se hidrata y reordena experimentando una oxidación más, con NAD para formar nuevamente el aceptor Oxaloacetato, completando el Ciclo. Las Coenzimas oxidantes NAD y FAD una vez reducidas, dependen del Oxígeno para su regeneración, ya que pasan a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), ubicada en la membrana interna de la Mitocondria, para entregar allí sus protones y volver nuevamente al Ciclo por más (Fig 1 - 9).

n ATP

GDP + P i Sustrato Reducido

n HO

Coenzimas Oxidadas NAD y FAD

Rico en Protones.

C.T.C Sustrato Oxidado

2

C.T.E. Coenzimas Reducidas NADH + H y FADH2

en forma de CO 2

nO

2

nADP + nP i

GTP

Fig 1 - 9. Las Coenzimas NAD y FAD que oxidan los intermediarios del CTC entregan los protones al Oxígeno en la Cadena de Transporte de Electrones.

El camino que recorren los protones aportados por las Coenzimas del Ciclo Tricarboxílico es algo complejo, ya que antes de pasar al aceptor final de elementos reductores, que en este caso es el Oxígeno, son aún capaces de aportar energía para generar ATP mediante un mecanismo de tipo quimiosmótico. Este proceso ocurre a ambos lados de la membrana interna de la mitocondria y se denomina Fosforilación Oxidativa (PO). En este lugar se

405

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

aprovecha la energía aportada por las Coenzimas reducidas que a su vez la obtuvieron de oxidar a los intermediarios del Ciclo Tricarboxílico. Las Coenzimas una vez oxidadas repiten su acción y de esta manera se mantiene un flujo constante hacia y desde la CTE, (Fig. 2 - 9).

G DP + P i CH - CO SCoA 3

2C O

2

11 ATP 3 NAD +FAD

GTP ADP

4 H2O

3 NADH + H + FADH2

G DP

O2

11 ADP + 11 P i ATP

Fig. 2 - 9. Por cada molécula de Acetil-SCoA que entre al CTC se producen 12 ATPs y dos moléculas de CO2.

El CTC es uno de los procesos del metabolismo intermediario donde se produce CO2 por descarboxilación oxidativa y a la vez ocurre una fosforilación a nivel de sustrato que forma GTP. La reacción de balance general incluye tanto el proceso que ocurre en el Ciclo como la oxidación de las coenzimas NAD y FAD en la Cadena de Transporte de Electrones (CTE): CTC CH3-CO-S-CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi------------>GTP+2CO2+CoASH+3NADH+3H+FADH2 CTE 3NADH+3H+11ADP+11Pi+FADH2+2O2--------------->3NAD+FAD+11ATP+4H2O --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CH3-CO-SCoA+GDP+11ADP+12Pi----------------->11ATP+GTP+2CO2+CoASH+4H2O Mientras mayor sea el número de mitocondrias en un tejido mayor será la cantidad de ATP generado, con la excepción del tejido graso pardo. Este tejido tiene unas mitocondrias que no generan un gradiente quimiosmótico para sintetizar ATP, sino que liberan la energía directamente en forma de calor (ver Cadena Transportadora de Electrones, Capítulo 12). El Ciclo Tricarboxílico parece ser el colector principal de sustratos y a su vez el productor mayoritario de coenzimas reducidas. Por ejemplo en el salmón las fibras musculares de

406

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

contracción rápida y anaeróbicas emplean como combustible Glucosa, mientras que las lentas y aeróbicas emplean ácidos grasos y algún Piruvato que proviene de la Glucosa, sin embargo también concurren al metabolismo aeróbico los aminoácidos deaminados. Por ejemplo cuando se emplean marcadamente ambas fibras durante las migraciones de estos peces corriente arriba, se recurre a estás durante las últimas etapas cuando se han quemado los otros combustibles, para reponer a los intermediarios del Ciclo. En los músculos voladores de los himenópteros (mariposas), se emplea como combustible para sus vuelos el Piruvato de la Glucosa y del Glicerol-P. En otros, como es el caso de la langosta se emplea Glucosa para vuelos cortos y para vuelos migratorios se recurre a la βOxidación de los ácidos grasos y su posterior oxidación en el CTC. Entre los cefalópodos (calamares, pulpos) se emplea la Prolina como combustible la que entra como α-Cetoglutárico al CTC. El hombre no es mucho más distinto de los otros especímenes, ya que un maratonista emplea en primer término Glucosa proveniente de los músculos y almacenada como Glicógeno, posteriormente ocupa el Glicógeno hepático el cuál se agota como a los 15 Km dependiendo de su tamaño y peso. Continúa luego, con la oxidación de los ácidos grasos para terminar con la energía aportada por los aminoácidos, que se obtienen mediante la degradación de proteínas tisulares, especialmente del músculo. En el caso de una huelga de hambre el mecanismo de degradación de substratos ocurre de orden similar (Ver Capítulo 10). Volver

al

inicio 2) APORTE DE SUBSTRATOS Y SALIDA DE PRECURSORES EN EL CICLO El aporte de carbonos al Ciclo proviene de los Hidratos de Carbono, los Ácidos Grasos y los Aminoácidos: 1) Los sustratos que provienen de la Glucosa son el Piruvato y el Oxaloacetato. El primero entra a la Mitocondria por medio del Complejo Piruvato Deshidrogenasa y formará después de una descarboxilación Acetil-SCoA, mientras que el Oxaloacetato también se formará a partir de Piruvato en el interior de la Mitocondria por medio de una reacción anapleriótica en que ocurre una carboxilación con gasto de ATP y catalizada por la enzima Piruvato Carboxilasa . El ácido Málico es uno de los intermediarios del Ciclo y bajo ciertas condiciones de regulación, puede salir de este y de la Mitocondria para formar en el citoplasma FosfoenolPiruvato, este último se dirige a la síntesis de la Glucosa. 2) El Acetil-SCoA es también producto de la β-Oxidación que sufren los Ácidos Grasos en el interior de la Mitocondria, ya que pueden ser oxidados en sucesivas unidades de dos carbones. Los ácidos grasos impares al oxidarse de dos en dos desde el carboxilo a la cola alquílica, pueden entrar al CTC no solo como Acetil-SCoA al Ciclo sino que también como el compuesto de tres carbones denominado Propionil-SCoA. Este último pasa de 3 a 4 carbones mediante una carboxilación y reordenamiento para formar el intermediario del CTC conocido como Succinil-SCoA, (Figs. 3 - 9 y 4 - 9).

407

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Enzi ma Act i vador a CoASH + ATP CH 3 CH2 COOH

P + ADP

Pr opi oni l –S Co A CARBOXI LASA

ATP P + + CO ADP 2 CH COOH 3 CH 2 CH CH 3 C SCoA C SCoA

RUMI ANTES O Ac. Pr opi òni co

Pr opi oni l –SCoA

Met i l –Mal oni l –Mut asa

COOH

B12

CH 2 CH 2 C SCoA

H C CH3 C SCoA

O

O

D–Met i l –Mal oni l –SCoA

COOH

O Succi ni l –SCoA

L–Met i l –Mal oni l –SCoA Fig. 3 - 9. El ác. Propiónico en rumiantes y la Propionil-SCoA de los ácidos grasos impares pueden entrar al Ciclo como Succinil-SCoA.

Bajo ciertas condiciones de regulación en el Ciclo, el Ácido Cítrico puede abandonar la Mitocondria descomponiéndose nuevamente en Acetil-SCoA y ác. Oxaloacético con gasto de un ATP. El Acetil-SCoA es transportado desde el interior de la Mitocondria al citoplasma y pasará a ser el precursor de los ácidos grasos al entrar al complejo enzimático de la Ácido Graso Sintasa. En los rumiantes el principal precursor de la Gluconeogénesis es el ác. Propiónico. Este ácido es el producto principal del metabolismo fermentativo en su estómago segmentado y también entra al CTC después de una carboxilación y reordenamiento al igual que los ácidos grasos impares, en la forma de Succinil-SCoA (Fig. 3 - 9). 3) La entrada de los aminoácidos al CTC, ocurre a través de sus esqueletos hidrocarbonados. Esto ocurre una vez que han perdido el amonio y son capaces de formar algunos de los intermediarios del Ciclo como: α-Cetoglutarato, Succinil-SCoA, Fumarato y ác. Oxaloacético (Fig. 4 - 9). En general, dentro de este grupo están todos los intermediarios que pueden formar Malato. Esta última molécula es a su vez precursora de la Glucosa y los aminoácidos que formen parte de ella son conocidos como Glucogénicos, en cambio los esqueletos hidrocarbonados de los aminoácidos Cetogénicos, serán aquellos que formen solamente Acetil-SCoA. Como esta molécula se adiciona al Oxaloacetato para formar Citrato. Este último bajo ciertas condiciones pasará al citoplasma y se descompondrá nuevamente como Acetil-SCoA y Oxaloacetato, logrando transportar al exterior Acetil-SCoA que actuará como precursor de la síntesis de los ácidos grasos. De esta manera se convierten en grasas hidratos de carbono y algunos aminoácidos. Otros aminoácidos tan solo por deaminación oxidativa y/o transaminación forman inmediatamente intermediarios directos del Ciclo. Estos son los aminoácidos Glutámico y Aspártico que forman los Cetoácidos α-Cetoglutárico y Ác. Oxaloacético respectivamente.

408

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Aminoácidos HIDRATOS DE CARBONO

OXIDACIÓN DE LA GLUCOSA

PRODUCTO DE LA OXIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS

Acetil - SCoA

SINTESIS DE ACIDOS GRASOS

Citrato

Aminoácidos Cis - Aconítico

Ac. Oxaloacético

Isocitrato

Málico

C O2

Aminoácidos

Cetoglutarato

Fumárico

C O2

Aminoácidos

Succinil - SCoA

Succínico

Aminoácidos ACIDOS GRASOS DE CADENA IMPAR

Fig. 4 - 9. Aporte y remoción de los intermediarios del Ciclo.

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al

inicio

3) DESTINO DE LOS CARBONES EN EL CTC. Durante el CTC. un compuesto de dos carbones se combina con un aceptor de cuatro para sintetizar uno de seis carbones (Fig 5 - 9). Este compuesto se reordena pierde por descarboxilación oxidativa un carbono como CO2, dejando a un intermediario de solo 5 carbonos que luego por otra descarboxilación oxidativa pierde otro CO2. Restando

409

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

finalmente solo 4 carbonos que por medio de un reordenamiento, hidratación y posterior oxidación generan nuevamente el aceptor de cuatro carbonos para que al reiniciar el ciclo se acepten nuevamente dos carbonos más nuevamente.

Rol de los Carbones durante el C.T.C. 6C

REORDENAMIENTO

OXIDACION

CO

SINTESIS

6C

2C + 4C

5C

2 OXIDACION

OXIDACION

CO

4C HIDRATACION

4C

2

REORDENAMIENTO

4C

Balance del C.T.C. 2 Piruvato 2 CO

GTP

= ATP

/ ATP

2 Acetil-SCoA 6 NADH

2 GTP

2 FADH 4 CO

30 ATP

NADH

2 NADH

2

6 CO 2

FADH 2

2/

ATP

2 8 NADH

2 FADH

2

Fig 5 - 9. Rol de los carbonos que entran al CTC y balance final de dos moléculas de Piruvato que se oxidan totalmente.

DESTINO DE LOS CARBONOS EN EL CTC. Síntesis Reordenamiento Oxidación 4C + 2 C ----------> 6 C---------------------->6 C-------------->5 C --- CO2 Oxidación Reordenamiento Hidratación ---------------->4 C ------------------------>4C-------------------------------> - CO2 Oxidación ---------------> 4 C. Volver

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inicio 4) COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA, REACCION DE ENTRADA AL CICLO. El Piruvato que proviene de la Glucosa entra a la mitocondria para ser descarboxilado por el complejo de la PIRUVATO DESHIDROGENASA y dar Acetil-SCoA:

410

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

CH3COCOO- + NAD+ + CoASH ----------> CH3CO-SCoA + CO2 + NADH Piruvato Acetil-SCoA En este complejo se encuentran tres enzimas (Fig. 6 - 9), y la primera se denomina PIRUVATO DESCARBOXILASA. Esta emplea la Tiamina Pirofosfato que es la Coenzima proveniente de la vitamina B1 para descarboxilar el Piruvato con salida de CO2, de esta manera el piruvato queda unido como un etil hidroxi a la Coenzima. Este primer paso hace irreversible la cadena de reacciones que se encuentran a continuación. En un segundo paso el etil hidroxi es tomado por el Ác. Lipoico de ocho carbones, que posee en su parte activa un puente disulfuro, formando con el etil hidroxi un tio-ester. El ácido Lipoico actúa como un pasador de pelotas y lleva al Tiol-ester a la segunda enzima o DIHIDROLIPOIL TRANSACETILASA que a su vez lo traspasa a la CoASH, la que lo acepta por el lado de su grupo SH para que finalmente se forme el Acetil-SCoA que sale libre de la reacción.

COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA.

CH C

CoASH

CH

3 O

C

TPP

COOH

3 O

SCoA CH3 C

O HS

S CH CO2

H

C

L

3

S

OH

TPP

FAD NADH

S

+ H +

L

PIRUVATO DESCARBOXILASA

L HS

S

DIHIDROLIPOIL TRANSACETILASA

FADH 2

DIHIDROLIPOIL

NAD

DESHIDROGENASA

Fig. 6 - 9. Descarboxilación del Piruvato en la Mitocondria por el Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa.

El ácido Lipoico queda reducido después de la segunda reacción y se debe oxidar para recuperar su reactividad en la forma de un puente disulfuro. Con este fin se entrega el par de protones de ambos grupos tioles del ácido Lipoico al FAD. Esta reacción es catalizada por la tercera enzima o DIHIDROLIPOIL DESHIDROGENASA, donde el grupo de la Coenzima reducida FADH2 se encuentra unido covalentemente a la enzima y debe deshacerse de los protones pasándolos a su vez al NAD, para así formar NADH + H que sí se encuentra libre y puede entregar finalmente los protones a la C.T.E. reoxidándose.

411

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Las tres reacciones del complejo son reguladas por los niveles de Acetil-SCoA, si su concentración es baja o el ATP se encuentra disminuido, se activa la cadena del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa y si es alto se inhibe (Fig. 7 - 9). El control se ejerce directamente por fosforilación sobre la Piruvato Descarboxilasa por una enzima denominada Piruvato Descarboxilasa Quinasa. Al estar fosforilada se inactiva y al estar defosforilada por otra enzima denominada Fosfoproteína Fosfatasa se activa.

Piruvato Deshidrogenasa

Piruvato Carboxilasa

+

-

Acetil SCoA

OXALOACETATO

Acetil - SCoA NADH ATP

ACETIL - SCoA

β – OXIDACION DE ÁCIDOS GRASOS CETOÁCIDOS

-

Citrato Sintasa NADH

MALATO

CITRATO

Fig. 7 - 9. Regulación de la entrada del Piruvato al CTC.

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inicio 5) DESCRIPCION DEL CICLO. En la primera reacción del CTC, (Fig. 8 - 9), el Acetil-SCoA se combina con ác. Oxaloacético para formar Ac. Cítrico, saliendo CoASH al romperse el enlace tiol-ester. Esta reacción es catalizada por la CITRATO SINTASA, enzima alostérica regulada por los niveles de ATP y citrato. Ambos la inhiben y a la vez puede ser activada por AMP y ADP. Esta reacción es exergónica. En el segundo paso el ác. cítrico se isomeriza por deshidratación hasta cis-aconitato y luego por hidratación se convierte en el isómero denominado ác. isocítrico. Este reordenamiento permite la salida del primer carbono de la molécula. Esta reacción es catalizada por la enzima ACONITASA. El tercer paso ocurre cuando el Ac. Isocítrico es descarboxilado por oxidación a α-ceto glutárico de 5 carbones. La energía que se libera en la oxidación y descarboxilación se emplea para conducir en parte a la reacción y es también atrapada junto a los protones por la coenzima NAD, que al oxidarse posteriormente en la CTE es aprovechada en la fosforilación oxidativa como ATP, mientras que los protones son entregados al Oxígeno. La reacción es catalizada por la ISOCITRATO DESHIDROGENASA, enzima alostérica activada por ADP e inhibida por ATP. Esta última reacción es exergónica.

412

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

H O 2

+

C H

C

3

Ac. Oxaloacético

O S - Co A COO C

NADH + H

O

2 COO

H Málico

-

OOC H

COO C

OH

C

H H

COO

-

- OOC

H O

C OO -

2 C H2 HO C COO

SINTASA

Cis - Aconitato

C H2

CH

C

2 COO -

COO -

CH COO -

H O 2

C OO -

ACONITASA

H HO Succinato y Fumarato son moléculas simétricas y los Cs 1 y 2 son indistinguibles de los Cs 3 y 4

FUMARASA

-

C H

C OO

MALATO DESHIDROGENASA

C Fumárico

Co A - SH

CITRATO

CH

NAD

Citrato

C OO H O

CETOGLUTARATO

CH

2 C OO

DESHIDROGENASA

TIOQUINASA GTP

-

GDP + P i

H Co A - SH

Ac. Succinico

O

-

Isocitrato

NAD

DESHIDROGENASA

DESHIDROGENASA

-

CH COO

ISOCITRATO

SUCCINO

COO C H2

CH 2 C COO

C OO

-

CH2 C H C COO

NADH + H CO 2

Cetoglutarato

Co A - SH NAD

CO 2 C H2 NADH + H C H C S - Co A Succinil - SCoA

Fig. 8 - 9. Panorama del Ciclo Tricarboxílico.

En la cuarta etapa del Ciclo, el ác. α-cetoglutárico es nuevamente descarboxilado en una reacción exergónica por oxidación con NAD y parte de su energía se emplea para activar al compuesto restante de 4 carbones con CoASH. De esta manera se forma el enlace éster tiolsuccinato que dará origen a la Succinil-SCoA. La coenzima reducida NADH sigue el mismo camino del caso anterior. Esta reacción es catalizada por un complejo multienzimático similar a la descarboxilación oxidativa del piruvato que es otro cetoácido. Este complejo se denomina αCETOGLUTARATO DESHIDROGENASA. En una quinta etapa sale la CoASH y la energía de la ruptura del enlace éster se emplea para la fosforilación a nivel de sustrato que forma GTP, lo cual equivale a la formación de un ATP. Esta reacción es catalizada por la SUCCINATO TIOQUINASA. En la sexta etapa el ác Succínico es oxidado con FAD para formar FADH2 que sigue la ruta de las coenzimas reducidas a la CTE. Esta reacción es catalizada por la SUCCINO DESHIDROGENASA, que es la única enzima unida a la membrana interna de la mitocondria. En la penúltima o séptima etapa el ác. Fumárico es hidroxilado por la FUMARASA para producir el ácido L-Málico. En la octava y última etapa, el ác. málico pasa a ác. Oxaloacético por la MALATO DESHIDROGENASA que emplea NAD como coenzima oxidante. Aunque el equilibrio de la reacción esté desplazado hacia la formación de ác. Málico, la reacción ocurre debido a la

413

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

rápida remoción de los productos NADH + H y Oxaloacético, ya que está acoplada a la primera reacción del Ciclo que es decididamente exergónica. La velocidad del Ciclo depende del estado de energía en que se encuentre la mitocondria, así tenemos que un estado de alta energía significa una alta relación de NADH/NAD junto a una alta relación de ATP/AMP. En este caso el ciclo funcionará lentamente, mientras que un estado de baja energía con alto nivel de NAD/NADH o ADP/ATP, el Ciclo funcionaría rápidamente para producir más Coenzima reducida (NADH + H y FADH2) que concurren a oxidarse a la CTE para producir una mayor cantidad de ATP. En la Tabla 1 -7, se observa el tipo de reacción, el nombre de la enzima, el cambio químico ocurrido y la energía de cada una de ellas individualmente. Tabla 1 - 7 ENERGÍA DE LA REACCIÓN Kcal/mol

REACCIÓN

ENZIMA

TIPO DE REACCIÓN QUÍMICA

Acetil-CoA + Oxaloacetato + H2O → Citrato + CoA-SH + H+ Citrato → Cis-Aconitato + H2O Cis-Aconitasa + H2O → Isocitrato

Citrato Sintasa

CONDENSACIÓN

Aconitasa

DESHIDRATACIÓN

Isocitrato + NAD+ → α-Ketoglutarato + CO2 + NADH

Isocitrato Deshidrogenasa

DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA

- 2,0

α-Cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH → Succinil-SCoA + CO2 + NADH

α-Cetoglutarato Deshidrogenasa

DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA

- 8,0

Succinil-SCoA + Pi + GDP → Succinato + GTP + CoA-SH

Succinil-SCoA Sintasa

FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO

- 0,7

Succinato + E-FAD → Fumarato + E-FADH2

Succinato Deshidrogenasa

DESHIDROGENACIÓN

Fumarato + H2O → L-Malato

Fumarasa

HIDRATACIÓN

L-Malato + NAD+ → Oxaloacetato + NADH + H+

Malato Deshidrogenasa

DESHIDROGENACIÓN

Aconitasa

- 7,7

HIDRATACIÓN

6) REACCIONES ANAPLERIOTICAS.

+7,1 - 10,7

Volver inicio

0 -0,9

BALANCE :

414

+ 1,5

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Existen algunas reacciones que están destinadas a reponer algunos de los intermediarios del CTC. El ác. Oxaloacético cumple una función catalítica en este, ya que después de su adición experimental o in vitro se ha observado un elevado consumo de Oxígeno, mayor que el necesario para metabolizarlo. Por lo tanto, los mecanismos para mantener su concentración en estado estable son de fundamental importancia para el metabolismo oxidativo. La primera de estas reacciones que aporta Oxaloacetato, es por la carboxilación del Piruvato con ATP y Biotina en el hígado y riñón por la enzima PIRUVATO CARBOXILASA. Esta es una enzima alostérica y es activada por Acetil-SCoA (Fig. 7 - 9): Biotina CH3-CO-COOH + CO2 + ATP-------->Ac. OXALOACETICO + ADP + Pi Otras reacciones que alimentan de intermediarios al CTC. , son las originadas por la Transaminación de algunos aminoácidos, como lo son el Aspartato y el Glutamato. Estos aminoácidos por acción de una Transaminasa, con una constante de equilibrio cercana a uno, cuyas reacciones son reguladas por aporte de substrato y remoción de productos forman los intermediarios del CTC, Oxaloacetato y α-Cetoglutarato: PALP ASPARTATO + PIRUVATOÅ---------------->OXALACETATO + ALANINA PALP Glutamato + PIRUVATOÅ---------------------> α-CETOGLUTARATO + ALANINA Otro caso de interés ocurre en el músculo cardíaco y esquelético donde la enzima Málica produce Piruvato a partir del Malato que encuentra en el citoplasma. El Malato proviene del Citrato que ha abandonado la Mitocondria cuando el CTC está inhibido por exceso de ATP. Malato + NADP------------------> NADPH + H + CO2 + PIRUVATO Esta enzima produce gran parte del NADPH necesario para el metabolismo biosintético de los Lípidos en el citoplasma a partir del Citrato. Este último al salir al citoplasma se descompone en sus precursores, Acetil-SCoA y Ac. Oxaloacético por la acción de la Citrato Liasa con el gasto de una molécula de ATP. El Acetil-SCoA transportado al citoplasma desde la mitocondria será el precursor de los ácidos grasos. Volver

al

inicio 7) HOMOLOGIA DE LOS PROCESOS OXIDATIVOS. La cadena de reacciones de la PIRUVATO DESHIDROGENASA es similar a la del complejo α-CETOGLUTARATO DESHIDROGENASA, que incluye una descarboxilación y la formación de un compuesto activado con CoASH, como lo es el Acetil-SCoA y la Succinil-SCoA. Ambas enzimas hacen uso de las coenzimas NAD, FAD, TPP, CoASH y del ác. Lipoico.

415

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

El metabolismo intermediario recurre en estos casos a secuencias repetidas de reacciones por representar el mecanismo óptimo para descarboxilar un cetoácido. Similar caso ocurre entre la Beta Oxidación de los ácidos grasos y la cadena de reacciones que ocurren en el Ciclo, desde la Succinil-SCoA hasta el ác. Oxaloacético. Se parte de un ácido graso activado por CoASH en el caso de la β-Oxidación o un ácido dicarboxílico como el Succínico, que también es activado por CoASH en el CTC y ambos se oxidan primero con FAD en vez de NAD, por ser termodinámicamente favorable el empleo de esta coenzima. Luego se procede a hidratar en ambos casos formando el L-Hidroxiderivado para oxidar nuevamente con NAD, dando como producto final un cetoácido. Este último es el ác. Oxaloacético en el CTC y el CetoacilSCoA en el caso del ácido graso. En el CTC durante la etapa en que se oxida al ácido Succínico, la CoASH no acompaña a la reacción todo el tiempo como en la βOxidación, ya que el ácido Succínico es una molécula de menor tamaño y con menor dificultad para ser activada. Volver inicio

8) DESCARBOXILACIONES DEL CTC.

416

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Al iniciarse la primera vuelta del CTC entra Acetil-SCoA y Ác. Oxaloacético y a medida que progresa el Ciclo se pierden dos carbones como CO2. Estos pertenecen solo al Oxaloacético y no al Acetil-SCoA. Los carbones del Acetil-SCoA se emplean para regenerar los carbones

+

H O 2

C

C H3

Citrato

O

C

C OOH

NAD

H Málico

-

C

OH

C

H

OOC

COO

C

CITRATO

CH

SINTASA

COO

2

-

C OO

-

-

Cis - Aconitato

C H2 C

-

-

COO

CH COO

MALATO

-

COO

HO

O

C H 2

NADH + H

H O 2

C H2

C OOH

Ac. Oxaloacético

-

C OO

Co A - SH

S - Co A

H O 2

-

COO

H

-

-

FUMARASA

Isocitrato

-

COO

ISOCITRATO

NAD

DESHIDROGENASA

C OO

C OOC

CH

HO

C Fumárico

CH 2 C COO

H

H

-

C OO

ACONITASA

DESHIDROGENASA

H

SUCCINO

H

DESHIDROGENASA

O CETOGLUTARATO

-

C OO

COO

2

CH2

CH2

CH2

C H

COO

-

-

GTP

GDP + P i

C OO C H

C OO Co A - SH

Ac. Succinico

DESHIDROGENASA

TIOQUINASA

-

CO

C H2 C H C COO

NADH + H

-

2

Cetoglutarato

Co A - SH

-

NAD CO 2 NADH + H

2

H

C

H

O

C

S - Co A Succinil - SCoA

Fig. 9 - 9. Destino de los carbones marcados del Acetil-SCoA.

perdidos del Oxaloacetato de la segunda vuelta al Ciclo, de tal manera que no son los carbones que entran en una vuelta, los mismos que ss pierden. Esto ocurre de forma desfasada en las vueltas posteriores, (Fig. 9 - 9) Al introducir un Piruvato marcado en los tres carbones, se pierde el primero que se encuentra en el grupo Carboxilo durante la reacción de la Piruvato Deshidrogenasa, quedando marcado los dos carbones del Acetil-SCoA, los carbonos restantes no salen como CO2 en la primera vuelta del Ciclo sino que en las sucesivas. En la vuelta número dos durante la formación del Succinato ( molécula simétrica), la posición de los carbones se vuelve aleatoria. Es decir, los carbones metileno del Succinato pueden ser ambos del grupo metilo del Acetil-SCoA. De esta manera el ác. Oxaloacético de la primera vuelta que perdió dos carbones como CO2, los repone con los del Acetil-SCoA y tendrá ahora los cuatro carbones marcados. Es decir existe una simetrización de la marca debido a la reacción Fumarato - Malato - Oxaloacetato. En la segunda vuelta sale el 50% de la marca del Oxaloacético como CO2. Estos pertenecen al carbono carbonilo del Acetil-SCoA y nuevamente se regenera Oxaloacétato, aún marcado en los cuatro carbones, esta vez con el carbono metilo del Acetil-SCoA y con el otro 50%

417

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

restante de la marca de tal manera que en la tercera se pierde 25% y en la cuarta el otro 25%. En otro caso si el Oxaloacético entra marcado en los cuatro carbones se pierden los dos carboxilos en la primera vuelta del Ciclo con el 50% de la marca y se pierden 25% en la segunda y los otros 25% en la tercera.

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9) REGULACION DEL CICLO TRICARBOXILICO.

418

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Las reacciones que tienen a cargo la regulación del ciclo son en general exergónicas (Fig. 10 - 9) y afectan según su estado de actividad la velocidad con que ocurre el Ciclo o la acumulación de intermediarios que pueden tomar otras vías biosintéticas.

PIRUVATO

Acetil - SCoA Complejo Piruvato Deshidrogenasa

+

OXALOACETATO

NADH , ATP , CH3 CO - SCoA , ACS. Grasos CITRATO

Citrato Sintasa

MALATO

NAD , Ca , AMP y CoA SH

+ NAD , ADP

NADH , ATP ISOCITRATO , Ca ,NAD + ADP ATP , NADH

Isocitrato deshidrogenasa FUMARATO

α-CETOGLUTARATO SUCCINATO

α-Cetoglutarato Deshidrogenasa SUCCINIL- SCoA

+

Ca , NAD Succinil - SCoA , NADH

Fig. 10 - 9. Las enzimas regulables del CTC son las más exergónicas.

a) Síntesis de Hidratos de Carbono. Cuando la enzima CITRATO SINTASA disminuye la afinidad por el Acetil-SCoA a causa de la inhibición alostérica por exceso de ATP o un alto nivel de NADH/NAD (Fig 10 - 9 y 11 - 9), Succinil-SCoA o Citrato, se acumula el ácido Oxaloacético y como la reacción previa a esta en el inicio del Ciclo es endergónica, el Oxaloacetato se devuelve a Malato. Este último difunde fuera de la Mitocondria donde por efecto del nivel NAD/NADH pasa a Oxaloacetato citoplasmático. El cuál mediante la enzima FOSFOENOL PIRUVATO CARBOXIQUINASA y GTP sé descarboxila y fosforila para dar origen al Fosfoenol-Piruvato que entrará a la vía de la Glucogénesis dando origen a Glucosa.

419

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

CITOPLASMA

MATRIZ C O

GLUCOSA

PIRUVATO ATP C O

C H2

O

C

O

P

C

O

O

O

OH

MITOCONDRIAL

2 Acetil - SCoA

Piruvato

2

CARBOXILASA

CITRATO ADP

COO C O

P

P Enol - Piruvato

C H2

P - Enol

GDP

Piruvato CARBOXI -

ISOCITRATO

COO

CO 2

Ac. Oxalo Ac[etico

GTP

QUINASA

Malato

COO C

O

C H2

Ac. Oxalo Ac[etico

NADH +

DESHIDRO -

NAD

GENASA

CETOGLU TARATO

COO Malato

COO NADH +

DESHIDRO GENASA

NAD C

Succinil - SCoA

OH

Ac. Malico

OH

C H2

C

C H2 COO

COO H

H

SUCCINICO

Ac. Malico

COO

FUMARICO

Fig. 11 - 9. La acumulación de Oxaloacético desplaza la reacción hacia Malato y este último fluye fuera de la mitocondria, como precursor de la Gluconeogénesis.

La Citrato Sintasa es también estimulada por altos niveles de ADP. Volver

al

inicio b) Síntesis de Ácidos Grasos. Cuando se acumula Citrato (Figs. 10 - 9 y 12 - 9), por inhibición de la ISOCITRATO DESHIDROGENASA a causa de un alto nivel de la razón ATP/ADP, el Citrato sale de la mitocondria y se descompone por medio de la CITRATO LIASA y ATP. La energía del ATP se emplea en activar la CoASH para la unión con el acetilo y proceder a formar nuevamente ACETIL-SCoA. Este último se dirige a la síntesis de Ácidos Grasos. El ác. Oxaloacético restante de la descomposición del Citrato, puede ser reducido a Malato, el cuál puede entrar nuevamente a la mitocondria y extraer cíclicamente más Acetil-SCoA al formar Citrato. Por otro lado si el Malato no entra puede ser tomado por la Enzima MALICA, que ocupa como coenzima NADP para formar por descarboxilación Piruvato. Este último puede entrar nuevamente a la mitocondria y participar en la salida de otra molécula de Citrato o bien pasar a la formación de Oxaloacetato y continuar hacia la Gluconeogénesis al formar Malato. El Piruvato también puede producir ác. Oxaloacético mediante la enzima Piruvato Carboxilasa y este último puede formar más Citrato con Acetil-SCoA mediante la enzima Citrato Sintasa.

420

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Otra situación en que se produce una regulación sobre las enzimas ISOCITRATO DESHIDROGENASA y α-CETOGLUTARATO DESHIDROGENASA se desarrolla al acumularse el NADH, este último por ley de acción de masas, desplaza las reacciones catalizadas por ambas enzimas a su forma inversa, incluyendo en ello a la Malato Deshidrogensa. Ambas enzimas son también activadas por Ca+2 en el músculo, cuando necesita ATP durante la contracción. Individualmente la Isocitrato Deshidrogenasa es estimulada por ADP e inhibida por ATP mientras que los niveles de Mg +2 la afectan cooperativamente. La α-Cetoglutarato Deshidrogenasa es también inhibida por Succinil-SCoA.

MATRIZ

CITOPLASMA

MITOCONDRIAL CH C

SINTESIS DE ACIDOS GRASOS

CH

3

S CoA

CITRATO

HO

SINTASA

+

ATP

ACETIL-SCoA

CITRATO LIASA

CITRATO

COOH C

CoASH

CH C CH COOH COOH

CoASH

COOH ADP

O

C

+ P

NAD

MALATO DESHIDROGENASA

H

CARBOXILASA Biotina

+ ATP

CH C

NADH +

H

COOH

ENZIMA MALICA

PIRUVATO

2

O

CH2 COOH AC. OXALOACETICO

CH2 COOH AC. OXALOACETICO

ADP + P

O

S CoA

COOH

ACETIL-SCoA

CO

3

C

O

C

OH

CH2 COOH CH

3 O

C

COOH

AC. MALICO

3 O

COOH

AC. PIRUVICO

AC. PIRUVICO

NADP CO 2

NADPH + H

PRODUCCION DE NADPH PARA LA SINTESIS DE ACIDOS GRASOS

Fig. 12 - 9. La enzima Málica produce NADPH mientras que la Citrato Liasa produce Acetil-SCoA para la Síntesis de los Lípidos.

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421

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

10) CONSIDERACIONES ENERGETICAS DEL CICLO. En todo el Ciclo Tricarboxílico existen dos reacciones endergónicas y son el paso de Citrato a Isocitrato y el paso de Malato a Oxaloacetato (Fig. 13 - 9). La primera reacción es arrastrada por las dos descarboxilaciones sucesivas que ocurren desde el Isocitrato a Succinil-SCoA, siendo la segunda de α-Cetoglutarato a Succinil-SCoA mucho más exergónica que la primera. La segunda reacción endergónica listada arriba, es arrastrada por la unión del Oxaloacetato al Acetil-SCoA para formar Citrato la cual si es exergónica.

Perfíl de Energía.

Energía Kcal/mol

0 -2 -4

Excergónica Deshidratación Hidratación

-6

DESCARBOXILACION Y

Endergónica

-8

OXIDACION

Condensación

Excergónicas

-10 -12

Oxidación

DESCARBOXILACION Y

-14

Endergónica

OXIDACION

Oxidación

-16

FOSFORILACION A NIVEL DE

-18

Hidratación

SUBSTRATO

-20 A Citrato

B

C Isocitrato

cis - Aconitato

D

E F G Fumarato Succinil - SCoA Succinico Alfa - Cetoglutarato

H Malato

I Oxaloacetato Productos

Fig. 13 - 9. Distribución de la Energía libre estándar durante el Ciclo Tricarboxílico.

Existen otras reacciones fuera de las dos reversibles mencionadas anteriormente, que pueden ser también levemente reversibles en el Ciclo, ya que son poco exergónicas y constituyen el paso de Succinil-SCoA a Succinato, el paso de Succinato a Fumarato y el paso de Fumarato a Malato, donde la caída de energía como se observa en la Figura 13 - 9 no es muy pronunciada.

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422

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

11) El CTC EN DISTINTOS ORGANOS A continuación en la Tabla X se pueden observar las distintas particularidades del Ciclo Tricarboxílico en diferentes órganos como son el Hígado, Músculo esquelético, Corazón y Cerebro. Así tenemos que en el hígado la entrada al Ciclo puede ser por medio del Acetil SCoA que proviene del Piruvato que A su vez deriva del ác. Láctico muscular o la Glucosa almacenada como glicógeno del mismo Hígado. Por otro lado el Piruvato proveniente de la Glucosa o la Alanina, puede entrar directamente al Ciclo como Oxaloacetato después de sufrir una reacción anapleriótica de Carboxilación con Biotina y ATP. A su vez los ácidos grasos pueden entrar como Acetil-SCoA después de sufrir la β-Oxidación en la mitocondria y si son impares producen una cola de Propionil-SCoA que puede entrar al Ciclo como Succinil-SCoA, después de ser carboxilada y reordenada. Los aminoácidos tienen varias formas de entrar al Ciclo, ya sea como Acetil-SCoA o como algunos de los intermediarios señalados en la Tabla después de sufrir algunas modificaciones consistentes en deaminaciones y descarboxilaciones. En el músculo según sea la fibra muscular roja o blanca el empleo del CTC será diferente, así tenemos que en la fibra muscular blanca las mitocondrias son escasas y se produce normalmente ác. Láctico, el que difunde hacia el sistema circulatorio como Alanina o ác. Láctico mismo y entra al CTC del Hígado como Acetil-SCoA. La fibra muscular roja tiene abundantes mitocondrias y oxida, ya sea Glucosa y/o ácidos grasos totalmente a CO2 y H2O. En algunos casos de inanición o cuando se padece de la diabetes insípida, también se puede aceptar Cuerpos Cetónicos que se cortan con la enzima Tiolasa y forman posteriormente Acetil-SCoA. Ciclo Tricarboxílico CTC en distintos tejidos

Sustratos que abastecen de intermediarios al Ciclo

Entrada al Ciclo bajo la forma De

Salida del CTC en la forma de

Hígado (Lanzadera Malato-Aspartato)

Glucosa Piruvato Lactato Ácidos Grasos pares Ácidos Grasos impares

Acetil-SCoA Oxaloacetato

CO2 y H2O

Acetil-SCoA Acetil-SCoA y Succinil-SCoA

CO2 y H2O CO2 y H2O Malato a Gluconeogénesis

Ala, Gly, Ser, Thr, Cys, Ile, Leu, Trp, Phe, Tyr, Leu, Lys

Acetil-SCoA

Citrato a síntesis de Acs. grasos o CO2 y H2O

Glu, Gln, Arg, His, Pro

α-Cetoglutárico

Malato a Gluconeogénesis o CO2 y H2O

Ile, Met, Val

Succinil-SCoA

Malato a Gluconeogénesis o CO2 y H2O

Aminoácidos

423

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

Músculo, según sea la Fibra muscular roja o blanca. Lanzadera Glicerol-P Ayuno e inanición Corazón (Ocupa 15% del oxígeno y la Lanzadera MalatoAspartato) Ayuno e inanición

Cerebro (Ocupa 20% de todo el Oxígeno, más aeróbico que el corazón y ocupa Lanzadera Glicerol-P, baja conc. de NADH) Mitoc. sin enzimas para βoxidación de los ács. grasos.

Tyr, Phe

Fumarato

Malato a Gluconeogénesis o CO2 y H2O

Asp, Asn

Oxaloacetato

Malato a Gluconeogénesis o CO2 y H2O

Glucosa Piruvato

Acetil-SCoA

Ácidos Grasos Cuerpos Cetónicos

Acetil-SCoA β-Hidroxibutírico Acetoacético Acetil-SCoA

CO2 y H2O Lactato sale a la sangre con dirección al hígado en la fibra muscular blanca (pocas mitocondrias) CO2 y H2O CO2 y H2O

Ácidos Grasos

Cuerpos Cetónicos Lactato y Piruvato Glucosa (se emplea muy poco) Glucosa

Cuerpos Cetónicos

β-Hidroxibutírico Acetoacético Acetil-SCoA

Acetil-SCoA Oxaloacetato

CO2 y H2O

CO2 y H2O CO2 y H2O

CO2 y H2O Se pierde αCetoglutarato del CTC que se dirige a sintetizar neurotransmisores

β-Hidroxibutírico Acetoacético

El corazón es el segundo órgano más aeróbico, ya que el primero es el Cerebro y hace uso principalmente de los ácidos grasos y cuerpos cetónicos, mientras que la oxidación de la glucosa es casi inexistente. El Cerebro ocupa principalmente Glucosa y al Ciclo Tricarboxílico entra como Acetil-SCoA y como Oxaloacetato, ambos a partir de Piruvato. En este caso la Glucosa es la única molécula que aporta 2 (Acetil-SCoA) y 4 (Oxaloacetato) carbones al Ciclo para formar el Citrato o ác. Cítrico de seis carbones. Es posible entrar al Ciclo como Cuerpo Cetónico (Ác. Acetoacético), previamente activado por el intermediario del Ciclo Succinil-SCoA que le transfiere su CoASH quedando como Acetoacetil-SCoA que con la Tiolasa pasa a AcetilSCoA.

424

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

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al

inicio 12) CICLO GLIOXILICO EN PLANTAS. Este Ciclo ocurre en los Glioxisomas de las plantas, especialmente en las semillas y se emplea para convertir Ácidos Grasos en Glucosa (Fig. 14 - 9). Se le puede considerar a este Ciclo como anapleriótico y su balance general es: 2Acetil-SCoA + NAD + 2H2O--------->Succinato + 2CoA-SH + NADH + H En él se emplean dos enzimas distintas al resto, la Isocitrato Liasa y la Malato Sintasa. Ambas permiten la incorporación de dos moléculas de Acetil-SCoA al Ciclo Tricarboxílico. Las reacciones normales de descarboxilación del CTC no se encuentran presentes en este Ciclo Glioxílico.

C H3

ACETIL - SCoA

C

HIDRATOS

COOH

SCoA

DE CARBONO

BETA OXIDACION ACS. GRASOS

CoASH

O

C H2 HO C Citrato

C O O H CITRATO

C H2

Sintasa

COOH

Aconitasa

COOH OXALOACETATO

C

O

COOH

CH 2 COOH

C H2 H

C

COOH

HO CH COOH

NADH + H

ISOCITRATO

Malato Deshidrogenasa

Isocitrato

NAD H

COOH

H

OH

C

C

C H2 Ac. MALICO

Liasa O

COOH

AC. GLIXILICO

COOH Malato CoASH + H+

Sintasa

C H3 C

O + H O 2

SCoA ACETIL- SCoA

Fig. 14 - 9. Ciclo biosintético o Ciclo Glioxílico.

El Malato acumulado de esta manera se destina a la síntesis de Hidratos de Carbono al igual que en la Gluconeogénesis. Volver inicio 14) METABOLISMO EN LOS RUMIANTES.

425

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

El estómago de los rumiantes se divide en cuatro secciones y de ellas el rúmen es la que posee la mayor cantidad de microorganismos ( 1010 microorganismos/ cm3 ). La Celulosa de las plantas es el principal alimento de los rumiantes y consiste en moléculas de Glucosa unidas por enlaces β(1-4). En la primera parte de este estómago segmentado (rúmen), la celulosa sufre el ataque de las enzimas microbiales o en otras palabras es fermentada, produciendo ác. Acético, ác. Propanoico y ác. Butanoico más CO2 y Metano (CH4). El proceso es considerado un tanto ineficiente ya que se pierde el 40% de la energía. Los ácidos producidos por los microorganismos serán luego los principales precursores de las moléculas complejas del animal. Solo los ácidos nombrados anteriormente serán la fuente primaria de energía mientras que la producción de Metano (80 lts/día) es tan solo una pérdida de energía. La Glucosa que se libera de la Celulosa no pasa directamente a la sangre ya que la emplean los mismos microorganismos, por lo tanto la Glucosa que necesita el rumiante proviene de la síntesis de novo, es decir a partir de intermediarios del CTC. El ácido Propanoico, principal componente de la fermentación se activa a Propionil-SCoA y luego se transforma en Succinil-SCoA como se observa en el capítulo de vitaminas y ácidos grasos. Posteriormente entra al CTC y puede salir como Malato para ser ocupado en la síntesis de Glucosa necesaria para el animal y una parte de ella es posteriormente transformada en Galactosa para la leche. El Glicerol-fosfato producido en la Gluconeogénesis es empleado para la síntesis de TAG. Propionil-SCoA Carboxilasa Biotina Propionil-SCoA + CO2 + ATP---------------------> D-Metilmalonil-SCoA del Rúmen Metilmalonil-SCoA Racemasa Metilmalonil-SCoA ------------------------------> L-metilmalonil-SCoA Metilmalonil-SCoA Mutasa B12 o Cobalamida L-Metilmalonil-SCoA ---------------------------> Succinil-SCoA Succinil-SCoA----> C.T.C. ----> Malato ----> Gluconeogénesis La Lactosa presente en la Leche junto a sus triglicéridos provienen de los productos de la fermentación de la Celulosa, como el Acetil-SCoA y Propionil-SCoA: Gluconeogénesis---------> Glucosa---------> Lactosa---------→ Leche Gluconeogénesis--------> Glicerol-3-P --------> Triglicéridos Acetato -------> Acetil-SCoA ------> Ácidos grasos -------> Leche

426

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

del Rúmen Ác. Propiónico -----> Propionil-SCoA -----> Ácidos grasos -----> Leche del Rúmen Ningún aminoácido es esencial para los rumiantes ya que sus microorganismos los pueden sintetizar de similar manera que las vitaminas. Algunas sales de Amonio y la Urea misma pueden servir como fuentes de Nitrógeno a los microorganismos para formar aminoácidos. Por otro lado las proteínas de las plantas son hidrolizadas directamente en el rúmen y sus aminoácidos pueden pasar luego a la sangre o bien pueden ser deaminados y finalmente convertidos en ácidos grasos, sin embargo la mayoría de ellos pasa a constituir la proteína de los microorganismos. De esta manera se multiplican en gran cantidad para ser posteriormente hidrolizados y aprovechados en otras secciones del estómago. Por este medio se enriquece la composición aminoacídica aportada por las plantas y constituyen la fuente de aminoácidos para la proteína Caseína que se encuentra en la leche. Cuando los rumiantes deben amamantar sus crías y el suministro de Celulosa es bajo suelen padecer de Cetosis. Este desorden se caracteriza por la presencia de cuerpos cetónicos en la sangre a causa de una excesiva degradación de Triglicéridos, cuya presencia se manifiesta por un olor dulzón en el aliento, orina y leche del animal. La causa se atribuye a la falta de un nivel normal de Oxaloacetato durante el inicio del CTC, para así permitir la entrada del Acetil-SCoA que viene como producto de la β-Oxidación de los ácidos grasos. Por esta razón el Acetil-SCoA se acumula y origina los cuerpos cetónicos por un mecanismo que aparece en el capítulo de Lípidos. El Oxaloacetato se encuentra disminuido a causa de que el Malato, su precursor se dirige a la Gluconeogénesis para palear la falta de Lactosa producida por la dieta pobre en Celulosa. La cura para esta enfermedad consiste en el suministro de Glucosa endógeno, ya que en la dieta lo aprovecharían solo los microorganismos. Volver inicio

427

al

Héctor Rocha L. Ciclo Tricarboxílico.

REFERENCIAS Complexes of Sequential Metabolic Enzymes., P.A. Srere. Ann. Rew. Biochem. Vol 56, 89124, 1987. Biochemistry., L. Stryer, Third edition, 1988 W.H. Freeman and Co., NY

428

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

430

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

METABOLISMO EN LAS PLANTAS 1) FOTOSINTESIS 433 2) ESTRUCTURA GENERAL DEL SISTEMA FOTOSINTETICO 434 3) COMPUESTOS PROTEICOS DE LA MEMBRANA TILACOIDES, ANTENA COLECTORA 435 4) TRANSPORTE FOTOSINTÉTICO DE ELECTRONES 439 a) Fotosistema II 441 b) Citocromo b6/f 445 c) Fotosistema I 446 d) ATP sintasa 447 5) FIJACIÓN DEL CO2 448 6) FIJACIÓN DE CO2 EN PLANTAS C3 449 7) RUBISCO

451

8) FOTORRESPIRACIÓN 9) CICLO GLICOLATO

455

456

10) PLANTAS DEL TIPO C4 11) VARIEDAD EN LOS MECANISMOS DESCARBOXILACIÓN 12) LAS PLANTAS CAM

460

13) FIJACIÓN DEL NITRÓGENO 14) FLUORESCENCIA

461

466

15) FACTORES qP y qN

469

431

458

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

1) FOTOSÍNTESIS Las plantas son capaces de convertir la energía radiante del sol en energía química. Esta es a su vez empleada en la síntesis de complejas estructuras químicas, donde el ATP es la

432

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

principal molécula transportadora de energía. Durante este proceso la energía del sol se almacena en las estructuras químicas. La fotosíntesis consta de dos etapas, donde la primera de ellas se le conoce como Etapa Clara o Fotoquímica y se describe por medio de la ecuación de Hill. En ella se observa la necesidad de luz y agua para generar poder reductor en la forma de NADPH. En esta etapa se sintetiza el ATP y se libera O2 al medio como subproducto. 2H2O + luz ---> O2 + 4H+ + 4e ( Etapa clara o Fotoquímica conocida como Reacción de Hill) La segunda parte es la Etapa Oscura, que se caracteriza por la fijación de CO2 y su posterior reducción mediante NADPH + H, para la síntesis de Hidratos de Carbono por medio del Ciclo de Calvin. CO2 + 4e + 4H+ ---> (CHOH)n ( Etapa oscura o Ciclo de Calvin) El proceso por el que ocurre la conversión de energía radiante en energía química requiere de complejos sistemas de moléculas excitables por la luz, transportadores de electrones, enzimas y membranas que se encuentran ubicados en los Cloroplastos, (Fig. 1 -10). Estos organelos tienen por función producir energía química como ATP, romper el H2O para liberar O2 y obtener protones, cuyo destino será la reducción de Coenzimas que a su vez participarán en la reducción de CO2 durante la síntesis de los Carbohidratos. En cambio las Mitocondrias animales también producen ATP, pero emplean O2 para oxidar Coenzimas En la Grana o apilamiento de membranas tilacoidales se producen las reacciones claras que necesitan luz. En el Estroma se llevan a cabo las reacciones oscuras que no necesitan luz

Membranas Tilacoidales

Estroma

Memb. Ext.

Grana

Memb. Int

.

LUZ ADP + Pi

O 2

NADPH + H ATP

ETAPA

HIDRATOS DE CARBONO

NADP

H O 2

CLARA

CO

ETAPA

2

OSCURA

Fig 1 - 10. Estructura del Cloroplasto presente en el mesófilo de las hojas. La síntesis de Hidratos de Carbono se lleva a cabo en el Estroma y la ruptura del agua en las membranas Tilacoides o Grana.

433

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

reducidas cuyos protones se obtienen de la oxidación de Carbohidratos y otros substratos. De esta manera los protones se entregan finalmente al O2 formando H2O metabólica. Volver al inicio 2) ESTRUCTURA GENERAL DEL SISTEMA FOTOSINTETICO El Cloroplasto es un organelo constituido por tres membranas que a su vez definen tres espacios físicos funcionalmente diferentes (Fig. 1 - 10). a) La membrana externa lo separa del citoplasma y lo aísla como identidad, esta membrana tiene una constitución porosa y permite el paso de las moléculas con relativa facilidad en ambos sentidos. b) La membrana interna en cambio presenta varios sistemas de transporte para dejar pasar precursores y productos siendo muy selectiva. El espacio interno que rodean ambas membranas externa e interna, se denomina Estroma y es donde se encuentran muchas enzimas destinadas a la fijación del CO2 junto al Ciclo de Calvin donde se lleva acabo la Síntesis de los Hidratos de Carbono. c) La tercera membrana es la Tilacoidal (Fig.2 - 10) en cuyo seno se encuentran embebidos los sistemas transductores de energía. Estos se denominan Fotosistema II o P 680 y el Fotosistema I o P 700. Ambos fotosistemas capturan energía radiante a 680 y 700 nm respectivamente. Esta energía se emplea para llevar electrones de bajo a alto potencial reductor. Una vez excitados los electrones serán capaces de fluir a través de una cadena de transportadores empleando su energía en la formación de un gradiente quimiosmótico que posteriormente se acopla a la síntesis de ATP. Las membranas tilacoidales al encerrar un espacio de forma discoidal se apilan entre sí formando la estructura denominada como Grana (Fig. 1 - 10). Los lúmenes internos de los compartimentos intratilacoidales se encuentran en algunos casos conectados entre sí. A

Tilacoides

ATP sintasa

Fotosistema I I

Fotosistema I

Citocromo b f

Fig. 2 - 10. Distribución de los Complejos del Fotosistema II, Citocromos b6/f y Fotosistema I junto a la ATP Sintasa en la membrana Tilacoides.

