Bioquimica De Harper (14ed)

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Bioquímica de Harper Índice de Capítulos Capítulo 1: Bioquímica y medicina Capítulo 2: Biomoléculas y métodos bioquímicos Capítulo 3: Agua y pH

Sección I

Estructura y funciones de proteínas y enzimas Capitulo 4: Aminoácidos Capítulo 5: Péptidos Capítulo 6: Proteínas. Estructura y función Capítulo 7: Proteínas. Mioglobina y Hemoglobina Capítulo 8: Enzimas. Propiedades generales Capítulo 9: Enzimas. Cinética Capítulo 10: Enzimas. Mecanismos de acción Capítulo 11: Enzimas. Regulación de la actividad enzimática

Sección II

Bioenergética y el metabolismo de carbohidratos y lípidos Capítulo 12: Bioenergenética. La función del ATP Capítulo 13: Oxidación biológica Capítulo 14: Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa Capítulo 15: Carbohidratos de importancia fisiológica Capítulo 16: Lípidos de importancia fisiológica Capítulo 17: Panorama del metabolismo intermediario Capítulo 18: El ciclo del ácido cítrico. Catabolismo de la acetil-CoA Capítulo 19: Glucólisis y oxidación del piruvato Capítulo 20: Metabolismo del glucógeno Capítulo 21: Gluconeogénesis y control de la glucosa sanguínea Capítulo 22: Vía de la pentosa fosfato y otras vías del metabolismo de las hexosas Capítulo 23: Biosíntesis de ácidos grasos Capítulo 24: Oxidación de los ácidos grasos. Cetogénesis Capítulo 25: Metabolismo de ácidos grasos insaturados y de los eicosanoides Capítulo 26: Metabolismo de acilgliceroles y esfingolípidos Capítulo 27: Transporte y almacenamiento de lípidos Capítulo 28: Síntesis, transporte y excreción del colesterol Capítulo 29: Integración del metabolismo y el suministro de energéticos tisulares

Sección III

Metabolismo de proteínas y aminoácidos

Capítulo 30: Biosíntesis de aminoácidos no esenciales en la nutrición Capítulo 31: Catabolismo de proteínas y del nitrógeno de aminoácidos Capítulo 32: Catabolismo de los esqueletos de carbono de aminoácidos Capítulo 33: Conversión de aminoácidos en productos especializados Capítulo 34: Porfirinas y pigmentos biliares

Sección IV

Estructura, función y replicación de las macromoléculas informativas Capítulo 35: Nucleótidos

Capítulo 36: Metabolismo de los nucleótidos de purina y pirimidina Capítulo 37: Estructura y función de los ácidos nucleicos Capítulo 38: Organización y replicación del DNA Capítulo 39: Síntesis, procesamiento y metabolismo del RNA Capítulo 40: Síntesis de proteínas y el código genético Capítulo 41: Regulación de la expresión genética Capítulo 42: Tecnología del DNA recombinante

Sección V

Bioquímica de la comunicación extracelular e intracelular

Capítulo 43: Membranas. Estructura, ensamble y función Capítulo 44: Acción de las hormonas Capítulo 45: Hormonas de hipófisis e hipotálamo Capítulo 46: Hormonas tiroideas Capítulo 47: Hormonas que regulan el metabolismo del calcio Capítulo 48: Hormonas de la corteza suprarrenal Capítulo 49: Hormonas de la médula suprarrenal Capítulo 50: Hormonas de las gónadas Capítulo 51: Hormonas del páncreas y vías gastrointestinales

Sección VI

Tópicos especiales

Capítulo 52: Estructura y función de las vitaminas hidrosolubles Capítulo 53: Estructura y función de las vitaminas liposolubles Capítulo 54: Nutrición Capítulo 55: Digestión y absorción Capítulo 56: Glucoproteínas Capítulo 57: Matriz extracelular Capítulo 58: Músculo Capítulo 59: Proteínas plasmáticas, inmunoglobulinas y coagulación sanguínea Capítulo 60: Eritrocitos y leucocitos Capítulo 61: Metabolismo de xenobióticos Capítulo 62: Cáncer, oncogenes y factores de crecimiento

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Bioquímica y medicina Roberf K. Murray, MD, PhD

INTRODUCCIÓN La bioquirnica es la ciencia que estudia las diversas moliculas que ce presentan en las células y organismos vivos, asi como las reacciones quimicas que tienen lugar en los mismos. Una comprensibn más completa de todas 1% manifestaciones de la vida, demanda el conocimiento de la bioquímica. AdemBs, los estudiantes de que adquieren una base siilida de la bioquimica estarhn en una posición firme para enfrentarse, en la práctica y la investigación, a los dos intereses centrales de las ciencias de la salud: 1 ) la comprensión y conservación de la salud y 2) la apreciación y tratamiento eficaz de la enfermedad.

La bioquímica es la química de la vida La bioquimica puede definirse de manera más forma1 como la ciencia que se ocupa de la base química de la vida (del griego, bios: vida). La cblula es la unidad estructural de los sistemas vivientes. La concfderaci0n de este concepto conduce

a una definicion funcional de la bioquímica como la ciencia que se ocupa de los constituyentes químicos de las células vivas y de las reacciones y procesos que experimentan. Con esta definición, la bioquimica abarca extensas heac de la biología celular, la biología molecular y la genkitica moIecular.

El objetivo de la bioquímica es describir y explicar, en términos moleculares, todos los procesos químicos de las células vivas El interés principal de la bioquimica es la comprensión completa a nivel rnolecular de todos los procesos

químicos relacionados con las células vivas. Para lograr este objetivo, los bioquimicos han necesitado aislar las numerosa moléculas de que se componen las cé1u]a1 determinar sus e s t ~ - ~ c t u Yr a analizar la forma en que funcionan. Para dar un e j e m ~ l o10s ~ e~füermsde numerosos bioquímicos Para comprender la base mOlecular de la -proceso quc acompaiia de preferencia, pero no de manera exclusiva, a las células musculares- han emprendido la purificación de muchas moléculas, siniples y complejas, seguida por detallados estudios de esh-uctura-funcibn. A iraves de estos esfuerzos, se han encontrado algunas de los fundamentos muleculares de la contracción muscular. Un obietivo adicional de la bioqliímica es intentar la comprensión del origen de la vida; este fascinante tema aún se encuentra en la etapa embrionaria. El campo de la bioquimica es tan amplio como la vida misma. Dondequiera que hay vida, se prodiicm procesos quimicos. Los bioquimicos los estudian en microorganismos, vegetales, insectos, peces, aves, mamíferos y en el ser humano. Es lbgico que los estudiantes de ciencias biomédicas centren su interes en la bioquimica de los dos últimos grupos. No obstante, una apreciaci6n respecto a formas de vida menos complejas tiene a menudo relevancia directa con la bioquimica humana. Por ejemplo, las teorías contemporaneas sobre la regulación de las actividades de genes y enzima5 en el ser humano provienen de estiidios pioneros en pan enmohecido y bacterias. El campo del DNA recombinante surgió de estudios en bacterias y sus virus; su rapidez para la multiplicacibn y la facilidad para extraer su material genético los hace adecuados para análisis y manipulaciones gentticas. El cor,ocimiento logrado por el estudio de genes virales causantes de ciertos tipos de cáncer en animales (oncogenes viraIes) ha permitido avanzar profundamente-en el modo en que la célula humana se torna cancerosa.

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Bioquim icu d~ JIarper

(Capitulo I )

El: conocimiento de la bioquímica es esencial en todas las ciencias de la vida, incluyendo la medicina

las ciencias de la salud, en particular médicos, son la comprensión y mnservacibn de la salud y la comprensión y tratamiento eficaz de las enfcmedades. !,a hioquimica tiene un impacto tremendo en ambos. De hecho, la interrelación entre bioquimica y medicina es un amplio camino de doble sentido. Los estudios bioquimicos han ilurriinado numerosos aspectos de salud y enfermedad y, de manera inversa, cl estudio de éstas ha abierto areas nuevas en bioquimica. En la figura 1-1 se muestran algunos casos de esta via de doble dirección. Por ejemplo, fue necesario el conocimiento de la estructura y Ilinción de las proteinas para dilucidar la sencilla diferencia bioquimica entre la hcmoglnbina normal y la de las células falcifonnes. Por otra parte, el analisis de esta última ha conwibuido de mancra significativa a la comprensibn de la estructura y función dc la hemoglobina normal y de otras proteínas. Podrian citarsc ejemplos análogos del beneficio reciproco entre bioquimica y medicina para los demhs pares de conceptos mostrados en la figura 1 -1 . Otro ejemplo es el trabajo pionero de Garrod, mkdico inglCs, a principios de este siglo. Estudió pacientes con cierto número de trastornos relativamente raros (alcaptonuria. alhinismo, pentosuria y cistinuria; descritos en loc últimos capítulos) y estableció que su origen era genciico. Garrod designb a estas enfemcdades como errores congdnitos del metabolismo. Sus punros de vista proporcionaron una base importante para el desarrollo del campo de la genktica bioquímica humana. La relaciún entre medicina y bioquímica tiene implicaciones filosóficas importantes para la primera. Hasta donde el tratamiento medjco se asiente en el conocimiento de la bioquimica y otras ciencias básicas pertinentes (como fisiología, microbiologia y nutricibn), la práctica de la medicina tendrá una base racional que puede acomodar nuevos conocimientos. Esto contrasta con culros de saliid no ortodoxos, que a menudo se elevan a poco más que un mito sin fundamento intelectual alguno.

Los fundamentos de la genética se apoyan en la bloquímica de los ácidos nucleicos; a su vez, los enfoques geneticos han dilucidado numerosas áreas de la bioquímica. La fisiologia, estudio de la función corporal, se traslapa casi por completo con la bioquimica. La inmunoIogía, por su parte, emplea numerosas técnicas bioquimicas y muchos de los aspectos inmunol0gicos han encontrado uso extenso eiitre bioquimicos. Asimismo, la farmacologia y la farmacia se apoyan en un co~iocimientosblido dc bioquimica y Ilsiologia; en particular, la mayoría de los firmacos son metabolizados por reacciones catalizadas por enzimas y las comple,jas interacciones entre fármacos se comprenden mejor desdc el punto de vista bioquimico. También los venenos actúan por medio de rcaccjones o procesos bioquimicos y este es el terna de la toxicologia. Cada vez más se emplean enfoques bioquimicos en el estudio de aspectos básicos de la patología (estudio de la enfermedad}, como inflamación, lesión celular y cancer. Muchos profesionales en rnicrobiologia, 7001ogía y botanica emplean métodos bioquímicos casi de manera exclusiva. Estas relaciones 110 sorprenden, debido a que la vida como se conoce dcpende de reacciones y procesos bioquirnicos. De hecho, han caído las viejas barreras entre las ciencias de la vida y la bioquirnica se toma cada vez mas su lenguaje común.

Una relación recíproca entre la bioquímica y la medicina ha estimulado adelantos mutuos Como se estableciii al principio de este capítulo, las dos preocupaciones principales de los estudiosos de

Actdos nucEelc05

geneticas

Proteína

Anemia de células falciforme5

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Lípidos

Aterosclerosis

Carbohidratos

Diabetes

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MEDICINA

Figura 1-1. Ejemplos de la via de doble dirección (interrelación) que existe entre la bioquímica y medicina. El conocimiento de los Compuestosmostradosen la porci6n superior del diagrama ha esclarecido las enfermedades mencionadas en la porcion inferior; de manera inversa, análisis de los trastornos mostrados abajo han despejado numerosas áreas de la bioquimica Debe aclararse que la anemia de cklulas falciformes es una enfermedad genetica y que tanto la aterosclerosiscomo la diabetes sacarina tienen componentes geneticos

Bioquímicuy medicina

LOS PROCESOS BIOQU~MICOS NORMALES SON LA BASE DE LA SALUD La Organización Mundial de la Salud (OMS) define a la salud como un estado de "bienestar fisico, mental y social completo y no unicamente fa ausencia de enferrnedad o dolencia". Desde un punto de vista bioquimico estricto, puede considerarse a la salud como la situación en donde las miles de reaccioiies intra y extracelulares que tienen lugar en el cuerpo proceden a velocidades adecuadas a su supervivencia máxima en el estado fisialogico. Sin embargo, este es un concepto sumamente reduccionista; es necesario enfatizar que atender la salud de los pacientes no sólo requiere de un extenso conocimiento de los fundamentos biológicos sino tambien de principios sociales y psicolbgicos.

Cuadro 1-1. Principales causas de enfermedad. Tcd a s las cairsiisenunieradas actiian bajo tia dt! varios rnecanisnl o s bioquírnicos t la o t:n el cuerpo* ..

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Agcnt cs f i s i c o s - ~ r a i i a t i s m or n e c á n i c o ~ tcinper aturas extremas, cambios repentinos cn la prcsióri atmosférica, radiacibn, choque elkctrico Aeente quirnicos y famacos: Ciertos comnuestos tvxicoc,, agentes terapéutica: ;, etcétera Agente hiológicos: Vinis. ri ckettsias, b lngos, fo rmas superiores de p:!~rásilos . ~ 5 i i c n c i de a o~igeno:Falta de Tumrnlsrro sangulneo, deficiencia en la capacidad sanpiiinea para t~mspori :ar oxigeno, intouicaciiin de las enzimns oxidativas Gen6tica: Alteraciones congenita~o rn,~ ,, oiies ininuiioliigicas: Anafilaxia nd nunológic; 1 iilihrio nut riconal: DÍ:ficiencia r :S,

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La investigación bioquimica tiene impacto en la nutrición y la medicina preventiva

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Dtsequilibrio en docrino: 1>eficiencias o excesos hurmonates -* i\dapiado con autori7acion ae KObblnS SL,Colram RS,Kizmm

8.

V Tlie Pafhologic Rasis ojDtseasr, 3rd ed. Saunders, 19R4

Un prerrequisito importante en la conservaci6n dc la salud es la ingestión óptima de cierto numero de compuestos qufmicos; de entre ellos los principales son vitaminas, varios aminoficidos, &cidos grasos, minerales y agua. Dado que el objeto de la bioquimica y la nutrición es precisamente el estudio de los diversos aspectos de estos compuestos, hay una selaci~n estrecha entre las dos ciencias. AdemBs, con la intenci6n de restringir 30s costos en aumento del cuidado médico, se enfatizan los esfiierzos sistemáticos para conservar la salud y anticiparse a la enfermedad, es decir, la medicina preventiva. Por tanto, cada vez tiende a considermsc m6s el aspecto nutricional, por ejemplo, en la prevención de aterosclerosis y c h c e r . El conocimiento de la nutricibn depende en alto grado de la bioquimica.

Todas las enfermedades tienen una base bioquímica Las enfermedades son manifestaciones de anorrnatidades de molécu tas, reacciones quimicas o procesos. En el cuadro 1-1 se enumeran tos principales factores como causa de padecimientos en el ser humano y los animales. Todos ellos afectan a una o más reacciones quimicas criticas Q rnaleculas del cuerpo.

Los estudios bioquimicos contribuyen al diagnóstico, pronóstico y trataltiiento Existe un caudal de información respecto al uso de la b i a q u i m i c a e n la prevención, d i a g n ó s t i c o y tratamiento de la enfermedad; muchos casos se citarhn

a Io Eargo del libro. N o obstante, aquí se presentan s61o siete ejemplos breves para ilustrar la envergadura del tema y estimular e1 interés del lector. I) Los seres humanos deben ingerir cierto numero de rnol&culasorgánicas comple,ja~llamadas vitaminas para conservar la salud. Si en la dieta hay deficiencia de determinada vitamina, se comprometen las reacciones en que participan. Esta situación puede manifestarse como una enfermedad por deficiencia como escorbuto o raquitismo (resultado de Ingestidn insufíciente de vitamina C y D, respectivamente). Dilucidar la actividad de las vitaminas o sus derivados con acción biolbgica ha sido una inquietud constante de bioquimicos y nutri6logos desde el principio del siglo. Una vez que el estado patologico por deficiencia de una vitamina se estableció, es racional tratarla mediante la administracidn de la vitamina apropiada. 2) El hecho de que numerosos vegetales en África son deficientes en uno o más aminohcidos esenciales (es decir, aminoacidos que deben ingerirse con los alimentos para conservar la salud) ayuda a explicar la desnutrición debilitante (kwashiorkor) que padecen quienes dependen de esos vegetales como fuente principal de proteínas. El tratamiento de deficiencias de aminoácidos esenciales es racional pero, desafortunadamente, n o siempre es posible. Consiste en proporcionar una alimentacibn balanceada que contenga cantidades suficientes de tales aminoácidos.

3) Los esquimales Tnuit de Gruenlandia consumen cantidades abundantes de aceites de pescado ricos en ciertos acidos grasos poliinsaturadosy se sabe que su concentración plasrnática de colesterol es baja, lo mismo que la frecuencia de aterosclerocis. Estas observaciones han estimulado el interés en el uso de esos Bcidos para reducir los valores plasrná~icosde colesteral. Las enfermedades por deficiencia vitamínica o de aminoácidos esenciales son ejemplos de desequi librios nutricionales (cuadro 1 -1 ). La aterosclerosis puedc considerar~eun desequilibrio de la nutricjon, pero tambikn intervienen otros factores (corno el genético). 4) El estado conocido como fcnilcetonuria si no se trata, puede cotiducir en la infancia a retraso mental grave. Desdc 1953, se conoce la base bioquimica de este trastorno, el cual está. detcrminado gencticarnente y se debe a la actividad escasa o nula de la enzima que convierte el aminoácido fenilalanina en tirosina. Esto, a su vez, eleva la concentración sanguínea de fenilalanina, lo que dafia al sistema nervioso central en desmollo. Cuando se descubrió la naturaleza del daAo bioquímico, se trató la enfermedad haciendo que los lactantes afectados ingirieran una alimentación pobre en fenilalanina. Una vez que se dispuso de pruebas bioquimicas selectivas para diagnosticar feni lcetonuria al nacimiento, pudo instituirse el tratamiento desde el principio en el niño afectado. 5 ) La fibrosis quistica es una enfermedad genMica común de las glindulas exocrinas y las glhndtilas sudoríparas ecrinas. Se caracteriza por secseciones anomalmente viscosas que obstruyen los conductos secretores del phncreas y los bronquiolos. Ademhs. los pacientes con esta afección muestran una concentración elevada de cloruro en el sudor. A menudo, las víctimas mueren a temprana edad por infecciones pulmonares. En 1989, se inform6 sohrc el aislamiento y la secuencia completa del gen causante de esta enfermedad. El gen normal codifica una proteína transrnembrana (regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis quísticaj formada de 1480 arninoacidos, la cual funciona como un conducto del cloruro. En 70% de los pacientes con la enfermedad se ha observado una deleción de tres bases en el gen, lo cual hace que en la proteina transmembrana falte el aminoacido 508, un residuo de fenilalanina. Se esth determinando la forma en que esta omisión altera la hnciún de la proteína transmembrana con produccion de moco demasiado denso. Este importante estudio facilitarii la identificacion de portadores del gen de la fibrosis quistica y se espera que conducirá a un tratamiento rnás racional dc la enfermedad que el existente hasta ahora, Por ejemplo, quizfi será posible desarrollar fhrrnacos que corrijan la anor-

malidad en la proteina transmembrana; de igual modo, podría introducirse un gen normal en las células pulmonares por manipulaciiin genética. Ida fenilcetonuria y la fibrosis quistica son ejemplos de enfermedades g e i a i c a s (cuadro 1-1 ). 6) El análisis del mecanismo de accihn de la toxina bacteriana que causa el cálera ha proporcionado infonacibn importante sobre el modo en que ocurren las manifestaciones clínicas de la enfermedad (diarrea copiosa y pérdida de sal y agua). 7) El hallazgo de que los mosquitos transmisores de parásitos (plasmodios) que causan el paludismo pueden desarrollar resistencia bioquímica a la acción de insecticidas, tiene consecuenciac importantes s o b r e los intentos para erradicar esta enfermedad. Este caso y el anterior, son ejemplos de enfermedades causadas por agentes bioliigicos (cuadro 1-1).

Muchos estudios bioquirnicos aclaran mecanismos patológicos y, a su ver, las enfermedades inspiran estudios en áreas especificas de la bioquímica Las observaciones iniciales reali~adaspor el mhdico inglés Archibald Garrod en un grupo pequeño de errores congknitos del metabolismo al principio del decenio de 1900, estimulb la investigación de las vias hiliqiiimicas afectadas en estas alteraciones. Los esfuerzos para comprender la base de la enfermedad genktica conocida como hipercolesterr)lemia familiar, que lleva a aterosclerosis grave a edad temprana, condujeron al notable progreso en el conocimiento de los receptores celulares de los mecanismos de captación ddel colesterol por las cÉlulas. Los estudios actuales de los onrogenes en células cancerosas han dirigido la atención a mecanismos moleculares que interv-ncn en el control de la inultiplicacibn celular normal. Estos y otros numerosos ejemplos posibles ilustran la forma en que el estudio de la enfermedad puede abrir areas enteras de la funci6n celular para la investigación bioquimica bhsica.

ESTE TEXTO AYUDARÁ A RELACIONAR CONOCIMIENTOS BIOQU¡MICOS CON PROBLEMAS CL~NICOS En cl texto se encuentran dispersas, breves descripciones de los mecanismos bioquímicos en que sc basan muchas enfermedades. En particular, las capítulos 63, 64 y 65 se refieren a las bases bioquimicas de varias enfermedades importantes. En el apcndice se analizan brevemente algunos conceptos basicos para interprctar los resultados de las pruebas bioquimicas de labo-

Bioyuimicu y medicina

5

Cuadro 1-2. Algunas investigaciones bialhgicas y pruebas de laboratorio aplicadas al estudio de las enfermedadi

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ratorio y se presenta una lista de las mas empleadas junto con el intervalo en el cual varian sus valores normales. El propbsito global es animar at lector a dar a SU ~0nocitTlient0de bioquimica U n USO ~ l i n i c 0eficaz.

Las inve~tigacionesbioquimicas en relacion con las enfermedades se resumen en el cuadro 1-2. En

varias secciones de este libro se presentan ejemplos de muchos de estos usos.

RESUMEN La bioquimica es la ciencia que se ocupa del estudio de las diversas molkculas que componen las células y organismos vivos así c o n o de sus reacciones quimicas, Debido a que la vida depende de estas reacciones, la bioquimica se ha convertido en el lenguaje b;isico de todas las ciencias biológicas. bioquímica se interesa en la totalidad de las forma? vivientes, desde virus y bacterias, relativamente simples, hasta les cornpIejos seres humanos.

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1. Revelar, ;I ,,u,, Au,,uu,,,L,,,ules y los mccanicmos dc la enfermedad 2. Sugerir tratamientos racionales de las enfi con base en las causas mencionadas antes ( 3. Ayudar al diagnóstico de enfermedades especirlcas 4 , Actuar colmo pruebas para deteccibn y dlagnóstid:O tcmpranci dc ciertas cnfemedades 5 . Ayudar ein la vigilancia de le. evolucifin (por qemp,lo ,,,,,,,,,cien, empeoramiento. remisibn o recaid,,111 de ciertas en remidades 6. Ay udar a evaluar la respuesta dc las cnfcrmedad

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La bioquimica y la medicina tienen una relacion estrecha. La salud depende del equilibrio armonioso de [as reacciones bioquimicas que tienen lugar en cl ,,,mo,. y- la enfermedad en biornold~ulas, reacciones bioquimicas o procesos biológicos, Los adelantos en el conocimiento bioquirnico han iluminado numerosas áreas de la medicina. De modo inverso, a menudo el estudio de las enfermedades ha revelado aspectos previamente no sospechados de la bioquimica. Con frecuencia, un enfoque bioquímico es fundamental para aclarar las caus& de Ias enfermedades e idear terapéuticas apropiadas+ EE uso racional de varias pruebas bioquimicas de laboratorio es un componente integral del diagnhstico Y vigilmcia Un conocimiento sólido de la bioquimica y de otras disciplinas bQsicasrelacionadas es esencial para la practica racional de la medicina y ciencias de la salud afines. I

REFERENCIAS Garrod AE: Inhorn errors of metabolism (Croonian Lec-

tures). Lance[ 1908;2: 1.73, 142,2 14. Kornberg A: Basic rssearch: The lireline of medicine FASBB J 1992:6:3143.

Scriver CR et al. (editors): The Melabelfc andiIhlecular Bases nJ Inherited Disease, 7th cd McGraw Hill. 1995. Willilims DL, Marks V: Scient13c Fooundaiions of Biochemi.~tryin Clin~calPractice, 2nd ed. Bunenuorth1 leinemann, 1994.

RiornoAéculas y métodos bioquímicos

Este capitulo tiene cinca objetivos. El primero se refiere a la camposici6n del cuerpo y a las principales clases de moléculas que se encuentran en 61. El estudio de estas mol&culasconfonnagrnn parte de este texto. La ctluIa es la principal unidad estructural y funcional de la biología. La mayor parte de las reacciones químicas dentro del cuerpo tienen lugar en las c6lulas. Por tanta, el segundo objetivo es dar una descripci6n concisa de los componentes de las c&lulas y de la forma en que pueden aislarse; los detalles de las funciones de estos componentes constituyen gran parte de la estructura del libro. El tercer objetivo concierne al hecho de que la biquimica es una ciencia experimental. Es importante comprender y apreciar el enfoque experimental y los mbtodos usados en bioquimica, para permitir que su estudio se convierta en un ejercicio rutinario del aprendizaje. Más aún, la bioquímica no es un cuerpo inmutable de conocimiento, sino un campo en evolución constante. Los adelantos, como en otras lireas de la bioquímica, dependen de la innovación en el enfoque experimental y tecnológico. El cuarto objetivo consiste en resumir de manera breve los principales logros obtenidos en bioquímica. La visibn concisa de la ciencia, que se presentad aquí, ayudará a impartir en el lector un sentido de la direccibn global del resto del texto. El quinto objetiva se dirige a destacar lo poco que conocemos en ciertas Areas, por ejemplo, sobre el desarrollo, la di ferenciacidn y funcibn cerebral, el cáncer y muchas otras enfermedades humanas. Quizá esto sirva de estimulo a algunos lectores para contribuir a la investigacibn de estas Areas.

EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS ELEMENTOS QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA VARIEDAD DE MOLÉCULAS Los principales elementos san carbono, hidrágeno, oxígeno y nitrógeno Se ha determinado la composición elemental del cuerpo humano y en el cuadro 2-1 se muestran los principales resultados. El carbono, oxígeno, hidrbgeno y nitrógeno son los constituyentes principales de casi todas las biomol&culas.El fosfato es un componente de los Iicidos nucleicos as1 como de otras moléculas y tambikn se distribuye ampliamente en su forma ionizada en el cuerpo humana. Por su parte el calcio tiene una funci6n importante en innumerables procesos biolbgicos y sobre él esta enfocada buena parte de la investigacibn. Los elementos enumerados en la tercera columna desempefían diversas funciones. Muchos de ellos se manejan casi diariamente en la prhctica mkdica al atender a pacientes con desequilibrios electroliticos (K', Na', C1- y Mg2+},anemia por deficiencia de hierro (Fe2+) y enfermedades de la tiroides (1-1.

Las cinco principales biomolécufas complejas son DNA, RNA, proteínas, polisacaráridos y Iípidos complejos Como se muestra en el cuadro 2-2, las principales biomol~culascomplejas encontradas en las células y tejidos de los animales superiores (incluyendo al ser humano) son DNA, RNA, proteínas, polisacfiridos

Biuqriim ica de Hrrrper

8

Cuadro 2-1. Composición ekemental aproximada del cuerpo humano (con base en peso seco)* -

Carbono

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Ovigeno I lidrógeno N itrógcno

Azufre

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-- 0.00005 * Reproducido con autorizacibn de West ES. l o d d WR. T?xzbook ofRiochcmist~.3rd e d . Macmillan, 1961.

ques estructurales de los Iipidos, aunque éstos no son polimeros de acidos grasos. Al DNA, RNA, proteinas y polisacaridos se les conoce como hiopolimeros debido a que esthn compuestos de unidades repetidas de sus bloques estructurales (los mon6meros). Las rnol~culasantes mencionadas constituyen esencialmente el "ingrediente vital" de este texto; la rnayor parte se ocupa de describir sus características bioquímicas y las de sus bloques estructurales. Por lo general se encuentran las mismas moleculas complejas en los organismos inferiores, pero pueden diferir de los que se muestran en el cuadro 2-2. Por ejemplo, las bacterias no contienen giucogeno o triaci!gliceroles, pero poseen otros polisacaridos y Iípidos.

y lipidos. Lac moiéculac complejas se construyen a partir de biomoMculas simples, tainbien enumeradas. Los bloques estructurales del DNA y el RNA (Ilarnados colectivamente ácidos nucleicoc) son los desoxinucleótidos y los ribonucle6tidos, respcctivamente. Por su parte, las bases estructurales de las protehas con los arninoitcidos, mientras que los polisacaridos estan constituidos por carbohidratos simples; en el caso del glucógeno (polisacárido principal de los tejidos humanos), el carbohidrato es la glucosa. Los ácidos grasos pueden considerarse como los blo-

Proteínas, I ípidos, carbohid ratos, agua y minerales son los principales componentes del cuerpo humano Ya se mencionb cual es la composici6n elemental del cuerpo humano. Su composición quimica se muestra en el cuadro 2-3; proteina, grasa, carbohidrato, agua y minerales son los elementos principales. E1 agua coristituye la proporción mayor, aunque su cantidad varia ampliamente en los difcrentes tejidos. Su naturaleza polar y su propiedad de formar puentes de hidrogeno hacen al agua idealmente adecuada para su función como solvente en el cuerpo. En el capítulo 3 se presentan con mayor detalle las propiedades del agua.

Cuadro 2-2. Biomol&culas orghnicas comptejas principales de células y tejidos. Los &cidos nucleicos, proteinas y plisadridos son biopolimems, constrriidm a partir de las bases estructurales mostradas. Por lo general, tos lipidos no son biopolimaros y no bases estructurates todos tienen ácidos grasos como -. - .. -.

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La célula fue reconocida como la unidad fundamental de la actividad biológica por Schleidcn y Schwann y por otros pioneros como Virchow en el sigloXIX. Sin embargo, en los aRos posteriores a la Segunda Guerra

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LA CÉLULA ES LA UNIDAD BÁSICA DE LA BIOLOG~A

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Milierales * Reproducido con

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branas y almaccnaje por tiempo prolongado dc energía como triacil-

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Hrock JF: Iiuman ,l'uiri rion and Di ererrcs, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973. El valor para el agua pucdc variar ampliamente entre los riircrentes tejidos, siendo tan bajo como 22 5% para e l hueso sin mtdula Además, el porcentaje dcf agua tiende a disminuir confunnc alimenta 13 grasa curpura)

Biomoléculas y métodos hioquímrcos * 9

Mundial, tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de actividad sin paralelo en la bioquimica y la biologia celular. Fueron: 1 ) la disponibilidad creciente del microscopio electrónico; 2) la introducci~nde rnktodos que permiten separar las células bajo condiciones relativamente poco agresivas de modo que se preserve su función: 3) el desarrollo y disponibilidad de una ultracentrifuga refrigerada de alta velocidad, capaz de generar fuerzas centrífugas suficientes para aislar los constituyentes de las celuias separadas sin sobrecalentarlos y, por tanto, sin desnaturali7arlos. El uso del microscopio electrónico reve16 muchos de los componentes ce!ularec que hasta entonces eran desconocidos o deficientemente observados, en tanto que la rotura de las células y la ultracentrifugación permitió su aislamiento y anhlisis in vitro.

Retículo endopllrsmico

h

Citoesqueleto

El hepatocito de rata muestra características comunes a muchas células eucariotas En la figura 2-1 se muestra un diagrama de la estrucmra de una ckIuEa hepatica (hepatocito) de rata; es

probabEe que ésta sea la célula m8s estudiada desde el punto de vista bioquímico, en parte por su disponibilidad en cantidades relativamente grandes, por su facilidad para fraccionarse y por la diversidad de siis funciones. El hepatocito contiene todos los organelos principales que se encuentran en [as células eucariotas (cuadro 2 4 ) ; es decir, niicleo, mitocondrias. retículo endoplásmico, ribosomas libres, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisornas, membrana plasrnatica y ciertos elementos citotsque2eticos.

Para disgregar células y aislar moléculas intracelulares y organelos subcelulares se usan técnicas físicas Para estudiar con profundidad la funcidn de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma relativamente pura, sin contaminacion importante de otros organelos. El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general, comprende tres procedimientos: extraccibn, homogeneización y centrifugaci6n. Gran parte de los trabajos iniciales en esta irea utilizaron higado de rata.

A. Extracción Como primer paso hacia el aislamiento de un organelo (o molécula) especifico, es necesario extraerlo de las cAulas en que se localiza. La rnayoria de los organelos y muchas ~iomoleculasson bastante Ihbiles y propensos a perder sus actividades biolbgicas. De acuerdo a ello, deben extraerse en condiciones poco agresivas

Membrana plasmalica

Peruxisoma

citoso1

Lisosoma

Figura 2-1. Representacibn esquematica d e una d l u l a hep8tica d e rata, con sus organefos principales

(es decir, usando soiuciones acuosas y evitando sitiiaciones extremas de pH, presibn osmótica y temperaturas altas). En realidad, muchos de los psocedimientos para aislar organelos se efectria aproximadamente entre 0 y 40 "C (por ejemplo, en un cuarto frlo o utilizando materiales conservados en hielo). A la temperatura ambiente puede haber pérdida significativa de la actividad, en parte por la acción de varias enzima5 digestivas (proteasas, nucleasas, etcktera), liberadas cuando se rompen las cdlulas. Una solución comun para la extraccion de organelos consiste en sacarosa 0.25 moVL (Esosmótica), ajustada a un pH de 7.4 con un amortiguador de hcido cIorhidrico-TRIS (tris [hidmimetil] am jnomewno), 0.05 moW, que contiene iones K' y Mg2' a concentraciones casi fisiol~gicas;a esta solución se le conoce con las siglas STKM (del ingles, Sucrosu, Tris, Kulium y Magnesiurn). No todos los solventes usados para la extraccibn son tan suaves como el STKM ; por ejemplo, para extraer lipidos y ácidos nucleicos se emplean solventes orghnicos.

10

Bioquimica de Harper

imdro 2 4 poriancia

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(Cupitulo 2)

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Funcio'nes princi

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DNA

los cromo!iornas Lugar donde se desarrvl . .. ,la la sintesi

Mitoconorion -~ibosoma*

biut&nico d ~ h i d r o g ~ n ~ a Alta contenido de RNA

dirigida pc

lo c A ( t r r gosforilaci b n oxidativa-ASitio de la sínitesis protteí! icibn del mRNA a pro-

! teina) :f ículo endc

Glucosa.

-

Li:

LoS rihosomas unidos a la mernbrama son un tanite de síntesis proteinica Siritesis de varios Iípidas Ox idación de n u m e ~ o s o s ~ e n ~ i 6 t i (c coist o c m m o _ i ~ 4 ~ o ~ io dc almacenaje de muchas hiilrolasas (e e alizan reacciones deg:radativas) .insporte dc molCculm dentro y tiuera dc las herencxa y comunicacibn interce Di:jtribucion intracelular de protein Reacciones de glucosilac:i6n Reacciones de sulfatación gradación iie ciertos ácidos gracos y amino iducción y degtadrtcíiin.-de - peroxido de h d ! crofilamentos, microtiÚbulos, filamentos intl u

ATPEI~

Mi

Aparato de Golgi

Pe

-

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1

Cata! asa

Oxidasa del Qido iirica No tien!e marcadc + 'OS'

ieshidroge .. - -nasa Citosol* 1 En:zlmas-ae !a gtuco~isis,--síntesis de:-hcidos ". & * Un organelo se puedc dcfinir como una entidad. suba :eEulwquue está limiida oormembranav se aislarior ccntxifup aci6n a altas . ..

De acuerdo a Ia definicihn, los r i b m a 5 , ei crioesqueieto y ei citosoi no son organclos. Sin embargo, aqui se les considera junto con ellos dehido a que, por lo general. también se aislan p r centrifugacibn F'ueden ctasiiiicarse comcb entidades ci fracciones subcelulares Un organelo al sisl arse por un ciclo ii c ccetrifug aci6n diferencial rara vi2s: es puro; 1Jara obtener una fraccib n pura, habi tudmente eS necesario pnr lo menos, c ierto numerci de ciclos. fracciones de citoesqueleto se pi ieden recont xer por mii:roscopia el carxteristicñs que contiei1P"

Laq

B. Homogeneización Para extraer un organela (o biomolkcu1a) de las c&lulas, primero es necesario romperlas bajo condiciones suaves. Los 6rganos (hígado, rifion, cerebro) y las células que contienen se pueden separar de manera conveniente mediante el proceso de homogeneizacibn; éste consiste en girar manualmente o por medio de un motor, un agitador dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del &gano en estudio con un medio hornogeneizante apropiado como STKM. La rotacibn controlada del agitador ejerce una fuerza mechica en las dtulas y las rompe l i h d o sus constituyentes en la sacarosa. Resulta una suspensión que contiene muchos organelos intactos, la cual se conoce como homogenado.

C. Centn'fugacidn El subfraccionamiento del contenido de un homogenada por centrifugación diferencial ha sido una tkcnica de importancia capital en bioquimica. El mttodo

por análisis

oforesis de

S

clásico utiliza una serie de tres pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores (figura 2-2) y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este prmedimiento proporciona tres sedimentos, que son las fracciones nuclear, rnitocondrial y rnicrosbmica. Ninguna de las fracciones está compuestade organelos absolutamente puros. Sin embargo, se ha establecido con precisión por el uso del microscopio electrbnico y por mediciones de enzimas "marcadoras" adecuadas y de componentes químicos (por ejemplo, DNA y RNA) que los constituyentes principales de cada 1 de las 3 fracciones son nucleos, mitocondrias y microsomas, respectivamente. Una enzima o un compuesto químico "marcador" es aquel que esta casi exclusivamente confmado a un organelo particular, corno la fosfatasa hcida en los lisosomas y el DNA en el núcleo (cuadro 2 4 ) . Por tanto, sirve para indicar la presencia o ausencia, en una fracción determinada, del organelo en el que esth contenido. La fraccibn microsbmica (mi-

Biomol~culusy métodos biquimicos

-

Sobrenadante (1)

15 o00 g x 5

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Sobrenadante (3)

min

P

Fraccibn

Fraccibn microsbmica

nuclear

Figura 2-2. Esquema de separacibn de fracciones cubceluTares por centrifugaeibn diferencial. fl tejido hornogeneuado (por ejemplo, hepfitico) se sujeta primero a centrifugacibn a bala velocidad para obtener la fraccidn nuclear (que contiene tanto núcleo como dlulas enteras) y el sobrenadante (1). Este ultimo se decanta y sujeta a centrifugacion a veloadad intermedia para producir la fraccibn mitocondr~af(que contiene rnitocondrias, lisosomas y peroxisomas) y el sobrenadante (2) este se decanta y sujeta a centrifugacibna alta velocidad para obtener la fracción microsórnica (que contiene una mezcla de ribosomas libres y reticuio endoplAsmico liso y rugoso) y una soiucibn final clara, el sobrenadante (3). Este último corresponde aproximadamente al citocol o savia celular. Modificando de varias maneras el mktodo, por lo general, es posible aislar mda organelo en forma casi pura

crosomas) contiene principalmente una mezcla de

reticulo endoplásrnico liso, retículo endopliismico rugoso (es decir, que tiene adheridos ribosomas) y rEbosornas libres. E! contenido del irltimo sobrenadante corresponde a la savia celular (citosol). Las modificaciones a este proceso bácico, que utilizan medios diferentes de homogeneizacibn o protocolos distintos de centrifugacion (por ejemplo, el uso de gradientes, continuos o discontinuos, de sacarosa), han pem itido el aislamiento, en fonna más o menos pura, de todos los organelos ilustrados en la figura 2-1 y enumerados en el cuadro 2 4 . El esquema descrito anteriormente es aplicable en tkrminos generales a la mayoría de los 6rganos y las dlulas; sin embargo, los fraccionamientos celulares de este tipo deben ser valorados con mediciones de enzimas o de compuestos químicos marcadores y por el rnjcroscopio electrónico, hasta que el procedimiento global pueda considerarse estandarizado. La importancia de los estudios d e fraccionamiento subcelular en el desarrollo de la bioquímica y la biologia celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. La infomaci6n de estas funciones, resumida en el cuadro 2 4 , representa uno de los mayores logros de la investigac i 6n bioquimica (vkase despubs).

El enfoque experimental tiene tres componentes Los componentes principaEes del enfoque experimental son tres: 1) el aislamiento de biomoldculas y organelos (vdase Centrifugación, antes) contenidos en las células; 2) la deteminacibn de la estructura de las biomoléculas, y 3) el aniilisis, utiIizando diversas preparaciones, de la funcion y el metabolismo (es decir, sintesis y degradacibn) de las biornoltculas.

El enfoque experimental requiere del aislamiento de biomoléculas Como en el caso de los organelos, conocer la funci6n de cualquier biomoidcula requiere que primero se le aisle en fonna pura. En el cuadro 2-5 se resumen los mktodos principales empleados para separar y purificar biomolkculas. Aquí no se detall&, pero algunos se explicarán de modo breve en otras partes del libro. Para purificar una biomol&culase necesita casi siempre una cornbinaci6n de mitodos hasta lograr la homogeneidad (la forma pura sin contarninacibn por cualquier otra biomolécula). Es importante apreciar que los adelantos en bioquimica dependen del desarrolIo de ttscnicas nuevas

C u a d r o 2 -5. Prin cipales nmbtodas risados p ara separar y purificar biamoléc:ulas. Mu chos de e 110s son adecu:ados paríi analiza t los comr)orientes i4 "e 1 -- -... 1 - v eii _ - virus ..-existen en ius extractos celulart.~ matcriales bioq uimicos. El uso en secuenciaI de varias d e estas tbcnicas permiitirA, por 10 general1, la purifícacihn de In mmJaJ,,s ,a de las bilirliurrcuid~.Para maY ores deta lles respt: ~ f a cadla uno de los rnétodos d e investig,aci6n bioquimica, el lector d ebe dirigiirse sI los texto1s especiallimdos . ..-

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Fraccionarniento srli no (por ejemrnyilo, prec sulfato dc:amonio) Cromatogt-afia

En papel Por intercambio ibnrco (intercan Por afinidad En capa fina Gas-l1qu1do En fase li quida a alt Filtración itn gel Electroforr:sis

En papel Con alto vvltaje En agarosa En acetato de cclulosa En gel de almidiin En poliacrilamida Poliacrilamida y dot I!ltracentrifugacibn

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sódico (S1

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de anliIisis, purificacibn y determinación de estmcturas. Por ejemplo, el campo de la bioquimica de los Iípidos avanzó con rapidez gracias a la introduccibn de la crornatografia en capa fina y gas-liquido. El anklisís de la membrana y de muchas proteínas era extremadamente dificil hasta la introducción de la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (EGPASDS); el detergente dodecilsulfonato sódico permiti6 la "solubilización" para la electroforesis de muchas proteinas que antes no habían logrado disolverse. Asimismo, el desarrollo de métodos para la secuenciacihn y clonacion del DNA ha tenido un efecto revolucionario en el estudio de los ácidos nucleicos y de la biología en general.

El enfoque experimental requiere la determinación de la estructura de biomole~ulas Una vez que una biornoIecula ha sido purificada es necesario determinar su estnictura. De este modo puede hacerse una correlacion entre estnictura y función. En el cuadro 2 4 se enumeran los metodos principales en uso para analizar la estructura de las

CYuadro 2- 6. Principiales meto determinacibn de la1s estructi

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ados para la iomolécu las . . .

Anaiisis cielncntñl ....... . Espectroscopia ultrnvioleta, visilsle, infrarr o,ja y de resonancia magnética nuclear (RMt'4 Uso de hidrólisis ácida o alcalina para degrasdar la hiomolecula balo estudio en sus const,,,,,,,,,, 11so de una serie dc enz ¡mas de esplecificidad conocidapara degradar la biornolrScula (por ejemplo, piroteasas, r1 ucleaqas o glucosidast 1s) ~spectrometriade mas: Mdtodos es[)ecificos para secuenciaci6n (por cjcmplo, de protcinas o de ácido: ; nucleicos;b Cristalografiia de rayos X m

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biornoléculas. El lector con algunos conocimientos de química orghnica los encontrara familiares. Ciertas enzimas cuya especificidad se conoce, son medios muy poderosos para revelar estas caracteristicas estructurales. El perfeccionamiento en la resolución respaldado por los adelantos tebricos y tecnolbgicos, está convirtiendo cada vez más a la espectrometria de masa y a la de resonancia magnetita nuclear (RMN), en los métodos de elección rutinarios para estos analisic. Las estructuras de las cadenas extremadamente complejas de los carbohidratos contenidos en ciertas biomoléculas, como las glucoproteinas, se pueden ahora aclarar por la elevada resolucibn de la espectrometría RMN. Una infomacion m8s detallada se logra con la difraccibn de los rayos X y la cristalografia. Su uso fue decisivo para revelar las estructuras dctalIadas de varias proteínas, enzimas y la naturaleza de la doble hélice de DNA.