434

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

ambos lados de esta membrana es donde se forma el gradiente quimiosmótico o gradiente de protones como consecuencia del flujo de electrones entre ambos Fotosistemas y de la presencia de una bomba de protones que los pasa desde el estroma al lumen. (Fig 16 - 10). La diferencia de concentración de iones hidrógenos entre lumen y estroma, es de alrededor de 2,5 unidades de pH. Como consecuencia de este gradiente los protones pasan ahora desde el lumen al estroma generando con ello ATP por medio de una ATP Sintasa, que posee un canal iónico destinado a permitir el paso de los protones capturando la energía del gradiente quimiosmótico en la forma de ATP (Fig. 16 - 10). Volver al inicio 3) COMPLEJOS PROTEICOS DE LA MEMBRANA TILACOIDES, ANTENA COLECTORA Su función es captar la energía radiante entre los 400 y 700 nm y transferirla a los Centros de Reacción donde se encuentran los Fotosistemas II y I. La antena colectora actúa como un embudo para transferir la energía de los fotones al Centro de Reacción (Fig. 3 - 10) El proceso de captación de la energía radiante está a cargo de los pigmentos fotorreceptores de la antena, así tenemos que una hoja con 70 millones de células tiene aproximadamente cinco mil millones de Cloroplastos y cada uno de ellos cuenta aproximadamente con 600

Antena

f

Luz

Fotones

f f

f

f

f

MOLECULAS DE LA ANTENA

CLOROFILA

CAROTENOIDES

f

=

fotón

P

Fotosistema Fig. 3 - 10. Los fotones excitan a los pigmentos que conducen la energía al centro de reacción.

millones de moléculas de Clorofila las que están unidas a las proteínas de la membrana t tilacoidal. Solo 250 a 300 de ellas se encuentran en cada antena y transfieren la energía de la luz

435

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

con la ayuda de pigmentos especiales que poseen enlaces dobles conjugados, estos se excitan a diferentes longitudes de onda que las Clorofilas y aprovechan la mayor parte del espectro de luz visible. En los pigmentos la presencia de dobles enlaces conjugados es necesaria para así disponer de electrones que puedan excitarse produciendo una redistribución de su nube dentro de la estructura molecular del pigmento. Posteriormente, al volver a decaer en energía, los electrones excitados retornan a sus orbitales originales emitiendo a su vez fotones, por medio de un fenómeno denominado fluorescencia. Este se transmite de una molécula colectora a otra,

Espectro de la Luz que alcanza la Tierra

Clorofila b Absorción

Clorofila a

300

400

500

600

700

800

nm Ficoeritrina

Absorción

Caroteno

300

Ficocianina

400

500

600

700

800

nm

Fig. 4 - 10. Espectros de Absorción de la luz solar presentado por los pigmentos de la antena.

siendo finalmente canalizado hasta el centro físico de la antena, que se encuentra formado por un par de Clorofilas sin Mg. Este par se halla tanto en el fotosistema P680 como en el P 700 y ambos constituyen los dadores de electrones primarios. Entre los pigmentos de la antena colectora encontramos a las Clorofilas a y b con cuatro anillos de Pirrol, desde el I al IV, los que se ligan en un Tetrapirrol con un átomo de Mg en el centro y una cadena Fitol en el anillo IV (Fig. 5 - 10). La Clorofila a tiene un grupo Metilo en la posición 3, mientras que la Clorofila b posee un Formilo en la misma posición y se le encuentra en plantas superiores y algas. Entre los pigmentos accesorios de la antena se encuentra el Beta-Caroteno, la Ficoeritrina y la Ficocianina que cubren el espectro de las luz solar que alcanza la Tierra (Fig. 4 - 10).

436

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Estos pigmentos se excitan con una longitud de onda distinta a la Clorofila para aprovechar todo el espectro de la luz solar (Fig. 4 - 10).

CLOROFILA a

CLOROFILA b

Nótese la presencia de dobles CH

enlaces conjugados en el anillo

2

CH

CH

2 CH

I

3

CHO 3

II

CH

III

CH

CH 2

3

N

N Cadena Fitol Mg HC 3

N

N IV

CH

CH 3

CH

3

CH

3

O 3 C

HC

O

3

3

H CH CH

H

2

H

2

O C

CH

3

O

O

Fig. 5 - 10. Molécula de Clorofila.

Las Clorofilas poseen máximos de 460 y 660nm en el tipo a y máximos de 430 a650nm en el tipo b (Fig. 5 - 10).

Caroteno Dobles enlaces conjugados

C H3 C H3

CH

CH 3

HC 3

3

CH

CH 3

CH 3

Fig. 6 - 10. Pigmento β-Caroteno.

437

CH 3

CH 3

3

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Los pigmentos accesorios poseen máximos de absorción distintos a la Clorofila y contribuyen a cubrir el total del espectro de luz visible supliendo a las Clorofilas en regiones en donde su absorción es deficiente. Entre los pigmentos accesorios se encuentran los Beta-Carotenos (Fig. 6 - 10), con máximos de absorción entre 400 y 500nm (Fig. 4 - 10).

FICOERITROBILINA Cuando este grupo se esterifica a una proteína se forma la FOCOERITRINA

CH 3 CH

CH 3

O

CH

COO

COO

CH

CH

CH

3

N

N

H

H

2

2

CH

CH2

2 2

CH

3

CH

CH

3

N

N

O

H

Diferencias Cuando este grupo se esterifica a una proteína se forma la FICOCIANINA

FICOCIANOBILINA

CH CH

O

CH 3

3

COO

COO

CH

CH 2

CH

CH

3

N

N

H

H

2

CH

CH 2 2

N

CH

3

CH

entre ambos pigmentos

3

CH 2

3

N

O

H

Fig. 7 - 10. Molécula de Ficoeritrina.

Las Ficobilinas, formadas por tetrapirroles de cadena abierta como la Ficoeritrobilina (Fig. 7 10), que se encuentra presente en las algas rojas y que conjugada a una proteína constituye la Ficoeritrina con máximos de absorción entre los 500 y 600 nm (Fig. 4 - 10). Otro de los pigmentos accesorios lo constituyen las Ficocianobilinas (Fig. 7 - 10), presentes en las algas verde-azuladas que conjugados con una proteína pasan a formar las Ficocianinas que absorben entre las regiones de 500 y 700 nm (Fig. 4 - 10).

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438

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

4) TRANSPORTE FOTOSINTÉTICO DE ELECTRONES. La presencia y disposición de los Fotosistemas en el Cloroplasto permite "elevar" el Potencial Redox [ un Pot. Red. negativo (-) tiene capacidad para donar electrones y es un reductor fuerte mientras que un Pot. Red (+) tiene capacidad de aceptar electrones y es un oxidante fuerte] desde + 0,81 a - 0,32 volt (Fig. 8a - 15), es decir llevar los electrones cargados negativamente desde un polo (+) a un polo (-). Este proceso, no es espontáneo y requerirá '

Eo

Cl*

1,0

Cl*

a) 0,5

PS I 0,0

PQ Cit b / f

PS I I

0,5 1,0

Fd

H2O

6

Pc

Cl

1/2 O2

Cl

b)

LUZ Fd

PS I I

PQ

Cit b / f

PS I

6

Pc 2 H2O

O2

+

+ 4H

Fig 8a - 10. Esquema Z de la cadena de transporte de electrones en el Cloroplasto. Fig 8b - 10. Los Fotosistemas II y I están integrados en la membrana Tilacoides.

de la energía aportada por la luz sobre los Fotosistemas II y I, (Fig. 8b - 15). Una vez que el Fotosistema II ha elevado la energía de los electrones, es entonces posible que funcione normalmente la cadena de transporte de electrones desde el potencial electronegativo al electropositivo en la membrana Tilacoides. De esta manera se genera un gradiente de protones a través de esta membrana, donde la energía conservada por este gradiente se empleará posteriormente en la síntesis de ATP. A continuación, el Fotosistema I volverá a "elevar" el Potencial Redox de los electrones para que en un último paso se reduzcan el NADP a NADPH + H+ completando la cadena (Fig. 9 - 10). El problema que ocurre en el Cloroplasto radica en que no se puede iniciar una cadena de transporte con electrones electropositivos de baja energía, lo que no ocurre en la Mitocondria, ya que la cadena se inicia de inmediato con electrones electronegativos a - 0,32 volt y que son producidos por las Coenzimas reducidas. Por esta razón se requiere de la energía radiante para pasar los electrones electropositivos del Cloroplasto a electronegativos e iniciar la cadena reductora que finalizará con la reducción del NADP. En general al comparar los Cloroplastos con las Mitocondrias se observa que los primeros rompen el agua y producen NADPH para reducir CO2, formando moléculas hidrocarbonadas,

439

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

mientras que las Mitocondrias forman hidrocarbonadas por oxidación con O2:

agua

metabólica

y

destruyen

moléculas

Cloroplasto 2H2O + 2NADP ---------------> O2 + 2NADPH + 2H+ Mitocondria O2 + 2NADH + 2H+ -------------->2H2O + 2NAD Se puede simplificar aún más el concepto, concluyendo que la Fotosíntesis ocurre con la ruptura del agua para producir Oxígeno y la Respiración animal con la formación de agua a partir del Oxígeno.

' Eo

[V]

FOTOSISTEMA i i

FOTOSISTEMA I

- 1,6 - 1.4

P 700 *

- 1.2

Clorofila acept.de e Filoquinona

- 1.0

- 0,6

Feofitina Plastoquinona

- 0,4

Quinona

- 0,2

Prot Fe - S Ferredoxina

Luz

P 680 *

- 0,8

ferredoxina NADP dep.

NADP +

Luz

NADPH

Ciclo Q

Complejo Citoc b / f 6

0

H+

0,2

Plastocianina

P 700

0,4 0.6 0,8 1,0

El Ciclo Q pasa protones

HO 2

P 680 Mn Mn

1/2

al lumen desde el estroma

O2 + 2 H+

Fig. 9 - 10. Bombeo de electrones por los Fotosistemas II (P680) y I (P700) entre la ruptura del agua para formar O2 y la formación de la Coenzima NADP reducida.

Fotosíntesis (Cloroplasto, PS II) 2 H2O < -------------------> O2 + 4H+ + 4 electrones Respiración Animal (Mitocondria, Citoc. Oxidasa) Volver al inicio

440

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

a) El FOTOSISTEMA II. El Fotosistema II esta formado por las siguientes moléculas (Fig. 10 - 15).

Centro de Reacción P S 2. 2H

Luz

+

CLOROFILA

f

f

f f

f

ANTENA

f CAROTENOIDES

6 8 0 nm P680

:

Clorofila s/Mg

Fotón = D1

PLASTOQUINONA Q A

f

D2

QB H 2 LIBRE

FEOFITINA

f

P680 Tyr Z

33 Mn

4 X 2H O 2

Mn 23

e

Complejo Disruptor del H 2 O 4 H

+ + O2

Fig 10 - 10. Fotosistema II

a) El sistema P680 esta formado por dos Clorofilas que absorben luz a 680 nm y que se encuentran unidas a los polipéptidos D1 y D2.. Su función es actuar como donadores primarios de electrones. b) La Feofitina formada por una Clorofila sin Mg y cuya función es aceptar el electrón del P680. c) La Plastoquinona QA o Quinona unida a una proteína que actúa como aceptor primario de electrones desde la Feofitina. d) La Plastoquinona QB o Quinona libre que actúa como aceptor secundario de electrones desde la Plastoquinona QA. Esta Quinona es capaz de difundir libremente entre los complejos proteicos después de ser reducida a diferencia de la QA que es fija. e) El sistema oxidante del agua con sus 4 átomos de Mn. f) El factor Z con los polipéptidos D1 y D2 que aportan un residuo de Tyr y que actúan como un conjunto donador secundario de electrones para restituir el electrón del P680. El Complejo Fotosintético II funciona de la siguiente manera:

441

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Los fotones excitan a las moléculas de Clorofila de la antena y la energía de excitación es transferida en este embudo desde una molécula de Clorofila a otra (Fig. 10-13), hasta alcanzar al complejo donador primario de electrones o P680 representado en las figuras 1113 y 12-13. Este centro de reacción es parte del fotosistema PS II y se encuentra formado por un par de moléculas de Clorofila. Al ser excitado el sistema P680, transfiere un electrón en 1012 seg. a una molécula adyacente de Feofitina (Clorofila sin Mg) y adquiere de esta manera carga positiva al quedar como catión P680+. Ahora el electrón pasa desde la Feofitina a la Plastoquinona o Quinona A en 200 x 10-12 seg. y posteriormente en una forma más lenta, en 200 x 10-6 seg. pasa a la Quinona B que se encuentra libre. Cuando la Quinona B está doblemente reducida, difunde libremente hacia el Complejo b6-f donando sus electrones al Ciclo Q. Desde el Complejo b6-f los electrones pasan a una pequeña proteína denominada Plastocianina y desde allí se dirigen al Fotosistema I.

Secuencia de Polarización del Fotosistema II .

1

Energía Radiante

4

QB

QB

QB

QB

Q

Q

Q

Q

A

Feo

A

A

Feo

Feo P

P680

P

Z

Z

Z

Z

680

680

FACTOR Z PEPTIDO

P 680* Feo

( DONADOR

Q

A ( PLASTOQUINONA )

PRIMARIO ( ( CLOROFILA SIN MAGNESIO )

QB

( QUINONA LIBRE )

A

Feo

P 680*

Los Fotones exitan al sistema P

3

2

Máxima separación de las cargas

Fig. 11 - 10. Polarización del Fotosistema II.

El sistema P680 oxidado al quedar con carga + recupera su electrón por medio de un polipéptido D1 cuyo residuo de Tyr denominado factor Z permanece como Tyr Z+ después de donar su electrón. Esta polarización o separación máxima de cargas en el PS II, se traduce en una capacidad oxidativa de tal magnitud que es capaz de extraer en forma secuencial 4 electrones desde los

442

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

4 átomos de Mn que se encuentran asociados a las proteínas del PS II y que están involucradas en la oxidación del agua.

Este último sistema posee 5 etapas independientes y se le denomina reloj oxidante (Fig. 13 10). Este reloj proporciona electrones a las Clorofilas ubicadas en el l centro de reacción del Fotosistema II (P680).

a) +

4P

4H

+

+

+

4P

2 Q + 4 Fotones

+

2QH B

680

680

DONADOR PRIMARIO

4 P

+

680

+

+ 4Z 680

+4

0

+ 4 Z

4 P

2 +

+

4 Z

[ Complejo con M n ]

[ Complejo con M n ] 0

+4 [ Complejo con M n ]

+

[ Complejo con M n ]

+2 H O

+ + 4H

+

2

2 H2 O + Q B +

b)

O

4 Fotones

2

+

Energía Fotónica f

Complejo Disruptor

2 QH B procedente antena

+4

+

4Z

[ Complejo con M n ]

2

4P 680

_ e 4H

+

[ Complejo con Mn ]

0

Q

H B

2

+ 4Z Paso de 4

O 2

2

de la

del Agua 2 H

O

_ e

4P 680

Q

B

en forma individual

Fig 12a - 10. Polarización del Fotosistema II junto al paso secuencial de los 4 electrones producto de la ruptura del agua. Fig 12b - 10. Visión similar del mismo proceso.

Cuando el P680 recibe un fotón el reloj avanza un estado S o en una etapa de oxidación dinámica de sus átomos de Mn. Los que son capaces de liberar un electrón por etapa, excepto en la etapa S4 en cuyo estado de oxidación, se libera espontáneamente una molécula de Oxígeno para luego volver luego al estado So completando un ciclo.

443

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Reloj Oxidante del Agua .

P680 e e O2

+ 2H

Z

e e

2 H2 O

So

S4

H

+

e

e

S3

S1

+ H e

S2

e

Fig. 13 - 10. Reloj que indica como el complejo Mn -proteico libera secuencialmente 4 electrones para oxidar el agua.

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444

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

b) CITOCROMO b6/f El Complejo del Citocromo b6/f, (Fig. 14 - 10) se encuentra a medio camino de la cadena de transporte de electrones entre el sistema P680 y el P700. Esta formado por varios polipéptidos transportadores de electrones codificados por el núcleo y el cloroplasto. El polipéptido que se une a la Quinona recibe de esta protones y electrones, donando los electrones al siguiente transportador y liberando los protones a través de la membrana mediante el Ciclo Q, descrito previamente en las mitocondrias. En este complejo se encuentran el Citocromo b563, una proteína de Rieske Fe-S y el Citocromo c552. El flujo de electrones viene desde la Quinona reducida QB H2 que participa en el ciclo Q, pasa al citocromo b6/f y se dirige desde aquí a la Plastocianina. La entrada de protones al espacio intratilacoidal o lumen ocurre mediante el Ciclo Q que provoca una diferencia de pH de 3,5, ya que el Estroma tiene un pH de 8 y el espacio intratilacoidal de 4,5.

Citocromo b6/f + LUMEN O

H

ESPACIO INTRATILACOIDAL

Rieske Fe S Polipéptido Quinona

e

+

+ H

e

C i t. b6

TILACOIDES

C i t. f Ferredoxina Nucleótido Reductasa

Ciclo Q ESTROMA

+ H

BOMBEO DE PROTONES

Fig. 14 - 10. Citocromo b6/f con Ciclo Q que bombea protones al espacio intratilacoidal y que pasa electrones entre el PS II y PS I.

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445

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

c) FOTOSISTEMA I. En forma similar a la anterior el Fotosistema I, (Fig. 15 - 10) atrapa luz mediante los pigmentos de la antena, Clorofila a y b más los Carotenoides, para canalizar esta energía al centro de reacción formado por las dos Clorofilas. Estas se encuentran unidas a un dímero proteico con subunidades A y B que atraviesa la membrana y constituye el centro P700.Este sistema pierde un electrón hacia un aceptor Ao, conocido por ser una forma especial de Clorofila como es la Feofitina del Fotosistema II, quedando ahora como P700+ y Ao-.

Centro de Reacción PS I 2H

Luz 70 0 nm

+

CLOROFILA

f f

f f

ANTENA

f

f NADP

CAROTENOIDES NADPH + H P 700

: Clorofila s/Mg

o FEOFITINA Ferredoxina 4 Fe - 4 S

FERREDOXINA REDUCTASA

Fotón =

f

4 Fe - 4 S e FILOQUINONA e

A

e

f B

PLASTOCIANINA f

Fig 15 - 10. Fotosistema PS I encargado de excitar los electrones nuevamente para formar NADPH.

El compuesto Ao- es un fuerte reductor que pasa los electrones a la Filoquinona y luego desde allí a la proteína Fe-S que su vez los pasa a la Ferredoxina (también es una proteína Fe-S). El último aceptor de electrones es la Ferredoxina-NADP Reductasa que transfiere electrones desde la Ferredoxina reducida al NADP para quedar finalmente como NADPH + H+. A continuación se produce la polarización del Fotosistema I y de forma similar al caso anterior el P680+, se restaura con un electrón de la Plastocianina, proteína que contiene Cu y que se encuentra en la cadena en una posición previa al Fotosistema I.

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446

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

d) ATP SINTASA H+ ADP

+

ATP

P

ESTROMA CF1

ATP SINTASA II

II III

MEMBRANA

III

CFo

III

TILACOIDAL

IV

2 H+ 2H2O Mn PSII

LUMEN

+ O2 + 4H Q H2

Pc Cyt b / f

Q

PS I

6

Fd

2 H+ NADP

LUZ

NADPH + + H

LUZ

Fig 16 - 10. Destino de los protones provenientes de la ruptura del agua y los aportados por el Ciclo Q en la síntesis de ATP.

Este sistema funciona básicamente de la misma forma que en las mitocondrias y se encuentra impulsado por un gradiente de protones que existe en ambos lados de la membrana tilacoides (Fig. 16 - 10). El gradiente se encuentra formado por los protones importados desde el Estroma por el Ciclo Q más la ruptura del agua que ocurre en el lado luminal. La salida de los protones hacia el estroma se realiza por medio del canal iónico CFo asociado a la enzima CF1. Entre ambos constituyen la ATP Sintasa. El paso de estos protones provoca a su vez en la parte CF1 cambios conformacionales que varían la afinidad de la enzima por el ADP, Pi y el ATP. La reacción necesita de Mg. La parte CF1 consta de 3 subunidades α que se encuentran intercaladas con 3 subunidades β, más las subunidades γ, δ y ε (Fig. 16 - 10). A su vez las subunidades α y β constituyen el sitio activo que junto a la subunidad ε están codificadas por el genoma del Cloroplasto. El canal iónico o parte Cfo de la enzima comprende a las subunidades I, III y IV que también se encuentran codificadas por el genoma del Cloroplasto, mientras que las subunidades γ, δ y II se encuentran codificadas por el núcleo. En la Figura 16 - 10, se puede apreciar la disposición de los dos Fotosistemas, el citocromo b6/f y la ATP sintasa. Los protones se acumulan en el espacio intratilacoidal bombeados por el Ciclo Q del Citocromo b6/f y salen por medio de la ATP Sintasa que aprovecha la energía del gradiente de carga y concentración para la síntesis de ATP.

447

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

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448

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

5) FIJACION DEL CO2. Solo el 1% del total de la energía radiante que alcanza la Tierra es aprovechada por las plantas para generar biomasa. La eficiencia con que se fija el CO2 puede variar entre ellas, así tenemos que se aproxima al 2% en las plantas conocidas como C4 y en otras conocidas como C3 ni siquiera se alcanza el 1%. Las plantas como organismos dependientes de la luz tienen un metabolismo que procede en dos etapas, la primera consta de una serie de reacciones ya descritas que constituyen la etapa clara que arroja como productos fotosintéticos ATP, NADPH y O2 por la ruptura del agua. La etapa oscura en cambio, consta de reacciones de fijación de CO2 y síntesis de hidratos de carbono (Fig. 17 - 10). Durante la fijación del CO2, se ha determinado que algunas plantas mantenidas en un invernadero, donde se acumula el CO2, experimentan un inusitado desarrollo (plantas denominadas C3) y que otras en similares condiciones no experimentan beneficio alguno (plantas denominadas C4). Esta diferencia se debe principalmente a la forma como ambos tipos fijan el CO2. En general entre las plantas existen tres estrategias distintas de fijación: a) Las C3, se encuentran en los climas templados con temperaturas inferiores a 30oC y se denominan así por el compuesto de tres átomos de carbono que se genera al fijar el CO2 durante el día. b) Las C4, pertenecientes a climas tropicales o subtropicales, con temperaturas superiores a los 30oC y que fijan el CO2 mediante la formación de un compuesto de cuatro átomos de carbono durante el día. c) Las CAM ( Crassulacean Acid Metabolism) por Metabolismo Ácido de la Crasulaceas. Estas plantas se encuentran en climas desérticos y para no perder agua por los estomas proceden a abrirlos solo por la noche para fijar el CO2 mediante la formación de un compuesto de cuatro átomos de carbono. Este último se almacena hasta el día siguiente donde se procede a incorporarlo. CITOPLASMA

CLOROPLASTO LUZ ETAPA OSCURA

ETAPA CLARA

CICLO DE CALVIN Y BENSON H2O

1/2 O2 NADPH

Cyt b6/f NADP ADP

CO 2 FOSFOFRUCTO

ATP

QUINASA RUBISCO

ATP

CICLO DE REDUCCION FOTOSINTETICA GLICERALDEHIDO 3 P DEL CARBONO

ALMIDON

NADPH

DESHIDROGENASA TRIOSA

FOSFATO FRUCTOSA 1,6 BIFOSFATASA SUCROSA

Fig 17 - 10. Esquema simplificado de la etapa clara y oscura en el Cloroplasto.

449

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Volver al inicio 6) FIJACIÓN DEL CO2 EN PLANTAS C3. Las plantas C3 son las más comunes y se encuentran presentes en todos los climas templados e incluyen al tomate, trigo, cebada, remolacha, papa, tabaco, espinaca, girasol, etc. En general desde las bacterias fotosintéticas, las algas azules o cianofíceas, los musgos y helechos hasta todos los árboles, incluyendo las coníferas, pertenecen a este grupo. Para la fijación del CO2 todas las plantas C3, C4 y CAM, poseen el Ciclo de Reducción Fotosintética del Carbono (RFC) o Ciclo de Calvin y Benson (Fig. 18 - 14). En este Ciclo el CO2 se integra a una molécula de 5 carbones para luego formar dos moléculas de tres carbones o triosas fosfato (C3), a continuación estas son nuevamente fosforiladas y enseguida reducidas por los productos de la etapa clara de la fotosíntesis (ATP y NADPH). De esta forma el destino final del CO2 puede consistir en: a) ser reciclado como el metabolito aceptor de CO2, la Ribulosa-1,5-Bifosfato de 5 carbones en el Estroma. b) ser destinado a la síntesis de Almidón en el Estroma del Cloroplasto. c) ser exportado para la síntesis de Sacarosa en el citoplasma. La enzima que cataliza la fijación del CO2 se llama Ribulosa -1,5-Bifosfato Carboxilasa y puede ser también abreviada con el nombre de Rubisco. La estructura celular de las hojas en una planta C3 difiere notablemente de las plantas tipo C4 como se aprecia en las Figuras 18 - 10 y 24 - 10. En un corte transversal de la hoja perteneciente a una planta C3 se observa en la parte superior de ella la cutícula y parte de su epidermis donde se encuentran intercalados los

CORTE TRANSVERSAL DE UNA HOJA EN UNA PLANTA C 3 EPIDERMIS SUPERIOR

ESTOMA CUTICULA

CELULAS EN EMPALIZADA

CELULAS ESPONJOSAS MESO VASOS DEL FLOEMA FILO

Y XILEMA

TEJIDO LAGUNAR

EPIDERMIS INFERIOR

ESTOMA

Fig. 18 - 10. Estructura de la hoja en plantas C3.

450

Trigo

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

estomas que permiten la entrada del CO2. Desde aquí el CO2 difunde hacia el Mesófilo con su tejido en empalizada alcanzando el tejido esponjoso donde todos los Cloroplastos poseen la enzima Rubisco para fijar el CO2. Finalmente hacia el centro se encuentra el haz vascular que rodea a los vasos del floema y xilema por donde se transporta la savia. De esta manera en todos los Cloroplastos de las plantas C3 se lleva a cabo el Ciclo de Calvin y Benson o Ciclo Fotosintético Reductor para fijar el CO2. Este ciclo se puede dividir en tres eventos (Fig. 19 - 10) que son: a) Fijación de CO2 o Carboxilación b) Reducción con NADPH c) Regeneración

BALANCE DEL CICLO DE CALVIN .

2X3

2X3

CO + 2

2X6

Ribulosa - 1,5 - Bifosfato

3 - Fosfoglicerato

FIJACION

2 x 3 ADP 2 x 3 ATP

2X3

H O 2

2X6 REDUCCION

Ribulosa - 5 - Fosfato

2 x 6 ATP 2 x 6 ADP 1 , 3 - Bifosfoglicerato

2 x 6 ( NADPH + H )

REGENE 2 X 3 Pi

2 x 6 ( NADP + Pi )

RACION

2X6 2X5

Gliceraldehido - 3 - Fosfato

Gliceraldehido - 3 - Fosfato

2X1

Gliceraldehido - 3 - Fosfato

Glucosa

Fig. 19 - 10. En el Ciclo de Calvin y Benson por cada tres moléculas de CO2 se sintetiza una Triosa fosfato y se consumen 9 ATPs y 6 NADPH.

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451

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

7) RUBISCO a) Fijación de CO2 o Carboxilación La enzima fijadora de CO2 denominada RuBisCO, es la enzima que se encuentra en mayor cantidad en la naturaleza. Esta enzima cataliza la unión del CO2 a compuestos de cinco carbonos como la Ribulosa-1,5-Bifosfato, para formar luego dos moléculas de tres carbones o 3-Fosfoglicerato (Fig. 20a - 10). La enzima tiene 8 subunidades catalíticas grande y 8 subunidades reguladoras pequeñas (Fig. 20b - 10). Cada subunidad grande tiene 475 aas. y un PM de 50kD. A su vez se encuentran codificadas por una sola copia del gen rbc L por genoma del Cloroplasto. Las 8 subunidades reguladoras pequeñas tienen 120 aas. cada una y un PM de 15kD. La subunidad pequeña se encuentra codificada por una familia de genes rbc S que se encuentran presentes en el genoma nuclear. Las dos subunidades se pliegan y asocian en el Cloroplasto con ayuda de Chaperoninas y Cochaperoninas, para formar dos capas con un total de 16 subunidades denominadas L8S8 holoenzima. El sitio activo esta formado por residuos del lado Ct de una subunidad L y los residuos del lado Nt en la siguiente subunidad L. La enzima recién aislada tiene una Km para el CO2 que se encuentra entre 18 y 20 microMolar. Su síntesis es activada por las condiciones de luz y su actividad por conocidos RuBisCO

Ribulosa - 1,5 - Bifosfato + CO

a) CH

2 ( 3 - Fosfoglicerato )

2 O

O O

2

2

O

P

CH

O

C

O

C

O H

OOC

2

C

OH

C

O

3

O

P

O

O

Enediol Intermediario C

H

O

O H

CH

O

2

O O

P

+

C

H

Cetoácido O

O H

C CH

O

O

2

P

O

O

O

H O 2

O H CH C H H

O

2

O H

CH

CH

O

2

CH

O P

O

1

S

L

H

L S 8 8

L

C

O

C

O

C

O H O

O P

C

OOC

O

OH

2

P

4 O

O

O

2

P

H

Carbanion O

C

O

H

C

O H

CH

2

O

OOC

O

Intermediario Hidratado

3 - P - Glicerato

S

Desde arriba

vista lateral

Fig 20a - 10. Fijación del CO2 y transformación en dos Triosas Fosfato. Fig 20b - 10. La enzima Rubisco

452

O

2

P O

C OH

+

O P

CH

O

O

OH

O

L S

O

2

CH

L

S

OOC HO

O

b) Rubisco

O

O

O

Ribulosa - 1, 5 - Bi - P

O H

C

O

O

O

C

P

5

+

H

3 - P - Glicerato

O

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

modificadores alostéricos como: NADPH, 6- Fosfogluconato, Fructosa-1,6-bifosfato junto a un pH y concentración de MgCl2 adecuados. El CO2 fuera de ser uno de los substratos, es también considerado un activador de esta enzima. En presencia de CO2, como se observa en la Figura 20a - 10, la Rubisco cataliza la unión del CO2 a la forma enediólica (2) de la Ribulosa-1,5-Bifosfato (1) para formar un BetaCetoácido (3). Este se hidrata en un compuesto de seis carbones de carácter inestable (4) que se hidroliza en dos moléculas de Ác. 3-Fosfoglicérico (5) (Fig. 20a - 10). Una de las curiosidades que presenta esta enzima consiste en su afinidad por O2, ya que pudo haber evolucionado químicamente cuando los niveles de Oxígeno en la Tierra eran muy bajos y esta molécula no interfería, (Fig. 21 - 10). Esta propiedad no le confiere ninguna ventaja evolutiva y se comporta en la realidad como una Ribulosa Bifosfato Carboxilasa/Oxigenasa en 1/3 de su catálisis normal. La actividad Oxigenasa es Dismutásica, debido a que le permite romper a la Ribulosa-1,5Bifosfato en 3-Fofogliceraldehido de tres carbones y en Fosfoglicolato de dos carbones, es decir forma dos productos desiguales (Fig. 5 - 10). Al mismo tiempo se inicia aquí una serie de reacciones que culminan en un Ciclo diferente al de Calvin y que se denomina Ciclo Fotorespiratorio Glicolato, ya que emplea al compuesto denominado ác.Glicólico que cuenta con dos carbones. Esta anomalía supuestamente favoreció la evolución de las plantas C4, consideradas de orígenes más recientes. En ellas el CO2 se concentra primero disminuyendo la posibilidad de entrada del O2 y posteriormente se le transporta a la enzima fijadora Rubisco. En la Tabla 1 - 10 y la Figura 21 - 10 se puede apreciar como varía la afinidad de la enzima por las concentraciones de CO2 y O2 en una solución que se encuentra en equilibrio con la atmósfera. Si la concentración de CO2 es de 10 uMolar ( micromolar), la enzima se encuentra saturada en un 25% con solo 20 micromolar de CO2. Al mismo tiempo con 250 uMolar de O2, la enzima se encontrará competitivamente saturada por sobre el 50%. De esta manera se puede apreciar claramente la interferencia provocada por el Oxígeno ante la fijación del CO2. TABLA 1 - 10

Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa

Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa/Oxigenasa

10 microMolar Conc. de CO2 en una solución en equilibrio con la atmósfera

20 microMolar Km para el CO2

250 microMolar Conc. de O2 en una solución en equilibrio con la atmósfera

453

200 microMolar Km para el O2

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

% Sat. 50 %

Km

10

M

20

M

[CO ] 2

200

M

[ O ] 2

% Sat. 50 %

250

M

Fig 21 - 10. Curvas de saturación para la afinidad de la Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa por CO2 y O2.

Volver al inicio b) Reducción con NADPH. Al continuar nuevamente con el Ciclo de Calvin y Benson se observa que el 1,3-DifosfoGlicerato es reducido mediante NADPH + H por las Isoenzimas de la Glicólisis en el Estroma para formar el 3-FosfogliceraldehÍdo (Fig. 22 - 10) En el primer paso la enzima 3-Fosfglicerato Kinasa cataliza el paso del Gama- Fosfato del ATP al 3-Fosfoglicerato para ganar energía en el 1,3-Difosfoglicerato y a continuación en un segundo paso la enzima 3-FosfogliceraldehÍdo Deshidrogenasa reduce empleando NADPH + H y la energía del paso previo, para así formar el 3-Fosfo-gliceraldehido. Este último se emplea nuevamente para sintetizar Ribulosa, (Fig. 22 - 10). Este ciclo sería del tipo cumulativo si solo se formaran sucesivas moléculas de Ribulosa destinadas a captar un mayor número de moléculas de CO2, sin embargo esto no ocurre, ya que el 3-FosfogliceraldehÍdo dedica alguna de sus moléculas a vías alternativas como son la fabricación de Almidón en el Estroma y de Sucrosa en el Citoplasma. El 3-Fosfogliceraldehído que sale del Ciclo, (Fig. 21 - 10) es tomado por la Triosa Fosfato Isomerasa para formar la Fosfo-Dihidroxicetona que junto a otra molécula de 3-

454

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

FosfogliceraldehÍdo y la acción de la Aldolasa formará la Fructosa-1,6-Bifosfato. Esta última molécula mediante la enzima Fructosa-1,6-Bifosfatasa formará la Fructosa-6-Fosfato que será destinada a la síntesis de Almidón por las enzimas del Estroma. La Fosfo-dihidroxicetona puede también dejar el Cloroplasto y pasar al citoplasma mediante un antiporter, que por medio de otras isoenzimas del tipo isomerasa y aldolasa, formará Fructosa-6-Fosfato que se dirigirá a la síntesis de Sucrosa. Volver al inicio c) Regeneración. En esta etapa se construye nuevamente una molécula de Ribulosa destinada a fijar nuevamente el CO2 y se emplean varios intermediarios que van de tres a siete carbones (Fig. 22 - 10). El 3-FosfogliceraldehÍdo se une a la Fosfodihidroxicetona en una reacción catalizada por la Aldolasa para formar la Fructosa-1,6-difosfato que a continuación por medio de la Fructosa1,6-bifosfatasa da origen a la Fructosa-6-Fosfato. Esta última por medio de la enzima Transcetolasa, se rompe en Eritrosa-4-Fosfato y el Glicoaldehído-Tiamina Pirofosfato que se encuentra en el sitio activo de la enzima. A continuación la Eritrosa-4-Fosfato junto a la Fosfodihidroxicetona se unen para dar origen a la Sedoheptulosa-1,7-difosfato de siete carbones. Esta molécula por acción de la Sedoheptulosa-1,7-difosfatasa produce la

C O OP COO H

CH OP 2

2

H

C

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

OH

NADPH

CH OP 2

CH OP 2

CH OP 2 C HO

CH OP 2

P - D i - OH Cetona

ATP

C

CHO H

O

H

C

OH

C

OH

HO

C

H

C

OH

CH OP 2

C

OH

Eritrosa - 4 P

C

OH

H

C

OH

H

H

C

OH

H H H

C

OH

H

C

OH

H

C

Ribosa - 5 P

C

OH

C

OH

C HO

H

H

C

OH

C H 2O P

Pi CH OH 2

C

Sedoheptulosa - 7 P CH OH 2 C O

O

C

Fructosa - 1,6 - Bi P

HO

CH OH 2

OH

CH OP 2

H

C

CHO CH OP 2

T

Xilulosa - 5 - P

O H

CH OP 2

CH OH 2

CH OH 2

C

H

Pi

Ribulosa - 1,5 - Bi P

O

OH

C

CH OH 2 C O

Sedoheptulosa -1,7 B i P

Ribulosa - 5 P

CHO H

1,3 D i - P Glicerato

OH

C

OH

CH OP 2

3 P - Gliceraldehido

OH

CH OP 2

CH OP 2

C

C

CH OP 2 C O

3 - P - Glicerato

CH OP 2 C O C

H

OH

C

CO

H

ATP

O H

H

C

OH

H

C

OH

CH OP 2

Fructosa - 6 P

ALMIDON

Fig. 22 - 10. La regeneración de la Ribulosa requiere de complejas reacciones que incluyen intermediarios que van de tres a siete carbones.

455

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Sedoheptulosa-7-Fosfato. La enzima Transcetolasa rompe la molécula de Sedoheptulosa-7Fosfato para dar Ribosa-5-Fosfato y nuevamente Glicoaldehído-Tiamina Pirofosfato unido a la enzima. Ambos Glicoaldehído-Tiamina Pirofosfato, el anterior y el recién formado son transferidos desde sus distintas enzimas al Gliceraldehido-Fosfato para formar Xilulosa-5Fosfato por medio de la Transcetolasa. Desde aquí en adelante, la Xilulosa-5-Fosfato y la Ribosa-5-Fosfato por medio de las enzimas Ribulosa-5-Fosfato Isomerasa y la Ribosa-5-Fosfato Epimerasa se transforman respectivamente en Ribulosa-5-Fosfato, que por acción de la Ribulosa-5-Fosfato Quinasa y ATP producen finalmente la Ribulosa-1,5-Difosfato. Como se puede observar el Ciclo es endergónico y requiere de ATP para ser llevado a cabo, especialmente en las reacciones de 3-Fosfoglicerato a 1,3-Difosfoglicerato, antes de la etapa de reducción y en el paso de Ribulosa-5-Fosfato a Ribulosa-1,5-Bifosfato, para activar la molécula de Ribulosa de tal manera que la unión del CO2 y la ruptura en dos moléculas de tres carbonos sea exergónica. En general se necesitan aquí tres moléculas de ATP para fijar una de CO2. Volver al inicio 8) FOTO RESPIRACIÓN El proceso denominado Fotorespiración, (Fig. 23 - 10) ocurre en las plantas C3, y se produce con desprendimiento de CO2 y absorción de O2 en condiciones de elevada temperatura ambiental, alta presión parcial de O2 y baja presión parcial de CO2. El producto de la Fotorrespiración es el Fosfoglicolato, que no es de utilidad a la célula y por consiguiente al mantener en existencia estos dos carbonos implica un gasto de dos ATPs extras por molécula de CO2.

456

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

PEROXISOMA

CLOROPLASTO

MITOCONDRIA

FOTORESPIRACION Ribulosa - 1,5 - Bifosfato + O 2 P - Glicolato Glicolato

Fosfoglicolato 3 - Fosfoglicerato + Glioxilato Glicina Glicina

Glicolato

O

O

O CH

H

C

O H

C

O H

O2

H

O

2

C

O P O

O

C HCALVIN P O 2

C

H

C

O H

ATP

CH

O H

2

2

C H O P C H OH H -O-O C O H CH OH 2 2 2 O H H COO COO CCO O Pi

O

O

3-PGlice rato O

C CH

O H 2

O

2

CHO

C

P

COO

O

O

C H2

O

P

NAD

H

C

O

H

C

O H

NADH + H

en el sitio activo

CH 2

CH OH

O

O

Glicerato

P

NH CH OH 3 2 Gliceraldehido - 3 - P HOH C CH C O

2

COO

COO

NAD

O O

C O2

O

CH OH COO

2

COO Ac. Glicólico

+

Intermediario

O

O

O

CH

O H

COO

O

+

HO H 3

O

CH OH 2

P

C

P - Glicolato

P

Ribulosa - 1, 5 - Bi - P

CH OH 2

CHN 2

O

O H

OH O

O

CG + CH N2 H O 3

H Glu O

O

O

ADP H

CH

H

CICLO Ribulosa de -1,5 - di P

C

O HO 2 P 2 2O O

2

Forma Enediólica

O

2

O

O

O H

CH

P

COO

+

NH

3

NH 3

HOH C CH 2 COO

NADH + H

Glicerato

Serina

Serina

Fig. 23 - 10. Tan solo uno de los productos deHidroxipiruvato la actividad dismutásica de la Ribulosa1,5-Bifosfato Carboxilasa puede entrar al Ciclo de Calvin (3-FosfogliceraldehÍdo) Fig. 24 - 14. El Ciclo Fotorespiratorio Glicolato demanda gasto extra de ATP a la célula y no es beneficioso. Se consume O2 y se libera CO2, pero no hay formación de ATP.

Volver al inicio 9) CICLO GLICOLATO

La foto respiración se produce en tres compartimentos de las células de las hojas verdes, el Cloroplasto, la Mitocondria y el Peroxisoma (Fig. 24 - 10). El Fosfoglicolato, se produce en el Cloroplasto como producto de la interacción con el Oxígeno de la Ribulosa-1,5-Bifosfato. Este se defosforila y es transportado al peroxisoma como Glicolato donde por medio de una oxidación directa con Oxígeno forma el Glioxilato y Peróxido de Hidrógeno. El Glioxilato transamina luego con el Ác. Glutámico para formar Glicina, la que viaja a la Mitocondria, donde por cada 2 moléculas de Glicina se formará una de CO2 que va a la atmósfera y otra molécula de Serina. A continuación los tres carbones de la Serina son reenviados al Cloroplasto vía Peroxisoma y entran nuevamente al Ciclo de Calvin como Glicerato después de fosforilarce a 3-Fosfoglicerato.

457

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Volver al inicio

9) PLANTAS DEL TIPO C4. El mecanismo denominado C4 ocurre en plantas de las zonas tropicales y semitropicales como la caña de azúcar y el maíz, que presentan un crecimiento agresivo en condiciones de alta intensidad lumínica y temperaturas superiores a 30oC. La estructura de la hoja se aprecia en la figura 25-10.

CORTE TRANSVERSAL DE UNA HOJA DE UNA PLANTA C 4

MAIZ

ESTOMA

SUPERFICIE

CORONA EXTERNA CUBIERTA CORONA INTERNA

PERIVASCULAR

VASOS

EPIDERMIS INFERIOR

ESTOMA

Fig. 25 - 10. Estructura de las hojas en plantas C4.

Las plantas C4 evolucionaron por ser más eficientes que las C3, ya que la enzima Rubisco a altas temperaturas disminuye la afinidad por el CO2 y actúa como Oxigenasa y no como Carboxilasa, predominando en ellas la foto respiración lo que implica un mayor gasto de ATP. La fijación ocurre en este caso de manera concéntrica hacia el interior. El CO2 se fija a un compuesto de tres carbones en el citoplasma de la célula Mesófila para generar otro de cuatro. Estas células contienen mitocondrias que no poseen la enzima Rubisco (Fig. 26 - 10). A continuación el compuesto portador del CO2 o C4 pasa a las células de la Vaina Vascular o Cubierta Perivascular (parte central que rodea los vasos transportadores) que sí poseen Cloroplastos con la enzima Rubisco. En este lugar se libera el CO2 para que sea tomado por la enzima y lo incorpore al Ciclo de Calvin. Posteriormente el compuesto de tres carbones que resta de esta entrega, vuelve desde las células de la Vaina Vascular al Mesófilo para ser carboxilado nuevamente por más CO2 y

458

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

continuar de esta manera con su transporte cíclico. Este sistema se denomina Ciclo de Hatch y Slack.

SUPERFICIE VAINA VASCULAR

MESOFILO

DE LA

VASOS

HOJA

COO CO

2

HCO 3

FOSFO ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA

CH 2 CH 2 COO Ac. OXALO ACETICO

CH H C

Malato Deshidro genasa HO

COO HO C H

COO H C

Ac. MALICO

2

O

O

P

COO O FOSFO PIRUVATO

Enzima Malica CH3 C

CALVIN

Ac. MALICO

Piruvato Fosfato Dikinasa O

CICLO DE

CH COO

CH COO

O

COO PIRUVATO

CH 3 C O

CO 2

Rubisco

COO PIRUVATO

Organización funcional de las células mesófilas y perivasculares para concentrar y luego fijar el CO2.

Fig 26 - 10. Las Células del Mesófilo se conectan a la Vaina Vascular por medio de las membranas celulares para entregar Malato y recuperar Piruvato.

La Rubisco recibe de manera localizada el CO2, para que lo integre al Ciclo de Calvin y posteriormente a la síntesis de Almidón. El transporte y la incorporación son simultáneos durante el día en la plantas C4. En las plantas C3 se encuentra solo Mesófilo generalizado y no poseen la capa de Vaina Vascular concentradora de la acción. Sin embargo, por cada CO2 que se fije en las C4, se requieren dos ATPs extras comparados a los tres ATPs necesarios empleados por las C3. Esto indica que se requerirá un total de cinco ATPs por cada molécula de CO2 que se fije por este mecanismo, lo que significa desde un punto de vista energético que a las plantas C4 les es más caro fijar el CO2 en comparación a las C3. Este hecho no presenta un mayor problema en las zonas tropicales con exceso de luz y calor o durante el verano cuando las C4 sobrepasan en crecimiento a las C3. Todos los mecanismos anteriores permiten un aumento de 10 a 60 veces en la concentración de CO2, al comparar los mismos tejidos con las plantas C3 y un incremento de dos a tres veces en la eficiencia de los cultivos. Volver al inicio 11) VARIEDAD EN LOS MECANISMOS DE DESCARBOXILACION.

459

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Existen cerca de tres mecanismos distintos para la Descarboxilación en la celulas de la Vaina Vascular en las plantas C4 y cada uno de ellos se distingue por el nombre de la enzima que lleva a cabo esta acción. El primero de ellos se denomina ME-NADP+(Malic Enzyme-NADP), con la Enzima Málica-NADP dependiente (Fig. 27 - 10). En otro tipo de plantas se llama mecanismo de la enzima Fosfoenol-Piruvato Carboxilasa (Fig. 28 - 10) y por último el mecanismo tipo ME-NAD (Malic Enzyme-NAD) con la enzima Málica-NAD dependiente (Fig. 29 - 10).

SUPERFICIE VAINA VASCULAR

MESOFILO

DE LA

VASOS

HOJA Malato Deshidrogenasa

CO 2

COO

COO C H 2 NADPH + H O H C CH 2 CH COO COO NADP Ac. OXALO Ac. MALICO ACETICO

FOSFO HCO 3

ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA

CH H C

2

O

O

P

PIRUVATO

CH

O

ATP

C

3

C

O

3 - Fosfo Glicerato

NADPH +

Enzima Málica NADP Dependiente CH

CH

NADP

COO Ac. MALICO

Piruvato Fosfato Dikinasa

O

COO FOSFO - ENOL

HO

CICLO DE CALVIN

COO C H

CO 2 RUBISCO

3 O

Ribulosa 1, Bifosfato

COO

COO

AMP + PPi

PIRUVATO

PIRUVATO

PRODUCTOS

Fig. 27 - 13. La descarboxilación es por medio de la Enzima Málica dependiente de NADP. SUPERFICIE

MESOFILO

DE LA

VAINA VASCULAR

VASOS

HOJA

CO 2

CICLO DE

Oxalo acetato

Aspártico

Aspártico

FOSFO -

HCO 3

Oxalo acetato

Fosfoenol Piruvato Carboxilasa

ENOL PIRUVA TO CAR -

CALVIN 3 - Fosfo Glicerato

CO 2

BOXILASA RUBISCO

P - Enol Piruvato

Piru vato

Ala

Ala

Piru -

P - Enol

vato

Piruvato

Ribulosa 1,5 Bifosfato

PRODUCTOS

Ala : Alanina

Fig. 28 - 10. La descarboxilación es por medio de la Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa.

460

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

SUPERFICIE VAINA VASCULAR

MESOFILO

DE LA

VASOS

HOJA

CO 2

CICLO DE

Oxalo acetato HC O 3

Oxalo acetato

Asp

CALVIN

Malato 3 - Fosfo Glicerato

FOSFO ENOL

Enzima MALICA-NADdependiente

PIRUVA TO CAR -

CO 2

BOXILASA RUBISCO

P - Enol

Piru -

Piruvato

vato

Ala

Ala

Piru -

Ribulosa 1,5 Bifosfato

vato PRODUCTOS

Fig 29 - 10. En esta descarboxilación se emplea la enzima Málica NAD dependiente.

Volver al inicio

12) LAS PLANTAS CAM. Las plantas CAM se denominan así por "Crassulacean Acid Metabolism" o Metabolismo Ácido de las Crasuláceas (Fig. 30 - 10). Estas plantas pertenecen a climas desérticos y para evitar la deshidratación deben abrir sus estomas durante la noche captando CO2. A continuación lo almacenan como ácido Málico en vacuolas que al día siguiente lo liberan para ser transportado y posteriormente incorporado al Ciclo de Calvin mediante la enzima denominada Rubisco. Las CAM son plantas del tipo suculento, es decir poseen tejidos destinados a retener agua. Así encontramos como exponentes de este mecanismo a la Piña y al Cactus, aunque no relacionadas entre sí, poseen el mismo mecanismo metabólico para fijar CO2. Cuando lo estomas se encuentran abiertos durante la noche el CO2 se fija por medio de la enzima Fosfoenolpiruvato Carboxilasa al Fosfoenol Piruvato para formar el Ac. Oxaloacético. Este último por acción de la Malato Deshidrogenasa, es luego reducido a ácido Málico, el que se almacena en una vacuola durante la noche para evitar así trastornos de pH. Durante el día se lo libera gradualmente cuando los estomas se encuentran cerrados y no se intercambian gases, ni se pierde agua. Durante esta etapa el ác. Málico difunde desde la vacuola al citoplasma donde sé descarboxila por medio de la enzima Málica NAD o NADP dependiente, pasando a Piruvato. El CO2 liberado por esta reacción ingresa al Cloroplasto donde es fijado por la Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa entrando al Ciclo de Calvin. El Piruvato que resta de la descarboxilación del Malato entra a la Mitocondria (Fig. 30-13), donde participa del Ciclo de Krebs que aporta con otra cantidad de CO2, que pasa al Cloroplasto para ser integrado nuevamente al Ciclo de Calvin.

461

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Separación Temporal de los Procesos de Fijación de CO2 . NOCHE

DIA Cierre de los Estomas Sale el Malato de la vacuola

Estomas abiertos

CO 2

Fosfo Enol

Ribulosa - 1,5 Bi - P

Piruvato

Carboxilasa

Carboxilasa CO FEP 2

AOA

CO

Piruvato - P Diquinasa ATP + Pi

2

Piruvato

Malato

HC

AMP + PP i

CO

HC

CALVIN

FEP Fosfo Enol -

Enzima Málica NAD o NADP

2

CLOROPLASTO

CO

Piruvato

2

dependiente Malato VACUOLA

Piruvato

KREBS

CO

2

Ac CoA

El Malato se almacena en la vacuola durante

MITOCONDRIA

la NOCHE

Fig. 30 - 10. La fijación de CO2 mediante la formación de Ác. Málico ocurre solo en la noche. Durante el día el Ác. Málico entrega el CO2 al Ciclo de Calvin

Según el estado energético del metabolismo de la planta el Piruvato puede ser tomado por la enzima Piruvato Fosfato Diquinasa que lo transforma en Fosfoenolpiruvato y desde allí continúa hacia la Gluconeogénesis (Fig. 30 - 10). Volver al inicio 13) FIJACIÓN DEL NITROGENO. Algunas plantas son incapaces de fijar el gas Nitrógeno por si mismas y para hacerlo requieren de la cooperación de microorganismos simbiontes o de la presencia de fertilizantes nitrogenados. En la Figura 31 - 10, se puede apreciar el Ciclo del Nitrógeno, donde este es fijado desde la atmósfera y reducido por las bacterias en Amonio NH4+. El amonio puede pasar a formar parte de organismos superiores, sin embargo las bacterias del suelo durante el proceso de Nitrificación lo pueden oxidar a Nitrito NO2- (Nitrosomonas) y posteriormente pasarlo a Nitrato por las Nitrobacter. A su vez las plantas pueden asimilar formas inorgánicas de Nitrógeno como Nitrato o Nitrito, que por medio de la Nitrato Reductasa en el citoplasma y la Nitrito Reductasa en el

462

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Cloroplasto pueden transformarlo en Amonio. Otras formas orgánicas de nitrógeno como la Urea, también pueden ser asimiladas por la planta. En la planta el amonio se incorpora a los cetoácidos formando especialmente el aminoácido Glutámico y la Glutamina que se emplean como transportadores primarios de nitrógeno junto al Aspartato y la Asparegina. De esta manera se producen todos los aminoácidos en la planta que puede ser ingerida por los animales donde se enriquece y multiplica su contenido. Durante el proceso llamado Desnitrificación, los animales en estado de putrefacción retornan Amonio al suelo por acción de los microorganismos y este puede nuevamente pasar a Nitrito primero y luego a Nitrato completando el Ciclo.

N2 Bacterias Desnitrificantes

SUELO

N2

ATMOSFERA

Bacterias fijadoras de Nitrógeno

Amino ácidos

Plantas Superiores

Animales Superiores Putrefacción

NO 3

Bacterias Nitrificantes Nitrobacter

+ NH

4

Bacterias Nitrificantes Nitrosomonas N O2 Nitrito

Fig 31 - 10. Ciclo del Nitrógeno.

Las Leguminosas como el trébol, alfalfa y soya tienen un papel preponderante en la fijación del Nitrógeno y la bacteria que hace simbiosis con estas plantas pertenece al género RHIZOBIUM. Otra de las bacterias que hace simbiosis pertenece al género Frankia en los Actinorhizoides, sin embargo su metabolismo no ha sido lo suficientemente estudiado al igual que las cianobacterias del género Nostoc. La simbiosis es siempre entre plantas superiores y bacterias o algas azules. La interacción de las bacterias con la raíz ocurre a partir de un intercambio de señales químicas con la planta que concluye en la fijación de estas por los pelos radiculares. La infección por la bacteria se

463

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

manifiesta con una hinchazón y un incremento de la corriente citoplasmática que avanza hasta la base del pelo. A continuación las bacterias penetran por la rotura del tubo y alcanzan las células corticales e inducen la formación del nódulo. Los nódulos tienen aspecto rosado o rojo pardos debido a la presencia de Leghemoglobina. Una vez en el interior las bacterias están rodeadas por una membrana peribacterioide y expresan su actividad Nitrogenásica dirigida por los genes Nif y se denominan ahora simbiosomas. La fijación biológica de Nitrógeno es llevada a cabo por el Complejo de la Nitrogenasa, presente en la bacteria simbionte o simbiosoma (Fig. 32 - 10). A medida que la bacteria entrega Amonio a la planta, esta última le entrega Glucosa para su metabolismo. La fijación del Nitrógeno es extremadamente lábil al O2, ya que uno de sus cofactores Fe-Mo sé denatura irreversiblemente con Oxígeno. Por esta causa se necesita de la proteína Leghemoglobina que fija el O2 y lo encausa para la Fosforilación Oxidativa permitiendo la producción de ATP y sirviendo a la vez como una molécula protectora de los efectos tóxicos del Oxígeno que ayuda a concentrar el Nitrógeno.

XILEMA

FLOEMA

NODULO DE UNA LEGUMONOSA O CITOPLASMA VEGETAL

2

LEGHEMOGLOBINA

O

2

FOTOSINTATO

BACTEROIDE Utilización CARBOHIDRATOS

e Mg ADP

NITROGENASA

AMINOACIDOS

Transporte de Electrones

Mg ATP

NH

H 2O

3

N2 Fig 32 - 10. Nódulo con bacteroide. Fotosintato corresponde a carbohidratos y aminoácidos sintetizados en la hoja de la planta y que son transportados por el xilema a los nódulos de la raíz.

A continuación se aprecia el balance general de la reacción de reducción del Nitrógeno:

N2 + 10 H+ + 8 e + 16Mg-ATP ----> 2 NH4+ + 16Mg-ADP + 16 Pi + H2

464

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

COMPLEJO DE LA NITROGENASA Fijación del Nitrógeno

16 ATP

4 CoA SH + 4 Piruvato

8e

8 Ferredoxina oxidada

8 Dinitrogenasa 8 Dinitrogenasa reductasa reducida

8e

4 C O2 8 Ferredoxina + reducida 4 Acetil SCoA

+ 2NH 4 reductasa reducida 8 e + 16 ATP

8 Dinitrogenasa8 Dinitrogenasa reductasa

reductasa

oxidada

oxidada + 16 ATP

Dinitrogenasa oxidada

8e

H

2

2 H+

Dinitrogenasa reducida

N 2

16 ADP + 16 Pi

Fig. 33 - 10. Complejo de la Nitrogenasa. De los 8 electrones que se emplean, 6 son para la fijación del Nitrógeno y 2 para reducir los dos H+ a Hidrógeno molecular.

La Cadena de reacciones que desemboca en la reducción del Nitrógeno se aprecia en la figura 33-10. La Dinitrogenasa Reductasa de PM 60kD, es un dímero con un centro redox Fe4-S4 y se puede oxidar y reducir mediante un electrón a la vez. Se le conoce también como homodímero Ferro-proteico codifcado por el gen Nif H del bacterioide. La Dinitrogenasa es de PM 240kD y corresponde a un tetrámero con 2 Mo, 32 Fe y 30 S por tetrámero. Se requieren de 8 electrones para el mecanismo de reducción, 6 para reducir el Nitrógeno (Fig. 34 – 10), y 2 para reducir el Hidrógeno. Se le conoce como codificada por los genes Nif D y Nif K del bacterioide. Todos los electrones son pasados de manera individual y secuencialmente en la cadena de reacciones. Los niveles de Oxígeno controlan la expresión de los genes correspondientes a la Nitrogenasa, de esta manera cuando el O2 disminuye en su concentración en el exterior, se activa un sensor transmembrana el cual fosforila y activa a un factor transcripcional en el interior denominado FixJ. Este último induce la transcripción de los genes nifA y fixK cuyos productos de transcripción inducen a su vez la transcripción de los genes involucrados en la formación del complejo de la Nitrogenasa (Nif). La regulación de la actividad Nitrogenásica también depende de los niveles de Amonio, a bajo nivel se estimula y a alto nivel se inhibe. Otro elemento regulador es también la concentración de ADP donde los altos niveles pueden inhibir la actividad del Complejo.

465

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

La fijación del Nitrógeno es bastante exergónica - 8 Kcal/mol de N2

N2 + 3H2 -------> 2NH3

/\Go' = - 8,3 Kcal/mol

Sin embargo, la barrera de energía entre sustratos y producto es alta y en condiciones artificiales se requiere de grandes presiones y temperaturas. En la forma biológica se precisa de tan solo 16 ATPs por mol de N2 a 1 atm de presión. El ATP tiene aquí dos funciones una termodinámica y la otra catalítica, es decir la unión al ATP aumenta el potencial de óxido-reducción de -280 mV a -490 mV, con lo que se aumenta el poder de reducción o la entrega de electrones.

2e N

N

2e

NH

2H+

2e NH NH2 NH 2 NH3 2 2H+ 2H+

Fig. 34 - 10. Los 6 electrones reducen a la molécula de Nitrógeno.

El Amonio producido por el Complejo de la Nitrogenasa se integra a los aminoácidos de la planta por aquella reacción de la Glutámico Deshidrogenasa en que el Ac. Alfa-Cetoglutárico, se amina en presencia de NADPH + H para formar Glutámico. El Ac. Glutámico puede aún aminarse nuevamente con ATP y Amonio para producir Glutamina. El Ac. Glutámico o la glutamina pueden transferir a su vez el grupo amonio a otros cetoácidos por transaminación en reacciones similares a las descritas en el capítulo de síntesis y degradación de aminoácidos. Otro de los aminoácidos encargado del transporte de amonio en la planta es el Aspártico que se forma por aminación del ácido Oxaloacético. El Aspártico también puede formar el aminoácido Asparegina que se emplea como vía alternativa para transportar el amonio a otros lugares en la planta. Entre las bacterias no simbiontes que fijan Nitrógeno se encuentran las Azotobacter, Clostridium, la bacteria fotosintética Rhodospirillum Rubrum y las Cianobacterias como la Anabaena.

466

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Volver al inicio 14) FLUORESCENCIA Los procesos que ocurren en la antena durante la Fotosíntesis se pueden ilustrar bajo la siguiente aproximación: Existen en la actualidad algunas técnicas para analizar la organización y la función del aparato Fotosintético en plantas y algas, que se pueden emplear tanto en el laboratorio como en el terreno para estudiar una serie de parámetros útiles tales como: la senescencia de la fruta, el efecto de los aceptores de electrones artificiales, el estrés de la planta frente a los herbicidas, el efecto del calor, la falta de agua y la mayor o menor concentración de CO2 en el aire. Los métodos que se emplean para conocer la influencia de estos factores sobre la planta hacen uso de la medición de la Fluorescencia emitida por la hoja, bajo distintas condiciones de luz tanto limitante como saturante. Esta particularidad afecta el número de trampas fotoquímicas abiertas, (fig35-14) bajo distintas condiciones de luz dando una idea de la actividad fotosintética de la planta.

T R A M P A S F O T O Q U IM IC A S E X C IT A C IO N

F O T O R E A C C IO N

T R A M P A S F O T O Q U IM IC A S C E R R A D A S E X C IT A C IO N

F L U O R E S C E N C IA V IA S D E D IS IP A C IO N N O R A D IA N T E S

Fig. 35 – 10. Vías por las cuales se aprovecha y/o se libera la energía según se encuentren las trampas fotoquímicas abiertas o cerradas en la antena.

Cuando un fotón de luz es recibido por una molécula de Clorofila, se promueve un electrón a un nivel superior de energía, esta nueva posición es inestable por lo tanto se relaja pasando a un nivel de menor energía o estado basal. En este momento se produce la liberación de la energía absorbida que puede seguir distintos caminos(Fig. 36 - 10), como son: a) la transferencia a una trampa fotoquímica abierta la que conducirá al excitón a ser transformado en energía química útil o fotosíntesis. b) la disipación de la energía en la forma de calor. c) la re-emisión de la energía por medio de la transformación de la energía incidente en energía radiante de una longitud de onda distinta, como es la fluorescencia.

467

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Por lo tanto la mayor o menor Fluorescencia producida por la hoja resulta de la competición entre las distintas vías por llevarse la energía de excitación capturada por la antena. Parte de la energía se aprovecha por la vía fotosintética que tiene la constante de velocidad kp y la otra parte se disipa por la vía del calor que tiene la constante de velocidad kd. Otra fracción de energía se pierde por fluorescencia (F%) con la constante de velocidad kf. Esta última fracción se relaciona con las distintas constantes de velocidad de seudo-primer orden y se puede expresar como se observa en la Ecuación 1:

Ecuación 1 F% =

kf (fluorescencia) --------------------------------------------------------------------kf(fluorescencia) + kp(fotosíntesis) + kd(calor)

De esta forma la Fluorescencia dependerá de los componentes que se observan en la Ecuación 2:

Ecuación 2 ( Fv)máx =

Fvariable (fluores. est. estable)

+ qP (Fv) sat + (fracción de energía que se disipa en la fotosíntesis o trabajo útil)

+ +

qN (Fv)máx ( fracción de energía que se disipa por calor)

En la Ecuación 2, qP y qN son los denominados ¨quenching¨ o factores de extinción de la energía que corresponde a la Fluorescencia por medio de los procesos que ocurren desde la antena misma hacia el sistema colector N o la Fluorescencia que se extingue desde el sistema colector de la antena hacia la cadena de transporte de electrones P, durante la fotosíntesis. Mientras más expedito sea el flujo de energía hacia el sistema colector de la antena y desde allí hacia la fotosíntesis, qN y qP serán respectivamente menores.

En la misma Ecuación 2, (Fv)máx o total corresponde a la Fluorescencia máxima, que es igual a la sumatoria de la fluorescencia variable (Fv) o en estado estable, más la contribución que hace la fracción ( qP (Fv)sat) de la fluorescencia que se disipa durante el trabajo fotosintético, más (qN (Fv)máx ) o la fracción de la fluorescencia que se disipa por calor en la misma antena.

Cualquier cambio en la Fluorescencia misma, significa la participación de las vías competitivas en el empleo útil de la energía como lo son la fotosíntesis misma y el inútil como la disipación en forma de calor (Fig. 36-14) y que se relacionan con el estado en que se encuentra la planta frente a la intensidad de la luz, humedad, temperatura, etc.

468

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Fotosíntesis

ENERGIA

Calor

Fluorescencia Fig. 36 - 10. El flujo de la energía hacia sus distintos procesos puede aumentar o disminuir por la reversibilidad y competición entre las vías. Para medir la fluorescencia en la forma más básica o elemental se procede a iluminar la hoja de la planta o bien una suspensión de Cloroplastos con una luz con filtro rojo capaz de excitar a la Clorofila, además de un detector representado por un fotomultiplicador o fotodiodo con un segundo filtro, que permite el paso de la luz re-emitida de longitud de onda mayor que la incidente, es decir mayor de 700nm. Como la luz de la fluorescencia es de electrones que tienen poca energía la longitud de onda que emiten es de más allá del rojo, de esta manera el detector tomará en gran parte la fluorescencia y no la luz empleada para excitar a la Clorofila. Por otro lado para disminuir el efecto anterior provocado por la luz incidente, es también posible aplicar luz de 400nm y detectar fluorescencia desde 690 a 700 nm. Sin embargo, la señal detectada dependerá de la intensidad de la luz incidente empleada para la excitación y cualquiera luz ambiente que se filtre puede alterar las mediciones. Para mejorar el sistema de medición a lo anteriormente descrito, es necesario recurrir a un sistema que emplea luz modulada, es decir esta se prende y se apaga en pulsos de alta frecuencia, mientras que la señal de la fluorescencia se mide con un detector calibrado para captar la diferencia entre la luz absorbida con y sin luz modulada. De esta manera se puede obtener la eficiencia relativa de la fluorescencia de la Clorofila como se verá más adelante en presencia de iluminación ambiental.

15) FACTORES qP y qN La extinción de la fluorescencia (Ecuación 2) o la disipación de la energía llamada “quenching” se produce por dos mecanismos principales (Fig. 37 – 10). El primero de ellos denominado qP o ¨quenching fotosintéticos , este ocurre cuando todas las trampas se encuentran abiertas y la fluorescencia es mínima, es decir cuando se aplica luz limitante para que la energía absorbida por la antena abierta sea transferida totalmente al centro de reacción en la forma de estado estable.

469

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

qP

T ra n s fe re n c ia d e e n e rg ía e n tre lo s c o m p o n e n te s d e la A N T E N A

qN F

F

CEN TR O DE R E A C C IO N

CENTR O DE R E A C C IO N

L A E N E R G IA P A S A E N E S T A D O ESTAB LE AL C ENTRO D E R E A C C IO N y S O L O S E D IS IP A C O M O F L U O R E S C E N C IA ( F ) C UAND O Q a SE ENCU EN TRA T O T A L M E N T E R E D U C ID O

L A E N E R G IA S E D IS IP A C O M O F L U O R E S C E N C IA (F ) A N T E S D E E N T R A R A L C E N T R O D E R E A C C IO N

Fig. 37 - 10. Los dos casos por los cuales se disipa la energía como fluorescencia F.

En el caso de que la Plastoquinona (Ca) se encuentre totalmente reducida o cuando el flujo de fotones excede la capacidad de reoxidación de la Plastoquinona, se tiene la fluorescencia máxima (Fmáx), es decir se pierde la energía que no se aprovecha en el proceso de fotosíntesis en la forma de fluorescencia. Aunque la fluorescencia máxima (Fmáx), también se puede obtener por inducción, mediante la presencia de DCMU (Diurón) que inhibe la reducción del pool de Plastoquinona, elevándose de esta manera la Fluorescencia desde un bajo nivel en estado estable hasta un máximo con DCMU. En este punto kp(fotosíntesis) en la Ecuación 1 es de 0 ya que la producción de fluorescencia ha aumentado. P 680 + Q a re d

Q b ox.

DCMU

e le c tr ó n Qa ox P 680

Fig. 38 – 10. Efecto del Diurno (DCMU).

470

Q b re d

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Las técnicas empleadas para medir la Fluorescencia permiten medir una serie de datos como lo son la fluorescencia mínima (Fo) y la máxima (Fmáx) relacionadas con el estado de la planta. El primero de ellos Fo, se obtiene con iluminación extremadamente débil de tal manera que se produzca un nivel de fluorescencia aproximado al que se tiene cuando la planta se ha adaptado a la oscuridad, es decir cuando la totalidad de la Plastoquinona Qa se encuentra oxidada. Por otro lado Fmáx es la producción de máxima fluorescencia y se obtiene después de un pulso saturante de luz o con DCMU, cuando todos los mecanismos de extinción (quenching) se encuentran en cero. A continuación se procede a emplear luz actínica (ambiental) de la intensidad necesaria para empujar la fotosíntesis y pulsos de luz saturantes superimpuestos a intervalos apropiados. Cada pulso saturante hace que Qa se encuentre totalmente reducida y el primero de ellos dará como respuesta una fluorescencia similar a la máxima, Fmáx y desde allí en adelante descenderá debido a la extinción o quenching provocado por el componente que toma energía para generar el gradiente de protones o ¨quenching¨ qE, que es un componente de qP. El mismo efecto anterior también se puede lograr con luz modulada en cortos destellos de alta intensidad, la que debido al tiempo de relajación que se toma el PSII, es decir el tiempo que toma en recuperarse antes de adquirir la capacidad de reaccionar nuevamente (debido a que atrapa la energía de excitación, transfiere los electrones y pasa de reducido a oxidado), si la luz llega antes de que esto ocurra, puede no responder lo que hará que aumente la fluorescencia. Ahora si la luz es lo suficientemente fuerte o saturante, todos los centros de reacción se encontrarán cerrados y el valor de kp (fotosíntesis) se aproximará a 0, aumentando la fracción de energía que se disipa por fluorescencia (kf). En este caso, se evita la disipación por calor al hacer que los destellos sean de corta duración, de manera que kd (calor) es también igual a 0, ya que esta última vía de disipación se activa cuando se aplica más luz de lo que se emplea para fijar el CO2. La técnica para alcanzar el efecto anterior se llama “light doubling” y los periodos de luz son de aproximadamente 1 segundo. Como se dijo anteriormente, los pulsos cortos evitan que se dispare el mecanismo de disipación de la energía destinada a la fluorescencia en calor. Más aún el número de trampas fotosintéticas o PSII abiertos depende en general de la intensidad de la luz y la velocidad con que el centro se abre. El equilibrio se alcanza cuando el número de centros cerrados es determinado por el balance de la excitación y la velocidad de recambio de los centros. Mientras más centros cerrados menos efectiva es la fotosíntesis y hay mayor fluorescencia. Si la fluorescencia estado estable es en un momento Ft y la fluorescencia máxima inmediatamente después de este punto es Fmáx, la eficiencia de la fluorescencia F% (Ecuación 1), será dada por la Ecuación 3:

Ecuación 3 Fmáx Ft ( unos centros abiertos otros cerrados o (Todas los centros cerrados) número centros cerrados estado estable) F% = --------------------------------------------------------------------------------------------------------Fmáx La eficiencia se emplea como índice de la luz absorbida por el centro formado por la antena del PSII.

471

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

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FACTOR

qN

La Fluorescencia se puede extinguir por un proceso no fotosintético denominado qN y que puede ocurrir cuando se ilumina con alta intensidad a la planta que se encontraba en reposo en la oscuridad, haciendo que la energía de excitación en la antena se disipe como fluorescencia antes de llegar al centro de reacción, debido a los mecanismos de protección propios de la antena. Este mecanismo consiste en la de-epoxidación de los carotenos en la antena ( Violaxantina / Zeaxantina) y el reordenamiento de los complejos que capturan la luz en la antena CP24, CP26 y CP29, los que entregan protección a la hoja por ¨quenching¨ no fotoquímico o qN. qN se puede dividir en qE, extinción que depende del gradiente de pH en la membrana tilacoides y qI, extinción atribuida a la formación de zeaxantina en la antena y finalmente qT, extinción o ¨quenching¨ debido a la temperatura.

CICLO DE LAS XANTOFILAS 2 ASCORBATO

VIOLAXANTINA

EPOXIDACION BAJA LUZ pH 7.5

DE –EPOXIDACION LUZ SATURANTE pH 5.1

2 DEHIDROASCORBATO

2 NADP +2 H2O

ZEAXANTINA

2 NADPH + 2 O2

Fig. 39 – 10. Ciclo de las Xantófilas para la Violaxantina de la antena en la membrana Tilacoides. El gradiente de pH percibe el exceso de luz y estimula la emisión de calor para evadir el efecto nocivo de esta condición. Los cambios asociados al PSII debidos a qE ocurren en la antena cuando aumenta la intensidad de la luz lo que se puede traducir en un aumento del gradiente de pH, seguido por una protonación de los residuos carboxilos de las subunidades menores del PSII, lo que lleva a la de-epoxidación de la violaxantina (carotenoide) a zeaxantina ( de amarillo a rojo) por activación de la enzima Violaxantina De-Epoxidasa (VDE)ubicada en el lúmen de la membrana tilacoides. Esto se traduce en

472

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

una disminución de la brillantez del PSII y eliminación de calor asociado a un cambio en la organización de las moléculas, acercándose a su vez las moléculas de Clorofila a las de Xantófila. Posteriormente en la oscuridad la Zeaxantina pasa nuevamente a Violaxantina constituyendo este proceso repetitivo el Ciclo de las Xantófilas en Figuras 3710,10). La disipación de la energía puede ocurrir mediante el reordenamiento de las Clorofilas que reciben la luz como también por el manejo de ciertos pigmentos como son los carotenos ( Ciclo Xantófilas) con lo cual se impide la fotoinhibición o la fotodestrucción del PSII. En ambos casos la energía se disipa como calor (kd). Estos cambios afectarán a la producción estado estable de fluorescencia, la que también es afectada por cambios en la fotosíntesis, pero no a la fluorescencia máxima Fmáx. Por lo tanto Fmáx sirve de punto de referencia para observar cambios en la disipación por calor (kd). El punto de referencia que se usa es el valor de Fmáx medido después de la aclimatación de la hoja a la oscuridad por unos 10min o por 24 hrs. Los cambios en la disipación del calor pueden ser expresados en la Ecuación 4:

Ecuación 4 (Fmáx de la hoja adaptada a la oscuridad (o) - (Fmáx hoja estado estable (t) NPQ o qN =-------------------------------------------------------------------------------------------------Fmáx (t) NPQ : ¨Non photochemical quenching¨ Fmáx(o) es la fluorescencia máxima en la hoja adaptada a la oscuridad y Fmáx (t) es la fluorescencia máxima en el tiempo t. Si Fmáx (t) aumenta se produce un aumento de la extinción de la energía o quenching calórico y disminuye la fluorescencia a causa de este factor.

Beta-Caroteno

HO

OH

Zeaxantina

Fig. 40 – 10. Carotenoides En general, la Zeaxantina se encuentra relacionada con el mecanismo de defensa frente al estrés producido por la luz en las plantas, ya que el Ciclo de las Xantófilas es una forma de adaptación producida durante la evolución que le confiere a la planta resistencia a los cambios climáticos estacionales.

ALGUNOS PARÁMETROS QUE SE PUEDEN MEDIR para observar la eficiencia DE UNA PLANTA bajo distintas condiciones ambientales.

473

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

Fo es la fluorescencia desplegada por una hoja adaptada a la oscuridad en una luz modulada muy débil. (Fv) m es la fluorescencia variable máxima que se observa cuando se aplica un pulso saturante de luz actínica. Fv es la fluorescencia variable observada una vez que luz actínica continua se aplica y (Fv) s son los peaks producidos por la fluorescencia producto de los pulsos de luz saturante Durante la inducción Fv disminuye desde Fm ((Fv)m), debido al grado de extinción provocada por el coeficiente de extinción: Fv = (Fv)m - q(Fv)m

q es el coeficiente de la extinción que varía entre 0 y 1 y equivale a la ecuación: q=1 - (1 - qN) (1 - qP) donde: qP =0, cuando Qa se encuentra 100% reducido no hay empleo de la energía y la fluorescencia es máxima y qN =0, cuando no hay gradiente de protones y no se emplea la energía por esta vía, por otro lado, q =1 cuando la fluorescencia variable Fv se suprime totalmente.

Después de cada pulso de luz saturante la fluorescencia se empuja a (Fv)s ya que qP es eliminado ( Fv)s = Fv + qP(Fv)s (Fv)s desciende de un máximo debido a la generación de un gradiente de protones asociado al qN (Fv)s= (Fv)m - qN(Fv)m Fv = (Fv)m - qN(Fv)m - qP(Fv)s

y finalmente Fv = (1-qN) (1- qP) (Fv)m Donde:

qP

(Fv)s - Fv = ------------------------

474

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

(Fv)s (Fv)m - (Fv)s qN = ------------------------(Fv)m Fv 1 - qP = ---------------(Fv)s

(Fv)s 1 - qN = --------------(Fv)m El valor de Fv/Fm es considerado como la Eficiencia cuántica máxima de PSII. Fv es la fluorescencia variable que es igual a (Fm - Fo). Fs, es la fluorescencia de la planta adaptada a la luz o señal estado estable con luz limitante. Fm', es la señal cuando Qa se encuentra totalmente reducida en la fotosíntesis (detenida) o la producción de fluorescencia después de un pulso saturante de luz. Fo', es la señal cuando Qa se encuentra totalmente oxidado con luz de fondo al extremo rojo en la fotosíntesis. E es la eficiencia cuántica de PSII. Eficiencia cuántica máxima de PSII o Phi(PSII)

Fm - Fo Fv E = ------------------ = ----Fm Fm

E¨ es la eficiencia de la antena de PSII. Eficiencia de la antena

Fm´ - Fo´ Fv´ E¨ = ----------------- = ----Fm´ Fm´

Del valor de los parámetros examinados hasta aquí dependerá, como se dijo al principio el estado de la planta frente a las condiciones ambientales de luz, humedad, temperatura y senescencia.

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475

al

Héctor Rocha L. Fotosíntesis

REFERENCIAS Fotosíntesis., C.S. Andreo y R.H. Vallejos., Monografía No 30, Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos. Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico. Washington, D.C. - 1984. Ribulose-1,5-Biphosphate Carboxilase-Oxygenase., H. M. Miziorko and G.H. Lorimer., Ann.Rew. Biochem. Vol 52, 507-535, 1983. Regulation of Photosynthesis in C3 and C4 Plants: A Molecular Approach. R.T. Furbank and W.C. Taylor ., The Plant Cell, Vol 7, 797-807, 1995. Rubisco Synthesis, Assembly, Mechanism and Regulation. S. Gutteridge and A.A. Gatenby ., The Plant Cell, Vol 7, 809-819, 1995. Clorophyll Biosynthesis. Ditter von Wettstein, S. Gough and C.G. Kannangara, The Plant Cell, Vol 7, 1039-1057, 1995 . Regulation of Light Harvesting in Green Plants. P.Horton, A.V.Ruban and R. G. Walters, Plant. Physiol. 106: 415-420, 1994. Oxidative Stress, http:// www.agronomy.psu.edu/Courses/AGRO518/Oxygen.htm

476

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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479

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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LÍPIDOS 1) LOS LIPIDOS 483 2) ACIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS 486 3) TRANSPORTE DE LOS LIPIDOS EN EL ORGANISMO 490 a) CICLO EXOGENO 491 b) CICLO ENDOGENO 493 4) APOPROTEÍNAS 5) DISLIPIDEMIAS

496 497

6) TEJIDOS INVOLUCRADOS EN EL MANEJO DE LOS LIPIDOS 499 7) DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES Y β-OXIDACIÓN DE LOS ACIDOS GRASOS 505 8) OXIDACIÓN EN LOS PEROXISOMAS 9) 10)

ω - OXIDACIÓN α - OXIDACIÓN

512

514 515

11) FORMACION DE CUERPOS CETONICOS 12) SINTESIS DE ÁCIDOS GRASOS

516

519

13) ELONGACION E INSATURACION DE LOS ACIDOS GRASOS 525 14) INSATURACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS 525 15) SINTESIS DE TRIACILGLICEROLES

527

16) SINTESIS DE FOSFOLIPIDOS 528 17) SINTESIS DE ESFINGOLIPIDOS 530 18) DERIVADOS DEL ACIDO ARAQUIDONICO QUE COMPRENDEN A LOS EICOSANOIDES CONOCIDOS COMO PROSTAGLANDINAS, TROMBOXANOS Y LEUCOTRIENOS 532

480

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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19) CONTROL DE LA SINTESIS DE LOS ACIDOS GRASOS 533 20) DIFERENCIA ENTRE SINTESIS Y OXIDACION DE ACIDOS GRASOS 534 21) EL COLESTEROL

535

22) CONTROL SOBRE LA HMG-CoA REDUCTASA 23) SÍNTESIS DEL COLESTEROL

538

541

24) SÍNTESIS DE LAS SALES BILIARES

545

25) FENOTIPO DE CINTURA HIPERTRIGLICERIDÉMICA U OBESIDAD VISCERAL 546

481

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

1) LOS LIPIDOS. Constituyen una familia amplia y heterogénea que cumple funciones mucho más variadas que los Hidratos de Carbono. Los Lípidos sirven de reservorio de energía, aislante térmico,

482

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

aislantes de la función conductora y ejercen funciones estructurales. Los Triglicéridos por ejemplo constituyen el tejido adiposo, mientras que los Fosfolípidos constituyen las membranas biológicas que rodean a las células del organismo y a sus organelos. Por otro lado los Glicoesfingolípidos y Cerebrósidos forman parte de la Mielina, sustancia aislante que se encuentra ampliamente distribuida en el sistema nervioso. Algunos otros como la familia de las Prostaglandinas, actúan como hormonas paracrinas o autocrinas. Los lípidos son insolubles en agua y comprenden a todas aquellas moléculas que pueden ser extraídas de los tejidos mediante solventes orgánicos. Así tenemos que entre estos compuestos se pueden encontrar a los triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, cerebrósidos y ceras (Figs. 1 - 10 y 2 - 10).

= TRIPALMITINA TRIACILGLICEROL (TAG)CEREBROSIDO D - GALACTOSA

O ESFINGOSINA AC. PALMITICO H H H C CH C HCCHHCC H HOC H CH CH CH CH C H C H O CH H C H C CC H C2HCCH2H C H C H CH CH CH CH CH CH2 C C C 2 2 2 2 2H 2 2 2 C2H O2 H 3 2 2 2 2 3 22 2 2 2 2 22 2 2 GLICEROL H C O C C H C H C H CH C H C H C H CHH C H CH CH C H CH C2H C H 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OH H 2 3 OH O CH CCH HCH O C CCHCCCH CH CH CH CH CHH CH HHCCHHCCH C HHCH H CCHHC CNHCCC C C H C H CH CH CH C H C H 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 22 2 22 22 2 2 22 H H 2 22 2 2 3 2 2 2 O 3 H OH O AC. OLEICO H H FOSFOLIPIDO (P L) = FOSFATIDIL COLINA

o

OH H

O AC. PALMITICO CERA C C H CH C H CH C H C H CH CH C H CH CH C H CH C H C H 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 O H H H C O C C 2 C 2 C H2 CH2C H2C H2 CH2 CH2C H2CH2 CH2 C H2 CH C H 2C H 2 3 CH C O CH CH O H CCH O CH

GLICEROL HC O

FOS FATO O O P

2

2

3

2

14

O COLINA Ac. PALMITICO CH

2

3

28

Alcohol TRIACONTANOL

2

C H2

Fig. 2 - 10. Estructura química de un Cerebrósido y de una Cera. C H N + CH 3

3

CH

3

ESFINGOLIPIDO ESFINGOSINA H OH C H C H CH C H CH C H CH C H CH C H CH C H CH C C C H 2 2 2 3

2

2

2

2

H C H C H CH C H CH C H CH CH C 3

2

2

2

2

2

2 2

2

2

2

2

COLINA

2

CH O H 3 H + C CH C H CH C H CH C H CH C N C C H O P O C H C H N CH 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 H H 2 O O CH

AC. OLEICO

Fig. 1 - 10. Algunos compuestos representativos de la familia de los Lípidos.

483

3

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

C H3

C H3 C H 3 7 1 2 3

4

6 5

9

13 15 CHO

11 12

C H3

C H3

C H3

10

8

.

C

CH

14

D

2

A

VITAMINA A RETINAL

B C H3 C H3

C H3 H

VITAMINA D

o

C H3

C H3

C H3

o C H3

C H3

o

COLECALCIFEROL

C H3

3

C H3 VITAMINA E o α - TOCOFEROL C H3

C H3

C H3

C H3 CH

o

C H3

3

VITAMINA K 1 - FILOQUINONA

Fig. 3 - 10. Las Vitaminas liposolubles son también clasificadas como Lípidos.

Entre las moléculas clasificadas como lípidos se encuentran las vitaminas A, D, E y K, (Fig. 3 - 10) que se derivan de la vía de los Isoprenos, ampliamente desarrollada en las plantas. Otros de los compuestos considerados como lípidos son de origen esteroidal, siendo el principal de ellos el Colesterol y sus derivados hormonales como la Testosterona, Progesterona y Estradiol, además de las sales biliares, representadas por los ácidos Glicocólico y Taurocólico (Fig. 4a - 10). Por otro lado algunos compuestos lipídicos tienen propiedades fisiológicas moduladoras de la microcirculación de los tejidos, así tenemos a las Prostaglandinas consideradas como segundos mensajeros que afectan la musculatura lisa de los capilares junto a otras moléculas relacionadas, como son los Tromboxanos (Plaquetas) y Leucotrienos (Leucocitos y Macrófagos). Estos últimos derivan de los ácidos grasos poli-insaturados (Fig. 4b - 10) como el Araquidónico y se encuentran relacionados con la agregación de plaquetas y el proceso inflamatorio de los tejidos.

484

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Por otro lado, entre los lípidos también encontramos a las esencias vegetales producidas en la vía de los Isoprenos y Terpenos representados por el Citronelal y el Cineol, ambos pertenecientes al genero Eucaliptus. Entre los terpenos tenemos al Pineno del Pinus Radiata y al Limoneno que se encuentra en la cáscara del limón (Fig. 4c - 10). A pesar de la clasificación algo tendenciosa de las moléculas denominadas lípidos, es O H

a)

C H

3

C H

H C

3

C H

O H

3

H C

3

C

3

C H

C H

3

3

C H O

H N O H

O O

COOH

H O

3

A C . GLICOCOLICO

TE S TO S TE RONA

b)

P RO GE S TE RO NA

O CO O H C H

C O O O 3

O H O

A C. A RA QUIDO NICO E ICO S A TE TRA E NO ICO

c)

T romboxano A2

Terpenos Ac íc lic os y C íc lic os .

CIT RO NE L A L E u ca lip tu s

O H

Prostaglandina

H C

O

O

P INE NO

L IM O NE NO

P in o

L im ó n

CINE O L E u ca lip tu s

Fig. 4a - 10 Estructura de los Esteroides Fig. 4b - 10. Estructura de las Prostaglandinas y Tromboxanos. Fig. 4c - 10. Estructura de algunos Terpenos.

posible encontrar un denominador común mucho más específico. En otras palabras, el precursor de todos los lípidos es nada menos que el Acetil-SCoA (CH3-CO-SCoA). Esta molécula consiste en un par de carbones activado por la Coenzima A y cuyo origen puede estar en la Glucosa, los Aminoácidos o los mismos Ácidos Grasos como producto de la β-Oxidación. Es interesante hacer notar que la unión de varias moléculas de Acetil-SCoA, activadas como MALONIL-SCoA, es a la vez el punto de partida para aquellas vías que sintetizan los ácidos grasos, isoprenos y esteroides. Volver al inicio 2) LOS ACIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS.

485

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Su estructura química está formada por una cola hidrofóbica de carácter alquílico de tamaño variable más una cabeza polar con un carboxilo ionizable (pK 4.8), que les entrega a pH fisiológico el carácter de moléculas amfipáticas 9o hidrofóbico-polares (Fig. Palmitoleico, cis-9-Hexadecanoico, 16:1Δ 5a - 10).

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

Oleico, cis-9-octadecanoico, 18:1Δ9 a)

CH 2

HC 3 CH HC 3

HC 3

HC 3

HC 3

b)

2 CH 2

CH 2

CH 2

CH CH 2

CH 2 CH

CH 2

2

CH 2

CH 2

CH 2

2

2

CH 2

CH CH 2

CH

CH CH

CH

2

CH 2

2

2

CH

2

CH CH

2

2

CH

CH 2

CH 2

2

CH CH

CH 2 CH 2

CH 2

CH CH CH CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 2 2 2

CH 2 CH 2

2

CH CH 2

CH

2

CH 2

2 CH

CH

CH 2

CH 2

CH

2

2

2 CH

2 CH

CH 2

2

CH 2

2

2

CH CH

+

COO

2

2

CH 2

CH 2

CH CH

CH 2

COO

2

CH

2 CH 2

2 CH

CH

+

2

CH CH

Ac. MIRISTICO

H

2

CH 2 CH 2

11

+

COO

CH 2

Ac. LAURICO

H

CH 2

2 COO

CH

2

Ac. PALMITICO

H

2

CH 2

+

Ac. ESTEARICO

H

CH 2 COO

+ H

Ac ARAQUIDICO

o CADENA SATURADA

DOBLE ENLACE CIS 123 o 123 o DOBLE ENLACE TRANS

Fig. 5a - 10.Estructura de los ácidos grasos saturados más comunes. Fig. 5b - 10.Configuración de los dobles enlaces en ácidos grasos insaturados.

Los ácidos grasos son las moléculas más comunes entre todos los lípidos y se encuentran en los productos naturales con un número par de carbones. Pueden poseer una o varias insaturaciones del tipo CIS en su cola alquílica. Estas producen un ángulo de 30o en la cadena que es característico a todos los compuestos naturales de este tipo. Algunos de los ácidos grasos insaturados más comunes son el Palmitoléico y el Oléico (Fig. 5b - 10), con solo una insaturación del tipo CIS (Fig. 6 10). Entre aquellos ácidos grasos con más de una insaturación se encuentran los denominados esenciales (Fig. 7 - 10), que no pueden ser sintetizados por humanos y deben encontrarse presentes en la dieta. Estos ácidos grasos se conocen por los nombres de Linoléico [18: 2 (9,12) ], con 18 carbones e insaturaciones en los carbones 9 y 12, otro de ellos es el Linolénico [18 : 3 (6,9,12)], también con 18 carbones e insaturaciones en los carbones 6, 9 y 12.

Fig. 6 - 10. Estructura de algunos ácidos grasos insaturados.

486

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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Ambos ácidos grasos polinsarturados se encuentran presentes en los aceites vegetales y son a la vez precursores de otro ácido graso esencial como el Ác. Araquidónico [20: 4 (5,8,11,14)], (Fig. 7 - 10), con cuatro insaturaciones. Este último es conocido por ser el precursor directo de las Prostaglandinas. Los ácidos grasos poliinsaturados se pueden nombrar comercialmente desde el grupo metilo o carbono distal denominado ω (Omega) y se acostumbra a decir que el ác. Araquidónico es un ω-6, ya que el primer doble enlace desde el Metilo a Carboxilo queda en el carbono 6 (Tabla I - 10 ). La importancia de la insaturación de los ácidos grasos puede ser fácilmente observada en la constitución de los fosfolípidos de una bicapa. Estas estructuras cuentan con ácidos grasos que les entregan una fluidez y flexibilidad compatible a la temperatura en que el organismo prospera, ya sea del tipo Procarionte o Eucarionte. Las insaturaciones del tipo CIS (fig. 5b10), producen una torsión en la cadena que permite un empaquetamiento separado de las cadenas alquílicas lo cual disminuye las interacciones del tipo hidrofóbicas y Van der Waals, produciendo una membrana mucho más fluida. LIN OLEIC O cis 18

17

16

15

14

13

cis

12

10

LINOLEICO u ω-6 9

8

1

7

6

5

4

3

2

1

H C =HC - CH H- C =HC - CH -CH - CH - CH - CH - CH - CH - COOH CH - CH - CH - CH - CHC H C H CH CH CH C C H C 2H C 2 O H 2 C H C2 H C H C H2 C H 2 3 3 22 2 H C CHH 2 2C H C H 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 O

α - LINOLENICO u ω-3 cis- CH - CH - CH - CH - CH - CH - CH - COOH CH - CH - C = Ccis- CH - C = Ccis-CH - C = C 3 2 H H 2 H H 2 H H 2 2 2 2 2 2 2 LIN OLEN IC O

16

18

17

C H

CH

H C

15

10

12

13

14

H C CH

1

H H C CH C

H C

9

8

7

6

5

4

3

2

1

H C CH C H CH C H CH CH CH C

O H

γ - LINOLENICO u2 ω-62 2 2 2 2 2 O CH - CH - CH - CH - CH -C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - CH - CH - CH - COOH 3 2 2 2 2 H H 2 H H 2 H H 2 2 2 2 3

2

LIN OLEN IC O

ARAQUIDONICO cis cis u ω-6 cis CH - CH - CH - CH - CH - C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - CH - CH - COOH 9 7 13 12 6 10 3 2 18 2 17 2 16 2 H 2 H H1 2 H H8 2 H H 4 2 3 2 2 21 15 H14 5 H 3

C H

2

CH

2

CH CH 2

2

H C

H H C CH CC 2

H H C CH C 2

H C CH

2

CH C H CH C 2

2

2

O H

Fig. 7 - 10. Ácidos grasos esenciales del tipo poli-insaturado. De esta forma es posible mantener una mayor movilidad entre las moléculas que constituyen una bicapa, especialmente en aquellos organismos que toleran bajas temperaturas como peces, plantas e insectos. En ellos las estructuras se mantienen viables a pesar de la escasa agitación térmica. Por otro lado, los ácidos grasos poliinsaturados cis, son deseables para el organismo humano debido al menor número de pasos metabólicos que requieren durante su catabolismo y la capacidad de reducir los

Tabla 1 - 10 ω- 6 (OMEGA-6- Maíz, Girasol, Azafrán)

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Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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CH3

12

C18:2 C18 ∆ 9,12 LINOLEICO

COOH

9

CH3

C20:4 C20 ∆ 5, 8, 11, 14 ARAQUIDONICO

14

11

8

COOH

5

CH3

15

12

9

6

C22:5 C22 ∆ 3, 6, 9, 12, 15 DOCOSAPENTANOICO

COOH

3

ω- 3 (OMEGA-3 –Peces, mariscos, soya, nueces)

CH3 CH3

CH3

15

17

12

14

COOH

9

11

8

(ALA) C18:3 C18 ∆ 9, 12, 15 LINOLENICO (Derivado de plantas)

(EPA) C20:5 C20 ∆ 5, 8, 11, 14, 17 EICOSAPENTANOICO COOH (Origen marino)

5

COOH CH3

19

16

13

10

7

4

(DHA) C22:6 C22 ∆ 4, 7, 10,13,19 DOCOSAHEXANOICO (Origen marino)

depósitos de Colesterol al circular esterificados con éste, debido a que son menos susceptible a depositarse en las paredes de los vasos sanguíneos. Cuando los ácidos grasos son conjugados pueden ser susceptibles al ataque por compuestos aberrantes del Oxígeno (Superóxido O2- y Superhidroxilo OH- ).

488

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Los compuestos aberrantes del Oxígeno se producen cuando la reducción metabólica de la molécula O2 ocurre por un número impar de electrones. Esta reducción es imperfecta y conduce a compuestos de una vida media corta, como lo son el Superóxido y el Superhidroxilo: +e +e +e +e O2--------> O2- ----------> H2O2-----------> OH- -------> H2O Oxígeno Superóxido Peróxido de Super Agua Hidrógeno Hidroxilo Estos compuestos al poseer nubes electrónicas impares son capaces de peroxidar y romper las colas alquílicas de los ácidos grasos en el lugar de los dobles enlaces. Lo hacen de preferencia en aquellas moléculas conjugadas donde los dobles enlaces se encuentran alternados (Fig. 8 - 10). Oxidación de Acido Graso con dobles enlaces Conjugados. Iniciación

β

H C

Iniciación H

H

α

C

C

C

Radical Peroxi

2

H

C

Propagación

H

H

Radical Superhidroxilo

C

C

C

C C

R

C

Ruptura

Radical Alcohoxilo

Radical Peroxi arranca este

H

H

O Ambos Radicales inician reacción en cadena con efecto autocatalítico

O O

C

H

R

C H

C

R

H

C

H C

+

H C

R

O

Ruptura

O H

H

C

R

H Homolítica

H C

C

R

C

R

O

H

Homolítica

O

Protón

Hidroperóxido

O H

Fig. 8 - 10. Los ácidos grasos poli-insaturados pueden ser atacados por los compuestos aberrantes del Oxígeno.

La formación de radicales libres puede ocurrir a distintos niveles del metabolismo aeróbico. Por ejemplo durante el transporte de Oxígeno por la Hemoglobina, parte del O2 abandona al Fe+2 del grupo HEME oxidándolo a Fe+3 (Metahemoglobina), al llevarse un electrón y convertirse en Superóxido O2-. La Hemoglobina oxidada pasa a llamarse ahora Metahemoglobina y solo puede ser reducida nuevamente mediante una reacción catalizada por la enzima Glutatión Reductasa que se encuentra presente en el eritrocito junto al polipéptido denominado Glutatión que cuenta con un grupo reductor -SH destinado a reducir el Fe+3 del grupo Heme y reactivar la molécula nuevamente. En cambio el Superóxido recién formado ( O2- ), puede atacar la membrana del eritrocito e inducir la Hemólisis temprana de este, pero enzimas como la Superóxido Dismutasa y Catalasa actúan de manera concertada para eliminar al compuesto aberrante junto a las Vitaminas C y E ampliamente conocidas por sus propiedades antioxidantes. Superóxido Dismutasa O2- + O2- + 2H+ ------> 2H2O2 + O2

489

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Catalasa 2H2O2 ---------------->2H2O + O2 Una forma de evitar la peroxidación de los ácidos grasos consiste a recurrir al empleo de insaturaciones cada tres carbones del tipo no conjugadas. Lo que es un tanto impracticable a menos que la dieta sea artificial. Las insaturaciones del tipo TRANS, se encuentran solo en los productos sintéticos formados por hidrogenación catalítica y a pesar de que no son naturales, no se ha demostrado que causen daño al organismo. Volver al inicio . 3) TRANSPORTE DE LOS LIPIDOS EN EL ORGANISMO. Los lípidos se distribuyen por el organismo en forma de lipoproteínas, ya que son insolubles en el plasma acuoso. Las lipoproteínas están a su vez constituidas de Apoproteínas (Ver Tabla 2 - 10 de las Apoproteínas y fig. 9 – 10) que se encuentran formadas estructuralmente por un segmento hidrofílico y otra hidrofóbico. Densidad gr/ml HDL Naciente 1,18 HDL3

1,14

HDL2

1,10

LDL

HDL1

1,06

IDL

1,02

Remanente de Quilomicrón

1,006

Quilomicrón 0,95 60

100

140

200

240

280

400

600

800

1000 Diámetro Aº

Fig. 9 - 10. Lipoproteínas del suero

Esta última sección, la hidrofóbica interactúa con los lípidos mientras que la parte hidrofílica se encuentra en contacto con el medio acuoso del plasma. Las apoproteínas se sintetizan en el hígado y se ensamblan con los lípidos tanto aquí como en el intestino. Sus principales funciones son: 1) Empaquetar lípidos en complejos lipoprotéicos.

490

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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2) Activar y modular enzimas hidrolíticas endoteliales que degradan a estos lípidos y que posteriormente los dejan listos para su internalización. 3) Reconocer receptores en diversos órganos para descargar en ellos a los lípidos que transportan. La distribución de los Lípidos por el organismo sigue dos ciclos, uno de ellos es el CICLO EXOGENO con los lípidos de la dieta y el otro es el CICLO ENDOGENO con los lípidos sintetizados por el propio organismo. A continuación se describen ambos: Volver al inicio a) CICLO EXOGENO. Después de una alimentación rica en grasas los lípidos saponificados por las sales biliares, se hidrolizan en el intestino por las Lipasas Pancreáticas formando a su paso por la pared intestinal los Quilomicrones ( Qm ), (Fig. 10 - 10). Esta asociación o complejo lipoproteico contiene las apoproteínas Apo B 48 (proteína estructural) que favorecen la formación del Quilomicrón mismo, junto a las apo E (Ver Tabla I de Apoproteínas) que son los factores de reconocimiento para la unión de CETP : Cholesterol Ester Transfer Protein CLAT : Cholesterol Lecitine Acyl Transferase PLTP: Phospholipid Transfer Protein ABC1: ATP Binding Cassette Protein or Transporter SR-B1: Scavenger Receptor-B1 los remanentes del quilomicrón al hígado. A continuación se encuentran las Apo C2 que activan a la Lipasa Capilar (LPL), para la degradación del Quilomicrón en los capilares de los tejidos y la Apo A1 que activa a la enzima Lecitina-Colesterol Acil Transferasa (LCAT). Además, se encuentran aquí las apoproteínas Apo A2 y A4 que acompañan a una gran cantidad de triglicéridos, fosfolípidos y colesterol. Los Quilomicrones viajan por el sistema linfático ya que su tamaño no les permite atravesar los poros de los capilares sanguíneos y posteriormente penetran a la circulación por la vena subclavia izquierda (ducto torácico), empezando a repartirse hacia los tejidos. De esta manera, pasan al músculo esquelético, tejido adiposo, corazón y glándula mamaria lactante. En los endotelios capilares de cada uno de estos tejidos, la Lipoproteína Lipasa que ha sido activada por la Apo C2 e inhibida por la Apo E, libera del Quilomicrón hacia los tejidos, ácidos grasos y colesterol previa hidrólisis de sus formas esterificadas. Lo que resta de ello, se denomina como remanente de Quilomicrón. Este último es tomado por el hígado mediante receptores específicos que junto a las partículas de Clatrina (Proteína internalizadora en la superficie de la membrana) forman las fosas revestidas, que al interaccionar entre sí internalizan por endocitosis al remanente de Quilomicrón. En el interior pasará a formar un endosoma que luego de asociarse a un lisosoma hidroliza su contenido liberando los ácidos grasos y el colesterol. En aquellos casos donde se observa un plasma lechoso se produce una Hiperquilomicronemia, donde el nivel de los Quilomicrones se eleva por 10-12 hrs después de ingerir alimento. Esta falla, es parte de las Dislipidemias (Tabla II), nombre genérico por el cual se identifican los trastornos en el manejo de los lípidos.

491

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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CICLO EXÓGENO Formación de Qm en el RER de las células epiteliales

Sales Biliaras

Lípido

Micela

Sist. Circulatorio

Sist. Linfático

Entrada por vena subclavia izquierda

Tejido Muscular, Adiposo, Corazón y Mamario

Acción de la Lipoproteína Lipasa activada por Apo C2 de la del Qm

Tejido Muscular, Adiposo, Corazón y Mamario

Acción de la Lipoproteína Lipasa activada por Apo C2 de la VLDL

Triglicérido, Apo B48 ,Colesterol, Apo E Fosfolípido, Apo C2

Triglicéridos Esteres de Colesterol, Apo B 100,

CETP

Apo E

LDL Apo B 100 Colesterol

CE

Transferencia de Fosfolípi-dos por PLTP desde Qm y también Colesterol desde VLDL. Transferencia de Colesterol desde remanente de Qm e IDL. La enzima LCAT esterifica el Colesterol y se guarda en CE el centro

CE

CE

Apo A1 LCAT desde el Hígado

IDL LDL LDL

IDL TRANSFERENCIA DE ESTERES DE COLESTEROL y Apo E Apoproteínas DESDE LAS HDL POR CETP (PRODUCIDA EN EL HÍGADO) A LAS LIPOPROTEÍNAS VLDL, IDL Y LDL QUE CONTIENEN Apo B 100 EN INTERCAMBIO POR TAG

Hepatocito

SR-B1

CE

VLDL

Estan formadas por Fosfolípidos, Apo A1,C-1 ,C-2 , E y LCAT de origen intestinal e hígado

LCAT

Unión al Receptor en el Hepatocito e internalización por endocitosis, degradación lisosómica y reciclaje

Célula No Hepatica

HDL2 Apo B100

Apo A1 Activa a

Quilomicrón

Resto de Quilomicrón Colesterol Apo B48 Apo E

CICLO ENDÓGENO

HDL discoidales o Nacientes

Intestino

CE Apo C2, E y CE CE A1 con LCAT y CE CE, PLTP LCAT y FORMACIÓN DE HDL PLTP CON DISTINTAS DESNSIDADES 3, 2 Y 1. SEGÚN FORMA Y CONTENIDO DE LÍPIDOS

LCAT

C

ABC1

HDL 3

maduras Apo C1,C2,C3 Apo A1, A2, E RECIBEN COLESTEROL QUE SE ESTERIFICA POR LCAT. CE: COLESTEROL ESTERIFICADO EN EL CENTRO RODEADO DE FOSFOLÍPIDOS

HDL1 Apo A1, E

CETP

Fig. 10 - 10. Distribución de los complejos Lipoproteicos en el organismo.