El enfoque experimental requiere análisis de la función y metabolismo de biomoléculas, utilizando varias preparaciones La investigacihn bioquímica inicial en el ser humano y los animales se hizo con el anima1 intacto. Son ejemplos los estudios de la respiracibn y el destino de las sustancias ingeridas. Pronto se descubri6 que el animal íntegro erademasiado complejo para permitir dar respuestas definitivas a numerosas interrogantes. En concordancia, se hicieron preparaciones más sencillas in vitro, que eliminaron muchas de las complicaciones experimentadas con el animal intacto. El cuadro 2-7 resume los diversos tipos de preparaciones de que se dispone ahora para estudiar los procesos bioquimicos; la mayosia de tos conocimientos presentados en este texto se han obtenido gracias a su uso. El enlistado se

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Comentar

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rueaen sc. 1. Bxtirpaci6n de un 6rgano (por ejemplo. hepatectomia) 2. Alteraciones en la alimentación (por qjemplo, ayuno-posprandial) 3. AdministraciOn de un fármaco (por ejemplo. fenobarbital) 4. Administracihn de una toxina (por qemplo, tetracloruro dc carbono) 5. uso de iin anirrial cori una enferrned:id especific:a (por cjernplo, diabc:tes sacarina) 6. Emp leo de tecn icas sofistjcadas corrio espectri3scopia R:MN y tam ografia po:r emisibn dc nositrones .' .- - - .-. Los Cstiid~ub achrc n ~ v c sur1 i a rricnriuu iibiuiugicoh, pcru uueucri x r uiliciics CYCirricruretar debido a la intcracción orgánich mediada por la circulacion . ..-.-ia nervioso1 central - . En particular higado, ~oraz6ny rifiiin son adecuado: método permite el estudio de un organo aislado de la influencia dc otros o dcl sistema nervioso ..Este-Especfalnnente se ha n usado cortes de tejido hephtict) Aislíi los cortes tisu1ares de otras influencias. pero lar; preparaciimes tiende o . . de alguna 1s heras, cn parte debido al suministro inadecuado -. . . . .ac. .nutrientcs .... i . Aplicable en particular a lm células sanguínea, que pueden ser purificad 7.En m u c h a breas de la biología son indispensahles los culiivos de-teji . -. . -. -t . Asegura una prcparacibn qiie no contiene cklul;Ls .. ... :... .,. ... 2. Pueden agregarse o removerse comnuestos esneciiiuis rnor eiemniri. nur ui~hisisiv ehrudiar sus p .

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OrganeIos cetulares -. aislados -ente usadoS, por ejemplo, en cstudios de la funcibn mitocondrial Subfraccionamiento de organelos .....-.. ....Aislamiento aci=. t= pai rc v irni uLi aiiálisis de cualquier reacciiin o vía quirnica ri~acióndi:metabulinas -tos y emir " . Clonacidn de genes qu~ tl aislamiento del gen clonado es esencial para cstudtar los detalles de su estructura y rcgulaclbn: It la enzimia o proteinla n la que 1 codifican r t ambitn iuede revel ar b secuencia de am A

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presenta en orden decreciente de complejidad. Igual que el uso de animal integro tiene desventajas, las demás preparaciones tambiéin tienen sus limitaciones. De los procesos usados in vitro pueden derivar resultados erroneos (artefactos); por ejemplo, Ea homogeneizacién de las células puede liberar enzimas que digieran parcialmente a las moléculas celulares.

LAS ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE REACCIONES BIOQU~M~CAS SON COMPLEJAS Y EN MÚLTIPLES NIVELES Gran parte de esta obra se dedica a los procesos bioquimicos complejos (por ejemplo, slntesis de proteinas y contracción muscular), incluyendo las vías rnetabólicas. Una vía metabhlica es una serie de

reacciones responsables de la síntesis de un com-

puesto complejo a partir de uno o miis compuestos simples o de la degradación de una sustancia hasta su producto final. La existencia de un proceso bioquimico complejo o de cienas vias metabhiicas puede inferirse de las observaciones a nivel del animal intacto. Por ejemplo, observaciones directas de nuestros congeneres indican que los músculos se contraen. Sabemos que la glucosa sirve como fuente de energia para el ser humano y otros animales; por tanto, podemos deducir que debe ser degradada (metabolizada) en el cuerpo para producir energia. Sin embargo, la comprensi6n total de la forma en que la glucosa se metaboliza en las cklulac humanas -su conocimiento está aún lejos de ser completo- se requieren anhlisis a diferentes niveles. Lafiqura2-3 muestravarios tipos de observaciones y anhlisis utilizados en un intento por comprender los procesos bioquimicos, como la degradación inicial de la glucosa para producir ener-

14

(Capituio 2)

Bioquimiccr de Hurper

gia (proceso conocido como glucblisis). El esquema de la figura 2-3 se aplica en un nivel general a todos los procesos bioquimicos principales por lo cual representa una estrategia global para diIucidarlos; cada uno de los procesos (glucblisis, oxidación de los Acidos grasos, etcétera) debcdn tenerse en mente al estudiar el texto, aunque no siempre encontrarán lugar todos los puntos mencionados. Algunos puntos importantes del cuadro 2-7 y de la figura 2-3 ameritan discusión. 1) A pesar de la posibilidad de artefactos, es absohtamente necesario aislar e identificar cada uno de los componentes de un proceso bioquimico en forma pura para comprenderlo a nivel molecular. Más adelante se encontrarán numerosos ejemplos de esto. 2) También es importante ~ o d e reconstituir r in vitro el vroceso en estudio. mediante el ensamblaje sistemático de sus componentes individuales. Si el proceso no se realiza al ser reensambladas sus partes, una explicacibn puede ser que algun componente critico ha escapado a la identificaci6n y, por tanto, no se ha afiadido. 3) Los adelantos tecnologicos recientes (por ejemplo, en espectroscopia RMN y en tomografia por emisión de positrones [TEP]) han permitido la detección de ciertas biomoléculas a nivel del &gano intacto y la vigilancia de Eos cambios en sus cantidades con e1 tiempo. Estos desarrollos indican que se esti haciendo posible efectuar anhlisis sofisticados de muchos procesos bioquímicos in vivo. 4) Cuando los resultados obtenidos con el uso de varios planteamientos a diferentes niveles son congruentes, entonces sejustifica concluir que se ha logrado un progreso real en la comprensión del proceso bioquímico en estudio. Si utilizando diversos enfoques, se obtienen incongruencias imporiantes, en toncesdekn inrestigme sus causas hastaobtener explicaciones racionales. 5 ) Las preparaciones y niveles de anhlisis delineados pueden utilizarse para estudiar alteraciones bioquimicas en animales con estados metabólicos alterados (como ayuno o ingestión de alimentos) o enfermedades especificas (por ejemplo, diabetes sacarina, o cincer). 6) Muchos de los mktodos y enfoques indicados pueden aplicarse a estudios de ctlulas o tejidos humanos normales o enfermos. Sin embargo, debe tenerse cuidado de obtener material fresco y prestar atención particular a las consideraciones tticas que se aplican a la experimentaci6n en el ser humano.

Los Esótopos radiactivos pesados han contribuido de manera importante en el ecclarecimienta de procesos bioquímicos

La introduccibn del uso de isbtopos en la bioquimica en el decenio de 1930 tuvo un impacto notable; en consecuencia, su uso merece discusibn especial. Antes de su empleo, era muy dificil "marcar" las biomo-

Deduccibn de la existencia del proceso bioquímico de la vla metabólica por las observaciones hechas a nivel del animal intacto

& Anhlisis de sus mecanismos de control in vrtro

J Anhlisis de sus mecanismos de mntrol in vivo

.1 AnBltsis de bc efectos de enfermedades específicas sobre di (por epmpio. errores cong8nitos del metahlismo. cáncer)

& SU locallzaubn en uno o mas brganoc

1 Su localizacibn en uno o mAs organelos celulares o fracciones sub-

celulares

3.

Determinación del número de reacciones que intervienen en 81

4 Purificación de sus susb-atos. productos, enzimas y uifactores individuales u otros componentes

& Establecimientode los mecanismos de control utilizados en él

.1 Su reconstruccibn

L Estudios del proceso o vla a nivel genbnm por los mktodos de la tecnología del DNA recombinante

Figura 23. Esquema de la estrategia general utilizada para analizar un proceso bioqulmim o una vía metabblica. Los planteamientos enumerados no necesrtan efectuarse obligadarnente en la secuencia precisa indicada aquí Sin embargo, por lo general mediante su uso se han dilucidado los detalles de los procesos o vías bioquimicos Por tanto, &te es el esquema que se aplica de modo común a M a s las vias rnetabblicas principales explicadas e n los capítulos siguientes

Itculas de modo que sus destinos metabblicos pudieran vigilarse de modo conveniente. Los estudios iniciales, en particular los de Schoenheimer y sus colaboradores, se aplicaron a la utilización de ciertos isótopos estables (por ejemplo, D2 y NI5)combinados con su identificación por espectrometría de masa, para dilucidar muchos problemas bioquimicos. Por ejemplo, pudieron sintetizarse varios arninoAcidos, azúcares y iicidos gsasos que contenian un isótopo estable adecuado y, entonces, administrarse a un animal o agregarse a una preparacibn in vitro para trazar su destino metabólico (por ejemplo, vidas medias y conversi611 a otras biomoltculas). Los compuestos marcados con is6topos estables se utilizaron para investigar muchos aspectos del metabolismo de proteinas, carbohidratos y lipidos. De estos estudios, se dedujo que el metabolismo es un proceso muy activo, en donde Ea mayoría de los compuestos en una cdlula se estan sintetizando y degradando de manera continua, aunque a velocidades que difieren amplia-

mente. Schoenheimer llam6 a estos hallazgos "la naturaleza d i n h i c a del metabolismo". La introducción subsiguiente de los is6topos radiactivos y de instrumentos capaces de medirlos también fue muy importante. En el cuadro 2 4 se muestran los isdtopos principales, estables y radiactivos, usados en los sistemas biológicos. El uso de los dos tipos de isótopas es decisivo para el desarrollo de cada irea de Ia bioquimica. La investigación de las biomoléculas complejas y simples, in vivo o ipi vim, se apoya fweftemente en su empleo. El gran avance logrado en la secuenciacib de los hcidos nucleicos y en la rnedici~n de cantidades extremadamente pequeflas de compuestos que se encuentran en los sistemas biolbgims se debe a la radioinmunovaloración que también utiliza isotopos.

LOGROS IMPORTANTES CARACTERIZAN LAS CONTRIBUCIONES DE LA BIOQU~MICAA LA CITOLOG~A Y A LA MEDICINA Los siguientes piirrafos resumen los descubrimientos principales en el campo de la bioquimica, en particular en relacibn con la bioquimica humana. Gran parte de este texto desarrolla los temas que aquI se enumeran.

1) Se ha determinado la composición quimica global de c&lulas,tejidos y 6rganos; los compuestos principales se han aislado y sus estructuras se han establecido.

2) Se comprenden, por la menos a un nivel general, las funciones de muchas biomoléculas simples, las cuales se describirhn en los capitulas subsiguientes. Tambitn se han establecido las funciones de biomol&culas complejas. Es de capital interks el conocimiento actual de que el DNA es el material gendtico que transmite su información a un tipo de RNA (RNA mensajero, o mRNA) y este RNA a su vez dicta la secuencia lineal de los aminoácidos en

g. Isatopo,S princip investigaici6n bioc -.--

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las proteínas. E! flujo de 3a información del DNA puede ser representado convenientemente como DNA +RNA -+ proteina. Sin embargo, se conocen excepciones importantes de algunos de los enunciados anteriores. El RNA es el material gendtico de ciertos virus. Además, en algunas circunstancias la información contenida en el RNA puede transcrjbirse al DNA; este proceso se conoce como transcripción inversa y es usado, por ejemplo, por el virus HIV-1 (virus de inrnunodeficiencia humana-1), causa posible del SIDA. 3) El desarrollo de la tecnología del DNA recornbinante constituye un logro fundamental. Esta tecnologla revolucion6 el estudio de la estructura y funcibn de los genes y también tuvo un impacto revolucionario en todos los campos de la biologia, incluyendo la medicina. 4) Se han aislado los principales organelos de las células animales y establecido sus funciones principales. 5) Se sabe que casi todas las reacciones que tienen lugar en las células son catalizadas por enzimas; muchas de estas han sido purificadas y estudiadas y se han descubierto las caracteristicas generales de sus mecanismos de acción. Aunque la mayoría de las enzirnas son proteinas, en la actualidad se ha establecido de manera firme que ciertas moldculas de RNA tambidn tienen actividad biocatalitica. 6) Se han delineado las vías membólicas que intervienen en la síntesis y degradacibn de numerosas biomolCculas simples y complejas. En general, se sabe que 1a vía de sintesis de un compuesto es distinta de su via de degradacion. 7) Se han esclarecida algunos aspectos de la regulacidn del metabolismo, 8) Se han reconocido las características generales de la forma en que las cClulas conservan y utiIizan la energia. 9) Se comprenden muchos aspectos de la esmctura y funcion de las diversas membranas encontradas en la ctlula; sus componentes principales son proteínas y lfpidos. 1(3 Se dispone de información importante a nivel general sobre el modo de accibn de las hormonas. 11)Se han descubierto las bases bioqufmicas para un número considerable de enfermedades.

QUEDA MUCHO POR APRENDER Aunque es importante saber que es mucha la información que se ha acumulado, tiene igual relevanciaapreciar lo escaso del conocimiento en numerosas areas. Probablemente los dos problemas principales por resolver respecto al establecimiento de sus bases bioquirnicas son el desarrollo, la diferenciacibn y la función cere-

bral. Si bien está perfectamente asentada la naturaleza quimica del material genético, casi nada se sabe acerca de los mecanismos que activan y desactivan a los genes eucariotas durante el desarrollo. Comprender la regulación génica es tarnbitn un &ea clave en el aprendizaje de la forma en que las células se diferencian y toman cancerosas. El conocimiento de la división y el crecimiento celular -tanto normal como malignoy su regulaci6n es muy primitivo. Virtualmente nada se sabe can respecto a las bases bioquimicac de fenómenos neurolbgicos complejos como la conciencia y la memoria. Sólo se riene informacibn muy limitada de los mecanismos de la secrecion celular. A perar de cierto progreso, se desconocen los fundamentos moleculmes de la mayoria de las enfermedades genéticas principales, pero las tentativas proporcionadas por la tecnología del DNA recombinante sugieren que en los próximos afios se logrará un progreso notable en esta hrea. Es posible que en el año 2005 o antes se logre conocer la secuencia del genoma humano; la informacihn disponible gracias a este esfuerzo masivo tendrh un impacto tremendo sobre la biologia humana y la medicina.

RESUMEN El carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrbgeno son los constituyentes principales de gran parte de las biomoléculas. Ademls el calcio, fbsforo, potasio, sodio, cloro, rnagnesio, hierro, manganeso, yodo y otros elementos tienen gran importancia biol6gica y medica. El agua, DNA, R N A , proteínas, polisacaridos y lipidos son las moléculas principales de células y tejidos. Las células son las unidades biolbgicas hndamentales. Contienen v e o s organelos que desempeiian numerosas funciones especializadas. Estos organelos

pueden separarse por fraccionamiento subcelular y, de este modo, estudiar sus fiinciones en detalle. El avance de la bioquímica ha dependido del aislamiento de biomolkculas celulares. de la dcterminación de sus estructuras así como del an8lisis de su funcibn y metabolismo. Para investigar la estructura, funci6n y metabolismos d e las biomoléculas se han utilizado diferentes planteamientos, desde el anima! íntegro al gen aislado. En particular, el uso de isotopos. tanto estables como radiactivos, ha tenido tremenda importancia en el adelanto del conocimiento hjoquímico. La representacihn:

Transcripcibn

DNA-

Traslación RNA-Proteina

resume la fuerza propulsara de gran parte del esfuerzo contemporáneo en bíoquímica. No obstante, se han hecho muchos otros avances en el conocimiento de la bioquimica, como la apreciacibn de la ~omposicibn corporal y la comprensibn parcial de estructuras y funciones de enzimac, hormonas y membranas. Se han descubierto las bases bioquímicas y genéticas de numerosas enfermedades y la aplicación reciente de la tecnología del DNA recombinante ha acelerado enormemente el progreso en esta área. Sin embargo, aún es mucho lo que se desconoce; los retos principales para el futuro incluyen definir ("mapear") el genorna humano y proporcionar explicaciones moleculares de los mecanismos que intervienen en el desarrollo orghnico, la diferenciacibn celular y !a función cerebral. M

REFERENCIAS Freifelder D: Phys~calBiochemistry: Applicaiions to Rin-

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Victor W. Rodwell, PhD

Ld5 biomolecula~polarcs orghicas e inorgánicas de 1% células vivienles existen y reaccionan de manera priniariri en un ambiente acuoso El agua, una molécula notable esencial para la vida, solubiIi75~y modifica las características de biomoléculas coino hcidos nucleicos, protcinas y carbohidratos al formar puentes de hidr6geno con sil? grupos fi~nciotiales.Estas interacciones mridifican las propiedades de las biomoléculas y si15conformaciones en solucicin. ],os cambios le dan a las molkciilas ias propiedades esenciales para el ciclo de la vida. [,si$ biornoléculas -aun aquéllas relativamei1:e no pulares, tales como ciertos lipidos- tambiéti inodificw las propiedades del agua La comprensión de 3us mecanismos honieostáticos utilizados por los organismos para conservar un entorno intraceliilar relativamente constante debe considerar el pH y el amortiguarnierito en liquidos corporales y compartimienlos siibcelulares. Por ultimo, el comportamiento de disociación de los gmpos funcionales de biomol~culasen soJuci6n acuosa a diversos valores de pH e? critico cn la comprensióti de sus reacciones y propiedades tanto en células vivas corno en el laboratorio

IMPORTANCIA B I O M ~ D I C A Ida homeostasis, conservaci6n de la cornposic~óndel rnedio interno que es esencial para la salud, incluye considerar la distribucihn dcl agua en el cuerpo y la preservaci~n del ptl así como de concentmciones clecirol iticas apjopiadas. Dos terceras partes del agua corporal total (55 a 65% del peso corporal eri varones y alrededor de 10% menos en mujeres) cs liquido intracelular. Del liquido extracelular remanente, el plasma sanguineo constituye cerca de 25 por ciento.

La regulaciiin del equilibrio hídrico depende de mecanismos hipcitaláinicos para controlar la sed, de la hormona aiitidiurdtica y de la retención o excrecion del agua por los riilones. 1.0s estados de depleción de agua y exceso de Iíqiiido corporal son bastante comunes. En inuchos casos se acompañan de deficiencia o exceso de sodio. Las causas de dealecibn hidrica son a una disminución de la ingestión (por ejemplo, en estados de coma) e increniento de la perdida (por ejemplo, perdida renal en la diabetes sacarina, cuthnea por sudaciún intensa y gastrointestinal eii diarrea intensa en lactantes y en ctilera). Las causas de exceso de agua corporal se deben al incremento en la ingertión (por ejemplo, excesiva administración de liquidos IV) y excrecibn escasa (por ejemplo, en insuficiencia renal grave). Ciertos niecanismos osrnóticos y no osmóticos protegen el agua y la htirneostasis osrn0tica del liquido extracelular. Tanto la conservacibn del agua por la atitidiuresis como la ingestihn de liquido por la sed, sirven para mantener la homeostasis. Incrcmentos tan pequefios como 2% en la osmolaridad del liquido r:xtraceluIar pueden provocar sed y Iiberacihn de liorniona antidiurética (ADH) en la hipáfi~is.Un mecanismc) algo menos sensible desencadena la Iiheración no osmólica de ADH y la sed, cuando disminuye 10nAel volumen de liquido circulante extracelular. La diabetes insípida nefrogeiia, de origen genético, se caracteriza por sed extrema, ingest icin abundante de agua e incapacidad para concentrar la orina o para responder a cambios sutiles en la osmolaridad de liqiiido extracelular; esto se dehc a la incapacidad de los osmorreceptores de ADH en los túbulos renales para responder a la ADH. La conservación del liquido extracelular dcntto de un p1-E entre 7.35 y 7.45, cn donde el sistema amortiguador de bicarbonato tiene una funcihn importante, es cscncial para la salud. Las alteraciones del equilibrio acidobásico se diagnostican en el labora-

torio clínico por medicibn del pH de la sangre arteria1 y el contenido de COZde la sangre venosa. Las causas de la acidosis (pH sangutneo < 7.35) incluyen cetoacidosis díabdtica y acidosis 1Actica; mientras que las de la alcalosis (gH sanguineo > 7.45) comprenden el vbmito de contenido ácido gástrico o el tratamiento con ciertos diun5ticos. Un diagnóstico preciso y un rápido tratamiento del desequilibrio hidrico y de las alteraciones acidobiisicas se apoyan en gran medida en la comprensi6n de los conceptos considerados en este capitulo.

EL AGUA ES UN SOLVENTE BIOLÓGICO IDEAL El agua es una molécula tetraédrica ligeramente asimétrica La molCcula del agua es un tetraedro irregular con oxígeno en el cenúo (figura3-1). Los dos enlaces con hidrbgeno se dirigen hacia dos vértices del tetraedro, en tanto que los electrones no compartidos del oxigeno en el orbital 2sp3 híbrido ocupan los dos vertices restantes. El ángulo entre los dos Atomos de hidrogeno (105 grados) es algo menor que el Angulo del tetraedro (109.5 grados), formando una figura geomdtrica ligeramente asimktrica.

Las rnoléculas de agua forman dipolos Debido a la estructura tetraédrica asimktrica, la carga eléctrica no se distribuye de manera uniforme alrededor de la moltcula de agua. El lado de1 oxigeno opuesto a los dos hidrbgenos muestra cierta riqueza de electrones, en tanto que del otro lado, los núcleos

Figura 3-1. Estructura tetrabdrica del agua

de hidrógeno escasos en electrones forman una regi6n de carga positiva local. El término "dipoEoV se refiere a moléculas como el agua que tienen carga electrica (electrones) distribuida en forma desigual alrededor de su estructura.

El amoniaco también es dipolar y tetraédrico En el amoniaco, los angulos de enlace entre hidrbgenos (107 grados) se aproximan al ángulo del tetraedro aun miis que en el agua (figura 3-2). Muchos compuestos químicos son dipolos. Entre ellos se Incluyen alcoholes, fosfollpidos, aminohcidos y hcidos nucleicos.

LAS MOLÉCULAS DE AGUA FORMAN PUENTES DE HIDRÓGENO Los puentes de hidrogeno confieren una estructura macromolecular Debido a su caríicter dipolar, las moléculas de agua pueden asumir conf~rtmacionesordenadas (considerese un copo de nieve). Al igual que el hielo, el agua liquida muestra una estructura rnacromolecular ankloga a la disposicibn ggeom&tricade las molkculas de agua en el hielo. La propiedad de las moltculas de agua de unirse unas con otras tanto en estado líquido como sblido surge del carhcter dipolar del agua. Se conserva como liquido más que como sblido debido a la naturdeza transitoria de estos complejos macromoleculares (la vida media de asociacibn-disociacidn de las moléculas de agua es de alrededor de un microsegundo). En estado sdlido, cada moltcula de agua se une con otras cuatro. En estado liquido, el número es algo menor (mlis o menos 3.5). Con excepcibn de

Flgura 3-2. Estructura tetraMrica del amoniaw

Agua y pH

la naturaleza transitoria de las interacciones intermoleculares en el agua liquida, ksta se parece al hielo en su estructura macromolecular mSis de lo que en un principio se imaginaba. El cariicter dipolar de las moldculas de agua favorece los enlaces mutuos en conformaciones ordenadas con una geometría precisa dictada por la configuracibn interna de cada molécula de agua (figura 3-3). La interacción electrostAtica entre el nijcleo de hidrdgeno de una moldcula de agua y el par de ekctrones no compartidos de otra se denomina puente de hidrógeno. Comparados con enlaces covalentes, los puentes de hidriigeno son bastante debiles. Romper un enlace de hidrógeno en agua Iíquida requiere alrededor de 4.5 kcal de energía por mot -más o menos 4% de la energía que se requiere para romper el enlace O-H del agua ( 1 I O kcal/mol). Los puentes de hidrógeno estabiliran proteínas y ácidos nucleicos En tanto que el metano (peso molecular 16) y el amoniaco (peso molecular 17) son gases a la temperatura ambiente, e l agua (peso molecular 18) es un liquido. ¿Por quc es ast? L a respuesta se apoya en la capacidad del agua para formar puentes de hidrogeno, lo cual explica tambien su viscosidad y su tensibn superficial relativamente altas. La propiedad del agua de servir como solvente para iones y numerosas mol&culasorghnicas se debe a su carácter bipolar y a su capacidad para formar puentes de hidrhgeno. Las molCculas que pueden formar puentes de hidrógeno con el agua (por ejemplo, compuestos con radicales 4 N o S H , aminas,

Figura 3 3 . Izquierda: Reunibn de dos mol&culasdipolares de agua. La línea punteada representa un puente de hidrógeno. Nbtese que una mol8wla dada de agua puede actuar como donador o como aceptor de hidrbgeno, o ambas cosas a la vez Derecha: Unldn de una rnol6cula central de agua con otras cuatro mol6culas mediante puentes de hidrógeno. Esta estructura es típica deT hielo y, en menor grado, del agua líquida.

a

19

esleres, aldehidos y cetonas) se sotvatan con facilidad lo que por su solubilidad en agua aumenta. Así, las

proteinas solubles están recubiertas con una capa de agua formada por intercambio de enlaces de hidrbgeno intermoleculares superfjciales por puentes de hidrógeno intramoleculares del agua, lo que incrementa la solubilidad. El carácter dipolar del agua afecta profundamente sus interacciones con las biomoltculas, En el ambiente acuoso de las cClulas vivientes se producen muchas interacciones entre cargas y grupos polares de las biomoléculas. El DNA se pliega de modo que expone su azúcar y sus grupos fosfato polares a las moiéculas de agua. De manera similar, residuos polares de proteinas se presentan primariamente en la superficie biopolímera donde participan extensamente en interacciones con las moléculas de agua. La figura 3 4 ilustra la formacibn de puentes de hidrógeno entre el agua y grupos funcionales representativos de biomol~culas.N6tese que los alcoholes, del mismo modo que el agua, pueden participar como donadores y como aceptores de hidrógeno en la formación de puentes de hidrdgeno con agua o con otras biomoltsculas. Grupos apolares como aquellos presentes en hidrocarburos no tienen capacidad para formar uniones hidrbgeno y, por tanto, son insolubles en agua. No obstante, estos grupos no polares pueden afectar la estructura hidrica. Cuando se añaden el agua, las moléculas apolares forman gotas esfericas con una supeficie mínima expuesta al agua; este fenbmeno se ilustra con la tendencia del aceite de olivo en agua fria para formar una sola gran masa flotante. La reduccibn aE mlnimo de la superficie apolar expuesta al agua es un proceso gobernado entrópicamente. La presencia de moltculas apolares reduce el numero de posibles orientaciones (grados de libertad) de las rnol~culas

Figura 3-4. Fomacibn de puentes de hidrbgeno entre un alcohol y agua, entre dos molbculas de etanol y entre el oxigeno carbonilo de un pbptido y el hidrbgeno del grupo amino de otro pkptido adyacente.

'

adyacentes al agua por lo que se acompafía de un incremento en la entropía. La reducción al minimo del área de la superficie apolar expuesta permite el m k i m o grado de libertad (por ejemplo, desorden máximo) de las mo!éculas de agua cercanas y, por tanto, reduce al mínimo el incremento en entropía. En el agua. los hidrocarburos forman estructuras clatrato rígidas (semejante a cajas). De manera similar, en el ambiente acuoso de las ctlulas vivientes, las partes no polares de los biopolímeros tienden a situarse dentro de su estructura. minimiírando asi su contacto con el agua.

Las moléculas de agua presentan una tendencia ligera a disociarse, lo cual es fisiolciqicarnente importante La propiedad del agua de ioni~arse,aunque de modo ligero, tiene importancia capital para la vida sobre la tierra. Dado que el agua puede actuar como un hcido o como una base, es posible representar su ionizacibn como una transferencia protónica intermolecular, que foma un ion hidronio (I.I,O&)y un ion hidr6xido (OH-):

., En realidad, el protbn transferido est6 asociado con un racimo de: mol$culas de agua y existe en solucion, no siilo como H30- sino como algo semejante a HrOz' o H703'. Aunque para propósitos prhcticos este protbn ' al parecer 'Vesnudo" se escribe casi siempre como "H'",no debe olvidarse que de hecho esta fuertemente hidratado. Ya que los iones se recombinan de manera continua para formar rnolécu2as de agua y viceversa, no puede definirse si un hidrógeno o un oxigeno deterrninado tiene el estado de ion o de una parte de una moiécula de agua En un instante están como ion; un momento después como una parte de una mol6cula. Por fortuna, no es necesario considerar iones o molkculas individuales. Dado que 1 g de agua contiene 3.46 x moléculas, su ionización puede describirse por estadística. Es suficiente conocer la probabilidad de que un hidrbgeno estC presente como ion o como parte de una molécula de agua. Establecer que la probabilidad de que un hidrbgeno exista como un ion es 0.01 significa que un átomo de hidrhgeno tiene una oportunidad en 100 de estar como ion y 99 posibilidades en 100 de estar como parte de una rno4&culade agua. La probabilidad real de que un Atorno de hidrhgeno en agua pura exista coma ion hidr6geno es alrededor de 0.0000000018 o 1.S x 104. En consecuencia, la probabilidad de estar como parte de una rnotecula es casi la unidad. Definido de otra manera, por cada ion hidrbgeno y cada ion oxhidrilo en agua pura, hay 1.S bi tlones o 1 .X x

109 moléculas de agua. N o obstante, los iones hídr0geno y oxhidrilo contribuyen de modo significativo a las propiedades del agua. La disociacion del agua,

donde los t6rminos entre paréntesis representan concentraciones molares de iones hidrbgeno, iones oxhidrilo y rnolkculas de agua sin disociar*, rnlentras que la K es la constante de disociación. Para calcular este valor, recuérdese que una molkula de agua pesa 1& g. Por tanto, un litro (1 000 g) de agua contiene 1000 + I g = 55.56 moles. Asi, la concentración del agua pura es 55.56 molar. Ya que la probabilidad de que un hidrbgeno en agua pura exista como ion H' es de 1 .S x 1 Omy, la concentración molar de iones H' (e de iones OH-)en agua pura se calcula multiplicando la probabi tidad, 1.8 x 1 Q4, por la concentracion molar del agua, 55.56 moIL. Este resultado es 1 x 10" rnoYL. Ahora puede calcularse la K para el agua:

La elevada concentración de agua molecular (55.56 moYL) no se afecta de manera significativa por la disociacibn. Por tanto, resulta conveniente considerarla en esencia como una constante, que luego puede incorporarse a la constante de disociación, K, para crear una nueva constante, K,, designada el producto ibnico para el agua. La relación entre K, y K se muestra a continuación:

Nótese que las dimensiones de K son moles por litro y las de K, molesZpor litro2.Como su nombre sugiere, el producto iónico, K,, es en cifras igual al producto de las concentraciones rnolares de H ' y OH-:

* Estrictamente hablando, los tCrtninos entre parkntesis reprcsentan la actividad molar en lugar de la concentración molar.

m

A 25 OC,K, = (1 0-'j2 = I O-'' (molJL)'. A temperaturas que a menores a 25 O C , K, es menor de 10-'"mientras superiores a 25 O C , es mayor de 1 O-". Por ejemplo, a la temperatura del cuerpo humano (37 "C),la concentración de iones H' en agua pura es algo mayor de 1 mol/L. Dentro de las lim itaciunes establecidas por el efecto de la temperatura, K, = lW4 (mol/L)' para todas las soluciones acuosas, incluso las que contienen acidos o bases. Esta constante se usarii en el cálculo de valores de pH para soluciones ácidas y alcalinas.

EL pH ES EL LOGARlTMO NEGATIVO DE LA CONCENTRACI~NDEL ION HIDR~GENO El término pH fue introdiicido en 1909 por Sorensen. quien lo definió como el logaritrno negativo de l a concentraci~nde iones hidrúgeno:

Los siguientes ejemplos ilustran el modo de calcular el pH de soluciones ácidas y alcalinas. Ejemplo: cuál es el pH de una solución cuya concentracibn de ion hidrógeno es 3.2 x 1O-' mol/L? PH = - 109[H+] = log (3.2 x lo4) = - log (3.2) - log (104) = - 0.5 + 4.0 = 3.5

-

Ejemplo: ¿Cuál es el pH de una colucihn cuya concentracion de ion oxhidrilo es 4.0 x 1O4 mol/L? Para abordar este problema, hay que definir una cantidad pOH, que sea igual a -1og [OH-] y que puede derivarse de la definiciiin de Kw:

por tanto:

pH = - log [H']

Esta definición, aunque no es rigurosa*, es adecuada para la mayor parte de los estudios bioquimicos. Para calcular el pH de una solucihn se debe:

Para resolver el problema bajo estc enfoque:

1) Calcular la concentración del ion hidrdgeno,

W+l.

2) Calcular el logaritmo de base 10 de [w']. 3) El pH es el negativo del valor encontrado en el paso 2. Por ejemplo, para agua pura a 25 O C : pH = -lag [HJ = - log

= - (-7) = 7.0

],os valores de pH bajos corresponden a concentraciones elevadas de H- y los valores de pH altos a concentraciones bajas de H'. Los ácidos son donadores de protones y las bases son aceptores de pmtones. Sin embargo, se hace una distinción entre ácidos fuertes (por ejemplo, HCI, H:SOd), que se disocian completamente aun en soluciones muy ácidas (pH bajo) y los iicidos débiles, que se disocian solo de manera parcial en selucíones bcidas. Una distinción semejante se hace entre bases fuertes (por ejemplo, KOH, NaOH) y bases debiles (por ejemplo, Ca[OH]:). S610 las bases ruerics sc disocian a pH alto. Muchas sustancias bioquimicas son Bcidos ddbiles. Las excepciones son tos intermediarios fosforilados, que poseen el grupo acido fosfórico primario fuertemente acídico.

Ahora:

Ejemplo: ¿Cuales son los valores del pH de a) 2.0 x 1OA2mol/L de KOH y de b) 2.0 x 1 Oa m o l k de KOH? Los oxhidrilos proceden de dos fuentes: KOH y agua. Dado que el pH esta determinado por el [HA] totai (y pOH por el [OH-] total), es preciso considerar los dos orígenes. En el primer caso, la contribucion del agua al [OH-] total es despreciable. No puede decirse lo mismo en el segundo caso

Molaridad di:KOH

[OH-] de KC)H [OH-1 del agua

* pH = -log (actividad dcl H +).

2.0 x . -

(Capitulo 3)

Una vez que se ha comprendido el significado de la contribucihn del agua, el pM puede calcularse como se describid. En los ejemplos anteriores, se asurni6 que la base Fuerte KOH estaba completamente disociada en la solución y que, por tanto, la concentracion molar de iones OH-era igual a la concentración molar de KOH. Esta aseveración es válida para soluciones relativamente diluidas de bases o ácidos fuertes, pero no para soluciones de acidos o bases dbbiles. Dado que estos electrólitos dkbiles se disocian sólo un poco en soluci6n, se debe calcular la concentracidn de H ' (o de [OH-1) producida por una molaridad dada del hcido (o base) usando la constante de disociación antes de calcular [H'] total (o [OH-] total) y, posteriormente, calcular el pH.

Los grupos funcionales que son ácidos débiles tienen un gran significado fisiológico Numerosos compuestos bioqulmicos poseen grupos funcionales que son ácidos o bases dkbiles. En todas las proteínas y ácidos nucleicos existen uno o más de estos: carboxilos, aminos o fosfatos derivados de la disociación secundaria de esteres de fosfato; tambihn los hay en la rnayoria de las coenzimas y los metabolitos intermediarios. Por tanto, el comportamiento de disociacibn (equilibrios protónicos) de grupos funcionales débiles, hcidos o bhsicos, es fundamental -para comprender la influencia del pH intracelular en la estructiira y actividad bioquimica de estos compuestos. Su sepmtci&ne identificación en los laboratorios clinicos y de investigacidn se facilita tambidn cuando se conoce el comportamiento de disociacibn de sus grupos funcionales. A la forma protonada de un hcido (por ejemplo, HA o RNH?') se le designa como el hcide y a la forma no protonada (por ejemplo, A- o RNH?}, base conjugada. De igual modo, es posible referirse a una base (por e.jemplo, A-o RNH2) y su hcido conjugado (HA o RNH3'); la palabra proviene del latln, cuniungre: reunirse). Los hcidos débiles representativos (izquierda), sus bases conjugadas (centro) y tos valores de pK (derecha) incluyen lo siguiente:

Las potencias relativas de ácidos y bases dkbiles se expresan de manera cuantitativa como sus constantes de disociacibn, que expresan su tendencia a ionizarse. A continuacibn se muestran las expresiones de la constante de disociacidn (K) para dos ácidos débiles representativos, R-LOOH y R-NHJ-.

Dado que los valores numéricos de K para hcidos débiles son exponentes negativos, es conveniente cxpresar a K como pK, donde:

Nótese que la relacibn de pK con respecto a K es igual a la de pH con la concentracion de H'. El cuadro 3-1 enumera valores de K y pK ilustrativos para un ácido monocarboxílico, dicarboxílico y tricarboxílico. Observese que los grupos hcidos más fuertes tienen los valores de pK mas bajos. De las ecuaciones anteriores que relacionan K a [H']y a las concentraciones de un ácido no disociado y su base conjugada, nbtese que:

o cuando:

entonces,

En otras palabras, cuando las especies asociada (protonada) y disociada (base conjugada) están presentes

C u a d r o 3-1. Constantes de disociacibn y valores de1 pK para ácidos carhoxllicos r e ~ r e s e n t a t k o s

-

-.---

A

Acktico

Glutdrico Citrico

(primero) 8.40 x 1 O4 (segundo) 1.80 x 1

3.08

Agua y pH

en concentraciones iguales, la concentración prevalente de ion hidrógeno [H']es numh-icarnente iguat a la constante de disociacion, K. Si se obtienen los logaritmos de los dos lados de la ecuacibn anterior y la ecuación completa se multiplica por -1, las expresiones serfan las siguientes: K = [H']

23

Se multiplica todo por -1 :

- 109 [HT = - lag K - toa IH4 [A7

Se sustituye pM y pK en lugar de -log [Ht] y -lag K, respectivamente; luego:

- log K = - iog [HT Ahora, -log K se defínib como pK y -1og [H'] es la definicibn de pH. La ecuación puede quedar como:

es decir, el pK de un grupo 4cido es el pH al cual Ias especies protonada y no protonada esthn presentesen la misma concentración. El pK de un &ido puede determinarse de modo experimental agregando 0.5 equivalentes de iilcali por cada equivalente de acido. El pH resultante seri igual al pK del ácido.

El comportamiento de ácidos dkbiles y de amertiguadores se expresan par la ecuación de Henderson-Hasselbalch

Para eliminar el signo negativo se invierte el ÚItirno

La ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch ha probado ser una expresión de gran valor predictivo en equilibrios protonicos. Por ejemplo:

1) Cuando un hcido se ha neutralizado exactamente a la mitad [ A 7 = [HA]. En esta situacibn,

El pH de una solucihn que contiene un Bcido débil se relaciona con la constante de disociaci6n de dicho acido, como se mosirb antes para el agua como Acido débil. La relación puede establecerse en la forma convenientede la ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch, que se desarrolla desputs. Un acido ddbil, HA, se ioniza de la manera siguiente: HA = H+ + A-

1 pH = pK + log f[HlAI = p ~ + ~ o g ~ = p ~ +

Por tanto, con 50% de neutralizacibn, pH PK.

=

2) Cuando la proporci6n [A-JI[HA] = 100:1,

La constante de equilibrio para esta disociacibn se escribe:

3) Cuando la proporción [A-]/[HA]

Se multiplican los dos términos entre si: pki = pK

Se dividen ambos miembros entre [A-]:

(E)

log %o = PK

1 : 10,

+ (-1)

Si la ecuación se valora en varias proporciones de [A-]/[HA] entre los limites 103 y 1O-? y los valores de pH obtenidos se grafican, el resultado describe la curva de titulación para un a ácido débil (figura 3-5).

Se obtiene el logaritmo de toda la ecuacibn: log [H7 = log K

+

=

Las soluciones de ácidos debiles sus sales amortiguan el pH

y

Las sofuciones de ácidos dkbiles y sus bases conjugadas (o de bases dtbiles y sus k i d o s conjugados)

24

Bioquinaica de Harper

Figura 3-5. Forma general de una curva de tlulacibn calculada con la ecuación de Hende~on-Hasselbalch.

exhiben la propiedad de amortiguar -tendencia de una solrici6n para resistir con inayor eficacia a un cambio en el pH después de la ztdicibn de un Cicido o una base fuertes que un volumen igual de agua. Los amortiguadores fisiol6gicos importantes incluyen bicarbonato (HCOi/H2C0i), ortofosfato inorgánico ( H ? P O ~ - tPQ4C2) '/~ y proteínas intracelulares. Los amortiguadores no fisiolbgicos usados en experimentacibn bioquirnica comprenden al TRIS (pK S.2) y al HEPES (pK 7.6). El efecto de amortiguador se observa mejor por titulacibn de un hcido o base débil utilizando rin potenciómetro (medidor de pH). De manera alterna, es posible calcular el desplazamiento del pH que acompaiia a la adición de Acido o de base a una solución amortiguada, En el ejemplo, el amortiguador (mezcla de un ácido débil. pK = a 5.0 y su base conjugada se encuentra inicialmente en 1 de los 4 valores de pH indicados. Se calculará el desplazamiento del pH que resulta cuando se agrega O. 1 mEq de KOH a 1 mEq de cadauna de estas soIuciones:

pH inicial

Obskwese que el cambio de pH por miliequivatente de OH- agregado varía de modo notable dependiendo del pH iniciai. A valores de pH próximos al pK, la soluciOn resiste los cambios con mayor eficacia y se dice que ejerce un efecto amortiguador. Las soluciones de ácidos débiles y sus bases conjugadas amortiguan mejor en valores de pH que oscilan alrededor de pK k 2.0 unidades de pH. Ecto significa q u e para amortiguar una solución a pH X, deberfi usarse un Acido o una base débil cuyo pK no se separe mas de 2.0 unidades de pIJ del pH X. En la figura 3-6 se muestra la carga neta en una rnoltcula del ácido como funcihn del pH. Una carga fraccionaria de -0,s no significa que una molécula individual posea una carga fraccionaria sino que 0.5 es la probabilidad estadística de que una rnolkcula dada tenga una carga negativa. La consideración de la carga neta de macromoléculas como funcibn del pH constituye Ia base para numerosas tkcnicas de separación, incluyendo la separacibn electroforética de aminohcidos, proteinas plasmhticas y hemoglobinas anormales.

RESUMEN El agua, que en !os estados liquido y sdlido existe como racimos rnoleculares unidos por hidrógenos, forma puentes tanto con sus propias rnol~culascomo con otros donadores o aceptores de protones. La tensión superficial, viscosidad, estado líquido a temperatura ambiente y potencia solvente del agua se deben a su capacidad para formar puentes de hidrógeno. Los compuestos que contienen O, N o S son solvatados por el agua, ya que tienen la propiedad de servir como aceptores o donadores de hidrdgeno para formar puen-

5.00

5.37 5.60 5.86 0.88 0.70 0.80 0.50 0.12 0.30 0.20 0.50 [HAI~nicia~ 7.33 2.33 4.00 i.00 ([A-]l[HA])inlclal La adición de O.T meq de KOH produce 0.98 0.80 0.90 0.60 [A-lfinai 0.20 0.10 0.02 0.40 [HAlfinai 49.00 4.00 9.00 1.50 ([A-[4HA])fina1 log ([A-]I[HA])n,,t 0.176 0.602 0.95 1.69 pHfinal " 5.18-_-5:60 5-95 6.69

[A-]inicial

L~PH

0.18---"6 0 -0 .

.

. ..

-

Figura 3 4 . Curva de titulación para un ácido del tipo HA El punto (m) ~ndicael pK 5.0.

tes con el agua. Las proteínas y otras rnacromoteculas se estabili~anpor intercambio de eniaces de hidrbgeno intermoleculares superficiales con los enlaces de hidrtigeno del agua. E1 agua modifica las propiedades de biomolkculas como las proteinas y los hcidos nucleicos que poseen gmpos funcionales polares y no polares. Las fuerzas entrópicas indican que las macrornoleculas en soluci6n acuosa se pliegan de modo que sus porciones polares entran en contacto con la interfasr acutisa, en tanto que sus porciones no polares se ocultan en el interior de la biomolCcula. El agua se disocia para formar iones hidrdxido y protones hidratados de modo masivo, los cuales de manera convenciona! se representan como protones desnudos (H'). El pH, logaritmo negativo de [H'], expresa la acidez relativa. Un pH bajo denota una solución ácida y uno alto una solución básica o alcalina.