La desaparición de los Quilomicrones, en general depende de varios factores como lo son: a) la presencia de una LPL activa y sin deficiencias b) la presencia de una HDL con Apo CII y Apo E normales (Ver Tabla I de Apoproteínas) c) La presencia de una Proteína Transferidora de Apoproteínas, que posee la HDL y dona a otras lipoproteínas, como lo és el remanente de Quilomicrón y aquellos factores necesarios (Apo E) para mejorar su remoción por el hígado.

492

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Por lo tanto si los Quilomicrones no son procesados correctamente, como es el caso en que la Apo CII falla en activar a la LPL o bien falla el receptor del hígado y no reconoce a la Apo E que acompaña al Quilomicrón, este continúa circulando y aumenta sus niveles por más tiempo produciéndose la Hiperquilomicronemia. Volver

al

inicio b) CICLO ENDOGENO. Los componentes lipídicos internalizados en el ciclo anterior se reagrupan y esterifican volviendo a salir posteriormente del Hígado, junto a los componentes de origen endógeno como los paquetes de VLDL o Lipoproteínas de Muy Baja Densidad (Fig. 10 – 10 y Tabla I de Apoproteínas) que contienen Apo B 100, C y E. La síntesis de estas Apoproteínas se encuentra regulada por la expresión de la Apo B100, la relación entre la enzima ACAT y las enzimas hidrolizadoras del Colesterol más la actividad de la Insulina. La VLDL procede a un nuevo recorrido hacia el tejido adiposo, músculo, corazón y glándula mamaria, donde nuevamente por acción de las enzimas LPL y la LCAT activadas por las correspondientes Apoproteínas hidrolizan los fosfolípidos y ésteres de colesterol para su internalización y posterior esterificación. De forma similar a la anterior se internalizan los productos de la hidrólisis de los paquetes para dejar un remanente de VLDL denominado IDL o Lipoproteína de Densidad Intermedia. La IDL es rica en colesterol esterificado y la mitad es internalizada por endocitosis en el hígado mediante los receptores de la lipoproteína LDL (Lipoproteína de Baja Densidad), ya que ambas poseen la lipoproteína Apo E y pueden interaccionar con los mismos receptores Apo E afines. El resto de las IDL pasa a transformarse en LDL perdiendo su Apo E, la que es de gran afinidad por los receptores del hígado quedando ahora solo con Apo B 100 que presenta una afinidad menor. Esta última es capaz de unirse a receptores periféricos de VLDL nuevamente. Las LDL recién formadas son las que permanecen largo tiempo en circulación y manejan el 65 a 70% del colesterol transportándolo hacia los tejidos periféricos (Fig. 11 - 10).El principal componente de las LDL es la Apo B100 que se une a los receptores de los tejidos periféricos como son los fibroblastos. Estas células tienen receptores que reconocen a la Apo B100 de las LDL y a las Apo E de las HDL1 (Lipoproteínas de Alta Densidad, fracción 1). Cuando el plasma tiene un color amarillo-anaranjado ocurre una Hipercolesterolemia (otra de las Dislipidemias, Tabla II). En este caso la LPL funciona bien, pero el reciclaje del remanente de la Apolipoproteína VLDL o IDL no, ya que pierde su Apo E. De esta manera aumentan las IDL y LDL, incluso algunos pacientes producen otra Apo E (isoforma) con baja afinidad por los receptores. Un efecto similar ocurre durante el síndrome nefrótico, la Diabetes Mellitus donde se produce la Glicosilación de las Apoproteínas y en los casos de Alcoholismo donde ocurre la acetilación de ellas o la falla en su síntesis por el hígado. Por otro lado, la falla genética de los receptores para estas lipoproteínas en el hígado, también impide su internalización, de tal manera que los complejos lipoproteicos vuelven a la circulación y depositan su colesterol en los tejidos periféricos, lo que acarrea la llamada Hipercolesterolemia Familiar (Tabla 3 - 10), enfermedad que se manifiesta por la aparición de ateroesclerosis a temprana edad.

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Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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Las causas por las que se desencadena la Hipercolesterolemia Familiar se pueden atribuir a fallas del receptor en: Colesterol Proteína

H

o

o P

o

o oc

o

Colesterol esterificado

o

Fosfolípidos

LDL Receptores

H o

HMG CoA Reductasa

H o H o

Clatrina

H o H o

1) Fijación de la Apo B 100 a los receptores

H o

H o

Ho

2) Polimerización de las moléculas de Clatrina 3) Endocitosis

ACAT

H o

Receptores a L D L

4) Fusión con Lisosoma, , Hidrólisis de Esteres de Colesterol y Proteínas 5) El Colesterol libre no esterificado inhibe la HMG CoA Reductasa , estimula la Colesterol Acil transferasa e inhibe la síntesis de Receptores.

Fig. 11 - 10. Composición de la partícula de LDL y su internalización en los fibroblastos, donde provoca la inhibición de la síntesis del Colesterol.

a) Su anclaje a la membrana. b) Falta de unión a las LDL, aunque estén los receptores bien anclados. c) Baja afinidad por las LDL. d) No se internaliza el receptor una vez unido a las LDL. e) Ausencia total del receptor para la unión a las LDL. Otra enfermedad relacionada con los lípidos es la Hipercolesterolemia e Hipertrigliceridemia familiar (tipo I I) (Ver Tabla I I I -10). Donde el Colesterol del plasma aumenta al doble, mientras que los triglicéridos de 9 a 10 veces, su principal característica es la existencia de VLDL que contienen Apo B-48, el que se debe encontrar normalmente en los Quilomicrones, ya que se sintetiza en la mucosa intestinal y su presencia anormal en las VLDL sugiere que estas últimas son en realidad remanentes de Quilomicrón, ya que las VLDLs que salen del hígado solo emplean a las Apo B100. Otra de las Dislipidemias, es la Hipertrigliceridemia, que se caracteriza por una falla en la enzima Lipoproteína Lipasa de los endotelios capilares o bien por una falla a nivel de la Apoproteína (Apo C2) que activa a esta enzima. Por esta razón al no ser degradados e internalizados los lípidos permanecen circulando y los Triglicéridos suben sobre los 250 mg/dl en el plasma provocando otras complicaciones, como lo es una Pancreatitis. Las HDL son las lipoproteínas conocidas como buenas, es decir llevan colesterol al hígado para convertirlo en sales biliares, en otras palabras se encargan del transporte reverso. Un nivel elevado de estas lipoproteínas se asocia con longevidad. También se

494

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

encuentran elevadas en algunas razas, como sucede en el caso de esquimales, cuya dieta es rica en grasas y no presentan mayores problemas de oclusión coronaria. La proteína precursora de las HDL es la Apo A1 que proviene del intestino e hígado (Fig. 10 - 11). Esta recibe Fosfolípidos y Colesterol libre formando una partícula discoidal que se encuentra constituida por LCAT que esterifica el colesterol y lo guarda en el centro rodeado de Fosfolípidos. A medida que la enzima LCAT esterifica el colesterol, las HDL toman forma micelar y se separan en varias fracciones. Las fuentes de Colesterol para las HDL son las células muertas, los macrófagos, el recambio de membranas y los remanentes de Quilomicrón, VLDL e IDL. De estos paquetes es también posible obtener algunas de sus Apoproteínas, como la Apo A1 desde los Qm y las Apo C desde las VLDL. La principal fracción de las Lipoproteínas de Alta Densidad es la HDL3, formada por el traspaso de Apoproteínas y lípidos de los remanentes de VLDL y Quilomicrones. La HDL3 esta formada por las apoproteínas Apo A1, A2 y las Apo C1, C2 y C3. Este paquete o complejo recibe Colesterol de células muertas y macrófagos, que luego se esterifica con LCAT y al mismo tiempo recibe lípidos proveniente de los recambios de membranas por la PLTP (Proteína transferidora de Fosfolípidos). Después de cargada pasará a dar origen a la HDL2, esta última fracción es finalmente atrapada por el hígado, mediante el receptor atrapador B1 (SR-B1). Otra de las fracciones similares a las anteriores es la HDL1 con Apo E, este complejo es rico en ésteres de colesterol por lo que puede volver al hígado y entregar colesterol, para la síntesis de ácidos biliares o hacer transferencia de lípidos y Apoproteínas a las IDL. Sin embargo, su rol principal parece ser el desplazar competitivamente a las LDL de los receptores periféricos para las Apoproteínas B y E, evitando de esta manera la captación de las LDL. Esto se debe a que el complejo Apo E- HDL1 ocupa los cuatro sitios de unión del receptor destinado a las Apoproteínas B y E que forman parte de cada uno de los cuatro complejos de LDL. En resumen, el Transporte de Colesterol Reverso desde los tejidos periféricos hacia el Hígado, parte con los macrófagos, que han atrapado colesterol y que luego lo ceden al hidrolizar su éster dejándolo como Colesterol libre. Este último es sacado de la célula y transferido por la proteína ABC1 o ATP- Binding Cassette Protein, hacia las Apo A1 circulantes constituyendo las HDL nacientes de forma discoidal. Por otro lado, mediante la acción de la LCAT (Lecitina Colesterol Acil Transferasa ), se esterifica el Colesterol libre y se guarda en el centro de la HDL naciente, quedando rodeado por una capa de Fosfolípidos. Ahora pasa a constituir una HDL3 o madura de forma esférica. Este complejo lipoproteico, puede a su vez ser internalizado en el Hígado por la Proteína “Scavenger” (atrapadora) , la cual actúa como receptor (SR-B1). Posteriormente el Colesterol en el Hígado se dirige a formar las sales biliares. Volver inicio

4) APOPROTEÍNAS TABLA 2 -10

495

al

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

APOPROTEÍNAS Apo A-1 Apo A-2 Apo A-4 Apo B48

Apo B100

Apo C-1 Apo C-2 Apo C-3

PMs kDs 29,0

.

LIPOPROTEÍNA DONDE SE ASOCIA

Quilomicrones y en gran proporción en HDL 17,4 Quilomicrones y en mayor proporción en HDL 46,0 Quilomicrones y HDL 241,0 Quilomicrones

FUNCION

Activa a la LCAT (Lecitina Colesterol Acil Transferasa) Activa Lipasas Hepáticas En Lipoproteínas ricas en TAG

Prot. Estructural. Se deriva del gen de la Apo B100 y se obtiene por edición o recorte del RNA transcrito primario en el epitelio intestinal. Carece del dominio de unión al receptor, presente en la Apo B 100. 513,0 VLDL, IDL y LDL. Prot. Estructural. Se une al receptor de las En mayor LDL. Es una de las proteínas más largas proporción en LDL. conocidas. Se une con baja afinidad a receptor LDL en el hígado 7,6 Quilomicrones, Activa a LCAT VLDL, IDL y HDL 8,9 Quilomicrones, Activa a la Lipoproteína Lipasa endotelial VLDL, IDL y HDL (LPL) 8,7 Quilomicrones, Inhibe a la Lipoproteína Lipasa endotelial VLDL, IDL y HDL (LPL) o 20,0 HDL Paso de esteres de Colesterol a las HDL

CETP Proteína Transferidora de Colesterol o Apo D Apo E (tiene 34,0 3 alelos con varias isoformas) Apo H 50,0 Apo (a)

Remanentes de Se une al receptor LDL en el hígado con Quilomicrón, VLDL, alta afinidad. Uno de sus alelos se IDL y HDL encuentra en alta proporción en personas susceptibles al Alzheimer. Quilomicrones Metabolismo de los TAG Apo (a)- LDL: forma Unida por puente disulfuro a la Apo B100. la Lipoproteína (a) Lleva Colesterol a los sitios de daño vascular. Unida a LDL es asociada a Aterosclerosis y enf. Coronaria.

Las HDL como un todo, poseen gran cantidad de otras lipoproteínas, así tenemos a las Apo A1 que activan LCAT y a las Apo A2, A4, C1 y C2 que activan a la LPLPasa y a la Apo C3 que la inhiben. También cuentan con la Apo D y Apo E que activan la remoción de Qms y VLDLs.

496

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La enzima LCAT es otro componente de este paquete y se sabe que las HDL también pueden pasar ésteres de Colesterol a las LDL por medio de una proteína lanzadera CETP (CETP: Cholesterol Ester Transfer Protein). Volver al inicio 5) DISLIPIDEMIAS TABLA 3 -10 TIPO Hipercolesterolemia Familiar Tipo I

DESORDEN Deficiencia de la enzima Lipoproteína Lipasa (LPL)

DEFECTO Falla síntesis LPL o LPL mutada o bien deficiencia de Apo C I I

Hipercolesterolemia Familiar Tipo I I

Receptores con baja afinidad o baja capacidad de anclaje a la membrana o bien no se internalizan una ves unidos a las Lipoproteínas Deficiencia de Apoproteína E

Defectos en los receptores de LDL

Disbetaliproproteinemia Familiar Tipo I I I o enfermedad de la eliminación de los remanentes de VLDL y Qms

Hiperaciltrigliceridemia Familiar o Tipo IV

Exceso de VLDL

Tipo V Familiar

Niveles elevados de Colesterol y

Apo E anormal. Pacientes con Apo E2, que interactúa pobremente con el receptor

CARACTERÍSTICAS Clearance de Qm lento, niveles reducidos de LDL y HDL. Se trata con dieta baja en grasa y carbohidratos, no hay riesgo de enfermedad coronaria Clearance reducido de LDL produce una hipercolesterolemia que lleva a la aterosclerosis y enfermedad coronaria

Exceso de lípidos circulando causa Xantomas, Hipercolesterolemia y aterosclerosis en arterias periféricas y coronarias debido a elevados niveles de Qms y VLDLs Elevado nivel de Asociada con Diabetes VLDL asociado Mellitus Tipo II, con intolerancia obesidad, alcoholismo y a la Glucosa e administración de hiperinsulinemia progestágenos. Se observa un colesterol elevado como resultado del aumento de las VLDL debido a Hiperaciltrigliceridemia motivos Hipercolesterolemia desconocidos Con disminución de

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VLDLs Niveles aumentados de HDLs Hiperbetalipoproteinemia Producción familiar o Tipo I I elevada de LDL y Clearance retardado de TAG y AGs Apo B ligante-defectuoso Afinidad familiar disminuida de LDL por su receptor Hiperalfalipoproteinemia Familiar

Deficiencia Familiar de LCAT

Ausencia de LCAT

Enf. De Wolman

Falla en el Lisosoma la Hidrolasa de esteres de Colesterol Falla o esta ausente la TAG-Lipasa

Deficiencia de la Triacilglicerol Lipasa Hepática liberada por Heparina

Causas genéticas

LDLs y HDLs Buena salud y longevidad Asociado a enf. Coronaria

2 mutaciones diferentes Gln por Arg (3500) y Cys por Arg (3531)

Aumento dramático de LDL, no se afectan las HDL, VLDL y TAG plasmáticos. Producen Hipercolesterolemia y enf. Coronaria prematura Las HDL no Clearance reducido de pueden capturar LDL que conduce a Colesterol sin hipercolesterolemia con LCAT aterosclerosis y enf, coronaria Afecta metabolismo de LDLs Acumulación de HDL ricas en TAG y de remanentes de VLDL o IDLs

Xantomas y enf. coronaria

La falla de algunas de las Apoproteínas como la disponibilidad de la E o la C, las Lipoproteínas Lipasas, la Lecitina Colesterol Acil Transferasa, por nombrar algunas provocan las enfermedades conocidas como Dislipidemias, en que el control y proporción en que circulan las Lipoproteínas se encuentra afectado. En la siguiente Tabla se pueden observarlas características de algunas de ellas. Recientemente se le ha atribuido importancia a la Lipoproteína a (Lp a), que presenta una estructura compleja consistente en un núcleo de LDL unido covalentemente a una Apoliproteína (a). Esta última presenta un dominio similar a una Proteasa y otro dominio parecido al Plasminógeno. La Lipoproteína (a), es producida en el hígado y sus elevados niveles (mayores de 0,3 gr/lt) se asocian con la enfermedad coronaria y aterosclerosis. Ocurre que la Apolipoproteína (a) que se encuentra asociada a ella, es capaz de competir con el Plasminógeno para la unión a la Fibrina, así inhibe la disolución de los coágulos o Fibrinolísis, además puede unirse a sitios específicos del endotelio capilar estimulando el crecimiento de la musculatura lisa y con ello contribuye a ocluir los capilares y arterias. Por lo tanto, se la ha asociado con infartos repentinos, en aquellas personas jóvenes y que hacen ejercicio.

498

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Volver

al

inicio 6) TEJIDOS INVOLUCRADOS EN EL MANEJO DE LOS LIPIDOS. A continuación analizaremos el rol de los tejidos involucrados en el manejo de los lípidos, como son el tejido adiposo como reservorio, el músculo como efector de la energía extraída a los lípidos por oxidación y el hígado como órgano sintetizador de lípidos (Fig. 12 10). Los ácidos grasos son aportados a los tejidos en forma de Triacilglicerol mediante las lipoproteínas del plasma e hidrolizados en ácidos grasos libres por medio de la Lipoproteína Lipasa Capilar, la que a su vez es activada por una de las lipoproteínas del complejo antes de entrar al adipocito. Una vez en su interior, se esterifican nuevamente para formar los TAG de almacenamiento con Glicerol-3-Fosfato proveniente de la Glicólisis.

CEREBRO

GLICEROL

MUSCULO

ALBUMINA

TAG CTC

ACS . GRASOS

ADIPOCITO

GLICOLISIS

ACS. GRASOS

β - OXIDACION

*

GLICEROL 3- P

VLDL

GLICOLISIS

GLUCOSA

GLUCOSA

GLUCOSA VLDL

CUERPOS CETONICOS

CTC

CUERPOS CETONICOS

HIGADO

Qm Q m : Quilomicrones V L D L : Lipoproteínas

ESTA VIA OCURRE

Vena Subclavia izquierda

SOLO EN AYUNAS

muy baja densidad

SISTEMA LINFATICO

C T C : Ciclo Tricarbox'ilico

*

EL ADIPOCITO CARECE DE GLICEROL QUINASA Y NO EMPLEA GLICEROL

T A G : Tri Acil Glicerol

Qm

ENDOGENO

INTESTINO

Fig. 12 - 10. Distribución de los Lípidos desde el Hígado a los tejidos periféricos.

499

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Los lípidos almacenados en el tejido adiposo no solo provienen de la dieta, sino que pueden

Glucosa

Triacil Gliceroles y Fosfolípidos

La Glucosa puede formar Acetil - SCoA que es el precursor de los Lípidos y tambien formar Glicerol - 3 - P necesario para TAG y PL.

Acido Graso activado

Glicerol - 3 - P

Acido Graso

Esteroides

Malonil - SCoA

Colesterol

β-Oxidación

Piruvato

Acetil - SCoA

Lanzadera Citrato-Malato

Acetil - SCoA

Citrato Citrato

AOA

Isocitrato

Cuerpos Cetonicos

CTC Malato

α-Cetoglutarato

AOA Malato

Fumarato

Succinil - SCoA

Fig. 13 - 10. La glucosa participa en la síntesis de Triacilgliceroles por medio del Glicerol-P de la Glicólisis y el Acetil-SCoA.

haber sido generados por distintos precursores. Uno de ellos lo constituyen los Hidratos de Carbono u otros precursores de origen proteico, ya que los aminoácidos son también capaces de transformar su esqueleto hidrocarbonado en lípidos después de remover el amonio de su estructura. Esta última vía se incrementa en los casos de ayuno prolongado. Los adipocitos están constituidos por una gran vacuola central con un núcleo periférico y solo unas pocas mitocondrias. Su función principal es la de almacenar Triglicéridos (TAG), para lo cual recurren a la Glicólisis como fuente de energía y como productora de Glicerol3-Fosfato para la síntesis de los TAGs, (Fig. 13 - 10). Los adipocitos no poseen la enzima Glicerol Quinasa por lo tanto extraen el Glicerol-3-Fosfasto por medio de la reducción de un intermediario glicolítico, como es la Fosfo-Dihidroxicetona.

500

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La degradación de los TAG de almacenamiento en el Adipocito ocurre por un mecanismo de regulación en cascada donde intervienen los niveles de epinefrina y glucagón, como agentes lipolíticos y la insulina como agente antilipolítico que descompone el AMPc en 5´AMP. Se emplea en este mecanismo la Adenil Ciclasa, el segundo mensajero AMPc y una Proteína Quinasa que activa a la TAG Lipasa por fosforilación, en conjunto con las Diacil Glicerol Lipasa (DAG) y la Mono Acil Glicerol Lipasa (MAG). Una vez liberados los ácidos grasos de los TAG, estos pueden salir a la circulación y unirse a la Seroalbúmina, para dirigirse al músculo donde se oxidarán. Por su parte el Glicerol liberado de los TAG, pasará al hígado donde será oxidado posteriormente por la vía Glicolítica o bien podrá convertirse en Glucosa por Glucogénesis. El músculo es el lugar donde los ácidos grasos sé oxídan durante el metabolismo aeróbico y se transforman finalmente en CO2 y H2O. La fibra muscular roja es la responsable de la contracción sostenida y ocupa ácidos grasos como su principal combustible y secundariamente Glucosa, ya que las enzimas del Ciclo Tricarboxílico están aumentadas aquí drásticamente en comparación con los niveles encontrados en las fibras musculares blancas. Uno de los requerimientos para que entre el Acetil-SCoA proveniente de la β-Oxidación al CTC es el aporte de intermediarios al Ciclo Tricarboxílico, mediante las reacciones anaplerióticas. De esta manera se puede contar con un nivel de Oxaloacetato adecuado para formar Citrato, ya que la presencia de solo Acetil-SCoA no aporta intermediarios de al Ciclo como lo hacen los Aminoácidos y la Glucosa. En humanos el principal órgano encargado de la síntesis de los lípidos es el hígado, donde los equivalentes reductores se obtienen por medio de la Vía de las Pentosas. El tejido adiposo, la glándula mamaria y la corteza adrenal también cuentan con esta vía para obtener NADPH. La Ribulosa-5-Fosfato, como producto de la Vía de las Pentosas debe volver a la vía Glicolítica por medio de una serie de reacciones destinadas a evitar su acumulación, (Fig. 14 - 10). El NADPH no solo se necesita para la síntesis de ácidos grasos sino que también para la síntesis de Colesterol. V ía d e la s P e n t o s a s o V í a d e l F o s f o g lu c o n a t o C í c lic a c o m o p r o d u c t o r a d e N A D P H e n la G lá n d u la M a m a r ia , T e jid o A d ip o s o y C o r t e x A d r e n a l. 6 G lu c o s a - 6 - P

+ 12 N A D P + 6 H 2O

6 R ib u lo s a - 5 - P

6 R ib u lo s a - 5 - P

4 F ru c tos a - 6 - P

G lic e r a ld e h id o - 3 - P

F r u c to s a - 1 , 6 - b i - P

+

+ H 2O

12 N AD P

+ 12 N AD PH + 12 H

+ 2 G lic e r a ld e h id o - 3 - P

F r u c to s a - 1 , 6 - b i - P F ru c tos a - 6 - P

+ Pi

5 G lu c o s a - 6 - P

5 F ru c tos a - 6 - P G lu c o s a - 6 P

6 CO2

D i - h id r o x i - C e t o n a - P

+ D i - h id r o xi - C e t o n a - P

G lic e r a ld e h id o - 3 - P

+

+

7 H 2O

6 CO2

+

12 N AD PH

+

12 H

+

P i

Fig. 14 - 10.La Vía de las Pentosas produce NADPH y su producto la Ribulosa-5-P pasa luego a la Vía Glicolítica.

501

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Un tejido de excepción es el Tejido Graso Pardo que se encuentra en los animales que hibernan o se encuentran estresados por el frío. También se le encuentra en los recién nacidos incluyendo a los humanos. Tiene una gran cantidad de mitocondrias y de allí su color debido a los citocromos presentes en ellas. El tejido graso pardo no solo sirve para aislación térmica, sino que produce una gran cantidad de calor debido a que la oxidación de los ácidos grasos no está acoplada a la síntesis de ATP. La especialidad de este tejido, es en realidad la producción de calor ya que en animales como los osos durante su periodo de hibernación, la temperatura se mantienen a 34oC, por lo que es posible una rápida recuperación a 37oC ante la presencia de algún peligro (Fig. 15 - 10). En la mitocondria del tejido graso pardo existe un sistema que permite la regulación del paso de los protones. Este ocurre desde el espacio intermembrana (donde se acumulan por las sucesivas reacciones de oxidación de las Coenzimas de la Cadena de Transporte de Electrones) a la matriz mitocondrial, por medio de una proteína de 32kD, la que no se encuentra acoplada a la síntesis de ATP como ocurre en la mitocondria normal donde se le halla unida a la ATP Sintasa. Esta proteína transportadora se encuentra aquí regulada por los niveles de GDP presentes y sucede que a menor cantidad de GDP mayor paso de protones y mayor producción de calor por la Cadena de Transporte de Electrones ( Ver Capítulo 12).

SISTEMA TERMOGENICO CORTOCIRCUITO DEL SISTEMA QUIMIOSMOTICO EN EL TEJIDO GRASO PARDO La energía destinada a la síntesis de ATP se pierde por calor ACS. GRASOS H+

H+

H+ H + H +

H+

H+

CTE

GRADIENTE QUIMIOSMOTICO

NADH + H

FADH

H+

H+

2

H+ H

Entrada de los sint la síntesis de ATP

CTC

MEMB. EXTERNA H+ H+ + H H+ MEMB. INTERNA H+

H+

+

GDP GDP

H+

PROTEINA REGULADORA DE LA ENTRADA DE H+

La unión de GDP inhibe conductancia de los l t

MATRIZ MITOCONDRIAL

β- OXIDACION

Fig. 15 - 10. El gradiente de protones se colapsa produciendo solamente calor y no ATP. El cortocircuito de los protones se encuentra regulado por la Termogenina.

Se puede concluir que las funciones de los distintos tejidos involucrados en el metabolismo de los Lípidos son las siguientes:

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a) Hígado: recibe remanentes de Quilomicrón y almacena Triglicéridos. Obtiene energía por β-Oxidación y puede mandar Acetil-SCoA al citoplasma para la síntesis de ácidos grasos endógenos por la Ácido Graso Sintasa. Forma Cuerpos Cetónicos cuando el Oxaloacetato es deficiente durante la inanición, ya que se dirige a Malato para ir a la Gluconeogénesis. En situaciones normales puede ir a la Gluconeogénesis con Lactato, Piruvato, Alanina, y aminoácidos Gluconeogénicos. En especial con Glicerol del tejido adiposo,. El hígado mismo se puede mantener con Cetoácidos derivados de los aminoácidos deaminados por Transaminación o deaminación oxidativa, que entran al Ciclo Tricarboxílico. Sintetiza también lipoproteínas para el transporte de lípidos. Sintetiza Colesterol y sales Biliares, almacena vitaminas Liposolubles. b) Músculo: Emplea para obtener energía en la forma de ATP a los siguientes sustratos: Glucosa, Ácidos Grasos y Cuerpos Cetónicos. El corazón es un gran consumidor de Acetoacetato , uno de los Cuerpos cetónicos en casos de ayuno o inanición. En las fibras aeróbicas y en el corazón (músculos aeróbicos), la β-Oxidación de los ácidos grasos se encuentra estrechamente acoplada a la cadena de transporte de Electrones y mínimas cantidades (microgramos) de NAD y FAD producen oxidación de gramos de ácidos grasos. El Corazón mismo emplea Ácidos grasos, Acetoacetato, lactato y piruvato, aunque es capaz de almacenar algo de Glicógeno. c) Tejido Adiposo (Tabla 4 – 10): Almacena TAG y necesita de Glucosa para obtener Fosfo-Dihidroxicetona que por una posterior reducción con NADH pasa a GlicerolFosfato. Este último se emplea en la síntesis de los TAG. Libera ácidos grasos que se unen a la Albúmina durante la inanición, el ejercicio y el estrés. Tabla 4 - 10 Regulación Hormonal de la cascada que conduce a la lipólisis en el Tejido Adiposo Liberación Rápida Epinefrina Norepinefrina Glucagón ACTH Secretina Vasopresina

Liberación Lenta Glucocorticoides Hormona del crecimiento

Inhibidores Insulina

d) Cerebro o tejido nervioso. Emplea Glucosa aeróbicamente y cuerpos cetónicos en ayuno o inanición para obtener su energía. 20% del Oxígeno consumido en estado de reposo es ocupado por el cerebro para mantener el Potencial Transmembrana. Este depende a su vez de la concentración de K+ (dentro de la célula) y Na+ (fuera de esta), mientras que el ATP producido por la Glicólisis aeróbica, se gasta en mantener esta separación de iones y su proporción a través de las membranas por las enzimas Na+, K+ ATP asas.

e) La Glándula Mamaria Lactante.

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Parte de los lípidos de la leche son aportados por el organismo mediante el empleo de las Lipoproteínas transportadoras como Quilomicrones (de la dieta) y VLDLs (síntesis en el hígado) y otros son sintetizados por la misma glándula mamaria (síntesis de novo en células epiteliales), es decir a partir de Glucosa. La cual es imprescindible en la síntesis de los componentes de la leche. La Glucosa también es una fuente de Lactosa, disacárido formado por Galactosa y Glucosa. Para su conversión se emplea la reacción de la UDP-Glucosa (Fig. 16 – 10). La vía parte con la reacción desde Glucosa a Glucosa-1-P y de Glucosa-1-P a Glucosa-6-P, posteriormente se activa de Glucosa-6-P a UDP-Glucosa y una vez activada con una epimerasa, se invierte el grupo en posición 4 para formar la UDP-Galactosa la que se une a otra Glucosa. La lactosa se acumula en el aparato de Golgi. GLUCOSA + ATP

GLICÓGENO + PI

GLUCOSA 1 P GLUCOSA-6-P UTP UDP - GLUCOSA EPIMERASA (en carbono 4) UDP- GALACTOSA GLUCOSA

UDP LACTOSA Fig. 16 -10. Transformación de Glucosa en Galactosa

Los compuestos que se deben tener en la leche son triglicéridos, lactosa y proteínas. Para ello se requiere de una constante previsión de energía que en un 90% proviene de la Mitocondria en la forma de ATP. Otra vía predominante lo constituye la Vía de las Pentosas, que a partir de Glucosa produce Pentosas y NADPH. Esta última es la principal coenzima para la síntesis de los ácidos grasos y en su producción se emplea aquí más Glucosa que la misma Glicólisis. Otra fuente de NADPH lo constituye la Enzima Málica que transforma Malato en Piruvato con salida de un CO2. La enzima marcapaso de la síntesis de los ácidos grasos es en este caso la Acetil-SCoA Carboxilasa que produce Malonil-SCoA a partir de Acetil-SCoA. En el Retículo Endoplásmico Liso de las células alveolares, a partir de ácidos grasos y Glicerol se produce el ensamble de los triglicéridos. Posteriormente coalecen en gotas mayores que se dirigen al ápice de la célula donde se agrupan y forman una protuberancia, que sale por exocitosis, rodeada de una membrana que a su vez tiene fosfolípidos y

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.

colesterol. Esta membrana evita que continúen creciendo los glóbulos en gotas cada vez mayores por adición de ellos y se conviertan en elementos difíciles de secretar. Los lípidos en la leche humana constituyen solo un 4% y en su mayoría son triglicéridos. 20% de ellos son de cadena de tamaño medio (12: 0, 14: 0 o 16: 0) sintetizados en la misma glándula mamaria y el resto son derivados de los aportes del plasma (dieta, hígado). Volver

al

inicio 7) DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES Y β-OXIDACIÓN DE LOS ACIDOS GRASOS. Se procederá a describir de manera integrada la degradación de los Triacilgliceroles desde una vacuola presente en el tejido adiposo hasta su oxidación en el Músculo o en el Hígado. La Epinefrina, Norepinefrina, la Adrenocorticotropina y el Glucagón estimulan sus receptores en la superficie del Adipocito activando una cadena de amplificaciones en cascada donde intervienen la proteína G, la Adenil Ciclasa y la formación de AMPc. El nivel de AMPc es disminuido por la Insulina que inhibe la Lipólisis. Este segundo mensajero activará luego a la Proteína Quinasa y esta será capaz de fosforilar a la Lipoproteína Lipasa, la que actuará hidrolizando secuencialmente los ácidos grasos de un Triacilglicerol (Fig. 17 - 10).

H

AMPLIFICACION EN CASCADA DE LA DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES (TAG).

R G ATP PROT. QUINASA

R C inact.

MEMB. CITOPLASMATICA

AC AMPc AMPc

R +

C

ATP

act. FOSFORILACION P ADP

TGL VESICULA CON TAG

TAG

DAG + AGL

DAG

MAG + AGL

Glicerol + AGL

MAG

Fig. 17 - 10. Cascada de amplificación para la activación de la Triacilglicerol Lipasa.

Se puede observar en la Figura 17 - 10, que la enzima Triacil Glicerol Lipasa (TGL) esta sometida a un estricto control por modificación covalente o por el mecanismo de Fosforilación-Defosforilación. Una vez que el ácido graso libre sale del tejido adiposo circula unido a una proteína que es el mayor constituyente del plasma y se conoce como Seroalbúmina. Por otro lado, como el

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.

tejido adiposo carece de la enzima Glicerol Quinasa, el Glicerol libre puede ser esterificado nuevamente o viaja al Hígado donde pasa a Glicerol-Fosfato y a Fosfo-Dihidrxicetona integrándose entonces a la Glicólisis. El ácido graso libre en el citoplasma del Hepatocito, sufre la activación es decir, se lo lleva a un nivel de energía superior donde puede ser manejada su estructura para alargarla en el Retículo Endoplásmico Rugoso u oxidarla y extraer la energía total de su molécula en el interior de la Mitocondria. La activación se lleva a cabo por medio de la enzima Acil-CoASintasa, con un gasto de energía equivalente a dos ATPs. Acil-SCoA-Sintasa CH3(CH2)nCOOH + ATP + CoA-SH---->CH3(CH2)nCO-S-CoA + AMP + PPi La reacción hasta aquí es reversible y solo cuando se rompe el PPi por acción de una Pirofosfatasa se hace irreversible y exergónica: PPi---------> 2Pi

TRANSPORTADOR CARNITINA ACTIVACION

MEMB. EXT.

3

2 14

CH

C O

Co A SH

CAT 2

: Carnitina Acil Transferasa 2

TLC

: Translocasa

CARNITINA

CH

ATP

: Carnitina Acil Transferasa 1

MEMB. INT.

O C H ( CH )

CAT 1

3

N

+

O

3

CH

2

CH

3

CARNITINA CH

CH

CH

2

C

CH

O

3

OH

N

+

CH

O

3

CH

2

3

CH

CH

2

C

O

OH

AMP

+

PP i

CAT 1 O

C H ( CH ) 3

2 14

TLC

CAT 2 O

C O S CoA

CH ( CH ) 3

PALMITOIL - S - CoA

PALMITOIL

2 14

C O S CoA

PALMITOIL - S - CoA

CARNITINA Co A SH

Co A SH

ENZIMA CAT 1 INHIBIDA POR MALONIL - S - CoA CITOPLASMA

ESPACIO INTERMEMBRANA

βOXIDACION MATRIZ MITOCONDRIAL

Fig. 18 - 10.Transporte de los Ács. Grasos al interior de la Mitocondria.

Una vez activado el ácido graso, este puede dirigirse a la mitocondria donde sufrirá βOxidación. El transporte al interior de la mitocondria se produce por medio de una molécula denominada Carnitina (Fig. 18 - 10). Aquellos ácidos grasos con cadenas menores a diez carbones, no necesitan de este sistema de transporte y pasan fácilmente la membrana interna de la mitocondria, ya que la membrana externa es permeable para todos, pero la membrana interna es más selectiva y todos los

506

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

ácidos grasos de más de diez carbones deben emplear el sistema del transportador Carnitina. Aquellos ácidos grasos de mayor tamaño sufrirán una oxidación previa en los Peroxisomas para pasar posteriormente a ser degradados en la Mitocondria. Para entrar a la Mitocondria se emplean tres enzimas que se denominan CAT 1 o Carnitina Acil Transferasa 1 (Fig. 19 - 10), la que une la Carnitina al ácido graso desplazando a la Coenzima A exógena, la segunda enzima es la Translocasa que pasa el complejo de Ácido Graso-Carnitina a través de la membrana y finalmente la Carnitina Acil Transferasa 2, que retira la Carnitina para otro ciclo y a la vez restaura la activación previa del ác. Graso con la CoASH endógena. Memb. Ext.

Mitocondria

Memb. Int.

β - Oxidación O

CH3

CARNITINA Co A

( CH2 )

CH2 C

S Co A

FAD

CARNITINA CAT 1

CH2

12

H

S C O

PALMITOIL CARNITINA

CH2

TLC

(CTE)

FADH 2

CAT 2 CH3 ( CH2 )

PALMITOIL CARNITINA

12

O

C

C

C

S Co A

H

H2O

CH2 ( CH2 ) CH3

12

OH

CoASH

CoASH

CH3

( CH2 ) 12

O

C

C

H

H

C

S Co A

NAD

(CTE)

NADH + H O C CH3 ( CH2 ) O 12 CH C S Co A 2 CoASH

CH3

O C ( CH2 ) 12 S Co A

+

O CH3

CICLO TRICARBOXILICO

C

S Co A

O

8 CH3

(CTC)

C S

Co A

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES (CTE)

Fig. 19 - 10.Oxidación de los Ác. Grasos al interior de la Mitocondria.

El ácido graso activado en el interior de la mitocondria, dispone de un alto nivel de coenzimas NAD y FAD oxidadas. Estas procederán a retirar sucesivamente los protones del ácido graso mediante un procedimiento denominado, β-Oxidación (Fig. 18 - 10). Esta serie de reacciones

507

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

consisten en una oxidación con FAD, hidratación y una nueva oxidación, pero esta vez con NAD, para rematar con una tiólisis empleando CoASH. De esta manera se cortan sucesivas unidades de dos carbonos, desde el grupo carboxilo inicial hasta el final de la cadena alquílica. En el ácido graso intacto los carbones que se oxidan serán siempre los β. Un ácido graso de 16 carbones producirá 8 moléculas de Acetil-S-CoA y uno de 18 carbones dará 9 moléculas de Acetil-S-CoA La primera reacción de oxidación ocurre con la enzima Acil-CoA-Deshidrogenasa que emplea FAD como coenzima en vez de NAD, de esta manera la reacción se hace más exergónica o es mayormente favorecida por su potencial de óxido reducción. Acil CoA-Deshidrogenasa H CH3(CH2)n - CH2 - CH2 – CO – S - CoA + FAD ---->CH3(CH2)n – C = C – CO – S - CoA + H FADH2 Trans δ-2Acil-S-CoA La segunda reacción, es una Hidratación donde entra un OH al carbono β y un Hidrógeno al carbono α. La enzima que cataliza este paso es una Enoil-SCoA Hidrasa. Enoil-SCoA Hidrasa. H OH CH3(CH2)n – C = C – CO - SCoA + H2O------>CH3(CH2)n – C - C – CO – S - CoA H H β-L-OH - Acil-S-CoA A continuación ocurre otra reacción de Oxidación con la Coenzima NAD y la enzima β-LHidroxi o 3-L-Hidroxi Acil-SCoA Deshidrogenasa en la que se forma el grupo ceto en el carbono Beta de la Ceto Acil-S-CoA.

β-L-Hidroxi Acil-SCoA Deshidrogenasa OH CH3(CH2)n – C - C – CO – S - CoA + NAD----------> CH3(CH2)n - CO - CH2 – CO – H – S - CoA + NADH + H Aceto Acetil-SCoA Finalmente, en una reacción catalizada por la enzima Tiolasa se rompe el enlace β - α por Tiólisis y se libera un Acetil-S-CoA. TIOLASA CH3(CH2)n - CO - CH2 – CO – S - CoA + CoASH-------> CH3(CH2)n - CO – S - CoA + CH3 - CO - SCoA El ácido graso activado a perdido hasta aquí solo dos carbones y tendrá que entrar a sucesivas vueltas antes de oxidarse en su totalidad. Si tiene 16 carbones dará 7 vueltas y si tiene 20 carbones dará 9 vueltas. Por lo tanto el ácido palmítico de 16 carbones al oxidarse completamente producirá 8 moléculas de Acetil-S-CoA, 7 moléculas de (NADH + H) y 7 moléculas de FADH2:

508

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

CH3-(CH2)14-CO- S - CoA +7CoASH + 7NAD + 7FAD + 7 H2O ------> 8CH3–CO–S-CoA+7NADH+7H+7FADH2 17

16

15

14

12

13

10

1

9

8

7

6

5

4

3

2

1

CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH 2 2 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C O S CoA 2 2 2 2 2 2 2 3

6 NAD + 6 FAD

NAD + FAD NADH + H + FADH 17

16

CH 3

CH

C O + ATP 2

ADP + P i D - Metil - Malonil SCoA

6 NADH + 6 H + 6 FADH 15

2

C O S CoA

CH

C H C O S CoA 3

3

L - Metil - Malonil SCoA Racemasa

CH C O S CoA

C O OH

Succinil - SCoA

+ 6HO 2

CH

C O OH CH 3

7

2

Propionil SCoA Carboxilasa COOH TPP

C O S CoA

L - Metil - Malonil SCoA

+ 6 CoASH

CH

Metil Malonil SCoA Mutasa B 12

CTC

CH C O S CoA

Fig. 20 - 10. La Oxidación de ácidos grasos impares produce un intermediario de tres carbones que se transforma en uno de cuatro carbones y entra al Ciclo Tricarboxílico.

En el caso de que un ácido graso tenga un número impar de carbones (Fig. 20 – 10), dejará al final un compuesto de tres carbones o Propionil-SCoA, que por medio de una metilación y reordenamiento (Ver Capítulo Vitaminas, B12) se transformará en Succinil-SCoA de cuatro carbones y podrá ser oxidado como intermediario del Ciclo Tricarboxílico. Ácidos grasos insaturados con doble enlace entre carbonos γ - δ o entre carbonos C3 y C4 (Fig. 21 - 10), harán uso de una Isomerasa para trasladar el doble enlace a los carbonos α- β o C2 y C3, quedando listos para entrar a la etapa de Hidratación durante la β-Oxidación.

509

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Las Isomerasas cambian la posición de los dobles enlaces del lugar inadecuado carbonos 3,4 al lugar adecuado o carbonos 2,3. 3

2

4

γ , δ

CH

CH

3

3

β , γ

2

4

3

H

H

C

C

δ

γ β

2

CH

Ruptura por la βOxidación 1

2

Enoil - SCoA ISOMERASA

3

C O - SCoA

CH

α

4

3

CH

2

CH

2

γ

3

2

H

H

C

C

1

C O - SCoA

β α

β- OXIDACION Fig. 21 - 10. Las isomerasas cambian de posición al doble enlace, desde la posición 3,4 a la 2,3.

Aquellos ácidos grasos que poseen un grupo D-OH (Fig. 22 - 10), pueden transformarlo en un L-OH, cambiando de configuración por medio de una Epimerasa y de esta manera proseguir con las reacciones restantes de la β-Oxidación.

Ac. Grasos poli - insaturados con 2 cis - enoil SCoA producen solo D - 3 - OH - acil SCoA, que por medio de una EPIMERASA lo convierten a L - 3 - OH - Acil SCoA H H R CH C C C 2 2

O SCoA

cis - enoil SCoA

3 - OH - Acil SCoA Epimerasa

H

O

R C H C CH C 2 2 SCoA OH D - 3 - OH - acil SCoA

OH

O R C H C CH C 2 2 SCoA L- 3 - OH - acil SCoA

Fig. 22 - 10. Cuando existe un doble enlace en posición cis en vez de trans, se forma un D-OH que posteriormente pasa a L-OH, por acción de la EPIMERASA para continuar con la β -Oxidación.

A continuación en Tabla 2 -10 se observa la oxidación de un ác. Graso poli-insaturado (Araquidónico) con las enzimas Enoil-SCoA Isomerasa y 2,4 – Dienoil-SCoA Reductasa: Tabla 2 - 10

510

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

6 5

3 4

5,8,11,14

2

1

) Araquidonil-CoA (20:4 ∆ Un ciclo de beta-Oxidación

6 5 4 32 1 3,6,9,12

) 3,6,9,12-Octadecatetraenoil-CoA (18:4 ∆ CH3-CO-S-CoA Enoil SCo A Isomerasa (dobles enlaces de cis en trans)

5 4 3 2,6,9,12

) 2,6,9,12-Octadecatetraenoil-CoA (18:4 ∆ Un ciclo de β-Oxidación sin FAD y con Hidratasa trans

6 α

8 γ

5

β 7 4,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3 ∆ Acil-SCoA Deshidrogenasa

4

4,7,10

FAD FADH2

5 4

3

CH3-CO-S-CoA

)

2 1 3

2,4,7,10-Hexadecatetraenoil-CoA (16:4 ∆

2,4,7,10

)

2,4 Dienoil-SCoA Reductasa NADPH + H NADP

2

5 4

1

3 3,7,10

3,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3 ∆

)

Enoil-SCoA Isomerasa (transforma cis en trans)

5

3 4

2

1

2,7,10

2,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3 ∆ ) Un ciclo de β- Oxidación sin FAD y con Hidratasa trans

3,6-Dodecadienoil-CoA (12:2 ∆

3,6

)

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al

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

8) OXIDACIÓN EN LOS PEROXISOMAS Los Peroxisomas se encuentran en las células Eucarióticas tanto de plantas como animales. Son organelos donde se llevan a cabo funciones específicas y cada célula puede tener cientos de ellos. Son especialmente abundantes y de mayor tamaño en las células del hígado y riñón. Se identifican principalmente por la presencia de Catalasa, la enzima que descompone H2O2. Algunas de las reacciones que ocurren en los Lisosomas son de síntesis y otras son de degradación, así tenemos que se encuentran involucrados en la síntesis de sales biliares, colesterol, plasmalógenos, ácido docosahexanoico y los procesos de degradación como la oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga, el ác. Fitánico (fig. 25 – 10), ác. Pipecólico y las Prostaglandinas. En general, estos proceso se llevan a cabo por una interacción coordinada entre los Peroxisomas y otros organelos. Los ácidos grasos de cadena muy larga se degradan en conjunto con la Mitocondria al igual que el ácido Fitánico. Por otro lado los precursores de los Plasmalógenos, se sintetizan en los Peroxisomas y se terminan de hacer en el Retículo Endoplásmico de la célula. En lo que aquí nos concierne, los Peroxisomas son capaces de β-Oxidar ács. Grasos de cadena larga y muy larga o mayores de 26 Cs), ya sea saturados o insaturados e incluso ács grasos dicarboxílicos productos de la Oxidación tipo ω (fig. 24 -10). En cambio la Mitocondria oxida ács grasos de cadena corta ( menos de 10 carbones que entran sin necesidad del transportador Carnitina), ács grasos de cadena media ( 12, 14 y 16 Cs) y aún las cadenas largas (26Cs). Fig.

ACTIVACIÓN DEL ÁCIDO GRASO EN EL PEROXISOMA CON LA CoASH 1/2O2 + H2O CATALASA

CH3 - (CH2)n - CH2 - CH2 – CO – S - CoA H2O2

O2

FAD OXIDACIÓN POR UNA FLAVO OXIDASA FADH2

CH3(CH2)n - CH = CH – CO – S - CoA Cis Δ-2- Acil-S-CoA

RESTO DE LAS REACCIONES SON SIMILARES A LA β-OXIDACION 23-10. Formación de Peróxido de Hidrógeno como subproducto de la Oxidación de un ácido graso de cadena larga.

Por otro lado, en los Peroxisomas se pueden oxidar las cadenas laterales de los Eicosanoides, que son precursores de las Prostaglandinas (regulación del AMPc en los tejidos), Tromboxanos (involucradas en la coagulación de la sangre) y Leucotrienos (implicadas en la contracción muscular).

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.

En los Peroxisomas incluso existe la Oxidación de cadenas dicarboxílicas (fig. 23 – 10) que son los productos de la oxidación tipo ω que ocurre en el Retículo Endoplásmico de la célula. En los Peroxisomas el ácido graso que ha sido activado mediante CoASH es oxidado a Enoil-SCoA empleando FAD y pasando los protones directamente al O2 por una Oxidasa que produce H2O2, el cual para evitar su toxicidad, debe ser convertido rápidamente en agua por una Catalasa. El resto de las reacciones son similares en ambos organelos, sin embargo las enzimas para ambas vías metabólicas se encuentran codificadas por distintos genes en el núcleo de la célula. Como toda labor compleja es susceptible a un error, en el Peroxisoma ocurren una serie de trastornos que se expresan finalmente como enfermedades. Estas se deben a defectos, ya sea en el ensamblaje del Peroxisoma, defectos en procesos multienzimáticos y defectos en tan solo en una enzima que se encuentra ligada a una cadena de reacciones. La primera de ellas es extremadamente rara (1/ 150.000) y es autosómica recesiva, no tiene cura. Se caracteriza por presentar organelos fantasmas, es decir vacíos o con muy pocas o ninguna función en su interior. Por otro lado los Lisosomas pueden ser incluso normales, pero su número es muy reducido para llevar a cabo sus funciones adecuadamente. En el segundo tipo, se encuentran ausentes varias de las enzimas, sin embargo cuenta con la Catalasa, lo que indica que la pérdida de funciones no es global como en el caso anterior. En el último caso solo una función del Lisosoma es defectuosa, sin embargo puede ser tan severa como en el primero de ellos. Por ejemplo, puede fallar una de las enzimas que degradan a los ácidos grasos de cadena muy larga, produciendo un trastorno debido a la acumulación de estos ácidos en el tejido nervioso, debido a la falla en el metabolismo de la Mielina y a su vez en la inervación de las Glándulas Adrenales.

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9)

ω-OXIDACIÓN

513

al

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.

Cuando la Oxidación es del tipo ω, significa que ocurre en el extremo distal o la cola del ácido graso. Aquí participan NADP, citocromo P450 y el Retículo Endoplásmico que produce H2O2. Este último es rápidamente descompuesto por la Catalasa debido a su toxicidad. El ácido graso puede ser oxidado parcialmente y luego es completado en la Mitocondria (Fig. 24 – 10).

ω- Oxidación

O

Citocromo P ONADPH+H +O 2 Oxidasa de función mixta en el Retículo Endoplásmico NADP + H 2O 2 O HO - CH – (CH 2) 10 – C ONAD Alcohol Deshidrogenasa NADH + H O O H – C – (CH 2) 10 – C O NAD Aldehido Deshidrogenasa NADH + H O O H O – C – (CH 2) 10 – C O CH 3 – (CH 2)

10

–C

450

β- Oxidación acorta ambos lados

O -

O

O

O C – (CH 2) 2 – C

-

O-

O

O C – (CH 2) 10 – C

O

-

Adipato a la β - Oxidación

Ác. Succínico al CTC Fig. 24-10. Oxidación de los ácidos grasos en el extremo distal.

Este tipo de oxidación ocurre en aquellas drogas que tienen una cadena alquílica. De esta manera se hacen más polares lo que facilita su excreción. Volver inicio

514

al

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10) α-OXIDACIÓN Ácidos grasos ramificados (Fig. 25, 26-10) como el Fitol componente de la Clorofila, aparecen en la dieta como derivados del mundo vegetal y en especial como producto de la acción metabólica que ocurre en los animales rumiantes. Así tenemos que en el ác. Fitánico presente en la mantequilla, leche y carne de rumiantes se encuentra un grupo 3 – Metilo que bloquea la etapa de Deshidrogenación del grupo OH por la Hidroxiacil-SCoA Deshidrogenasa en el Peroxisoma, por lo tanto se debe recurrir a una α-Oxidación. G r u p o M e t ilo e n p o s ic ió n 3

O

OÁ c . F it á n ic o

Fig. 25-10. El Ác. Fitánico es un derivado de los vegetales

Los primeros dos pasos de la Oxidación son de activación a Fitanoil-SCoA mediante la enzima Acil-SCoA Sintasa empleando ATP, seguida de Hidroxilación a α- HidroxifitanoilSCoA empleando α-Cetoglutarato que pasa a Succinato por medio de la enzima FitanoilSCoA Hidroxilasa. Posteriormente hay varios pasos en disputa que llevan a obtener el ác. Pristánico (Fig. 2610) con salida de CO2. El ác Pristánico es finalmente oxidado en los Peroxisomas. G r u p o M e t ilo e n p o s ic ió n 2 O-

Á c . P r is t á n ic o

O

Fig. 26-10. El Ác. Pristánico entra para ser oxidado por los Peroxisomas

Cuando una persona carece de la enzima α-Oxidante (la Hidrolasa del ác. Fitánico en los Peroxisomas), se acumulan grandes cantidades de ác. Fitánico en los tejidos y en el suero sufriendo la enfermedad de Refsum. Sus síntomas son retinitis pigmentosa, ataxia cerebelar y neuropatía periférica. Por lo tanto, en estos casos se deben eliminar de la dieta los productos de vacuno. Volver inicio

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al

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11) FORMACION DE CUERPOS CETONICOS. En situaciones de ayuno o ejercicio prolongado disminuye el transporte de glucosa hacia el interior del hígado y ocurre que la concentración de Glucosa baja de los 90 mg %. Sin embargo, para paliar esta merma de combustible se recurre a los ácidos grasos y a la βOxidación, esto lleva a producir una acumulación de Acetil-SCoA en el interior de la mitocondria del hígado, ya que esta molécula no puede entrar con la velocidad necesaria al Ciclo Tricarboxílico por falta de ácido Oxaloacético. Este último proviene del Piruvato que a se deriva de la Glucosa que se encuentra en bajos niveles. Como resultado el Acetil-SCoA, se acumula y se invierte la reacción perteneciente a la última etapa de la β-Oxidación de los ácidos grasos, catalizada por la enzima Tiolasa. De esta manera se produce el compuesto Cetoacetil-SCoA que se encuentra formado por la unión de dos moléculas de Acetil-SCoA. Luego, a partir de este compuesto más otra molécula de Acetil-SCoA se genera por una reacción catalizada por la enzima Hidroximetilglutaril-CoA Sintasa (HMG-CoA) el βHidroxi, β-Metil-Glutaril-SCoA. Esta molécula se descompone luego por la acción de la enzima HMG-CoA Liasa en ác. Acetoacético y nuevamente en Acetil-SCoA. El ác. Acetoacético por reacción no enzimática puede perder el carboxilo transformándose en Acetona o puede ser posteriormente reducido con NADH en ác. β-Hidroxibutírico por medio

FORMACION DE LOS CUERPOS CETONICOS EN EL HIGADO β-OXIDACION

LAS SIGUIENTES REACCIONES OCURREN EN LA MATRIZ MITOCONDRIAL TIOLASA CH

CO C H

3

2

C O - S - CoA

CH

3 H M G Co A

COO CH HO

C CH

CoASH

C O - S - CoA

C O - S - CoA

LIASA

CO

CO 3

3

CH

3

C O - S - CoA

EXCESO DE ACETIL - S Co A

C O - S - CoA

2

CUERPO CETONICO CH

3 CH

+

SINTASA

2

COO

3

H M G Co A

2 CH

CH

CH

CH CO CH 3 3

COOH 2 ESPONTANEA

AC. ACETOACETICO

β - Hidroxi β - Metil- Glutaril - S Co A

CUERPO CETONICO

ACETONA

NADH + H NAD

β - HIDROXI - BUTIRATO DESHIDROGENASA

CUERPO CETONICO HO CH

3

C

CH

2

COOH

β-- HIDROXI -- BUTIRATO

Fig. 27 - 10. Formación de cuerpos cetónicos en la mitocondria del hígado.

de la enzima β-L-Hidroxi o 3-Hidroxibutirato Deshidrogenasa. Esta cadena de reacciones

516

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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entrega como productos finales β-Hidroxibutirato, Acetoacetato y Acetona (Fig. 27 - 10). Todos ellos pueden difundir al sistema circulatorio y ser llevados a los órganos periféricos. De los tres cuerpos cetónicos, la acetona es difícil de metabolizar y produce el olor típico de las personas en ayunas, tanto en la orina como en el aliento. Mientras que el D-βhidroxibutirato puede ser oxidado en los tejidos periféricos por una D-β-Hidroxibutirato Deshidrogenasa. El Acetoacetato obtenido por esta reacción es luego activado empleando Succinil-SCoA, (Fig. 28 - 10) por la enzima Cetoacil CoA Transferasa, propia del músculo y que no se encuentra en la mitocondria hepática. A continuación en la forma de Acetoacetil-SCoA, la molécula se rompe por medio de la enzima Tiolasa. El Acetil-SCoA que se produce entra ahora al Ciclo Tricarboxílico del Empleo de los cuerpos cetónicos como combustible en las Mitocondrias del músculo caerdiaco, esquelético y tejido nervioso SUCCINIL - S -CoA

COO

COO

CH 2 CH 2 C O - S - CoA

CH 2 SUCCINICO CH 2 COO

FUMARICO

CUERPO CETONICO

SANGRE

CH CO 3

CH

2

COOH

AC. ACETOACETICO β - HIDROXI -- BUTIRATO

C H C O C H C O - S - CoA MALICO 3 2 CETO ACIL -S-CoA TRANSFERASA CoA - SH

NADH + H

DESHIDROGENASA

NAD

2

CUERPO CETONICO

SANGRE

TIOLASA

OXALOACETICO

C H C O S -- CoA 3

HO CH C CH COOH 3 2

β-- HIDROXI -- BUTIRATO

CICLO TRICARBOXILICO Fig. 28 - 10. Empleo de los cuerpos cetónicos como combustible en los órganos periféricos. La Cetoacil-SCoA Transferasa no se encuentra presente en el hígado, pero sí en músculo y tejido nervioso.

músculo o del Cerebro. Por otro lado, el ác. Acetoacético también puede ser activado con ATP y CoASH por la enzima Tioquinasa Cetoacética: TIOQUINASA CETOACETICA CH3 – CO - CH2 - COO + ATP + CoASH--->CH3 – CO - CH2 – CO – S - CoA+ AMP +PPi Finalmente, el Acetoacetil-SCoA es transformado en Acetil-SCoA por la Tiolasa Mitocondrial y llevado al Ciclo Tricarboxílico como combustible en el músculo esquelético, músculo cardíaco y cerebro En el caso de que no se disponga de Oxaloacetato,

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permanecerán los cuerpos cetónicos circulando con el consiguiente problema de pH hasta ser excretados. En las personas afectadas por la Diabetes Mellitus, la falta de Insulina hace que las células no sean permeables a la Glucosa y al no contar con este sustrato como aporte de energía, el organismo recurre a los lípidos y a la β-Oxidación. De esta manera se produce una gran acumulación de Acetil-SCoA produciendo Cuerpos Cetónicos en las Mitocondrias del Hígado. Similar efecto puede tener una dieta con un gran contenido de grasas y baja en proteínas. A continuación se muestra en la Figura 29 - 10 el metabolismo general de los cuerpos cetónicos. El Acetil-SCoA formado en el Hígado puede provenir de los aminoácidos que entran al CTC o a la β-Oxidación de los ácidos grasos cuando los niveles de Glucosa son bajos o esta no entra al hepatocito por falta de Insulina. Luego, se producen los Cuerpos Cetónicos en la Mitocondria del Hepatocito y viajan por la sangre al Músculo y Cerebro, donde se activan por la Succinil-SCoA. A continuación entran al CTC como Acetil-SCoA y forman Citrato, siempre que exista Ác. Oxaloacético obtenido por Gluconeogénesis. FORMACION Y DESTINO DE LOS CUERPOS CETONICOS

HIGADO MITOCONDRIA

CITOPLASMA

CITOPLASMA

β - HIDROXI BUTIRATO ACETOACETATO ACETILSCoA β - OXIDACION

MUSCULO , CEREBRO

SANGRE β - HIDROXI BUTIRATO

β - HIDROXI BUTIRATO

ACETOACETATO

ACETOACETATO

VLDL

TAG

ACETOACETILSCoA

CARNITINA

ACILSCoA

MITOCONDRIA

ACILSCoA

ACILSCoA MALONILSCoA

CTC

GLUCOSA

+ PIRUVATO ACETILSCoA CITRATO AOA MALATO

PIRUVATO

ACETILSCoA CITRATO AOA MALATO

CITRATO Estimula a la Acetil-SCoA Carboxilasa

+

MALONIL-SCoA Inhibe la entrada de Acil-SCoA por CAT I

Fig. 29 - 10. Los cuerpos cetónicos necesitan de Glucosa Gluconeogénica como fuente de Oxaloacetato, para ser consumidos en la periferia.

En los animales rumiantes ocurre que en Invierno la mala calidad del pasto bajo en celulosa, no permite un nivel adecuado de ác. Propiónico para satisfacer la demanda de glucosa por la ubre y se produce Cetosis (Ver Capítulo 9 del CTC). Volver inicio

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al

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12) SINTESIS DE ÁCIDOS GRASOS La síntesis de lípidos ocurre a nivel del citoplasma a diferencia de la oxidación. Ambas vías ocurren en compartimentos diferentes para protegerse de un cortocircuito o un ciclo fútil, ya que no existe regulación cruzada por enzimas alostéricas como ocurre entre la Glicólisis y la Gluconeogénesis, donde los activadores de una vía son los inhibidores de la otra asegurándose con esto la independencia entre ambas. Cuando el Ciclo Tricarboxílico se encuentra inhibido por exceso de ATP, se acumula Citrato el que se elimina al exterior de la mitocondria. Este último se descompone enzimáticamente y da origen a Acetil-SCoA y ác. Oxaloacético. El Acetil-SCoA transportado por la lanzadera Citrato, será luego el precursor de la síntesis de los lípidos, pues podrá pasar tanto a la vía de la síntesis de los ácidos grasos como a la vía de la síntesis del colesterol (Fig.30 - 10).

Transformación de Hidratos de Carbono en Lípidos Citoplasma

Matriz Mitocondrial

Hidratos de Carbono

Piruvato

Citoplasma Síntesis de Ácidos Grasos o Colesterol

Piruvato

Piruvato Deshidrogenasa

AcetilSCoA

AcetilSCoA Oxaloacético

Citrato

CTC

Citrato

Citrato Liasa + ATP Oxaloacético +ADP + P Malato NADP

Piruvato

Piruvato

Enzima Málica

NADPH + H

Fig. 30 - 10.Transporte de Acetil-SCoA desde el interior de la Mitocondria hacia el citoplasma por la lanzadera Citrato.

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Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La síntesis de los ácidos grasos se llevará a cabo en dos etapas, primero será la Carboxilación con Biotina del Acetil-SCoA por medio del Complejo enzimático Acetil-SCoA Carboxilasa, para formar una molécula con mayor energía como el Malonil-SCoA y luego la acción del segundo complejo enzimático formado por la Ácido Graso Sintasa. La Acetil CoA Carboxilasa tiene un peso molecular de 225.kD y tres actividades enzimáticas como son: Biotina Carboxilasa, Carboxil Transferasa y la proteína Biotina Transportadora de Carboxilos, BCCP: Biotina Carboxilasa BCCP + HCO3- + ATP---> BCCP--COO- + ADP + P Carboxil Transferasa BCCP - COO- + CH3 - COSCoA---> BCCP + -OOC - CH2 - COSCoA BCCP = Proteína transportadora de carboxilos- Biotina Por el mecanismo anterior se carga de energía a la molécula de Acetil-SCoA como MalonilSCoA con gasto de un ATP, de esta manera las reacciones posteriores serán exergónicas. Por otro lado la Ácido Graso Sintasa, tiene un peso molecular de 265 kD y es un homodímero en que cada subunidad tiene la Proteína Transportadora de Acilos y 7 actividades enzimáticas como son: Acetil Transacilasa, Malonil Transacilasa, β-CetoacilPTA-Reductasa, β- Hidroxiacil-PTA Deshidrasa, Enoil-PTA-Reductasa, Cetoacil-PTA Transferasa y Tioesterasa (Fig. 31 - 10). Cada una de las reacciones esta multiplicada por dos, ya que el complejo enzimático es doble: (1) Acetil TransAcilasa CH3COS - CoA + Enz- SH-->CH3COS- Enz + CoA-SH (2) Malonil TransAcilasa HOOC- CH2COS- CoA + PTA-SH--->HOOC- CH2COS- PTA + CoA-SH (3) β- Cetoacil PTA Reductasa CH3COS-Enz + HOOC- CH2COS- PTA-->CH3COCH2COS - PTA + CO2 + Enz-SH (4) β-D-Hidroxiacil-PTA Deshidrasa CH3COCH2- PTA + NADPH + H-->CH3CHOHCH2COS - PTA + H2O (5) Enoil PTA Reductasa CH3CH = CHCOS- PTA + NADPH + H-->CH3CH2CH2COS- PTA + NADP+ (6) Cetoacil PTA Transferasa CH3CH2CH2COS - PTA + Enz- SH---> CH3CH2CH2COS – Enz + PTA-SH (7) Tioesterasa CH3-(CH2)14- COS - PTA + H2O---->CH3 - (CH2)14 - COOH + PTA-SH

520

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La síntesis del ác. graso Palmítico se puede resumir con la reacción del balance general: 7 CO2 + 7 Acetil - S- CoA + 7 ATP ---> 7 Malonil – S - CoA + 7 ADP + 7 P Acetil-S-CoA + 7 Malonil-S-CoA + 14 NADPH + 14 H -->Palmitoil-S-CoA + 7CO2 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------8Acetil-S-CoA + 14NADPH + 14H + 7ATP--->Palmitoil-S-CoA + 14NADP + 7ADP + 7P

521

SINTESIS DE AC. PALMITICO POR EL COMPLEJO ACIDO GRASO SINTASA.

SH

S H

CH3

C=O

C=O

C=O

S H

S

2

pant

cys

CH3

CH2

pant

cys

SH

S H

CH3 - CO - S - CoA

cys

1

2

S

COO

S

pant

cys

pant

pant

cys

cys

SH

S

S

C=O

C=O

CH3

CH2

pant

2

COO

( CH 2 ) 4

SH cys

C=O

S pant

cys

SH

2 NADPH

S

S

C=O

CH2

CH3

C=O

C=O

cys

pant

cys

4

S

SH

cys

2 NADPH 2 H2O 2 NADPH

cys

S

SH

S

C=O ( CH 2 ) 4

pant

8

SH

2 H2O

cys

S

C=O ( CH 2 ) 4 CH3

CH3

2 CH (CH) COOH 3

2

14

Fig. 31 - 10. Síntesis de Ácidos Grasos.

522

pant

cys

S

SH

C=O

S C=O CH2

CH2 C=O

C=O

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

CH3

S H

S

S H

6

pant

cys

S

SH

C=O CH2 CH2 CH3

7 CH3 CH2

CH2

CH2

CH2 C=O

S

S cys

S pant

cys

COO

2

COO CH2 CO - S - CoA

pant

pant

pant

cys

S H

CH2

cys cys

pant

pant

C=O C=O

2 CO2

pant

pant

CH3

CH2

SH

2 NADPH

CH3

CH3

C=O

S

C H

CH3

CH2 C=O

pant

OH

CH2

CH2 C=O

C=O C H

CH2 H C

CH2

S

5

C=O

C=O

S H

SH cys

cys

CH2

H

C=O

2 H2O

pant

CH3 H

C

S

pant

SH

C=O

S H

S

pant

C

C=O

S pant

cys

CH3 OH

CH2

CH2 CH2

5 veces

( CH 2 ) 4

C=O

C=O

H C

CH3

Reacciones de 2 a 7 CH3

3

SH

C=O CH2

CH3

Se repiten

CH3

2 CO2

CH2 CO - S - CoA

CH3

CH3

COO

S C=O

cys

S

C=O

CH2

CH2

COO

CH2 CH3

S H

S cys

pant

pant

cys

SH

S C=O CH2 CH2 CH3

La siguiente tabla indica que la cantidad necesaria de moléculas de Malonil-SCoA para la síntesis equivale a 7, mientras que se eliminan al mismo tiempo 7 moléculas de CO2 con liberación de energía: Acetil-SCoA + Malonil-SCoA = CetoAcil-S-PTA + CO2 2+3= 4+1 4+3= 6+1 6+3= 8+1 8 + 3 = 10 + 1 10 + 3 = 12 + 1 12 + 3 = 14 + 1 14 + 3 = 16 + 1 La síntesis del ácido graso se lleva a cabo desde la cola alquílica hacia el grupo carboxilo, pasando los dos carbones iniciales del Acetil-SCoA a formar parte de los carbones 15 y 16 del ác. Palmítico. La oxidación del ácido graso en cambio se lleva acabo desde la cabeza a la cola siendo los carbones 1 y 2, los primeros en salir como Acetil-S-CoA y al segundo ciclo de oxidación saldrán los carbonos 3 y 4 (Fig. 32 - 10).

SINTESIS De la cola a la cabeza 16

Cola

15

14

13

12

1

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH COOH 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Ac Palmítico

Cabeza

β - OXIDACION D e la cabeza a la cola Fig. 32 - 10. Dirección de la Síntesis y la Oxidación en un ácido graso.

En la Figura 33 - 10 se observa una visión simplificada de la síntesis de los ácidos grasos, donde se indica el origen intramitocondrial del Citrato que se descompone como portador de Acetil-SCoA.

523

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.

HIGADO MATRIZ MITOCONDRIAL

β - CETOACIL - REDUCTASA

CITOPLASMA

NADPH + H

HS

HS

NADP

O CH

3

O

C CH

2

CO2

P TA

CH

C S

Cys

O OOC CH

2

3

P TA

HO

C S

2

ACETIL TRANSFERASA MALONIL TRANSFERASA

PTA

C S

C

C

H DESHIDRATASA

C S

3

O

O

O CH

Cys

H

Cys

HS Cys

CH

3

H

H

O

C

C

C

PTA

S

NADPH + H HS

ENOIL REDUCTASA

Cys

PIRUVATO

NADP HS Cys

P TA

HS

O CH

O O OC C H CH3 – CO – S - CoA

ACETIL –SCoA Carboxilasa

2

CH CITRATO

C

S Co A

2

P TA

C S

2

ADP + P O CO2 + ATP

O 3

3

C H CH

C

S Co A

C H

3

C H CH 2

C S

2

Cys

O

CITRATO

OO C C H 2

AC. OXALOACETICO

PTA

C S

AC. OXALOACETICO MALATO PIRUVATO

PIRUVATO

CH3 - (CH2)14 - coo

-

TIOESTERASA SUELTA EL PALMITATO AL FINAL DE LA SÍNTESIS

Fig. 33 - 10. Síntesis de Ácidos Grasos.

La Oxidación de los ácidos grasos se regula a diferentes niveles, los cuales a su vez se controlan hormonalmente. La Triacilglicerol Lipasa del tejido adiposo es regulada por fosforilación con intervención del Glucagón, sin embargo su actividad es baja cuando los niveles de Insulina son altos. A su vez los elevados niveles de Malonil-SCoA inhiben alostéricamente a CAT-1 (Carnitina Acil Transferasa I), lo que evita la β-Oxidación. Además, la CoASH debe encontrarse disponible para que ocurra β-Oxidación ya que es un sustrato para la reacción de la Tiolasa. La síntesis de los ácidos grasos depende de la disponibilidad de sustrato o grupos acetilos como Acetil-SCoA presentes en el citoplasma. Su paso desde Citrato se encuentra regulado por la actividad de la lanzadera (antiport) Citrato-Malato, cuya actividad es a su vez disminuida por Palmitoil-SCoA, además la concentración de Citrato en la Mitocondria también afecta su transporte. La enzima Acetil-SCoA Carboxilasa es una enzima clave para la síntesis de ács grasos, se encuentra activada Alostéricamente por Citrato y covalentemente por fosforilación. Por otro lado, se inhibe alostéricamente por Palmitoil-SCoA y covalentemente por defosforilación. Volver al inicio

524

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.

13) ELONGACION E INSATURACIÓN DE LOS ACIDOS GRASOS. El principal ácido graso sintetizado es el Palmítico de 16 carbones el que puede elongarse o insaturarse en el Retículo Endoplásmico Liso o en la Mitocondria del Hígado. En estos organelos se encuentra la molécula de Malonil-SCoA con un conjunto distinto de enzimas que actúan sobre el ác. Palmítico para formar el Estearoíl-SCoA (Fig. 34 - 10) de 18 carbones mediante las reacciones de Adición de dos carbonos activados en la forma de Malonil-SCoA, Reducción, Deshidratación y nueva etapa de Reducción para formar el Estearoíl-SCoA.

Elongacion de Ács. Grasos COO Retículo Endoplásmico C H ( C H ) C O SCoA 2 14 3 Palmitoil – SCoA 16 Cs

Malonil - SCoA CH 2 C O SCoA C H ( C H ) C O SCoA 2 16 3

NADPH + H

NADP + C O 2 CoASH

Estearoil – SCoA 18 Cs

Mitocondria Saturados e Insaturados de 12 a 16 carbones

Elongación por adición de Acetil - SCoA

Inversión de la β -Oxidación empleando NADPH por FADH 2

Fig. 34 - 10. Elongación de ácidos grasos en el RETICULO ENDOPLASMICO LISO y la MITOCONDRIA.

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inicio

14) INSATURACION DE LOS ACIDOS GRASOS A su vez el ácido Palmítico, puede insaturarse para formar el Palmitoleato 16:1 cis (Delta, Δ 9) y el ácido Esteárico se puede insaturar en ác. Oleico 18:1 cis (Delta, Δ 9) por la Ácido Graso Desaturasa que emplea O2 y NADP, ubicada en la parte luminal del Retículo Endoplásmico Liso (Fig. 35 - 10). El paso de Oleato 18: 1( Δ9) a Linoleato 18: 2 ( Δ9,12) y de este a α-

525

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.

Linolenato 18: 3 (Δ9,12,15) ocurre solo en las plantas ya que los animales no poseen este sistema Desaturasa. Ambos ácidos grasos anteriores Linoleato 18:2 (Δ 9,12) y Linolenato 18:3 ( Δ 9,12,15) son esenciales para los animales y son producidos solamente por las plantas y deben encontrarse en la dieta humana. El ácido graso Linoleico 18:2 (Δ 9,12) mantiene el estado fluido de las bicapas en las membranas y también se le encuentra en las Lipoproteínas y Triacilgliceroles de almacenamiento. También es precursor del ácido Araquidónico, que dará origen a las Prostaglandinas y Tromboxanos.

Elongación e Insaturación de los Acidos Grasos Malonil – SCoA ES NECESARIO PARA LA C H3 - (CH2)14 - CO – SCoA Palmitoil-SCoA (C16)

ELONGACIÓN EN 2 Cs

NADPH Retículo Endoplásmico Liso HÍGADO

Fe+ 2

NADP Complejo DESATURASA

Cyt b

OLEICO (9) C18:1Δ

O2 5 HO

Fe + 3

NADPH + H

2

H C H( C H ) 3

El paso de Oleico (18:1) a Linoleico (18:2) no se encuentra presente en animales PLANTAS

C H3 - (CH2)16 - CO – SCoA Estearoil-SCoA (C18)

LINOLEICO C 18: 2 Δ

( 9, 12 )

7

C ( C H ) C O - SCoA 2 7 Oleoil - SCoA C

C 18 : 1 Δ

γ - LINOLENICO C 18 : 3 Δ

2

H

( 6, 9, 12 )

+C

2

HOMO γ - LINOLENICO C20 : 3 Δ

Alargamiento en 2 Cs

Desaturación en posición 6 con NADP y O2

El paso de Linolieco (18:2) a Araquidónico (20:4) ocurre en animales

( 9)

(8, 11, 14 )

Desaturación en posición 5 con NADP y O2

ARAQUIDONICO C 20 : 4 Δ

( 5, 8, 11, 14 )

Fig. 35 - 10. Insaturación de los Ácidos Grasos. Δ significa el carbón de la insaturación.

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526

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.

15) SINTESIS DE TRIACIL GLICEROLES. Los TAG se sintetizan en el retículo endoplásmico (RE) del hígado y tejido adiposo por el complejo de la Triacilglicerol Sintasa (Fig. 36 - 10). Los ácidos grasos pueden ser de origen exógeno o endógeno y son tomados por la enzima Acil-CoA Sintasa que se encuentra en la membrana del RE para ser activados con CoASH y luego esterificados con Glicerol-Fosfato, mediante la enzima Acil-CoA Transferasa formando el ácido Fosfatídico. El Glicerol-Fosfato proviene de la reducción de la Dihidroxicetona-Fosfato de la Glicólisis y de la fosforilación del Glicerol. El ácido Fosfatídico sufre la hidrólisis del grupo Fosfato por medio de la enzima Fosfatidato Fosfatasa y a continuación se le introduce otro ácido graso en su grupo hidroxilo remanente por acción de otra Aciltransferasa formando el Triacilglicerol. En el intestino se produce la síntesis en el RE, pero a partir del 2-Monoacilglicerol: 2-Monoacilglicerol + Acil-SCoA ----> 1,2 diacilglicerol 1,2 diacilglicerol + Acil-SCoA ----> 1,2,3 triacilglicerol El TAG puede ser posteriormente liberado al citoplasma en los adipocitos y formar gotas de aceite o al interior del RE en el hígado para salir como VLDL, mientras que en el intestino se empaca en los Qm, para salir luego a la circulación.

P

SCoA 22

C O

P

CH CH CH 2 2 OH OH

OH

CH CH CH 2 2 O O

CH CH CH 2 2 O O

CH CH CH 2 2 O O O

C O C O

C O C O

C O C OC O

2 CoASH

Aciltransferasa

Fosfatasa

Aciltransferasa

Fig. 36 - 10. La síntesis de los TAG en el RE de Hepatocitos y Adipocitos.

527

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.

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al

inicio 16) SINTESIS DE FOSFOLIPIDOS Se produce en el RE de los hepatocitos y posee varias rutas, una de ellas consiste en la activación del Ác. Fosfatídico con CTP para formar la Citidina-Difosfo-Diacilglicerol (Fig. 37 10), formándose Pirofosfato el cuál se hidroliza eventualmente haciendo la reacción exergónica. El ácido Fosfatídico activado por CTP reacciona con la Serina para formar luego la FosfatidilSerina. Es también posible en otras especies la formación de Fosfatidil Etanolamina por descarboxilación de la Serina y posteriormente por metilación del Nitrógeno de la Serina la formación de la Fosfatidil Colina (Fig. 37 - 10) _ COO

NH 2

P O CTP CH CH CH 2 2

PPi

P

O

P

CH 2

CH CH CH 2 2

O

N

CH

C

CH N

O

H

Fosfatidil Serina

Serina C M P

+ C NH 3 CH 2 O

P O

CH CH CH 2 2 Ac. Fosfatídico

CH 3

C D P - Diacilglicerol

3

+ HC N CH

3

H

C

Fosfatidil

C H2

Colina

O

H

HO

CO 2

OH H

+ H C NH 3 Fosfatidil CH 2 3 C H Etanolamina 3 O

P

P

O

O

CH CH CH 2 2

CH CH CH 2 2

Fig. 37 - 10. Formación de los Fosfolípidos.

En general en mamíferos la síntesis de Fosfatidil Colina ocurre de la siguiente manera: ATP

CTP

528

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Colina--------> Fosfatidil

Colina

Fosfato---------->

.

CDP-Colina

-------->

CDP-Colina

-------->

+ PPi + 1,2 Diacilglicerol Colina ATP CTP Etanolamina----->Etanolamina Fosfato------> CDP-Etanolamina ------> CDP-Etanolamina +1,2Diacilglicerol -------> Fosfatidil Colina La Colina proviene de la dieta y es considerada como un candidato a vitamina. Esta se Fosforila por medio del ATP y la enzima Colina Quinasa formando la Colina Fosfato. La que sufre una activación por medio de CTP y la enzima CTP-Colina Fosfato Citidiltransferasa formando CDP-Colina y Pirofosfato que al hidrolizarse hace la reacción exergónica. A continuación la CDP-Colina mediante la acción de la 1,2 Diacilglicerol Colina Fosfotransferasa se une al 1,2 Diacilglicerol formando la Fosfatidilcolina. La Fosfatidil Colina puede ser sintetizada por reacciones similares a la anterior.

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17) SINTESIS DE ESFINGOLIPIDOS Al igual que los Fosfolípidos tienen una cabeza polar y una cola apolar, la diferencia se encuentra en que no tienen Glicerol, pero sí otro tipo de alcohol como la Esfingosina. Esta última (Fig. 38 - 10), constituye el compuesto principal de los esfingolípidos y se obtiene o sintetiza de la siguiente manera. Primero se une el Palmitoil-SCoA a la Serina para formar Dehidroesfinganina, esta última es luego reducida con NADPH a Dihidroesfingosina y posteriormente oxidada o insaturada con FAD a Esfingosina. Este alcohol puede esterificarse con otro ácido graso como Acil-SCoA para formar la Ceramida. Este compuesto es un intermediario común de Glicolípidos como Gangliósidos y Cerebrósidos, así como también de la Esfingomielina. Los Cerebrósidos como monosacáridos de ceramida son parte de la membrana en las células del sistema nervioso central, mientras que los Gangliósidos considerados como oligosacáridos de ceramida con ácido Siálico son receptores de la superficie celular en el reconocimiento entre las células.

C O S CoA ( CH CH

2 )14 3

+

Palmitoil - SCoA

CH OH 2 H

C

NH

+ H

3

COO SERINA

H CO 2

C

NH

3

C

O

( CH

2 ) 14

CH OH 2

CH OH 2

CH OH 2

NADPH

CH 3

H

C

H

C ( CH

NADP

Dehidroesfinganina

+ CH

NH

H

C

H

C

OH

C

H

3

O H FAD 2 )14 3

C

H FADH

2

Dihidroesfingosina

NH

3

Esfingosina

( CH CH

2 ) 12 O

3 R

Azucares activados

GANGLIOSIDOS

CH OH 2

O

H

C

C

H

C

UDP - Galactosa

CEREBROSIDOS

ESFINGOMIELINA

H

C ( CH

CMP

NH

CH

H

CERAMIDA 2 ) 12 3

Composición de los Esfingolípidos importantes en la constitución de la Mielina: = Serina + Ác. Graso = Esfingosina + Ác. Graso

530

R

N Acil Esfingosina

Fig. 38 - 10. Síntesis de Esfingolípidos.

Esfingosina Ceramida

S Co A

OH

C

UDP CDP - Colina

C

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Esfingomielina = Esfingosina + Ác. Graso + Colina = Ceramida + Colina Cerebrósidos = Esfingosina + Ác. Graso + Galactosa = Ceramida + Galactosa Gangliósidos = Esfingosina + Ác. Graso + Glucosa + Galactosa + Ác. Siálico = Ceramida + Glucosa + Galactosa + Ác. Siálico Los esfingolípidos, se encuentran también involucrados en la determinación de los grupos sanguíneos como los antígenos A, B y O en la superficie de los Eritrocitos. Existen algunas enfermedades relacionadas con el metabolismo de los Esfingolípidos (en niños antes de los 8 años) y se deben a alteraciones en los Lisosomas, así tenemos a la enfermedad de Niemann-Pick (autosómica recesiva) producida por la falla de la Esfingomielinasa ácida, caracterizada por desórdenes nerviosos y cerebrales debido a la acumulación de subproductos de la Esfingomielina en cerebro, bazo, hígado y pulmones debido al recambio normal de las células. En otras variantes de la enfermedad se produce acumulación de Colesterol, proveniente del recambio normal de las membranas celulares. Otra de estas enfermedades es la de Gaucher caracterizada por anormalidades hematológicas, hiperesplenomegalia, lesiones en los huesos y pigmentación. Se debe en parte a la falla de una Glucocerebrosidasa de los lisosomas. En general estas enfermedades se deben a la falla en la función del Lisosoma involucrado en la degradación de la parte de hidrato de carbono en aquellos esfingolípidos como los gangliósidos. Otra enfermedad es la incapacidad de producir por una falla enzimática, la cantidad suficiente de surfactante pulmonar cuyo principal componente es la Dipalmitoil Lecitina. Esto sucede como al tercer mes después de nacido, que es donde se produce el síndrome causado por una disminución del intercambio de gases durante la respiración.

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.

18) DERIVADOS DEL ACIDO ARAQUIDONICO QUE COMPRENDEN A LOS EICOSANOIDES CONOCIDOS COMO PROSTAGLANDINAS, TROMBOXANOS Y LEUCOTRIENOS. Las Prostaglandinas se encuentran en todos los tejidos en bajas concentraciones (10-6 o 1012 M) y tienen variados efectos fisiológicos, ya sea en la misma célula (Paracrinos) donde se sintetizaron y también a corta distancia de esta. Algunos de sus efectos comprenden el control de la contracción y relajación de la musculatura lisa, el control del flujo sanguíneo renal, efectos vasodilatadores o vasoconstrictores en el sistema circulatorio, aumento de la motilidad intestinal, etc. El precursor de las Prostaglandinas se encuentra en las membranas plasmáticas formando parte de los Fosfolípidos estructurales y se denomina ácido esencial Araquidónico. La Fosfolipasa A2 se activa por ciertos factores hormonales o físicos que perturban la membrana celular y que inducen la producción de segundos mensajeros como el AMPc o el Ca+2, ante los cuales hidroliza al ácido Araquidónico o Eicosatetranoico (C20:4 Δ 5,8,11,14) constitutivo de los Fosfolípidos estructurales. El ác. Araquidónico se conoce también por su numeración desde el último carbono de su cola que forma un grupo Metilo y se denomina carbón ω (Omega). De esta manera tenemos el ω - 3 o ác. Linolénico C 18:3 (Δ 6, 9, 12) y el ω - 6 o ác. Linoleico C 18:2 (Δ 9,12 ). Este ácido graso esencial se puede adquirir directamente de la dieta o de otros ácidos grasos esenciales como el ácido Linolénico (C18:3 Δ6,9,12)o el ácido Linoleico (C18:2 Δ9,12) que se encuentran en los aceites vegetales. Estos ácidos sufren en el organismo a nivel del RE, dos insaturaciones consecutivas más una elongación a 20 carbonos para dar origen al ácido Araquidónico y al ácido Eicosapentanoico, este último también se le puede encontrar en los aceites de pescado. El ácido Araquidónico, es luego tomado por el sistema enzimático de la Prostaglandina Sintasa en el Retículo Endoplásmico, donde se encuentra la enzima Ciclooxigenasa. Esta última cataliza la entrada de Oxígeno y la ciclación de la cadena de carbonos en la región del doble enlace, exactamente en las posiciones 8 y 1. De esta manera se sintetiza la Prostaglandina PGG2 y posteriormente la Prostaglandina PGH2, desde donde se deriva una nueva serie de Prostaglandinas y los Tromboxanos. Los Tromboxanos se encuentran en las plaquetas y son sintetizados por la Tromboxano Sintasa a partir de PGH2, su efecto es la constricción de los vasos sanguíneos y la agregación de las plaquetas (Fig. 39 - 10). Ambos eventos favorecen la formación del coágulo, sin embargo el medicamento Aspirina bloquea su síntesis al unirse a una Serina del sitio activo de la enzima Tromboxano Sintasa, por lo que inhibe la coagulación de la sangre. Los Leucotrienos se encuentran en los Leucocitos y su precursor es también el ácido Araquidónico. Se caracterizan por tener un doble enlace conjugado formando un trieno (Leucotrieno) y se encuentran en el bazo, corazón, pulmones y cerebro. Su efecto es la vasoconstricción vascular y bronquial. Estas moléculas son capaces de inducir estados de isquemia con graves consecuencias en algunas patologías, como la oclusión coronaria y el

532

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.

asma bronquial. Otra de sus funciones consiste en servir de agente quimiotáctico durante los procesos inflamatorios.

COOH Ac. LINOLENICO

6

Endoperóxido

a:

Desaturasa Elongación + 2 Cs 5 Desaturasa

COOH 5 - LipoxigenasaO O H

D - Isomerasa

b:

Endoperóxido E - Isomerasa

c:

Endoperóxido F - Reductasa

COOH

Ac. ARAQUIDONICO Ciclooxigenasa

Ac. 5 - HIDROPEROXIEICOSATETRAEN

O COOH O

CH

Deshidratasa

3

O

OOH

COOH CH

PROSTAGLANDINA G 2 HO

LEUCOTRIENO A 4

O COOH

COOH O

C H3

O

CH

OH

3

Hidrolasa

OH

OH

PROSTAGLANDINA H 2 Tromboxano Sintasa

a:

b:

HO

c:

COOH CH

3

CH

3

PROSTAGLANDINA D 2

O

3

OH

LEUCOTRIENO B 4 COOH CH

HO

OH

COOH

O O

HO

PROSTAGLANDINA E 2

COOH

OH

3

TXA2

OH

PROSTAGLANDINA F 2

TROMBOXANOS

Fig. 39 - 10. Vías para la Síntesis de las Prostaglandinas, Tromboxanos y Leucotrienos denominados como Eicosanoides. Volver

al

inicio 19) CONTROL DE LA SINTESIS DE LOS ACIDOS GRASOS. La Insulina estimula la síntesis de estos complejos multienzimáticos a largo plazo, pero a corto plazo tenemos que Citrato y Acetil-SCoA activan alostéricamente a la Acetil-SCoA Carboxilasa o Malonil-SCoA Sintasa, estimulando la polimerización del protómero inactivo, mientras que los Acil-SCoA la depolimerizan, en otras palabras el Palmitioil-SCoA inhibe su síntesis . También parece ser estimulada por fosforilación mediante una Proteína Quinasa activada por AMPc.

533

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La Ácido Graso Sintasa a su vez puede ser regulada por los niveles de NADPH, ya que el aumento de su concentración estimula al complejo multienzimático en su síntesis. Similar cosa ocurre con la hormona Insulina que aumenta el número de copias de la AGS, aumentando concomitantemente la síntesis de palmitato. Una vez sintetizado el ácido Palmítico este puede viajar como AG desde el Hígado a los músculos en la seroalbúmina o como TAG en una VLDL, para ser oxidado o dirigirse al tejido adiposo para su almacenamiento. La formación de un Triacilglicerol se lleva acabo al activar el ácido graso nuevamente como un AcilCoA derivado. Este último junto con el Glicerolfosfato dará origen a un Triacilglicerol. El Malonil-SCoA que se forma previo a la síntesis de los ácidos grasos en el citoplasma por el complejo multienzimático en el hígado, ejerce un efecto inhibitorio en la Carnitina Acil Transferasa 1 (CAT 1), que transporta ácidos grasos al interior de la mitocondria. De esta manera se evita que la síntesis y la oxidación sean simultaneas. Volver al inicio 20) DIFERENCIAS ENTRE SINTESIS Y OXIDACION DE LOS ACIDOS GRASOS. a) La oxidación de los ácidos grasos se lleva a cabo en la mitocondria, mientras que la síntesis ocurre en el citoplasma. b) La oxidación ocurre por activación del ácido graso por unión a la Coenzima A, mientras que la síntesis ocurre con los precursores unidos a la Proteína Transportadora de Acilos (PTA) que depende del Complejo de la Ácido Graso Sintasa. Sin embargo, ambas moléculas poseen ác. Pantoténico y un grupo tiol donde se unen los acilos. c) La oxidación emplea primero FAD y luego NAD como coenzimas oxidantes en el interior de la mitocondria. La reducción durante la síntesis emplea NADPH proveniente de la Vía de las Pentosas o de la enzima Málica. d) La oxidación produce el Trans Δ-2-Enoil intermediario junto al L-OH derivado y la síntesis el D-OH derivado junto al Cis Δ- 2 intermediario. e) En la síntesis se activa el precursor Acetil-S-CoA mediante carboxilación con biotina para formar malonil-S-CoA, el CO2 se pierde posteriormente. En la degradación se activa el ácido graso con gasto de ATP y unión a la Coenzima A. f) Los ácidos grasos se degradan de la cabeza a la cola, es decir la oxidación ocurre siempre en el carbono β o bien en el carbono 2, 4, 6, 8, etc., ya que a la segunda vuelta el primitivo carbono 4 pasa a ser el β y así sucesivamente. Mientras que la síntesis procede de la cola a la cabeza, en otras palabras la primeras molécula adicionada, es el Acetilo y después se adicionan los malonilos. Por lo tanto para un ácido graso de 16 carbonos, entran primero los de la cola 16 y 15, para luego entrar el 14 y 13 y así sucesivamente se completa hasta el carboxilo número 1. g) La degradación ocurre en ayuno o durante el ejercicio muscular aeróbico, mientras que la síntesis ocurre después de una ingesta de carbohidratos. h) El ácido palmítico produce 131 ATPs durante la oxidación, menos los dos ATPs empleados en su activación. En la síntesis del mismo aminoácido se emplean 7 ATPs para producir 7 Malonil-S-CoA que entregarán 14 carbonos al Acetil-S-CoA y formar nuevamente el ác. Palmítico.

534

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

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535

al

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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21) EL COLESTEROL CARCTERÍSTICAS GENERALES El 80% del Colesterol se encuentra asociado a membranas celulares, donde ejecuta la función de mantener a la membrana en su forma funcional óptima, es decir en un estado intermedio no muy fluido (desordenado) ni muy cristalino (ordenado). El resto del Colesterol se distribuye en células especializadas como precursor de hormonas Esteroidales. A su vez, parte del Colesterol es reciclado como una sal biliar componente de la bilis y es secretado al intestino, donde parte es excretada y parte es reabsorbida. Esta última etapa, es la razón por la que se hace difícil de eliminar. En realidad no existe una vía especializada en la degradación del Colesterol a CO2 y Agua. El Colesterol es una molécula cíclica difícil de destruir. Incluso los Macrófagos no pueden degradarlo y su acumulación provoca la formación de células espumosas que dan origen a los Ateromas. En una persona normal, el total de colesterol debe ser de 140 gr mientras que los niveles plasmáticos normales deberán encontrarse entre los 180 a 220 mg por lt. Aproximadamente, la síntesis endógena de Colesterol diario alcanza a 1,5 gr y el aportado por la dieta es de alrededor de 0,3 gr. El Colesterol no es sintetizado por las bacterias y en el caso de los insectos, estos emplean fuentes externas para llegar a producir el esteroide denominado Ecdysona, que actúa como una hormona que se encuentra involucrada en los procesos de la metamorfosis.

DIETA 0,3 gr/día

COLESTEROL

HORMONAS ESTEROIDALES Y SALES BILIARES MEMEBRANAS CELULAS

SÍNTESIS ENDÓGENA 1 gr/día

1) HMG – CoA Reductasa (Dominio sensible a esteroles)

2) Acil - SCoA: Colesterol Acil Transferasa (ACAT). 3) Regulación del Colesterol en el plasma y célula vía Inh. del Nº de Receptores de LDL 4) Transporte reverso por HDL Fig. 40 -10. Distribución y control del Colesterol.

536

Inh. por Retroalimentación negativa Control de la Expresión Génica (Sistema SCREP/SCAP reducen RNAm para HMGReductase) Modificación covalente por Fosforilación (inactiva) /Defosforilación (activa) Velocidad de Degradación Enzimática (Poli – ubiquitinación/ Proteosoma)

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

En humanos el Colesterol es principalmente manejado por las lipoproteínas denominadas LDL y HDL. Cada vez que las LDL se enfrentan a un fibroblasto ocurre una serie de mecanismos, observado en la figura 41-10. Los receptores presentes en la membrana interaccionan con las apoproteínas de las LDL, que junto con las moléculas de Clatrina ubicadas en la superficie de la membrana, permiten la internalización por endocitosis. La Apo B 100 es considerada una apoproteína estructural, pero tiene una débil afinidad por los receptores que normalmente reciben a la Apo E. En el interior, la vesícula se funde con un lisosoma pasando a hidrolizar los ésteres de colesterol, mientras que las apoproteínas se descomponen en sus aminoácidos. El colesterol libre a su vez produce tres efectos: 1º Inhibe la síntesis endógena de Colesterol por medio del control sobre la HMG-CoA Reductasa. 2º Estimula la enzima ACAT o Acil-SCoA: Colesterol Acil Transferasa, destinada a esterificar Colesterol para su almacenamiento en el Retículo Endoplásmico 3º Inhibe el número de receptores LDL de la superficie del fibroblasto.

537

Receptores de LDL

Esteres de Colesterol

LDL

Memb. plasmática

Apo prot. B100 Fosa recubierta

Proteínas receptoras

+

Síntesis de Receptores LDL

Aparato de Golgi

Vesícula recubierta Vesícula reciclada

Síntesis de Colesterol

DNA

Endosoma

HMG-CoA Reductasa

Lisosoma Aminoácidos

RNA Ribosomas Retículo Endoplásmico

Inhibición Inhibición Exceso de Colesterol Activación

Proteínas Receptores

Colesterol ACAT

Almacenamiento de Ésteres de Colesterol

Fig. 41 – 10. Control intracelular de los niveles de Colesterol

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538

Esteroides de membrana, hormonas y sales bili

21) CONTROL SOBRE LA HMG-CoA REDUCTASA. La enzima reguladora de la síntesis del Colesterol puede ser afectada tanto en su actividad como en sus niveles disponibles por una serie de mecanismos (fig. 40-10), entre lo cuales tenemos: a) Inhibición alostérica mediante retroalimentación negativa de los mismos esteroides junto al ácido Mevalónico. b) Modificación covalente (fig. 42 – 10), que incluye fosforilación-defosforilación. Además, otras enzimas de la síntesis también son sometidas a control de esta misma forma. La forma FOSFO de la HMGCoA reductasa, es la inactiva, mientras que la forma DEFOSFO es la activa. El mecanismo cuenta con una Proteína Quinasa dependiente de AMPc como enzima fosforiladora o inactivadora y una Fosfatasa que es la enzima activadora. Ocurre que Epinefrina y Glucagón estimulan las Fosforilaciones y por consiguiente la inactividad de la enzima, mientras que Insulina estimula las defosforilaciones mediante disminución del nivel de AMPc y por consiguiente pone en actividad a la enzima. c) Control de la expresión de los genes (fig. 43 – 10) que codifican a la HMG Reductasa por medio de un sistema formado por proteínas transmembranas del Retículo Endoplásmico, denominadas SCAP-SREBP. Ambas proteínas se unen por los Ct. Una de ellas posee un dominio sensor de Colesterol (SCAP) y la otra (SREBP) libera una secuencia denominada b-HLH que actúa como factor de transcripción desde su lado Nt, cuando actúan sobre ella dos proteasas. Estos factores de transcripción estimulan encadena una serie de genes involucrados en la síntesis de Colesterol y Triglicéridos y Fosfolípidos. d) Degradación de la enzima marcapaso HMG CoA reductasa. Cuando existe una mayor concentración de Colesterol en el citoplasma se activa la enzima Ligasa de Ubiquitina, que marca a la enzima HMG-CoA Reductasa mediante la unión de un péptido de 7,6 kDs denominado Ubiquitina. Este péptido junto a la unión sucesiva de varios de ellos, hace que la enzima sea reconocida por el Proteosoma o complejo multienzimático, destinado a la hidrólisis de las proteínas. De esta manera el número de copias de la enzima disminuye hasta disminuir la síntesis endógena de Colesterol.

539

EPINEFRINA GLUCAGÓN

Inhibidor Fosfoproteína Fosfatasa (INACTIVO)

AMPc

ATP

INSULINA

AMPc

PKA

OH

P

AMPK, HMGRK o Reductasa Kinasa ( inactiva )

Fosfoproteína Fosfatasa ADP

Inhibidor Fosfoproteína Fosfatasa (ACTIVO)

HMG-CoA Reductasa Fosfatasa Inhibida Pi

Pi

ATP

Pi

HMG-CoA Reductasa (inactiva) OH HMG-CoA Reductasa (activa)

HMG-CoA Fig. 42-10. Regulación de la HMG-CoA reductasa por modificación covalente

540

OH

ProteAMPKK o ína P Reductasa Kinasa FosfaKinasa tasa 2C ADP ADP AMPK, HMGRK o Pi Reductasa Kinasa ( activa ) ATP

Mevalonato

Colesterol

SREBP : SCAP : WD 40 : bHLH :

STEROL REGULARORY PROTEIN BINDING ELEMENT SREBP CLEAVAGE ACTIVATING PROTEIN Ct DE SCAP CON 4 MOTIVOS REPETIDOS Y QUE SE UNE A CT DE SREBP FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN CONSTITUIDO POR EL MOTIVO Nt- BETA– HELIX - VUELTA – HELIX SIP Y S2P: PROTEASAS PRESENTES EN EL GOLGI

LADO CITOPLASMATICO DEL R.E. WD 40

NÚCLEO bHLH Ct

SCAP

SREBP

ESTEROLES

Bajo Colesterol, permite la asociación de SCAP con SREBP para ser presentado a S1P primero en el Golgi y posteriormente a S2P que libera bHLH que parte al Núcleo a promover la transcripción de Receptores de LDL

Exceso de Esteroles impide la unión de SCAP con SREBP y su presentación a S1P en el Golgi

LUMEN DEL R.E. GOLGI

bHLH Ct Reg.

WD 40

SCAP

Ct

bHLH

SREBP

S1P

Proteasa luminal del Golgi que es inhibida por alto nivel de Esteroles

bHLH

S2P Proteasa transmembrana que libra bHLH

Fig. 43 – 10. Sistema SREB/SCAP de regulación de la expresión

541

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

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542

al

23) SINTESIS DEL COLESTEROL. El Colesterol se sintetiza en el citoplasma y microsomas del hígado, intestino y corteza suprarrenal, además, puede ser sintetizado en aquellos otros órganos destinados a la síntesis de testosterona (testículos) y estradiol (ovarios). Fuera de las hormonas esteroidales el Colesterol ejerce su efecto en la fluidez de las membranas celulares y es eliminado finalmente en las heces al ser secretado como una sal biliar al intestino. No existe vía catabólica del colesterol que lo oxide a CO2 y agua, por lo tanto su acumulación está sujeta a una serie de trastornos provocados en la salud de las personas. La vía destinada a la síntesis del colesterol parte desde Acetil-SCoA como precursor y logra formar en una primera etapa los Isoprenos ( 2-metil butadieno). Estos compuestos son poliinsaturados y poseen 5 átomos de carbono que se adicionan entre sí generando nuevas moléculas de mayor tamaño. Son de extremada importancia en las plantas, donde dan origen a vitaminas, esencias vegetales e incluso al caucho. El precursor Acetil-S-CoA, puede ser originado por los Hidratos de Carbono, Aminoácidos y la Beta-oxidación de los Ácidos Grasos. En la primera etapa de la síntesis del Colesterol, 3 moléculas de Acetil SCoA generan el 3OH-3-Metil-Gluataril-SCoA el que mediante una reducción con dos moléculas de NADPH da origen al ácido Mevalónico, un compuesto de 5 carbones (Fig. 40 - 10). Esta reacción es catalizada por la enzima HMGCoA Reductasa o enzima marcapaso. El ácido Mevalónico en la segunda etapa es activado por tres moléculas de ATP y pierde un CO2 dando origen a la unidad Isoprénica soluble Isopentenilpirofosfato (IPP), que aún puede isomerizar a Dimetilalil Pirofosfato (DMAPP). La síntesis del Colesterol es totalmente distinta a la síntesis de los ácidos grasos, donde el precursor Acetil-S-CoA acumula energía en la forma de de Malonil-SCoA gastando un ATP/ Malonil-SCoA para hacer la adición sucesiva de moléculas exergónica. En el caso particular del IPP, este cuenta con 5 átomos de carbono y es soluble por los fosfatos además de encontrarse en un estado activado que le permite en una tercera etapa condensarse sobre sí mismo 6 veces para dar origen al Escualeno, que posteriormente en un cuarto paso que cuenta con sucesivas etapas de oxidación y descarboxilación se convierte en Lanosterol, precursor directo del Colesterol de 27 átomos de carbono (Fig. 40 – 10 y 41 - 10) después de una quinta etapa que incluye varias reacciones. El IPP en las plantas, es también precursor de los terpenos cíclicos, entre los cuales se encuentran las esencias vegetales como el Limoneno (cáscara del limón), Cineol (eucaliptus), Longifoleno, Pineno (pino) y otros terpenos acíclicos como el Citronelal (eucaliptus). El IPP es también precursor de los compuestos Carotenoídeos como la Vitamina A y las otras vitaminas liposolubles D, E y K, junto a las hormonas vegetales entre las que se encuentran las Auxinas, Giberelinas y Citocininas.

543

H M G- C oA R e d u c t a s a

H M G- C oA S i n t a s a

T io la s a 2CH3 C O

S

C oA S H

CH3

H C 2

CoA

D e s c a rb o x ila s a COO

C

CO2 + P i

C

H

O

H C

H

CH3 C O

P

O

O P

O

O

IP P

O

COO COO CH3 C O S CoA 2 NADPH + 2 H CH2 CH2 M e v a l o – C H 2 C S C oA CH3 C OH CH3 C OH n a to CH2 O CH2 C oA S H 2 N A D P C o A S C CH2 OH C oA S H O ATP 3 -O H -3 -M e til-G lu ta ril-S C o A ADP

CH2 O CH3 C O P O O CH2 O O O CH2 O P O P O

COO

ATP ADP

CH2

O O CH2 O P O P O O O

O

O

IP P

ATP

CH2 C OH

CH3

CH2 CH3

ADP

C OH CH2 CH2 O

O P O O

M e v a lo n a to

P- P-

COO-

-

P-

M e v a lo n a to

Is o m e ra s a H H C

O

O

O

P

O P O

O

CH

CH3

O

CH3

O P O P

CH3

CH3

D M A P P

Fig. 44 - 10.Síntesis de los Esteroides.

544

CH2

CH3

HC H

CH3

CH3

T ra n s fe ra s a

C

+

C

D M A P P

O

O

O

CH

T ra n s fe ra s a

D M A P P

O

O

H H C

C

O P P

G P P

PP i H C O

H

IP P

O

O

P O P O

O

O

CH3

CH3

G P P

CH3

IP P

F P P

P P i O P P

P P i

CH3

CH3

F P P

E s c u a le n o

HMG CoA R e d u c ta s a

L a n o s te ro l

C o le s te ro l

(- )

Fig. 45 - 10. Síntesis final del Colesterol.