REFERENCIAS Segel 1M: Riocochemicnl Calculations. Wiley, 1968

Los bioqulmicos consideran tanto a los hcidos carboxilicos (como el R X O O H ) como a las aminas (por ejemplo. R-NH,') como bcidos, y nombran a los aceptores protónicos correspondientes ( R - 4 0 0 - y R-NH2), las bases conjugadas de estos ácidos. Estos ácidos débiles desernpeíian actividades claves en el metabolismo. Su potencia heida se expresa de manera cuantitativa con el simbola pK, el cual es el logaritmo negativo de su constante de disociación. Los ácidos relativamente fuertes tienen pK bajo mientras que en los relativamente débiles es alto. Los amortiguadores resisten los cambios en el pH cuando se producen o consumen protones. La capacidad amortiguadora máxima a IT I unidad de pH en cualquier región de pK. Entre los amortiguadores fisiológicos importantes se encuentran el bicarbonato, e[ ortofosfato y las proteínas.

Estructura y funciones

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 . . Capítulo S.Yéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Capitulo 6 . Proteínas: estructura y función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Capítulo 7 .Proteínas: mio~lobinay hemoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Capitulo 8. Enzimas: propiedades generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Capitulo 9. Enzirnas: cinética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Capitulo 10.Enzirnas: mecanismos de acción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111 Capitulo 11.Emzimas: regulacióln de actividades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Capítulo 4 Aminoácidos

Victor W Rodwell, PhD

Una de las múltiples funciones de los arninohcidos en las ~Clulasvivientes es la de servir como unidades monómeraq a partir de las cuales se sinteticen cadenas pEipéptidicas de proteinas. La mayoría de las proteinas contienen. cn proporciones diferentes, los mismos 20 1,-al fa-am inokidos. Muchas protcinas específicas contienen además aminoicidos 1.-alfa derivados de algunos de los 20 aminoacidos basicos mediante procesos que tienen lugar después de la fbrtnacibn del esqueleto fundamental del polipéptido. Estos aminohcidos "poco habituales" satisfacen funciones altamente específicas de la proteína en cuestidn. El tipo de aminoácido, el orden en que se unen y su relación espacia1 mutua estableceii las estructuras tridimensionales y las propiedades biológicas de proteínas simples y son determinantes importantes de la estructura 4 fiinción de proteinas complejas que contienen aderntis de aininoácidos, hem, carbohidratos, Iípidos, ácidos nucleicos, etcktcra. Este capítuIo estudia las estructuras, propiedades fisicas, estereoquim ica, reacciones químicas y equilibrios iOnicos de los L-alfaaminoacidos presentes en las proteínas.

trastornos graves. Varias enfermedades genéticas. Telativamente raras, del catabolismo de arninoácidos (como la fenilcetonuria y la enfermedad dc la orina de jarabe de rnaple) producen, si no se tratan, retraso mental y muerte temprana. Otros padecimientos genkticos pueden deberse a la alteración de la capacidad para transportar aminoácidos específicos a las células. Dado que estos defectos de transporte por lo común causan una excreción urinaria exagerada de uno a más amino8cidos, a menudo se designan como aminoacidurias. Además de sus actividades como proteinas, los 1,-arninoacidos y sus derivados participan en runciones intraceIuIares tan diversas como Ia transmisión nerviosa, la regulación del desarro110 celular y en la biosintesis de porfirinas, purínas, pirimidinas y de urea. IdosI .-arninohcidos de pkptidos de peso moIecular bajo actúan como hormonas y tanto los aminoicidos ri como los l. esthn presentes en 10% antihioticos polipeptidos elaborados por microorganismos.

PROPIEDADES DE LOS

AMINOACIDOS

El código genético específica 20 L - a l f a - a m i n o á c i d o s La alimentación humana debe coniencr cantidades adecuadas de 1 0 1,-alfa-aminoácidos esenciales, ya que, ni el ser humano ni los demás animales superiores pueden sintetizarlos en las proporciones necesarias para mantener el crecimiento infantiI o conservar la salud en los adultos. En forma de proteinas, los aminoAcidos realizin una multitud de funciones estructurales, hormonales y cataliticas esenciales para la vida. Por tanto, no sorprende que defectos genttícos en el metabolismo de los aminoacidos puedan conducir a

Aunque existen más de 300 arninoácidosdiferentes en la naturaleza, sólo un subconjunta de 20 constituye las unidades monomericas a partir de las cuales se construye el esqueleto básico de las proteínas polipeptidicsts. Un cbdigo genetico de tres letras no repetidas podría incluir más de 20 arninoacidos, pero la redundancia en el código genetico universal limita los codones de arninohcidos disponibles a los 20 arnino8cidos L-alfa que se presentan en e1 cuadro 4-1. Por consiguiente, todas las proteinas contienen diferentes pro-

30

(cupí6ulo 4)

Bioquimic.a de Harper

r i i s d rn 4-1.r.-alfa-~m~no"ácidos presentes -----

en las proteina~i --

I

iula estrur

Alanina

Lc---.:-'.

'

I,eu [l

i

.

-

-

- .

I--. 2.3

m

Con crdcnas laterales que tienen grupos bidroxila [OH)

Se?-

nI

2

Scr FS'

1;

I -..---- 9.8

CkI2&.

I

!

OH

I

I

i

l

.NHI

~m~-CH-ch'1

Tre 17

Treonina

I

2.1

9.1

Casi 13

Tir

-.

Con cadenas laterales que contienen 4tomnr de azufr*

ci:

Cis [C

~n,-CH2-W

i Metionina -

8.3

CH,-CH-

SI

~

e [I t

-. - -- Con cadenas laterales que contienen grupos hcidos o sus amidas I

A

A--

"

ÁCido asphrtil

Asparagina

o[

Asn

Ac ido gIuiárnico Glu [E

Glutamina

A -

I

2 1.u

,Y.Y

-

u

Cuadro 4-f. t-milfa-Aminohcidos presentes en las proteínas (continuación) ---.*u..--. -A

"

A-----A

1 :on cadenais IatcralejI que conti

'

.

-."..".

NombriLI_- Silmbolo

1 A r e m1

1 1 istidina -iue contiei

Fistidina

1

Lis 1

icos 1 VCase desputs

F

Tirosina

rolina

porciones de estos 20 L-alfa-aminoAcidos. Sin embargo, ciertas proteínas contienen, además, aminohcidos L-alfa "poco habituales" originados en algunos de los 20 aminoácidos básicos mediante un procesamiento postraslacional (o sea, un proceso que tiene lugar despues de la fomaci6n de un esqueleto de polipép tidos). Un ejemplo frecuente es la cistina, que se produce por oxidacibn a partir de los grupos S H de dos cistefnas para convertirse en una unibn -S-S(disulfuro). Otros aminoficidos modificados menos comunes o "poco habituales" tambidn cumplen funciones muy especificas en las proteínas donde se encuentran. Algunos casos de modificaciones postraslacionales son la metitación, la formilaci6n, la acetilacibn, la psenilacidn, la carboxilacibn y la fosforilacibn (capítulo 40).

En las proteínas sólo existen L-alfa-aminoácidos Los aminohcidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un alfa-aminoAcido, ambos esthn unidos al mismo atomo de carbono (figura 4-1).

R-C-

NH,

I

COOH

R

o

Flgura 4-1. Dos representacionesde un alfa-aminoAcido.

(Capífulo 4)

Se dice que un átomo de carbono que tiene cuatro sustituyentes diferentes es un carbono quiral. Con excepcion de la glicina, para la cual R es un átomo de hidrógeno (figura 4-l), los cuatro grupos unidos al átomo de carbono alfa de los aminoácidoc son diferentes. Esta orientación tetraedrica de cuatro grupos distintos alrededor del carbono alfa le confiere actividad óptica (la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada) a 10s aminoácidos. A~inqueen las proteinas se han encontrado algunos aminoácidos dextrorrotatorios y algunos levorrotatorios a pI.1 7.0, todos tienen las configuraciones absolutas del bgliceraldehido por lo cual son L-alfa-aminoacidos. Dado que los u-aminoicidos existen en la naturaleza e inclusive en antibióticos polipeptldicos, ¿por q u e se encuentran sOlo L-aminoácidos en las proteínas? Los autores proponen la hipbtesis dc quc los L - a m i n o a c i d o s f u e r o n s e l e c c i o n a d o s por un fenómeno, en cierta manera fortuito, que tuvo lugar muy temprano durante la evolución de Ea vida.

Los aminoácidos pueden tener carga neta positiva, negativa o cero Los aminoácidos portan por lo menos dos grupos Bcidos débiles ionizables, un -COOH y un -NHq'. En solucibn, dos formas de estos grupos, una con carga y otra sin carga. existen en equilibrio protónico: R-COOH R-NH3'

-

R-COO-

e R-NH2

Figura 4-2. Estructura ionicamente correcta para un aminoacido a pH fisiológico o cerca de el (A). La estructura sin carga que se muestra en (B) no puede existir a ningún pH, pero es posible usarla por conveniencia cuando se describe la quimica de los aminoacidos

un grupo carboxilo estará presente como ion carboxi-

lato (R-COO-). Sin embargo, por conveniencia se utiliza la representación i3 para numerosas ecuaciones en las que no intervienen los equilibrios protbnicos.

Las fuenas relativas de los icidos débiles se expresan en términos de su pK, Las fuer7as relativas de los icidos dhbilec son expresadas en tkrminm de sus constantes de disociaci6n de ácidos, K,, o de su pK., que es simplemente el log negativo de la constante de disociación, esto es.

+ H'

+ H'

R-COOH y R-NHit representan los miembros protonados o acídicos en estos equilibrios. El R-COOy el R-NH2 son las bases conjugadas (es decir, los aceptores dc protones} de los ácidos correspondientes. Aunque el R X O O H y el R-NHj' son Acidos dhhiles, el R-COOH es un acido con mayor fuerza que el R-NH]'. Al pH de1 plasma sanguíneo o del liquido intracelular (7.4 y 7.1, respectivamente), los grupos carboxilos existen casi enteramente como iones carboxilato, R--COO-. A estos valores de pH, la mayoría de los grupos amino estfin predominantemente en la f o m a proíonada, R-NH?'. Las especies ionicas prevalentes de los aminoácidos en la sangre y en la mayoria de los tejidos, deberán representarse como se muestra en la figura 4-2A. La estructura E3 (figura 4-2) no puede existir a ningún pH. En un pH suficientemente bajo para ionizar al grupo carboxilo, el grupo amino con el Bcido rnh débil tambien se protonaría. A un pH dos unidades por debajo de su pK,, un hcido estarh protonado aproxiniadamente 99 por ciento. Si el pH se eleva de manera gradual, el protbn del ácido carboxílico se perderh mucho tiempo antes que el del R-NH3'. A cualquier pH bastante alto para que predomine [a base conjugada sin carga del grupo amino,

El cuadro 4-1 enumera los valores de pK para los grupos funcionales presentes en los 20 arninohcidos de las proteinas. Por conveniencia, el subindice a en K, y pK, queda implicito, pero se omitirá de aquí en adelante. La figura 4-3 iIustra Ias formas protonadas de los grupos R imidazol de la histidina y el grupo R guanidino de la arginina. Ambos existen como híbri-

NH

I C - NH,

!I

ONH,

-

NM

1 0 C=NHi,

I N'%

=

NH

i:.o

G~NH,

1:

NH2

Figura 43. Hlbridos de resonancia de las formas protonadas de los grupos R de histidina y arginina.

dos de resonancia, por lo que se pueden representar como se muestra a la derecha, con la carga positiva distribuida entre ambos nitrógenos (histidina) o sobre P los tres nitrogenos (arginina). La carga neta (la suma algebraica de todos los gnipos con cargas positivas y negativas que se encuentran presentes en la moléculaj de un aminoacido depende del pH o de la concentraci6n de protones de la solucihn en que se encuentren. La capacidad de alterar la carga de los aminoáicidos o de sus derivados por manipuIacíón del pH facilita la separación fisica de aminoácidos, péptidos y proteínas.

A su pH isoelectrico (pl), un aminoácido tiene una carga neta de cero Para un aminohcido aIifático como la alanina, la especie isoeléctrica es la forma que se muestra en la figura 4 4 . El pH isoeléctrico es el pH que esta en medio de los valores de pK de ambos lados de la especie isoeléctrica. Para un aminohcido con s61o dos grupos disociables, no puede haber ambigüedad posible, como se muestra abajo en el cálculo del p l para la alanina. Dado que p K l (R-COOH) = 2.35 y pKz(R-NH,') = 9.69, el pH isoeléctrico (pl) de la alanina es:

El calculo del pl para un compuesto con más de dos grupos disociables tiene una posibilidad mayor de m o r . Por ejemplo, considerando la figura 4-5, ¿cuál podria ser el pH isoeléctrico (p1) para el Acido aspartico? Primero, se escriben todas las estructuras ibnicas posibles para un cornpiiesto en el orden en el cual se presentan cuando se va de una solución fuertemente acida a una solución alcalina (por ejemplo, para el ácido aspártico en la figura 4-5). A continuación, se identifica la representaci6n isoibnica, zwitterionica o neutra (como en la figura 4-58). El pI es el pH que esta en medio de los vaiores de pK de ambos lados de las especies isoiónica.

II

O

Fiqura 4-4. Estructura isoeléctrica o "zwttteri6nica" de la alanina Aunque tiene carga, el zwitterlbn Presenta una carga neta igual a cero y por consiguiente no emigra en u n campo elkctrico de corriente directa.

En este ejemplo.

Este procedimiento es uti! para todos los aminoácidos con grupos disociables adicionales, como la lisina o la histidina. Qespuks de escribir las fórmulas para todas las especies cargadas posibles de los arninoacidos lisina y arginina, se observa que:

Para la Iisina, el pl es 9.7; para la arginina es 10.8. El ectiidiantc deberli determinar el pl para la histidina. Determinar por inspección de las estructuras cargadas, los valores de pK a ambos lados del zwitterion, no se limita a los aminoicidos. Puede ser aplicado al cálculo de la carga de una molécula con cualquier numero de grupos disociables. [,a capacidad de realizar cálculos de este tipo es valiosa en el laboratorio clínico para predecir la movilidad de los compuestos en los campos elkctricos y para seleccionar Iris arnortiguadores apropiados para Ias separaciones. Por ejemplo, un amortiguador a pH 7.0 podria separar dos moleculas con un pl de 6 y S, respectivamente, debido a que la molécula con pl = 6 tendrfi una carga negativa neta mayor a pH 7.0 que la molécula con pl = 8. Consideraciones análogas se aplican a la comprensión de separaciones sobre soportes ibnicos como las de polimeros con carga positiva o negativa (por ejemplo, celulosa DEAE o resina 1 Dowex).

La solubilidad y el punto de fusión de los aminoácidos reflejan su carácter iónico Dado que los aminoácidos poseen múltiples grupos con carga, se solvatan con facilidad y, por tanto, son solubles en solventes polares como agua y etanol, pero insoluhles en solventes no polares como benceno, hexano y &ter.Sus elevados puntos de fusidn (> 200 "C) reflejan la gran cantidad de energía necesaria para romper las fuerzas iónicas que estabilimn la red cristalina.

LOS AMINOAGIDOS PUEDEN CLASIFICARSE POR LAS POLARIDADES DE SUS GRUPOS R dividirse en dos Los aminoficidos proteinicos amplios grupos de acuerdo a la polaridad o no polari-

34

Bioquimica de Hurper

(Capítulo 4)

En actdo fuerte (menor de pH 1); carganeta=+ 1

Aproximadamente pH6a8 carga neta = -1

Aproximadamente pH 3: carga neta = O

En hlcali fuerte (arriba de pW i1); carga neta = -2

Figura 4-5. Equilibrio protbnico del Bcido asplrtico.

dad de los grupos R adheridos a los átomos de carbono alfa (cuadro 4-2). Las abreviaturas de una sola letra (cuadro 4-1) se emplean para representar secuencias extremadamente largas de arninoacidos (por ejemplo, para anotar la secuencia completa de aminoacidos en una proteína). Los aminoácidos que se encuentran en estados libre o combinado (pero no en proteinas} desempefían funciones importantes en los procesos metabólícos. Por ejemplo, la ornitina, la cimilina y el arginosuccinato participan en la formación de la urea. Hay mas de 20 u-aminohcidos en la naturaleza, los cuales incluyen D-alanina y D-glutamato de las paredes celulares de ciertas bacterias y varios D-aminoácidos de antibióticos.

LOS GRUPOS ALFA-R DETERMINAN LAS PROPIEDADES DE CADA AMINOACIDO La glicina, el más pequefio de los aminoácidos, puede encajar en regiones de la estructura tridimensional de las proteinas inaccesibles para otros aminoácidos y se

Cuadro 6 2 . Ctasificaci6n de los alf fa-aminohcidos

presentes en las proteinas con base en su relativa liidrofilicidad (tendencia a asociarse con el agua) o hi dad (tcnd encia a asociarse a I qte no polar en lugar de agua) . -

- FIidrbfot.-LisA lanina Fr:niIalanina 1solcucina

Lc M PI Ti Triptófano Valina

l

-

"

"

-

"~

.. ..-.

1' w : 3 . . c E , . -

do aspártic o Áci do glutamico ,inina imagina Cisi:eina Glic:ina G lutamina

Histiclina Cisinia a -Serin. 1 reoriína

-.-

encuentra en regiones donde tos pdptidos se doblan en forma aguda. Los grupos R alifáticos de alanina, valina, leucina e isoleucina y los gmpos R aromáticos de fenilalanina, tirosina y triptdfano son hidrof6bicos, propiedad que tiene consecuencias importantes para el ordenamiento de !as moldculas de agua de las proteinas que estan en la vecindad inmediata. Es tlpica la presencia de estos aminohcidos en el interior de proteinas citosólicas. Los grupos R con carga, de los aminoácidos básicos y acidicos, estabilizan las conformaciones proteínicas especificaspor intermedio de la formación de enlaces salinos. Por ejemplo, la rotura y reconsúucciSn de enlaces salinos que acompafla a la oxigenación y desoxigenación de la hemoglobina (capitulo 7). Además, los aminokidos con grupos Rde cargapositiva o negativa funcionan en los sistemas de "transmisibn de carga" que las transportan a distancias considerables durante la catálisis enzimática. Por último, la histidina tiene funciones unicas en la catalisis enzimática, debido a que el pK de su protón imidazblico le permite, a pH 7.0, funcionar alternativamente como base o como acido catalitico. El grupo alcohol primario de la serina y el grupo tioalcohot primario (-SI+) de la cistelna son nucleófi los excelentes y pueden funcionar como tales en muchos procesos de la catklisis enzimhtica. Aunque el alcohol secundario de la treonina es tambitn un buen nucleófilo, no se sabe que se comporte como taI en la catálisis. Además de su papel catalitico, el grupo 4 H de la serina y de la tirosina actúa en la regulación de la actividad de ciertas enzirnas cuya acción catatitica depende del estado de fosforilación de residuos seril o tirosil especificas. Los arninohcidos no absorkn la luz visible (es decir, son incoloros) y, con excepcibn de los arninoficidos aromaticos triptófano, tirosina, fenilalanina e histidina, tampoco absorben la luz ultravioleta de una longitud de onda mayor de 240 nm. Varios aminoAcidos, particularmente el triptdfano, absorben luz ultravioleta de longitud de onda de alta frecuencia (250 a 290 nm) (figura 4 4 ) . Aunque el triptofano es relativamente

dos también reaccionan, pero con mayor lentitud que un alfa-aminoácido. La prolina y la 4- hidroxiprolina producen un color amarillo con ninhidrina. La fluorescamina (figura 4 - 9 , un reactivo aun más sensible, puede detectar nanogramos de un aminohcido. Igual que la ninhidrina, Sa fluorescamina f u m a un complejo con arninas de otros compuestos además de los arninoácidos.

VARIAS TÉCNICASAISLAN LOS AMINOACIDOS Crornatog rafía 240

260

280

Longitud de onda (nm)

Figura 4 4 . Espectrode absorcidn ultravioleta del triptbfano, tirosina y fenilalanina.

poco común en la mayoria de las proteínas, contribuye de manera importante a la capacidad de muchas de ellas, para absorber h z en la región de los 280 nm.

En todas las separaciones cromatográficas, las moldculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una rnbvil. La separacion depende de la tendencia !elativa de tas moléculas en la mezcla para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase. Aunque estas tkcnicas de separacidn se describen principalmente en reIaci6n con aminoácidos, su uso de ninguna manera está restringido a estas moléculas.

Cromatografía en papel

LA NlNHlDRlNA O LA FLUORESCAMINA DETECTA LOS AMINOACIDOS

La ninhidrina (figura 4-7) descarboxila por oxidación los alfa-aminohcidos a Coz,NN3 y un aldehido con un htomo de carbono menos que el arninoficido precursor. Luego, la ninhidrina reducida reacciona con el amoniaco liberado, formando un complejri azul que absorbe al rnkirno la luz a una longitud de onda de 570 nm. Este color azul es la base de una prueba cuantitativa para alfa-aminohcidos que puede detectar cantidades de aminoAcidos tan pequeflas como 1 pg. Otras arninas distintas a los alfa-aminoicidos también reaccionan con ninhidrina dando un color azul, pero sin liberar Coz.Por tanto, la formación de COZindica Ea presencia de un alfa-aminohcido. El NH, y los pépti-

Para la cromatografia en papel, se coloca una gota de solucibn que contenga uno o mas aminokidos a unos 5 cm del borde de una tira de papel filtro. La tira se coloca en un vaso cerrado donde su extremo entra en contacto CUII un solvente, generalmente un alcohol de bajo peso molecular en solución saturada con agua que contiene un ficido o una base. Despds de la migración del solvente sobre el papel, se seca la tira, se trata con ninhidrina en acetona y se calienta un poco; entonces las posiciones de los arninoácidos aparecen como puntos de color purpura (figura 4-9). Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ile, Fen, Tri, Val, Met, Tir) emigran m& que los que tienen cadenas laterales mas cortas no polares (Pro, Ala) o cadenas laterales polares (TE, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis) (figura 4-9). Esto

Figura 4-7. Ninhidrina.

Figura 4-8. Fluorescamina.

(Capítulo 4)

sentidode rnigracibn

1

1

del solvente

Cis

4 Tri

-origen

*

-Iir

)

Met

'

Figura 4-9. ldentificacibnde los aminoAcidos presentes en las proteínas DespuBc de crornatwrafia descendiente en papel, en A-butanol. ;ícido acético. agua, las manchas fueron vistas al añadir ninhidrina

refleja la mayor solubilidad relativa de las moltculas polares en la fase estacionaria hidr6fila y de las moI&culas no polares en solventes orgánicos. Para una serie no polar (Gli, Ala, Val, Leu), a mayor longitud de !a cadena lateral no polar se incrementa su caracter no polar lo cual aumenta su movilidad. La relacibn entre la distancia recorrida por un aminohcido con la distancia que viaja ei solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicacibn de la rne7cla de arninoácidos, se designa como valor RF (movilidad relativa con el solvente) de ese aminohcido. Los valores RFpara un aminohcido dado varían de acuerdo con las condiciones experimentales, por ejemplo, según solvente usado. Aunque es posible identificar tentativamente un aminohcido s61o por su valor RF,es preferible hacer la cromatografia estandar de aminoácidos conocidos de manera simultáneacon la mezcla desconocida. Luego, la movilidad puede expresarse en relacion a la de uo esthndar (es decir, como RI,m8s que como Rf). Las movilidades expresadas como relativas a un estAndar varían menos que los valores Rf de un experimento a otro.

Cromatografía en capa fina Hay dos tipos distintos de cromatografia en capa fina (CCF): CCF de partición (CCFP) y CCF de absorción (CCFA). En Ia CCF de partfcion, la resolucibn implica

particihn de los elementos de una mezcla entrz dos

fases liquidas: una estacionaria y otra móvil de polaridad diferente, conforme la fase móvil pasa sobre [a estacionaria. La separacidn se produce por la diferencia de solubilidad de los componentes en las fases estacionaria y móvil. En la CCFP nonnal, la fase ectacionana es el componente más polar. El solvente desarrollado contiene ambos elementos: polares y débilmente no polares, típicamente agua, un alcohol de 4 o de 5 carbones y un Acido débil o una base débil como ácido acético o arnoniaco. Conforme se desplaza sobre la placa de apoyo, el solvente cambia de composición debido a los elementos más polares que acornpairan a los grupos - O H polares de la celulosa. Por tanto, el solvente que avanza paulatinamente se convierte en más no polar. Los componentes más no polares de una mczcIa se desplazan mLs lejos que los componentes mas polares de igual tamafio. Por ejemplo, el glutamato y la lisina se retardan, en tanto que la leucina y la valina migran junto con el solvente. En la CCFP en "fase reversa", tanto las polaridades de las fases como las movilidades de los componentes de la mezcla se revierten respecto a la CCFP normal. La fase móvil suministra la fase polar. La fase estacionaria, por lo común celulosa recubierta con un líquido no polar como el aceite de silicon, suministra la fase más no polar. En contraste con la CCFP normal, los componentes polares rnigran con el solvente en tanto que se retrasa el desplazamiento de los componentes menos polares. En la CCF de absorción (CCFA), la separacidn se basa en un principio totalmente diferente. La resolucibn implica absorber los componentes de la mezcla en gel de sílice que se calienta para expulsar toda el agua fija. La fase móvil, típicamente una mezcla simple o binaria de calventes organices, desplaza los compuestos absorbidos compitiendo por los sitios de unibn sobre el gel de sltice. Primero se desplazan los componentes unidos con menor firmeza y asf se logra la resolucibn.

Cromatografía de intercam bia ionico El anhlisis de los residuos de aminolicidos despuks de la hidrólisis de un polipéptido, por la general involucra a la crornatografía automatizada d e intercambio i6nico. La separación, identificación y cuantiticación completas requieren menos de tres horas. EI procedimiento de Moore y Stein utiliza una columna corta y una larga las cuales contienen la forma ionizada de Na" de una resina de poliestireno sulfonatada. Cuando e3 ácido hidrolizado a pH 2 se apZica a las columnas, los arninoácidos se unen mediante el intercambio de cationes con el catión Na'. Las columnas se eluyen despues con citrato de sodio bajo condiciones prede-

Aminoácidos

terminadas de pH y temperatura. El material eluido se hace reaccionar con la solucibn de ninhidrina y las densidades de la coloración se miden en un colorimetro de flujo. Los datos aparecen en un tubo de sayos catbdicos con integración relacionada con cornputadora de las áreas pico (figura 4-1 0).

Electroforesic de alto voltaje (EAV) Las separaciones de aminoacidos, polipkptidos y otros anfhlitos (moléculas cuya carga neta depende del pH del entorno) en un campo el6ctrico de corriente directa tienen extensa aplicación en bioquimica. Para los aminoCicidos. las hojas de papel o capas finas de celulosa en polvo son las que se usan Con mayor frecuencia como soportes inertes. Para poliptptidos grandes o proteínas, se emplea gel de poliacrilamida con enlaces cruzados. Para oligcimeros de nuclehtidos se utilizan soportes de agarosa y poliacrilarnida. Las separaciones dependen de la carga neta del anfólito y del peso molecular de los compuestos que seran separados. Para molécuIas con carga idéntica, la de peso molecular más bajo emigra más lejos. Sin embargo, la carga neta es el factor mas importante que determina la separación. Esta técnica es htil para aminohcidos, polipeptidos de peso molecular bajo, ciertas proteínas, nucleótidos y fosfoazúcares. Las muestras se aplican a! soporte, que a continuación se humedece en una solución amortiguadora de un pH apropiado y se pone en contacto con reservorios de amortiguador

* 37

mediante tiras de papel. El papel puede cubrirse con una placa de vidrio o sumergirse en un hidrocarburo refrigerante. Al aplicar lacorriente, las mol&culascon carga negativa neta al pH seIeccionado, emigran hacia el Iinodo y aquellas con carga positiva neta, hacia el chtodo. Para visualizar la separacidn, el electroferograma ya seco es tratado con ninhidrina (aminohcidos, péptidos) o expuesto a la liiz ultravioleta (nuclebtidos). La elección de pH es dictada por los valores de pK de los grupos que se disocian en las rnol&culasde la mezcla.

LOS GRUPOS FUNCIONALES DETERMINAN LAS REACCIONES Q U ~ M ~ C ADE S LOS AMINOACIDOS Los grupos funcionales que poseen los aminoácidos gobiernan las reacciones quimicas en las que participan, las funciones Bcidas alfa-amino y alfa-carboxílica y los grupos Funcionales presentes en los grupos R. Cada grupo funcional puede participar en todas sus reacciones químicas características. Estas reacciones incluyen para los grupos del Iicido carboxílico, la ionización y ia formación de &teres. amidas y anhidridos ficidos. Estas reacciones incluyen la ionizaciiin, la acilacibn y la esteri ficacibn d e grupos amino, oxidacibn y alquilación de grupos -SH, y esterificacibn de grupos -OH, etcétera.

Figura 4-10. Anhlisis automatizado de los aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteínas. Los arninoacidos se adsorben en una resina intercambiadora de cationes en una base de poliestireno, Dowex 50, se eluyeron con amortiguadores del pH indicado, se sometieron a reaccidn Con ninhidrina y se registr6 la absorbencia a 570 y 440 nrn (para detectar prolina). Las hreas máximas son proporcionales a la canttdad existente de cada aminoácido. Una columna corta (A) determina arninoAciUoc bastms a pH 5.28. La elución de una columna mBc larga (B) a pH 3.25 y 4.25, identifica los amino8cidos restantes. El aminohcido no proteinico norleucina sirve como estBndar intenso

38

Bioquímica de Hurper

comprender la conversion previa en un cloruro de acido. En los procesos biolbgicos, la activación comprende una condensación inicial con ATP con la formacibn de un am inoaciladenilato.

RESUMEN

Figura 4-1 1. Aminoicidos unidos por un enlace peptídim (porei6n sombreada).

LA REACCION MAS IMPORTANTE DE LOS AMINOACIQOS ES LA FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTIDICO En principio, la formacion del enlace peptídico comprende la eliminacion de un m01 de agua entre el grupo aIfa-amino de un aminoácido y el grupo alfa carboxilo de un segundo aminoácido (figura4-11). N o obstante, esta reacción no procede en esta direccibn, ya que la constante de equilibrio favorece con firmeza la hidrólisic del enlace peptídico. Para sintetizar la unibn entre dos aminohcidos, primero debe activarse el grupo carboxilo. Desde el punto de vistaquimico, esto puede

Sblo los L-alfa-aminoácidos forman las protelnas, aunque en la naturaleza existen o-aminoácidos y no al fa-aminoácidos. Todos los aminoácidos poseen por lo menos dos grupos funcionales acidos débiles, RNHH y R-CQOH, que, para los arninoacidos protelnicos, residen en el átomo de carbono alfa. Adernas, estos y otros grupos funcionares hcidos ddbiles ( 4 H , -SH, guanidino, imidazol) determinan que la carga neta en un aminoácido varíe con el pH. Por tanto, los arninoacidos son anfhlitos cuya carga neta a un pH dado depende de los valores de pK, de sus grupos funcionales. El pI es el pI4 en el que un amínohcido tiene una carga neta igual a cero y por ende no se mueve en un campo elkctric~de corriente directa. AdernBs de determinar las relaciones de carga y las clases de reacciones qulmicas que un aminohcido experimentará (por lo cual la formación del enlace peptidico es de suma importancia}, los grupos R y sus funcionalidades definen las funciones bioauimicas únicas para cada aminohcido. Las funcionalidades del grupo R proporcionan también una base para clasificar a los aminoácidos como básicos, ácidos, aramhticos, alifáticos y con contenido de azufre. Después de la separacion de mezclas de aminohcidos por particihn o cromatografia de intercambio iónico, estos compuestos pueden detectarse y cuantificarse por su reaccibn con ninhidrina. E

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JM: Amrno Acid

Analysis. Halstcad Press,

Péptidos .

.

Vicior W. Rodwell, PhD

La polimerización de los L-alfa-aminoácidos por enlaces peptidicos constituye el marco estructural para las proteínas. Este capitulo describe las características de estos enlaces, las propiedades de los péptidos, los m&todos para deteminar la estructura primaria de los mismos y de las proteínas así como las tdcnicas para la sintesis de péptidos.

Idos pdptidos tienen un enorme inteds biornédico, en particular para endocrinologia. Muchas de las hormonas son péptidos y pueden suminislrarse a los pacientes para corregir deficiencias (como la administración de insulina a pacientes con diabetes sacarina). Ciertos antibibticos son peptidos (por ejemplo, la valinomicina y la gsamicidina A), igual que algunos agentes antitumorales (como la bleomicina). Por su parte, el dipéptido aspartame se utiliza como edulcorante en muchas bebidas. La dpida síntesis quirnica y la tecnologia de recombinacibn del DNA facilitan la producción de cantidades sustanciales de hormonas peptídicas que en el cuerpo existen solo en concentraciones rninimas, por lo cual son dificiles de aislar en cantidad suficiente para usarse en teraptutica. La misma tecnologia permite la slntesis de otras péptidos, también disponibles de fuentes naturales, pero solo en cantidades pequeilas (es eE caso de ciertos peptidos y proteínas viralec), para usarse en vacunas.

LOS L-ALFA-AMINOACIDOSSE UNEN MEDIANTE ENLACES PEPT~DICOS PARA FORMAR LOS PEPTIDOS En la figura 5-1 se muestra un tripkpcido constituido por alanina, cisteina y valina. Advierta que un tripdptido es aquél formado con tres residuos. no con tres enlaces peptidicos. Por convencion, las estructuras peptidicas se escriben con el residuo amino-terminal (el residuo con un gmpo de alfa amino libre) a ta izquierda y con el residuo carboxiío terminal (et residuo con un gmpo alfacarboxiIo libre) a laderecha. Este péptido tiene un solo grupo alfa amino libre y un solo grupo a3fa carboxilo libre. Sin embargo, en algunos péptidos, los grupos terminales arnino o carboxilo pueden derivarse (por ejemplo, una amina N-fomilo o una amida del gmpo carboxilo) y por tanto no están libres.

Alanil

Cisteinil

Valloa

Figura 5-1. Fbrmula estructural de un tripkptido. Los enlaces peptídicos están sombreados para enfatizarlos.

Las estructuras de los péptidos son fáciles de representar Por conveniencia, los peptidos se representan con su terminal amino a la izquierda y la terminal carboxilo a la derecha de la página. Para mostrar las estructuras de los péptidos, primero se dibuja la cadena principal o esqueleto y en seguida se agregan los grupos R apropiados. Escriba un zig-zag formado a partir de la secuencia de Atomos que se repite en el esqueleto o cadena principal: alfa-nitrbgeno, alfa-carbono, carbiin carbonilo.

Después, se completan las terminales atnino y carboxilo, se agrega un hidrogeno a cada uno de los alfacarbonos y a cada nitrógeno del pbptido; ademhs se añade oxígeno a los carbonos carbonilos.

alanilo, aspartilo, tirosilo). Los ptptidos reciben su nombre como derivados de la terminal carboxilo del residuo aminoacilo. Por ejemplo, el tmapéptido LisLeu-Tir-Gln se denomina como derivado de la glutamina y se le llama lisil-leucil-tirosil-glutamina.La terminación -ina en la glutmina indica que su grupo atfa-carboxilo no participa en la formación del enlace del péptido.

La estructura primaria afecta la actividad biológica La mutación del DNA que altera codones puede producir la inserción de grupos aminoacilo inapropiados en un polipkptido o proteina. Aunque a menudo no tiene el mayor efecto biolbgico, en ocasiones incluso una sola sustitución puede reducir o abolir la actividad bioE6gica con efectos resultantes leves (es el caso de la intolerancia al alcohol en muchos asihtiticos) o mhs serios {como la enfermedad de ckluIas falciformes). Muchos errores metab6licos hereditarios comprenden un cambio sencillo de este tipo. Ai respeczo. b s nuevos mdtodos para determinar la estructura proteinica y del DNA han incrementado de manera notable la comprensión de la bioquimica de numerosas enfermedades metabolicas hereditarias.

Para dar nombre a los aminoácidos existentes en los péptidos se utilizan abreviaturas Por ultimo, se incluyen los grupos R apropiados (con sombra) a cada átomo de alfa-carbono.

lC /c\ /N\ \ / COQN C

/ c\ / Ci-h

H

l

O

H/C\cY I

Se utilizan las abreviaturas de 3 y de 1 letras de los aminolicidos (cuadro 4-1) para representar las esmcturas primarias (figura 5-2). Las abreviaturas de tres letras ligadas por líneas rectas, qresentan una estructura primaria conocida e inequlvoca. Estas líneas se omiten para las abreviaturas de una sola l&a. Cuando hay incertidumbre acerca del orden preciso de una porción de un polipkptido, los residuos en duda se encierran en parentesis y separados por comas (figura 5-3).

Numerosos péptidos tienen actividad fisielogica La secuencia de aminoácidos determina la estructura primaria de un péptido Cuando el número, estructura y orden de todos los residuos de aminoácidos en un polipéptido se conocen, su estructura primaria ha sido determinada. Los aminoácidos cuyos grupos alfa-carboxilo participan en la formacibn de los enjaces del péptido se designan "residuos aminoacilo". Estos se denominan mediante la sustitucibn de las terminaciones -ato o -ina de los arninohcidos libres, por la terminación -ilo (como

Las cklulas animales, vegetales y bacterianas contienen diversos polipkptidos de peso molecular bajo

Glu-Ala-Lis-Gli-Tir-Ala

E A K G Y A Figura 5-2. Representacibn de 3 y 1 letra de un hexapbptido.

Figura 53. Heptapeptido que contiene una regidn de estruci tura primaria incierta (en el parbntesis)

(3 a 100 residuos aminoacilos) que tienen actividad fisioldgica importante. Algunos, incluyendo la mayoría de las hormonas polipeptidicas de tos marniferos, contienen solo enlaces peptidicos formados entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo de los L-aifa-aminohcidos de las protelnas. Sin embargo, en los polipéptidos también pueden existir aminoacidos o derivados de aminohcidos proteinicas adicionales. El glutatihn (figura 541,en el cual el glutamato amino-terminal estB enlazado a la cisteína por un enlace alfa no peptidico, es requerido por varias enzimas. El glutatión y la enzima glutatibn reductasa participan en la forrnacibn de los puentes disulfuro correctos de numerosas hormonas proteinicas y polipeptidicas así como tarnbidn en el metabolismo de los xenobióticos (capitulo 6 1). Los antibióticos polipeptidicos elaborados por hongos contienen aminohcidos D y L así como otros no presentes en las proteinas. Ejemplos son la tirocidina y la gramicidina S, polipkptidos clcIicos que contienen n-fenilalanina y e[ aminohcido no proteinico ornitina. La hormona liberadora de tirotropina (TRH, del inglds, flyrotropin-releming hormone} (figura 5-5) ejemplifica otra variante más. El glutamato amino-termina1 experimenta ciclizaci6n a hcido pirogluthmico y el carboxilo del propilo carboxilo terminal se arnida. Un polipéprido de mamífero puede contener más de wn +pido con actividad fisiol6gicapotente. Denm de la estructura primaria de la beta-lipotropina (hormona hipofisaria que estimula la liberación de hcidos grasos del tejido adiposo) hay secuencias de aminohcjdos que son comunes a otras hormonas polipep-

CH,

O II

/C\N/CH\C/N\CH, CHz 1 I

7%

H 1

I

H

Flgura 5-5. TRH (pir~lutamilhistidiIprolinamida).

tidicas con actividades fisioldgicas diversas (figura 54). El poli@ptido grande es un precursor de los poIipkptidos menores.

Los peptidoc con polielectrólitos El enlace peptidico (mida) no estA cargado a cualquier pH de interés fisiolligico. Por tanto, la forrnacibn de péptidos a partir de arninohcidos a pH de 7.4 se acompafia de una pérdida neta de una carga positiva y una negativa, por cada en!ace peptidico formado. No obstante, a pH 5siolbgico los peptidos son maléculas con carga debido a sus grupos R ácidos o básicos.

El enlace peptidico tiene carácter de enlace doble parcial Aunque los péptidos se representan con un enlace sencillo que conecta los htomos alfa-carboxilo y alfanitrdgeno, este enlace tiene en realidad un caracter de doble ligadura parcial (figura 5-7). No posee libertad de rotación alrededor de[ enlace que conecta a los htomos C y N. En consecuencia, los cuatro iitornos mostrados en la figura 5-7yacen en el mismo plano, esto es, son coplanares. Esta semirrigidez tiene consecuencias importantes para órdenes de estructura proteínica superiores al primer nivel. Por el contrario, hay plena libertad de rotacibn alrededor de los enlaces remanentes del esqueleto polipeptidico. En la figura 5-8, que resume estos conceptos, los enlaces que tienen rotación libre estan circundados por flechas y los átomos coplanares se han sombreado.

Las fuenas no covalentes restringen II

O

I COO -

H-C-NH~+ I

COO -

Figura 6 4 . Glutatibn (gamma-giutarnilcisteinil-glicha).Obsérvese el enlace ara no peptldiw que une a la Glu con Cis

la conformación de los péptidos Un polipkptido puede tener un gran número de conformaciones (disposiciones espaciales). Sin embargo, en solución tiende a predominar un número mucho menor de conformaciones. Estas conformaciones favorecidas resultan de factores como bloqueo espacial,

42

a

Biogulmica de H a r ~ e r

(Capitulo 5)

Metioninaencefalina

Figura 54. Estructura primaria de la beta-lipotropina. Los residuos 41 a 58 son la hormona estimulante de los melanocitoc (0-MSH). Los residuos 61 a 91 mntienen las estructuras primarias de las endorfinas sefíaladas.

interacciones coulómbicas, puentes de hidrhgeno e interacciones hidrbfobas. T m t o para que las proteinas, como para que los poli@ptidos (capítulo 6) tengan actividad fisiológica se reqviercn ~onformacionesespecíficas.

El m g o de variacibn de los residuos no consewados de una proteína entre especies indica la divergencia de

SECUENCIACI~NPROTE~NICA: DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA

La comparación de las secuencias de los peptidos muestra residuos clave e interrelaciones filogenéticas La comparacibn de las estructuras primarias de una proteína determinada entre organismos con reIacibn distante, proporciona indicios vitales respecto al modo en que una proteína puede servir como componente del citoesqueleto, transportador de electrones o catalizador.

Ffgun 5-7. La estabilrzacibn por resonancia del enlace peptidico le confiere un cardcter de doble enlace parcial, de ahi la rigidez en el enlace C-N.

Ftgura 5 4 . Dimensionesde una cadena polipeptidica completamente extendidas. Los cuatro $tomos que se encuentran en las áreas sombreadas, las cuales son coplanares, comprenden al enlace polipeptidico Los átomos en las áreas no sombreadas son los átomos alfa carbono, alfa hidrbgeno y el grupo alfa R de un aminofiado en particular. La libre rotacibn puede producirse alrededor de los enlaces que unen el alfa carbono con el alfa nitrbgeno y las funciones del alfa carbonilo (flechas azules). La cadena de polipéptido extendida es asi una estructura semirrigida con dos teroeras partes de los Btomos de la estructura unidos en una relación planar fijada La distancia entre los Btomos alfa carbono adyacentes es de 0.36 nm (3.6 A) También se muestra la distancia interatbmica y los Angulos de enlace, los cuales no son equivalentes (Redibujada y reproducida con autoriracibn de Pauling L, Corey LP. Branson HR, The structure o€ proteins Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA 1957;37:205.)

las mismas durante la evolucibn. Las relaciones evolutivas estrechas se vinculan con un alto grado de semejanza de las secuencias. mientras que las relaciones mas distantes corresponden a más diferencias en las secuencias. Esta interrelacibn, que primero se documentb en el iibicuo residuo 104 a 1 11 del polipeptido transportador de electrones citocromo c, se mantiene como verdadera en un número cada vez mayor de proteinas.

Los peptidos se purifican antes

del análisis Los datos de secuenciacion de los pdptidos serlan ininterpretables a menos que la homogeneidad peptídica. valorada por EGPASDS. excediera de 95 por ciento. Por tanto, los pkptidos deben purificarse primero mediante tkcnicas convencionales de purificacibn de proteínas (capitulo 8).

Por lo general primero se determina la composición de los aminoácidos 1,a determinación de los aminoácidos que componen un péptído, por lo general, se lleva a cabo antes de iniciar la secuenciacion, para identificar los posibles escollos y, de manera subsiguiente verificar los datos de secuenciacidn. Primero se rompen los enlaces peptldicos que unen a los aminohcidos por hidrólisis. Luego, los aminoicidos liberados se separan e identifican por LLAR o cromatografia de intercambio i6nico. Ningun procedimiento hidroliza pkpcidos de manera total sin algunas pdrdidas. El mdtodo de: eIeccibn es la hidrdlisis de muestras repetidas en HCI 6N a 110 "C en tubos de vidrio sellados al vacío por 24, 48,72 y 96 horas. Esto destruye todos los Tri y Cis, y si estan presentes iones rnetblicos, se pierde algo de Met y Tir. I,a recuperacibn de Ser y Tre es incompleta. Los enlaces Val-Val, Ile-[le, Val-Ile e Ile-Val, son muy resistentes a la hidrdlisis, en tanto que Gln y Asn son desarninados a GIu y d s p . ¿Cómo se superan estas dificultades? Antes de la hidrdlisis, la Cis se convierte en hcido cisteico, un derivado ácido estable. El Tri se mide desputs de la hidrdlisis bhsica, proceso que destruye a la Ser, Tre, Arg y Cis. Los datos de Ser y Tre se extrapolan al tiempo cero de la hidrdlisis. La Val y la t e u se determinan de datos obtenidos a las 96 horas. Sobre los hcidos dicarboxilicos y sus arnidas se informan de manera colectiva como "Glx" o "Asx". Por ultimo, dado que las proporciones relativas de cada aminohcido deben expresarse en números enteros, las fracciones decimales se redondean al nhrnero entero más próximo.

Sanger fue el primero en secuenciar un polipéptido Casi cuatro ddcadas han transcurrido desde que Sanger detenni116 la estructura primaria completa de la hormona polipeptidica insulina. La idea de Sanger h e separar primero las dos cadenas polipeptídicas, A y 0, de la insulina y entonces convertirlas, mediante separación enzimhtica especifica, en péptidos más pequeílos que contuvieran regiones de secuencia sobrepuesta. Utilizando el reactivo l -fluoro-2,4-dinitrobenceno (figura 5-9), entonces removio e identificó, uno en cada ocasibn, los residuos aminoterminales de los aminokcidos de estos pkptidos. Por medio de la comparación de las secuencias de péptidos sobrepuestas. fue capaz de deducir una estructura primaria inequívoca para ambas cadenas, A y B. Las siguientes dos tkcnicas han revolucionado la determinación de las estructuras primarias de los polipkptidos (proteínas). La primera fue la introducci6n por Edman, en 1967, de un procedimiento para la separacion e identificación automfitica de residuos ítmino terminales de aminoácidos asi como sus derivados feniltiohidantoinicos. La segunda fue la introducción independiente por Sanger y por Maxm y Gilbert de tkcnicas para la secuenciación rápida del DNA. En la actualidad, la estrategia óptima consiste en utili7ar ambas técnicas de manera simulthnea.

Las estructuras primarias de los polipéptidos se determinan por la técnica automatizada de Edman Dado que numerosas protelnas están constituidas por más de una cadena polipeptidica ligada por fuerzas no covalentes o pos puentes disulfuro, es posible que el primer paso sea disociar y separar las cadenas poli-

Figura 5-9. Reacción de un arnino~cidocon 1-fluoro-2,4dinitrobsnmno (reactivo de Sanger). El reactivo recibe ese nombre en honor del bioqulmico Frederick Sanger, laureado con el premio Nobel en 1958. quien lo us6 para determinar la estructura primarta de la insulina.

peptídicas individuales. Los agentes desnaturalizantes como ta urea o el clorhidrato de guanidina destruyen los puentes de hidrógeno, y disocian polipéptidos unidos de modo no covalente. Por su parte, los agentes oxídantes y reductores rompen los puentes disulfuro (figura 5-1 0). Entonces los polipCptidos son separados pos cromatografia.

anhidrido citracbnico (una reacción reversible) para cambiar su carga de positiva a negativa, ahora la tripsina se separa solo despues de Arg. La obtención de residuos de arginina es menos útil, debido a la abundancia relativa de residuos de lisina. No obstante, resulta de utilidad en la divisihn subsecuente de fraprnentos obtenidos con CNBr.

Los polipéptidos largos se fraccionan antes de su secuenciación

C. o-Yodosobenceno

[,os instrumentos automáticos mas eficaces para Ia obtencibn de secuencias (secuenciadores) operan sobre polipéptidos de 20 a 60 residuos de longitud. Por tanto, es deseable una partición especifica y completa en sitios relativamente raros. Los reactivos siguientes cumplen con este requerimiento.

A. Bromuro de cianógeno (CNBr) Inicialmente, los residuos de cisteina son modificados con ácido yodoacético. Despuks, el CNBr rompe en el lado COOH de la Met. Puesto que la metionina es comparativamente escasa en los polipéptidos, por lo general se producen fragmentos peptidicos dentro de los limites de tamafio deseado.

B. Tripsina

El o-yodosobenceno fracciona los relativamente escasos residuos de Trí-X. No se requiere una proteccibn previa de los demas residuos.

D. Hidroxiiamina La hidrox i larn ina separa los enlaces comparativamente raros de Asn-Gli, aunque por 10 general no da resultados cuantitativos.

E. Proteasa V8 La proteasa V8 de Staphylococcus aureus separa los residuos Glu-X-pdptido con preferencia por condiciones en que X es hidrdfobo. La uni6n Glu-Lis resiste el fraccionamiento. Esta reaccibn es útil para la degadacibn subsecuente de fragmentos obtenidos con bromuro de cianógeno.

La tripsina rompe el lado COOH de los residuos Lis

y Arg. Si los residuos de lisina son obtenidos con

F. Hidróiisis con ácidos moderadamente débiles Esta separa el enlace raro ~sp-!+o.

La secuenciación requiere de múltiples digestiones Las 2 o 3 digestiones del polipdptido original, normalmente en Me[, Tri, Arg y Asn-Gli, combinadas con subdigestiones apropiadas de los fragmentos resultantes, por lo general permitir& la determinacibn de la estructura primaria completa del polipeptido. Exceptuando algunas dificultades extraordinarias en la purificacibn de los fragmentos, kstapuede efectuarse con unos pocos micromoles del polipéptido.

LAS MEZCLAS DE PÉPTIDOS DEBEN SEPARARSE ANTES DE LA SECUENCIACI~N

Figura 5-10. Separacibn oxidativa de cadenas polipeptldicas adyacentes enlazadas por puentes disulfuro (sombreado) por Bcido perfbrmrco (lzqulerda) o la separacidn reductiva con beta-mercaptoetanal (derecha) forman dos pbptidos que incorporan residuos de Acido eisteico o de cisteinilo, respectivamente.

La purificación de fragmentos se logra principalmente por filt~aci6nen gel en iicido acético o fbmico por cromatografia liquida de alto rendimiento de fase invertida (CLAR) o por cromatografía de intercambio i6nico en fosfocelulosa o en sulfofenil-Sephadex en soluciones de k i d o fosfbrico.

A. Cromatografia de intercambio iónico y electroforesis de alto voltaje (EA Estas técnicas (capitulo 4), que separan con base en la carga, se adican a polipkptidos de peso molecular bajo y también a aminoácidos. El valor de pK para el grupo carboxilo-terminal del hcido alfa-carboxilico de un polipéptido es más alto que el del grupo alfacarboxilo en el aminoAcido correspondiente (es decir, el COOH peptídico es un hcido mas dkbil). De m a n e p inversa, el grupo amino-terminal es un ácido rnhs fuerte (tiene un pK menor) que el aminoacido del cual proviene.

B. Filtracibn en gel La secuenciación automatizada utiliza cantidades pequeiias de polipéptidos grandestde30 a 100 residuos). Sin embargo, muchos polipkptidos de peso molecular alto desnaturalizados pueden ser insofubles debido a la exposicibn de residuos hidrófobos antes escondidos durante la desnaturalimciiin. Aunque la insolubilidad puede resolverse con urea, alcoholes, hcidos orgánicos o bases, estos restringen el uso subsiguiente de tCcnicas de intercambio ibnico para la purificacibn de péptidos. Sin embargo, la filtración en gel de ptptidos hidrbfobos grandes puede llevarse a cabo entre hcido formico o acético, I y 4 molar. Esta tkcnica separa moliculas de tamaflos diferentes con base en su exclusión o inclusión en los poros de un filtro molccular como Sephadex.

C. CLAR de fase invedida Una tdcnica potente para la purificación de péptidos no polares de peso molecular grande es la cromatografia líquida de alto rendimiento en material no polar con elucibn mediante solventes polares (CLAR de fase invertida). La filtracibn en gel y la CLAR de fase invertida se emplean juntas para purificar las mezclas complejas de péptidos obtenidas por digestibn parciai de proteinas.

D. EA V en filtros moleculares La filtracirin molecular puede usarse junto con la separacibn por carga para facilitar la particibn. Aunque es posible emplear almidbn y agarosa, el soporte mhs común es un polimero de enlaces cruzados de acrilarnida (CHi=CN-CONH2). Para la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), las soluciones de proteínas se vacian en tubos o se aplican en placas que contienen un amortiguador de poliacrilamida can 2 a 10% de enlaces cruzados por inclusibn de bisacrilamida de metileno (bis) (CHZ=CH-CONH~)~-CH~ o reactivos con enlaces cruzados similares. Luego se aplica corriente directa. La visualizacián se logra por tincibn con azul de Coornassie o Ag". Una variante popular es la EGPA bajo condiciones de desnaturalizacihn. Las proteinas se hierven y a continuacibn se

someten a etectroforesic en presencia del compuesto desnaturalizante dodecilsulfato sbdico (SDS). Ea molécula con carga negativa CH3-(CH2)ii-S012recubre a los pkptidos en la proporcibn aproximada de un SDS por cada dos enlaces peptidicos. Esto "sumerge*' la carga original de la proteina, volviendola fuertemente negativa. Así, las separaciones subsiguientes se basan de manera primaria en el tamaflo molecular. El EGPA-SDS se usa de manera extensa para determinar los pesos moleculares de péptidos por comparación de sus movilidades con la de esthdares de pesos moleculares conocidos.

Para la secuenciación se utiliza la reacción de Edman La secuenciación automatizada utiliza el reactivo de Edman, fenilisotiocianato. La reaccion de secuencia (figura 5-1 1) libera el aminohcido arnino-terminal como un derivado de la feniltiohidantoina, el cual se identifica mediante C LAR. E! prbximo arninoálcido por secuenciar entonces se deriva y se elimina; luego se repite el proceso. Una secuencia de 30 a 40, o, en ocasiones, 60 a 80, residuos aminoácidos se determina en una operación continua. Las reacciones de Edman se llevan a cabo en una pelicula delgada sobre la pared de una cámara de reaccibn giratoria o en una matriz s61ida a la cual el carboxilo terminal del pdptido se ha acoplado de manera covalente. La secuenciación en fase gaseosa, una técnica en fase sblida, emplea reactivos gaseosos y facilita la remoción de productos gaseosos. Los metodos de secuenciacibn en fase sólida son aplicables a cantidades muy pequefias de péptidos, en algunos de hasta 1 pg.

Deben secuenciarse varios péptidos sobrepuestos Conocer la secuencia de todos los peptidos CNBr de una proteina no proporciona, por si mismo, su estructura primaria completa ya que no se sabe el orden en que estos péptidos se encuentran en la proteína. Para deducir una estructura primaria inequívoca tambikn deben prepararse y cecuenciarse péptidos adicionales cuyas teminaies m i n o y carboxilo se sobrepongan con los de los peptidos CNBr. Estos ptrptidos adicionales se producen por tecnicas (por ejemplo, digestion con quimiotripsina) que dividen la proteina en otros lugares distintos aresiduos Met. Luego, La deduccibn de una estructura primaria inequivoca por comparación de secuencias peptidicas se efectiia por un proceso aniilogo al ensamblaje de un rompecabezas (figura 5-12). Para localizar los puentes disulfuro, los péptidos de protelna sin tratar y de proteina reducida u oxidada

46

0

Bioquímica de H q e r

(Capítulo 5j

Fenilisotrocianato(reactivode Edrnan)

Pomi6n

y un peptido

C-terminal del peptido X

Porcibn

N-terminal del pbptido Y

Figura 5-32. Uso del peptido Z sobrepuesto para deducir que los pépttdos X y Y ectbn presentes en la proteina original enelom'enX~Y,noYtX.

La secuenciación de péptidos y de DNA son técnicas complementarias

metano

Una feniltiohidantolna y un peptido mds corto en un residuo

Figura 5-71. Reaccidn de Edman. El fenilisotiocianato reacciona con el amino-terminal de un residuo de un peptido para dar acido feniltiohidantotw El tratamiento con acido en un solvente hidroxilim libera una feniltiohidantoína la cual es identificada posteriormente mediante su movilidad crornatogrhfica y un phptido mas corto en un residuo. Entonces el proceso se repite

se separan por cromatografía bidimensional o por electroforesis y cromatografía (huellas dactilares). La visualizacidn con ninhidrina revela los piptidos mhs escasos en la digestión de protelna sin tratar y un pkptido adicional en la digestibn de proteina tratada. Con el conocimiento de la estructura primaria de estos péptidos, es posible inferir las posiciones de los puentes disulfuro.

Aunque la simplicidad y velocidad de la técnica de secuenciacibn del DNA (capítulo 42) ha revolucionado la forma en que se determinan las estructuras peptidicas; la secuenciación de péptidos y DNA son tecnicas complementarias más que mutuamente exclusivas, cada una con ciertas ventajas. En tanto que las estructuras primarias de las proteínas se pueden deducir mediante la secuenciación de los genes que Eas codifican, la secuenciacibn directa de las proteínas continúa siendo esencial para el anhlisis de su estructura. La secuenciación del DNA no puede mostrar la posición de los puentes disulfuro o la presencia de otras muchas modificaciones postraslacionales. Los codones triples y tas moléculas apropiadas de tRNA solo se encuentran disponibles para Eos 20 arninoacidos más comunes. Por tanto, la secuenciacjbn del DNA no puede revelar la presencia de propilo, hidroxilisil o un hutsped metilado, isoprentilado, fosforitado, esterifjcado u otros residuos aminoacilo postraslacionales modificados que efecttian funciones esenciales en proteinas especificas. Así, la técnica de Edman continuarii siendo fundamental para demostrar la determinación esrruct~ralde pkptidos y proteínas. Aunque la secuenciacibn de péptidos no presenta estas desventajas, muchos de ellos experimentan una o más modificaciones postraslación por procesamiento proteolítico. Por tanto, la secuenciacibn de DNA es una ayuda valiosa para detectar prepéptidos y prepropkptidos Ilibiles importantes en la cathlisis (capitulo 10) o en la sefializacibn de péptidos dirigidos a organelos subcelulares específicos.

La espectometria de masas puede utilizarse para secuenciar péptidos El bombardeo rápido de fitomos (BRA) unido a la espectrometria de masas (EM), en dos espectrómetros

de masa integrados. proporciona un camino alternativo para secuenciar péptidos con longitud de alrededor de 25 residuos. El bombardeo rápido por átomos de argon o xenbn, de los htomos de un péptido disuelto en glicerol forma un ibn pkptido con carga positiva. El primer espectt-ografo de masa limpia el ion gkptido de iones contaminantes, y luego lo transfiere a una celdilta en donde colisiona con atomos de helio. Debido a la energía que absorbe, el ion pkptido se fragmenta a partir de sus dos terminales con lo cual forma mliltiples iones de tamafío decreciente.Entoncw, en el segundo espectrómetro de masa se determina la masa molecular de estos fragmentos del ion. La comparacion de los iones de acuerdo con los incrementos sucesivos de masa,permite la identificación de todos los fragmentes aminoacilo y de la secuencia del péptido completo. La tkcnica BRA dirigida por computadora es muy rápida, no requiere pkptidos altamente purificados, identifica residuos modificados por traslacibn y, a diferencia de la tdcnica de Edman, puede cecuenciar péptidos cuyas terminales amino están bloqueadas (por ejemplo, aciladas). En comparación con los secuenciadores avanzados de Edman, las principales desventajas del BRA-EM son su alto costo y menor sensibilidad.

LOS PÉPTIDOS PUEDEN SINTETIZARSE MEDIANTE TECNICAS AUTOMATIZADAS Las péptidos que se obtienen mediante síntesis qulmica sirven como fArmacos o aditivos alimentarios. La capacidad para sintetizar conjuntos de peptidos similares, cuyas estnicturas primarias difieren sblo un poco, permite profundim en el conocimiento de la relacibn entre la estructura del péptido y la actividad bioldgica. La qufmica básica de la sintesis de los péptidos, desarrollada a fines del decenio de 1800 por el químico a l e m h Emil Fisisher, proporciona los elementos para la activaci6n de los grupos carboxilo y para la adición y eliminación de los grupos bloqueados, que evita reacciones colaterales indeseables. Muchos aAos despues, las tkcnicas de sintesis de los pbptidos fueron evolucionados por Bmce MerrifieEd (Premio Nobel 19841, quien desarrollb la síntesis en fase dlida. La tdcnica automeica de síntesis de Merrifield que produce ptptidos largos sintkticos en periodos cortos, inicib un renacimiento en la química de los péptidos.

Síntesis de peptidos en fase sólida La figura 5-1 3-muestrala sintesic de un dipéptido A-B representativo (en el cual A es la terminal m i n o y E

Figura 5-13, Representaubn sirnbblica de la sintesis de un dipéptido genérico por la técnica de fase s6Fida iniciada por MernReld Véase el texto para explicación de los simbolos.

la termina carboxito del residuo aminoacilo), rnediante la tkcnica en fase s6lida de Merrifield y resume las reacciones que se requieren para sintetizar un ptptido de cualquier tamaño deseado. Estos pasos son como sigue:

1) Proteger las terminales amino del aminohcido A (en blanco) y del arninoiicido B (en negro) con el grupo t-butiloxicnrboniIo (t-BOC) (m):

famando t-BOC-A y t-BOC-B. 2) Activar el gmpo carboxilo de t-BOC-B con diciclohexilcarbodiimida (DCC) (b):

48

3) Hacer reaccionar al grupo carboxilo del aminoácido A (que se convertírh en el residuo carboxilo4)

5)

6) 7)

(Capítulo 5)

Bioquimica de Hurper

terminal del peptido) con una resina activada de poliestireno insoluble @I Eliminar al grupo protector de r-BOC-A con ácido tnfluoroac&tico(TFA, F 3 C 4 0 0 N )a la temperatura ambiente. (Nota: En la prhctica, es posible omitir los pasos 3 y 4 puesto que ya se dispone en el comercio de resinas con cualquier aminoácido f-BOC conectado por un enlace éster a una moltcula "enlazadora" de fenilacetamidometilo, PAM, del inglks, p h e ~ lucetamidometkyí),adherida al pol iest ireno. Condensar el grupo carboxilo activado de t-BOCR con el grupo amino libre del inmovilizado A. Eliminar el grupo protector (d-BOC) con TFA (véase paso 4). Liberar el dipéptido A-13 de la particula de resina por tratamiento a -2 "C con hcido hidroflubico (HF) en diclorometano.

Los logros iniciales de la técnica de Merrifield fueron la síntesis de las cadenas A y B de inculina y de la enzima pancrektica ribonucleasa. Mejoras subsecuentes han reducido el tiempo para la sintesis y han incrementado el rendimiento de manera significativa. Esto ha abierto el campo para producir vacunas y hormonas polipeptldicas y aun puede pensarse en tratar errores congénitos del metabolismo seleccionados.

RESUMEN Los pkptidos, formados por la pérdida de agua entre los grupos carboxilo y amino de los aminohcidos, se designan de acuerdo al numero de aminoicidos presentes. Sus estructuras primarias (orden de aminoácidos listados desde la amino-terminal) determinan la actividad biológica y las conformaciones. Los péptidos

pequefios pueden contener enlaces diferentes a alfa-peptidilo y aminolcidos poco comunes. Como poiielectrblitos, los pkptidos se separan por crornatografia de intercambio iónico y técnicas electrofor&ticas. El carácter de doble ligadura parcial del enlace que une al carbono del COOH y al N de un péptido, hace que cuatro Iitomos del enlace peptidiw sean coplanares. Esto limita el numero de conformaciones peptidicas posibles. En solucibn. estas conformaciones son restringidas aún m8s por fuerzas no covalentes. Despuks de la hidrblisis Acida es posible deteminar la composición de los péptidos purificados, pero se requiere correccihn por perdida de ciertos aminolcidos. La determinacibn de la estructura primaria emplea tkcnicas de Edman automatizadas, que pueden realizar la secuenciacibn en cantidades tan pequefias de hasta microgramos de phptido purificado. Primero se oxidan o reducen los enlaces disuffuro. Las péptidos grandes se escinden en sitios raros con reactivos como CNBry los pkptidos resultantes se purifican por filtración en gel y CLAR. Luego pueden enlazarse por su terminal carboxilo a un soporte sólido para facilitar la secuenciacibn.Lar operaciones automáticas subsiguientes comprenden quimica de líquidos o reactivos y productos gaseosos que facilitan la recuperación y purificacibn de la muestra. Por lo general pueden secuenciarse hasta 40 residuos mino-tem inales sucesivos. Para definir el orden de ensamblaje de los ptptidos secuenciados en el polipéptido original. se determina la secuencia de péptidos sobrepuestos generados por diferentes ttcnicas de partición. De manera alterna, los enlaces entre péptidos pueden inferirse de la secuencia de DNA del gen apropiado. Por tanto, las tkcnicas de secuenciacion de DNA y péptidos son complementarias, no mutuamente excluyentes. Ademis, las tkcnicas automáticas permiten la síntesis inequívoca de pdptidos de estructura primaria conocida y actividad biol6gica completa..

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Proteínas: estructura y función Victor W Rodwell, PhD

dc vilaminas, oxígeno y bióxido de carbono, ademAs de

Las características comunes a todas las proteinas incluyen restricciones en su conformación por enlaces covalentes y no covalentes. En este capítulo 5e analizan las estructuras secundaria, terciaria y cuatemarfa de las proteínas. con énfasis en las fuerzas que estabilizan estos ordenes m& elevados de estructum y los metodos físico5 empleados para examinarlos. Los principales temas iiicluyeii hdlice alfa, hoja beta, giro beta y asa; el modo en que estas estructuras características secundarias Sorman dominios y estructuras terciarias; así como el ensamblado de polipiptidos en subunidades de proteinas multiméricas. Además, se examinan las vias propuestas para que las proteíiias se plieguen y el papel de las chaperoninas {proteinas acornpafiantes)y de otras proteinas accesorias que facilitan el rápido y correcto plegamiento in vnJo Las ~amcterísticn~ y comentarios mencionados antes generalmente son validos para todas aunque algunas proteinas especificas pueden mostrar estructuras secundarias y terciarias peculiares que Ies confieren propiedades para cumplir funciones biologicas también especifica. Se ilustra la estrecha vinciilacilin entre estructura y funci6n biolhgica de estas rnolt5culas mediante dos proteinas fibrosas que tienen funciones estructurales: la fibroina de la seda y el colageno. Los capitulos subsecuentes amplian esta estrecha reIaci6n al estudiar las proteinar globulares mioglobina y hemoglobiiia así como las proteínas catalíticas conocidas como eiizimas.

IMPORTANCIA BIOMEDICA Los millares de proteínas presentes en el cuerpo humano realizan funciones demasiado numerosas para enumerarlas. Entre ellas están: servir como portadores

llevar a cabo actividades estructurales, cineticas, cataliiicas y de señalización. Por tanto, no deben sorprender las terribles consecuencias que pueden surgir de mutaciones en genes que codifican proteínas o en regiones de DNA que controlan la expresibn genktica Asimismo, pueden derivar consecuencias igualmente desastrosas de la deficiencia de cofictores csenciales para la maduración de una proteína. El sindrome de EhlersDanlos ilustra defectos geneticos en la rnaduraciOn proteínica y el escorbuto la deficiencia de un coiactor esencial para esta maduracion.

LAS PROTE~NASSE CLASIFICAN EN NUMEROSAS FORMAS Si bien no existe un sistema universal, las proteínas pueden clasificarse con base en su solubilidad, forma, función biolbgica o estructura tridimensional. Un sistema de uso limitado en bioquimica clinica las clasifica como "albiiminas", "globulinas". "historias", etcétera, dependiendo de su solubilidad en soluciones salinas acuosas. Tambikn pueden clasificarse bashndose en su fonna global. Así, las proteinas globulares (por ejemplo, numerosas enzirnas) tienen cadenas polipeptidicas enrolladas, plegadas cn forma compacta y proporciones axiles (proporciones dc longitud a anchura) menores de 10 y que iio exceden de 3 a 4 por lo general. Las proteinas fibrosas tienen proporciones axiles mayores de 10 Las proteinas pueden clasiticarse según sus funciones bioIogicas en: cnzimar (deshidrogenasas, cinasas), proteinas de alrnacenainiento (ferritina, mioglobina), reguladoras (proteínas unidas a DNA, hormonas peptídicas), estructurales (colligeno, proteoglucanos), protectoras (factores de coagulación sanguínea, inrnu-

52

(Capitulo ti)

Bioquírnicu de Harper

noglobulinas), de transporte (hemoglobina, Iipoproteinas plasnihticas) y contráctiles o dotadas de motilidad (actina. tubilina). Sistemas especialiados de clasificacibn distinguen ciertas proteinas complejas de interés médico elevado. De este inodo, las lipoproteinas plasmhticas se denominan de "origen", lipoproteinas alfa,, alfaz o beta de acuerdo con su movilidad elemforéticaap1-I 8.6;o como quilomicrones, VLDI,, 1-DL, HDL o VHDL basándose en sus propiedades de sedimentación en una ultracentri fugación (figura 6- 1 ). Las lipoproteínas puedcn clasi ficarse tam bien por deteminacibn inmunol0gica dc las apopruteinas presentes (A, B, C, D, E, F). Asimismo. las semejanzas en la estructura tridimeiisional. reveladas principa2rnente por cristalografia con rayos X. proporcionan una base potencialmente valiosa para la clasificación de proteinas. Por ejemplo, las proteinas qiie unen nuclcótidos comparten un dominio fijador de nucleiitido de estructura terciaria.

ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria de la cadena polipeptidica de una proteína es el orden en el cual los aminoacidos se

unen e incluye la uhlcacidn de los enlaces bisulhro. La estructura primaria se determina por métodos descritos para polipkptidos en el capítulo S. El nbrnero de las secuencias conocidas de proteínas es tan grande y crece con tal rapidez que, en la actualidad, en vez de disponer de formas impresas, los datos de las secuencias se depositan en bases de datos electrhnicac de secuencias de proteinas a las cuales se puede tencr acceso a través de Internet. Las bases de datos importantes continuamente actualizadas inc lu yen EM R L (Europeun Molecu~ur13ioloa Laboraiory Oaia I,ibrary), GenBank (Genefic Sequence Dafabank), y PIK (Protein fdenllficdron Resource S~quenceDufuhuse).

ESTRUCTURA SECUNDARIA Configuración y conformación El tkrtnino "configuracion" se refiere a las relaciones gcométricas entre un conjunto dado de htomos, La interconversión de alternativas diferentes de configuracibn (por ejemplo, !a conversión de 0- a L-alanina) sulo se puede logmr rompiendo y restableciendo uniones covalentes. fl importante término similar "conformación " se refiere a la arquitectura tridirnensional de una proteína. las relaciones espaciales de todos los itomos entre sí. La interconversión de estructuras conformadas no implica la rotura de uniones covalentcs sino la rotura y restablecimiento de fuerzas no covalentes (puentes de hidrógeno, puentes salinos, interacciones hidr~fobas)que estabilizan una conformaci6n dada Incluso después de excluir las ~onfonnacionesque las interacciones estcricas impiden, la rotación libre alrededor de las dos terceras partes de las uniones covalentes dc la cadena principal de un polipéptido (figura 5-81 permite clasificar por etapas un gran númcro de conformaciones posibles para una proteína d e t e n i nada. Sin embargo, para una cierta proteina s61o un pequefío número de posibles conformaciones tienen significacibn biolbgica.

Diferentes fuenas que estabilizan las estructuras proteínicas Tama Ao

Más graride

Figura 6-1. Magnitud y densidad de distribucibn de las lipoproteínas (CHYLO. quilomicrones; VLDL, lrpoproteinas de muy baja densidad, LDL. Iipoproteinas de baja densidad, HDL, lipoproteínas de alta densidad; Lp [a], Iipoproteina [a]) (Reproducida con autorizacibn de Segrest JP y colaboradores The amphipathic alfa-helix A rnultrfundionalstructural motrf in plasma Itpoproteins Adv Protein Chem 1995;45 303)

Varías interacciones no covalentcs que individualmente son dgbiles, pero formidables en número. estabilizan la conformacion de una proteina. Estas fuenas incluyen puentes de hidrhgeno, interacciones hidrófobas, interacciones electrostáticas y f u e r m ~de van der Waals.

Puentes de hidrógeno En la superficie de las proteinas globulares por lo general se encuentran residuos con grupos R polares,

Proteinus: esfrucfuray función

los cuales forman puentes de hidrógeno principalmente con moléculas de agua. Por otra parte, los residuos aminoacilo del esqueleto carbhnico forman puentes de hidrogeno entre si.

Interacciones hidrófobas Las interacciones hidrófobas implican a los grupos R no polares de los residuos arninoacilo que en las proteínas globulares típicas residen en el interior de Ea proteína. La formación de interacciones hidrhfobas es "conducida por la entropia". Una forma esférica regular reduce al mínimo el área de supedcie. [,a concentracibnde residuos no polares en el interior de la proteína disminuye cI número de residuos superficiales e incrementa al m b u n o la oportunidad para que la pelicula superficial de moldculas de agua formen puentes dc hidrhgeno entre si, uii proceso relacionado con un incremeiito de la entropia. Por cI contrario, el ambiente no polar dc las membranas biológicas favorece a los residuos hidrófobos de la superficie. cuyos grupos R no polares participan en interacciones hidrlirobas con las cadenas laterales alquil de los ésteres acilgrasos de las bicapas de la membrana.

Interaccionec electrostáticas Las interacciones eiectrosthticac o puentes salinos se forman entre grupos con carga opuesta, como los gmpos terminales amino y carboxilo de los péptidos y los grupos R cagados de los residuos aminoacilos. Aunque todos los gmpos con carga forma1 tienden a localizarse sobre la supesficie las proteínas globulares, hay excepciones, pues existen grupos polares específicos ejecut a n t e ~de funciones biológicas indispensables, los cuales es posible que residan en hendiduras quc penetran hasta el interior de la proteína. 13uesto que los residuos polares también pueden participar en interacciones ihnicas, la presencia de sales como KCI puede disminuir de manera significativa las interacciones iónicas entre los residuos de la superfície.

Interacciones de las fuerzas de van der Waals Las fuerzas de van der Waals, que son sumamente dkbiles y sblo actúan a distancias extremadamente cortas, incluyen componentes de airaccihn y de repulsión. Las fuerzas de atraccibn implican interacción enve dipolos inducidos formados por las occilaciones instanthneas en la distribucion de electrones en los htomos cercanos. Las fuerzas repulsivas entran en juego cuando dos Atomos se aproximan tanto que sus orbitales electrónicoc se superponen. La distancia a la cual la fuerza de atracciciii es rnAxima y la fuerza de

53

repulsión es mínima se denomina distancia de contacto van der Waals. Los átomos tienen un radio van der Waals característico y la distancia de contacto óptima entre dos es la suma de sus radios van der Waals.

Uniones peptídicas que restringen las posibles conformaciones secundarias La rotacidn solo es posible alrededor de 2 de las 3 uniones covalentes que forman el esqueleto polipeptidico de las proteínas. El carhcter de doble unión parcial de la ligadura que unc el grupo carbonilo al nitrógeno alfa de la uniiin peptidíca restringe de manera significativa las confomaciones posibles de los átomos que la constituyen, la cual debe ser coplanar (figura 5-8). La rotación sólo puede darse alrededor de las unioncs entre eE carbón alfa (Cm) al carbbn carbonilo (C,) y al se nitrogeno. El ángulo alrededor de la unión C,-N denomina ángulo fi (m) y el que se encuentra alrededor de la unión C,-C, es el ingulo psi (Y). No e s t h permitidas las combinaciones de los IinguEos fi-psf qiie produ7can impedimento estérico entre los Atomos no s y unidos. Cuando se especifican todos los ~ g u l o fi psi, se conoce la conforrnaci6n de la totalidad de Atomos de la cadena principal o esqueleto de u n polipéptido. Por tanto, el anhlisis de los datos crista1ogr;ificos empieza con la deteminacilin de los principales ángulos fi y psi de la cadena. G.N. Ramachandran fue el primero en emplear una grhfica de los Angulos fi contra los ángulos psi para ilustrar tanto los valores permitidos como los numerosos, no permitidos (figura 61-21.Las combinaciones estéricamente permitidas caracterizan a la Ii&licealfa y a la hoja plegada beta y a la helice triple de colágeno w a l i ~ a d amás adelante.

Las conformaciones regulares e irregulares caracterizan a la estructura secundaria La conformacibn de los esqueletos polipeptidicos de las proteínas constituye su estructura secundaria. Al principio, la existencia de una estructura secundaria se propuso con bases exclusivamente teoricas, pero despuks los analisis cristalográficos de rayos X las confirmaron ampliamente. Los tipos de estructura secundaria esthn limitados por el carlicter de doble uni6n parcial de la unibn peptídica (figuras 5-7 y 5-8) y por el tarnaiio y la forma de los grupos R arninoácidos. Las estructuras secundarias incluyen, ademas de Ias unidades hélices alfa regulares repetitivas, las hojas beta y las incurvaciones beta con formaciones irregulares denominadas asas o bobinas.

Waals que pueden formar y estabilizar un tipo determinado de hdice. Las helices alfa tienen ángulos favorables fi y psi y un patrbn de uniones de hidriigeno que les conficre la máxima estabilidad. Las hklices alfa de proteínas contienen, en todas partes, de 4 a 50 residuos (en promedio cerca de 12 residuos). Los parametros relevantes de una helice-alfa (figura 6-3) son n = 3.6 residuos por vuelta y p = 0.54 nm (5.4 A). La distancia a 10 largo del eje de la hélice que separa htornos equivalentes en las cadenas principales, de los residuos adyacentes es de O. 15 nrn (1.5 A). Los grupos Rarninoacil se dirigen hacia afuera del eje de la hClice (figuras 6 4 y 6-51, lo cual reduce al mínimo la interferencia esterica.

Las uniones de hidrógeno y las f u e n a s de van der Waals estabilizan las hélices alfa

Q Figura 6-2. GrBfica de Ramachandrande 10s ángulac fi y pci de la cadena principal para 1000recidvos no giicina aproximadamente, en ocho proteinas cuyas estructuras fueron resueltas a resolución alta. Los puntos representan las mmbinaciones pemitidas y los espacios las combinaciones prohibidas de Bngulos fi-psi (Reproducida con autorización de Richardson JS. The anatomy and taxonomy of protein structures Adv Protein Chem 1981,34 167.)

Puesto que la hélice alfa es la confomacibn de menor Y más estable para una cadena de P ~ ~ ~ se forma de manera espontánea. La estabilidad de las

La hélice alfa Cuando se gira el esqueleto de iin polipeptido por una magnitud igual alrededor de cada carbón alfa, se forma una bobina o hélice. Los diferentes tipoc de hélices

formados cuando los giroc tienen dirección y extensibn diferentes se describen según el número (n) de residuos aminohcidos por vuelta y el paso Ip) o distancia por vuelta que la hélice se eleva alrededor de su eje. Las hélices polipeptidicas están formadas por aminoácidos quiraIes (estrwcturas que no pueden superponer su imagen en espejo, como las manos) y por tanto muestran quiralismo -o sea, son hélices con giros hacia Ea derecha o hacia la izquierda. Para visualizar una hElice derecha, se debe mantener la mano derecha con la palma hacia arriba, los dedos ligeramente curvados y el pulgar apuntando alejándose de uno mismo. El pulgar sefiala en la dirección del carboxilo terminal del polipeptido de hélice derecha, el cual avanza en la dirección de los dedos curvados. Aunque los polipéptidos sinteticos de D-aminoácidos pueden furmar hélices izquierdas, la interferencia estérica de los grupos R de los residuos L-arninoacilos determina que las hélices izquierdas no pueden tener lugar en las proteinas. Idos tipos de hilices polipeptidicas presentes en las proteinas, además están limitadas por factores cstéricos adicionales y por el numero de posibles puentes de hidrógeno e interacciones de van der

------ - -

I

0 54-nm paso (3 6 residuos)

1

- --

1 - -0 -1 5-n m- -

t

Figura 6-3. Orientacibn de átomos de la cadena principal de

u n peptido alrededor del eje de una h8lice alfa

P

Figura 6 6 . Vista superior del eje de una hélice alfa Las cadenas laterales (R) están en el exterior de la hélice Los radios de van der Waals de los Atomos son mas grandes que los mostrados aqui; por tanto. casi no hay espacio libre en el interior de la hélice (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacion de Stryer L Biochernistry, 2a ed Freeman, 1981. Copyright 1995 por W H Freeman y Cia.)

mente encaja en la primera vuelta de una hélice alfa En otro puiito produce una incurvación. Sin embargo, n o todas las incurvaciones en las hélices alfa son causadas por residuos prolilo. Las curvaturas también tienen lugar con frecuencia eii los residuos GIi. Figura 6-4. Puentes de hidrógeno (puntos) formados entre Alomos de H y O estabilizan un polipeptido en una conformación alfa helicoidal (Reimpreso con autorización de Haggrs GH y colaboradores Introducfronto Molecular Brology Wiley, 1964 )

hélices alfa se debe principalmente a la formación del máximo número posible de puentes de hidrúgeno. Los nitrógenos peptidicos actúan como donadores de hidrhgcno, y el oxigeno del carbonilo del cuarto residiio en linea posterior cn un sentido estructural primario actúa corno aceptador de hidrógeno (figura 6-4). Estos puentes de hidrógeno tienen una distancia N-a-O practicamente óptima dc 20 nm (2.8 A). Las interacciones van der Waals tambitn confieren mayor estabilidad, pues los átomos firmemente empaquetados en el núcleo de una hélice alfa están en contacto van der Waals con otros a través del eje de la helice alfa.

La prolina puede doblar una hélice alfa En las hélices alfa son residuosmas comunes Ala, Glu, Leu y Met que Gli, Pro, Ser, o Tir. Sin embargo, esta tendencia no es util para proncisticos cstructuraIes. Puesto que el nitrbieno pcptidico de un residuo proilo, no puede I'orrnar un pucn te tle tiidrógeno, la psoliaa sola-

Las hélices alfa pueden ser anfipáticas Aunque por lo común, las hClices alfa se encuentran en la superficie dc las proteinas, también pueden estar total o parcialmente integradas en el interior de una proteína La hélicc antipática, un caso especial en el cual los residuos alternan entre hidroSbbicos e hidrofilicos casi cada 3 o 4 residuos (figura 6 4 ) , tienc lugar donde las helices alfa forman interfase con un ambientc al mismo tiempo polar y no polar. Aiiinisrno, las hélices anfipáticas sc presentan en las lipoproteinas plasrnaticas y en ciertas hormonas polipí.ptjdas, venenos, antibihticos, glucoproteinas del virus de la inrnunodeficiencia humana y en proteínas cinasa reguladas por calmodulina.

Los aminoácidos de diferentes regiones forman hojas beta La segunda conforn~aciónregular, presente en la mayor parte de las proteinas, es la hoja plegada-beta. Se le llama beta porque fue la segunda estructura regular descrita. Por su parte, el término "110,ja plegada" describe su aspecto cuando se le obscrva con el borde hacia arriba. Los carbones alfa y sus grupos R relacionados alternati entre un plano ligeramente arriba

56

Bioquimica de Hurper

Figura 6-6, Representaciónespiral de aminoAcrdos en una hélrce alfa anfipLtica. Las hkiicec de las apolipoproteínas plasrn$ticas son anfrpSticas: es decir, una cara es polar y la otra no polar. Los residuos están gratificados con 100" de separación (360°13.6 residuos = 100" por residuo) mirando hacia abajo del eje de la hblice Los círculos negros representan residuos no polares y los circulos blancos, residuos polares.

y otro ligeramente abajo de la cadena principal del polipeptido (figura 6-71, Como las hklices alfa, las hojas beta tienen aningulos fi y psi repetitivos, estabilizados con el máximo número posible de uniones de hidrogeno. Los polipéptidos se alinean a lo largo, uno d e t r h de otro, y estan estabilizados por puentes de hidrógeno que se forman entre los hidrbgenos de los pbptidos nitrogenados y los de los carbonilos oxigenados de tiras adyacentes. Sin embargo, aunque las hklíces alfa contienen residuos adyacentes en un sentido estructural primario, las hojas beta implican t~amos de 5 a 10 arninoacidos de diferentes regiones estructurales primarias. A diferencia de las helices alfa compactas, el esqueleto peptidico de una hoja beta esti casi por completo extendido.

Las hojas beta plegadas pueden ser paralelas o antiparalelas La figura 6-7 ilustra tiras antiparalelas de laminas beta plegadas. Las cadenas adyacentes de polipkptidos de una lámina antiparalela proceden en direcciones opuestas; aquellas de láminas paralelas, en Ea misma direcciiin. Todos los posibles puentes de hidrbgeno se forman excepto para las tiras de los flancos (figura 6-81. Para estabilizar las hojas antiparalelas se en-

(Capítulo 6)

Figura 6-7. Modelo de una hoja plegada beta antiparalela. Tiras adyacentes corren en direccionesopuestas (veanse las flechas) Los grupos R se localizan arriba y abajo del plano de la hoja. Nbtese que los carbonos alfa sucesivos se localizan justo arriba y abajo de este plano, dando un efecto plegado. Los puentes de hidrogeno agrupados por pares estabilizan la conformación de hoja beta En hojas plegadas paralelas (no mostradas), las cadenas adyacentes corren en la misma dirección.

cuentran ubicadas de manera estrecha y amplia, pares alternos de puentes de hidrdgeno. Los puentes de hidrogeno que estabilizan cordones paralelos están regularmente espaciados pero angulados transversalmente a travks de las tiras. Casi todo los cordones de láminas beta están girados en el sentido de la mano derecha. Estos cordones girados de I h i n a s beta forman el núcleo central de muchas proteinas globulares. Una lámina beta puede estar conformada pw 2 a 15 cordones y son comunes las regiones donde hay laminas mixtas paralelas y antiparalelas. Qui7.á por SU estabilidad algo menor, las lhminas beta paralelas de cinco cordones son un poco más raras.

Las regiones en asa forman sitios de unión de antígenos

Más o menos la mitad de los residuos en una proteína globular típica se presentan en forma de h6Iices alfa o hojas beta. El recto reside en conformaciones "asa" o "bobina" que, aunque ordenadas de manera irregular no tienen menor importancia biolligica que las esiructuras secundarias regularmente ordenadas. Las asas o bobinas no se deben confundir con "bobinas al m",un término que describe las conformaciones desordenadas y con menos importanciabiológica de las proteinas desnaturalizadas. Regiones en asa de tamaiio y forma variables constituyen una de las principales carac-

Estas vueltas invertidas o incuracioncs beta, afectan cuatro residuos unidos por puentes de hidrbgeno era varias formas y se presentan de manera primaria en la superficie de las proteínas.

Las proteinas pueden contener regiones desordenadas Nonecesariamente todos los residuos se presentan como estructuras con ordenamiento secundario. Hay regiones especificas en muchas proteinas que tienen abundantes confomaciones en solucion, por lo que se presentan en verdad desordenadas Los ejemplos incluyen los grupos U largos de los residuos Lis y porciones de los amino o carboxilo terminales de muchos polipéptidos. Este desorden significa flexibilidad y puede decempefíar un papel biológico vital. Por otra parte, muchas regiones desordenadas pueden llegar a ser ordenadas cuando se les une un ligando especifico. Un caso común es la estabilizacibn de las regiones desordenadas de los centros cataliticos de muchas enzimtls cuando se unen a un ligando. Figura 6 4 . Distancia y ángulos de unibn de los puentes de hidrógeno entre hojas beta plegadas paralelas y antiparalelas Las flechas indican la dirección de cada tira. Los Atomos de nitrágeno alfa donadores de hidrógeno se muestran con eirculos azules. Para mayor claridad en la presentacidn, se omitieron los grupos R y los hidrógenos alfa. Arriba: Hojas beta antiparalelas. Los pares de puentes de hidrógeno alternan entre pares muy próximos y pares muy separados y esthn orientados en dirección perpendicular aproximada al esqueleto polipeptldico. Abajo: Hoja beta paralela Los puentes de hidrbgano están regularmente espaciados, pero oblicuos en direcciones alternas.

teristicas de superficie de las proteinas. Cuando se exponen a solventes, ricos en residuos cargados y polares, pero que carecen de estructura regular secundaria, las asas en gancho u horquilla se conectan con las hojas beta adyacentes antiparalelas. Con Erecuencia, el sitio para interacciones ligando, regiones de asa de estructura primaria y longitud variables forman los sitios de unibn de antigenos en los anticuerpos.