Primera Etapa: Varias Enzimas 3 Acetil-SCoA + 2NADPH+H+H2O------------------------>AC. MEVALONICO+2NADP+3CoASH (2 C ) (6C) Segunda Etapa: Mevalonato Quinasa AC. MEVALONICO + 3 ATP----------------------------------> ISOPENTENIL-PP+Pi+3ADP+CO2 (6C) (5C) Isomerasa ISOPENTENIL-PP DIMETILALIL-PP ( IPP ) ( DMAPP ) Tercera Etapa: Isoprenil Transferasa IPP + DMAPP-------------------------------------> GERANIL-PP + PPi (5C)(5C) ( 10 C , GPP ) Prenil Transferasa GPP + IPP-------------------------------------> FARNESIL-PP ( 10 C ) ( 5 C ) ( 15 C , FPP )

545

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

Escualeno Sintasa FPP + FPP + NADPH + H ----------------------------------> ESCUALENO +2 PPi ( 15 C ) ( 15 C ) ( 30 C ) Cuarta Etapa Escualeno Monoxigenasa y Ciclasa ESCUALENO + 1/2 O2 ------------------------------------------------------> LANOSTEROL ( 30 C ) ( 30 C ) Varias Enzimas LANOSTEROL ---------------------------------------------> COLESTEROL + HCOOH+2CO2 ( 30 C ) ( 27 C , C27 H46 O )

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546

al

24) SÍNTESIS DE LAS SALES BILIARES La síntesis de los ácidos biliares ocurre en el hígado a partir de Colesterol para llegar al ác. Quinodeoxicólico y ác. Cólico (fig. 42-10), ambos se conjugan con Taurina y Glicina. para dar origen al ác. Taurocólico y Glicocólico. Ambos son secretados desde los canalículos biliares a la vesícula y posteriormente al intestino, donde después de emulsificar a las grasas se elimina la Taurina y la Glicina para ser reabsorbidos nuevamente. Debido a este tipo de recirculación enterohepática (fig. 43 – 10), es difícil eliminar los niveles de Colesterol, excepto cuando la estadía intestinal es acortada por acción de algunos compuestos que actúan como resinas que no se absorben, pero sí unen sales biliares y las arrastran, promoviendo una rápida evacuación por acortamiento del tiempo dedicado a la absorción intestinal.

COLESTEROL o

HO

o

Á C Q U IN O D E O X IC Ó L IC O HO

OH

o

HO

o

Á C . C Ó L IC O HO

OH SCoA

HO

HO

C O L IL - S C o A

o

OH G L IC IN A

T A U R IN A

CoASH

CoASH HO

HO

SO3

HN

O

-

HN HO

o

OH

Á C . T A U R O C Ó L IC O

HO

o o

OH

Á C G L I C O C Ó L IC O

Fig. 46 – 10. Resumen de la Síntesis de los Ácidos Biliares a partir de Colesterol

547

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

HIGADO

CIRCULACIÓN SISTÉMICA

COLESTEROL ÁCS. CÓLICOQUINODEOXICÓLICO CONJUGACIÓN CON TAURINA Y GLICINA

95%

5%

CIRCULACIÓN PORTAL

VESÍCULA 90% DUODENO

ILEON 10% HECES

Fig. 47 – 10. Circulación de los Ácidos Biliares.

La sangre venosa va desde el Ileón a la vena Porta y desde allí a los canales sinusoidales del Hígado. Los Hepatocitos toman nuevamente los ácidos biliares desde la sangre sinusoidal y son nuevamente secretados a los canalículos. Volver inicio

25) FENOTIPO DE CINTURA HIPERTRIGLICERIDÉMICA U OBESIDAD VISCERAL En la actualidad se ha observado la presencia de tres factores asociados con esta característica y consisten en: a) Hiperinsulinemia o resistencia a la Insulina conocida como Diabetes Tipo 2. b) La Presencia de Hiperapoliproteína B o alto nivel de LDL c) Hipertensión. Todos estos factores conducen a la Aterogénesis o enfermedad cardiovascular.

548

al

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

.

La Hipertensión daña el Endotelio capilar liberándose factores quimiotácticos que atraen a los macrófagos. Estos últimos ingieren el Colesterol y como no lo pueden degradar se transforman en células espumosas cuya agrupación dará origen al Ateroma.

REFERENCIAS

549

Héctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lípidos

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Sterol Biosynthesis. , G.J. Schroepfer,Jr. Ann.Rew.Biochim. ,Vol 50,585-621,1981. Sterol Biosynthesis., G.J. Schroepfer,Jr. Ann.Rew.Biochim. ,Vol 51,555-585,1982. Fatty Acid Synthesis and its Regulation., J.J. Wakil , J.K. Stoops and V.C. Joshi., Ann.Rew. Biochem. Vol 52, 537-579, 1983 http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/fasynthesis.htm http://www.mednote.co.kr/BOKnote/lipsynth.html http://www.ohsu.edu/cliniweb/D10/D10.516.532.html http://www.kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/Lipo2/index.htm

550

550

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

AMINOÁCIDOS 1 1) SINTESIS Y OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS

554.

2) SINTESIS EN MICROORGANISMOS Y PLANTAS DE LOS AMINOACIDOS ESENCIALES Y SU OXIDACION EN HUMANOS 555 3) SINTESIS DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS COMO VALINA, LEUCINA E ISOLEUCINA 557 4) OXIDACIÓN DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS 559 5) SINTESIS Y OXIDACION DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS AROMATICOS COMO FENILALANINA, TIROSINA Y TRIPTOFANO 561 6) OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS AROMATICOS 563 7) SINTESIS Y OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA 567 a) Síntesis de Metionina y Treonina 567 b) Oxidación de Metionina y Treonina en Humanos 569 8) SINTESIS DE LISINA, ARGININA E HISTIDINA 573 a) Síntesis de Lisina 573 b) Síntesis de Arginina e Histidina 575 c) Oxidación de Lisina 578 d) Oxidación de Arginina e Histidina en Humanos

579

9) METABOLISMO DE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES 354 a) METABOLISMO DE LA ALANINA, PROLINA, GLUTAMICO Y GLUTAMINA 581 b) METABOLISMO DE LA GLICINA Y SERINA 581 c) METABOLISMO DE LA TIROSINA 587 d) METABOLISMO DE LA CISTEINA 587 10) MANEJO DEL AMONIO 587 11) TRANSPORTE DEL AMONIO POR LOS AMINOACIDOS GLUTAMICO, GLUTAMINA Y ALANINA 593

551

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

AMINOACIDOS 2 12) ENTRADA DE LOS AMINOACIDOS AL CICLO TRICARBOXILICO 594 13) CICLO DE LA UREA 596 14) FALLAS EN EL CICLO DE LA UREA

597

15) REGULACIÓN DEL CICLO DE LA UREA

599

16) CONTROL DEL AMONIO DURANTE LA INANICION

599

17) APÉNDICE – MALNUTRICIÓN PROTEICO – ENERGÉTICA

552

603

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

1) SINTESIS Y OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS. De los 20 aminoácidos presentes en los Eucariontes, 10 de ellos no pueden ser sintetizados en la especie humana, como son los ramificados Valina, Leucina, Isoleucina y aquellos

553

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

que poseen anillos aromáticos como Fenilalanina y Triptófano. Tampoco es posible dentro del metabolismo incorporar Azufre libre a la estructura de algunos de ellos por lo que se requiere de Metionina en la dieta. Los aminoácidos esenciales son necesarios al igual que las vitaminas y algunos de los ácidos grasos poli-insaturados (linoleico, linolénico). Los otros 10 restantes no esenciales, aunque no menos útiles que los primeros pueden ser manejados por el metabolismo humano. Los aminoácidos esenciales se pueden clasificar como:

Hidrofóbicos ramificados

Hidrofóbicos con anillos cíclicos

Valina Leucina Isoleucina Fenilalanina Triptófano

Hidrofóbico que porta Azufre para incorporarlo a la Serina y producir Cisteína

Metionina

Polares sin carga

Treonina

Polares con carga positiva

Lisina Arginina* Histidina

Polares de carga negativa

No se encuentran

*

Arginina es esencial solo en lactantes que no han madurado a plenitud el Ciclo de la Urea en el Hígado. Los aminoácidos tanto esenciales como no esenciales pueden ser precursores de casi todos los compuestos que necesita el metabolismo intermediario, de esta manera se encuentran entre ellos los aminoácidos Glucogénicos que podrán transformarse en Glucosa, mientras que otros aminoácidos serán los Cetogénicos, cuyo esqueleto hidrocarbonado puede dar origen a los Ácidos Grasos y compuestos relacionados. Los aminoácidos son también precursores de otras moléculas importantes para el organismo como son los Neurotransmisores, Grupos Prostéticos (Heme) y las Bases Nitrogenadas de los Ácidos Nucleicos. El principal problema del metabolismo aminoacídico es la eliminación del amonio para aquellos aminoácidos que no se emplean en la síntesis de proteínas o en la generación de aminas metabólicas y grupos prostéticos. Los aminoácidos que por circunstancias especiales del metabolismo se destinan a transformarse en energía, glucosa o ácidos grasos, aportarán solamente su esqueleto hidrocarbonado, previa eliminación del Nitrógeno. Por ejemplo, el aminoácido Glutámico y su relacionado la Glutamina, aunque no esenciales son fundamentales para el transporte del Nitrógeno que viaja en la forma de los grupos α-Amino

554

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

(-NH2) o Amido (- CO-NH2), desde los distintos tejidos hacia el Hígado, para la formación de Urea como producto de deshecho. Uno de los motivos que ha impulsado el conocimiento detallado de las vías metabólicas en los aminoácidos, es la existencia de "los errores congénitos del metabolismo". Estos errores se caracterizan por ser enfermedades moleculares recesivas (no la sufren los heterozigotos) y poco comunes. Las alteraciones metabólicas que caracterizan estas enfermedades ocurren por la acumulación de intermediarios catabólicos, como consecuencia de fallas en las reacciones enzimáticas por causas que se pueden enumerar como: ausencia de la enzima, un cambio de su cinética o bien una mala regulación del funcionamiento de las enzimas involucradas en las reacciones de oxidación de los aminoácidos. Las consecuencias de estas fallas se traducen en aminoacidemias y/o aminoacidurias, que tienen un efecto nocivo al organismo alterando el pH de la sangre y causando toxicidad al sistema nervioso central. Ocurre en estas enfermedades que los genes que codifican para las enzimas deficientes pueden estar presentes, pero no se expresan o bien se expresan, pero la enzima no es funcional por alguna mutación o bien, no es posible controlar su actividad enzimática. En algunos casos puede ocurrir que los genes no estén presentes del todo o solo lo estén parcialmente a causa de alguna deleción en su estructura. Ocurre también que muchas de estas enfermedades son clínicamente similares, pero molecularmente distintas. Volver al inicio 2) SINTESIS EN MICROORGANISMOS Y PLANTAS DE LOS AMINOACIDOS ESENCIALES Y SU OXIDACION EN HUMANOS. El estudio de la síntesis de los aminoácidos es extremadamente complejo por la cantidad de isoenzimas presentes y los compartimientos donde se lleva a cabo. De esta manera, la aproximación estilo bioquímica clásica, que consiste en homogenizar y estudiar los intermediarios no es exitosa, ya que se mezclarían las isoenzimas de los distintos compartimientos. La única solución hasta ahora ha consistido en recurrir a la generación de microorganismos mutantes. Especialmente aquellos con enzimas defectuosas o ausentes en distintas etapas de las vías metabólicas que conducen a la síntesis de algún compuesto. Dichas técnicas se basan en la administración de los posibles intermediarios de estas vías, más los experimentos de conjugación (traspaso de material genético) entre las distintas estirpes bacterianas, para así lograr la síntesis completa de un determinado aminoácido. De esta forma se ha podido estudiar cada una de las etapas relacionadas con la síntesis de un aminoácido en especial. Lisina y Treonina son los aminoácidos esenciales que se encuentran en menor proporción en los cereales, de tal manera que se ha investigado ampliamente la forma de aumentar su producción. Otros aminoácidos como los aromáticos, son de importancia tanto en bacterias como en plantas. En estas últimas, la misma vía de síntesis produce también ác. Siquímico, compuesto cíclico esencial para la fabricación de los elementos estructurales leñosos (Lignina). El Triptófano es uno de los aminoácidos aromáticos esenciales que requiere de una mayor cantidad de energía para su síntesis. En los animales, este aminoácido es necesario para la síntesis del neurotransmisor Serotonina y la Amina conocida como ácido Nicotínico o bien denominada en la actualidad como Niacina, precursor de la coenzima NAD. Los tres aminoácidos esenciales del tipo ramificado Valina, Leucina e Isoleucina se sintetizan en los Cloroplastos de todas las plantas, principalmente en aquellos tejidos que se encuentran en crecimiento y sus vías biosintéticas han sido lo suficientemente estudiadas en

555

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

la actualidad. El Nitrógeno es tomado por las plantas en la forma de Nitrato y reducido a la forma de Amonio por la Nitrato y Nitrito Reductasa. Este amonio es posteriormente ingresado a los esqueletos hidrocarbonados para formar los aminoácidos. Por otro lado, los aminoácidos no esenciales como lo son Glutámico, Glutamina, Aspártico y Asparegina en animales, se emplean en la planta para transportar el Nitrógeno hacia las distintas necesidades metabólicas como se verá posteriormente en un Capítulo posterior destinado a ello.

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al

inicio

3) SINTESIS DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS COMO VALINA, LEUCINA E ISOLEUCINA.

556

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

SINTESIS DE AAS. HIDROFOBICOS ALQUILICOS

Acetil -- SCoA

CH COOH 2

OH H O CH 3

PIRUVATO

C

COOH

Adición de Piruvato O CH 3

C

H

NH

COOH

TREONINA

2

HO C Adición + Cetoisovalerico HC

α-Aceto Láctico

Adición de Piruvato

O

CHH 3 C C COOH

OH

HC

α-Aceto- α- OH Butírico

Reordena

OH O H

miento

Reordena CH

CH 3

miento

3 COOH

C C H O

CH

3

α-Cetoisovalérico

Hidratación

H NH 2

COOH

VALINA

H

COOH

H C

COOH

α,β-Dihidroxi-β-Metilvalérico

3 C

OH O

CH CH C 3 2

C

O

COOH

HC

CH

α-Ceto-β-Metil Valérico

C NH

H HN 2

COOH O

C

Transami nación

H CH COOH 2

ISOLEUCINA

HC HC 3

CH 3

LEUCINA

3

α-OH β-Carboxi Isocaproico

Reordenamiento

CH H 3 COOH

α-Isopropil Maleico

HC 3

Transami nación

CHH 3 C C

CH

CH CH C 2 3

Transami nación

C

CH 3

HC 3

C H3 H CH C 2

COOH

C COOH

OH O H

α,β-Di-Hidroxi CetoisovaléricoC H3

3

α-Isopropil Malico

HC

α-Cetobutírico

CH 3

Reducción

CH

Deshidratación

CH CH C COOH 3 2 C O

Reducción

COOH

HC 3

CH CH C COOH 3 2

COOH

OH

C

Thr Deaminasa

CH 3

C C

CH 3

CH 3

C

COOH

HC H

H C C H3 HC 3

α-Ceto Isocaproico

Fig 1 - 12. Síntesis de Valina, Leucina e Isoleucina.

Los aminoácidos hidrofóbicos esenciales como Valina, Leucina e Isoleucina (Fig. 1 - 12), se sintetizan a partir del PIRUVATO. En el caso de la Valina y la Isoleucina, un Acetaldehído activado con Tiamina Pirofosfato (TPP) es entregado a los cetoácidos Pirúvico y α-Cetobutírico para extender su estructura, seguido de una reducción y reordenamiento de los grupos tanto Hidroxi como Metilo, formándose de esta manera los α-cetoácidos correspondientes, para ser luego Transaminados y convertidos en aminoácidos. La síntesis de la Leucina empieza con la

557

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

adición de Acetil-SCoA sobre el cetoácido α-Cetoisovalérico, para formar así el ác. αIsopropilmálico, posteriormente ocurre una reacción similar a la catalizada por la cisAconitasa del CTC con una Deshidratación-Hidratación y subsecuente reordenamiento en la posición del OH, para facilitar la salida del CO2 y formar así el ác. α-Cetoisocaproico, el que finalmente por medio de una Transaminación da origen a la Leucina.

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4) OXIDACIÓN DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS.

558

al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Isoleucina, Leucina y Valina (Fig. 2 - 12), son degradados principalmente en el músculo y en su primera reacción es eliminado el amonio por Transaminación. El grupo amino es cargado en el cetoácido α-Cetoglutárico para formar Ac. Glutámico que transportará el amonio al Ciclo de la Urea. Los Cetoácidos restantes sufren enseguida una Descarboxilación oxidativa, con una activación mediante la CoASH. Posteriormente, son insaturados por una oxidación del tipo α-β, con la subsecuente formación de un doble enlace entre estos dos carbonos. En el caso de la Leucina se introduce un nuevo carboxilo, con la ayuda de la Biotina, para luego continuar al igual que la Isoleucina y la Valina, con una insaturación e hidratación, CONVERSION DE LOS AAS ALQUILICOS HIDRFOBICOS A PRECURSORES E INTERMEDIARIOS DEL CICLO TRICARBOXILICO

CH

CH

CH 3 CH 2 CH

CH CH

NH

CH 3 CH

CH 3

3 C

3

CH

2

CH

H C

OH

H C

CH

C

O

C

CH

CH

C

O

2

O

CH3 – CO-SCoA

CH

3

3

1 2

CH

CH

3

3

C

CH

C

O

3

3

H C

CH

C

O

2 COOH

COOH

S CoA

S CoA

O

3

CH 3

8

CH 2

S CoA S CoA

ISOLEUCINA

α-Ceto β-Metil Valérico

C

α-Metilbutiril- SCoA Tiglil – ScoA α-Metil β-OHO H α-Metil Glutaril – ScoA Acetoacetil - SCoA

S CoA

Propionil SCoA

Carboxilación CH

CH 3 CH

CH

CH 3

CH

CH

CH 2

CH

3

CH 3

3

CH

CH

2

C

NH

1

O

CH

3

CH

CH 2

3

C

CH

3

CH

C

CH 2

COOH

3

O

S CoA

C

COOH CH3

CH3 – CO-SCoA

7

CH 2

CH

O

O

C

S CoA

C

O

3 CH 2

Glutaconil OH

C

-SCoA

9

3

CH

CH 3

CH

NH

CH 3

1

CH

CH

C

O

3

CH

CH 2

3

CH

CH 3

C

CH

C

O

C

O

3

CH 2

OH

CH

CH

C

O

3

CH 2

OH

C H

CH

COOH

CHO

3

CH

O CH 3

VALINA

C

SCoA

CH

CH 3

COOH

COOH

2 COOH

O

Ac. Aceto acético

HO

CH

CH

C

O

S CoA

S CoA

α-Cetoisocaproico Isovaleril-SCoA β-Metil Crotonil β-Metil Glutaconil -SCoA -SCoA

LEUCINA

C

HO

6

5

C

COOH

4

CH

2

2

2

COOH

3

O

COOH

Ác. α-Ceto Ac. Isovalérico

2

S CoA

Isobutiril-SCoA

S CoA

S CoA

Metacril-SCoA β-OH β-OH Semialdehído Isobutiril-SCoA Isobutírico Metlmalónico

Metil MalonilSCoA

Fig. 2 - 12. Los aminoácidos Valina, Leucina e Isoleucina forman intermediarios del CTC.

similar a la que ocurre en la β-Oxidación de los Ácidos Grasos. Los Hidroxiderivados que se

559

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

forman en esta etapa, se oxidan posteriormente a sus correspondientes cetoácidos. Estos últimos se rompen generando productos que son aceptados como intermediarios del CTC. Otros compuestos como la Propionil-SCoA y la Metil-Malonil-SCoA, forman después de algunos reordenamientos Succinil-SCoA para entrar finalmente al CTC. Tabla 1 - 12 Nombre 1

2 3

4 5 6 7 8

Falla la Enzima

α-Cetoácido Descarboxilasa y/o la α-Cetoácid Deshidrogenasa de cadena ramificada con solo actividad residual. Val, Leu, Ile en la orina. Orina olor a mermelada α-Cetoácido Descarboxilasa inactiva, ocurre de arce y presencia de α-Cetoácidosen pob. Mediterranea, retardo físico y mental Acidemia y/o Aciduria Isovalérica, Isovaleril-SCoA Deshidrogenasa Isovaleraturia, Isovaleremia Olor a pié sudado β-Metil Crotonil Glicinuria β-Metil Crotonil-SCoA Carboxilasa Atrofia muscular Holocarboxilasa Sintasa. β-Metil Crotonil Glicinuria Cetoacidosis Aciduria β-Metil Glutacónica β-Metil Gluataconil Hidrasa Cetoaciduria de aminoácidos con residuos ramificados

Aciduria β-Hidroxi β-Metilglutárica Aciduria α-Metil-β-Hidroxi-Butírica Cetoacidosis y vómito

β-Hidroxi β-Metilglutaril-SCoA Liasa β-Cetotiolasa

Hipervalinemia

Valina Transaminasa

9

Isoleucina produce ambos, Acetil-SCoA y Propionil-SCoA, siendo tanto Cetogénico como Glucogénico, mientras que Leucina produce Acetil-SCoA y ác. Acetoacético siendo en ambos casos Cetogénico. Finalmente Valina produce Metil-Malonil-SCoA que pasa a Propionil-SCoA, este último se integra al CTC como Succinil-SCoA y será Glucogénico. El metabolismo de estos aminoácidos produce NAD y FAD reducido que serán capaces de producir ATP. En la Tabla 1 - 12, se pueden observar las enfermedades producidas al fallar algunas de las enzimas normalmente presentes en estas vías metabólicas. Debido a ello se produce la acumulación de ciertos intermediarios, ya sea en la sangre y/o en la orina. Cuando la descarboxilación oxidativa por la α-Cetoácido Descarboxilasa se encuentra parcial (1) o totalmente (2) bloqueada, aparecen los tres aminoácidos ramificados y sus cetoácidos en distintas concentraciones tanto en la sangre como en la orina. Durante el bloqueo total se produce orina con "olor a mermelada de arce" y la aparición de síntomas neurológicos en los recién nacidos al cabo de unos días. La Acidemia y/o Aciduria Isovalérica (3) o "síndrome de los pies sudorosos" es otra de estas enfermedades, donde la reacción catalizada por la Isovaleril-SCoA Deshidrogenasa está bloqueada y se forma el compuesto tóxico denominado ác. Isovalérico, como producto de la hidrólisis del intermediario acumulado Isovaleril-SCoA. La enfermedad aparece en la

560

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

niñez y se trata con Glicina para que reaccione con el Isovaleril-SCoA acumulado, mediante la enzima Glicina-N-Acilasa, ya que de esta manera se forma un compuesto no tóxico como la Isovaleril-Glicina que puede ser excretado sin inconveniente. En la β-Metil-Crotonilglicinuria (4) y (5), falla una de las dos o ambas enzimas β-MetilCrotonil-SCoA Carboxilasa y/o Propionil-SCoA Carboxilasa e incluso en algunos casos la Piruvato Carboxilasa. Los pacientes responden bien a las dosis de BIOTINA. Finalmente se encuentra la Hipervalinemia (9) que involucra a la enzima Valina Transaminasa y es caracterizada por altos niveles de Valina en la sangre y orina, pero no de Leucina o Isoleucina. Volver al inicio

5) SINTESIS Y OXIDACION DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS AROMATICOS COMO FENILALANINA, TIROSINA Y TRIPTOFANO. Entre los aminoácidos aromáticos tenemos a la Fenilalanina, Tirosina (No esencial, pero involucrado en la síntesis) y Triptófano. La determinación de la vía metabólica para la síntesis de estos aminoácidos se logró con mutantes bacterianos auxotróficos, que necesitan de los tres aminoácidos aromáticos para crecer, ya que cada uno de ellos falla en una reacción parcial distinta conducente a la síntesis de uno de los aminoácidos. Todos los mutantes al crecer en conjunto logran sintetizar los aminoácidos, pero individualmente catalizan solo algunas etapas de cada vía metabólica, por ejemplo: Mutante X: A------------>B D-----------> Aminoácido M Mutante Y: B---------->C D-----------> Aminoácido M Mutante Z: C -----------> D------------>Aminoácido M Total:

A------------->B---------->C-----------> D------------>Aminoácido M

En este ejemplo los tres mutantes necesitan del aminoácido M para crecer, ya que individualmente no lo fabrican, sin embargo, si se adiciona el intermediario D serán capaces de sintetizarlo. Mediante este método se descubrió al ácido Sikímico o Siquímico, que es el principal intermediario de la síntesis de los aminoácidos aromáticos. En los microorganismos el 90% de la maquinaria esta comprometida con la síntesis de proteínas, mientras que en las plantas solo el 20% del carbón fijado pasa por la síntesis de tan solo el ácido Siquímico, que no es tan solo el precursor de los aminoácidos aromáticos, sino que es una vía alterna para la fabricación de compuestos anillados como el heteropolímero Lignina. Este último se encuentra en la parte leñosa de la planta junto a los pigmentos y los compuestos anti-insectos. La síntesis empieza por un Fosfoenol Piruvato que se une a la Eritrosa-4-P (Figs. 3 - 12 y 4 12), para formar un compuesto de 7 carbones que posteriormente se cicla y da origen al ác. 5- Deshidroquínico. Este se convierte posteriormente en ác. Sikímico, el que vía fosforilación con Fosfoenol Piruvato (PEP), pasa a Corísmico, desde donde la vía se ramifica. Una de las ramas conduce al ác. Antranílico y por lo tanto a Triptófano, mientras que la otra conduce al ác. Prefénico. Este último se aromatiza por deshidrogenación y descarboxilación simultanea para dar el ác. p-OH-Fenilpirúvico que formará finalmente la Tirosina. La otra forma de aromatizarse es por descarboxilación y deshidratación para así formar Fenil Pirúvico que por transaminación producirá Fenilalanina y esta última por Hidroxilación se transformará en Tirosina.

561

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

La vía que conduce a Triptófano empieza con el ácido Antranílico que reacciona con la Ribosa activa como 5-P-Ribosil-1-PP, de donde toma sus carbones para formar el N-(5-PRibosil)-Antranilato. Posteriormente el anillo de la Ribosa se abre, pierde un CO2 formando el Indol-3-Glicerol-P, que por la acción de la enzima Triptófano Sintasa permite la entrada de Serina, saliendo el Gliceraldehido-3-P y quedando sintetizado el aminoácido Triptófano. Este aminoácido es COO O

O

H

H H

C C

+

OH

O

C CH

2

O

OH

CH

O

P

O

2

O

C

COO

C

CH

O

P

H O

O

H+ COO

HO

Fosfo - Enol Piruvato

H

C

OH

H

C

OH

+ H Ac.

Sikímico

C

C

O

CH

O 2

OH

Ac. 5-Deshidro

C H2

C

Ac. Dehidroquínico

Sikímico COO H +

H+

COO

O

OH

H

O

P

Ac. 3 -Deoxi Arabino O Heptulosonico -7 - P

O

CH 2 C

O

Ac. Fenil Ac. Prefénico

COO

H+

(PEP)

COO

2

Pirúvico

OH

O

OH

O

OH C

O

OH

(PEP)

HOO CH

COO

CH2

HC 2

CH

H+

H

COO C

COO

C

2

O

Eritrosa - 4 - P

H+

O

O

COO

OH

O

OH

P

OH

O

CH 2 C COO

O

Ac. Corísmico

OH

HO OH

Ac. 5 - P - Sikímico

ac. 3 Enoil - 5 - P- Piruvilsikímico COO

Fenil Alanina

CH

COO

O

C

O

2 NH

Tirosina

O

2

Ac. P - OH - Fenil OH

Pirúvico

COO

H+

P

HN O CH

FIGURA SIGUIENTE

2 O

O

Ac. Antranilico HO

OH

Fig. 3 - 12. Síntesis del ácido Sikímico (Siquímico) como precursor de la Fenilalanina, Tirosina y Triptófano.

precursor de los Indoles y Auxinas que intervienen en el desarrollo de la planta e incluso de algunos Indol-Alcaloides como la Vinblastina y la Vincristina que se emplean como drogas anticáncer.

562

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Indol - 3 - Glicerol - P

1 - ( O - Carboxifenilamino ) - 1 - Deoxirribulosa - 5 - P

-

OH OH OH

O

H

H

C

C

O

C OO

C CH O P O 2 O H H

C C N H

C

N H

CH O P O 2

OH OH

O

Serina Gliceraldehido - 3- P

N H

H

+ N H3

C

C

H

H C O O--

Tript[ofano

Fig. 4 - 12.Continuación de la Síntesis de los aminoácidos aromáticos.

Volver

al

inicio 6) OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS AROMATICOS. La oxidación de la Fenilalanina y Tirosina, es una de las vías más estudiadas ya que en ella ocurren varias deficiencias enzimáticas que acarrean enfermedades metabólicas (Fig. 5 12). La primera reacción es catalizada por la Fenilalanina Hidroxilasa unida a Citocromo P450, que introduce un Hidroxilo en el anillo bencénico en la posición para (orto, meta, para). De esta manera se forma el aminoácido Tirosina que no es esencial a menos que la enzima que cataliza esta reacción sea defectuosa. La Tirosina es luego convertida a Melanina por medio de la Dopa y la Dopaquinona como intermediarios. El bloqueo de alguna de las etapas de esta vía produce Albinismo. La Tirosina es también precursora de neurotransmisores como la Dopamina y la Norepinefrina, causando enfermedades con graves síntomas neurológicos cuando alguna etapa de esta vía se encuentra defectuosa. Una de las mayores vías de oxidación de la Tirosina incluye la formación del ác. p-OHFenilpirúvico que se oxida a ác. Homogentísico, el que se rompe finalmente en Fumarato y Acetoacetato (Fig. 5 - 12). Entre las múltiples enfermedades metabólicas (Hiperfenilalaninemias) producidas por las fallas enzimáticas de esta vía se encuentra la clásicamente denominada Fenil Cetonuria, Tabla 2 - 12. La enzima Fenilalanina Hidroxilasa (1), al ser incapaz de incapaz de actuar en esta etapa conduce a la acumulación de Fenilalanina. Esta última por transaminación con α-Cetoglutarato genera elevados niveles del Ac. Fenilpirúvico, el que aparece en la orina. Este ácido es tóxico a nivel del Sistema Nervioso Central.

563

O

OH

O

OH

Melanina Dopa 5

DHBReductasa

Dopaquinona

CH

CH

CH NH 2

CH

2

NH

2

COOH

COOH

THB

2

DHB OH

OH

O

C

C

4

3

2

1

O

OH

HC

CH

HC

2

COOH

2 HC

CH

CH

2

3 HC

C

CH CH

2 COOH

Fenil alanina

CH

2 NH

CH

OH NH 2

COOH

C

COOH

COOH

HOOC

CH 2

O

CH

O

+ HOOC

CH

C

O

CH 2

2 COOH

COOH

COOH

Tirosina ác. P-OH ác. HomogenFenil pirúvico tísico

THB

C

2

CH

2 CH

CH

O

OH

COOH

ác. Malomil ác. Fumaril acetoacético acetoacético

ác. Fumárico

OH

OH

1 OH

ác. Aceto acético

OH

OH

DHB

CH 2 CH

CH

CH

OH

CH 2

NH

Nor epi

2 NH

COOH

2

Dopa

CH 2

NH 2

Dopamina

2

nefrina

Fig. 5 - 12. La Fenilalanina es un precursor de otros productos como la Tirosina, Melanina y los Neurotransmisores.

564

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

565

Tabla 2 - 12

1

NOMBRE

Falla en la Enzima

Fenilcetonuria o Hiperfenilalaninemia

Fenilalanina Hidroxilasa o su Cofactor L-Eritro- 5,6,7,8 - Tetrahidrobiopterina

Tirosinemia

Probable Fumarilacetoacetasa o la Tirosina Transaminasa

Tirosinosis

p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa

Alcaptonuria

Homogentisato Dioxigenasa Presencia de ác. Homogentísico en la orina Conjunto de fallas enzimáticas que pueden ser Tirosinasas - o +, cuando alguna otra enzima de la vía es defectuosa

2

3 4

5 Albinismo

Otra enfermedad clínicamente similar a la anterior (1), ocurre por deficiencias enzimáticas en la síntesis del cofactor Tetrahidrobiopterina (THB), empleado por esta misma enzima (Fig. 5 - 12). Este cofactor interviene en la reacción conducente a la Hidroxilación del Triptófano. Su falta acarrea deficiencias en la síntesis de neurotransmisores como Dopamina, Norepinefrina y Serotonina, más la acumulación de Fenilalanina. Esta última al igual que en la falla de la enzima Fenilalanina Hidroxilasa, hace disminuir por Transaminación los niveles de α-Cetoglutarato necesarios para que el Ciclo Tricarboxílico se complete. Esto ocurre especialmente a nivel del tejido nervioso, lo que a su vez provoca daño neurológico por falta de ATP, que no desaparece al disminuir la administración de Fenilalanina. Además, el ácido Fenilpirúvico producido por la transaminación del exceso de Fenilalanina que no puede ser hidroxilada, se reduce a Fenil-lactato y luego es oxidado a Fenilacetato, dando un olor especial a la orina (“olor a ratón”). Por otro lado, el cofactor THB (Tetrahidrobiopterina) que pasa a DHB (Dihidrobiopterina) durante la reacción de hidroxilación de la Fenilalanina a Tirosina es posible recuperarlo posteriormente, al ser reducido por NADPH a DHB por medio de la enzima Dihidrobiopterina Reductasa. Esta última enzima, puede ser también otra causa de falla impidiendo la reducción del cofactor y desencadenando la Fenilcetonuria. Otra de estas enfermedades es la Tirosinemia hepatorenal (2), que se caracteriza por mostrar una baja actividad de la p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa o la Fumarilacetoacetasa. Las Tirosinemias (2) y Tirosinosis (3), pueden agruparse en varios tipos de enfermedades con síntomas interconectados entre sí. Ejemplo de ello son la falla de la Tirosina Transaminasa del citosol, pero no de la Mitocondria. La Tirosinosis por probable falla en la enzima p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa (3) conduce a una elevada excreción de Ac. pHidroxifenilpirúvico. Los pacientes pueden ser clínicamente normales, aunque en la mayoría de los casos esta enfermedad es detectada secundariamente a otras.

566

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

1 NH

C CH CH 2 COO H

N H

Triptófano

NH

O

CH CH COO 2

N

Triptofano Pirrolasa

C

CHO

H

NH

O

2

2

N

CInurenina

H

3 -- O H Cinurenina

H

OH

Alani -na

O C

NH 2 OHC C

C

C

H

H

H

C

COO

H

H

H

C

COO

H

O

C

OHC C

C

C

H

H

H

H

OH

Ac. 3 - O H _ Antranílico

COO

H

H

H

O

OHC C

C

C

C

H

H

H

Oxalocrotonico

COO

α-Cetoadipico

O

O

O C CH 2

H

H

H

2 - Acroleil - 3 - Amino Fumarico

2 - O H - Muconico

CH 3

N

HOO

OH C

SCoA

COO

COO

Semialdehido 2 - Amino Mucónico

C

Acetil -

H

N

OHC C

2

CH CH COO 2

C

H

H

NH

O

CH CH COO 2

N

N - Formil Cinurenina

2

C O SCoA

Acetoacetil SCoA

CO +

2

O

H O O C C H C H C H C S CoA

C H C H C H C S CoA 3

2

Glutaconil - SCoA

H O O C C H C H C H C S CoA 2

2

2

Glutaril - SCoA

Crotonil - SCoA

Fig. 6 - 12. Oxidación del Triptófano.

La Alcaptonuria (4), se caracteriza por la falla de la Homogentisato Dioxigenasa y excreción urinaria de Ac. Homogentísico que se torna negro en contacto con el aire (orina negra). El Albinismo (5), presenta cerca de seis tipos diferentes, en que lo único en común es la falta de melanina o la síntesis defectuosa de este pigmento. La forma clásica se puede atribuir a que la vía metabólica carece de Tirosinasa y pueden sorpresivamente existir casos del tipo Tirosinasa positivo, donde la cantidad de melanina es muy baja o bien ocurre que la melanina esta mal ensamblada. Más aún existen casos en que se ha detectado la presencia de otros pigmentos de color amarillo, etc. La oxidación del Triptófano empieza con la Triptófano Pirrolasa (1), (Fig. 6 - 12). Esta enzima cataliza la ruptura del anillo para formar la N-Formil Cinurenina con O2. Cuando su actividad es deficiente, se produce un gran aumento de la concentración de Triptófano en la sangre y a la vez una gran excreción del aminoácido en la orina junto a una baja excreción de Cinurenina. El nombre del defecto es Triptofanuria y provoca retardo mental. La N-

567

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Formil-Cinurenina después de la eliminación del grupo formilo y subsecuente oxidación se transforma en la 3-OH-Kinurenina, la que se descompone eliminando Alanina que pasará a formar Acetil-SCoA, quedando solo el ác. 3-OH-Antranílico. Después de una segunda oxidación con O2 y eliminación de CO2 se rompe el segundo anillo, para formar el Semialdehído 2-Amino Mucónico que a través de sucesivas oxidaciones y descarboxilaciones formará el Acetoacetil-SCoA, quedando listo para la entrada al CTC después de pasar a Acetil-SCoA (Fig. 6 - 12). Volver al inicio 7) SINTESIS Y OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA. a) SINTESIS DE METIONINA Y TREONINA. Ambos aminoácidos provienen del ác. Oxaloacético que en los microorganismos y plantas pasa a formar el ác. Aspártico (Fig 7 - 12). Este último se transformará en los aminoácidos Metionina y Treonina, por medio de una serie de reacciones que consisten en la activación del grupo β-Carboxilo del Aspártico con un Fosfato para luego reducirlo con NADPH en un aldehído y a continuación en un Alcohol, formando la Homoserina.

O Treonina

CH 3 CH OH HC

NH

CH

Sintasa

CH HC

2

COOH

Activación COOH

COOH CH C

β

2 O

CH HC

Ac. Oxaloacético

2 2 H C NH2 CH

CH

3

P OH

2

NADPH

C

H

HC

β-Aspartil - P

O 2

ADP

2 NH

ATP

γ β

CH 2 O H CH2

HC 2

NH

2

COOH

COOH β-Semialdehido Aspártico

Homoserina

Succinil - SCoA CoASH

Cobalamina

2 CH2

O

CH

O 2 HC NH 2 COOH

O

Fumárico

SH

HC NH 2 COOH Cobalamina

O

2 NH

P OH

Ac. Homoserino Fosfórico

NADPH

O

CH

CH

COOH

Metionina

2 NH

Ac. Aspártico CH 3

S

C

COOH

COOH

CH

O

2

COOH

Treonina Transaminación

O

CH

2

S

CH

2 HC NH 2 Piruvato

Homocisteina

+ Amonio

CH

C H2 CH

NH

COOH

CH 2

HC

COOH Cistationina

2

O

2 NH

2

COOH Cisteína

C CH

2

CH

2 COOH

O -- Succinil Homoserina

Fig. 7 - 12. La Homoserina es un precursor común en la síntesis de la Treonina y la Metionina.

568

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Este aminoácido es clave para la formación de Metionina y Treonina. La vía hacia la Treonina (Fig. 7 - 12), consiste en la activación con Fosfato del grupo β-alcohoxi, para luego ser hidrolizado por la Treonina Sintasa. Esta peculiar enzima, elimina el Fosfato y deja un intermediario con una insaturación entre los carbones β y γ, donde entra el hidrógeno de una molécula de agua reduciendo el carbono γ a Metilo (CH3). Luego, la insaturación se isomeriza a los carbones α y β entrando en este último un Hidroxilo que deja al carbono β como alcohoxi en el aminoácido Treonina. La otra vía alternativa donde se produce la síntesis de la Metionina, empieza desde Homoserina (Fig 7 - 12), la que al activarse en el carbono γ-alcohoxi con Succinil-SCoA forma O-Succinilhomoserina. Esta molécula en la siguiente etapa elimina ác. Fumárico y se carga con el aminoácido Cisteína, que después de liberar su esqueleto hidrocarbonado como Piruvato más Amonio, deja solamente al azufre pasando a ser denominado como Homocisteína. Este último intermediario al aceptar un metilo en el Azufre por medio de la Metil-Cobalamina en mamíferos y la N5-Metilen-Tetrahidrofolato en bacterias, sintetizará finalmente a la Metionina. El azufre es lo único que aporta la Cisteína, ya que el esqueleto hidrocarbonado de la Metionina proviene de la Homoserina. Volver inicio

569

al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

b) OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA EN HUMANOS. La Metionina es activada por ATP mediante la enzima Metionina Adenosil Transferasa (1) para formar S-Adenosil-Metionina (Fig. 8 - 12), esta molécula en una segunda reacción entrega su grupo Metilo de alta energía a otra molécula receptora (X - CH3) en una reacción catalizada por una MetilTransferasa, para quedar como S-Adenosil-Homocisteína. Este intermediario mediante hidrólisis se convierte en Homocisteína. Esta molécula es un punto de ramificación que permite volver nuevamente a Metionina, al aceptar un Metilo de la MetilCobalamina (B12) en la reacción catalizada por la Metionina Sintasa (2), o bien puede continuar por la otra vía donde entra una Serina, para unirse y formar la Cistationina, mediante la reacción catalizada por la enzima Cistationina-β-Sintasa (2). La Cistationina a su vez se descompone, por la enzima Cistationina-γ-Liasa (3) para formar Cisteína, ác. αCetobutírico y Amonio. El azufre pasó de la Metionina a la Serina para formar la Cisteína, mientras que el esqueleto hidrocarbonado de la Metionina se convirtió en ác. α-Cetobutírico. Aunque la Cisteína no es un aminoácido esencial se encuentra involucrado en el metabolismo de la Metionina. La vía se dirige en uno u otro sentido dependiendo de la disponibilidad de Metionina y Cisteína. A continuación el otro producto de la reacción, el ác. α-Cetobutírico, sufre una descarboxilación oxidativa final que lo lleva hasta Propionil-SCoA. Este último bajo al acción de las enzimas que carboxilan y reordenan como son la Propionil-SCoA Carboxilasa (4), la L-Metil Malonil-SCoA Racemasa y la Metil Malonil-SCoA Mutasa más B12, producen el compuesto Succinil-SCoA, que sí puede entrar al Ciclo Tricarboxílico (Fig. 8 - 12).

570

1 COOH

2

COOH

COOH

COOH

COOH

H H C N H C N H HC N H H H C NH 2 2 2 2 H2O Adenosina C H C H CH X-CH 2 CH ATP 2 Serina 2 X-H 3 2 CH CH CH 2 CH 2 2 2 Adenina Adenina H S CH 2 S CH2 S S

+

CH

C H3 METIONINA

O

O

3

S - Adenosil H Metionina

H OH OH

S - Adenosil H Hom ocisteina

Hom ocisteina

H OH OH

3

C NH 2 CH 2 CH 2 S C H2 C HN H 2 COOH

Cistationina

H S C H2 CHNH 2 COOH CISTE INA

3

2 Cobalamina COOH CH CH C

2 2 SCoA

CH 3

5

CH

HOOC

Cobalamina

NH 4+

4 3

CH C 2 O

SCoA

Metil - M alonil - SCoA

CH CH 3 2

C

SCoA

O

CH CH C 3 2 O

Propionil - SCoA

O Succinil - SCoA Fig. 8 - 12. La S-Adenosil Homocisteína es un intermediario común en el metabolismo de la Metionina y Cisteína.

571

COOH

α-Ceto butírico

Tabla 3 - 12, se pueden observar algunos de los trastornos que acarrean las fallas en el metabolismo de los aminoácidos azufrados. Tabla 3 – 12 Nombre

Falla en la Enzima

1

Hipermetioninemia

2

Homocisteinuria Retardo mental

3

Cistationuria

Metionina Adenosil Transferasa (Hígado) Puede ser asintomático o puede estar asociada a otras enfermedades metabólicas Cistationina-β-Sintasa o Metionina Sintasa o su cofactor Metil – Cobalamina También falla afinidad de la enzima por su cofactor γ- Cistationasa y se produce Cistationemia

4

Acidemia Propiónica Aciduria Metil Malónica

5

Propionil-SCoA Carboxilasa y presencia de Cetoacidosis Metil-Malonil-SCoA Mutasa con severa Cetoacidosis

En la realidad existen varias causas para la Homocisteinuria (2), donde la Homocisteína se encuentra en alta concentración en la sangre y orina. La primera o más común es por falla de la Cistationina-β-Sintasa, la Metionina de la sangre se encuentra elevada y los niveles de Cisteína aparecen como bajos. La segunda es por deficiencia en la Metionina Sintasa y una tercera causa se debe a una falla en la absorción de la Cobalamina. La Cistationuria (3), en cambio se caracteriza por una falla en la Cistationasa-γ-Liasa en la conversión de Cistationina a Cisteína y α-Cetobutirato, la que parece ser asimptomática. La Aciduria propiónica (4), se caracteriza por una falla a nivel de la enzima PropionilCarboxilasa. Esta enfermedad es de carácter severo con formación de derivados del Ac. Propiónico como 3-Hidroxipropionato y 2-Metil-Citrato que aparecen en la orina. Aciduria Metil Malónica (5), se caracteriza por la aparición de acidemia, aciduria y homocisteinuria asociada a defectos en la absorción de la vitamina B12, que interviene en el reordenamiento del Metil-Malonil-SCoA para formar el Succinil-SCoA y entrar al Ciclo Tricarboxílico. Esta enfermedad se encuentra también relacionada con defectos en el paso de Homocisteína a Metionina. En el caso de la Treonina existen al menos dos vías para la degradación de este aminoácido (Fig. 9 - 12). Una es mediante la ruptura en dos conpuestos como el Acetaldehido y la formación de Glicina. El Acetaldehido se activa posteriormente formando Acetil-SCoA y la Glicina adquiere un grupo Alcohoxi transformandose en Serina, que por deshidratación origina ác. Pirúvico y finalmente Acetil-SCoA. La otra vía ocurre cuando la Treonina se convierte en α- Cetobutírico y después de una descarboxilación oxidativa genera Propionil-SCoA, que a continuación sufre una Carboxilación, Isomerización y Reordenamiento con la participación de la Metil-Cobalamina. Al igual que en los ácidos grasos impares, formará el intermediario Succinil-SCoA del CTC.

572

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

CH

3 C O C H3

H

C H3

Acetaldehido

CH OH

C O

CH NH 2 COOH

S CoA NH

TREONINA

2

CH

2 C OOH

GLICINA Treonina

CH OH

C H3

CH NH 2 C OOH

C O

ACETIL- SCoA

C OOH Ac. PIRUVICO

SERINA

Deshidrasa PALP

MetilC H3 CoASH CH 2 C O C OOH α-Cetobutirato

CO 2

C H3 Cobalamina CH 2 C O SCoA Propionil - SCoA

CH

3 CH 2 CH 2 C O SCoA

Succinil - SCoA

Fig 9 -12. La Treonina es precursor de otros aminoácidos como Glicina y Serina, sin embargo se degrada en un intermediario del CTC como la Succinil-SCoA.

Solo una enfermedad molecular se ha detectado en estas vías y consiste en la Hipertreoninemia, caracterizada por elevados niveles de Treonina en la orina y la sangre. No se ha detectado aún la enzima responsable.

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573

al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

8) SINTESIS DE LISINA, ARGININA E HISTIDINA. a) SINTESIS DE LISINA. La síntesis de Lisina emplea como precursores al Piruvato y al Semialdehido Aspártico en bacterias y plantas para dar origen a la via del ác. Diaminopimélico, mientras que en los hongos se emplea el α-Cetoglutarato, como precursor de la vía del ác. αAminoadípico (Fig. 10 - 12).

PIRUVATO

+

SEMIALDEHIDO ASPARTICO

BACTERIAS HOOC N

C O OH

α- CETOGLUTARATO

C O OH

CH 2

CH 2

COOH

CH 2

AC. 2,3 - Dihidropicolínoco

CH 2 Ac. Homocítrico

H O C C OO H CH 2

HOOC N

COOH

HN CH 2 CH 23

( )

C O OH SACAROPINA C OO H

COOH

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

CH NH C

COOH

COOH L , L, α, ε Diaminopimélico

α-SEMIALDEHIDO AMNOADIPICO

CH 2

COOH

C O OH

C O OH

CH 2

CH 2

Ac. Oxaloglutárico

CH 2

(C H2)3 CH NH 2

α-AMINOADIPICO

C OO H

C OOH

CH NH 2

Isocítrico

HO CH

C O O H O Diaminopimélico

( )

Homo --

H C C OO H N - Succinil L , L , α, ε -

HN CH 2 CH 2 3

H N CH 2 C O OH

L - LISINA

AC. Tetrahidropicolínico

C OOH

CH 2

HONGOS

CH 2

H C C O OH O

C C O OH

L - LISINA

Fig. 10 - 11. Síntesis de la Lisina en Bacterias y Hongos.

574

CH 2 O

C C O OH

α-Cetoadípico

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

La vía del Ac. Diaminopimélico parte con la condensación aldólica entre el Piruvato y el Aldehido-Aspártico para formar intermediarios cíclicos como el ác. Tetrahidropicolínico, este último se activa con Succinil-SCoA para formar el ác. N-Succinil-L, L- α ,ε-Diaminopimélico. En la siguiente reacción se libera el ác. Succínico formando ahora el ác. L,L-α ,εDiaminopimélico, que después de una isomerización y eliminación de CO2 produce Lisina. La otra vía en hongos empieza con α-Cetoglutarato y Acetil-SCoA para formar ácido Homoisocítrico que por reordenamiento y descarboxilación llegará a formar el Ac. αCetoadípico. A continuación sufre una transaminación y reducción para formar el Semialdehido α-Aminoadípico. Este último sufre la aminación del carbono Épsilon(ε), por el Glutamato con posterior salida del α-Cetoglutarato para quedar finalmente el aminoácido Lisina.

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575

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

b) SINTESIS DE ARGININA E HISTIDINA. La Arginina se produce en el Ciclo de la Urea en adultos y no es considerada esencial en esta etapa de la vida como lo es en lactantes. En el Ciclo de la UREA, la Arginina se descompone para formar Urea y Ornitina por la Arginasa y debido a su rápida ruptura no existe un excedente para ser empleado en la síntesis de proteínas en los lactantes. De esta manera la Ornitina (Fig. 11 - 12) puede ser la precursora de la Arginina en bacterias, ya que no cuentan con la enzima Arginasa que descompone a la Arginina como ocurre en el Ciclo de la Urea (Fig. 26 - 12). La síntesis de la Ornitina puede empezar con ác. Glutámico y Acetil-SCoA para formar el ác. N-Acetilglutámico el que se activa con ATP en el γ-carboxilo para sufrir luego una reducción y dar origen al Semialdehido N-Acetil Glutámico. Este último por transaminación y desacetilación forma la Ornitina.

CH COOH CH

C

COOH

O

CH

SCoA

2

Acetil - SCoA

CH

CH

2

NH

2

C

NH

H C

3

CH

O

N - Acetil COOH

NH

CH

2

+ NH

HC

2

NH CH

Fumárico

H C NH

CH2 C

C

CH

2

CH

NH 2

COOH

H C

CH

2

CH Asp

NH

H C 2

COOH

C

H C

O

CH

2

3

C

NH

O

COOH

γ-

Semialdehido

2

Carbamil - P NH 2

O

C

O CH

POH 3

NH

2

2

3

γ- Glutamil - P

COOH

CH CH

CH

2

2

N - Acetilglutámico NH

2

H

NH

2

H C

2

2

CH CH

NH

CH

COOH

N - Acetilglutámico

GLUTAMICO

CH

O 2

NH

H C

COOH

COOH

H

C

O

P

O

CH

CH

2 H C

C

2

O

O

O

3

2

CH

2

NH

2

CH

2 NH

CH CH

2

H C

2

COOH

2 NH

CH

2

H C

2

NH

2

2 2 NH

CH C

3 O

COOH

2

COOH ORNITINA

N - Acetil Ornitina

Citrulina

ARGININA Arginino Succinato

Fig. 11 - 12. Transformación del aminoácido Glutámico en la Arginina.

Las reacciones a continuación de la Ornitina son también comunes al Ciclo de la Urea (Fig. 26 - 12). En este caso la Ornitina puede reaccionar con el compuesto de alta energía Carbamil-P para cargarse con un carbón y un grupo amino, dando origen a la Citrulina que al recibir el otro amino del ác. Aspártico cuyo esqueleto hidrocarbonado sale como ác fumárico, dará origen finalmente a la Arginina.