Las proteinas globulares contienen giros beta El cwActer compacto de las proteinas globulares se debe a mAs o menos 20 tramos rectos de residuos unidos por regiones de polisacáridos que bruscamente cambian de direccibn. Las tiras de hojas beta están conectadas por regiones de poliptptidos que, si son lo bastante largos, con frecuencia contienen hélices alfa.

ESTRUCTURA TERCIARIA

Los diagramas esquemáticos simplifican la esttuctura de las proteínas El alto contenido de informacibn de los diagramas o modelos en donde se incluyen todos los atomos de una proteína, dificulta el estudio de las características totales de la estructura proteinica. En consecuencia, empleamos representaciones simplificadas de manera convencional para exhibir las caracteristicas estructurales. Los símbolos qtie se emplean son cilindros para hélices alfa, flechas anchas para tiras beta y cordones semejantes a listones para las demas estructuras como asas y hojas beta.

Las estructuras secundarias pueden formar tipos supersecundarios En muchas proteínas globulares, las formas estmcturales secundarias de una hClice alfa o de una hoja beta plegada forman tipos reconocibles "supercecundanas". La figura 6-9 ejemplifica varios tipos supersecundarias: beta-alfa-beta, dos tiras de hoja beta conectados por una hdlice alfa; la horquilla o gancho beta, compuesta de hojas antiparalelas beta conectadas por una region corta de asa; y el motivo o figura "llave griega", asi denominada porque recuerda un motivo decorativo de un vaso griego antiguo. Las repeticiones de estas figuras supersecundarias pueden

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(Capitulo 6)

Uinqzdímica de Hut-per

maneras en las cuales las proteínas plegadas pueden reunir aminoácidos separados en un sentido estriictural primario y los enlaces que estabilizan estas confbrmacicincs.

Los polipeptidos grandes tienen dominios distintos Figura 6-9. Figuras supersecundarias Las hélices alfa y hojas plegadas beta de numerosas proteínas globulares estan ordenadas en untdades repetidas como las figuras supersecundarias d e clave griega (izquierda) o ~eta-alfabeta (derecha)

entonces formar estructuras como las unidades regularmente repetitivas beta-alfa-beta de toda una proteína (figura 6-1 0). El teririino "estructura terciaria" se refiere a las relaciones espaciales entre los elementos estructurales secundarios, [,as estructuras secundarias y s u p e r w cundarias de una proteina grande casi siempre están organizadas coma dominios -unidades compactas conectadas por el esqueleto polipeptidico. Por lo gcneral, el plegamiento de un polipéptido dentro de un dominio se prodiice dc mancra indcpcndienic del plcgamierito en otrni domiiiicis. Idas cstructiiras terciarias describen las relaciones entre estos dominios, las

La estructiira seciindaria-terciaria, en particular de lor polipeptidos grandes, se puede organizar en unidadcs relativamente independientes. pero estmcturaimente conectadas llamadas dominios, Ios cuales con frecuencia ejecutan funciones discretas tales como la unibn con ligandos específicos. Por su parte, los lipandos pucdcn cntrar en contacto con residuos formados de modo exclusivo por un solo dominio. Alternativamente. un ligando puede establecer contacto con residuos de más de un dominio y así residir rn la interfase entre los dominios. Por otro Eado, en las proteina~multimericas, los residuos de los dominios de diferente? subunidades pueden enlazarse con ligandos como las coenzimas en las interfases con subunidades cuyas superficies de contacto se derivan de residuos proccdentes de suburiidades diferentes.

Los enlaces electrostáticos unen los residuos de superficie Los enlaces salinos (electrosthticos) unen grupos R con carga opuesta de residuos y grupos al fa con carga de residuos terminales C y N. Por ejemplo, el grupa R de Lis (a pH fisiolhgico, carga neta + 1 ) y de aspartato o glutamato (carga neta -1 ), puede interactuar por fuerzas electrostáticas para estabilizar proteínas.

Las uniones de disulfuro confieren estabilidad adicional Además de los enlaces pcptidicoc, se pueden formar ~ i n i i ~ n c(IisuIfu h ni covalentes entre residuos de cfsteína presentes en el mismo o cn un polipéptido diferente. Estas uniones disulfuro confieren estabilidad adicional a la conformación especifica de proteínas tales como enzirnas (como la ribonucleasa) y proteínas estmcturales (ES el caso de la queratina).

lnteaacciones hidrofobas enlazan residuos interiores

Las cadenas laterales no polares de los aminoicidos Figura 6-1 0. Estructura terciaria. Triosa fosfato isornerasa, mostrada en una vista de frente, está constituida por cuatro beta-alfa-beta consecutivasen los dos sentidos estruciurales primario y terciario (Cortesia de 3 Richardson )

confluyen en el interior de las protelnas globulares. Estas uniones son individualmente muy debiles y no son estequiom&tricas. Su gran numero, sin embargo, determina su importancia para mantener la estructura de la proteina.

Proteínas: esfructura yfunción

La cristalografía con rayos X muestra la estructura secundaria y terciaria Los rayos X dirigidos a un cristal de proteína y de un derivado que contiene un metal pesado agregado, son dispersados en patrones que dependen de Ias densidades electrbnicac en diferentes partes de la proteína. Idos datos, obtenidos de placas rotográficas o detectores de área unidos a computadoras, se analizan por mitodos matemhticoc, se traducen a mapas de densidad electrónica y se emplean para construir modelos tridimensionalcs generados por computación. Aunque consume tiempo, es costosa y requiere personal adiestrado, la cristalografía con rayos X ha revelado vistas tridimensionaIes detalladas de mhs dc 1000 proteinas. Sus contribucio~iesa la comprensión de la estructura proteínica apenas pueden sobreenfatizarse. Las imágenes por resonancia magnética ORM), se han usado para resolver la estructura tridimensional de ciertas proteínas pequcfías y parece que es prometedora para aplicarse a proteinas de mayor tamaño.

Las bases de datos y los programas de computación perfeccionados facilitan el estudio y la manipulación de la estructura de las proteínas Un resumen coordinado de todor los Atomas de las proteínas cuyas estructuras se han determinado mediante cristalografia con rayos X es accesible a travCs de Intemet procedente de bases de datos eIectr0nicas. Estas coordinaciones pueden cargarse y enlazarse con programas de compuración perfeccionados -muchos del dominio públicc- que permiten generar y manipular modelos sobre la pantalla, girarlos en todas dirccciones, añadir o sustraer radicales, dominios o ligandos, cambiar ángulos de unión, etcétera en muchos casos utilizando simplemente una computadora personal Pentium.

ESTRUCTURA CUATERNARIA

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Las proteinas compuestas de 2 o 4 siibunidades sc denominan proteínas bimiricas o tetramtricas, respectivamente. Las hornodimeras, hornotetrámeras, etcétera, consisten en subunidades identicas; mientras que las IieterooligomCricas, de subunidades distintac. Las subunidades diferentes de proteinas heterooligoméricas ejecutan de manera tipica funciones discretas. Una subunidad o un conjunto de subunidades idénticas, puede efectuar una funcion catalítica; en tanto que otro conjunto de subunidades, se encargaria del reconocimiento de ligando0 tendría un papel regulador. Las diferentes orientaciones en el espacio de las subunidades les confiere propiedades diferentes en relación con el oligómero y permite a las proteínas multimkricas desempefiar papeles peculiares en la regulación intracelular.

Los desnaturalizantes de proteínas destruyen su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria Los reactivos como la urca, el dodecilsulfato de sodio (SDS), los bcidos ddbiles (H') y las bases débiles (OH-), rompen los puentes de hidrógeno, enlaces hidrbfobos y electrostáticos {peso no los enlaces peptidicos ni los puentes disulfuro). Por tanto, destruyen todos los 6rdenes de las proteinas, excepto su estruchrra primaria, y anulan su actividad biológica (figura 6-1 1)

Los métodos físicos determinan el peco molecular y la estructura cuatemaria La determinacion de la estructura cuaternaria de las proteínas oligoméricas comprende la identificación del número y clase de protómeros presentes, su orientación mutua y las interacciones que los unen. Si se prueba que los oligómeros no experimenten desnaturalizacion durante el procedimiento usado para determinar el peso molecular (PM), numerosos métodos pueden dar información de esta propiedad. Estas mismas técnicas pueden utilizarse para determinar el PM de los protómeros si primero se desnaturaliza el oligómero.

Las proteínas oligoméricas tienen cadenas polipeptidicas múltiples Se dice que las protehas que contienen dos o mas cadenas de polipbptidos unidos por fuerzas no covalentes muestran una estructura cuaternaria. En estas proteinas multiméricas, las cadenas polipeptidicas individuales se llaman protómeros o subunidades. Los puentes de hidrbgeno y las uniones electrostaticas formadas entre los residuos de superficie en unidades adyacentes estabilizan la unibn de las subunidades.

Enzima activa (nativa)

u

Enzima inactiva (desnaturalizada)

Figura 6-1 l.Representaeibn de la desnaturalizacibn de un iprotbmero.

A. Ultracentri fugaclon analítica Este procedimicnto. desarrollado por Svederg. mide Ea velocidad a la cual una proteina se scdimenta en un campo gravitacional de alrededor de 10' x R. Esta tkcnica física, excelente para la determinación de pesos moleculares. ha sido reemplazada en años recientes por métodos menos complejos.

B. Centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa Esta tecnica, análoga a la anterior, se aplica mejor a proteinas globulares. Las proteinas esthndares y las desconocidas se estratifican en un gradiente de sacarosa amortiguada de 5 a 20%, preparada por congeIación-descongelaci6n repetida de sacarosa a 20 por ciento. Después de centrifugar toda la noche a 10' x g, el contenido del tubo se retira en fracciones y se analiza la proteína contenida en cada fracción. La movilidad de la proteina desconocida se expresa en relación con la de estandares de PM conocido, luego se computa y se calcula su PM

C. Filtración en gel Coliimnas de Sephadex o matrices semejantes, que tienen "poros" de tamaño promedio definido, se calibran usando proteinas de PM conocido. Luego, el PM de una proteina desconocida se calcula de su posicibn en la elucidn, relativa a estos estándares. Puede haber errores importantes si la proteina es muy asimétrica o interactúa fuertemente con el material del que se ha manufacturado el filtro molecuIar.

D. Electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA) Proteínas desconocidas y esihndar se separan por electroforesis en gelcs de acrilamida con 5 a 15% de enlaces cruzados de diversa porosidad, que luego se tifien para la visualizacibn de la proteína usando colorante azul de Coomassie o Ag'. Para utilizar la tkcnica de EGPA-SDS, las proteinas oligomtricas se desnaturalizan primero hirviéndolas en presencia de betamercaptoetanol y el detergente ionico con carganegativa dodecilsulfato sbdico (SDS). Las proteinas desnaturalizadas, que quedan recubiertas con SDS en su totalidad y por tanto con carga negativa, se separan con base en su tamafio (no en su carga) por EGPA-SDS en geles que contienen SDS,

E. El microscopio electrónico visualiza complejos macromoleculares El microscopio electrbnico, que puede amplificar hasta 100 000 diiimetros, permite observar particulas virales, complejos~enzim~ticos, protelnas oligoméricns y oligbmeros de PM elevado.

CÓMOSE PLIEGAN LAS PROTE~NAS ¿Cómo puede un polipkptido plegarse en sus estados fisiolbgicos nativos en una fraccibn de segundo? Todavía no hay respuestas definitivas disponibles por lo que esta pregunta sigue siendo objeto de investigacihn activa. Sin embargo, pueden observarse algunos principios generales. El pIegamiento no puede proceder a traves de un enfoque "de búsqueda al azar"',es decir, que implique la exploracibn de todas las conformaciones posibles en la ruta hacia su estado nativo. Aun para polipéptidos comparativamente pequeños, jel plegamiento a travts de una via de búsqueda al azar requeriría no segundos sino un periodo mayor que el estimado para la edad del universo! Es claro que el plegamiento debe ser un proceso más altamente dirigido que implica vias intermedias muy conocidas entre el estado presentc y el estado fisiolbgico normal.

Principios generales Con base en el conocimiento actual, el plegamiento de los polipéptidos y de las proteínas multimGricas parece invoIucrar las siguientes etapas. Primero se forman tramos cortos de estnictura secundaria -re,-oiones de hCIices alfa, hojas beta, giros beta, etcétera. La difusión dirigida hace crecer estos tramos cortos y conduce en últiino termino a un dominio. En las proteinas de múltiples dominios, los dominios plegados se reunen para formar el denominado "glbbulo fundido" que tiene una estnictura secundaria extensa pero muy poca estructura terciaria ordenada. Los cambios de conformación exitosos convierten el gl6bulo fundido en una forma compacta con una estructura terciariaordenada. Por su parte los cambios menores de la conformación entonces, conducen a una estructura polipéptida original. Para las proteinas monomeras, el proceso de plegamiento ya en este momento es completo, mientms que, para proteínas con estructura cuaternaria, estos polipéptidos ordenados sirven como subunidades que se reúnen para formar multimeros.

Las proteínas desnaturalizadas pueden volver a naturalizarse Muchas proteinas desnaturalizadas se vuelven a plegar esponthneamente in v~trocon el restablecimiento subsecuente de su actividad biológica. Esto condujo a Anfinsen a concluir que la estructura primaria de los poliptptidos era en si misma suficiente para dirigir y orientar los plegarnientos de las protehas. Sin embargo, el repliegue espontán~otoma horas, lo cual es mucho más de lo necesario para explicar el plegamiento de las proreinas in vitro. La conclusilin de Anfisen de que Pa estructura primaria dirige el ple-

Proreinas: estructura y función

gamiento in vrvo todavía es vhlida, pero requiere modificaciones para incorporar la participacidn de las proteínas accesorias, las cuales aceleran el proceso de plegamiento y lo guían a lo largo de vías específicas. Estas proteinas incluyen las disulfuro isomerasa, proli-cis-frans-isomerasay las chaperoninas.

Proteina dicu lfuro isomerasa

[,as uniones disulfuro (-S-S-, o cistina) se fonrian bajo condiciones de oxidacidn dentro y entre los polipkptidos y estabilizan tanto la estructura secundaria como la terciaria. Un residuo cisteinil dado puede, sin embargo, formar muchos pares de enlaces, disulfuro diferentes, los cuales sólo uno es apropiado para el plegamiento biológico correcto. La proteina enzimática disulfuro isomerasa facilita el "barajeo" de las uniones -S-Sporque acelera el Indice al cual los disulfuros sufren intercambio neto y, por tanto, aumenta la velocidad de todo el proceso de plegamiento.

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cual se pueden acomodar polip&ptidosgrandes. Las chaperoninas favorecen la? vías que inhiben las interacciones inapropiadas entre superficies complementarias y facilitan las apropiadas. Sin embargo, todavia no se comprende bien el mecanismo mediante el cual las chaperoninas logran esto. Las chaperonhas incluyen las proteínas Hsp60 de choque tkrmino elaborada por las bacterias o los cloroplastos en respuesta a una elevación termica, la cual revierte la desnaturalizacidn y agregacibn de las proteínas que se produce a temperaturas elevadas. Las 14 subunidades idénticas de las proteínas HsplO y Hsp60, GroES y GroEL de E. coli y Cpn 10 y Cpn60 de ¡os cloroplastos-forman parejas de anillos de siete subunidades que rodean una espaciosa cavidad central en la cual se pueden acomodar polipéptidos grandes. Este ambiente protector contrarresta la tendencia de las regiones hidrrifobas expuestas a solventes de los polipCptidos parcialmente pegados o desnaturalizados a autorseunirse y formar agregados insolubles.

Prolil cís-trans isomerasa

LA FORMA DETERMINA LA FUNCIÓN

La configuraci6n de las uniones pdptido X-pro de los poIipéptidos recibn sintentizados es trans, pero mQs de 10% de las uniones X-pro de las proteinas maduras tienen coiifiguración cts. La enzima isomerasa prolil cis-fruns caializa esta isomerizacihn y, por tanto, facilita el proceso de plegamiento (figura 6-12).

El examen minucioso de proteínas representativas ilustra no sblo las estructuras únicas que han evolucionado para cumplir con funciones biologicas especificas sino también el estrecho nexo entre estructura proteinica y funcion biológica. La mayoría de las proteinas fibrosas desempefían funciones estructurales en piel, cejido conjuntiva o fibras como cabellos, seda o lana. Las secuencias atipicas de aminohcidos en las proteínas fibrosas definen estruchiras secundarias-terciarias especificas que confieren propiedades mecánica específicas.

Chaperonas maleculares Las chaperonas moleculares de bacterias, mitocondrias y cloroplastos son proteínas grandes de múltiples subunidades que aceleran el proceso de plegamiento porque suminism un ambiente protegido cuando los p lipéptidos se pliegan en sus conformaciones nativas para formar estructuras cuaternarias. Las chaperoninas incluyen las proteinas de choque térmico cuya estructura consta de dos anillos de subunidades idknticas dispuestas alrededor de un espacio central en el

Figura 6-1 t. lsornerizaeibn del enlace peptídiw prolil N-alfa1 de una configuración cis a una trans relacionada can el esqueleto del polipbptido.

Las fueizas hidrófobas estabilizan la hoja beta de la fibroína de la seda La fibroína de la seda, una proteína de un insecto, ilustra la estabilizacibn de una estructura secundaria por medio de fuerzas diferentes de los puentes de hidrbgeno. La composición de los aminoAcidos de la fibroina consiste casi por completo (85%) de residuos Gli que alternan con residuos Ala o Ser. Las cadenas plipeptidicas de Eibroina forman arreglos de hojas beta antiparalelas, en las cuales los gmpos R de residuos Gli (hidrbgeno} se extienden desde una superficie y los grupos R de Ala o Ser de la o m . Estos arreglos esthn estabilizados exclusivamente por interacciones hidrófobas enee los gmpos Rde Gli sobre una superficie y entre los grupos R de Gli o Ser de la otra. Pequetras cantidades de residuos como Val o Tir con gmpos R voluminosos aparecen con periodicidad e interrumpen las regiones de hojas beta y le confieren un poco

(Capitulo 6)

de flexibilidad. Regiones largas de fibroina estrechamente empaquetada, casi completamente extendidas en hojas antiparatelas beta resisten el estiramiento. pero todavía son muy flexibles debido al caracter no direccional de las fuerzas hidrófobas estabilizantes.

Estructura secundaria de las proteinas fibrosas La esrructura secundaria de las proteínas fibrosas, incluyendo las de la piel, tendbn, hueso y músculo que tienen funciones esmcturales protectoras y de motilidad, muestran caracteristiczs estructurales que contrastan notablemente con las de las proteínas globulares. A continuación se analiza la estructura secundaria de la proteina mas abundante de los mamíferos, la colhgena.

La colágena ejemplifica diversas relaciones entre estructura y función Las colagenas, que comprenden casi 25% del total de las proteinas de un mamífero, ilustran de manera notable las diversas relaciones entre estructura y función que caracterizan a las proteinas Eibrosas de tos vertebrados. La colagena de los tendones forma estructuras muy asimdtricas de fuerza tensil elevada; mientras que de la piel forma tramos laxos y fibras flexibles. Por su parte, la colagena de las regiones d u r a de los dientes y de [os huesos contiene hidroxiapatita, un polimero de fosfato de calcio. Finalmente, en la córnea del ojo está ordenada de manera casi cristalina y es transparente.

La tropocolágena es una molécula de triple hélice rica en Gli, Pro y Hip La tropocolágena consiste en tres cadenas de polipéptidos con 1000 residuos aproximadamente, organizadas como una Iidlice no alfa izquierda que tiene alrededor de tres residuos por giro. Tres hklices izquierdas se giran para formar una triple hdlice derecha o una superespiral, estabilizada con puentes de hidrdgeno formados entre (no dentro, como en la hdlice alfa) las cadenas individuales de polip6ptidos (figura 57-1). Esta triple superespiral helicoidal es sumamente fuerte. La superespiral resiste la distorsión debido a que sus tres polipéptidos están en espirales con direcciones opuestas, un principio que también se usa en los cables de acero para suspender puentes. Las fibras de colhgena maduras altamente asimbtricas miden 1.5 nm por casi 300 nm, lo cual refleja su conformacibn extendida estable.

Cada tercer residuo es glicina La figura estructural primaria de la colagena madura es (Gli-X-ProtHip),,. Cada tercer residuo es glicina, el único residuo con un grupo R lo bastante pequeño para encajarse dentro del núcleo central de la superhdlice. Cada glicina está precedida por un residuo prolil o hidroxiprolil. La repulsibn mutua entre los residuos prolil obliga al polipeptido a formar una hklice extendida con giro a la izquierda. Los residuos prolil e hidroxiproli1 son inflexibles en su conformaciún y confieren rigidez.

Muchas modificaciones postraslacionales caracterizan la maduración de la procolagena A diferencia de las superhelices de la colágena madura, las terminales carboxiI y m i n o del precursor de la mlágena procolagena tienen una composicibn de aminoácidos típica de una proteina globular. Durante la maduración de la procolhgena, estas extensiones terminales carboxilo y amino se retiran medianteproteólisis selectiva. Las modificaciones adicionales postraslacionales implican hidroxilacibn, oxidación, condensación de aldol, reducci6n y glucosiIación. La hidroxilacion de los residuos prolil y lisil es catalizadapor laproIiIhidroxiIasa y Iisilhidroxilasa, enzimas que requieren ácido ascorbico (vitamina C). Entonces, los residuos hidrosilil específicos son glucosilados por las transferasas galactosil y glucosil.

Los enlaces covalentes cruzados estabilizan las fibras de la colagena Las cadenas de tropocolAgena se reúnen para formar rnicrofibrillas de coIhgena. Al principio, las estabilizan puentes de hidrógeno dentro de la cadena y despuks, por enlaces covalentes formados entre y en el interior de las hdlices. Este proceso implica la participación de la enzima oxidasa lisil que requiere cobre, la cual convierte los grupos no alfa amino a de los residuos Iisil e hidroxil en aldehidos. A continuación estos aldehidos sufren una condensación aldol o se condensan con los grupos amino no alfa de la lisina o la hidroxilisina para formar bases Schiff. La reduccibn subsecuente foma enlaces covalentes cruzados estables que confieren una gran fuerza tensil.

Trastornos nutricionales y genéticos que pueden involucrar estructuras secundarias deficientes La importancia mddica de la estructura secundaria estable está ampliamente documentada por los trastor-

Proteinm. estructuru y función

nos de la biosintesis y maduracibn de la tropocolhgena. En la insuficiencia grave de vitamina C, las hidroxilasas prolil y iisil son inactivas, y la tropocolágena no puede sufrir las reacciones para f o m a r enlaces covalentes cruzados. Como consecuencia se produce el escorbuto, una enfermedad nutricional caracterizada clínicamente por sangrado dc las encías, deticiente cicatrización de las heridas y, en último término, la muerte. De mancra similar, la enfermedad de Menkes que se distingue por el pelo ensortijado y retardo del crecimiento. refleja una defíciencia en la dieta respecto a la IisiIoxidasa que requiere cnbrc. Los trastornos geneticos de la biosintesis de la colágena incluyen varias formas de osteogénesis imperfecta que, en clinica, se caracteriza por la fragilidad de los huesos, Además, pueden producirse formas geneticamente distinhs de la enfermedad, causadas por defectos en diferentes genes de la biosintesis de coIágena. De manera similar, varios tipos del sindrome de Ehlers-Ilanlos se distinguen clinicamente por articulaciones desplazadas y anomalias de la piel que muestran defectos eii los genes que codifican procolágeiiaalfa,. procoihgcna N-peptidasa, o l isi l hidroxilasa (capitulo 57)

RESUMEN Las caracterlsticas estructurales de las protehas se consideran bajo cuatro órdenes: primario, secundario, terciario y cuaternario (para proteínas oligoméricas'). La estructura primaria, secuencia de aminoácidos y ubicación única de cualquier puente disulfuro, está codificada en los genes. Las estructuras secundaria y terciaria, que conciernen a conformaciones proteíni-

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cas permitidas por los enlaces peptídicos, son dictadas Dor la estructura nrimaria. La estructura secundaria hescribe el plegaAiento de cadenas polipeptidicas en figuras unidas por pucntes de hidrbgeno rnuftiples como helice alfa y hoja plegada beta. Luego, combinaciones de estos motivos pueden f o m a r estructura^ supersecundarias (por ejemplo, beta-alfa-bcta). La estructura terciaria se refiere a las relaciones entre dominios estructurales secundarios v entre residuos bastante alejados desde el punín de vista de su estructura primaria. La estructura cuaternaria, presente sólo en proteinas que tienen dos o m& cadenas polipep~ídicas (proteínas oligomdricas), describe puntos de coniacto y otras relaciones entre estos polipéptidos o subunidades. En tanto que, la estructura primaria contiene enlaces covalentes. las iirdenes su~erioresse estabi lizan sólo por fuer7as dbbiles que incluyen puentcs de hidrhgena múltiples, enlaces salinos (electrostáticos) entre residuos de superficie y relación, no estequiometrica de grupos R hidrofobos en el interior de las proteínas. Los reactivos que rompen enlaces no covalentes (por ejemplo, urea o SDS) destruyen las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria con perdida concomitante de la actividad biolhgicn (desnaii~alizacion).Las técnicas físicas para estiidio de órdenes superiores de estructura proteinica incluyen cristalografía con rayos X (estructura secundaria v terciaria) mhs ultracetitrifugación, filtracf~nen gel y electroforesis en gel (estructura cuaternarial. El estrecho nexo entre la estructura proteinica y la función biológica se ilustra con dos proteínas fibrosas: fibroina dc la seda y colágena. Las enfennedades relacionadas con defectos en la maduración de la colagena comprenden al síndrome de Ehlers-Danlos y el escorbuto (enfermedad por deficiencia de vitamina C).

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Proteínas: miogIobina y hemoglobina Víctor W. Rodweii, PhD

Como ejemplo de la relación estructura-función proteinica, este capitulo estudia la rnioglobina y la hemoglobina, proteinas importantes por derecho propio y porque en ellas puede apreciarse cómo las estructuras de las proteinas conforman o determinan sus funciones bioldgicas.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA Las proteínas hemicas intervienen en el transporte y fijacibn de oxígeno, en el transporte de electrones y en la fotosintesis. El estudio detallado de la hemorrlobina y la mioglobina ejemplifica aspectos estructuraIes comunes a muchas proteinas. En un sentido, su mayor significado médico consiste en que su conocimiento muestra, de manera elocuente, las relaciones estructurafuncibn de las proteínas. Ademiis, este conocimiento permite reconocer la base rnolecular de enfermedades genéticas como la enfermedad de cklulas falciformes (que resulta de la alteracibn de las propiedades de superficie de la cubunidad beta de la hemoglobina) y tas talasemias (enfermedades hemoiiticas familiares crbnicas, caracterizadas por defectos en la síntesis de la hemoglobina). El cianuro y el mon6xido de carbono son tbxicos debido a que interrumpen la función fisiolbgica de las proteinas hdrnicas, citocromo oxidasa y hemoglobina, respectivamente. Por último, la estabilizacEbn de la eshuctura cuatemariade la desoxihemoglobina por el 2,3-bisfosfoglicerato (BPG, del inglés, 2,3bisphosphoglicerafe)es esencial para comprender los mecanismos del mal de montafía y de la adaptacihn a las grandes altitudes.

-

EL HEM Y EL HIERRO FERROSO CONFIEREN LA PROPIEDAD DE ALMACENAR Y TRANSPORTAR OX~GENO La mioglobina y la hemoglobina poseen coma grupo prostdtico un tetrapirrol cicIico, el hem. La extensa red de enlaces dobles conjugados del hem absorbe luz en el extremo bajo del espectro visible, por lo que su color es rojo intenso. Los tetrapimoles constan de cuaao mol~culasde girrol (figura 7-1) enlazadas en un anillo planar por cuatro puentes al fa-metileno. Los sustituyentes beta deteminan si un tetrapirrol es hem o un compuesto analogo. En el hern, los grupos son metilo (M), vinilo (V) y propionato (Pr) y siguen el orden M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (figura 7-2). En el centro de este anillo planar, hay un titorno de hierro ferroso ( ~ e ~ ' ) Otras . proteinas con grupos prostt5ticos tetrapirrdlicos (y sus iones methlicos relacionados) incluyen los citocromos (Fe2' y Fe3'), las enzima catalasa y triptófano pirrolasa y la clorofila (Mg2*).En los citocromos, la oxidación y la reducción del htorno de hierro son esenciales para su funci6n bioldgica. Por el contrario, la oxidación del Fe2'de mioglobina y hemoglobina destruye su actividad biológica.

Figura 7-1. Pirrol. Los carbonos alfa estdn unidos por puentes metileno en un tetrapirrol. Los carbonos beta sostienen a los sustituyentes característicos de un tetrapirrol específico, como el hern

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Rioquímica de Harper

Figura 7-2. Hem Los carbonos de los anillos pirrolicos y de los puentes de metileno son coplanares y el átomo de hierro (Fez+) esta casi en el misma plano. La quinta y la sexta posiciones de coordinacbn del Fe2+con perpendiculares y directamente arriba y abajo del plano del anillo hemico. Obsérvese la naturaleza de los grupos sustitvyentes en los carbonos beta de los anillos pirrblicos, el Btorno central de hierro y la ubicación del lado polar del anlllo hemica (casi a las siete horas del reloj) que se enfrenta a la superficie de la molécula de mioglabina.

La oxirnioglobina almacena oxígeno

(Capitulo 7)

embargo, su conformación es atipica. Para facilitar la referencia a regiones particulares de estructura secundaria o terciaria de un polipéptido, a cada hélice alfa, hoja beta o asa se le asigna un nhmero o letra a partir de la terminal amino del polipeptido. Aproximadamente 75% de sus residuos se distribuyen en ocho hhlices alfa (giro a la derecha) de 7 a 20 aminohcidos de longitud. Comenzando por la terminal amino, se denominan hklíces de la A a la H.Las regiones interRelicales se identifican con las letras de las dos hhlices que conectan. Los residuos individuales se designan por la letra de la hdlice en la que residen y un nrjmero que indica su distancia desde [a terminal amino de esa hélice. Por ejemplo, "His FX" se refiere al m v o residuo en la hClíce F e identifica a un residuo histidilo. Los residuos que en la esttuctum primaria se encuentran bastante alejados (por ejemplo, en hélices diferentes) pueden, no obstante, estar en sentido espacial muy juntos, por ejempIo, los residuos histidilo Fg (proximal) y E7 (dista]) (figura 7-3). La estructura secundaria y terciaria de la rnioglobina en solución es muy semejante a la de larnioglobina cristalizada. Exhiben virtualmente el mismo espectro de absorción; la cristalina fija oxígeno y la cantidad de hélice alfa en una solucibn (calculada por la dispersión óptica rotatoria y dicroísmo circular) se aproxima bastante a la mostrada por el análisis cristalográfico con rayos X.

La mioglobina del tejido muscular rojo almacena oxlgeno. Bajo condiciones de escasez (por ejemplo, en el ejercicio extenuante), el oxigeno almacenado se libera para usarse en las mitocondrias musculares para la síntesis de ATP dependiente de oxígeno.

Con dos excepciones, los residuos polares están en la superficie de la rnioglobina L a mioglobina, cadena polipeptfdica sencilla con peso moIecular de 17 000, no es excepcional respecto a sus 153 residuos aminoacídicos. Sin embargo, en su distribución espacial hay diferencias evidentes.La superficie es polar y el interior no polar, patrón típico de las proreinas globulares. Los residuos con regiones polares y no polares (por ejemplo, Tre, Tri y Tir) orientan sus partes no polares hacia el interior. Sin contar los dos residuos histidilos que funcionan en lafijacion del oxlgeno, el interior de la mioglobina s61o contiene residuos no polares (por e,jemplo, Leu, Val, Fen y Met).

La mioglobina es rica en hélices alfa La mioglobina es una molecula compacta, toscamente esférica, que mide 4.5 x 3.5 x 2.5 nm (figura 7-3). Sin

Figura 7 3 . Modelo de mioglobina de baja resolucibn S610 se muestran los Btomos de carbono alfa. Las regiones donde se localizan las hklices alfa se designan con las letras que van de la A hasta la H. (Basada en Dickerson RE en: The Proteins, 2nd ed vol. 2 Neurath H [Editor]. Academic Press, 1964 Reproducida con autorización )

Proteínw: miog/obinuy hemoglobina

En presencia del hem, la estructura primaria de la apomiogiobína determina un plegamiento proteínico correcto

His proximal (Fa)

P,

Cuando la apomioglobina (mioglobina sin el grupo hem) es preparada reduciendo el pH a 3.5, su contenido de h&licealfa decrece de manera notable. La adicibn subsecuente de urea elimina todo el contenido de hklices atfa. Si se retira la urea por diálisis y se agrega hem. el contenido completo de hélice alfa se recupera y la adiciirn de Fe2' restablece su actividad biolbgica (fijaci6nde oxigeno) integra. Por tanto, la infomacidn estnictural primaria contenida en la apomioglobina puede. en presencia del hern, especificar el plegamiento de la proteina a su conformacibn nativa con actividad biológica. Como se explic6 en el capítulo 6. este importante concepto se extiende a otras proteinas: la estructura primaria de una proteina dirige su conformacibn secundaria y terciaria.

Las histidinas F8 y E7 llevan a cabo funciones únicas en la fijación de oxígeno El hern de la mioglobina, que se encuentra en un surco entre las hélices E y F (figura 7-3), se orienta con sus propionatos polares en la superficie. El resto se proyecta hacia el interior de la rnolkcula de mioglobina en donde, con excepcidn de His E7 y de His FS, los residuos circundantes son no polares. La quinta posici6n de coordinacion del átomo de hierro se une al nitrógeno de un anillo de la histidina proximal, His F8 (figura 7 4 ) . Aunque no estit enlazada a la sexta posicion de coordinacidn del hierro, la histidina distal (His E7) permanece en el lado del aniilo hdrnico al otro lado de His F8 (figura 7-4).

El hierro se mueve hacia el plano del hern cuando se fija el oxígeno En la rnioglobina no oxigenada, el hierro del hern se encuentra aproximadamente a 0.03 nm (0.3 A) fuera del plano del anillo en direccidn a His F8. En la mioglobina oxigenada, un htorno de oxigeno ocupa la sexta posicion de coordinaci6n del iitorno de hierro y entonces &te se desplaza a 0.01 nm (0.1 A) fuera del plano del hem. Por tanto, la oxigenacibn de la rnioglobina va acornpaflada por el movimiento del átomo de hierro, y el consecuente desplazamiento de His FB y los residuos aminoacldicos enlazados por covalencia a CI, hacia el plano del anillo. Este movimiento produce una nueva conformacibn de ciertas porciones de la proteina.

67

4' HISdista1 (ET)

Figura 7 4 . Adicidn del oxlgeno al hierro hemico en la oxigenacibn Tambien se muestran las cadenas imidazólicas laterales de los dos resrduos importantes de histidina de la globina que se adhieren al hierro del hem (Reproducida con autoruacion de Harper HA y colaboradores Phys~ologische ChemEe. Springer-Verlag, 1975 )

La apomioglobina proporciona un ambiente adverso para el hierro hernico Cuando el oxigeno se une a la rnioglobina, el enlace entre este y Fe2' es perpendicular al plano del anillo hemico. Un segundo átomo de oxigeno se une en un dngulo de 121" con respecto al plano del hern y orientado alejándose de la h istidina dista1 (figura 7-51,

Figura 7-6. Anguios pceferidos para el enlace del oxfgeno y el rnonbxido de carbono al átomo de hierro del hern libre [línea gruesa)

El mon6xido de carbono (CO) se une al hem aislado con una afinidad aproximadamente de 25 000 veces mayor que la del oxigeno. Si la amibsfera contiene restos de CO y el catabolismo normal del propio hern produce cantidades pequefias de este gas, ¿por qué entonces no es el CO (en lugar del Oz) e[ que ocupa la sexta posicidn de coordinacibn del hierro hémico de la mioglobina? La respuesta se encuentra en el ambiente adverso del hem en la mioglobina. La orientacihn preferida del CO para enlazarse al hierro hkmico es con los tres átomos (Fe, C, O) en posición perpendicular respecto al anillo hémico (figura 7-5). Aunque esta orientacion es posible para el hem aislado. en la mioglobina la histidina dista! obstaculiza esttricamente a los enlaces de CO en este Angulo (figura 7 6 ) . Esto obliga al CO a unirse en una configuracibn menos favorabte y reduce la fuerza de la unión hem-CO en más de dos órdenes de magnitud, aproximadamente 200 veces la fuerza del enlace hem02. NO obstante, por lo común, una pequeila cantidad (m8s o menos 1%) de la mioglobina está presente en forma de mioglobina-CO.

LAS CURVAS DE DISOCIACIÓN DEL OX~GENOPARA LA MIOGLOBINA Y LA HEMOGLOBINA EXPLICAN SUS FUNCIONES FISIOLQGSCAS

como PO2 o presión parcial de oxigeno) en et entorno

inmediato del hierro h&rtico. Ea relacion entre PO? y la cantidad de oxlgeno unido puede graficarse como una curva de saturacibn de oxigeno (disociacidn del oxígeno). Para la mioglobina, la forma de la isotenna de absorción de oxígeno es hiperbblica (figura 7-7). Dado que la PO2 en el lecho capilar pulmonar es de 100 mm Hg, la miaglobina podria retener oxigeno de manera eficaz en los pulmones. Sin embargo, la POz de la sangre venosa es de 40 mm Hg y la del músculo activo aproximadamente de 20 mm Hg. Puesto que la mioglobina no puede liberar una fracción grande de su oxigeno unido aún a 20 rnm Hg, no sirve como un vehículo eficaz para el transporte del oxigeno de los pulmones a los tejidos perifkricos. No obstante, en la privacibn de oxigeno que acompaflñ al ejercicio físico extenuante, la PO2 del tejido muscular puede disminuir hasta 5 mrn Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxigeno pare la síntesis oxidativa de ATP por las rnitocondrias musculares.

LA HEMOGLOBINA TRANSPORTA 0 2 , COZ Y PROTONES

¿Por que la mioglobina es inadecuada como proteina transportadora de oxígeno, pero eficaz para almacenarlo? La cantidad de oxigeno unido a la rnioglobina (expresada como "porcentaje de saturacibn ") depende de la concentracibn de oxigeno (expresada

La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados llevan a cabo dos funciones biolbgicas principales: 1) transportar el 0 2 del aparato respiratorio a los tejidos perifericos y 2) transportar el C01 y los protones, desde los tejidos perifericos hasta los pulmones para ser excretados. Aunque la bioquímica comparativa de las hemaglobinas de los vertebrados constituye un campo fascinante, aqui sólo se describirkn las hemoglobina~humanas.

Figura 7 4 . Anguios para el enlace del oxigeno y e l rnonbxido de carbono al hierro hérnico de la mioglobina La histidina distal E7 obstaculiza el enlace del CO en su Angulo preferido (1 80 O) respecto al plano del anillo hbmico.

Flgura 7-7. Curva de fijecibn de oxlgeno para la mioglobina Obsérvese la relacibn entre el porcentaje de saturacidn y las presiones pardaks representativasen pulmones(lO0 mm Hg), tejidos (20mm Hg) y el músculo en trabajo activo (5 mm Hg).

LAS PROPIEDADES ALOSTÉRICAS DE LAS HEMOGLOBINAS SON CONSECUENCIA DE SUS ESTRUCTURAS CUATERNARIAS Las propiedades de cada hemoglobina son consecuencia inherente de su estructura cuaternaria, así como de la secundaria y la terciaria. La estructura cuaternaria Ze da a la hemoglobina propiedades adicionaIes sorprendentes (no existentes en la mioglobina) que la adaptan a su función biologica única y le permiten una regulacibn precisa de sus actividades. Ademas las propiedades alostéricas (del griego, allos: otros, steros: espacio} de la hemoglobina proporcionan un modelo para comprender otras proteínas alostericas.

A diferencia de la mioglobina, Za hemoglobina es una proteína tetramérica Las hemoglobinas son protcinas tetramdricas, compuestas de pares de polipbptidos diferentes (denominados alfa, beta, garnrna, delta, S, etcétera). Aunque semejantes en longitud global, los polipdptidos alfa (14 1 residuos) y beta (146 residuos) de la hemoglobina A (HbA) son codificados por genes diferentes y tienen estructuras primarias distintas. No asi, las estructuras primarias de las cadenas beta, delta y g a m a de las hemoglobinas humanas tienen estructuras primarias altamente conservadas. Las estructuras tekarnéricas de 1a.shemoglobinas comunes son: H1iA @emoglobina normal del adulto) = alfazbeta2, HbF memoglobina fetal) = alfaz,gammaz(a2,&), HbS pernoglobina de c&lulasfalciformes) = alfa2S2,y HbAz (una hemoglobina menor del adulto) = alfaz, deltaz (azSz.).

La mioglobina y las su bunidades beta de hemoglobina comparten estructuras secundarias y terciarias casi idénticas

La oxigenación de la hemoglobina se acompaña por cambios en la conformación de la apoproteína La hemoglobina fija cuatro rnol~culasde oxlgeno por tetrhmero (uno por cada subunidad hdmica), y sus curvas de saturacibn de oxigeno son sigmoideas (figura 7-8). Por tanto, la facilidad con la que el Ozse une a la hemoglobina depende de la presencia de otras moléculas de 0 2 en el mismo tetrámero. Si ya existe oxigeno unido, la fijacibn de subsiguientes moltculas del mismo tiene lugar con mayor facilidad. Por tanto, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fijacibn, propiedad que le permite retener una cantidad máxima de oxígeno en los pulmones y ceder una cantidad, también rnkirna, con la POz baja que prevalece en los tejidos perifdrjcos. Por ejemplo, compdrense estas cantidades a la PO2 de los pulmones humanos (100 mrn Hg) y de tos tejidos (20 mm Hg) con las de la rnioglobina (figura 7-8).

La P50 compara las afinidades relativas de diferentes hemoglobinas para el oxigeno La PW es la presibn parcial de oxfgeno que satura la mitad de una moltcula de hemoglobina. Dependiendo del organismo, la Psopuede variar ampliamente, aun-

100 c 90

.g so 'O

-5 70 2 60

P a,

,50

p 40 30

20

A pesar de las diferencias en el tipo y niimero de aminoácidos presentes en la mioglobina y en el polipéptido beta de HbA, exhiben estructuras secundarias y terciarias casi idrlnticas. Esta semejanza que se extiende a la ubicacibn del hem y de las ocho regiones helicoidales, es consecuencia en parte de la presencia de aminohcidos de propiedades análogas en puntos equivalentes en las estructuras primarias de ambos. Ademh, el polipéptido beta es muy semejante a la rnioglobina a pesar de la presencia de siete hélices en lugar de ocho. Igual que en la rnioglobina, los residuos hidrofobos son internos y (de nuevo con excepci6n de los dos residuos His por subunidad), tos residuos hidrbfílos son características de la superficie en las subunidades alfa y beta de la HbA.

'lo ' 0

20

40

00

80

100

120

140

Presidn gaseosa del oxígeno (mrn Hg)

Flgura 7-8. Curvas defijacibn del oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina. La tensión artenal de oxigeno es aproximadamente de 100 mm Hg, la tensión de oxígeno de la sangre venosa mezdada es de más o menos 40 rnm Hg, la tensibn caprlar (músculo activo) del oxígeno es de 20 mm Hg y la tensibn de oxígeno minirna requerida por las enzimac citocrómicas es de 5 mm Hg. La agrupacibn de cadenas en una estructura tetramkrica (hemoglobina) permite una cesibn mayor de oxígeno que la que sería posible mn cadenas sencillas. (Modificada con autorizacidn de Stanbury JB, Wyngaarden JB, Fredrrckson DS [editors]: The Metabolic Basis of lnhented Disease, 4th ed McGraw-Hill, f 978 )

70

(Capiau/o 7)

Bioquimica de Harper

que en todos los casos es superior a la PO?en !os tejidos periféricos del organismo en cuestihn. La hemoglobina fetal humana (H bl: del inglés, human~iaIhemoglohin) proporciona un ejemplo representativo. Para H bA, Pro = 26 mm Hg; para HbF, Pru= 20 mm Hg. Esta diferencia permite a la HbF extraer oxígeno de la HbA de la sange placentaria, Sin embargo, dcspuks del parto la HbF es inadecuada, ya que su elevada afinidad por el oxígeno la obliga a ceder menos O2a los tejidos. Al principio, el feto humano no sintetiza cadenas alfa ni beta sino reta y epsilon. Al final del primer trimestre, alfa ha reemplazado a las subunidades zeta y a 10s pCptidos Cpsílon. Asi, la hemoglobina F, que es la hemoglobina de Ia vida fetal tardía, tiene la camposici6n alFa: gammaz. Las cadenas beta, cuya sintcsis comienza en el tercer trimestre, no reemplala en su totalidad a gamrna hasta algunas semanas despues del nacimiento.

1 Forma T

wi

Forma R

Figura 7-10. Durante la trancicibn de la forma T a la R de la hemoglobina se produce Fa rotacibn da un par de subunidades rigidas (alfaZlbeta2) de 15 grados en relación con el otro par de subunidades rígidas (alfallbetal) El eje de rotacibn es excéntrico y además, el par alfa2lbeta2 derjva un poca hacia el eje. En el diagrama, el par aifallbetal no ect6 sombreado y se conserva f ~ oen , tantu que el par sombreado alfa2lbeta2 gira y se desplaza.

Grandes cambios de conformación acompañan la oxigenación de la hemoglobina La unión del oxígeno ocasiona la rotura de los enlaces salinos entre carboxilo de las cuatro subunidades (figura 7-9). La fijación subsecuente de O2se facilita ya que se requiere la rotura de un número menor de enlaces salinos. Estos cambios alteran lambidn de manera profunda las estructuras secundaria, terciaria y cuaternariade la hemoglobina. Un par de unidades alfdheta gira con respecto al otro par alfabeta, haciendo compacto al tetramero e incrementando Ia afinidad de los hemes por el O: (figuras 7-1 0 y 7-1 1 ). L a estructura cuaternaria de la hemoglobina parcialmente oxigenada se describe como el estado T (tenso) y el de la hemoglobina oxigenada (HbOz)

DESOXI (forma T)

0x1 (forma R)

Asn G41102)

His 94

/ n=

COO 4

ASP

NH,'

II,

Figura 1-9. Enlaces salinos entre las diferentes subunidades de la desoxihemoglobina Estas interaccioneselectrastáticas no covalentec son interrumprdas por la oxigenación (Ligeramente modtficada y reproducida con autorización de Stryer L. Brachemistry, 2nd ed Freernan, 1981.)

Figura 7-1 1. Cambios en el contado alfailbeta2 en la oxigenacion Et contacto se cierra de un Area en forma de cola de paloma a otra, comprende el cambio de un puente de hidrbgeno a otro distinto Los dernac enlaces son no polares (Reproducida con autorización de Perutz MF: Molecular pathology of human hemoglobin Stereochernical interpretation of abnormal oxygen affinities Nature 1971.232,408 )

como el estado R (relajado) (figura 7-12). La R y T se utilizan tambikn para describir las estructuras cuaternarias de las enzirnas alostkricas, donde el estado T tiene afinidad menor por el susírato.

bamato y liberando protones que contribuyen al efecto Bohr.

La oxigenación de la hemoglobina se acornpaiia de cambios de conformación en la vecindad del grupo hern

La conversión del amino terminal de una carga positiva a una negativa favorece la formacibn de un puente salino entre las cadenas alfa y beta, situación tipica del estado "desoxi". En los pulmones, la oxigenacibn de la hemoglobina se acompafía de la expulsi6n y la subsiguiente exhalación de COZ. Cuando la sangre recibe el Coa, laanhidrasa carbónica de Ios eritrocito5 cataliza Ia formación de ácido carbonico (figura 7-14). Este se disociacon rapidez en bicarbonato y un protón. Para evitar que se aumente la acidez en la sangre, debe existir un sistema amortiguador que absorba el exceso de protones. La hemoglobina retiene dos prorones por cada cuatro rnoltculas de oxigeno que pierde y de este modo aumenta la capacidad amortiguadora de la sangre (figura 7-15), En los pulmones, el proceso se invierte, es decir, conforme el oxígeno se une a la desoxihemoglobina, los protones se liberan y se unen al bicarbonato formando hcido carbónico. Con ayuda de la anhidma carbbnica, el hcido carb6nico forma Coz,que es exhalado. Por tanto, la fijacibn de! oxigeno obliga la expulsibn del COz. Este fenbmeno reversible se llama efecto Bohr: este efecto se acompafía por una desviacibn de la curva de oxigenacibn hacia la derecha, es decir, la hemoglobina se encuentra menos saturada a una presión parclal de oxígeno dada. El efecto Bohr es una propiedad de la hemoglobina tetramérica y depende de la interaccibn hem-hem o de efectos cooperativos. La mioglobina no muestra tal efecto.

En la oxigenación, los Qtomosde hierro de la desoxihemoglobina (que se encuentran alrededor de 0.06 nm fuera del plano del anillo hérnico) se mueven hacia este plano (figura 7-13). Este movimiento se tsansmite a la histidina proximal (Fg), que avanza hacia el plano del anillo y arrastra consigo a residuos adheridos a His F8.

Después de la liberación de oxígeno a los tejidos, la hemoglobina transporta COZy protones a los pulmones Además de llevar el oxigeno de los pulmones a los tejidos periféricos, la hemoglobina facilita el transporte del COz de los tejidos a los pulmones para ser exhalado. La hemoglobina puede un irse directamente al COI cuando cede su O? y aproximadamente 15% del CO1 acarreado por Ia sangre es transportado asi. El bióxido de carbono reacciona con los grupos amino terminales de la hemoglobina, formando un car-

m

CO~+H~-NH;=ZH'+

H ~b4-COO-

Estructura T

Estructura R

Figura 7-12. La Iransicibn de la estructura T a la estructura R es mfis probable conforme se oxigena cada 1 d e los 4 grupos hem de una hemoglobina tetrhmera En este modelo, los puentes salinos (lineas delgadas) que enlazan las sribunidades en la estructura T, se rompen progresivamente al unirse al oxigeno y aún aquellos enlaces salinos que no se han roto se debilitan cada vez m i s (lineas onduladas) La transicibn de T a R no tiene lugar sino decpu6s de q u e se han filado cierto numero de rnolewlas de oxigeno, pero se vuelve rnhs probable con cada oxígeno sucesivo que se une. La transición entre las dos estructuras es modificada por varios factores, incluyendo protones, bióxido de carbono, cloro y BPG. Mientras mayor sea su mncentracion, más oxígeno debe unirse para desencadenar la transiudn Aquí no se muestran mol&culac totalmente oxigenadas en la estructura T ni totalmente desoxigenadas en su forma R, debido a que son demasiado inestables para existir en cantidad significativa. (Modificada y redibujada Con autorizacidn de Perutz MF Hemoglobin structure and respiratory transport Sci Am [Dec] 1978:239,92)

(Capítulo 7)

Histidina Fa

ZCO, + 2HzO

1 lz3

2HXOs

Repulsibn

41 Plano de la porñrina

2HCO3-

x;;:>-03 TEJIDOS FERIFERICOS

Il

+ 2H

+

4%

(Amortiguador)

2HzCOa

PULMONES

Generado por el dcb de Krebs

Figura 7-13. El Btomo de hierro se mueve en el plano del hem durante la oxigenacibn La histidina F8 y sus residuos relacionadosson arrastrados con el fitomo de hierro. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L Biochemistry. 2nd ed Freeman 1981.

Los protones que causan el efecto Bohr se generan por rotura de enlaces salinos durante la fijación del oxígeno Los protones que ocasionan el efecto Bohr, son generados por la rotura de puentes salinos durante la fijacibn del oxigeno a la estructura T. Estos protones, liberados de los itomos de nitrógeno de los residuos HC3 (His 146) de la cadena beta, conducen al bicarbonato hacia el acido carbbnico, el cual es liberado como C 0 2en la sangre alveolar (figura 7-1 5). Por otro lado, en la cesibn del oxigeno Ea estructura T y los puentes salinos se regeneran, y tos protones se unen a los residuos HC3 de la cadena k t a . Por tanto, la presen~iade protones en los tejidos periféricos favorece la formación de puentes salinos en la residuo His terminales de las subunidades beta. La regene-

Figura 7-14. Formacibn de á d o carbónico, mtatizada por Fa anhidrasa carbbnica eritroutaria y disociacibn del áudo carbbnico a ion bicarbonato y un protbn.

/'

Figura 7-15. Efecto Bohr El bibxido de carbono generado en los tejtdos periféricosse combina con el agua para formar Audo carbbnico el cual se disocia en iones bicarbonato y protones. La hemoglobina desoxigenada actúa como un amortiguador al fijar protones y liberarlos en los pulmones Aqui, la unibn del oxígeno a la hemoclobina desaloja a los protones; estos se combinan con el ion bicarbonato y regeneran al ácido mrbbnico el cual, cuando es dechidratadopor la anhtdrasa carbbnica, produce bibxido de carbono, que es exhalado desde los pulmones.

ración de los enlaces salinos propicia la liberacibn del O2 de la hemoglobina oxigenada (forma R). En resumen, un incremento en los protones estimula la liberacibn de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxlgeno provoca la liberacibn de protones. El primer fenbmeno puede representarse en una curva de disociacibn del oxigeno por un desplazamiento a la derecha al aumentar la concentración de iones hidrbgeno (protones).

El 2,3-bicfosfoglicerato (BPG) estabiliza la estructura T de la hemoglobina En los tejidos perifericos, una escasez de oxigeno acumula el 2,3-difosfoglicerato (BPG)(figura 7-1 6). Este compuesto se forma a partir del intermediario de la vla glucolitica, 1,3-bisfosfoglicerato. Una molécula de BPG se une a cada tetrámero de la hemoglobina en una cavidad formada por residuos de las cuatro subunidades. La cavidad central es de tamaño suficiente para el BPG sblo cuando el espacio entre las hélices H de las cadenas beta es de una anchura adecuada, es decir cuando la molécula de hemoglo-

Proteinas: miogioblna y hemoglobina

Figura 7-16. Estructura del 2,3-bisfosfoglicerato(BPG).

bina esta en la forma T. El BPG es unido mediante puentes salinos entre sus Sitornos de oxigeno y las dos cadenas beta a travks de sus grupos m i n o arnino-termina1 (Val NAl ), Lis EF6 y His H21 (figura 7-17). Por tanto, el BPG estabiliza la forma T o desoxigenada de la hemoglobina por medio de enlaces cruzados con las cadenas beta y por contribuir con puentes salinos adicionales, que deben romperse antes de que se produzca la f o m a R. El BPG se une de manera más dtsbil a la hemoglobina fetal que a la hemoglobina del adulto debido a que el residuo H21 de las cadenas gamma de la hemoglobina fetal es Ser en lugar de His y no puede formar un puente salino con BPG. Por lo anterior el

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BPG tiene un efecto menos profundo en la estabilización de la HbF y es causa de que esta parezca tener una mayor afinidad por el oxigeno que la hemoglobina del adulto. El desencadenante de la transicibn entre R y T de la hemoglobina es el movimiento del hierro dentro y fuera del plano del anillo de porfirina. Tanto los factores espaciales como los electrostáticos median ese desencadenamiento. Asi, un cambio minimo en la posición de Fe2' en relacibn al anillo de porfirina induce variaciones significativas de las confonnaciones de la hemoglobina y afecta de manera decisiva su función biolbgica en respuesta a una sena1 ambiental.

SE HAN IDENTIFICADO VARIOS CIENTOS DE HEMOGLOBINAS HUMANAS MUTANTES Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas alfa y beta tienen potencial para afectar la functdn bioldgica de la hemoglobina. De los varios cientos de hemoglobinas humanas mutantes conocidas (lamayoría son muy raras y benignas), en seguida se descriixn algunas, cuya función biológica esti alterada. Cuando la alteracibn de la funcibn biolbgica se debe a una rnutacidn en la hemoglobina, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatia.

En la hemoglobina M, Tir reemplaza a His F8 El hierro hdmico se estabiliza en el estado Fe", ya que forma un complejo i6nico firme con el anión fenolato de Tir, Larnetahemoglobinemia, donde el ion hierro del hem está en estado férrico en lugar de ferroso, puede ser adquirida (por ejemplo, con la oxidacirin de Fe2' a Fe3+por compuestos tales como las sulfonamidas), hereditaria (debido a la presencia de HbM) o causada por la disminuci6n de Ia actividad de la rnetahemoglobina reductasa, enzima que reduce el Fe" de MetHb a Fe2+.Puesto que la metahemoglobina no fija 01, no puede participar en el transporte de oxlgeno. En las variantes de la cadena alfa de la hemoglobina M, el equilibrio R-T favorece a la forma T. La afinidad por el oxigeno esta disminuida y no hay efecto Bohr. La cadena beta de estas variantes presenta cambio R-T y, por tanto, se produce el efecto Boht. Las mutaciones (por ejemplo, la hemoglobina Figura 7-17. Modo de enlace del 2-3-bisfosfoglieeratoa la Chesapeake} que favorecen la f o m a R muestran una deaoxihemoglobina humana. El BPG interactba con tres afinidad creciente por el oxigeno, por lo cual no lo grupos d e carga positiva en cada cadena k t a (Basada en Arnone A: X-ray diffraction study of binding of 2,341phospho- ceden en suficiente cantidad a los tejidos periftricos. glycerate to human deoxyhemoglobin Nature 1972;237.146. La hipoxia tisuIar que se produce lleva a policiternia (incremento en el número de eritrocitos). Reproducida con autorizacibn.)

En ia hemoglobina S, un residuo valil reemplaza al glutamato beta-6 En la hemoglobina S, Val reemplaza a Glu A2 (6)P, es decir. el residuo 6 de la cadena beta localizado en la superficie de la hemoglobina, expuesta al agua. Esta sustitución reemplaza el residuo polar glutamato por uno no polar y da lugar a una "zona adherente" en la superficie de la cadena beta. Esta zona existe en las formas oxigenada y desoxigenada de la hemoglobina S pero no en la hemoglobina A. En la superficie de la hemoglobina S desoxigenada hay un complemento para la zona adherente, pero en la hemoglobina S oxigenada este sitio complementario esta enrnascarado (figura 7-1 8).

Aunque la desoxihemoglobina A contiene los sitios receptores para ia zona adherente que existe en las hemoglobinas S, oxigenada y desoxigenada (figura 7-1 S), la uni6n de la hemoglobina S adherente a la desoxihernoglobina A no puede extender el polimero, ya que esta iiltírna no tiene zona adherente para promover a su vez la unibn de otra molCcula de hemoglobina. Por tanto, la uni6n de la desoxihemoglobina A a la forma R o a la forma T de la hemoglobina S terminará la polimerizacibn. EI polimero forma una fibra helicoidal torcida, cuya seccion cruzada contiene 14 moléculas de HbS (figura 7-1 9). Estas fibras tubulares distorsionan al eritrocito de modo que toma la forma de una hoz (figura 7-20) y son vulnerables a lisis cuando penetran a los intersticios de los sinusoides esplknicos.

La desoxihernoglobina S puede formar una estructura fibrosa que distorsiona los eritrocitoc Cuando la hemoglobina S está desoxigenada, su zona

adherente puede unirse a la zona complementaria de otra molécula S desoxigenada. Esta union hace que la hemogiobina S desoxigenada se polimerice, formando precipitados fibrosos largos que se extienden a través del eritrocito y lo distorsionan mecfinicamente causando lisis y mtiltiples efectos cllnicos secundarios. Asl, si [a hemoglobina S pudiera conservarse en su estado oxigenado, o si la concentracidn de la Forma desoxigenada lograra mantenerse en un mínimo, no se formarían estos polímeros y se evitaria la aparición de "células falciformes". Es evidente que la forma T de la hemoglobina S es la que se polimeriza.

0 x 1A

Desoxi A

Desoxi A

1) Mioglohinuria: Despues de lesiones multiples, [a mioglobina liberada de las fibras muscuIares rotas aparece en la orina, colorehndola de rojo oscuro. Aunque después de un infarto del mimardio es Q O S ~ ble detectar la mioglobina en el plasma, el andlisis de las enzimas skricas (capitulo 8) proporciona un indice m& sensible del daflo miocárdico. 2) Anemias: Las anemias comunes (reducciones en la cantidad de eritrocitos o de hemoglobina en la sangre) se deben al deterioro de la slntesis de hemoglobina (por ejemplo, en deficiencia de hierro; capítulo 59) o a la produccibn alterada de eritrocitos (es el caso de la deficiencia de ácido fólico o vitamina Biz; capitulo 52). El diagnbstico de las

Oxi S

Desoxi S

Desoxi S

Flgura 7-18. Representacidn de la zona adherente (A) en la hemoglobina S y su "receptor" ( A ) en las desoxihemoglobinas A y S Las superficies complementarias permiten que la desoxihernoglobina S po/irnerice en una estructura fibrosa, pero la presencia de la desoxihernoglobina A termina la polimerizacibn debido a que no posee zona adherente. (Modificada y reproducida con autorizaubn de Stryar L. Biochemrstry, 2nd ed Freernan, 1981.)

Proteínas: miog/ubina y hemoglobina

75

3) Hemoglobinopatias: En tanto que la mutación de ciertos residuos crlticos de la hcmogIobina (como las histidinas E7 o F8) tiene consecuencias graves. es posible que la rnutacidn de muchos residuos

Figura 7-19. Reprecentacidn de la estructura helimidal propuesta de una fibra de desoxthamoglobina S agregada En este modelo, las esferas representan moléculas inviduales de HbS (Reproducida con autorizacibnde Maught II: A new understanding of sickle cell emerges Scienoe 1981,211 265 Copyright Q 1981 by the Arnerican Association for tha Advancement of Science )

anemias comienza con la deteminacidn espectrofotométrica de la concentración de hemoglobina sanguinea. Las talasemias y el uso de probadores de DNA para su diagnóstico se consideran en los capitulas 8 y 42.

superficiales, alejados del sitio de fijacion del hem, no se traduzca en anormalidades clinicas. Una excepcE6n notable es la anemia de cklulas falciformes, en donde todos los signos y sintomas (por ejemplo, crisis de céluEas Fatciformes y trombosis) provienen de la mutación de un solo residuo polar por uno no polar. 4) Hemoglobina glucosilada (HbAlr): Cuando la glucosa sanguínea entra a los eritrocitos, la hemoglobina es glucosilada de manera no enzimatica y su hidroxilo anomérico deriva los grupos amino presentes en los residuos lisil y en las terminales amino. La HbAic, puede separarse de HbA por cromatografía de intercambio ionico o electroforesis. La fraccibn de hemoglobina glucosilada, normalmente alrededor de 5%, es proporcional a la concentracibn de glucosa en la sangre. Por tanto, la medicibn de HbAic proporciona Pnfomaci6n util para el manejo de la diabetes sacarina. Dado que la vida media de un eritrocito es de 60 dias, la concentración de HbA i c refleja la concentración sanguínea promedio de glucosa en el periodo de 6 a 8 semanas precedentes. Asi, una HbA icelevada, que indica control deficiente de la glucosa sanguinea, puede guiar al mkdico en la seleccibn del tratamiento apropiado (por ejemplo, un control m i s riguroso de la alimentación o una dosificacibn mayor de insulina).

Figura 7-20. Micrografla electrdnica de barrido de un eritrocito normal (A) y uno falciforme {B).El cambio en la mol6cula de globina beta que causa esta alteracibn estructural, es consecuencia de la mutacibn de una sola base en el DNA Ttmina (T) por adenina (A), lo cual conduce a la sustitucidn de un residuo de valrna por uno de glutamina en la malécula de globina beta

Las talasemias se originan de la síntesis reducida de cadenas alfa o beta En las talasemias, la síntesis de las cadenas alfa (alfatalasemias} o beta (beta-tarasemias) de la hemoglobina estA disminuida. La consecuencia es una anemia que puede ser muy grave (capítulo 42).

RESUMEN Las proteínas globulares compactas, mioglobina (Mb) y hemoglobina (Hb), funcionan en el almacenaje y transporte de oxigeno. respectivamente. La ~b &S monomerica; Hb es un tetrhmero de dos tipos de subunidades (alfazbetaz en la hemoglobina del adulto, H1iA). La Mb y la subunidad beca de Hb, rica en hélices aIfa, comparten una estructura secundaria y terciaria vimialmente idtnticas (no así la Los residuos de arninoAcidos de sus seis (A a H) regiones helicoidales se denominan (por ejemplo) "His P8" -la histidina que es el octavo residuo en la hClice F o sexta. El grupo prostktico hem de Mb y I-Ib es un tetrapirrol ciclico, planar en esencia, un poco plegado, con un Fe" central. Cuando el grupo hem se agrega a una apomioglobina desnaturalizada (Mb sin hem), ésta se pliega de nuevo en su confomación nativa. Por tanto, la información estructural primaria impEicita en apoMb (y por extensidn, en otras proteínas) basta para definir la estructura secundaria y terciaria. El Fe2' del hem se une a los cuatro átomos de nitrogeno del hem y a los dos ligandos adicionales localizados arriba y abajo del plano del hem. Un ligando es la histidina FX. En la oxiMb y oxiHb, el sexto ligando es 02.En una intoxicacibn con monhxido de carbono, el sexto ligando es CO el cual, a pesar del obsthculo espacial por la presencia de His F7, se une con más fuerza al hierro que el 02. Las curvas de saturación muestran la captacibn y liberacirln del oxigeno. La curva de Mb es hiperbblica,

en tanto que con Wb es sigmoidea. Esta ultima forma es critica para una mol6cula transportadora de Oz que debe saturarse con oxígeno en los pulmones y liberarlo al m k i m o en los tejidos. Las afinidades relativas de las diferentes hemoglobinas se expresan como Pso, que es la presi6n parcial de O?a la cual se saturan la mitad de hemoglobinas con oxígeno. Las hernoglobinas se saturan a las presiones parciales de sus respectivos órganos respiratorios (por ejemplo, HbF se satura con la PO1 de la placenta). Los residuos His proximal (F8) y dista1 (E7) descansan en sitios opuestos del anillo hémico. Durante la oxigenacion, Fe2', His F8 y Pos residuos adyacentes se mueven hacia el anillo htmico. Por tanto, [a oxigenacidn de Hb se acompafía de cambies notorios en la conformación. La adición de Oza desoxiHb destruye los en taces salinos entre subunidades y dentro de ellas, volviendo laxa la estructura cuaternaria y facilitando la fijación de moliculas adicionales de oxigeno. En la cavidad central de la desoxiHb, el compuesto 2,3-bisfosfoglicerato (RPG) forma enlaces salinos con las subunidades beta, que estabilizan aún m8s la desoxiHb. Durante la oxigenacirln, la cavidad central se c o n h e , el BPG es expulsado y la estructura cuaternaria de nuevo queda laxa. La Hb tiene también la funcibn de transportar COI y protones desde los tejidos al pulmbn. La liberación de oxigeno de ra oxiHb (HbO2) a los tejidos se acornpaiía de captacibn de protones debido a la disminucirln del valor de pK. de un residuo His. Entre los cientos de mutantes de Hb (en gran parte benignos) se destaca la hemoglobina de las células falciformes (HbS), en la cual Val reemplaza a Glu beta6 de HbA. Esto crea una "zona adherente" que tiene un complemento sobre la desoxiHb (pero no en oxi Hb). En concentraciones bajas de oxigeno, desoxiHbS polimeriza, forma fibras y distorsiona los eritrocitos dándoles formas de hoz. Las talasemias al fa y beta son anemias causadas por disminución en la produccibn de subunidades alfa y beta de HbA, respectivamente.

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Enzirnas: propiedades generales

Despues del daflo tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituracidn de un miembro) o posterior a la multiplicación celular descontrolada (como en el carcinoma prostktico), las enzimas propias de los tejidos específicos pasan a la sangre. Por tanto, la determinación de estas enzirnas intracelulares en el suero sanguineo proporciona a los m6dicos inforrnacidn valiosa para el diagnbstico y pronóstico.

Los temas considerados en este capitulo incluyen las clases de reacciones catalizadas por enzirnas, la participacibn de coenzimas en reacciones de transfemcia de grupo catalizadas por enzima y aspectos de la especificidad enzimiitica. Asimismo, se introducen los m ttodos para purificación, análisis y deteminacibn de la distribucilin intracetular de enzimas. Luego se describen las isoenzimas, el. diagnbstico y el significado pronóstico de las enzirnas dricas, concluyendo con el uso de endonucleasas restrictivas en el diagnostico de enfermedades geneticas.

LAS ENZIMAS SE CLASIFICAN POR TIPO DE REACCIÓN Y MECANISMO

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Hace un siglo s61o se conocían algunas enzimas, muchas de las cuales catalizaban la hidrbtisis de en-

Sin enzimas no sería posible la vida que conocemos. Igual que [a biocatálisis que regula [a velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfemedad. Mientras que en estado de salud todos los -esos fisiológicos se llevan a cabo de una manera ordenada, regulada y se conserva la homeostasia, durante los estados patoldgicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el dafío tisular grave que caracteriza a la cirrosis hepfitica puede deteriorar de modo notable la propiedad de las células para producir enzimas que catalizan procesos metabólicos claves como la sintesis de urea. La incapacidad celular para convertir el arnoniaco tbxico a urea no tóxica es seguida por intoxicacibn con amoniaco y, por último, coma hephtico. Un conjunto de enfermedades genbticas raras, pero con frecuencia debilitaiites y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos impresionantes de las drásticas consecuencias fisiolbgicas del deterioro de la actividad enzirnhtica, incfusive de una sola enzima.

laces covalentes. Esm enzimas se identificaban por la adición del sufijo -asa al nombre de la sustancia o sustrato que hidrolizaban. De este modo, las lipasas hidrolizaban grasas (lipos, en griego); las amilasas, alrnidbn (amylon, en griego) y las proteasas, proteinas. Aunque hasta hoy persisten numerosos vestigios de esta terminología, demostr6 ser inadecuada cuando se descubrieron varias enzimas que catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato; por ejemplo, oxidacibn o reducción de la función alcohol de un azúcar. Aunque el sufijo -asa sigue en uso, en la actualidad los nombres de las enzirnas enfatizan el tipo de reaccidn catalizada. Por ejemplo, las deshidrogenasas catalizan la eliminacibn de hidrógeno y 1% transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de m&- y mhs enzimas, surgieron ambigtiedades inevitables y con frecuencia no estaba claro cukl era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Uni6n Internacional de Bioquirnica (IIJB, del inglis, Internotional Union of Biochemistry) adoptó un sistema complejo, pero inequivoco, de la nomenclatura

enzimhtica basado en el mecanismo de reacción. Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan a[ sistema de nomenclatura IUB para trabajos de invcstigación, nombres mis ambiguos, pero afortunadamente: bastante mhs cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clínico. Por esta razón, a continuación se presentan sólo principios generales del sistema IUR: 1) Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en seis cIases principales, cada una con 4 a 13 subclases. 2) El nombre de la enzima tiene dos partes. La primera es el nombre del o de los sustratos; Ia segunda, con terminación -asa, indica el tipo de reacción catalizada. 3) Infonnacion adicional, si es necesario aclarar la reacción, puede seguir en paréntesis, Por ejemplo, la enzima que cataliza ],-malato + NAD' = pinivato + COI + NADH t , ' H S/ denomina como 1.1.1.37 ~-malato:NAD oxidorreductasa (descarboxi lante). 4) Cada enzima tiene un número clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccibn segun la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y sub-subdase (tercer digito). El cuarto digito es para la enzima especifica. AsC, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa}, subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-subclase 1 (una función alcohol como aceptor de fosfato). El último digito denota a la enzima hexocinasa o ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo del carbono 6 de la glucosa.

MUCHAS ENZIMAS NECESITAN UNA COENZIMA Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones necesitan, ademb de su sustrato, una segunda mol~culaorghnica conocida como coenzima, sin la cual son inactivas. Para distinguirlas de iones methlicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestables, de peso molecular bajo, necesarias para ta actividad de las enzimas. La mayoda de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes. Las que forman enlaces covalentes con las enzirnas se denominan tambikn grupos prostkticos. Entre las reacciones que necesitan coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerizacibn y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1, 2, 5 y 6 de la

IUB). Las reacciones liticas que comprenden reacciones hidroliticas catali~adaspor enzimas digestivas no necesitan de coenzimas.

Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato Puede ser útil considerar a la coenzima como un segundo sustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la cOenzima compensan exactamente a los que se realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones de oxidorreducci6n (deshidrogenasa), cuando una rnolecula de sustrato es oxidada, una rnoIkcula de coenzima es reducida (figura 8-1). Una segunda raz6n para dar igual tiifasis a las reacciones de la coenzima es que este aspecto de lareacción es el que puede tener el mayor significado fisioPogico fundamental. Un caso es la importancia de la capacidad det músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no reside en el piruvato ni en el lactato. La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD'. Sin N A D ' la glucólisis no puede continuar y 3a sintesis anaerobia de ATP (y por tanto, el trabajo) tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reduccion del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la sintesis de ATP. Otras reacciones pueden servir iguaImente bien. Por ejemplo, en las bacterias o Fevaduras que crecen en un medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidantes para el NADH y ellos mismos son reducidos (cuadro 8-1).

Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo

, c-Lactato

o

x

NAD"

O piruvato

NADH + H+

Flgura 8-1. El NAD+ actúa como cosustrato en la reaccibn de la lactato deshidrogenasa

Enzimas: propiedades generales

Cuadro 8-1. Mecanismos para l a regeneración obia de iu A n+

-

-

-

-

ia viviente-

Pir :ctaldehido .,.La.,

u,,

dihidroxini

la. bacterias

L IVIUSLU

lácrica: Levadiira

-

Frr

ias lietert

79

Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno: Fosfatos de azucares. COA-SH. Pirofosfato de tiamina. 4 Fosfato de piridoxal. i Coenzimas del folato. * Biotina. Coenzimas de cobalamina (R 12). * Ácido lipoico. Para la transferencia del hidrbgeno:

en la cual un grupo funcional, G, es transferido de una moIecula donadora, D - G , a una moltcula aceptora. A, por lo gencral comprende la participaci~nde una coenzima como ultimo aceptor (por ejemplo, las reaccicne? de deshidrogenación) o como portador intermediario del grupo (como las reacciones de transaminacion). El esquema siguiente muestra el ultimo concepto.

Aunque esto sugiere la fomacion de un complejo sencillo C o E 4 , durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios C o E 4 en una reacción particular (como la transaminacibn). Cuando eI grupo transferido es el hidrhgeno, se acostumbra representar s61o la "mitad izquierda de la reaccion ":

NAD+, NADP+ FMN, FAD. Ácido lipoico. Coenzima Q.

Muchas coenzimas derivan de vitaminas B y del monofosfato de adenosina

Las vitaminas i3 forman parte de la estructura de numerosas coenzimas. Las nicotinamida, tiamina, siboflavina y iicido pantoténico son constituytntes esenciales de las coenzirnas para las oxidaciones y las reducciones bioIógicas mientras que las coenzimas Bcido fhlico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina (AMP. del inglés, adenmine monopho.~phate).tos ejemplos incluyen NAD' y NADP' (tlgura 8-2). Las enzimas son catalizadores estereoespecificos

Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en tkrminos de las reacciones que tienen lugar en las células intactas (cuadro 8-1 ). Se pueden representar de la siguiente manera:

Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan BacBndose en este concepto, podrían clasificarse las coenzirnas del siguiente modo:

Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzirnas. Esta "adherencia en tres puntos" puede conferir asimetría a una moldcula por otro lado cimCtrica. La figura 8-3 muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, pr6ximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sblo desde un lado y únicamente los fitomoc compIementarios y los sitios pueden interactuar (ambas suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unira sólo en una forma. La reaccibn misma puede estar confinada a los Atomos unidos en los sitios 1 y 2 aun cuando los htomos 1 y 4 sean idénticos. Girando mentalmente la moldcula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientaci6n. En consecuencia, los Atomos 1 y 4, aunque sean idénticos, vienen a ser distintos

80

Bioquimica de Harper

MUCHAS ENZlMAS CATALIZAN UNA REACCION O UN TIPO DE REACCION ESPEC~F ICA L a capacidad de una enzima para catalizar una reacción específica y esencialmente ninguna otra, es qui7A su propiedad miis significativa. De este modo, las velocidades de procesos metabólicosespecificas pueden regularse por cambios en la eficiencia catalitica de enzimas específicas. Sin embargo, la mayoría de las enzima~catalizm el mismo tipo de reacción (transferencia de fosfato, oxidación-reduccióin, etcdtera) con un pequeflo numero de sustratos relacionados estructuralmente. Las reacciones con otros sustratos alternativos tienden a efectuarse si ellos se encuentran en altas concentraciones. Que todas las reacciones posibles ocurran en el microorganismo vivo depende de la concentracibn relativa de sustratos alternativos en las células y de la afinidad relativa de la enzima para esos sustratos.

Las enzimas muestran especificidad óptica Figura 8-2. NAD(P)+. En NAD', -R

= H; en NADP*, R =

0~03"'.

cuando el sustrato esta adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar e1 &tomo 1 (pero no el Btomo 4) o viceversa. Si bien los sitios activos de las enzimas no son las supeficies planas que se muestran en la figura 8-3, la figura no puede mostrar la causa de que la reducción catalizada por la enzima del piruvato sin actividad bpticaproduzca L-lactato en vez de D, L-lactato

Excepto las epimerasas (racernasas), que.catalizan la interconversión de 10s idmeros bpticos, las enzimas por lo general muestran una especificidad bptica absoluta por lo menos para una porción de la rnoldcula de sustrato. Asi, las enzirnas de la via glucolitica y de la oxidativa directa catalizan la interconversibn de los D- pero no de los L-fosfoanjcares. Con unas cuantas excepciones (por ejemplo, la D-aminoacidooxidasa del riilon), la pan mayoría de las enzirnac de los marniferos actúan sobre los L-isbmeros de los aminohcidos. L a especificidad 6ptica se puede extender a una porción de la mol~culadel sustrato o a su totalidad. Las glucosidasas proporcionan ejemplos de ambos casos. Estas enzimas catalizan la hidrblisis de las uniones glucosidicas entre aziicares y alcoholes, y son altamente especificas para la porcibn azúcar y para la uni6n (alfa o beta), pero relativamente inespecíficas para la porcion alcohólica o aglicona. Las enzimas presentan un alta especificidad para el tipo de reacciiin que catalizan

Sitio enzimatim

Sustrato

Figura 8 3 . Representación de la adherencia en tres puntos de un sustrato a un sitio activo planar da una enzima.

Las enzimas líticas actúan sobre grupos de compuestos quimicos particulares, por ejemplo, glucosidas% sobre glucbsidos, pepsina y tripsina sobre los enlaces peptidicos y las esterasas sobe los ksteres. Un p a n numero de sustratos pueden ser atacados reduciendo asi, el número de enzirnas digestivas que de otro modo serian requeridas. Numerosas proteasas

Enzimm: propied~desgenerales

catalizan tarnbidn la hidrólisis de los tsteres. En tanto que esto es probablemente de importancia fisioldgica limitada, el uso de ésteres como sustratos sinttticos ha sido importante en el estudio del mecanismo de accion de las proteasas. Ciertas enzimas líticas presentan alta especiftcidad. La quimiotripsina hidroliza los enlaces peptidicos en tos cuales el grupo carboxilo es apostado por los aminohcido~aromhticos fenilalanina, tirosina o triptbfano. Las carboxipeptidasas y las aminopeptidasas desdoblan los aminoácidos I por 1 de la terminal carboxilo o de la amino de [as cadenas polipeptldicas, respectivamente. Aunque algunas oxidorreductasas funcionan igualmente bien, ya sea con NAD' o con NADP' como aceptores de electrones, la mayor parte de ellas usan exclusivamente uno o el otro. En general, las oxidorreductasas funcionales en los procesos biosintéticos de los sistemas de mamlferos (por ejemplo, en la síntesis de ácidos grasos o de esteroles) utilizan NADPH como reductor, mientras que las funcionales en los procesos de degradación (por ejemplo, la glucólisis, la oxidacibn de [os hcidos grasos) utilizan NADkomo oxidante.

LA ACTIVIDAD CATAL~TICA DE UNA ENZIMA FACILITA SU IDENTIFICACI~N

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o del NADPH (pero no del NAD' o del NADP') para absorber la luz a una longitud de onda de 340 nm (figura 8-41. La oxidación de NADH en NAD' se acompaíia de una disminucibn de la densidad bptica (DO) a 340 nm,proporcional a la cantidad de NAD que se oxida. De igual manera, cuando el NAD' se reduce, la DO aumenta en proporcion a la cantidad de NADH que se produce. Este cambio de DO, se puede utilizar para el anhlisis cuantitativo de cualquier NAD' o NADP' dependientes de deshidrogenasa, tal como sigue. Para una deshidrogenasa que cataliza la oxidación de NADH, mediante su s u s ~ oxidado, o la velocidad de decrecimiento de DO a 340 nm es directamente proporcional a la concentracibn enzimática.Por tanto, la medicibn de la velocidad de decrecimiento en DO a 340 nrn permite deducir la cantidad de enzima, expresada en unidades de actividad, presente en una muestra biológica dada como suero o extracto de tejido.

Muchas enzirnas pueden analizarse por acoplamiento de una reacción a una deshidrogenasa

En el ejemplo anterior se midi6 la velocidad de formaci6n de un producto (NADH} para determinar ta actividad enzimatica. TambEen es posible analizar la ac-

tividad de otras enzimas diferentes de las deshidrogenasas por la medicibn de la velocidad de aparición

Las pequeiías cantidades de enzimas presentes en la célula obstaculizan la rnedicidn de la cantidad de una enzima en liquidos o extractos de tejidos. Por fortuna, la actividad catitalitica de una enzima provee un dispositivo sensible y especifico para su propia medición. Para medir la cantidad de una enzima en una muestra de extracto tisular o de algún liquido biológico, se establece la velocidad de la reacción catalizada por ella. En circunstancias apropiadas, la velocidad medida es proporcional a la cantidad de enzima presente. Dado que es dificil determinar el número de mol&culaso la masa de enzima presente, los resultados se expresan en unidades enzimáticas. Las cantidades relativas de la enzima se pueden entonces comparar en diferentes extractos. Tales unidades se expresan mejor en micromoles (prnol; 1Q4 mot), nanomoles (nmol; lo4 rnol) o picomoles (pmol; 10-'' mol) de sustrato reaccionante o de producto formada por minuto. Las unidades internacionales enzimáticas correspondientes son pU,nU y pU.

Las deshidragenasas que dependen de NAO' puede analizarse a 340 nm En las reacciones que interviene el NAD' o el NADP' (deshidrogenasas) se utiliza la propiedad del NADH

1 1 200

1

233

I

1

300 350 Longitud de onda (nm)

600

Figura 8 4 ,Espectros de absorcibn del NADt y del NADH. Las densidades corresponden a una solucibn de 44 m g k en una celdilla de 1 m de paso de luz. El NADP* y el NADPH tlenen espectros semejantes a los de NAD* y NADH, respectivamente.

82

(Capitulo 8)

Rioquimicu de Harper

Glucosa

mecanismos reguladores que operan a nivel de la catálisis, derivan en gran medida de los estudios de enzima purificadas. La información fidedigna referente a la cinética, cofactores, sitios activos, estructura y mecanismo de acción tam bien nccesita cnzinias altamente purificadas.

1

ATP, ~ g "

[HEXC)CINASAI

ADP, h2+

Gluwsa 6-fosfato

La purificación incrementa la actividad especifica

GLUCO-SA6-FOSFATO DESHIDROGENASA

NADPH + H'

Figura 8-5. Andlisis acoplado para la actividad de la hexocinasa La reaccibn se acopla a la catalizada por la glucosa-6fosfato deshidrogenasa. Todos los reactivos, glucosa6-focfato deshidrogenasa, glumsa, ATP, y NADP*. se agregan en exceso. Entonces, la cantidad de hexocinasa presente determina la velocidad de la reacción acoplada global y. por tanto, la velocrdad de formación del NADPH, la cual puede ser medida a 340 nrn

de uii produclo (o, de modo menos común, la velocidad dc desaparición de un sustrato). Las propiedades fisictiquimicac del producto o sustrato determinan el mEtodo especifico seleccionado para la cuaníificacihn. A menudo es conveniente "acoplar" el producto de una reacción a una deshidrogenasapara la cual este producto representa un sustrato (figura 8-5).

ES ESENCIAL DISPONER DE ENZlMAS PURAS PARA COMPRENDER SU ESTRUCTURA, SU FUNCIÓN,~ SU MECANISMO DE REACCION Y SU REGWLACION E:l conocimiento de las reaccionecy los intermediarios quimicus en las vias meiabólicas así como de los

Cuai

El objetivo de la purificacihn de la enziina es aislar una proteina enzimhtica especifica dc un cxtracio crudo de celulas que contienen muchos otros compcinentes. Idas moléculas pequeiias pueden eliininarse por dialisis o por filtracidn en gel, los Licidos nucleicos por precipitacihn con el antibiótico estreptomicina, etcktera. El problema es separar la enzima deseada de una me7cla de cientos de proteínas quirnica y fisicamente semejantes. En el cuadro &-2 se muestra el progreso de la puri~~cación tipica de una enzima hepática con una recupcraci6n adecuada y una purificación de 490 veces. Nótese la forma en que se calcuEan la actividad especifica y la recuperacibn de la actividad inicial El objetivoes lograr la actividad especiiica máxima ( m i dades de enzima por miligramo de proteína) coi1 la mayor recuperación posible de la actividad inicial.

Para la purificación se emplean crornatografía de intercambio ionico y cromatografía con soportes de exclusion de tamaño Los procedimientos de purificacibn clásicos útiles incluyen la precipitacilin con concentraciones salinas variables (por lo general con sulfato de sodio o de amonio) o solventes (acetato o etanol), la dcsnaturalizacidn diferencial por calor o pH, Ia centrifugación diferencial, la filtracihn en gel y la electroforesis. La absorción celcctiva y la elucion de las proteínas en

iesumen de un esqluemn típico de pu rificación de una e

1 Actividad accibn dc ia

(mCJ)* 100 00(. 98 995 90 .,. OOC

~ii~irria

-

iteina tota

1

(mrr)

Hornogene izado criidc Liquido sol~rcnadante I'recipitado con (NIld Precipitado con acetorl a 20 a 350/u Fracciones 80 a 1 1 0 e ri, columna DBAE I'recipitado con (NH4)?SO443 a 4 8% Prirneroc cristales Recristalixacion 49 O00 . -* mlJ = milienzima: milimolcs de sustrato que cambian por minu

-

A,.A

"A--""

1

L ~ U

29

20 12

49

.- ..---

celulosa de intercambio aniónico, dietilarninoetilcelulosa (DEAE del ingles, diefhyIunainoe/hyoy en !a de intercambio catiónico carboximetilcclulosa (CMC. dcl inglds, carhox,vmeih~~/celJul~ tambien han sido extremadamente utiles para la purificación extensa y ripida de proteínas. Por ejemplo. un extracto acuoso de tejido hepático se ajusta a pH 7.5, valor en el cual la mayoría de las proteínas tienen una carga negativa neta. Luego, se adiciona la mezcla de proteínas solubles a una oolurnna de celulosa D E A E amortiguada a pH 7.5, valor al cual llt;,AE tiene carga positiva. Las proteínas con carga negativa sc Lincn a DEAE por interacción de cargas opuestas, eii tanto que las proieínas sin carga o con carga positiva fluyen libremente a traves de la columna. Luego, la coliimna se eluye, por lo común usando iin gradiente de NaCl que va de concentración ba,ja a alta, disuelto en amortiguador con pH 7.5. Dado que CI-compite con las proteínas por sitios de fijación cn cl soporte con carga positiva, éstas se eluyen de manera selectiva, primero las que se enlazan débilmente y, al último, las de enlace fuerte. Separaciones proteínicas an5logac emplean un soporte crin cargia negativa como carboximetiIceIulosa o fosfocelulosa a un p l l algo menor, para asegurar que ias proteínas tcngaii una carga m i s positiva Las separaciones de proteínas también pueden lograrsc sobre nrateriales porosos conocidos como -'filtros moleculares". Cuando una mezcla de proteínas fluye a través de una columna que contiene un filtro molecular, las proteinac pequeñas se distribuyen cn Iris espacios entre las partículas y en los espacios internos o poros del soporte. Conforme urja me7.cla de proteínas de diferentes tarnafios fluye al través de la columna, la movilidad de las protefnas pequeflas se retarda en relación con proteínas demasiado grandcs para pasar estos poros. Asi, las proteinas grandcs salen de la columna antes que las menores. E1 perfil de la clución presenta un patrón graduado que va desde las proteinas mas grandes hasta las pequefias. Sin embargo, los filtros rnoleculares tienen capacidad limitada y eil general sOlo se usan después de haber logrado una piirificación previa por otras técnicas.