576

1 N - ( 5' - Fosforibosil ) - ATP HOP 2 3

PRPP

O

N - ( 5' - Fosforibosil ) - AMP OH

C H2

O

NH

CONH

2

H

1

+ ATP

HO

+

OH

C

N H

N N O

N

-

-

O

O

OH

H C

OH

C

OH

H O

2

C H C

H

H C

NH

H C

2

H C

OH

H C

OH

2

C H

OH 2

C

2

OPOH 3 2

Histidinol - P

Histidinol

O

C H 2

OPOH 3

Imidazol Acetol - P

O

H C

OH

C

OH

C H C H

2

OPOH 3 2

Glicerol

N

P

CONH 2 N

NH

N

CH

OPOH 3

C

( 5'' - Fosforibosil) -4 -

2

C H

C 2

Fig 12 - 12. Síntesis de Histidina.

COOH

H

577

HISTIDINA

2

Formimino - 5 - Amino - 1 -

Carboxamida H C

N

N - ( 5' - P - D - Ribulosil ) -

Imidazol

CH H

N

C

H

NH

C H

N

N H

Gln

CH C

C

H C

2

N H

2

H C

C

C

H

N H

CH

N

N H

H

CH C

C

OPOH 3

OH N H

H C CH

RIBOSA - P

CONH

N H

H C

N

O C H

N H

N

OPOP OPO O

HO

N CH

O-

N C H2

H C

2

H N 2

N

N

2

Histidina en cambio (Fig.12 - 12), es sintetizada por medio de una serie de complicados pasos y por una vía que forma precursores para la síntesis de las Purinas en sus etapas iniciales. Se parte de una Ribosa activada como la 5-P-Ribosil-1-Pirofosfato, la que se une a la Adenina del ATP por la acción de la enzima Fosforibosil-Pirofosfato-ATP Fosforilasa. Después de la eliminación del anillo 1-fosforibosil-4-carboxamida-5-amino imidazol queda el Imidazol glicerol-P que por transaminación, defosforilación y oxidación da origen al aminoácido Histidina, (Figs. 12 - 12 y 13 - 12).

H N H

C a rb o n o y N it r ó g e n o d e la A d e n in a

C C

H

C

P e rte n e c e n a l e s q u e le to H id ro c a rb o n a d o d e la R ib o s a a c t iv a d a

N C H

C

H

2 N H

2

N itró g e n o d e la G lu t a m in a

COOH

Fig. 13 -12. Origen de los Carbonos y Nitrógenos de la Histidina.

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578

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

c) OXIDACION DE LISINA. De los seis carbonos de la Lisina (Fig. 14 - 12), dos se pierden en descarboxilaciones y los cuatro restantes terminan como Acetoacetil-SCoA. α-Cetobutirato NH

C OOH NH

2

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

1

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

CH NH

CH 2

C OOH

3

CH 2

N

N

N C OOH

C OOH

CH NH

2

4

CH

2

Ac.

C OOH

1

C OOH

C OOH

6

- Piperidino

Ac.

- Piperidina

2 - Carboxílico

2 - Carboxílico

Sacaropina

Ac.

Pipecólico

LISINA 2

H CH C CH C

3 O 2 O

S CoA

CH

3

CH

2

S CoA

Aceto – Acetil-SCoA

CH

CH

CH O

5

CH

CH

CH C

CH

C C

C OOH

C OOH

C OOH

C OOH C

2 2 2 O

O

CH 2 CH 2 CH 2

CH 2 CH 2

C

CH NH

O

C OOH

S CoA

CH

CH 2 CH 2

2

CH 2 2

C OOH

S CoA

CH NH

2

C OOH α - Cαetoadípico

Glutaconil - SCoA Crotonil -S -CoA

O

Glutaril - S -CoA

Semialdehido α - Aminoadípico α - Aminoadípico

Fig 14 - 12. Degradación de la Lisina

Existe el problema de que algunas de las transformaciones de esta vía metabólica degradativa no son muy bien entendidas aún. La degradación ocurre a través de la Sacaropina y el δ-6-Piperidina-2-Carboxílico, en equilibrio con su forma abierta que se denomina Semialdehido-α-aminoadípico, esta molécula formará posteriormente el ác. αaminoadípico. Otra alternativa a la anterior consiste en pasar por el compuesto Ac.Pipecólico. El αAminoadípico se convierte por medio del α-Cetoadipato en Glutaril-SCoA y luego en Glutaconil-SCoA para llegar a Crotonil-SCoA y terminar como Acetoacetil-SCoA. Algunas de las alteraciones metabólicas en la vía degradativa de la Lisina se pueden observar en la Tabla 4 - 12.

579

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Las Hiperlisinemias (1) pueden ser persistentes por falla en la Lisina-α-Cetoglutarato Reductasa que cataliza la formación de Sacaropina, mientras que los otros casos pueden ocurrir por la falla en la enzima Sacaropina Deshidrogenasa que cataliza el paso de Sacaropina a Glutamato y α-Aminoadípico-δ-Semialdehído.

Tabla 4 – 12 NOMBRE 1 Hiperlisinemia

FALLA EN LA ENZIMA Lisina-α-Cetoglutarato Reductasa junto a la Sacaropina Deshidrogenasa y Oxidoreductasa

2 Hiperlisinemia

Lisina Deshidrogenasa

Acidemia Pipecólica

Desconocida

Sacaropinuria

Sacaropina Deshidrogenasa

Aciduria Glutárica

Glutaril-SCoA Deshidrogenasa

3

4 5

La otra enzima es la Sacaropina Oxidoreductasa que cataliza el paso de Sacaropina a αCetoglutarato y Lisina. Algunas de estas enfermedades se asocian a retardo mental, mientras que otras no. Las Hiperlisinemias del tipo periódico no tienen una enzima definida como su causal y se caracterizan por episodios de coma. La Sacaropinuria (4), se caracteriza porque las enzimas pueden ser total o parcialmente defectuosas como la Sacaropina Deshidrogenasa y la Lisina-Alfa-Cetoglutarato Reductasa. Esta enfermedad presenta un severo retardo mental. Aciduria Glutárica (5), ocurre por falla en la Glutaril-SCoA Deshidrogenasa en algunos casos y en otros por falla de la Acil-SCoA Deshidrogenasa que probablemente sintetiza un componente necesario para la primera enzima.

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d) OXIDACION DE ARGININA E HISTIDINA EN HUMANOS. La Arginina por medio de la Arginasa produce Urea y Ornitina en el Hígado, la Ornitina es luego transaminada con ác. α-Cetoglutárico y formará el ác. γ-Semialdehido-Glutámico. Este último puede ir a la síntesis de Prolina o por oxidación genera finalmente el ác. Glutámico (Fig. 15 - 12). Los aminoácidos Arginina, Ornitina y Prolina son glucogénicos. La deficiencia en la enzima Arginasa provoca la Hiperargininemia (1)*, que se caracteriza por retardo mental y convulsiones (Tabla 5 - 12). La Histidina rompe su anillo para formar el Ac. N- Formiminoglutámico el que posteriormente entrega al ác. Tetrahidrofólico su grupo Formimino para quedar como ác. glutámico. Este último por transaminación origina el intermediario del CTC, α-Cetoglutárico.

580

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

El bloqueo del paso de Histidina a ác. Urocánico provoca una Histidinemia (1), este defecto N H2

NH 2 CH C H C OOH 2 2 N

NH

HISTIDINA

H C C COOH

1 N

NH

O

2

C NH

Urea

H Urocanico

NH

Ac. 4 - Imidazolona 5 - Propiónico

PROLINA

C OOH HN FH 4

O C H C H2 Ac. Semialdehido CH 2 Glutámico H N C COOH 2 H

CH N C H C H CH C OOH 2 2 Ac. N - Formimino H Glutámico

3

N 5 Formimino - F H 4

N H2 C H2 1 C H2 C H ORNITINA 2 H N C COOH 2 H

*

CH C H C OOH 2 2

N

N H2 ARGININA CH 2 C H2 CH 2 H N C COOH 2 H ARGINASA

Deshidrogenasa NH HOOC CH C H CH C OOH 2 2Ac. GLUTAMICO

Fig. 15 - 12.La Histidina y la Arginina forman el Ác. Glutámico como uno de los productos de degradación.

ocurre cuando la enzima Histidasa no es detectable en los pacientes. El paso de ác. Urocánico a ác.Imidazolonapropiónico, es catalizado por la Urocanasa (2), que al fallar o no estar presente acarrea en algunos casos retardo mental.

La presencia de ác. Formiminoglutámico en la orina (3), es un defecto primario provocado por el bloqueo del paso desde ác. formiminoglutámico a ác. glutámico debido a la ausencia o falla en la enzima Formimino Glutámico Transferasa.

Tabla 5 – 12

581

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

1*

NOMBRE Hiperargininemia

FALLA EN LA ENZIMA Arginasa

1 2

Histidinemia Aciduria urocánica

Histidasa Urocanasa y produce en algunos casos retardo mental

3

Aciduria forminoglutámica

Formino Glutámico Transferasa

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inicio

9) METABOLISMO DE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES

Los aminoácidos no esenciales se dividen en:

Hidrofóbicos

Polares sin carga

Polares de negativa

Alanina

Glicina

Glutámico

Prolina

Serina

Aspártico

carga Polares de carga positiva No existentes

Cisteína Tirosina Glutamina Asparegina

a) METABOLISMO DE LA ALANINA, PROLINA, GLUTAMICO Y GLUTAMINA. La Alanina se puede sintetizar a partir de Piruvato mediante una reacción de Transaminación. En esta reacción se emplea la vitamina B6 o Piridoxina (Fig 16 - 12), que forma el cofactor Piridoxal-P y se abrevia como PALP. El ác. Glutámico es el donador del grupo amonio y se transforma en el Cetoácido α-Cetoglutárico.

582

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

H

COOH

CH

NH

C

GPT

COOH

CH 3

+

2

CH

C

COOH C

CH

CH 3

PALP

O

+

O

COOH

K eq ( = ) 1

CH H C

COOH

2

COOH

Ac. α-- Cetoglutárico Cetoglutárico

Alanina

NH

Ac . Pirúvico

Ac. Glutámico

GOT COOH

COOH PALP

CH

CH

+

CH

C H C

NH

O

COOH

COOH

CH

CH

H C

NH

K eq ( = ) 1

2

COOH

+

C

COOH

COOH

CH

2 O

COOH

Ac. Glutámico

Ac. Oxaloacético

GPPT

COOH CH

H

+

CH 2 C NH

CH

PALP CH O

C

K eq ( = ) 1

2 COOH

Fenilalanina

COOH

CH C

COOH

Ac. α - Cetoglutárico Ac.

Ac.α - Cetoglutárico Ac.

Ac. Aspártico

2 O

+

COOH

Ac. Fenil Pirúvico

CH H C

NH 2

COOH

Ac. Glutámico

Fig. 16 - 12. Diferentes reacciones de Transaminación con PALP, que pueden ocurrir en uno u otro sentido según la proporción de productos y sustratos.

Varios otros aminoácidos pueden sufrir la misma reacción de Transaminación (Fig. 16 -12) y entre ellos se encuentran Valina, Isoleucina, Fenilalanina, Triptófano, Glutámico, Aspártico, Cisteína, Asparegina y Tirosina. El metabolismo degradativo de la Alanina es bastante simple y ocurre por medio de una reacción de transaminación donde forma ác. Pirúvico. Este último puede entrar al Ciclo Tricarboxílico como Acetil-SCoA y oxidarse totalmente después de pasar por el complejo de la Piruvato Deshidrogenasa donde sufre una descarboxilación oxidativa parcial. Existen algunos casos de Hiperalaninemias provocadas por fallas en el complejo multienzimático de la Piruvato Deshidrogenasa que forma Acetil-SCoA a partir de Piruvato. A consecuencias de este error se acumula Piruvato que proviene de la transaminación de la Alanina en una reacción que puede ir en ambos sentidos según la concentración de sustratos y productos. Las deficiencias enzimáticas del complejo ocurren a nivel de las enzimas Piruvato Descarboxilasa o Dihidrolipoil Deshidrogenasa. Otra causa por la que ocurre Hiperalaninemia, se produce cuando falla la enzima que sintetiza ác. Oxaloacético a partir de Piruvato y que se denomina Piruvato Carboxilasa. Esta reacción es considerada como anaplerótica, es decir enriquece el CTC con el intermediario

583

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

ác. Oxaloacético (Fig. 17-12). Por lo visto anteriormente cualquiera acumulación de Piruvato puede ser causal de Hiperalaninemia.

Alanina Alfa α- CetoglutáCetoglut rico

Piruvato

Transaminasa

Carboxilasa

Glutámico CH C

A TP + CO

3

COO ADP

2

CH

O

C

COO

2 O

COO

Piruvato

Ac. Oxaloacético

Fig. 17 - 12. Reacción de la Piruvato Carboxilasa.

La Prolina se sintetiza a partir del ác Glutámico, mediante la inversión de la vía degradativa O

COOH CH

C

2

CH

2 H C NH

CH

CH

2

COOH

Ac. Glutámico

H C

H N

2

COOH

H N

COOH

2 NH 2

COOH

Semialdehido γ - Glutámico

Ac.

1

Pirolino 5 -

Prolina

Carboxílico

Fig. 18 - 12. El Glutámico y la Prolina se interconvierten entre sí.

de la misma Prolina (Fig. 18 - 12). En la primera reacción se forma el Semialdehido γGlutámico, el que se cicla con su grupo α-Amino para formar el δ-1-Pirrolino-5-Carboxilato. Este último por reducción forma la Prolina. Durante el metabolismo degradativo de la Prolina pueden ocurrir algunas enfermedades metabólicas como se puede observar en la Figura 19 - 12.

584

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

NH 2 CH

2 C H2 C H2 C NH H

2 COOH

ORNITINA

H COOH C H2

3

C

O

2

CH 2 CH2

C H2 H C NH

2 COOH

AC. GLUTAMICO

1 N

H N

COOH

COOH

H C NH

2 COOH

A c.

γ - Semialdehido

1

PROLINA Pirrolino 5 Carbox[ilico

Glutámico

COLAGENO COOH

3*

CH OH CH2 H C NH

2 COOH

Ac. 4 - OH - Glutámico

A c.

H N

4 COOH

H N

COOH

HO HO 1 Pirrolino - 3 - OH - 5 -Carboxílico 4 - OH - Prolina

Fig. 19 - 12. La Prolina y la Ornitina provienen del Glutámico.

Es interesante hacer notar que la Prolina, Ornitina, Glutamato y Glutamina se pueden interconvertir metabólicamente. La Ornitina por Transaminación puede formar el compuesto cíclico δ-1-Pirrolino-5-Carboxilato, el que a su vez se puede oxidar a Glutámico o también puede ser reducido a Prolina (Fig. 19 - 12). El aminoácido Glutámico puede ser sintetizado a partir del Cetoácido α-Cetoglutarato, intermediario del CTC mediante una reducción con NADPH + H y NH4+, para formar el aminoácido, en una reacción catalizada por la enzima regulatoria GLUTAMICO DESHIDROGENASA. Dicha enzima oxida con NAD y reduce con NADPH. La presencia de AMP modula a la enzima para que forme α-Cetoglutárico mientras que la presencia de ATP modula hacia la formación del ác. Glutámico. La Glutamina se formará a su vez por aminación del aminoácido Glutámico con gasto de ATP. Los aminoácidos como Alanina, Glutámico y Glutamina están encargados de colectar el amonio desde los músculos y transportarlo al Hígado. Entre las enfermedades asociadas al metabolismo de la Prolina encontramos a las Hiperprolinemias en la Tabla 6 - 12, las que se manifiestan por hiperprolinurias del tipo I (1) y II (2), denominadas así por la variedad de síntomas existentes sin embargo, las principales fallas detectadas son a nivel de las enzimas Prolina Oxidasa (1) en el Tipo I y la δ-1-Pirrolina-5-Carboxilato Deshidrogenasa (3), más la δ-1-Pirrolina-3-Hidroxi-5-

585

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Carboxilato Deshidrogenasa en el Tipo II (3)*. Hiperornitinemia (2), se produce por falla de la enzima Ornitina-α-Cetoácido Transaminasa, caracterizada por elevados niveles de Ornitina y bajos niveles de Lisina en la orina. Por otro lado las Hidroxiprolinemias (4 ), caracterizadas por la acumulación de 4OH-Prolina obtenida del colágeno, se produce cuando falla la Hidroxiprolina Oxidasa (4), que se manifiesta con o sin retardo mental, (Tabla 6 -12).

Tabla 6 – 12 NOMBRE

FALLA LA ENZIMA Prolina Oxidasa

3

Hiperprolinemia Tipo I Elevada Prolina en Orina y Sangre Hiperornitinemia . Se produce Degeneración Coroidoretinal Hiperornitinemia

3*

Hiperprolinemia Tipo II

4

Hidroxiprolinemia

1 2

Ornitina-α-Cetoácido Transaminasa

δ 1-Pirrolina-5-Carboxilato Deshidrogenasa solamente δ1-Pirrolina -5- Carboxilato Deshidrogenasa y la δ -1-Pirrolina-3Hidroxi-5-Carboxilico Deshidrogenasa Hidroxiprolina Oxidasa

La acumulación del ác. δ-1-Pirrolino-3-OH-5-Carboxílico puede ocurrir también por una falla del metabolismo de la OH-Prolina del colágeno, a nivel de la δ-1Pirrolino-3-OH-5-Carboxilato Deshidrogenasa (3)* y parece ser asintomática.

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inicio

b) METABOLISMO DE LA GLICINA Y SERINA. Glicina y Serina tienen un metabolismo en conjunto ya que ambos aminoácidos derivan originalmente de un intermediario de la Glicólisis, que es el ác. 3-P- Glicérico (Fig. 20 - 12). Este precursor es sucesivamente oxidado y transaminado para formar la 3 P-Serina que finalmente por hidrólisis del Fosfato formará la Serina. La Glicina se sintetiza desde la Serina por solo un paso en que se carga el ác. Tetrahidrofólico con la Serina para dar N5, N10 - Metilen Tetrahidrofólico, dejando a la Glicina como producto. La Serina misma se puede descomponer a Pirúvico por acción de una Serina Deshidratasa liberando Amonio. La Glicina por otro lado, se descompone en la mitocondria del Hígado, al cargar al ác. FH4 como N5, N10-Metilen-FH4 y el resto se descompone en CO2 y Amonio. Esta reacción puede funcionar en ambos sentidos y también puede ser empleada para sintetizar Glicina. La enzima que carga el grupo Metilen y descompone a la Glicina (Glicina Sintasa) es suceptible de fallar en algunos casos provocando una Hiperglicinemia, Hiperglicinuria y retardo mental, ya que la Glicina es también un neurotransmisor a nivel del Sistema Nervioso Central. La Glicina se emplea en la síntesis de nucleótidos de Purina, grupos Heme, Glutatión, Serina y Creatina. N5,N10- Mutilen- FH4 producido en el paso de Ser a

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Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Gly y en la degradación de la Gly a CO2 y Amonio es necesario para la metilación de dUMP a dTMP en la síntesis de los nucleótidos. Su falta produce anemia megaloblástica.

TIMIDILATO SINTASA

GLICOLISIS

dUMP

OH O

P OH O

H

OH

OH O

P OH

O

H

P OH

CH 2 C O

COOH

COOH

2 H C N H2 COOH

2 COOH

Ác. 3 - P – Glicérico Ác. 3-P-OH- Pirúvico 3-P-Serina

CTC

CH 3 C O COOH

H

CH

CH 2 H C NH

CH 2 C OH

10 N5 N Metilen F H 4

FH 4

O

O

O

dTMP

H C NH

GLICINA

SERINA FH 4 + NAD

+ N H+ 4

Serina Deshidratasa

Ác. Pirúvico

2

COOH

Serina OH-Metil Transferasa

Glicina Sintasa

5 10 N N Metilen F H 4 + NADH + H

CO 2 + + NH 4

Fig 20 - 12. La Glicina y Serina provienen de intermediarios de la Glicólisis.

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c) METABOLISMO DE LA TIROSINA.

587

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

La Tirosina no es un aminoácido esencial, pero proviene de uno de ellos como lo es Fenilalanina. Esta reacción es catalizada por la enzima Fenil-Alanina Hidroxilasa. La degradación de la Fenilalanina se examinó anteriormente en este capítulo. Volver al inicio

d) METABOLISMO DE LA CISTEINA. La Cisteína proviene de otro aminoácido esencial como la Metionina al igual que la Tirosina proviene de la Fenilalanina, sin embargo también se requiere de la presencia de la Serina en su síntesis la que pondrá el esqueleto hidrocarbonado y el amonio, mientras que la Metionina aportará solo el azufre, (Fig. 8 - 12).

Transaminasa Cetoácido

Trans-sulfurasa Aminoácido

R

β - Mercapto Piruvato

CISTEINA

H S CH C 2 Cisteína Oxidasa

NH

2 S CH CH COOH 2 S CH CH COOH 2 NH 2

SH

R

COOH O

Transaminasa

H O S CH CH COOH 2 2 NH Cetoácido 2

CISTEINA

SH Tioderivado

Aminoácido H S CH CH COOH 2 NH 2

S

Ac. Cisteína- Sulfínico

CH C

O

COOH + SO

2

Ac . Pirúvico

CISTINA Fig. 21 - 12. Ambas vías degradan la Cistina y Cisteína.

En la figura 21 - 12, se puede apreciar la existencia de dos vías para degradar a la Cistina y Cisteína. La primera hace uso de una Transaminasa y una Trans-Sulfurasa para llegar a Piruvato, mientras que la segunda produce el intermediario Cisteino-Sulfínico que por medio de una transminación entrega Pirúvico y SO2. Volver al inicio

10) MANEJO DEL AMONIO.

El Amonio es una molécula capaz de producir neurotoxicidad y alcalosis en el organismo ya que se encuentra en dos formas. Parcialmente disuelto en el agua como un gas (NH3), donde es capaz de atravesar facilmente membranas como la Barrera Hemato Encefálica por su estructura hidrofóbica y como un compuesto iónico soluble en agua

588

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

(NH4+) que altera el pH de la sangre. La concentración normal de Amonio en el suero debe ser mantenida entre 20 y 40 mM, ya que sobre los 400mM es tóxica. Por lo tanto, para disminuir su efecto, el Amonio debe circular como aminoácido (Alanina, Glutámico y Glutamina). El Amonio es aportado a la circulación por la acción de la Glutámico Deshidrogenasa, más la acción de distintas Glutaminasas de origen intestinal y renal. La deaminación de las Purinas y Pirimidinas (degradación de ácidos nucleicos), junto a la reacción por la cual se degrada la Glicina con NAD y THF4 (Ac. Tetrahidro Fólico), son otra fuente de Amonio. Otras reacciones que contribuyen con Amonio son las catalizadas por las L y D Aminoácido-Oxidasas en los Peroxisomas. La falta de los peroxisomas o de la enzima L- aminoácido Oxidasa en ellos, puede causar tanto una Hiperaminoacidemia como una Hiperaminoaciduria acarreando un daño neuronal. Aproximadamente el 20% del Nitrógeno se puede eliminar como Amonio por el Riñón y es traído aquí por el aminoácido Glutamina, mientras que cerca del 80% del Nitrógeno se elimina como Urea, la que se forma en el Hígado a partir de los aminoácidos Glutámico y Aspártico, para ser posteriormente filtrada y concentrada en el Riñón. Así, el pH de la Orina se mantiene normalmente entre 4 y 8. En la Tabla 7 – 12, se aprecian algunos valores para los distintos catabolitos que extraen el Nitrógeno del organismo como lo son Urea, Amonio, Creatinina y Ac. Urico. TABLA 7 - 12

Catabolitos en la Orina

grs / 24hrs

UREA

30,0

NH4+

0,7

Creatinina

1,0 - 1,8

Ac. Urico

% Total

0,5 - 1,0

86,0

2,8

4-5

2-3

La toxicidad del Amonio se debe a que puede reaccionar con un compuesto del Ciclo Tricarboxílico disminuyendo el nivel de los intermediarios y por consecuencia la producción de ATP. El intermediario es el Cetoácido α-Cetoglutárico que puede formar por Aminación Reductiva (Fig. 23 - 12) el aminoácido Glutámico o el ión Glutamato. Esta reacción emplea NADPH y es catalizada por la enzima Glutamato Deshidrogenasa de Keq cercana a 1, por lo tanto depende de la concentración de los reactivos y productos para ir en uno u otro sentido:

Glutamato Deshidrogenasa

589

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

+

α-Cetoglutárico + NADH + H + NH4 (NADPH)

Aminación reductiva

Glutámico + NAD (NADP)

Deaminación Oxidativa

Por lo tanto el Ciclo Triacarboxílico del Cerebro, ante el exceso de Amonio sufre la merma de uno de sus intermediarios y no puede regenerar el ac Oxaloacético al completar una vuelta, ya que el cetoácido α-Cetoglutárico previo al Oxaloacético, se escapa de las sucesivas reacciones oxidativas al interactuar con el Amonio y producir el aminoácido Glutámico. A este problema se agrega la perdida de otros intermediarios que también se dirigen a la generación de neurotransmisores, como lo son el Cetoácido Oxaloacetato y el mismo α- Cetoglutarato, ambos son conocidos precursores de neurotransmisores, como el aminoácido Aspártico y el par Glutámico/Glutamina. Este efecto adverso trae como consecuencia una disminución de la formación de NADH y FADH2 en el Ciclo Tricarboxílico, con la consiguiente merma de ATP en la mitocondria y posteriormente se afecta la comunicación inter-neuronal, por lo que el paciente entra en estado de coma. Otra de las formas por la que se produce daño al tejido nervioso, consiste en la disminución de los niveles del Neurotransmisor γ-Aminobutírico (GABA), que actúa como inhibidor de la actividad cerebral y cuyo precursor es el Ac. Glutámico. Más aún, al dejar el cerebro con un exceso de Glutamina debido a la aminación del α- Cetoglutarato y posteriormente del Glutámico por la reacción con exceso de Amonio, se intercambia la Glutamina que abandona el tejido nervioso por Triptófano. Este último es un precursor del neurotransmisor Serotonina cuyos niveles aumentan fuera de lo normal y es a la vez un índice de los trastornos producidos por el coma hepático.

MUSCULO

CEREBRO GLUCOSA

Proteína Muscular

El CTC se encuentra cortado

PIRUVATO Piruvato Carboxilasa

Acetil-SCoA Neurotransmisores

Oxaloacetato

NH4+ NH4+

α -Cetoglutarato Aminación Glutamato

Glutamina Sintasa Glutamina

Triptófano

Fig. 22-12. El CTC se detiene ya que no puede completar el ciclo por pérdida de uno de sus intermediarios.

En la Figura 22 - 12, se pueden apreciar las sucesivas reacciones donde interviene el Amonio y el Cetoácido α – Cetoglutárico. Una forma de paliar el daño producido por la Hiperamonemia al Ciclo Tricarboxílico del SNC, consiste en suministrar un exceso de Glucosa, para así obtener por Glicolísis un

590

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

elevado nivel de Piruvato. Este último puede ser carboxilado por la reacción Anaplerótica de la Piruvato Carboxilasa mediante CO2, y ATP para así pasar posteriormente a Oxaloacetato. De esta manera se reconstituyen los niveles (Fig. 22 - 11), disminuídos de Oxaloacetato, debido al secuestro del α – Cetoglutárico por el Amonio libre. Otra manera de tratar este problema consiste en detoxificar el Amonio clínicamente, por medio de un tratamiento con Ac. Benzoico. Este último forma Benzoil-SCoA de la siguiente manera: AMP +PP + Benzoil-SCoA

Ac. Benzoico + CoASH + ATP

El Benzoil-SCoA reacciona con la Glicina, que incluye Amonio en su estructura para formar finalmente Benzoil-Glicina o Ác. Hipúrico que se elimina finalmente en la orina.

Benzoil-SCoA + Glicina

Benzoil-Glicina

Orina

Normalmente el Amonio que llega al Hígado, proviene en parte del tubo digestivo por la degradación bacteriana de las proteínas de la dieta y desde los tejidos transportado por el aminoácido Glutámico. G lutám ico Dehidrogenasa + 4 NADH + H NAD C O O H D eam inación O xidativa C H 2 C H 2 C O Aminación C O O H R eductiva NADPH + H NADP α - Cetoglutárico +

N H+ 4 ATP

N H

C TC

N H

4

C O O H

P i

O

ADP

NH 2

C

C H

2 C H 2 HC N H

C H2 C H

2 C O O H

2 N H 2 C O O H

H C

Glutam ina Sintasa

Ac. GLUTAM ICO

GLUTAM IN A

Gluta minasa

Enzim a alostéric a

Carga del Am onio

Descarga de Am onio Ac. GLUTAM ICO

α -C etoglutárico

GLUTAM INA Ac. GLUTAM ICO O

C TC

C O O H CH 2 C O C O O H

C O O H PALP

C H2 H C N H

Glutám ico Oxaloacético Transam inasa Ac. Oxaloacétic o GOT

2 C O O H

ASP AR TIC O

C

Anim ales

N H 2

C H

2 N H 2 C O O H

H C B acteria N H + 4 ATP

Pi

ASP AREG IN A

ADP

Fig. 23 - 12. Carga y descarga de Amonio. Este aminoácido hace acopio del Amonio desde los tejidos periféricos donde su Cetoácido α-Cetoglutárico (Fig. 23 - 12), se carga con Amonio proveniente de otros aminoácidos, por medio de las reacciones de Transaminación (excepto de Treonina y Lisina). Junto a estas se encuentran las aminaciones reducticvas que emplean NADPH con la Glutámico Deshidrogensa. Aquí se capta directamente el Amonio libre,

591

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

generando un determinado nivel de Ác. Glutámico y posteriormente con otra molécula de Amonio se carga hasta Glutamina, mediante la enzima Glutamina Sintasa. Entre las Transaminaciones más comunes por las que se carga Amonio al Cetoácido α Cetoglutárico, se encuentran las reacciones catalizadas por las enzimas GOT, Glutámico Oxaloacético Transaminasa y GPT, Glutámico Pirúvico Transaminasa: GOT Glutámico + Oxaloacetato α-Cetoglutarato + Aspártico GPT Glutámico + Piruvato α-Cetoglutarato + Alanina Estas reacciones pueden dirigirse en uno u otro sentido dependiendo de la concentración de los intermediarios. Posteriormente el Glutámico y la Glutamina en el Hígado se descargan por medio de las reacciones de hidrólisis y Deaminación Oxidativa catalizadas por las enzimas denominadas Glutaminasa y Glutamato Deshidrogenasa respectivamente (Fig. 23 12). Esta última ahora emplea NAD en el otro sentido y es alostéricamente activada por ADP, GDP e inhibida por ATP y GTP. En este caso la reacción sirve de manera anaplerótica al Ciclo Tricarboxílico es decir, cuando la carga energética de este se encuentra baja, se introduce el intermediario α-Cetoglutárico desde el Glutámico y se libera a la vez Amonio el que entra al Ciclo de la Urea en el Hígado. El Cetoácido Oxaloacético es también intermediario del CTC y puede cargarse con amonio por Transaminación con Glutámico formando el ác. Aspártico. Este aminoácido puede recibir aún otro amonio desde la Glutamina con el gasto de un ATP, para así formar la Asparegina. La enzima que cataliza esta reacción es la Asparegina Sintasa (Fig. 23 - 12). En bacterias el aminoácido Aspártico se puede cargar con amonio mediante un mecanismo de reacción que emplea directamente Amonio y la energía de un ATP para formar la Asparegina. Como se ha visto el ác. α-Cetoglutárico, el ác. Glutámico y la Glutamina son de crucial importancia en el metabolismo intermediario, (Figs. 22 - 12 y 23 - 12), ya que son los colectores primarios del amonio proveniente de la degradación de los aminoácidos ramificados en el músculo. Estos compuestos se dirigen bajo la forma de Glutamina al hígado para eliminar el Amonio mediante el Ciclo de la Urea. El Glutámico también colecta Amonio en el cerebro y lo lleva al hígado. Por otro lado puede ocurrir que el mismo aminoácido Glutámico se cargue con un amonio extra en los tejidos periféricos tales como Cerebro y Músculo, pasando a ser ahora el aminoácido Glutamina. Este aminoácido es el resultado de la reacción catalizada por la enzima Glutamina Sintasa, con gasto de un ATP que se degrada a AMP y PPi. A la vez parte de la Glutamina se puede emplear en la reacción catalizada por la Asparegina Sintasa para suplir las necesidades de Asparegina en los tejidos:

Glutámico + NH4 + ATP

Glutamina Sintasa Glutamina + AMP + PPi

Aspartato + Glutamina + ATP

Asparegina Sintasa Glutamato + Asparegina + AMP + PP

592

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Otra parte de la Glutamina de distintos orígenes, viaja al Hígado donde se unirá a otro "pool" de Glutamina sintetizado allí, para dirigirse finalmente al Riñón. La Glutamina es el aminoácido de mayor concentración en la sangre. La Glutamina al llegar Riñón se desamina por la acción de la enzima Glutaminasa, que emplea una molécula de H2O y el Amonio producido, pasa ahora a tamponar hidrogeniones. Sin embargo, se ha visto que otro ión básico para tamponar sería el HCO3, que se forma en el hígado y se emplea en la vía de entrada al Ciclo de la Urea, así que mientras más Urea se forma menos -HCO3 habrá disponible para tamponar.

MUSCULO

Sangre

HIGADO

Sangre

Aminoacidos Ramificados Val, Leu, Ile

α - CG

CEREBRO

Glucosa Alani na

Alanina

Alanina

CTC

α - CG Glutamina

Glutámico Piruvato NH

NH

+ 4

+

α - CG

4

Glutarato NH

Glutámico Glutamina CETOACIDOS

Piruvato

NH + 4

α - CG GLUCOSA

CTC α - CG = α = - Cetoglutárico AOA = Ac. Oxaloacético =

Glutamina

+ 4

Glutámico

AOA

+

α - CG Aspártico

Ciclo de la Urea

NH

Glutamina

4

Glutamina

Fig. 24 - 12.Por Transaminación de intermediarios del CTC y aminación con gasto de ATP se obtienen los aminoácidos Glutamina y Asparegina.

La Creatina - Fosfato como almacenadora de energía en el músculo es otra vía por la cual se elimina Nitrógeno. La Creatina después de donar su energía y Fosfato al ADP para formar ATP en la reacción catalizada por la Creatina Kinasa, se cicla para formar la Creatinina que se filtra en el Riñón. El test de Creatinina o el “Clearance rate” constituye el índice de funcionamiento renal. Su formación ocurre de la siguiente manera:

Arginina + Glicina Guanidinoacetatato Donador de carbono S-Adenosilmetionina + Guanidinoacetato Creatina-P +ADP ATP + Creatina Creatina Creatinina(Ciclada) Orina

593

Creatina

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

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11) TRANSPORTE DEL AMONIO POR LOS AMINOACIDOS GLUTAMICO, GLUTAMINA Y ALANINA Los aminoácidos de cadena ramificada Val, Leu e Ile transaminan de preferencia con αCetoglutárico en el músculo (Fig. 24 - 12), para formar ác. Glutámico que puede transformarse en Glutamina y pasar a la sangre o entregar el Amonio al Piruvato que proviene de la Oxidación de la Glucosa para formar Alanina y también pasar a la sangre. En el hígado la Glutamina se deamina hasta ác. α-Cetoglutárico y la Alanina transamina con el para formar Piruvato nuevamente. El ácido Glutámico recién formado por transaminación con la Alanina entrega su amonio en el interior de la mitocondria al Ciclo de la Urea por deaminación oxidativa o bien transamina en el citoplasma con el ác. Oxaloacético y forma ác. Aspártico que entrega finalmente su amonio a las reacciones del Ciclo de la Urea que ocurren en el citoplasma. La Glutamina también puede donar su Amonio por hidrólisis en el riñón donde se le empleará en la mantención del pH.

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12) ENTRADA DE LOS AMINOACIDOS AL CICLO TRICARBOXILICO. En la Figura 25 - 12 se recopilan las vías de entrada de los aminoácidos al CTC, donde los aminoácidos como Lisina, Triptófano, Fenilalanina, Tirosina y Leucina entran directamente al

594

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

CTC como Acetil-SCoA, mientras que Treonina, Glicina, Serina más Cisteína y Alanina pueden formar Piruvato y entrar también como Acetil-SCoA. Los aminoácidos como Arginina, Prolina, Glutamina y ác.Glutámico entran al CTC como AlfaCetoglutarato en tanto que Metionina, Isoleucina y Valina entran como el intermediario Succinil-SCoA.

TREONINA

FENILALANINA LISINA

TRIPTOFANO

GLUTARIL - SCoA

TIROSINA

LEUCINA

AC. ACETOACETICO

GLICINA

SERINA

CISTEINA

ACETOACETIL - SCoA

PIRUVATO

ACETIL - SCoA ARGININA

ALANINA

METIONINA

PROLINA ISOLEUCINA

γ-SEMIALDEHIDO GLUTAMICO VALINA

α-CETO - BUTIRICO

PROPIONIL - SCoA

GLUTAMICO METILMALONIL - SCoA GLUTAMINA α-CETOGLUTARICO

SUCCINIL -- SCoA

Fig. 25 - 12. Productos finales en que se degradan los aminoácidos.

Aquellos aminoácidos que forman Acetil-SCoA, (Fig. 26 - 12), pueden ser llamados CETOGENICOS o precursores de Lípidos, ya que el Citrato puede salir de la mitocondria y descomponerse nuevamente en Oxaloacético y Acetil-SCoA. Este último entra a la síntesis de los ácidos grasos activado en la forma de Malonil-SCoA. Todos los aminoácidos que formen compuestos como α-Cetoglutarato, Succinil-SCoA, Fumarato y Ác. Oxaloacético, serán GLUCONEOGENICOS, debido a que contribuyen con su esqueleto hidrocarbonado a la formación del intermediario Malato que puede salir de la Mitocondria y vía Oxaloacetato formará Fosfo-enol-Piruvato para entrar a la Gluconeogénesis (Fig. 26 - 12). El hígado tiene una baja capacidad de oxidación de aminoácidos y su función primaria es la síntesis de los Hidratos de Carbono, Ácidos Grasos y Cuerpos Cetónicos a partir de aminoácidos. En otras palabras el hígado transforma a los aminoácidos en combustibles más aceptables al resto de los tejidos desechando el amonio.

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Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Alanina Cisteína Glicina Serina Treonina

Fenilalanina Tirosina Leucina Lisina Triptófano

Isoleucina Leucina Triptófano PIRUVATO

Aspartato Asparegina

CO2 + ATP Biotina

ACETOACETIL - SCoA ÁCIDOS GRASOS ACETIL - SCoA CITRATO

OXALOACETATO

Arginina Histidina Glutamina Prolina

ISOCITRATO Glutamico

GLUCOSA

α-CETOGLUTARATO

MALATO

FUMARATO

SUCCINATO

Tirosina Fenilalanina SUCCINIL - SCoA

Isoleucina Metionina Valina

Fig. 26 - 12. Entrada de los aminoácidos como intermediarios del CTC.

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596

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13) CICLO DE LA UREA. La forma como se elimina el Amonio en un organismo depende de la disponibilidad de agua que halla encontrado durante el proceso evolutivo. Así tenemos que los peces del tipo Teleósteo (con esqueleto), son primariamente amonotélicos mientras que los Elasmobranqueos cartilaginosos, como la manta raya y su pariente el tiburón, son ureotélicos ya que ocupan la urea con propósitos de osmoregulación en el medio salino interno. Por otro lado los anfibios durante su etapa juvenil en el agua son primariamente Amonotelicos y cuando pasan a vivir en la tierra como la rana adulta son Ureotélicos. Los precursores de los vertebrados terrestres como el pez primitivo Celecanto y los peces pulmonados son Ureotélicos. Los reptiles del presente y los pájaros son Uricotélicos, ya que no es una ventaja selectiva el correr o volar sorpresivamente con el peso adicional de una vejiga llena de líquido, sin embargo, marsupiales y animales placentados han mantenido el Ureotelismo como la principal vía de excreción de amonio. El Ciclo de la Urea (Fig. 27 - 12), ocurre en el Hígado y una parte se lleva a cabo en la Mitocondria, mientras que la otra ocurre en el Citoplasma. Las reacciones del Ciclo consisten en una serie de reacciones destinadas a producir UREA, las que son impulsadas por el equivalente al gasto de cuatro moléculas de ATP a ADP + Pi. Dos de los ATPs se hidrolizan al interior de la mitocondria, favoreciendo la unión del Amonio como producto de la deaminación oxidativa del ác Glutámico a una molécula de CO2. De esta manera se forma un compuesto de alta energía denominado Carbamil-Fosfato. El otro ATP, se hidroliza a AMP y PP (la hidrólisis posterior del PP equivale a un ATP extra) en el citoplasma produciendo la energía para la incorporación del Amonio aportado por el ác. Aspártico al Ciclo de la Urea. La estequiometría de la reacción es la siguiente:

CO2 + NH4+ + 3 ATP + ác. Aspartico + 2H2O (NH2)2CO + 2ADP + 2Pi + AMP + PPi + Fumarato UREA PPi 2 Pi Dentro de las reacciones del Ciclo, la más tóxica es aquella donde se maneja el Amonio libre en el interior de la mitocondria, lugar que se encuentra rodeado por dos membranas. Su toxicidad se debe a que el compuesto se encuentra en equilibrio como NH4+/NH3, donde NH3 es el gas disuelto. Durante una necrosis hepática este gas disuelto es capaz de difundir hidrofóbicamente por las membranas, pasar al sistema circulatorio y actuar a nivel del cerebro invirtiendo la reacción de la Glutámico Deshidrogenasa para formar ác. Glutámico a expensas del Alfa-Cetoglutarato del CTC en las neuronas (Ver Capítulo del CTC). Como la única fuente de compuestos de dos y cuatro carbones para el CTC es la glucosa, se produce en el cerebro una merma de la función oxidativa en el Ciclo y este puede cesar de producir coenzimas reducidas y subsecuentemente de ATP en la Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa. De esta manera se provoca un déficit de ATP, que se traduce en falta de comunicación celular entre neuronas y finalmente se establece el Coma Hepático.

597

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inicio 14) FALLAS EN EL CICLO DE LA UREA En el Ciclo de la Urea existen 5 enzimas como se observa en la Figura 27 - 12 y desafortunadamente una enfermedad por cada enzima. Todas estas fallas metabólicas se caracterizan por retardo mental e hiperamonemia. Las enzimas del Ciclo se encuentran numeradas en la Figura 27 - 12 y corresponden a: 1) Carbamil-P-Sintasa, su falla produce Hiperamonemia. 2) Ornitina Transcarbamilasa, su falla produce Hiperamonemia. 3) Arginino Succinato Sintasa, su falla produce Citrulinemia. 4) Arginino Succinasa, su falla produce Aciduria Argininosuccínica. 5) Arginasa, su falla produce Hiperarginemia. Una falla total de una enzima resulta en fallecimiento del recién nacido. La enzima más importante del Ciclo es la Carbamil-P Sintasa, su falla se caracteriza por ataxia, convulsiones, letargo, el recién nacido no se amamanta bien y eventualmente sufre de coma y fallece. En algunos casos se producen estas enfermedades en adultos y acarrea hiperactividad, hepatomegalia y rechazo de comidas con alto contenido de proteínas. En general el tratamiento consiste en reemplazar los intermediarios que faltan del Ciclo, reducir las proteínas de la dieta y eliminar el exceso de Amonio. La inducción de la acidez del Colon promueve la eliminación de Amonio en las heces. También se emplean algunos compuestos como Benzoato de sodio y Fenil- Lactato de Sodio para unirse a Glicina y Glutamina respectivamente que ya que son los aminoácidos que transportan amonio. Los suplementos dietarios de arginina y citrulina, también ayudan a la producción de Urea por el Ciclo. El mantener a la Urea soluble requiere de agua y debido a esto los mamíferos deben echar mano a sus reservas para mantener una solución acuosa en la vejiga. En el caso de que una persona se alimente exclusivamente de proteínas se producirán grandes cantidades de Amonio, por la deaminación de los aminoácidos Gluconeogénicos y Cetogénicos que deberán abastecer con su esqueleto hidrocarbonado, la formación de intermediarios del Ciclo Tricarboxílico en el hígado. Estos a su vez mantendrán la concentración de Malato como precursor de Glucosa y la de Citrato como precursor de los ácidos grasos. El exceso de amonio es este caso puede conducir a una hiperamonemia, la que es tóxica al cerebro como ya se ha visto. Además, es posible que se produzca un cuadro de deshidratación debido al agua metabólica ocupada para mantener soluble la solución de Urea en la vejiga. En estos casos se perfunde al paciente con glucosa y se restablece el pH de la sangre. De esta manera se provee de Oxaloacético vía Piruvato al Ciclo Tricarboxílico para reponer la merma causada por la salida del Cetoácido αCetoglutárico, en la forma de ác. Glutámico al reaccionar con el Amonio libre. Por otro lado el ác. Fumárico que sale del Ciclo de la Urea debe pasar a Malato en el citoplasma, luego entrar a la mitocondria y convertirse en ác. Oxaloacético, que junto con el otro ác. Oxaloacético del CTC, formarán por transaminación con Glutámico el ác. Aspártico, este puede entrar nuevamente al Ciclo de la Urea. Si el Fumarato no se recicla de esta manera se inhibe el Ciclo de la Urea.

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al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

MATRIZ MITOCONDRIAL

CITOPLASMA MEMB. INT.

+ NH 3

+

MEMB. O

EXT.

C O2

NH

ATP

1)

2ADP

HN 2

O

O

C O

P

HN 2 2

CH

Pi

CH H C

O

NH

NH

2

C

UREA

CH

+

C

2

NH

2

CH

2 NH

CH 2

CH

5)

COOH

H C

O

CARBAMIL - P

2)

2

HC CH

2

FUMARICO

COOH

2 2 NH

COOH

ORNITINA

COOH

N H

2

ARGININA COOH

NH

NH

2

Pi C

NH

O

C 2

NH

2

CH

2 NH

CH

CH CH H C

COOH

CH

2

CH

O

HC

CH CH

2

3)

2

H C

COOH 2

CITRULINA

CITRULINA PPi

+

AMP

COOH

ARGININO SUCCINICO

2 2 2 NH

COOH

2 NH

2

COOH ATP

CH H C

2 NH

2

COOH

ASPARTICO

Fig. 27 - 12. Ciclo de la Urea.

599

2

C H

C N H NH

2

NH CH

CH

4)

15) REGULACIÓN DEL CICLO DE LA UREA. Este Ciclo parece tener dos tipos de regulaciones: a) Una rápida que depende de los niveles de N-Acetil Glutamato sobre la enzima Carbamil-P-Sintasa I (CPS I). Existe otra enzima CPS II en el citoplasma que se emplea en la síntesis de las Pirimidinas. El N-Acetil Glutamato es un modulador alostérico que a su vez depende de los niveles de Acetil-SCoA y Glutamato, junto a la enzima N-AcetilGlutamato Sintasa que cataliza su síntesis. Esta última responde a los distintos niveles de Arginina para su activación alostérica. b) Una regulación lenta que en base al aporte proteico de la dieta. Cuando la dieta es rica en proteínas los genes que codifican para las enzimas del ciclo se activan y aumentan los niveles de estas unas 20 veces, lo que también ocurre en casos de inanición cuando se consume proteína de la masa muscular y los esqueletos hidrocarbonados de los aminoácidos son destinados a Glucosa y ács. Grasos.

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600

al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

16) CONTROL DEL AMONIO DURANTE LA INANICION Durante un periodo de inanición lo primero que se ocupa como sustrato es la Glucosa proveniente del Glicógeno hepático, pero antes de que esta se agote empieza el proceso de Gluconeogénesis empleando como sustrato los Aminoácidos que han sido liberados por degradación muscular (fig. 28 - 11). Por otro lado se emplea también el Glicerol obtenido por la degradación de las grasas durante la Lipólisis y el Lactato, proveniente de la oxidación anaeróbica del músculo y los eritrocitos. La Gluconeogénesis a partir de Glicerol en el Hígado es baja en un principio, pero aumenta con la lipólisis de las grasas en los adipocitos. El mayor precursor de la Gluconeogénesis en el Hígado es en este caso la Alanina y a medida que la inanición se prolonga, llega la Glutamina al Riñón. Allí se convertirá en el precursor mayoritario de la Glucosa (Fig. 28 - 11). Este cambio de la Gluconeogénesis desde el Hígado al Riñón permite regular el balance ácido - básico.

CEREBRO

M úsculo

G lucosa

Alanina Hígado

G lutamina Alanina

Intestino

Urea

Aminoácidos

G lucosa

C uerpos C etónicos R iñón

N H 4 + y C uerpos C etónicos

Fig. 28 -12. Destino de Glutamina y Alanina producidos por el músculo durante la inanición.

601

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

Durante la inanición el músculo libera aminoácidos por degradación de proteínas tisulares y cerca del 50% de estos aminoácidos corresponden a Glutamina y Alanina, como productos de las sucesivas reacciones metabólicas internas. Alanina se dirige al Hígado y es Glucogénico, mientras que su amonio va al Ciclo de la Urea. Glutamina abastece de energía al intestino que debido al proceso de la descamación intestinal, necesita de sustrato para la multiplicación y crecimiento celular del borde en cepillo. En el intestino la Glutamina produce indirectamente Alanina al metabolizarce. Esta última se dirige posteriormente al hígado para la Gluconeogénesis y elimina su Amonio como Urea. A medida que la inanición continúa se producen Cuerpos Cetónicos, que se eliminan en la orina para mantener el equilibrio ácido-base junto con el Amonio que proviene de la Glutamina, mientras que su esqueleto hidrocarbonado o Cetoácido se usa para la Gluconeogénesis en el mismo riñón. El cambio del destino de la Glutamina desde el intestino al riñón es para conservar el balance ácido-base y neutralizar los cuerpos cetónicos con Amonio.

CONTENIDO DE METABOLITOS PRECURSORES DE LA GLUCOSA 200 Glicógeno

Hígado gm/24hr

Aminoácido Glicerol

Lactato y Piruvato 25 Lactato y Piruvato

0

Glicerol 25

Riñón gm/24hr

Aminoácido 50 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Días de Ayuno

Fig. 29 - 12. Nivel de los precursores de la Glucosa en el Hígado y en el Riñón durante los días de ayuno.

En la Figura 29 - 12, se observa un gráfico del contenido de Metabolitos precursores de Glucosa tanto en el Hígado como en el Riñón, expresados en gramos por 24 hrs versus los días de ayuno. En el Hígado se observa como disminuye el contenido de Glicógeno para mantener la Glicemia y al mismo tiempo, empieza paulatinamente la Gluconeogénesis a partir de los Aminoácidos la cual alcanza su máximo a los dos días. Posteriormente Glicerol y Lactato se convierten en la única fuente viable de Glucosa. A medida que la inanición progresa el problema se traslada al Riñón disminuyendo la Gluconeogénesis Hepática y aumentando de importancia la Gluconeogénesis del Riñón

602

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

como resultado del balance ácido-base mantenido entre los Cuerpos Cetónicos y el Amonio de los aminoácidos cuyo esqueleto Hidrocarbonado entra al CTC para formar Ac. Málico precursor de Glucosa. Se empieza con Alanina y se continúa con Glutamina que pasa a ser el precursor gluconeogénico más importante a la semana de inanición.

UREA Excreción diaria de Nitrógeno Urinario Otros Compuestos

Amonio Ac. Urico Creatinina

Dieta normal -7

Días de Ayuno 0

7

14 días

Fig. 30 - 12. Aumento de la excreción del Nitrógeno durante la inanición

En la Figura 30 - 12, se observa en un gráfico de Excreción diaria de Nitrógeno Urinario versus los días antes y después del ayuno. Durante la dieta normal se elimina principalmente Urea con una pequeña contribución del Amonio y ác. Urico del metabolismo de las Purinas más la Creatina proveniente del músculo. Durante el ayuno o inanición la concentración total del Nitrógeno excretado disminuye y aparece la necesidad de conservar nitrógeno, así que durante la primera etapa baja la cantidad de Urea secretada, pero a la semana de ayuno aumenta dentro de la cantidad total el nitrógeno proveniente de otros compuestos como Amonio debido a la Gluconeogénesis del Riñón sin embargo, los niveles de Ac. Urico y Creatinina permanecen constantes.

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17) APÉNDICE

603

al

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Malnutrición Proteico–Energética (PEM) KWASHIORKOR:

MARASMICO:

Enf. del niño desplazado, deficiencia en proteína, pero no en Carbohidrato Se conoce como enf. del niño destetado con pobre alimentación, no recibe proteínas

Deficiencia en ambas Proteína y Carbohidrato (casi inanición).