Los soportes de cromatografía por afinidad sirven para identificar regiones específicas de las enzimas L,a característica sobresaliente de la cromatografia por afinidad es sil capacidad para remover selectivamente de una mezcla proteínica compleja, una protcína particular o un pequeiio número de ellas. La técnica emplea un ligando inmovilizado que interactúai cspecificamente con la enzima cuya purificacilin se desea. Cuando la mezcla proteínica se expone a este ligando inmovilizado, las iinicas proteinas que se unen son las que interactúan fuertemente con él. Por su parte

la proteína indeseada fluye a lo largo de la columna y descarta. La proteina deseada se eluye del Iigando inmovilizado, por lo general con una concentración elevada de sal o de la Coma soluble dcl ligando. Las pusificaciones logradas por las técnicas de cromatngrafia por afinidad son iinpresioriantes. a menudo superando las posibles por la aplicaci~nsucesiba de numerosas técnicas clásicas. Los ligandos favorecidos son derivados dc sustratos y coenzimas adheridos por covalencia a un soporte como Sephadex. en general por niedio de utia mtilécula enla7~dorade 3 a 8 carbonos de longitud Sin embargo, la introducción de Hn "ligando" hidrbfobo complica la scparacihn, al agregar a la cromatrigrafia ese elem~ntohidrdfoha (vCase después), Entre Ins ejemplos de aplicación exitosa de la cromatograt'ía por aiinidad se incluyen la purificación de muchas dcshidrogenasas diferentes sobre soportes dc afinidad de NAD'. Dado que numerosas deshidrogcnasas puedcn fijarse y ser eluidas juntas cuando la columna es tratada con NAD' soluble, el emplco subsiguiente de sustsato (mas que de coenzima) a los soportes afínes o la elución con una "mezcla ternaría abortiva" de un producto y un sustrato han probado tener éxito en muchos casos. 5e

La crornatografía de ligando colorante y ligando hidrófobo son técnicas análogas de cromatografia por afinidad La crornatografia de Iigando colorante en soportes como Sepharose azul, verde o rojo y Ea cromatografia de ligando hidrofobo como octil o fenil-Sepharose son técnicas con relación estrecha con la crornatografía pos afinidad. La primera emplea como ligando inmovilizado a un colorante organice que sirve como análogo del sustrato, coenzima a efecror alostCrico. En general, la elución se logra usando gradientes salinus. En la cromatografía de ligando hidrlifobo, un hidrocarburo alquil o aril se adhiere a un soporte como Sephadex. La retención de proteínas en estos soportes comprende interaccioncc hidrofbbicac entre la cadena alquil y ias regiones hidrófobas de la proteina. Las proteínas se adicionan a soluciones que contienen una concentración alta de una sal (por ejemplo, [NH4]2S04)y se eluyen con gradientes decrecientes de la misma sal.

La tecnología del DNA recombinante puede ser una fuente abundante de enzimas Hasta fechas relativaniente recientes, los únicos materiales iniciales disponibles para preparar enzimas purificadas eran las células de animales, plantas o

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Bioquímica de Harper

bacterias, en Ias cuales se encuentran dichas enzimas. La cantidad existente de una enzima dada en muchos casos era muy pequefía, lo que imponía un límite máximo z la cantidad de enzima purificada que se podía obtener con un costo razonable. Esta situación se ha modificado en gran medida por la tecnología del DNA recombinante, ya que [os genes que codifican muchas enzimas se han donado y secuenciado y pueden colocarse en un vector de expresibn derivado de pllismido o fago, bajo el control de un promotor fuerte. Estos vectores se trasladan al interior de d l u las, ya sea de Escherichia coli, levaduras o de cultivos de mamíferos. En presencia de un inductor apropiado, la maquinaria de síntesis proteinica de la célula huésped se [leva a la shtesis de Ea enzima deseada. La purificación subsecuente se facilita tanto por las cantidades relativamente grandes de la enzima recombinante como por el hecho de que, al provenir de una forma de vida diferente a la del hubsped puede diferir en grado significativo de las propiedades de las proteínas de éste, como serfa Ea estabilidad al calor. Las levaduras varían desde pocos, hasta cientos de miligramos de proteína homogCnea por litro de celdas de Escherichia coli, cantidades adecuadas para los amplios estudios de cristalografía de rayos X y otros anklisis fisicos necesarios para deteminar la estructura tridimensional.

La electroforesis en gel de po!iacrjlamida detecta contarninantec La homogeneidad de las proteínas se valora mejor por electroforesis en gel de poiiacrilamida (EGPA) bajo diversas condiciones. La EGPA unidimensional de la proteina original revelará, si se aplica suficiente muestra, la presencia de contaminantes protelnicos mayores y menores. En la EGPA bidimensional (O'Farrell), la primera dimensibn separa a las proteinas desnaturalizadas con base en sus valores pI, equilibrindolos en un campo eldctrico que contiene urea y se mantiene un gradiente de pH por los anfblitos polimerizados. Entonces, la segunda dimensibn separa a las protefnas, despuds de su tratamiento con SDS, con base en los tamailos moleculares de sus unidades protoméricas.

LAS EN2IMAS PUEDEN ENCONTRARSE EN ORGANELOS ESPEC~FICOS El ordenamiento espacial y la compartimentaiizacibn de enzimas, sustratos y cofactores dentro de las c&lulas son de importancia cardinal. Por ejemplo, en las cklulas hepáticas, las enzimas de la gluc6lisis están localizadas en el citoplasma, en tanto que [as del ciclo del

(Capitulo 8)

hcido cíirico están en las mitocondnas. La distribución de las enzimas entre !3s organelos subcelulares puede estudiarse despues de fraccionar los hornogeneizados de células mediante ultracentrifugación. Entonces, se examina el contenido enzimátiw de cada fraccidn. La localizaci6n de una enzima particular en un tejido o cdlula, en estado relativamente inalterado, se puede lograr frecuentemente por procedimientos histoquimicos (histoenzimologia}. Cortes delgados de tejido congelado (2 a 10 pm)son tratados con un sustrato para una enzima particular. En las regiones donde se encuentra la enzima se forma el producto de la reacción catalizada por ella. Si el producto es colorido e insofuble, permanece en el sitio de formaci6n y sirve como un indice para la localizaci6n de la enzima. La histoenzimologia proporciona una imagen grhfica y relativamente fisiológica de los patrones de distribucibn enzimática.

LAS ISOZIMAS SON FORMAS F~SICAMENTEDISTINTAS CON LA MISMA ACTIVIDAD CATALITICA Cuando se aplicaron las tdcnicas de purificación de enzirnas a la malato dechidrogenasa de diversas fuentes (por ejemplo, hfgado de rata y Escherichia coli), pronto se obsenib que, si bien la malato deshidrogenasa de hlgado de rata y la de E. coli, catalizan la misma reaccidn, sus propiedades físicas y quimicas exhibían numerosas diferencias importantes. Pueden existir formas físicamente distintas con la misma actividad catalitica en diferentes tejidos del mismo organismo, en distintos tipos celulares, en compartimientos subcelulares o en pr-otas como E coli Este descubrimiento fue una consecuencia de aplicar los procedimientos de separacidn electroforktica a la separaci6n de entidades electroforéticamente distintas de una actividad enzimktica particular. Mientras que el ttmino "isozima" (isoenzirna) podría utilizarse para englobar a todos los ejemplos anteriores de formas fisicarnente distintas con una actividad catalftica dada, en la prhctica, en especial en la medicina clínica, la "isozima" tiene un significado más restringido, es decir, las formas distintas y físicamente separables de una enzima dada, presentes en tipos celulares diferentes o en compartimientossubcelulares de un ser humano. Las isozimas son comunes en los sueros y los tejidos de todos los vertebrados, insectos, vegetales y microorganisrnos unicelulares. Tanto la clase como el número de enzima involucradas es igualmente diverso. Se han localimdo isozimas de numerosas deshidrogenasas, oxidasas, tramaminasas, fosfatasas, transfosforilasas y proteasas. Tejidos diferentes pueden contener isozimas distintas y tstas a su vez diferir en su afinidad por los sustratos.

Enzimas . propiedades generoles

La capacidad para separar e identificar isozimas tiene valor diagnóstico El interds mCdico en las isotimas fue estimulado por el descubrimiento de que tos sueros humanos contenían varias isozimas de la lactato deshidrogenasa y quesus proporciones relativascambian significativamente en ciertos estados patol~gicos.Posteriormente, se han descrito numerosos ejemplos adicionales de cambios en las proporciones de isozimas como consecuencia de una enfermedad. Las isozimas de la lactato deshidrogenasa del suero pueden demostrarsesometiendo una muestm de suero a laelectroforesis, usualmente a pH 8.6,usando un gel de almidon, agar o poliacrilamida como soporte. Las isozimas tienen diferentes cargas a este pH y emigran a cinco regiones distintas del electroferograrna. Luego, se localizan por medio de su capacidad para catalizar la reducción de un colorante incoloro a su forma colotida e insoluble. Una mezcla tipica para anhlisis de deshidrogenasa contiene NADA,un sustrato reducido, la forma oxidada de un colorante redox como nitroaml de tetrazolio (NBT, del ingles, litro blue lelrmolrum) intermediario necesario para la transferencia de eIectrones de NADH a NBT, amortiguador e iones activantes segun sea necesario. La figura 8 4 ilustra la aplicacibn de este tipo de anklisis para visualizar y cuantificar isozimas de lactato deshidrogenasa shica (LDH, del inglks, lactnle dehydrogenuse) en el laboratorio clínico. La lactato deshidrogenasa cataliza la transferencia de dos electrones y un ion hidrbgeno del lactato al NAD' (figura 8-1). La reaccibn procede a una velocidad mensurable s61o en presenciade la lactato deshidrogenasa. Cuando la mezcla se rocía sobre el electroferograma y se incuba a 37 "C,tienen lugar las reacciones coordinadas de transferencia de electrones s61o en aquellas regiones donde se encuentra la lactato deshidrogenasa (figura 8 4 ) . Las intensidades relativas de las bandas pueden ser cuantificadas por un foriimetra de barrido (figura 8-7). La isozima mas negativa, se denomina 1

Las isozimas son productos de genes estrechamente relacionados

Las enzimas oiigoméricas con varios protómeros disimiles pueden existir en diversas formas. Con frezuencia, un tejido produce un protornero de manera predominante y otro tejido sintetiza un prothmero diferente. Si es posible que Cstos se combinen de varios modos para construir una enzima activa (por ejemplo, un tetrhmero), se dice que se han formado isozimas de esa actividad enzirnática. Este fenómeno se representa despues mediante una enzima de importancia en el diagnóstico: la deshidrogenasa Ifictica.

(Lactato)

sH2 WCTATO S k D E S H IDROGENASAJ

85

(Pjruvatc)

FMS reducido

~~C'oxidado

NBT oxidado (incoloro)

(azul)

Flgura 8 4 . Reacciones acopladas para la demostración de la actividad de la lactato deshidrogenasa en un etectroferograma. (NBT nttroazuF de tetrazoilo, PMS, metoculfato de fenacina.)

Las isozimas de la laciato dcshidrtigeiiasa difieren en el orden de la estructura cuaternaria. La molécula oligomérica de la lactato deshidrogenasa activa (peso molecular de 130 000) consiste en cuatro protomeros de dos tipos. E-1 y M (peso molecular aproximado de 34 000). Sólo la molécula tetramirica posee actividad catalitica. Si cl urden no e i iinportante, estos prothmeros pueden Fer combinado'; de cinco maneras diferentes como se muestra en seguida:

HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM

Market ha usado condiciones que se sabe disgregan y reforman la estructura cuatemaria para esclarecer las relaciones entre las isozimas de la lactato deshidrogenasa i,, o de la lactato deshidrogenasa Is. La separacidn y reconstitución no produce nuevas isozímas las cuales, por tanto, consisten en un solo tipo de protómeso. Cuando una mezcla de lactato deshidrogenasa I l y lactato deshidrogenasa 1s son sujetas al mismo tratamiento, tarnbikn se producen las lactato deshidrogenasas Iz, 1, e 14. Las proporciones aproximadas de las isozimas encontradas son las que resultarian si la relacibn fuera: lsazirna lactato

deshidrogenasa 11 12 13

14

15

Subunidades HHHH HHHM HHMM HMMM

MMMM

86

Bioquimica de Harper

(CapifuJo 81

NORMAL

Figura 8-7. Patrones normal y patolbgioode las isozimas de la laetato deshidrogenasa(LDH) en suero humano. Las isozimas de LDH del suero fueron separadasen acetatode celulosa a pH 8.6 y tenidas en busca d e la presencia d e enzimas. El fotbmetro de rastreo muestra la produccibn de las isozimas El patrbn A es suero de un pauente con infarto del rniocardio, B es suero normat y C de un paciente con enfermedad hsphtica. (Cortesía del Dr. Melvin Black y Mr. Hugh Miller, St Luke's Hospital, San Francisco.)

La sfntesis de subunidades H y M es controlada por distintos Iocr geneticos que estiin expresados de manera diferencial en diversos tejidos, por ejemplo, el coraz6n y el mUsculo esquel&ico. EL ANALISIS CUANTITATIVO DE CIERTAS ENZIMAS PLASMÁTICAS TIENE SIGNIFICADO DIAGNOSTICO Ciertas enzimas, proenzimas y sus sustratos se encuentran siempre en la circulacibn de las personas normales y realizan una funcibn fisiológica en la sangre. Algunas de estas enzimas plasmhticas funcionales son la lipoproteinlipasa, la seudocolinesterasa y las proenzimas de la coagulacibn sanguinea y de la disolución del cohgulo. Generalmente son sintetizadas en el hlgado, pero tarnbikn se encuentran en la sangre a concentraciones equivalentes o mayores que en los tejidos. Como lo dice su nombre, las enzimas plasmáticas no funcionales no desempeiian ninguna funcibn conocida en la sangre. Los sustratos de ellas con frecuencia faltan en el plasma y las propias enzimas se encuentran en la sangre de personas normales en

valores hasta de un mil1611 de veces inferiores a los de los tejidos. Su presencia en el plasma en cifras mayores que tos valores normales sugiere una velocidad aumentada de destruccibn tisular. Por tanto, la medicion de estos valores de enzimas plasmhticas no funcionales puede constituir para el médico una prueba valiosa de diagnóstico y pronóstico clínico. Las enzimas plasrnhcicas no funcionafes comprenden a las que existen en las secreciones exocrinac v a las enzimas intracelulares verdaderas. Las enzimas exocrinas, amilasa pancsektica, lipasa, fosfatasa biliar alcalina y fosfazasa ácida prostática, difunden en forma pasiva al plasma. Las enzimas intracelu lares verdaderas estiin normalmente ausentes de Ea circulacion.

La destrucción normal de c&lulas conduce a la presencia en plasma de concentraciones bajas de enzimas no funcionaIes Los valores bajos de enzima no funcionales que se encuentran por lo general en el plasma, aparentemente proceden de la desmiccibn rutinaria normal de los eritrocitos, leucocitos y otras cdlulas. Con la muerte acelerada de las c~lulas,las enzimas solubles entran

Enzimas. propiedades generales

en la circulación. Aunque los valores elevados de enzirnas plasmiiticas se interpretan generalmente como prueba de necrosis celular, el ejercicio intenso tambikn libera cantidades importantes de enzimas musculares.

Las enzimas plasmáticas no funcionales ayudan en el diagnóstico y pronóstico Por mucho tiempo, la práctica profesional médica ha usada la cuantificacibn de ciertas enzimas plasmaticas no funcionales. Esta valiosa inforrnacidn para el diagnóstico y el pronóstico se obtiene muchas veces con equipos totalmente automáticos. El cuadro 8-3 contiene una lista de lar enzimas principales utilizadas en el campo de la enzimologla para diagnóstico. En el Apendice se incluye la escala de valores normales de las principales enzimas usadas con propositos de diagnostico.

Cuadra 8-3. Principales enzimas séricas utitizadas en el diagnóstico clinico. Muchas de kstas no son cas para la enferm ncionada

-

-.

A

I Usa

Enzinna sérica

,-.-A-

--

uiirriuiriicu uriiiciuaI

A,minotrans!ferasas

Aspartat o aminoti ,* rerasa (rtST o SGOTI Alanina aminotr ferasa (A LT o SGR

."...

.,,.

-,,,,,-M

1 Infariu uei ~ n i u

. ....

-,

:reat~tisaguda

--

hepatote n-

'eruloplasniina

ticu

:rrnedad Ij c

-

-"

Creatinacine

stornos m usculares e infarto del mi0cardio

F

Carcinoma rnr la prhstata

iíio

de

-

Eosfatasa alcalina (isozi- Varias enfermedades bseas, tras'tornos he1 1smas) -

trucitivos

y-Glutamil t k m 1 3 p ~ C l ~1 ,Varias ~ ~ a entermcdades

L actato d e . . (isozirnas)

nasa Infarto del miocardio

--

--

Lipasa

-

he-

Pancreatitis aguda

--

* 87

LAS ENDONUCLEASAS RESTRICTIVAS FACILITAN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS El diagnbstico de las enfermedades genéticas ha recibido un impulso tremendo con la tecnología del DNA recombinante. Aunque desde hace tiempo se sabe que todas las enfermedades moleculares son consecuencia de una alteracibn del DNA, las técnicas para el examen directo de las secuencias del DNA s610 se han desarrollado en épocas recientes. El desarrollo de pruebas de hibridización para fragmentos de DNA ha conducido a técnicas de sensibilidad suficiente para investigar, desde antes del nacimiento, los trastornos hereditarios p r mapeo de enzirnasde mtricci6n det DN A derivado de las cklulas fetales en el líquido amnibtico. Las pruebas para el DNA pueden, en principio, ser preparadas para el diagnástico de la mayoría de las enfermedades gendticas. Por ejemplo, para la detección prenatal de talasemias (que se caracterizan por un defecto en la sintesis de las subunidades de la hemoglobina; capitulo 7), una prueba preparada contra una porcidn del gen para una subunidad de una hemoglcbina normal puede detectar un fmgmento de rwtnccibn acortado o inexistente, el cual proviene de unasupresidn en ese gen, como sucede en atgunas alfa talasemias y en ciertos tipos poco frecuentes de beta y beta, delta talasemias. De manera alternativa, se ha preparado un detector o probador de cDNA sintktico que se hibridiza a la secuencia de una beta-globina que contiene una rnutacidn sin sentido, presente en ciertas beta-talasemias, pero no en el gen normal de la beta-globina. La ausencia del inhibidor de la proteasa plasmática alfa,-antilipsina se ha relacionado con el enfisema y con la cirrosis hephtica infantil. La presencia de una alfa,-antitripsina inactiva se ha identificado por un probador construido contra el alelo inactivo que contiene una mutacián en un punto en el gen para la alfai-antitripsina. Los detectores de hibridizacidn tambitn pueden utilizarse para averiguar alteraciones genkticas que conducen a la pdrdida del sitio de una endonueleasa de restriccibn (capitulo 42). Por ejemplo, la mutación en un punto del coddn Glu (GAG) al codbn Y al (GTG) tipica de la enfermedad de c6lulas falcifonnes puede detectarse en el gen de la beta-globina en las células contenidas en cantidades tan pequeiías de hasta 10 mL de liquido amniótico usando la endonucleasa de restriccion MstII o SauI.

LA DIGESTIQN RESTRICTIVA DE PROBADORES PUEDE REVELAR GENES H O M ~ L O G O SCON DIFERENTES SECUENCIAS DE BASES Los detectores de DNA tambibn pueden usarse para encontrar secuencias de DN A íntimamente enlazadas

al gen que interesa, pero en realidad no dentro de 4. Los análisis pueden extenderse a la identificacibn de variaciones específicas de cromosomas (diferencias en la secuencia entre cromosomas hom6logos). La digestión del DNA con una endonucleasa de restricci6n genera diferentes mapas (patrones de fragmentos de DNA) de genes hornúlogos que contienen secuencias diferentes de bases. Este fenómeno se denomina "polilimorfismo d e la Longitud del fragmento de restriccibn" (PLFR). En una enfermedad genética ligada a un polimorfismo de la longitud de restriccibn, el portador de la enfermedad poseerá un cromosoma con un gen n o m a l y uno con un gen defectuoso. Cuando los fragmentos de restriccibn se analizan y sondean, se detectan dos bandas de hibndizacibn (que es distinto a una sola banda cuando ambos genes son idénticos). Los descendientes que heredan el cromosoma portador del defecto exhiben una sola banda de hibridizacibn que difiere de la producida por cromosornas normales. El fenbmeno de PLFR relacionado se ha aplicado al anhlisis de rasgo de las cdlulas falcifomes (bastsándose en un PLFR I-lpal relacionado) y de la beta-talasemia (ligada a un PLFR HindIII y BamHII. Se h a desarrollado una exploracibn basada en los PLFR para identificar la fenilcetonuria infantil (capítulo 32): Sin embargo, debe notarse que este enfbque general no es infalible, puesto que el PLFR no causa la enfermedad sino que simplemente se localiza cerca del gen defectuoso. Al parecer, la importancia firtura del PLFR radica en que es punto de partida para la identificacion del gen de las enfemidades relacionadas. Este enfoque que se ha empleado recientemente en la búsqueda de los fenómenos mutacionales que intervienen en la formación de los retinoblastomas y la enfermedad de Huntington. En el capitulo 42 se encuentran más ejemplos de los usos de las enzimas de restriccibn para diagnóstico.

RNA CATALITICOS Aunque es evidente que no son proteinas, ciertos ácidos ribonucleicos (RNA) presentan actividad catalitica altamente específica de sustrato. Estos RNA, que cumplen con todos los criterios clhsicos de la definicibn de enzirnas, se conocen como ribozimas. Aunque los sitios de accibn de las ribozimas se limitan a los enlaces fosfodiésteres de RNA, la especificidad de su acci6n se compara plenamente con la de las enzimas clksicas. Las ribozimas catalizan la trunsesterificacibn y, en iiltirna instancia, la hidrólisis, de los enlaces fosfodidcttres en moléculas de RNA. Estas reacciones son facilitadas por grupos libres --OH, por ejemplo, en residuos de guanosil. Las ribozimas inter-

vienen de manera clave en procesos de separacidn de intrones esenciales para la conversián de premRNA a m RNA maduro (capítulo 39).

RESUMEN Las enzimas son catalizadores protelnicos que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiolbgicos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzim htica con frecuencia causan patología. Las enzimas que catalizan reacciones que comprenden trasferencia de grupo, isomerimción, oxidomducción o sintesis de enlaces covalentes necesitan un cosustrato conocido como coenzima. Dado que numerosas coenzimas son derivados de la vitamina B, las deficiencias vitamínicas pueden afectar de modo adverso la funci6n enzimiitica y, por ende, la homeostasia. Varias coenzimas también contienen e[ nudebtido AMP. La mayoría de las enzimas tienen especificidad elevada por sus sustratos, coenzirnas y tipo de reaccion catalizada. Sin embargo, algunas proteasas tambiéri escinden esteres. Las enzimas que actúan sobre sustratos de peso molecular bajo, tambikn pueden reacciona. con análogos de sustratos, pero en general a velocidades bajas. La medicihn de la actividad enzimática es fundamental pam la cuantificacián de enzimas en investigacibn o en e3 laboratorio clínico. La actividad de deshidrogenasas dependientes de NAD(P)' s e analiza en espectrofotrimetro a través de la medición del cambio en la absorcion a 340 nrn que acompafla a la oxidacibn o reducción de NAD(P)+/NAD(P)H. Acoplar otras enzimas a las deshidrogenasas puede facilitar su análisis. En la investigacidn de su estructura, mecanismo de accián y regulacibn de su actividad, las enzimas deben purificarse a una homogeneidad mayor de 95 por ciento. Las tdcnicac para purificar enzimas incluyen precipitación selectiva por sales o solventes orgánicos y cromatografía en soportes de intercambio idnico, fi ttracibn en gel, afinidad por sustrato o interaccibn ligando colorante o ligando hidrbfobo, La capacidad para explotar tdcnicas de QNA secombinante en la expresión de enzimas en hutspedes utiles ha revolucionado la puriftcacibn de enzimas al proporcionar cantidades grandes de enzimas que en la mayorÍa de tos casos ya pueden purificarse hasta la homogeneidad. El progreso de una purificación se valora con la medición del incremento en la actividad especifica de la enzima (actividad por unidad de masa) y su homogeneidad final mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA). La localizacibn intracelular precisa de enzimas se infiere por medio de tbcnicas de histoquimica y fraccionamiento celular acopladas con análisis enzimático de cortes de tejido o de fracciones de hornogeneizados celulares. En todas las formas de vida y tejidos existen isozimas, que son formas fisi-

Enzrmas: propiedades generales

misma actividad catatítica. Patrones distintivos de isozimas de enzimas skricas no funcionales revelan daíio de tejidos humanos específicos y proporcionan informacibn valiosa para el diagnóstico y el pronostico. Por Ultimo, la propiedad de las endonucleasas restrictivas para detectar cambios sutiles en la estructura de los gcnes permite al médico el diagnhstico de enfermedades genkticas donde las mucamente distintas con la

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taciones conducen a sintesis de enzimas defectuosas o no funcionales. Aunque casi todas las enzirnas son proteínas, se conocen RNA catalíticos, como las ribozimas que catalizan de manera muy especifica la hidrolisis de enlaces fosfodiéster en el RNA. Estas reacciones son importantes en fenómenos de procesamiento que incluyen la maduración de pre-mRNA.

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Vicfor W Rodwell, PhD

Muchas caracterisiicas de la cinetica enzirnática provienen, por lógica, de conceptos propios de la cinbtica de reacciones químicas no catalizadas. Por tanto, este capitulo describe primero aspectos de la teoría de la velocidad de reaccidn, válidos para reacciones químicas en general y luego considera los factores exclusivos para reacciones cata1izadas por enzimas.

Todos los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas (concentración de enzima y de sustrato, temperatura, pH y presencia de inhibidores) tienen interés en clínica. EI principio biológico principal del estado homeostático de buena salud requiere que la composición del medio interno corporal se conserve dentro de limites relativamente estrechos. Por tanto, la buena salud exige no sólo que se produzcan cientos de reacciones catalizadas por enzimas, sino que procedan a velocidades apropiadas. No lograrlo perturba el equilibrio horntostatíco de los tejidos, con profundas consecuencias potenciales. El medico debe comprender el modo en que el pH, la concentraci6n de enzimas y de sustrato así como los inhibidores influyen en las velocidades de esas reacciones. Algunos ejemplos escogidos ejemplifican sobre este puitto. La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzirnas responde a las desviaciones sutiles del pH intracelular que caracterizan a la acidosis o alcalosis metabdlica. Además, dado que esta velocidad se eleva o baja en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban

la homeostasia al modificar la velocidad de numerosas reacciones catalizadas por enzirnas. Sin embargo, eszos cambios mínimos pueden convertirse en ventaja para el mtdico. Por ejemplo, la disminucibn en la actividad de todas las enzimas que tiene lugar a temperatura corporal baja (hipotermia), puede explotarse para reducir la demanda rnetabolica global durante cirugia a coraz6n abierto o en el transporte de órganos para trasplante quirúrgico. Por su parte, la toxicologia y la farmacología aprovechan eI conocimiento de los factores que modifican la velocidad de reacciones enzimiticas. Los venenos metabiilicos como los mercuriales, el curare y los gases nerviosos ejercen su toxicidad mediante la inhibicibn de enzimas y en consecuencia toman lentas o anulan reaccionasmetaMlicas esenciales. Por ultimo, numerosos fármacos importantes en terapéutica actúan por reduccjon de las velocidades de reacciones metabblicas al competir con el sustrato natural por una enzima clave. A menudo estos medicamentos tienen una estructura anhloga a la del sustrato natural. Ejemplos son la lovastatina y la zidovudina (AZT), famacos usados para tratar la hipercolesterolemia y el SlDA, respectivamente. Ambos tienen efectos teraptuticos mediante la alteracion de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

LAS REACCIONES PROCEDEN A TRAVÉS DE ESTADOS DE TRANSICIÓN El concepto de estados de transicidn es fundamental para la comprensibn de las catfilisis de cualquier tipo, incluyendo la enzirnhtica. Por ejemplo, considkrese unareacción de desplazamiento donde un grupo L que

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Bioqrcím ica de IJarpw

se desprende, adherido en uii principio a R, es desplazado por la entrada del grupo E: E + R-L

=

E-R+

L

En realidad este desplazamiento pasa por un estado de transicion, E- R.. L, cuya íormacibn y desintegración subsiguiente puede representarse con dos ''reacciones parciales". cada una con un cambio caracteristico en la energia libre: E + R-L E..R*.L

= E. .R. . L = E-R+ L

AGF

reaccionar; y 2) para cada reaccion química. hay una barrera energetica que debe superarse para que la reacción tenga lugar. Para que una colisibn termine en una reacción, las moléculas reactantes deben poseer energia suficiente para sobrepasar esta barrera energhtica. Por tanto, cualquier cosa que: a) eleve la energía cinética de las nioléculas reactantes, b) abata la barrera energktica para la reacción o c) incrernente la frecuencia de colisión, deberá aumentar la velocidad de reacción.

Temperatura

Gn

AGF y AGD son 10s cambios de energia libre que se producen en la formación y dcsintegracibn del estado de transicibn, respectivamente. EZ AG, cambio de energía libre relacionado con la reacción global, es igual a la suma de las energías libres de Ea Iormacibn y degradación del estado de transicihn:

De la misma manera que en cualquier ecuación con dos tCrminos, no es posible inferir el signo o magnitud de AGF y AGn por observación del signo algcbraico y magnitud de AG. De otro modo, es iniposible, a partir de la concideracihn del cambio de energia libre en la reaccihn global, AG, inferir dato alguno respecto a los cambios de la energia libre relacionados con la f o m a ción y degradación de los estados de transición, Dado que la catalisis se relaciona de manera intima con AGF y AGn, se deduce que la termodinamica de la reacción global (AG) no puede proporcionar indicios del camino que una reacción sigue [es decir. su mecanismo). Esta es tarea de la cinética. Reacciones m i s complejas involucran varios y sucesivos estados de transición y proceden a travhs de una seric de reacciones parciales, cada una con un cambio de energia libre. Es importante observar que el cambio de energia libre para la reacción global, AG, es independiente del número de estados de transición. Esto se deriva del hecho de que AG es la suma algebraica de los cambios de energía libre para cada reacción parcial participante.

Elevar la temperatura incrementa el número de moléculas que pueden reaccionar, ya que aumenta la energia cincrica e incrementa la frecuencia de las colisioncs. Como se muestra en la figura 9-1, el numero de mol&culas cuya energia cindtica excede la barrera energktíca para la reaccion (barra vertical) aumenta cuando la temperatura sube desde un valor bajo (A) a travds de uno intermedio (B) a uno alto (C). Adernhs, cualquier elevación de temperatura, acelera el movimiento molecular y, por ende, la frecuencia de colisión. Los dos factores contribuyen al incremento en la velocidad de reacción que acompafia a un aumento dc temperatura. Sin embargo, este incremento de la velocidad de reacción no continua de manera indefinida, dado que finalmente se alcanza una temperatura a la cual las mol6culas reactantes ya no son estables. Esta temperatura limitante tiende a ser en extremo elevada para reactantes inorghtcos, modwadamente alta para gran parte de las rnolkculas orgánicas, pero bastante menor de 100 "C para la mayoría de las reacciones de interés biolbgico.

Concentración de reactantes A concentraciones elevadas de reactantes, tanto la cantidad de mol&culas con energia suficiente para reaccionar como su frecuencia de colisión son altas. Esto es verdad, ya sea que todas o s61o una fraccion de las mol&culasposean energia suficiente para reac-

Barrera de energia

NUMEROSOS FACTORES MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN La teoria cinética o de colisión de la cindticaquimica, incorpora dos conceptos claves: 1) s61o las maltculas que chocan; es decir, que se acercan una de otra a distancias suficientes para formar enlaces, pueden

Figuta 3-1. Barrera energética para las reaeeiones químicas

cionar. Considtsrense reacciones que comprendan dos moléculas diferentes, A y R:

la expresidn apropiada de la velocidad es: Velocidad a [AnBd

La reversibilidad se presenta por flechas dobles: Duplicar la concentración de A o de 13 elevará la velocidad de reacción al doble, Dupticar la concentración de ambas. A y B, incrementarh cuatro veces la probabilidad de colision. Por tanto, la velocidad pe reacción aumenta al cuádruple. I,a velocidad de reaccihn es proporcional a las concentraciones de las moléculas reactantes. Los corchetes denotan concentraciones molaresk* cr sigriifica "proporcional a". La expresihn de la velocidad es:

Esta expresión se lee: "ri moléculas de A y m moléculas de B están en equilibrio con A,B,,". El signo "proporcional a" (E) puede reemplazarse con un signo de igualdad mediante la inserción de una constante de proporcionalidad, k, característica de la reacci6n en estudio. Para el caso general

Velocidad E [rnolbculas reactantes]

o Velocidad s: [A] [B]

las expresiones para las velocidades de reacción hacia la derecha (velocidad I ) y la izquierda (velocidad -I) son:

Para la situaciiin representada por:

la expresihn de la velocidad es: Velocldad m [A][B][B]

Cuando las velocidades de las reacciones hacia la derecha e iquierda son iguales, se dice que el sistema esta en equilibrio, es decir,

o Velocidad or [A][B]~

luego Para el caso general donde n moléculas de A reaccionen con m rnoldculas de B:

la expresibn de la velocidad es: Velocldad a [Aln[BIm

K,, es una proporción de constantes de velocidad Dado que todas las reacciones qulmicas son reversibles, para la reacci6n inversa donde A,B, forman n moléculas de A y m moléculas de B:

* Hablando de manera estricta, en lugar de concentraciones debería decirse actividades molares.

ki[AIn[B]"' = k-~[AnBrn]

Y

La proporción de ki a kise conoce como la constante de equilibrio, TG,. Deberh tenerse en mente las siguientes propiedades importantes de un sistema en equilibrio. 1) La constante de equilibrio es la proporción de las constantes de la velocidad de reacción, kik-1. 2) En el equilibrio, las velocidades (no las constantes de la velocidad} de las reacciones hacia la derecha y hacia Ia izquierda con iguales. 3) El equilibrio es un estado dinámico. Aunque en el equilibrio no existe un cambio neto en la concentracion de nioléculas reactantes o productos, A y B se están convirtiendo de manera continua a AnRm y viceversa. 4) La constante de equilibrio puede tener un valor numérico si se conocen las concentraciones de A, B y AnBm en el equilibrio.

94 a Bioauimica de Hur~er

AGO puede calcularse a parkir de K,, La constante de equilibrio se relaciona con AG' de la siguiente manera:

R es la constante de los gases y T, la temperatura absoluta. Dado que estas se conocen, el conocimiento del valor numérico de K, permite el chlculo del valor para AGa. Si la constante de equilibrio es > 1, la reacción es espontánea; es decir, se favorece la reacci6n según se ha escrito (de izquierda a derecha). Si es < 1, tiene lugar lo contrario; es decir, es mas probable que la reacción proceda de derecha a izquierda. Sin embargo, nbtese que aunque la constante de equilibrio para una reacci6n indica la direccidn a la cual una seaccibn es espontánea, no indica si tendra lugar con rapidez. Esto es, no informa acerca de la magnitud de la barrera energttica para la reacci6n (es decir, AGF, vkase antes). Esto se debe a que K, determina a AGO, que previamente se demostrb concierne sólo a los estados inicial y final. Las velocidades de reacción dependen de l a magnitud de la barrera energética, no de la magnitud de AGO. La mayoríade los factores que afectan la velocidad

de las reacciones catalizadas por enzirnas lo hacen mediante el cambio de la concentraci6n local de reactantes.

enzimas disminuyen la barrera energéticaen una reaccibn. En consecuencia, una proporcibn mayor de moléculas de sustrato son capaces de reaccionar. Sin embargo, nbtese que si bien las enzimas afectan a AGr;, no modifican a AG. La AGn de la reacci6n global es igual estt catalizada o no por enzimas. Debido a que la constante de equilibrio para una reacción química es una funcibn del cambio de energia libre estandar para una reacciiin

se deduce que en las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto sobre la constante de equilibrio para una reaccibn.

Las enzimas catalisan la formación o rotura de enlaces covalentes Para la reacci6n de transferencia de grupo:

un grupo, el G, es transferido de un donador, D 4 , a un aceptor, A. La reacción global comprende tanto la rotura del enlace D-G como la forrnacidn de un nuevo enlace A-G. Las reacciones de transferencia de grupo, catalizadas por enzimas, pueden representarse de la siguiente manera:

Esto enfatiza tres características importantes de las reacciones de transferencia de grupo, caializadas por enzirnas:

Las enzimas proporcionan estados de transición alteinoc Igual que en toda catálisis verdadera, las enzimas se recuperan sin cambio después que la reaccibn termina. No obstante, durante el proceso, las enzimas participan de manera directa en la formación de estados de transición. De manera tipica, los estados de transicibn enzima-sustrato estan en niveles energeticos significativamente menores que los estados de transici6n cuando la misma reaccibn procede en ausencia de catalisis enzimhtica. Por tanto, un factor importante que contribuye a la capacidad de una enzima para acelerar la velocidad de una reacci6n dada es que el AGFpara formar un estado de transicidn enzima-sustrato sea bastante menor que el AGF para la reaccibn no catalizada correspondiente. De otra manera, Ias

1) Cada reaccibn parcial comprende tanto la rotura como 3a formacibn de un enlace covalente. 2) La enzima es un reactante coeguivalente con D-G y con A. 3) Si bien en la reaccidn global la enzima actiia de manera catalitica (es decir, se requiere 5610 en oligocantidades y puede recuperarse sin cambio cuando lareaccibn ha terminado), para cada reaccidn parcial, la enzima es un reactante estequiomktrico (esto es, se requiere en proporcibn molar 1: 1 con los demhs reactantes). Numerosas reacciones bioquímicas adicionales pueden considerarse casos especiaks de la transferencia de grupo en la cual D, A o ambas pueden estar ausentes. Por ejemplo, reacciones de isomerización (como la interconversión de glucosa 6-fosfato y glu-

Enzimus: cinética

cosa 1-fosfato) podrían presentarse como reacciones en las cuales tanto D como A estan ausentes:

en términos de la constante de disociacibn, &, para el complejo R-C o la constante de equilibrio para la reacción: R-C

Los complejos EnzS participan en la catálisis Las representaciones anteriores todavia no son suficientes para enfatizar otra característica fundamental de las reacciones catalizadas por enzimas, la participacibn en la reacción global de dos o más fonnas intermediarias del complejo EnzS y la participación consecuente de u11 canjunto de varias reacciones parciales secuenciales. Una representación de una reacción de transferencia de grupo que enfatiza estas características podria ser:

9j

R*C

Así, un valor bajo para Kd representa un complejo R - C fuerte. Una consecuencia importante es que cuando un reactivo se une a un catalizador, éste aumenta la concentracion del reactante en un Area localizada de la solución, por arriba de su concentracion en soluci6n libre. De este modo, ya no m m o s con una soluci6n quimica homogbnea, sino heterogknea. Si el catalizador para una reacción bimolecular (dos reactantes) se une a ambos, laconcentracibn local de cada uno aumenta en razún de un factor que depende de su afinidad individual (valor &) por el catalizador. Puesto que la velocidad de la reaccibn biomolecular global

es, como se ve, proporcional a la concentracibn de ambos, A y B, la fijación de los dos A y l3 por e! catalizador puede conducir a un incremento enorme (varias miles de veces) en la velocidad de la reacción

en la cual EnzG, EnzG* y EnzG* * representan sucesivamente los complejos EnzS formados durante la reaccion global.

global.

Las enzirnas incrementan la proximidad del reactivo y la concentración local

LA CATALISIS SE PRODUCE EN EL SITIO ACTIVO

Para que cualquiera de las reacciones anteriores tenga lugar, todos los reactantes deben encontrarse, uno del otro, a una distancia que posibilite la formacidn de enlaces (o su rotura). Para una solucibn quinrica homogenea, en ausencia de catalizadores, la concenación de las mol~culasreactantes es constante en toda la solución. Estacondición yano se cumple despuks de introducir un catalizador. Los catalizadores tienen sus propios dominios de superficie para unirse a las moIdculas reactantes. Aunque este enlace es un procese reversible, la constante global de equilibrio para la unión favorece fuertemente las formas enlazadas miis que las libres de mol6culas reactantes. De manera cualitativa, esto podria representarse asl:

Una propiedad esencial de las enzimas es su capacidad para fijar los reactantes la cual se acompafia de incremento en la soncenmación local de estos y, por ende, en la velocidad de la reaccihn. Las enzirnas son catalizadores extremadamente eficaces y muy selectivos. Para comprender estas propiedades distintivas de las enzimas, se ha introducido el concepto de sitio "activo" o "catalitico"*. El gran tamafío de las proteínas en relación con los sustratos condujo al concepto de que una region restringida de la enzima, el "sitio activo", se ocupaba de la catálisis. Inicialmente, era extremadamente enig-

Reactante + catarizador complejo reactante-catalizador

* Aunque en muchos textos se establece una equivalencia

Cuantitativamente, se podría expresar la fortaleza de la relación entre un reactante, R, y un catalizador, C,

entre los sitios activos y los catalíticos de las enzimas, hay

sobre éstas, otros sitios "activos" que se relacionan con la regulación de la actividad enzimática m& que con la enzimologIa intermediaria del proceso cataIítico.

matico para los bioquimicos el porqug las enzimas cran tan grandes ciiando s6Io una porción de su estmctura parecía requerirse para unirse con el sustrato y para la catAlisis. Hoy en día, se reconoce que una porcion mucho mayor de la proteina actua reciprocamente con el sustrato que la que se suponia antes. Cuando aparece también la necesidad de sitios alostdricos de igual ramaiio ya no debe sorprender e! tamafio de las enzimas.

El modelo de un sitio catalitico rígido explica muchas de las propiedades de las enzirnas El modelo de un sitio catalitico, propuesto por Emil Fischer, represenro la accion reciproca del sustrato y la enzima en tkrminos de la analogia de una "cerradura y Ilave". Este modelo dc cerradura y Ilave o modelo de plantilla rigida (figura 9-2), todavía es útil para entender ciertas propiedades de las enzimas, por ejemplo, la unión ordenada de dos o más sustratos (figura 9-3) o la cin6tica dc una curva de saturación del sustraio simple.

Los sustratos inducen un cambio de conformación en la enzima 1Jna caractcristica desafortunada del modelo de Ficher es que implica rigidez del sitio catalitico. Un modelo mis geneml es el del "ajiiste inducido" de Koshland, el cual ha recibido un considerable apoyo experimental. En elmodelo de Fischer se presume que el sitio catalitico esta prefigurado para adaptarse al sustrato. En el modelo de ajuste inducido, el sustrato induce un cambio en la conformación de la enzima. Esto aIlnea los residuos de aminoácidos y otros grupos de la enzima en ia orientación espacial correcta para la combinacion del sustrato, la cathlisis o ambas. En el ejemplo (figura 9 4 ) , los grupos hidrófobos [porción rayada) y los grupos cargados (área punteada) se encuentran implicados en la combinacibn del sustrato. Una fosfoserina (-P) y el -SH de un residuo de cisteina intervienen en la catálisis. Otros residuos, no implicados en proceso alguno, están representados

Figura 9-2. Reprecentacidn de la fomacibn de un complejo EnzS de acuerdo con la hipdtesis de la plantilla de Fischer

Figura 9-3. Representacibn de la absorcibn sucesiva de una uienzima (CoE) y de dos sustratos ($1 y $2) sobre una encima en término de la hipbtesis de la plantilla. Se supone que la coenzima porta un grupo esencial que se une al primer sustrato [Si), el cual a su vez es necesarbo para unir a S2

por los de lisina y metionina. En ausencia de sustrato. el grupo catalitlcci y el fijador de sustrato estíh separados por varios enlaces. Ida aproximación del sustrato induce un cambio en la conformacibn dc la proteína enzimatica, alineando los grupos correctamesite par.1 combinarse con el sustrato y para la catálisis. A1 mismo tiempo, las orientaciones espaciales de otras regiones tambikn están alteradas -la lisina y la metionina están ahora más juntas (tigura 9 4 ) . Los anhlogos del sustrato pueden causar algunos, pero no todos, los cambios en la confomacibn correctos (figura 9-5). Al adherirse el verdadero sustrato (A), todos los grupos (representados como circulos negros en todas las ilustraciones) son alineados correctamente. La adherencia de un análogo del sustrato que es demasiado "voluminoso'' (figura 9-5 B) o demasiado "delgadc" (figura 9-5C) induce una alineación incorrecta. Una caracteristica final es el sitio mostrado como una pequefia muesca a 12 derecha de la enzima. Tal vez se pueda imaginar una molécula reguladora uniéndose en este punto y "bajando" uno de los braz.0~ polipeptídicos que portan un grupo catat itico. Entonces puede producirse la uni6n del sustrato, pero no la catalisis. Como se puede observar en el modelo de ajuste inducido, los residuos qtie comprenden el sitio catalitico, pueder! estar niuy distantes entre si en la estructura primaria, pero especialmente cercanos cuando se considera la estructura tridimensional (terciaria).

Figura 9 4 . Representacibn bidimensional de un ajuste inducido por un cambio de conformación en la estructura de la proteina Obsérvenselas pastciones relativasde los residuos clave antes y despues de la unibn del custrato

cadena polipéptida de 129 residuos y tiene una profunda hendidura central que alberga un sitio catalitico con seis subsitios (figura 9 4 ) los cuares enla;ían

varios susrratos. Los residuos que originan la rotura del enlace se encuentran entre los sitios D y E, cerca de los grupos carhoxiIo de Asp 52 y Glu 35. Al parecer, Enz + S EnzS este último cede prolones al enIace acethlico de1 srisA B C @ato,en tanto que Asp 52 Con carga negativa estabiliza el ion c a r b ~ ndesde el lado posterior. El sitio catalItico de la ribonucleasa también Figura 9 4 . Representación de cambios de c~nformacibn~en la protelna enrimatica cuando ocurre la unión can el sustrato radica dentro de una hendidura semejante a la anterior, a (A) a análogos inactivos del sustrato (B) y (C). (Según través de la cual se encuenmn His 12 e FIis 1 19, residuos Koshland.) que, segiin la evidencia química, soii el sitio catalitico.