Apatía

Alerta, tiene hambre

Cara de Luna

Apariencia de “cabeza grande”

Grasa subcutánea

Sin grasa en el cuerpo, pérdida de músculo y grasa en las extremidades. La última grasa que se pierde es de las mejillas. Hipotonía

Edematoso, hinchado debido a la Hipoalbuminemia

Sin edema, aspecto desecado y/o extremadamente delgado

Hígado graso, corazón de mayor tamaño que el normal

Sin Hígado graso

Pelo rojizo o sin pigmento

Sin cambios en el pelo

Falla en el crecimiento, la respuesta inmune, reparación y producción de hormonas y enzimas junto a diarrea crónica y malabsorción Datos del laboratorio: Baja conc. de Albúmina Baja conc. de Glucosa Cetonuria Baja conc. AAS en el plasma Niveles diminuidos de K+ y Mg++ Bajo Colesterol

Marcada falla en el crecimiento, menos del 60% para edad y sexo

604

No recibe pecho de su madre. Baja inmunidad por células T Constipado o diarrea con mucus

KWASHIORKOR

MARÁSMICO

Una dieta con exceso de carbohidrato y bajo contenido proteico conduce a una síntesis disminuida de proteína por el hígado e intestino. La Hipoalbuminemia cusa un edema y la falta de la síntesis de las Apoproteínas que forman las VLDL o región de las β-Lipoproteínas, produce un hígado graso. La secreción de Insulina se estimula para luego reducirse. La movilización de grasa y aminoácidos desde el músculo se reducen de tal manera que menos aminoácido como sustrato se encuentra disponible para el hígado. El hígado se adapta aumentando de nivel las AA Cintazas y la formación de urea disminuye, conservando nitrógeno y disminuyendo la perdida en la orina. Sin embargo, la síntesis reducida de proteínas se impone y bajan los niveles de Albúmina junto a la presión oncótica y se produce el edema.

Glicógeno del hígado se agota en pocas horas y la prot. muscular se emplea vía Gluconeogénesis, para mantener el nivel de Glucosa en el plasma. TAG del tejido graso se rompen en Ács. Grasos que proveen energía para el resto de los tejidos, excepto tej. nervioso. Si se prolonga el periodo sin alimento, ya cerca de la Inanición los ácidos grasos se oxidan casi totalmente a Cuerpos Cetónicos que pueden ser usados por el Cerebro, Corazón y Músculo como energía. Se elevan el Cortisol y la Hormona del Crecimiento y disminuyen la Insulina y secreción de la Tiroides. Debido a que los aminoácidos son transportados desde el músculo al Hígado para proveer de sustrato para la síntesis de proteínas, los niveles de proteínas plasmáticas disminuyen menos en Marasmicos que en Kwashiorkor.

KWASHIORKOR

MARÁSMICO

605

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

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606

al

Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminoácidos

REFERENCIAS. A Survey of Inborn Errors of Aminoacid Metabolism and transport in Man., D.Wellner and A. Meister Ann. Rew. Biochem. ,Vol 50, 911-968, 1981. Regulation of Lysine and Threonine Synthesis., G. Galili The Plant Cell, Vol 7, 899-906, 1995 The Shikimate Pathway: Early Steps in the Biosynthesis of Aromatic Compounds. K.M. Herrmann The Plant Cell, Vol 7, 907-919, 1995 Metabolism. Protein & Nitrogen Homeostasis http://www.zonehome.com/met/metProtNit.htm Nitrogen metabolism Index http:// web.upstate.edu/schmittm/NitMet2/Index.html Nitrogen Metabolism and the Urea Cycle http://web.indstate.edu/thcme/mwking/nitrogen-metabolism.html

607

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

CTE 606

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

1) COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES 609 2) GRADIENTE ELECTROQUIMICO 614 3) COMPLEJO I O COMPLEJO NADH DESHIDROGENASA 618 4) COMPLEJO II O COMPLEJO SUCCINATO DESHIDROGENASA 621 5) COMPLEJO III O COMPLEJO CITOCROMO bc1 623 6) COMPLEJO IV O COMPLEJO CITOCROMO OXIDASA 627 7) COMPLEJO V O COMPLEJO ATP SINTASA 632 8) CONSUMO DE OXÍGENO POR LA MITOCONDRIA

636

9) ELGENOMA MITOCONDRIAL 638 10) ADAPTACION AL FRIO 638 11) DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL 639 12) APOPTOSIS 640 13) ROL METABOLICO DE LOS ORGANOS 642 a) Hígado 643 b) Tejido Adiposo 644 c) Músculo esquelético 644 d) Corazón 645 e) Cerebro 646 f) Riñones 646 f) Intestino Delgado 646

14) DIRECCIÓN EN QUE SE TRASLADAN LOS PRINCIPALES METABOLITOS EN EL ESTADO ALIMENTADO Y DURANTE LA INANICIÓN 647 15) PRINCIPALES ENZIMAS REGULADORAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO JUNTO A SUS MODULADORES 648

607

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

1) COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES.

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Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

La Cadena de Transporte de Electrones (C.T.E.) se encuentra en la membrana interna de la Mitocondria y tiene por objeto reoxidar las coenzimas reducidas. Estas a su vez, provienen de la oxidación de los sustratos en las vías degradativas y son portadoras de los protones removidos a los sustratos. Estos mismos se emplearán para generar el llamado Gradiente Quimiosmótico o Electroquímico, que ocurre entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana con el fin de generar posteriormente energía química como ATP y energía térmica. La membrana interna de la mitocondria separa dichos espacios y se encuentra

CARDIOLIPINA Se encuentra en una gran proporción en la Mitocondria O CH CH O CH 2 2 O O C O C O CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 3 3

P O

O O

CH

2

CH

CH O H

2

O

P O

O

CH

CH CH 2 O O O C O C CH 2 CH 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 3 2

3

Fig. 1 - 13.La Cardiolipina colabora en la Cadena de Transporte de Electrones interaccionando con el Citocromo C.

formada por tan solo un 30% de fosfolípidos, entre los que se encuentra la Cardiolipina (Fig. 1 - 13), considerada como integrante del sistema transportador de electrones. El otro 70% corresponde a las distintas proteínas que se encuentran presentes en la membrana interna y que dan origen a los complejos proteicos multimoleculares responsables tanto de la Cadena de Transporte Electrónico (CTE) como los procesos de Fosforilación Oxidativa (FO) y Transporte Intermembrana. La CTE misma esta formada por cuatro complejos multienzimáticos (Tabla 1 - 13), que se pueden describir brevemente a continuación: Tabla 1 –13 Componentes de la Cadena de Transporte de Electrones Complejos

Número de Subunidades 609

Grupos Prostéticos

P.M. kD

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

I II

NADH Deshidrogenasa Succinato Deshidrogenasa III Coenzima Q – Citocromo C Oxido - Reductasa Citocromo C IV Citocromo Oxidasa

26 4

FMN, Fe-S FAD, Fe-S

850 140

10

Heme, Fe-S Heme Heme, Cu A, Cu B

250

1 6 -13

13 160

El Complejo I o NADH Deshidrogenasa tiene por función oxidar las coenzimas del tipo NADH + H, que se producen en algunas de las reacciones al interior de la mitocondria. Entre estas reacciones tenemos a las distintas etapas de la β-Oxidación de los Ácidos Grasos, el Ciclo Tricarboxílico y la reacción catalizada por la enzima Glutámico Deshidrogenasa (Fig. 2 - 13). Otra parte de sus funciones consiste en enviar los protones extraídos a las Coenzimas, al espacio intermembrana de la mitocondria para creación de un gradiente, mientras que los electrones son transportados a la etapa siguiente de la Cadena. El Complejo II o Succinato Deshidrogenasa, recibe los FADH2 aportados por la oxidación de los substratos reducidos en el metabolismo intermediario. Especialmente la reacción de Succínico a Fumárico perteneciente al CTC, que es la única reacción del Ciclo donde la enzima está unida físicamente a la membrana interna de la mitocondria (Fig. 2 - 13). Entre los Complejos I , I I y I I I se encuentra la Coenzima Q. Debido a su tamaño, potencial de óxido-reducción, estructura química (Quinona) y su cola hidrofóbica es capaz de moverse llevando protones y electrones al Complejo I I I. El Complejo III o Coenzima q-Citocromo C-Oxido-Reductasa, hace acopio de los electrones del primero y los protones y electrones del segundo más los protones que provienen de la enzima Acil-S-CoA Deshidrogenasa, durante la primera etapa de la βOxidación de los ácidos grasos, más los protones que provienen de la lanzadera Glicerol Fosfato Deshidrogenasa. En el complejo III también se transportan protones al espacio intermembrana y solo los electrones se dirigen al Complejo IV. El Complejo IV o Citocromo Oxidasa, recibe electrones de forma secuencial de cada uno de los Complejos anteriores y a la vez transporta protones desde el interior al espacio intermembrana. Es capaz de formar agua metabólica en su lado interno aprovechando los protones internalizados por el sistema de la ATP Sintasa o Complejo V. El Complejo V, que no aparece en la Tabla 1-11, tiene por función permitir la entrada hacia la matriz mitocondrial de los protones acumulados por los Complejos anteriores en el espacio intermembrana. La energía que se desprende de este proceso se ocupa en la síntesis de ATP por medio de una ATP Sintasa denominada Fo F1 ATPasa. La forma básica como se describe la cadena de transporte de electrones es la misma desde 1963 (Fig. 2 - 13), y como es lógico de suponer en la actualidad se han identificado sus componentes de una forma mucho más detallada.

610

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

En general se puede apreciar que los protones aportados por las coenzimas reducidas se emplean para generar un gradiente en el espacio intermembrana de la mitocondria, mediante los complejos I, III y IV. Debido a ello, se genera una mayor concentración de protones en este espacio comparado al de la matriz mitocondrial (Fig. 3 - 13). Este gradiente cuando trata de igualar concentración y carga, genera la energía para la síntesis de ATP.

Representacion de la Cadena Respiratoria en 1963. Glutamato β - Hidroxiacil - CoA β - Hidroxibutirato Isocitrato Malato Prolina

Acil - CoA Flavoproteína

Fp

NAD

de

(Fe) FMN

FAD2

α - Cetoglutarato

Transferidora

Electrones

(Fe) FAD 1

Piruvato Lipoato

FPTE

Succinato

[b, Q]

c1

c

(Cu) a, a3

O

2

FAD3

α - Glicerofosfato Colina Se puede observar la entrada de elementos reductores transferidos por las Deshidrogenasas, junto a los grupos prostéticos (Fe) y (Cu)

Fig. 2 - 13. Las Coenzimas reducidas provenientes de diferentes reacciones de oxidación entregan sus protones a la C.T.E. oxidándose. FPTE, es por Flavo proteína Transportadora de Electrones.

En la Figura 3 - 13, se puede observa la forma actualizada de la Cadena de Transporte de Electrones y del Sistema a cargo de la Fosforilación Oxidativa. Los componentes de la Cadena de Transporte de Electrones se desarrollaron después que apareció la vida en la Tierra, ya que hubo de esperar la aparición y evolución de los primeros organismos fotosintéticos que emplearon H2S y el ión Fe +2 , ya que el O2 no se encontraba libre. Es muy probables que los sistemas con cadena de transporte reductora en las plantas (CO2 + H2O -------- Glucosa) y oxidativa en los animales (Glucosa + O2 ---------- CO2 + H2O) evolucionaran a la par complementándose el uno con el otro. Para obtener energía es posible juntar dos elementos opuestos de la Tabla Periódica, uno de ellos debe tender a donar electrones (Electronegativo) como lo hace el Oxígeno y el otro debe captar electrones como lo hace el Hidrógeno (Electropositivo). Ambos producen H2O y energía, sin embargo en los sistemas biológicos debemos reemplazar uno de ellos por algo similar, como lo son aquellas Coenzimas reducidas NADH, FADH2 y NADPH. Estas han extraído los protones de los sustratos como Hidratos de Carbono, Aminoácidos y Lípidos mediante su oxidación.

611

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

H +

Secuencia de Reacciones

II Succi nato

Succinato Deshidrogensa FAD

Fe S

+

H QH

e

+

Q

e

QH

Q

IV Citocromo Oxidasa

e

Fe S

c1

Cu A

c

a

a

3 Cu B

b 566

e

I

NADH Deshidrogensa N A D H F M N Fe S

afuera

Oxidoreductasa

b 562 2

+

III CoQ-Cit C

QH

Fp2 H

H

QH QH H

Fp1

+

H

+

adentro

H H

+

O 2

Ács. Grasos

+

Glicerol-P

Fig 3 - 13. Transporte de electrones entre los complejos de la Cadena. En el Complejo III se puede observar el Ciclo Q. Solo los Complejos I, III y IV pasarán protones al espacio intermembrana.

Las Coenzimas deberán a su vez, entregar los protones al Oxígeno por medio de una serie de reacciones compatibles con las estructuras biológicas, es decir de manera escalonada ( Ver Tabla de Potenciales Redox 2 - 11), liberando la energía paulatinamente y no en una sola reacción como ocurre durante una combustión. En esta última se produce demasiada energía en corto tiempo en un lugar puntual, lo que es incompatible con la vida. Aquí se requiere de un flujo de electrones entre dos extremos que se lleva a cabo mediante sucesivos escalones. La cantidad de energía liberada será la misma que en una combustión, pero en un sistema biológico la energía se acoplará a la síntesis de otras moléculas o bien la generación de gradientes de concentración o por último podrá ser se liberada como calor radiante. En base a lo anterior los componentes de la Cadena de Transporte de Electrones se pueden agrupar midiendo la tendencia que tienen para donar electrones en un sistema lo cual estará dado por su Potencial Redox, que depende de la siguiente ecuación: ΔGº´ = - n F ΔEº´ = - n F ( Eº´ aceptor de electrones – Eº´ donador de electrones) n: Nº de electrones en la transferencia F: Constante de Faraday = 26.032 cal/mol x volt Eº´: Potencial Redox a pH 7 y 25ºC Tomando en cuenta el primero y último par Redox de la CTE (Tabla 2 – 11), podemos calcular la cantidad total de energía liberada por esta: NAD + 2H + 2e ½ O2 +2H + 2e

NADH + H H2O

- 0,32 volt + 0,82 volt

Tabla 2 – 11 POTENCIALES REDOX DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES. 612

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

Oxidante

Reductor

Nº de Eº´ electrones (volt)

O2 2H+ NAD+ NADP+ FMN (unido a enzima) FAD CoQ Citocromo b (+3) Citocromo c1(+3) Citocromo c (+3) Citocromo a (+3) ½ O2 + H2O

O2 – (Superóxido) H2 NADH + H+ NADPH + H+ FMNH2 (unido a enzima) FADH2 CoQH2 Citocromo b (+2)

1 2 2 2 2

-

2 2 1

- 0,22 + 0,04 + 0,07

Citocromo c1(+2)

1

+ 0,23

Citocromo c (+2)

1

+ 0,25

Citocromo a (+2)

1

+ 0,29

H2O2 ( Peróxido de Hidrógeno) Citocromo a3 (+2)

2

+ 0,30

1

+ 0,55

H2O

2

+ 0,82

Citocromo a3 (+3) ½ O2 + 2H+

0,60 0,42 0,32 0,32 0,30

La primera reacción es más electronegativa (- 0,32 volt) que la segunda, luego tenderá a donar electrones y protones por lo tanto se deberá invertir, mientras que la segunda reacción es electropositiva, acepta electrones y se encuentra en la disposición adecuada: NADH + H NAD + 2H + 2e + 0,32 volt ½ O2 + 2H + 2e H2O + 0,82 volt ----------------------------------------------------------------------------------NADH + H + ½ O2 + 2H NAD + H2O + 1,12 volt La energía total liberada por la Cadena de Transporte de Electrones será: ΔGº´ = - n F ΔEº´ = 2 x 26032 x (+ 0,82 – ( - 0,32) ) = 58.311,7 Cal/mol Sin embargo, la producción de energía alcanza a solo 3 ATPs, lo que indica que existe una fracción de energía que se disipa como calor y no se almacena en una molécula química. Volver al inicio

613

Citosol

+

+ H

Esp. Inter -

H

III Glicerol - 3 - P

H+

Memb.

P D H - Cetona

Glicerol - 3 - P

+ H

H+

Deshidrogenasa

QH

Cyt C

QH2 Cit b 561

Q

Fe - S FMN

QH2 2

Fe - S

Fe - S

NAD

I Matriz Mitocondrial

Succinato

FAD

Fumarato

II

+

H

Q H

+

Cit a 3 Cu a

FAD

O C

O+ 4H + 2

H

+

+ +

H

3

2 HO 2

+ H

+ H + H + H O

H

C

SCoA Acil - CoA Deshidrogenasa

H

H

FAD

FPTE

+

Cit a Cu a 4e

Cit b 562

QH

FAD

H

IV

Cit C 1

FAD

NADH

H

+ + H

SCoA

H

+ H + H

F1

A T P asa

Fo

V

Fig. 4 - 13.Visión general de los distintos complejos que dan origen a la C.T.E. y al flujo de electrones y protones que originan la Fosforilación Oxidativa.

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

606

2) GRADIENTE ELECTROQUIMICO. El gradiente electroquímico que se forma a ambos lados de la membrana mitocondrial interna en la figura general 4 - 13, es uno de concentración y carga. Este puede ser descrito por la ecuación (1 - 13):

ΔG = 2.3 R T lg C2/C1 + z F (V2 - V1) (A)

(1-13)

(B)

La parte (A) de la ecuación describe la energía que depende solo del gradiente de concentración:

Espacio intermembrana C2 o pH2 H+ H+ H+ H+ H+ H+ C1 o pH1 H+ H+ Membrana Mitocondrial interna La energía debido a la concentración de protones a ambos lados de la membrana esta dada por:

A = 2.3 R T lg C2/C1 que también se puede expresar como:

A = - 2.3 R T(pH2 - pH1) La otra parte (B) de la ecuación 1 - 13, describe la energía que se produce a consecuencias del gradiente de potencial o voltaje a ambos lados de la membrana interna debido a la carga de los protones:

Espacio Intermembrana ++++++++++++

V2

Membrana mitocondrial interna --------------V1 Este último efecto se debe a que la bicapa es aislante y actúa como un condensador acumulando carga en su superficie, cuya energía esta dada por la siguiente ecuación:

B = z F (V2 -V1) donde z = + 1 o carga del protón F = Constante de Faraday o 23062 cal/mol volt La parte (A) de la ecuación mide el cambio de energía libre cuando la concentración C pasa de C1 a C2 ( C2 > C1 ) y se establece el gradiente de concentración de protones. La parte (B) mide el cambio de energía libre al pasar de V1 = 0 cuando el soluto no tiene carga, a V2 = V2 o cuando el soluto sí tiene carga, como sucede con los protones que son capaces de generar

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

un potencial de membrana. Esto se debe a que la carga + es mayor hacia el espacio intermembrana que al interior o matriz mitocondrial donde es menor. Cuando el sistema tiende al equilibrio (ΔG = 0), tenemos que la energía libre total del sistema tiende a 0 y si consideramos que - log H+ = pH, la diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana estará dada por la Ecuación de Nernst (Ec. 2 - 13), adaptada a la Teoría Quimiosmótica:

ΔG = A - B ΔG = 0 A = B y se tiene que:

V=

2.3 R T (pH2 - pH1) -------------------(2 - 13) zF V=

- 60 (pH2 - pH1)

Como la diferencia de pH es de 1.4, siendo en el espacio intermembrana el pH más bajo o ácido que en la matriz mitocondrial. La parte (A) de la ecuación (1 - 11), empuja a los protones a la matriz mitocondrial mientras que el otro gradiente (B), que es de potencial favorece la mantención del gradiente de pH, es decir empuja a los protones hacia el espacio intermembrana. Por lo tanto ambos se oponen y cuando alcanzan el equilibrio el potencial de membrana o la diferencia de potencial entre ambos lados será de 60mV calculados por la ecuación 2 - 13. Nunca la concentración alcanzará valores iguales a ambos lados, pues al gradiente de concentración se opone al de voltaje y hay que considerar que no son equilibrios estáticos, sino que dinámicos, ya que los protones son aportados al espacio intermembrana y a su vez son capaces de fluir hacia el interior por medio del Complejo V o FoF1ATPasa (ATP Sintasa). En resumen se trata de un gradiente del tipo Estado Estable que fluye por medio de su acoplamiento a la energía de las reacciones exergónicas de oxidación que ocurren en cada etapa de la Cadena de Transporte de Electrones. La fuerza protón-motora F del gradiente electroquímico está expresada en mV y consiste en la contribución del potencial de membrana conocido como Vm, que es de 140 mV menos la contribución del gradiente de protones que es de 60mv multiplicados por la diferencia de pH (pH2-pH1) lo que corresponde a: F = Vm - 60(pH2 - pH1) F = 140 - 60 ( -1.4) Como el pH intermembrana es 1.4 veces más bajo que el de adentro, el total equivale a una fuerza protón motora de 224mV o 5.2 Kcal/mol de protones. La unidad de pH entonces produce una diferencia de potencial de 60 mV. Posteriormente estos protones, al tratar de equilibrarse en el sistema entran a la matriz mitocondrial movidos por la fuerza protón-motora pasando a través de los canales iónicos formados por el Complejo V o FoF1ATPasa. Las innumerables copias de esta Complejo V se encuentran ubicadas en las Crestas mitocondriales. Una vez en la matriz mitocondrial los protones ya no intervienen en la

606

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

ecuación de equilibrio por intervenir en la formación de agua mediante la acción del Complejo IV(Citocromo Oxidasa). Por lo tanto los protones entran a la matriz mitocondrial a través de las ATP Sintasa (FoF1ATPasa) a causa de la fuerza protón-motora tratando de igualar el potencial quimiosmótico. La energía de este gradiente es atrapada en la síntesis de ATP mediante el proceso denominado Fosforilación Oxidativa (P.O.). Las reacciones que producen energía mueven los protones hacia fuera (espacio intermembrana) y las reacciones que consumen energía (Complejo V) se acoplan a los protones que entran nuevamente, para así sintetizar ATP (Fig. 5 - 13).

Espacio Intermembrana

2 H+ 2H

Matriz

Bicapa I Q III

+

Mitocondrial Cadena

II

de Transporte de

c 2 H+

Complejo II no envia protones a travez de la membrana.

Electrones

IV

ADP + P Fo

F1

A T P Sintasa

2 H+ ATP + H2 O

Fosforilación Oxidativa

Fig. 5 - 13. Flujo de protones en los distintos complejos de la CTE. Solo los complejos I, III y IV transportan protones desde las coenzimas de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.

Los protones que han alcanzado el interior se unen al Oxígeno para formar agua en una reacción catalizada por el Complejo IV. De esta manera se mantiene siempre el gradiente a pesar del flujo de los protones al interior.

La transferencia de energía en el metabolismo intermediario comienza desde el substrato a las coenzimas reducidas, luego de las coenzimas reducidas al gradiente quimiosmótico y posteriormente desde este a las moléculas de ATP. Esta energía será posteriormente empleada en el anabolismo o cualquiera otra función que lo demande. La matriz mitocondrial a su vez, posee toda la maquinaria para producir coenzimas reducidas, ya que aquí ocurren los principales procesos oxidativos como la β-Oxidación de los ácidos grasos, el Ciclo Tricarboxílico y la oxidación de algunos aminoácidos.

607

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

La membrana externa de la mitocondria posee grandes poros y tolera el paso de polipéptidos de 5kD. Su composición enzimática es similar a la del Retículo Endoplásmico lo que determinaría un posible origen común. Todas las reacciones de la C.T.E. son exergónicas aunque algunas más que otras, (Fig. 6 13).

Perfil Energético de la C.T.E.

, E o - 0,4 - 0,2

Energía

NADH + H

a

- 0,0 + 0,2

0

FADH 2 2e ATP Co E Q

b

10

Cit b 2e Cit c

+ 0,4 + 0,6

20

ATP 1

c

Cit c

30

Cit a 2e

+ 0,8

a

Kcal

ATP O 2

40 50

b

c son las tres reacciones más exergónicas capaces de producir un flujo de protones y electro -

nes equivalentes a tres ATP s.

Fig 6 - 13. Perfil de energía en la C.T.E., donde todas las reacciones son exergónicas.

En general existen tres lugares donde se produce el flujo de protones desde la membrana interna hacia el espacio intermembrana y que se denominan en la Figura 6 - 13 por las letras a, b y c, que corresponden a los Complejos I, III y IV. Estos lugares se han determinado por el estudio de los niveles de P/O (Cuociente Fósforo/Oxígeno) bajo la acción de distintos inhibidores. Se estudia el consumo de Oxígeno con inhibidores que actúan a distintos niveles de la cadena. Aunque siempre se ha postulado la transferencia lineal de elementos reductores desde la región más electronegativa a la más electropositiva de la cadena, se observa que algunos componentes parecen desplazarse en ambas direcciones, lo que se comprueba en el caso de la Coenzima Q o Ubiquinona. Esta última forma un grupo de moléculas móviles que convergen equivalentes reductores desde varias Deshidrogenasas de la Cadena (Complejos I y II) hacia el sistema de los Citocromos (Fig. 7 - 13). El mismo Citocromo C parece migrar en uno y otro sentido al estar unido por las cargas de la Cardiolipina al lado externo de la membrana interna, lo que le permite navegar o moverse en la superficie externa de la bicapa en ambas direcciones para traer electrones al Complejo IV.

608

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

Más aún, la composición de los Complejos no es totalmente discreta y se sospecha que tienden a superponerse algunas de sus funciones.

UBIQUINONA O COENZIMA Q . Molécula hidrofóbica transportadora de protones y electrones

La cola isoprénica le permite navegar por los fosfolípidos CH 3 O

e

CH 3 O

O

O CH2

COLA ISO PRENICA

CH C CH H

CH 3 CH

2 10

Ubiquinona

3

CH 3 O

+ H + e

CH 3 O

O

O CH2 CH C CH H

CH CH

2 10

Semiquinona

3 3

CH 3 O

CH 3 O

HO

OH CH 2 CH C CH H

CH 3 CH

3

2 10

Quinona reducida o

Hidroquinona

Fig. 7 - 13. Distintos estados de reducción en la molécula de Ubiquinona, Quinona o Coenzima Q.

Después de la descripción general de la Cadena de Transporte de Electrones se procederá a la descripción individual de cada uno de estos Complejos. Volver al inicio

3) COMPLEJO I o Complejo NADH Deshidrogenasa. Recibe protones desde varias Deshidrogenasas entre las cuales se encuentran las LHidroxiacil Deshidrogenasas de la β-Oxidación de los Ácidos Grasos, la Piruvato Deshidrogenasa, la Glutámico Deshidrogenasa, la Isocitrato Deshidrogenasa, la αCetogutarato Deshidrogenasa y la Malato Deshidrogenasa del C.T.C. El complejo I está formado por al menos 25 polipéptidos (Fig. 8 - 13), de los cuales alrededor de 16 son de carácter hidrofóbico y se encuentran en asociación con fosfolípidos. Otros 6 son proteínas Ferro-Sulfuradas con PMs de 75, 49, 30, 18, 15 y 13 kD. Los últimos tres corresponden a la Flavoproteína NADH-Deshidrogenasa con PMs de 51, 24 y 9 kD más un grupo prostético FMN. El complejo posee múltiples centros Fe – S, que han sido detectados por análisis químico y ESR (Electrón Spin Resonance, técnica espectroscópica que somete a un fuerte campo magnético más la irradiación con microondas para crear y excitar orbitales midiendo la energía que estos desprenden cuando retornan a su estado basal), aunque no todos los centros ferrosulfurados parecen ser igualmente funcionales se han denominado como:

609

Héctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

N - 1a y N - 1b con dos centros binucleares (2Fe - 2S) y los N - 2, N - 3, N - 4 y N - 5 con 4 centros tetranucleares (4 Fe - 4 S). Sus respectivos Potenciales Redox se encuentran aproximadamente desde los -380 mV a los -260mV (Fig. 9 - 13).

Composición I

P.M. = 700 - 900 kD delComplejo Grupos = 1FM Prostéticos NCentro F e S Hidrofóbicos [ 2Fe - 2 S] [ 4Fe - 4 S]

Polipéptidos ( 25 )

3 [ 2Fe - 2

S] [ 4Fe - 4 S]( 6 )

Ferro - Flavo Prts.

49k

75K

Bicapa

FMN N - 34Fe -

51k

9k

Citoplasma Flujo de equivalentes Reductores

:

N A D H /N A D

2Fe 2S

13k

4S

24 N - 1b k

N-4

2Fe 2Fe2S 2S 2Fe 2S

4Fe 4S

N - 1a

FMN

N - 1a N - 1b

N-2 N-3

N-4 N-5

FM I 51 II 24 III 9 Disposición de las unidades delComposición delComplejo I

30k 2Fe 2S

[ 4Fe - 4 S]

75 kD 49 30 18 15 13

Prts. Ferro - Sulfuradas

Ubiquinona [ 4Fe - 4 S] = Fosfolípidos (3) Prta.Estabilizadora de Ubiquinona NADH

[ 2Fe - 2 S]

Centros Tetranucleares

Centros FerroSulfurados

[ 2Fe - 2 S]

Otros Componentes

Matriz Mitocondrial

( 16 ) Hidrofílicos (9)

Centros Binucleares

Q

Bicapa

N-2 4Fe 4S

N - 1b N - 3

N-4 N-5

.

N-2 QH

Q

Fig. 8 – 13 El número de polipéptidos y su disposición en el Complejo I de la C.T.E. aparecen junto a la secuencia con que fluyen los electrones.

La Ubiquinona parece también formar parte de este Complejo en asociación con una proteína estabilizadora llamada QPn, que estabilizaría a la Ubisemiquinona formada al atrapar un protón. La Ubiquinona parece ser un centro de acopio para protones que vienen de los Complejos I y II. Las enzimas que aportan elementos reductores en este caso son la Glutámico Deshidrogenasa, Isocitrato Deshidrogenasa, α-Cetoglutarato Deshidrogenasa, Malato Deshidrogenasa, L-OH-Acil-SCoA Deshidrogenasa entre otras. El flujo de protones en el Complejo I, se puede ordenar sobre la base de los potenciales redox y ocurre de la siguiente manera:

610

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N - 1b NADH---> FMN ---> N - 1a ---> N - 3 ---> N - 2 ---> QH ---> Q N - 4 (PQn) N-5 Centros Ferro-Sulfurados mono, bi, tetra y pentanucleares Los componentes N son los grupos Ferro-Sulfurados y la QH es la Ubiquinona estabilizada con su proteína. Este flujo de electrones es también acompañado por un flujo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Si uno se pregunta que coenzima es mejor reductora, ¿NADH o NADPH?. Encuentra que sus potenciales Redox son similares, además los NADPH del citoplasma y los de la Mitocondria son de distintas fuentes y dependen de distintas reacciones, no así las NADH cuyos elementos reductores (H+) son llevados al interior por transportadores. No hay comunicación directa entre los NADPH de la Mitocondria y Citosol. Sin embargo, existen Deshidrogenasas que funcionan con solo uno de ellos y no con ambos a excepción de la Glutámico Deshidrogenasa. Los sustratos que reaccionan con NADP tienen un potencial redox algo más negativo (son mejores reductores) que los que reaccionan con NAD. Por otro lado, la Glutámico Deshidrogenasa oxida con NAD y reduce con NADPH. Así, en el interior de la Mitocondria, la razón NADPH/NADP (casi 100% reducida) se encuentra en una proporción 500 veces mayor que la razón NADH/NAD (solo 30% reducida) a pesar de la equivalencia de sus potenciales redox. Probablemente esto se deba a su acoplamiento con la CTE y Fox.

NADH + NADP + 2H (afuera) -----Æ NADPH + NAD + 2H (adentro) NADPH + NAD+ + 2H+(adentro) U, A->Hipoxantina Agentes químicos que se intercalan, Ej.:Acridina Radiación U.V. Radiación ionizante, tipo γ o rayos X

Base alterada

Base incorrecta Deleción/Inserción Dímeros de Timina Ruptura de las Hebras

g) Mutaciones en el DNA.

Las mutaciones (Figs. 22-14 y 23-14) que cambian el marco de lectura para la síntesis de una proteína pueden ser por deleción o la inserción de una base en la secuencia de la hebra. Otro tipo de mutaciones solo afectan a un solo triplete y se traducen en un solo aminoácido cambiado en la proteína y su mecanismo es por transición, en que una Purina se cambia por otra Purina o transversión en que se cambia una Purina por una Pirimidina o viceversa.

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Héctor Rocha L. DNA

.

TIPOS DE MUTACIONES . A)

AUG UUU

UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro -

CODON DE INICIO CODONES DE

U

TERMINO

INSERCION

: AUG

: UAA UAG UGA

B) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AAU GGA AGU UGA

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Asn - Gli - Ser A

DELECION C)

AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AGG AAG UUG AAC CUU

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Arg - Lys - Leu - Asn - Leu - ETC - ETC

Fig. 22 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Se produce la inserción de Uracilo en el triplete AAG que pasa a AAU-G. c) El triplete AAG pierde Adenosina y pasa a ser AG-G.

A continuación se explica detalladamente cada una de estas mutaciones y se puede empezar analizando las que ocurre cuando se introduce una base como Citosina* en el lado 3' de la hebra cebadora. La Citosina no aparea con la Adenina de la hebra Templada: 3' A G C T G C A C T A G 5' Hebra Madre 5' T C G A C G C*- - - - - 3' Hebra Hija En este ejemplo la base mal apareada puede ser removida junto con otras vecinas por la capacidad exonucleásica 3'--> 5'de la DNA pol I o la DNA pol III de E. Coli y el sitio puede ser repavimentado con la base correcta. Esta capacidad es también denominada EDITORA en las DNA pol bacterianas y animales. Otro ejemplo de mutación ocurre cuando una molécula plana como el Benzopireno (alquitrán de cigarrillo) o las Aminas cíclicas (carne a las brazas) se intercalan en el DNA separando las bases. En estos casos se produce una mutación por cambio del marco de lectura. Esto significa que una proteína puede ser normal en su secuencia aminoacídica hasta el punto de la mutación y desde este lugar se salta en la lectura una o dos bases por la presencia de la molécula foránea que se encuentra intercalada en la secuencia. De esta manera la proteína es totalmente distinta desde el triplete de la mutación en adelante y en este caso la secuencia anormal puede en algunos casos detenerse prematuramente cuando se forme el codón que no codifica para ningún aminoácido (debido al desfasamiento de la lectura) o continuar aún más allá de su terminación normal, hasta que se forme alguno de los codones de terminación por similar razón a la anterior.

696

Héctor Rocha L. DNA

.

Igual cosa ocurre si se intercala una base extra en una de las hebras como se observa en la figura 19 - 14, donde la secuencia desde el lugar de la mutación en adelante es distinta a la original. Mutaciones por Deleción ocurren cuando se pierde una base por Depurinación espontanea, la que puede ser llevada a cabo por la Temperatura o la acidez del medio. En este caso se pierde el marco de lectura, ya que la base que falta para la lectura de un triplete se toma del siguiente alterando la proteína desde aquí en adelante en su secuencia (Fig. 19 - 14). En el caso de mutaciones por Transversión, es decir el cambio de una Purina por una Pirimidina o de Transición con el cambio de una Purina por otra Purina o de una Pirimidina por otra Pirimidina, ocurre que se altera en la secuencia de la proteína solo el aminoácido correspondiente al triplete afectado (Fig. 20 - 14). Si ocurre que este aminoácido tiene entre cuatro a seis tripletes para su codificación, este tipo de mutación puede ser silente. Esto significa que la mutación ocurre en el DNA, pero no se manifiesta en la Proteína, ya que el nuevo triplete producido aún codifica para el mismo aminoácido. De acuerdo a este postulado la primera y segunda base de un triplete afectan más la identidad de un aminoácido que la tercera base. Esta última no es importante ya que el código genético es degenerado o ambiguo. Lo que significa que distintas combinaciones pueden aún codificar para el mismo aminoácido. La expresión de la mutación siempre dependerá de los mecanismos correctores de la célula y en el caso de que esta sobrepase la corrección, dependerá del sitio y el nivel donde se produzca. Si es en los elementos de control de la expresión de un gen, el resultado será catastrófico, pero si ocurre en las zonas no codificadoras es probable que no ocurra ningún efecto, excepto cuando ocurre en las zonas repetitivas como se observará posteriormente.

697

Héctor Rocha L. DNA

.

h) Daño por luz UV.

La luz Ultravioleta por tener la longitud de onda de mayor energía del espectro induce daños en el DNA especialmente en aquellos lugares donde un par de bases nitrogenadas como la Timina se encuentran vecinas en la misma hebra, (Fig. 23 - 14). Así tenemos que en una célula de la dermis en un día de playa, dos timinas vecinas pueden dar origen a un aducto formado por un Ciclo Butilo entre los dos anillos de Timina. Esta unión produce una pequeña joroba en el DNA que si persiste en la replicación del DNA, las dos Timinas no tendrán representación como dos Adeninas en la hebra hija y en el caso de sintetizarse una proteína se producirá un salto en la lectura de las Timinas lo que se traducirá en una mutación por deleción. En los humanos existe la enfermedad denominada Xeroderma Pigmentosa, en que la piel se mancha fácilmente bajo la exposición de la luz solar. Esta enfermedad presenta una alta susceptibilidad al desarrollo de carcinomas y melanomas, donde se sospecha la existencia de varios genes involucrados en la reparación del DNA y que pueden encontrarse defectuosos por esta razón. En este caso las enfermedades son clínicamente similares, pero molecularmente pueden tener distintos orígenes. En bacterias el fenómeno es mucho mejor comprendido y ha sido descrito en detalle (Fig. 2414). TIPOS DE MUTACIONES .

CODON DE

A)

AUG

UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA

Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro G

: AUG

INICIO CODONES : U A A DE

UAG

TERMINO

UGA

TRANSICION B ) AUG

UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA

AUG

UUU UCU UAU CGG GAG GAA GUU GAA CCU UAA

Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Glu - Glu - Val - Glu - Pro C

TRANSVERSION C ) AUG

UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA

AUG

UUU UCU UAU CGG CAG GAA GUU GAA CCU UAA

Met -

Phe - Ser - Tyr - Arg - Gln - Glu - Val - Glu - Pro

Fig. 23 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Mutación por Transición donde Adenina es reemplazada por Guanina. c) Transversión donde Citosina es reemplazada por Citosina.

698

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.

Las proteínas UvrA y UvrB participan en la reparación uniéndose a la joroba del aducto y lo desenrollan con la energía del ATP. Luego una tercera proteína, UvrC se une a las otras dos e induce cortes de 12 nucleótidos, los que se desenrollan por la acción de la helicasa II. Este hueco es posteriormente relleno por la DNA pol I y a continuación la enzima DNA ligasa completa la reparación cerrando los extremos libres.

Reparación de ADN dañado por luz U V.

se separan cerca de 12 bases de la hebra dañada .

por sistem a de reparación Uvr ABC.

T

T Luz UV .

brecha .

ATP ADP

P

P

T T

T T

Uvr A

Uvr B

LIGASA.

OH

T T OH

Ambas proteínas desenrrollan la sección de ADN con joroba . Requieren de ATP .

Acción de la

P

P

T T

D N A pol I cierra la

OH

Uvr C Corta la sección de 12 nucleotidos y con Helicasa II se remueve el fragmento

Fig 24 - 14. La reparación de los dímeros de Timina en E. Coli se emplea de modelo para el estudio de la reparación del DNA en humanos.

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699

al

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14) REPLICACION DEL DNA. Durante la replicación del DNA descrita en procariontes intervienen una serie de proteínas que se catalogan en la Tabla 3 - 14. Estas proteínas son de varios tipos y entre ellas encontramos a las proteínas estabilizadoras, las enzimas replicadoras y aquellas proteínas que evitan la formación de nudos al desenrollar el DNA.

TABLA 3 - 14 PROTEINAS NECESARIAS PARA INICIAR LA REPLICACION DEL DNA.

Proteína Proteína DNA A

PM kD 50

Proteína DNA B o 300 Helicasa Proteína DNA C 29

Nº de subunidades Función 1 Abre la doble hebra en lugares específicos en el origen 6 Desenrolla DNA 1

HU

19

2

Primasa o proteína G SSB RNA polimerasa DNA topoisomerasa II o Girasa

60 75,6 454 400

1 4 6 4

Requerida para la unión del DNA B en el origen Proteína similar a la Histona. Se necesita para el inicio. Sintetiza RNA cebadores Se une a una sola hebra del DNA Facilita la actividad de la DNA A Reduce la tensión generada por el por el desenrrollamiento del DNA.

En la Tabla 4 - 14, se aprecian las características de las distintas DNA polimerasas descritas hasta la fecha en E. Coli.

La DNA pol I es la que se encuentra en mayor proporción, sin embargo es lenta para la replicación del DNA en bacterias, pero tiene actividad exonucleásica 5' ---> 3', hidrolizando y rellenando sectores del DNA que no aparean.

La DNA pol II actúa para reparar sectores específicos del DNA y la DNA pol III es la enzima principal involucrada en la replicación del DNA bacteriano (Fig. 22 - 14). La DNA pol III es multimérica con más de diez subunidades que poseen distintas actividades polimerizadoras y editoras.

TABLA 4 - 14.

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COMPARACION ENTRE DNA POLIMERASAS DE E. COLI.

Gen Estructural Subunidades PM kD 3'-->5'Exonucleasa Editora 5'-->3'Exonucleasa Vel. Polimerización.(nct/sg ) NCT agregados antes de la disociación

I polA 1 103 Si

II PolB >4 88

III polC > 10 900

Si 16-20

No 7

250-1000

3-200

> 10000

> 500000

En la Tabla 5-12, se caracterizan las subunidades que constituyen la DNA polimerasa III:

TABLA 5 - 14 SUBUNIDADES DE LA ENZIMA DNA pol III EN E. COLI. Subunidad Alfa α Epsilon ε Deta θ Tau τ Gama γ Delta δ Delta' δ’ Xi χ Psí φ Beta β

PM kD 13,2 27,0 10,0 71,0 52,0 35,0 33,0 15,0 12,0 37,0

Gen polc(dna E) dnaQ (MutD) hho lE DnaX DnaX HolA HolB HolC Hold DnaN

Función Polimerización 3'--> 5'Exonucleasa Editora

ATPasa requerida para óptima actividad

El lugar desde el que se inicia la replicación se denomina oriC y se encuentra en un sitio específico del cromosoma gigante en la bacteria E. Coli. Este sitio esta caracterizado por tener un sector con cuatro secuencias repetitivas de 9 pares de bases (4 de 9) y otro sector

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con tres secuencias de 13 pares de bases repetitivas (3 de 13), dando un total de 245 pares

D N A Polimerasa I I I Holoenzima de E . Coli.

Fig 25 - 14. Estructura general de la DNA pol III.

de bases (Fig. 23 - 14).

3 secuencias de

4 secuencias de

1 3 pares de bases en tandem

9 pares de bases

GATCTNTTNTTTT

TTATCCACA

Fig. 26 - 14. Secuencias repetitivas en Ori C.

En la práctica se suele dividir el proceso de replicación en tres etapas: Iniciación, Elongación y Terminación. Volver al inicio

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a) INICIACION: Esta etapa parte con la unión de cerca de 20 a 30 moléculas de proteína bajo la acción del ATP al sitio Ori C con 4 sectores repetidos de 9 pb con la secuencia TTATCCACA (Fig. 27 14). Este sitio debe poseer DNA circular superen rollado negativamente como exigencia. Luego bajo la presencia de la proteína HU similar a la histona, se forma un "loop" u horquilla con el DNA que se desaparea en la secuencia GATCTNTTNTTTT abriéndose. Posteriormente se unen a este sitio la proteína DNA B ayudada por la proteína DNA C. La proteína DNA B actúa como helicasa en presencia de ATP y desenrolla el DNA oriC en forma bidireccional creando una burbuja de replicación con dos horquillas de replicación en cada extremo con la ayuda de las proteínas DNA B y C.

Ori C Secuencias

9 - mers

repetitivas

13 mers

Cromosoma de E. Coli Proteínas dna A requerida para la iniciación

DNA Circular

Proteínas dna B Ambas proteínas dna C son requeridas en el 30 oC primosoma

O r i C 9 - mers

DNA Super – Enrrollado

13 mers

Fig 27 - 14. Etapa de Iniciación. El término "mers" se refiere a las secuencias repetitivas.

En este momento es posible la unión de la proteína SSB (Proteínas estabilizadoras) para estabilizar el DNA abierto junto a la DNA Girasa (DNA topoisomerasa II). La Girasa corta la hebra para desenrollar y aliviar la tensión producida por la Helicasa y la une posteriormente con la energía del ATP.

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b) ELONGACION: En esta etapa se sintetizan la hebra líder o continua de 5'--->3' y la hebra discontinua o retrasada que debiera ir de 3'--->5, sin embargo existe aquí un problema ya que la DNA polimerasa III y I avanzan en la dirección 5'--->3' solamente (Fig. 25a-12). La hebra líder o continua se sintetiza con la ayuda de la enzima PRIMASA del complejo PRIMOSOMA. Esta es una RNA pol que produce una hebra de 10 a 60 ribonucleótidos de RNA cebador en el sitio de origen. Este RNA cebador o "primer", aporta su lado 3'OH para la unión del 5' Alfa Fosfato del primer Deoxiribonucleótido del DNA que se esterifica a este lugar por medio de la enzima DNA polimerasa III (Fig. 25b - 14). Esta enzima solo avanza replicando en dirección 5'--->3' de acuerdo con el avance simultáneo de la burbuja de replicación en la misma dirección 5'--->3'. En la hebra discontinua o retrasada se presenta el problema de la falta de bidireccionalidad de la DNA pol III (Fig. 25c - 14). Por lo tanto un conjunto agrupado de proteínas en el complejo denominado PRIMOSOMA( 7 proteínas distintas) subsana este problema. En este caso se forman varios RNA cebadores o "primers" de 10 a 60 ribonucleótidos por acción de la Primasa del PRIMOSOMA en dirección opuesta al avance de la burbuja de replicación. Posteriormente a los cebadores de RNA se les unen trozos de DNA en su lado 3'libre por acción de la DNA polimerasa III, formando el fragmento mixto RNA-DNA conocido como fragmento de Okasaki (Fig. 25d - 14). RNA DNA Fragmento 5'---------->3'-P- 5'------------>3' de OKASAKI. unión fosfodiéster

Fig. 28 - 14. Horquilla con bucle permitiría la síntesis de la hebra Retardada en el mismo sentido de la hebra Líder coincidiendo con el movimiento de la Helicasa. Las horquillas permiten el avance del replisoma en ambos sentidos.

Cuando se han completado varios de los fragmentos de Okasaki en ambas direcciones de la burbuja, la DNA polimerasa I del PRIMOSOMA hidroliza los RNA cebadores y simultáneamente los reemplaza por DNA (Fig. 25d - 14). La brecha entre los distintos trozos es luego cerrada por una LIGASA del PRIMOSOMA, que forma los enlaces entre el final 3'OH de un deoxirribonucleótido y el inicio 5' Fosfato del otro, formando de esta manera el enlace fosfodiéster y dándole continuidad a la hebra recién sintetizada (Fig. 25e - 14 y 25f - 14). Ocurre el caso de que la hebra retardada puede ser también sintetizada en la dirección del avance de la horquilla cuando se produce un "loop" o bucle alrededor de la DNA polimerasa

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III (Fig. 26 - 14). De esta manera ambas hebras de DNA con sus respectivas DNA pol III, la líder (continua) y la retardada (discontinua), se encontrarán avanzando en la misma dirección de la horquilla (Fig. 26 - 14) a medida que el bucle se traslada en la misma dirección en que se mueven las Topoisomerasas. Volver al inicio

c) TERMINACION Ambas horquillas de replicación se encuentran en el otro extremo del cromosoma circular del E. Coli, donde intervienen las Topoisomerasas Tipo II. Estas enzimas son necesarias para la separación de los dos pares de hebras madre-hija. Las proteínas Ter especifica la terminación evitando que las Helicasas desenrollen más DNA impidiendo el avance de la horquilla. Algunos detalles de la replicación aún se desconocen, sin embargo es conocido que pueden aparecer varias burbujas de replicación simultáneas cuando la bacteria cuenta con un buen aporte de nutrientes. La replicación en Eucariontes es de 50 nucleótidos por segundo lo que es solo un décimo de la rapidez con que ocurre en los Procariontes, pero empieza en sectores denominados sitios de replicación autónomos y existen varios de estos sitios por cromosoma y a la vez varias burbujas de replicación autónomas. En Eucariontes las DNA polimerasas son tres, ALFA (α), DELTA (δ) y EPSILON (ε). La α replica la hebra retardada y la δ la hebra líder, mientras que la ε tiene actividad reparadora, además actúa en conjunto a otras proteínas estabilizando y facilitando el ensamblaje de los sistemas replicadores.

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H

O P

O

H

N

2

O

N N

O

5'

CH

N N

2 O O

O

O

OH

P

O

N

O N

CH 2

H

N

2

O O

O

O

OH

P

O

N

O CH 2

O

N

O

O

O

OH

P

O

O N N

O CH

3'

N 2

OH

O

N

N

H 2

OH

Fig. 29 - 14. Hebra de RNA.

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15) RNA El RNA está formado por solo una hebra de Poliribonucleótidos al igual que una de las hebras de DNA y se dirige desde el extremo 5'Fosfato al 3'OH. Los Ribonucleótidos se encuentran unidos por enlaces fosfodiéster y poseen las siguientes bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo (Fig. 27 - 14). La molécula tiene en su Ribosa un grupo 3' OH para el enlace fosfodiéster y un grupo 2'OH que la hace susceptible a la hidrólisis alcalina. La molécula de RNA puede aparear consigo misma, pero no forma hélices duplohelicoidales similares al DNA debido al impedimento estérico de la Ribosa con 2'OH que impide la torsión adecuada. El RNA es una molécula que posee variadas funciones y entre sus diversas moléculas se puede contar al RNAm que lleva la información desde el DNA a la proteína, al RNA ribosomal que interacciona con las proteínas del Ribosoma (RNAr) e interviene en el reconocimiento y fijación del RNAm a los ribosomas. Otras de estas moléculas se conocen como RNA de transferencia (RNAt) que lleva aminoácidos al sitio de ensamble en el Ribosoma, también se pueden citar al RNA cebador, para la DNA pol III en la formación de los fragmentos de Okasaki y aún se le puede encontrar como una enzima (Ribozima) en los Intrones de los

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transcritos primarios (RNA recién transcrito que lleva al RNAm) que son capaces de cortar y empalmar Exones de forma autocatalítica. La secuencia aminoacídica de una proteína esta determinada por la secuencia de los tripletes en el DNA. Cada triplete esta formado a su vez por tres bases y codifica para un aminoácido de la proteína. La información total para la secuencia aminoacídica de cada proteína reside en el Código Genético (Fig. 28 – 14). Esta información es transportada por el RNAm y leída por la maquinaria que da origen a la proteína. En el Código Genético cada aminoácido de los 20 conocidos, está codificado por uno o más tripletes de tres bases. En general existen 64 tripletes para codificar los 20 aminoácidos. Dos aminoácidos están codificados por solo un codón, como es el caso de la Metionina por AUG y Triptófano por UGG, mientras que Leu y Arg tienen seis codones para cada uno de ellos, además existen

U

C

A

G

U

C

A

G

Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala

Tyr Tyr No codifica No codifica His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu

Cys Cys No codifica Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

U C A G U C A G U C A G U C A G

Fig. 30 - 14. Código Genético.

tres codones que no codifican para aminoácidos e indican el final de una proteína y son UAA, UAG y UGA. Todas las proteínas empiezan con el aminoácido Metionina (AUG) en Eucariontes, mientras que en bacterias empiezan con Formil-Metionina. El código genético es universal entre comillas, ya que en ciertos organismos y las Mitocondrias es un tanto diferente lo que indica que aún se encuentra evolucionando. Su origen según las nuevas teorías puede provenir a partir de materiales encontrados en cometas orgánicos, sistemas marinos hidrotermales o bien de un mundo primordial regido por el RNA como origen de genes y proteínas.

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16) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA EN EUCARIONTES RNA a) Posee una Ribosa con 2'OH que no le permite formar una hélice similar al DNA cuando aparea consigo mismo

DNA a) La Deoxiribosa tiene un 2' H que le permite formar la doble hélice

b) Posee en su secuencia Uracilo en vez de Timina

b) En vez de Uracilo posee Timina

c) Estable a la hidrólisis alcalina

c) Se hidroliza con NaOH

d) En su estructura reside la información o d) Solo almacena información la actividad catalítica. e) Interacciona con las proteínas formando las Ribonucleoproteínas y Ribosomas

e) Interacciona con proteínas en los Nucleosomas y los complejos activadores y silenciadores

f) Se forma por de transcripción selectiva de los genes de la forma DNA --> RNA o pasa información de la forma RNA --> DNA en los retrovirus

f) Se forma por Replicación todo el DNA como DNA--> DNA

g) Existen los siguientes tipos: RNAm (mensajero), RNAr (ribosomal), RNAt (transferencia), Ribozimas.

g) Existen varios tipos como: DNA “génico” y DNA “basura” que comprende a su vez al DNA repetitivo DNA satélite DNA minisatélite, etc.

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17) TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES. La transcripción del DNA es el paso de la información desde una de las hebras del DNA al RNA mensajero, tanto en Procariontes como en Eucariontes. En Eucariontes se lleva a cabo este proceso mediante la acción de tres RNA polimerasas y el comienzo ocurre antes del sitio real de codificación. La nueva hebra de RNA crece en la dirección 5'--> 3' y proviene de la hebra 3'