Muchos residuos arninoacilo participan en el sitio activo ¿Qué partes de una enzima conforman y participan eii su sitio activo? EI sentido de esta pregunta se entiende mejor mediante el examen de las estructuras tridimensionales de un complejo terciario (tres componentes) formado por unaenzima y dos sustratos. Sin embargo, incluso en el estado de cristales, si estan presentes todos los siistratos se producira la catAlisis, lo cual complica Ia interpretacihn de los datos. Por tamo, se ha dei.,ostrado que es iitil el examen de la estructura de los denoiniiiados complqjoc terciarios abortivos compuestos de un sustrato y uti producto, o de complejos enzima-sustrato anhlogos al inhibidor. Estos complejos, que no pueden pasarse por alto, propercionan una estrecha aproximacibn al sitio activo durante el paso inicial de erilace con el sustrato en la c a t á l ~ s i s .Estos estudios muestran que muchos residuos aminoacilo esthn en contacto con sustratos o coenzimas unidos y, por tanto, constituyen parte del sitio activo. El tamaiio amplio y 61 carhcter tridimensional de los sitios activos determinan su visualizacibn 6ptima en las pantallas de computadoras mediante programas que permiten girar la estructura en todas las direcciones, verlas en tres dimensiones y acercar las partes que interesan. Las limitaciones de la hoja impresa tan solo permiten una representacibn iinperfecta de los sitios activos. Sin embargo, se pueden establecer algunas generalizaciones.

Los sitios activos a menudo se localizan en hendiduras

Los sitios activos de enzimas multiméricas pueden encontrarse en subunidades de interface Para ciertas enzimas que contienen multiples polipkptidos o subunidades, el sitio activo se encuentra en la interfase entre estas. Los residuos aminoacilo de ambos sustratos contribuycn al sitio activo, al servir para enlazar sustratos o para funcionar en la cathlisis. Uno de estos ejemplos es la enzima HMG-COA reductasa, que es la enziina limitante de la velocidad de colesterologenesis (figura 9-7).

Los residuos cataliticoc se conservan mucho Ciertos arninoacidos, cn particular la cisteína y otros aminolicidos hidroxllicos, Cicídos o bhsicos tienen funciones claves en la catllisis. Estos residuos sirven como nucle6fi los, como catalimdores generales bhicos

Tri 63

'

Asn 46

Ser 36

h F,

Para las enzimas que consisten en una subunidad cnica, el sitio activo amenudo radica en una hendidura de la enzima. Un ejemplo es la lisozima, enzima presente en las lágrimas y en el moco nasal, la cual lisa las paredes celulares de muchas bacterias grarnpositivas trasmitidas por el aire. Está constituida por una soIa

Arg114

Figura 9-6. Representacibn'bidimencionaldel sitio catalitico en la regibn hendida de la Ircozima De la A a la F representan las fracciones glucosilo de un hexasadrido Algunos residuos en la región hendida se muestran junto con sus números en las secuencias en la Iisorima (Adaptado de Koshland )

98

Bioauim ica de Hurper

~Cu~íieclo 9)

generos. El cuadro 9-1 muestra esta conservacibn de la estructura primaria en los sitios cataliticos de en7imas hidroliticas relacionadas, pero diferentes. Por su parte, el cuadro 9-2 aclara la conservaci0n de "tipos" estructurales primarios a través de los gkneros para la enzima biosintética H M G X o A reductasa. No obstante, dado que un "tipo" estructural terciario puede construirse a partir de varias estructuras primarias diferentes, la estructura primariaglobal de las enzimas esta mucho menos conservada que la terciaria.

MULTIPLES FACTORES INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS Figura 9-7. Estructurade una subunidad rjnica de HMG-COA reductasa de la bacteria Pseudomonasmevalonii La subunidad consta de dos dominios, el mAs pequeíio de los cuales (abajo izquierda) contiene un enlace nuclebtido doblado compuesto de hola beta y h6licec alfa Los residuos aminoacilo esun numerados para facilitar el trazo del polipéptido desde su terminal amino (N) hasta su teminal carboxilo (C). Observese que el polipéptido inicia en el dominio grande, entra al dominio pequeno y al final termina en el dominio grande (Rediseriada con autorizaubn de Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV. Crystal structure of Pseudomonas mevalon~iHMG-COAreductase at 3 O angstrom resolution Science 1995:268 1758 )

o acicidos o como aceptores de un grupo que esth experimentando transferencia. Es probable que, para todas las formas de una enzima que cataliza una reacción o una ciase de reaccibn dadas, el mecanismo de reaccidn sea idéntico sin importar el tejido o forma de vida original. En consecuencia, los aminoácidos que tienen funciones altamente especificas en la cathlisis y, hasta cierto grado, Ios aminoácidos adyacentes, tienden a mostrar una conservación elevada, inclusive entre

Temperatura Aunque la elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccihn cata1izada por enzimas, esto es verdad s610 dentro de limites estrictos de tempemtura (figura 9-81. Al principio, la velocidad de la reacci6n aumenta cuando latemperatura se eleva, debido al incremento en la energía cinktica de las moléculas reactantes. Sin embargo, al final, la energía cinetica de Ia enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces dkbiles de hidr6geno e hidrdfobos que conservan su estructura secundaria-terciaria, A esta temperatura, predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad cataiitica. Por tanto, las enzimas muestran una temperatura optima. No obstante, kste no es un parhmetro fundamental, ya que la temperatura óptima depende de la duración del analisis usado para determinarla, es decir, mientras mhs tiempo se conserve una enzima a una temperatura a la cual su estructura es apenas estable, mayor probabilidad tiene de experimentar desnaturalizacibn.

Cuadro 9-1. Swuenrrlaa de los aminohcidos en la vecindad de los sitios catalíticos de varias proteasas bovinas. Las regiones que se muestran son las situadas a cada lada de los residuos serilo S e histidilo J1l Sitio Ir'! -- ' '7

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Cuadre 9--2. La estructura primaria de algunas regiones d,e un sitio catalttico puede conservarse a través de 1os generris. Se piensa que los aminokidos, mostiar~uaaurit rodeando al residuo elutan n n la catá tisis realiizada por la e A reduc,tasa. L(i s residi10s subrayados se desvian de Ea secuencia consensual --.S--

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:ima de marniferos .- - -..-

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Aminohcidc

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Levadura" --

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Ser humano C F

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El factor por el cual la velocidad de un proceso biológico aumentacon un incremento de temperatura de 10 O C es el coeficiente de temperatura o Qio. La velocidad de numerosos procesos biolbgicos, como la contracci6n de un cosaz6n fuera de la cavidad toiricica, casi se duplica con una elevacibn de 10 "C en Ia temperatura (Qio = 2). La alteracidn en las velocidades de numerosas reacciones catalizadas por enzimas que acompaña a una elevacibn o caida de la temperatura corporal, constituye una caracteristica de supervivencia esencial para formas de vida como las lagartijas que no conservan constante su temperatura corporal. Por el contrario, organismos homottmicos como el ser humano toleran sblo alteraciones estrictamente limitadas en su temperatura. Por tanto, los cambios en la velocidad de reacción en el ser humano, debidos a

alteraciones en la temperatura tienen escaso significado fisiológico, excepto cuando hay fiebre o hipotermia. Dado que el aumento en el nhrnero de moléculas con energia cinética suficiente para superar la barrera energktica, ofkce escasas opciones para los organismos homotkrmicos, entonces, ¿cómo incrementan sus velocidades de reaccibn? La respuesta se apoya en la propiedad de las enzimas de abatir las barreras energéticas para las reacciones y elevar las concentraciones locales de reactantes. Para casi todas las enzimas, las temperaturas 6ptimas son iguales o mayores a las de las células en las que se encuentran. Las de los microorganismos adaptados para crecer en aguas termales o en áreas oceánicas termales profundas muestran temperaturas bptimas prbxirnas al punto de ebullición del agua.

Cuando se mide la actividad enzimAtica a diversos pH, la hptima generalmente se observa entre los valores de 5.0 y 9.0. Sin embargo, unas cuantas enzimas, como la pepsina, son activadas a valores de pH muy alejados de estos límites. La fomia de las curvas de pT-1 bptimo estii determinada por:

1) Desnaturalizaci6n de la enzima a valores de pH altos o bajos. 2) Alteraciones en el estado de carga de la enzima del sustrato o de ambos. Para la enzima, los cambios de carga pueden afectar la actividad, ya sea cambiando la estructura o la carga en un residuo que funciona para ligar el sustrato o en la catálisis. Para aclarar esto, considérese una enzima con carga negativa (Enz-) que reacciona con un sustrato cuya carga es positiva (SH*):

Temperatura dptime I

A pH bajo, la Enz-adquiere protones y pierde su carga negativa:

A valores de pH altos, SH' se ioniza y pierde su carga positiva:

Figura 9-8. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reaocibn hipotetia catalizada por enzimas.

Puesto que, por definicibn para este ejemplo, las unicas formas que interaccionan son SH' y Enz-, los valores extremos de pH disminuirán las concentraciones efectivas de Enz- y SH', con lo cual se reduce la

100

Rioquímica de Harper

mSH*

X

(Capítulo 99)

m Enz

Figura 9-9. Efectos del pH cobre la actividad enzimhtica.

velocidad de reacción (figura 9-9). Solamente en el área som breada con rayas cruzadas, se encuentran Enz y S en el estado ibnico apropiado y sus concentraciones rnliximas están correctamente cargadas a pH X. Ademh, las enzimaspueden experimentar cambios de conformación con las variaciones del pH. Podría ser necesario un grupo cargado dista1 a la región donde el sustrato se ha fijado, para conservar una estructura activa terciaria o cuaternaria. Conforme cambia la carga en este grupo, la proteína puede desenrollarse, volverse más compacta o disociarse en protiimeros, todo lo cual conduce a la pérdida de la actividad. Dependiendo de la gravedad de estos cambios, la actividad puede ser restablecida o no cuando la enzima regresa a su pH bptimo.

Las enzimas no afectan las constantes de equilibrio La enzima es un reactivo que se combina con el sustrato formando un complejo enzirna-sustrato, EnzS, que se descompone para formar un producto, P, y la enzima libre. En su f m a miis simple, esto puede representarse como:

Aunque las expresiones de la velocidad para las reacciones hacia la derecha e izquierda y global incluyen el tCrmino [Enz],

velocidad^ = kl [Enz] [S] Veloeidad.i = kl [Enz] [P]

en la expresihn de la constan.te de equilibrio glohaI la [Enz] se cancela.

Así, la concentración de la enzima no tiene efectas sobre la constante de equilibrio. Dicho de otra manera, puesto que las enzimas afectan a las velocidades y no a las constantes de velocidad, no pueden modificar a K,, que es una relacion de constantes de velocidad. Entonces, la K,, d e una reaccibn es la misma sin importar que se alcance el equilibrio con catálisis enzirnhtica o sin ella (recordar A G ~Las . enzirnas cambian la via de la reacci6n, pero no afectan las concentraciones de equilibrio inicial y final de los reactantes y productos, los cuales son los factores que determinan a K,, y AGO.

LA VELOCIDAD INICIAL ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzirnática es siempre proporcional a la concentracibn de la enzima. No obstante, obsdrvese que este enunciado se sostiene sole para velocidades in tiales.

LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOAFECTALA VElOClDAD DE LAS REACCIONES En la explicación siguiente, las reacciones enzimáticas son tratadas como si tuvieran un solo sustrato y un producto unico. Aunque Cste es el caso de algunas reacciones catalizadas por enzirnas, la mayorla de ellas tienen dos o mas sustratos y productos. No obstante, esta consideración no invalida lo siguiente. Si se aumenta la concentracion del sustrato [S1 mientras que todas las demás condiciones se conservan constantes, la velocidad inicial medida, v, (la velocidad medida cuando m u y poco sustrato ha reaccionado), crece hasta un valor mfiximo, V,,,, y no mas (figura 9-1 0 ) . La velocidad se incrementa al aumentar la concentracibn del sustrato hasta el punto donde se dice que la enzima estli "saturada" con el mismo. La velocidad inicial medida alcan7a un valor máximo y no es afectada por el incremento ulterior en la concentraci6n del sustrato, debido a que este está presente en

Figura 9-10. Efecto de la ooncentracibn del suctrato sobre la velocidad de una reaacibn catalizada por enzimas.

un gran exceso molar con relación a la enzima. Por ejemplo, si una enzima de peso molecular de 100 000 actúa sobre un sustrato de peso molecular de 100 y ambos se encuentran a la concentración de 1 mg/mL; existen 1 O00 moles de sustrato por cada mol de enzima. Cifras mhs realistas serian: [Enz] = 0.1 pglmL = 7 0 molar ~ [S] = 0.1 mglm L = 1o4 molar

dando un exceso molar de lo6 de sustrato sobre la enzima. Incluso si [S] decreciera 100 veces, el sustrato todavia estaria presente en un exceso molar de 10 000 veces sobre la enzima. La situación en los puntos A, B y C de la figura 9-1 0 se aclara en la figura 9-1 1. En los puntos A y B solamente una porcihn de la enzima presente estl combinada con el sustrato, aun cuando haya muchas mhs molkculas de sustrato que de enzima. Esto se debe a que la constante de equilibrio para la reaccihn

Enz + S & EnzS (formación del complejo EnzS) no es infinitamente grande. En los puntos A o B al aumentar o disminuir [S], aumenta o disminuye la cantidad de Enz ligada con S como EnzS: de aquí que V I dependa de [S]. En C, esencialmente toda la enzima se encuentra combinada con el sustrato, de manera que un incremento ulterior en [S], aunque praduce un aumento en la frecuencia de las colisiones entre Enz y S, no puede causar incrementos en la velocidad de reacción, puesto que no existe enzima libre disponible para reaccionar. El caso B presenta una situacibn de mayor interés tebrico donde exactamente la mitad de las rnol&culas de enzima esthn "saturadas con" sustrato. De acuerdo con esto, la velocidad es la mitad dc la vclocidad rnbxima alcanzable {V,/2) a esa concentración particular de la enzima.

LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-MENTEN DE HlLL REPRESENTAN LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO La ecuación de Michaelis-Menten La concentraci6n del sustrato que produce la mitad de la velocidad mhxima, llamada valor K, o constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v, como funcibn de [S] (figura 9-10). La Km tiene las dimensiones de la concentracidn molar. Cuando [S] es aproximadamente igual a K,,, v, es muy sensible a los cambios en [S] y la enzima esta trabajando precisamente a la mitad de su vclocidad máxima. De hecho, muchas de las enzimas poseen

Figura 4-11. Representacibn de una enzima a concentraciones bajas (A), altas (C) y a la wncentracibn Km del sustrato (6) Los puntos A, B y C corresponden a los de la figura 9-1 0

valores de Km que se aproximan a la concentraci6n fisioliigica de sus sustratos. L a expresión de Michaelis-Menten

describe el comportamiento de muchas enzimas de acuerdo a las variaciones de la concentracibn de sustrato. Ln dependencia de la velocidad inicial de una reacción catali7ada por enzirnas en [S] y en Kmpuede aclararse valorando la ecuaci6n Michaelis-Menten como sigue: 1 ) Cuando ISI es mucho menor que Km(punto A en las figuras 9-1 O y 9-1 1). Aííadiendo ahora

[S]a Kmen el denominador, cambia muy poco su valor, de modo que el término [S] puede ser eliminado dcI denominador. Dado que tanto Vmav como Km son constantes, se puede reemplazar su relación por una nueva constante, K: yi

", ,v

Fl - vi = !!!?%N = be

K m + [SI'

Km

Km

[S]

"aproximadamente igual a"]. En otras palabras, esto significa que cuando la concenlracihn del sustrato es considerablemente inferior a la requerida para producir la miiad de la velocidad miixirna (el valor U,), la velocidad inicial v,, depende de la concentraci6n del sustrato [S]. 2) Cuando [S]es mucho mayor que Km(punto C, figuras 9-10 y 9-1 1). Agregando ahora Km a [S] en el denominador, el valor de [S] cambia muy poco, por lo tanto el tCrmino Km se elimina del denominador.

Esto establece que cuando la concentración del sustrato [S] excede con mucho el valor de Km,la velocidad inicial v,, es mhxima, Y,,. 3) Cuando [Si = Km (punto B, figuras 9-10 y 9-1 1). = 'V d x [SI Km + [C] '

Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturación que no permiten fácilmente la valoración de Vmex (y por tanto de Km),cuando la v, es graficada contra [S], es conveniente reordenar la expresión de Michaelis-Menten para simplificar la valoracihn de Km y V,,,. La ecuacihn de Michaelis-Menten puede ser invertida y factorizada como sigue:

Invirtiendo:

K [S]

[a significa

VI

Para determinar Kmy V,A, se usa una forma lineal de La ecuación de Michaelis-Menten

[SI - V m h [SI -Vrns! p] SI+ [S] 2 [SI - 2

Vdx = -

Esto expresa que cuando la concentracion del sustrato es igual al valor de Km, la velocidad inicial vi es semimáxima. Tambikn indica la forma de evaluar a Km, esto es, de determinar de manera experimental la concentracion del sustrato donde la velocidad inicial es la mitad de la rnhxirna.

Simplificando:

~ s t es a la ecuación de una linea recta:

donde:

Si y, o 1/v, se grafican en función de x, o de l/[S], la interseccion en y, b, es IIV,,, y la pendiente, a, es K,/V,h. La interseccibn negativa en x puede ser valorada haciendo y = O. Entonces

Esta gráfica es llamada gráfica del doble reciproco, por ejemplo, el reclproco de v,(l lv,) se grhfica contra el reciproco de [S] (l/[S]). El valor dc K,, puede: ser calculado a partir de la grhfica de Lineweawer-Burk o del doble reciproco (figura 9-1 2) usando la pendiente y la intersección en y o la interseccibn negativa en x. Puesto que el [S] está expresado en rnolaridad, las dimensiones de Km esthn en molaridad o moles por litro. La velocidad, v,, se puede expresar en cualquier tipo de unidad, puesto que Km es independiente de [Enzl. El

Kmpuede aproximarse a una constante de fijación La afinidad de una enzima por su sustrato es igual al inverso de la constante de disociación, Kd, para el comple.jo enzima-sustrato, EnzS.

Figura 9-12. Gráfica de Lineweaver-Burk o de/ doble reciproco, l l v , contra [S] usado para valorar Km y Vmh

Esto es, mientras menor sea la tendencia del sustrato

y de la enzima para disociarse, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. El valor Kmde una enzima para su sustrato puede tratamienta por el doble recíproco requiere relativamente pocos puntos para definir Kmy es el método más utilizado para determinarla. De manera experimental, el uso de la grhfica de Lineweaver-Burk para valorar Km puede dar origen a una importancia no justificada de los datos reunidos a concentraciones bajas del sustrata. Éste cs el caso cuando las concentraciones del sustrato, seleccionadas para el estiidfo, difieren por un incremento constante. Este inconveniente puede superarse seleccionando las concentracioncs de sustratos, cuyos reciprocos difieren por incrementos constantes. Un enfoque alternativo a la evaluaci6n experimental de Km y V,,, es el de Eddie y Hofstee. La ecuación de Michaelis-Menten puede reordenarse a

Para evaluar Kmy V,,,, se grafica v,l[S] (eje y) contra v, (eje x}. Entonces la interstccidn en y es V,,,/K, y la intersección en x es Vmk.La pendiente es -1 /Km. Aunque la gráfica de Lineweaver-Rruk y el enfoque de Eadie-Hofstee son útiles en los ejemplos escogidos, la determinación rigurosa de Km y V,, rcquiere de tratamiento estadistico. Los valores de K,, son de importancia prActica considerable. A una concentracion de sustrato de 100 veces K,,, la enzima actuará esencialmente a velocidad mhxima y por tanto la velocidad mhxima (V,,,) reflejara la cantidad de enzima activa presente. Por lo general, en el análisis de enzimas esta situación es deseable. El valor de Km indica la cantidad de sustrato que debe usarse para medir V,,,,. Los tratamientos con el doble reciproca también tienen aplicacihn extensa en la cvaluacion de los inhibidorcs dc enzimas.

servir también corno una medida de su Kd. Sin embargo, para que esto sea verdadero, debe ser válida una hipótesis incluida en la derivacidn de la expresión de Mfchaelis-Menten. La derivación supone que el primer paso de Izt reacción catalizada enzimáticamente

es rapido y siempre esta en equilibrio. En otras palabras. la velocidad de dicaciacion de EnzS a Enz + S debe ser mucho mhs rápida que su disociación a enzima + producto.

En la expresion de Michaelis-Menten,

13

[S] que da

v,= V,8,/2 es: [S] =

kr

+

k-1

kl - Km

pero cuando

k-, >>

k2

entonces kz + k-.r

k-I

En estas condiciones, 1/K, = Kd = afinidad. Si kz es no a proximadamente igual a km,,entonces liK, subestima la afinidad, 1 /Kd.

104

Bioquímica de Harper

La ecuación de Hill Ciertas enzimas y otras proteinas que -jan ligandos, como la hemoglobina, no muestran la cinética clásica de saturación de Michaelis-Menten. Cuando [S] ce grafica contra v,, la curva de saturacibn es sigmoide (figura 9-13). Esto indica, por lo general, el enlace cooperativo del sustrato a sitios múltiples. El enlace en un sitio afecta el enlace en otros como se describió en el capitulo 7 para la hemoglobina. Para la cinktica de saturacibn del sustrato sigmoide no son válidos los métodos dc evaluacibn gráficas de la concentración del sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, como se describib (no se producen rectas). Para valorar la sigmoide de Ta cinttica de saturacibn se utiliza una representacidn gráfica de la ecuación de Hill, que originalmente se derivó para describir el enlace cooperativo de moléculas de oxígeno a la hemoglobina. Escrita de manera lineal, la ecuacihn - de Hitl es log k'

donde k' es una constante compleja. La ecuación afirma que cuando [S] es baja comparada con k', la velocidad de reacción aumenta a la enésima potencia de [S]. La figura 9-1 4 presenta una gráfica de Hill de datos cinéticos para una enzima con cinbtica de enlace cooperativo. Una grAfica de v,/V,,, -vi) contra log [S] proporciona una recta con pendiente = n, donde n es un pariirnetro empírico cuyo valor depende del número de sitios de enlace del sustrato y del numero y tipo de interacciones entre los sitios de enlace. Cuando n = 1, los sitios de union achian de modo independiente uno del otro. Si pl 1 1, los sitios son cooperativos; y cuanto mayor sea el valor de n, tanto

Figura 9-1 3. Sigrnoide de la cinética de saturacibn.

mejor será el cooperativismo y, de este modo, será m& "sigmoide" la cinética de saturación. Si rr < 1, se dice que los sitios exhiben una cooperativismo negativo. A la mitad de la velocidad máxima (v, = V,/2), v,J(Y,,, - v,)= 1, y por tanto, log v,/(V,, - v,) = O. De este modo, para determinar S r o (concenlracibn del sustrato que produce la mitad de la velocidad maxima), se traza una Ilnea perpendicular al eje de las x desde el punto donde log v,J(V,a, - v,) = 0.

EL ANALISIS CINETICO DISTINGUE ENTRE INHIBICIÓN COMPETlTlVA Y NO COMPETITIVA Aunque de manera tebtica se distinguen los inhibidores de la actividad enzimática con base en si la inhibici~n se anula o no por el incremento de la concentraci6n del sustrato, numerosos inhibidores no muestran las propiedades ideales de inhibicibn competitiva o no competitiva puras que se describen despubs. Un criterio alternativo para la clasificación de inhibidores es su sitio de acción. Algunos se unen a la enzima en el mismo sitio que el sustrato (el sitio catalitico); otros lo hacen en alguna región alejada de &te (un sitio alostérico).

Los inhibidores competitivos típicos se asemejan al sustrato La inhibicibn competitiva clásica tiene lugar en el sitio de unión del sustrato (catalitico). La estructura qulmica de un inhibidor (1) analogo del sustrato (S)

Figura 3-14. Evaluación grafica de la ecuacibn de Hill para determinar la concentracibn de sustratos que produce la mitad de velocidad mhxima. Este método se emplea cuando la curva de la cinbtica de saturacibn del sustrato es un sigmoide

por lo general es similar a la de este. Puede, por tanto, combinarse de manera reversible con la enzima, formando un complejo enzima-inhibidor (EnzI) en lugar de un complejo EnzS. Cuando tanto el sustrato como este tipo de inhibidor están presentes, compiten por los mismos sitios de unión sobre la superficie de la enzima. Un caso muy estudiado de inhibición competitiva es el del malonato (1) con el succinato (S) por la succinato deshidrogenasa. La succinato deshidrogenasa cataliza la formaci6n de fumarato mediante la remacibn de un htomo de hidrbgeno de cada htomo de carbono alfa del succinato (figura 9-1 5). El malonato (DOC-CT-iz-C003 puede combinarse con la deshidrogenasa formando un complejo EnzI. Este no puede ser deshidrogenado, puesta que no hay manera de quitar ni siquiera un atomo de hidrógeno del único atomo de carbono alfa del malonato sin formar un átomo de carbono pentavalente. La única reaccion que puede experimentar el complejo EnzI es la descomposicibn regresiva en enzima más inhibidor. Para la reaccibn reversible, ki E R A + S $ Enz + I k-i

la constante de equilibrio Ki es:

La accibn de los inhibidores competitivos se puede entender en tkrminos de las siguientes reacciones: Enz + P

Enzl (inactivo)+

se fija firmemente a la enzima (K, = una cifra pequefla). Ahora hay una cantidad escasa de enzima libre (Enz) disponible para combinarse con S para formar EnzS y finalmente Enz + P. Así, la velocidad de reaccibn (formación de P) sera lenta. Por razones anhlogas, una concentración igual de un inhibidor unido con menor fuerza (K, = un numero mayor) no hará disminuir la velocidad de la reaccibn de manera tan marcada. Supbngase que a una concentración fija de 1 se agrega más S. Esto aumenta la probabilidad de que Enz se combine con S, en lugar de hacerlo con 1. La proporcion de EnzS a EnzI y la velocidad de reacción se incrementan. A una concentracibn suficientemente elevada de S, la concentración relativa de EnzI desaparecerá. Si esto es asi, la velocidad de la reacción catalizada sera la misma que en ausencia del inhibidor (figura 9-1 6).

La gráfica del doble recíproco facilita la evaluación de los inhi bidores La figura 9-1 6 representa un caso tipico de inhibición competitivamostrada gráficamente en la forma de una línea de Lineweaver-Burk. La velocidad de reacción (v,) a una concentración fija del inhibidor fue medida a diversas concentraciones de S. Las líneas trazadas a travds de los puntos experimentales coinciden en el eje de las y. Puesto que la jnterseccibn en y es lIV,,, esto dice que a una concentración infinitamente grande de S (l/S = O), v, es la misma que en ausencia del inhibidor. Sin embargo, la interseccibn sobre el eje de las x (que está relacionado a Km)varia con la concentración del inhibidor y se convierte en un número mayor (-1 K', es mayor que -1/K,) en presencia del inhibidor. Así, un inhibidor competitivo eleva la Km aparente (K',) para el sustrato; puesto

Enz

EnzS (activa)

-+

Enz + P

La velocidad de formacibn del producto depende sOIo de la concentracibn de EnzS. Sup6ngase que el inhibidor

H I

H -C -COO 1

-0012C-H

-

- 2H

--OOC-C-H

Succinato

H- C-COOII

Fumarato

Figura 9-1 5. Reaeeibn del suminato deshidrogenasa.

Figura 9-16. GrAfica de Lineweaver-Burk de la inhibicidn cornpetiwa c l h s k . O b s é ~ e s ela liberacibn de la inhibición a concentración alta [S] (1I[S] baja).

106

nioquim ica de Har-p~r

Km es la concentración del sustraío a la cual la concentraci6n de enzima libre es igual a la concentración de enzima como EnzS, una cantidad sustancial de enzima libre estd disponible para combinarse con el inhibidor. Para la inhibicion competitiva simple, la intersección sobre el eje de las x es: que

El valor de Kmpuede ser evaluado en ausencia de 1, y K, también puede serlo usando Ia ecuación anterior. Si el nbmero de moles de 1 agregado es mucho mayor que el numero de moles de enzima presente [1] puede ser generalmente tomado como la concentracián agregada (conocida) der in hi bidor. Los valores de K,, para una serie de inhibidores análogos al susirato (competitivos), indican cuales son los mas eficaces. A una concentración baja, con los valores más bajos dc K, produciran el mayor grado de inhibición. Muchos medicamentos eficaces en clíiiica actúan corno inhibidores competitivos de actividades enzimkticas importantes en las células microbianas y animales,

Los inhibidores no competitivos reversibles reducen Vmax pero no afectan a K m En la inhibicibn no competitiva no hay competencia entre S e 1. Usualmente el inhibidor no muestra analogía estructural con S o esta es muy escasa y puede asumirse que se une a un espacio diferente en la enzima. Los inhibidores reversibles no competitivos disminuyen la velocidad rnfixima alcanzable con una cantidad dada de enzima (reducen V,,) pero por lo general no afectan a K,,. Puesto que S e I se pueden combinar en diferentes sitios es posibje la formacibn d e complejos En21 y EnzIS. Ya que EnzlS puede descompanerse para formar el producto a una velocidad menor que la de EnzS, la reaccihn puede retrasarse pero no impedirse Es posible que se presenten las siguientes reacciones de competencia:

Si S tiene igual afinidad par Enz y por En21 (1no afecta la afinidad de Enz por S), los resultados que se mues-

tran en la figura 9-1 7 son los que se obtienen cuando l l v , es graficado contra 1 /[S], en presencia y en ausencia de inhibidor. Se supone que no ha habido ninguna alteracion importante en la conformacibn del sitio activo cuando está unido 1.

Inhibidores irreversibles "envenenan" a las enzimas Unagran variedad de "venenos'knzimáticos tales como la yodoacetarnida, los iones de metales pesados (Ag', 1-Ig2'), agentes oxidantes, etcétera, reducen la actividad enzimhtica. Puesto que estos inhibidores no tienen semejanza estructural con el sustrato, un incremento en la concentración de éste, en general, es ineficaz para suprimir esta inhibicr~n.Sin embargo, la presencia de uno o más sustratos o productos pueden proteger a la enzima contra la inactivacion. Un análisis cinetico del tipo anteriormente tratado puede no distinguir entre venenos enzirnáticos e inhibidores no competitivos reversibles verdaderos. La inhibicidn reversible no competitiva cs, en todo caso, rara. Por desgracia, esto no se aprecia siempre, ya que tanto la inhibicihn no competitiva reversible, como la irreversible, muestran cinética serne.jantc.

La mayoría de las reacciones implica a dos o mas sustratos Ida exposición anterior de las reacciones enzimhlicas catalizadas considera 3610 las reacciones que involucran sustratos y productos únicos. Sin embargo, la mayoria de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos y productos. Aunque el análisis detallado de la cinCtíca de los mecanismos de las reacciones de rnultisustrato esta m& allá dcl asunto de este capítulo, a continuación se comentan las reacciones de dos sustratos y de dos productos, denominadas "Bi Bi".

Figura 9-17. Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición reversible no competitiva.

Términos especiales describen las reacciones enzimáticas complejas Los siguientes términos convencionalec se emplean pasa caracterizar reacciones compIe,jas catalizadas por enzirnas. Idossustratos se denominan A. B, C y D de acuerdo al orden en que se agregan a la enzima. Dc igual manera. los productos se designan P, Q, R y S de acuerdo al o r d ~ nen que se separan de la enzima. Los diferentes tipos de la enzima se denominan E, F y G, en las cuales la E corresponde a la enzima libre. y Cuater (4) Los términos Uni ( 1 ), Bi ( 2 ) , Ter (3, denotan el número de reactantes y productos. Aun cuando muchas reacciones catalizadas por enzimas involucran mis reactantes y productos (por e.jernplo, reacciones Bi Ter), aquí sblo se consideran las reacciones Bi Bi, es decir, aquellas que tienen dos sustraios y dos productos.

Reacciones en secuencia o de desplazamiento unico En las reaccioncs en secuencia todos los sustratos deben combinarse con la enzima antes de liberar cualquier producto. Estas tambikn se denominan reacciones de desplazamiento unico porque el grupo sujeto a transferencia (G) se pasa directamente desde el sustrato donador A-G al sustrato aceptor B. Dependiendo del modo en el cual los sustratos se agregan a la enzima, se distingue entre reacciones en orden aleatorio y reacciones en orden compulsorio. En las primeras, cualquier sustrato puede agregarse primero para formar ya sea E-A o E-8, mientras que en las segundas solo A puede reaccionar con E, en tanto que B reacciona c61o con el complejo E-A (figura 9-1 8). Una explicación para un orden compulsorio en la adicibn de sustratos es que agregar A induce un cambio en la conformación que alinea residuos escnciales para el enlace de B.

Reacciones en ping pong El tkrmino ping pong se aplica a mecanismos en los cuales uno o más productos se desprenden de la enzima antes de la adicibn de todos los sustratos. Las reacciones Bi Ri ping-pong son reacciones de doble desplazamiento porque el grupo sujeto a transferencia ( G ) primero es desplazado de A 4 por E y a continuación de E-G por B, con formación del producto Q-G.

t o s datos cineticos sirven para distinguir los tipos de mecanismos

Los datos sobre el estado de reposo cinbtico y las ecuaciones apropiadas respecto a la velocidad se utili-

E

EA

P

E

t

EAB-EPQ

EA-FP

t

E

a

B

F

t

EQ

FB-EQ

t

E

Figura 9-18. Reprecentaci6n de tres clases de mecanismos de reacuones Bi Bi Las líneas representan la enzima y las

flechas la adición de sustrato y desprendimiento de productos Arriba: Un mecanismo Bi 61ordenado, característico de muchas oxidorreductasas dependientes de NAD(P) Centro: Una reacción BI Bi aleatoria, típica de algunas deshidrogenasas y cinasas. Abajo: Una reacción de ping pong, propia de l a s arninotransferasas (transaminasas) y de la quimiotripsina

zan para distinguir entre diferentes mecanismos. Aunque Ios t&rminocen estas ecuaciones cinéticas son m& numerosos, son análogos a los de la ecuación de sustrato único de Michaelis-Menten; incluyen: 1) V,,, velocidad de reacción media cuando están presentes tanto A como B en concentraciones saturadas; 2) las concentraciones de A y B que dan como resultado la mitad de la velocidad m k i r n a cuando el otro sustrato esth presente en concentracion saturada, y 3 ) las constantes de disociación para el desprendimiento de A y B de la enzima.

Las gráficas de doble reciproco diferencian entre los mecanismos ping pong y los secuenciales Para distinguir entre diversos tipos de mecanismos, se mide la dependencia de la velocidad inicial en la concentracihn del sustrato A en varias series de concentraciones diferentes (pero constantes) del sustrato B. Los datos se obtienen ahora considerando B coma el sustrato variable y A como el sustrato constante. Los patrones de las lineas cuando 10s datos se representan mediante grhficas del doble recíproco muestran el tipo de mecanismo. Por ejemplo, las lineas paralelas indican un mecanismo Bi Bi ping pong, y las lintas que se intersectan en el cuadrante negativo, un mecanismo Bi Bi ordenado.

108

Bioquímica de Harper

Los estudios sobre inhibición de producto se utilizan para completar estos anhlisis cintticos y para distinguir entre mecanismos Bi Bi ordenados y Bi Bi aleatorios. Por qjemplo, en una reacción Bi Bi de equilibrio m i d o , cualquier producto es un inhibidor competitivo de A con [B] constante y de B con [A] constante. 1,os patrones mfis complejos de inhibiciOn de las reacciones B i Bi ordenadas involucran patrones de inhibición tanto competitivos como mixtos, dependiendo del producto que se estudie, de3 sustrato que varia y del que permanece constante.

RESUMEN La temperatura, el pH, la concentración enzimática y de sustrato y los inhibidores alteran las velocidades de las reacciones catalizadas por entimas, con importantes implicaciones en la salud y la enfermedad. Las enzimas alteran las velocidades de reaccidn por medio de: 1) abatir la energía de activacidn para formar estados de transición, 2) servir como plantillas para incrementar las concentraciones tocales de sustrato y 3) proporcionar aminoicidos cuyos grupos funcionales cumplan con funciones especificas en la catiilisis. Aunque las enzimas modifican de manera profunda las velocidades de las reacciones, no afectan las constantes de equilibrio ni los cambios globales en la energía libre de esas reacciones. La catAlisis enzimática comprende estados de trancicibn de menor energía que los correspondientes en reacciones no catalizadas. De este modo, disminuye la barrera energetica para la reacci6n. La fíjaci6n y catalisis del sustrato se produce en el sitio activo (catalitico), región tridimensional de una enxima que, además de residuos de aminoacidos, puede contener coenzimas o iones metálicos. Los sitios activos con frecuencia radican en hendiduras en las enzimas o en la interfase entre subunidades de enzimas multimericas. Cuando los sustratos se aproximan, los sitios cataliticos experimentan cambios de conformación que pueden propagarse mhs allá del sitio catalitico (recukrdese la fijaci6n de 01a la hemoglobina). Estos cambios de conformaci6n inducidos por el sustrato pueden crear bolsas para su retenci6n y alinear residuos clave para la catálisis. Cuando la temperahira de una enzima se eleva, la velocidad de reaccion aumenta, pero sblo hasta que el nivel de la energia cinetica de la enzima excede a la de rotura de las ddbiles fuerzas no covalentes que mantienen su estructura secundaria y terciaria nativa. En este punto, la actividad decrece en forma precipitada. Cambios de temperatura mAs moderados también afectan la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas in vivo, aunque a un grado estrictamente

limitado en organismos homotérmicos, como el ser humano. Los cambios moderados del pH (es decir, en Ia regibn de pH 5 a 9) afectan la actividad enzimktica al alterar la carga de grupos R bcidos o bhsicos dkbites de los arninoácidos que actúan en la caaisis, fijación de sustrato o conformaci6n del sitio catalltico. Las variaciones de pH t a m b i h pueden alterar la carga elkctrica de los sustratos. Por tanto, las enzimas tienen valores de pH a los cuales muestran actividad 6ptima (pI-l óptimo). Los extremos de pH desnaturalizan las enzimas al protonizar o desprotonizar residuos de arninoácidos acidicos o alcalinos, de modo que ya no pueden formar los enlaces salinos que conservan la estructura secundaria y terciaria de la enzima. En casi todas las situaciones de ínter&s fisio16gic0, la concentraci6n molar de una enzima [E] es de un orden de magnitud menorque laconcentración molar de su sustrato [S]. Dado que se dispone de abundante sustrato para reaccionar con la enzima libre, cualquier incremento o decremento en la concentración de la enzima va acornpaflado de un aumento o disminucidn en la velocidad de reacción. Sin embargo, los cambios en la concentraci6n del sustrato [S] afectan la velocidad de reacción sbIo cuando alrededor hay suficiente enzima libre para reaccionar. Cuando toda la enzima está unida como complejo EnzS (condiciones de V,,,), incrementos mayores de [S] ya no aumentan la velocidad de la reaccihn. Ida ecuacidn de MichaelisMenten describe los efectos de la concentracihn del sustrato sobre la actividad de numerosas enzimas. La constante de Michaelis (Km)es la concentracihn de sustrato que produce la mitad de lavelocidad de reaccibn mhxima (V,,,/2; la mitad de la enzima se encuentra como EnzS). Los valores de Km tienen dimensiones de molaridad y se determinan mediante grhficas. Para una gráfica de doble recipraco de 1 /v, contra I/[S], la intercepcidn en el eje horizontal es - 1 K y en el eje de Ins y es lIV,,,. El efecto de [S] sobre las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas alostkricas es descritopor laecuacibn de Hill. Lamayoriade las reacciones c a t a l i d a s por enzimas implican dos o más sustratos o productos. Los criterios para establecer las diferentes clases de reacciones Bi Bi (reacciones que involucran dos sustratos y dos productos) son si el sustrato se enlaza en secuencia o al azar y si el producto se libera antes de que se una la totalidad del sustrato (reacciones ping p o n d . Los anhlogos de sustrato que se unen de manera reversible al sitio catalitico y actúan como inhibfdores competitivos de las enzima, incluyen muchos f h a cos de valor en medicina. La mayoria de los compuestos quimicos con poca o nula semejanza estructural con sustratos y que se unen al sitio catalitico o a algún otro, actúan como inhibidores no competitivos de la actividad enzimhtica. De manera breve, los inhibidores competitivos decrecen la Km,pero no tienen efecto sobre

Vmb,en tanto que los inhibidores no competitivos decrecen V , sin afectar a Km.Estos inhibidores pueden distinguirse por la medicion de la actividad enzimática a varias concentraciones de sustrato en presencia o ausencia del inhibidor. Luego, los dos conjuntos de datos se grafican como l/v,, contra lI[S]. En la inhibicibn competitiva clfisica, las dos líneas se intersec-

-

tan en el eje y (es decir, V,,, no cambia), pero la intercepcibn (-IJK,) disminuye por la presencia de inhibidor (es decir, en apariencia Kmha disminuido). En la inhibicidn no competitiva, la intercepción en y (l/V,,) aumenta en presencia del inhibidor (es decir, V,b disminuye), pero la intercepcibn en x no se modifica. I

-

REFERENCIAS Bcnder ML, Rergeron RJ, Komiyama M: The Rioorganic Chemistty ofEmynalic Latalysis. Wiley-Interscience, 1984. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymolo~).'of Postiramlational ModEjicatinn ofProieins. Academic Press, 1985 Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV: Crystal smicturc of Pseudomonas mevalnnii HMG-COArductaqe at 3.0 angstrom resolution. Science 1995368 1758.

Suckling CJ: Eníyme Chemzstv Chapman & Hall, 1990. Syrnons RH: Small catalytic RNAs. Annu Rcv Biochem 1992,61:641. Walsh CT: Suicide substrates, rnechanism4ased enzyme inactivators: Recent developments. Annu Rev Biochem 1984;53:493. Vtase tambikn las referencias del capitula T.

Enzimas: mecanismos de acción Victor W. Rodwell, PhD

INTRODUCCION Los mecanismos de la catAlisis enzimática reflejan muy de cerca 10s mecanismos de las reacciones químicas. Sin embargo, en contraste con la catálisis inorgánica o la orgánica más sencilla, las enzimas muestran un orden en extremo alto de especificidad al sustrato y una enorme eficiencia catalítica; esto es consecuencia del prolongado desarrollo evolutivo de sitios adaptados a la perfección pasa la cathlisis rripida y selectiva de reacciones individuales. Los caminos o vías por los cuales las enzimas convierten los sustratos en productos involucran una sucesión de intermediarios, mas que uno solo entre la enzima y el sustrato. El propósito final de los estudios de estos mecanismos es entender, a nivel molecular. por qud las cnzimas son catalizadores eficientes y específicos. Este objetivo todavía lejos de alcanzarse, requiere de: la identificacion de la etapa o fase limitante de la velocidad en la reaccibn global; la caracterización de todos Tos intermediarias enlamdos en la enzima; la identificación de los iones metálicos o grupos funcionales en los residuos de aminohcidos, coenzimas o grupos prosteticos que participan en el enlace de sustratos, productos e intermediarios en el sitio activo; y, de ellos, identificación del participante directo en la cathlisis. Por anaIogia con el estudio de los intcrmediarios en las vías del metabolismo intermedio, el de los intermediarios enlazados a las enzimas que se forman durante la cathlisis, se denomina con toda propiedad "enzimología intermediaria". En este capitulo los principales comportamientos de la catálisis enzimática se ejemplifican Gon la enzima quimotripsina, una proteína comparativamente sencilla que no contiene coenzimas, grupos prostéticos ni iones metAl3cos.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA Los fenbmenos moleculares que acompafian la conversibn de sustratos a productos constituyen el tema del mecanismo de acción enzimática. Estos estudios conducen a un enfoque racional para la terapéutica y la preparaciiin de medicamentos - á r e a s dc gran potencial de desarrollo en un futuro inmediato. La informacihn estructural de alta resolucion obtenida por cristalografía con rayos X, combinada con la información mecanicista, facilita ahora la preparación de farmacos que inhiben enzimas especlf'ícas como H M G X o A reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ~olesterol.Asimismo, los estudios de los mecanismos sugieren ciimo puede usarsc la tecnologia del DNA recombinante y la mutagenesis dirigida a un sitio, con el fin de modificar la especificidad enzimática o la eficiencia catalítica. En ultimo caso, estas técnicas facilitarán el diseflo y la introducción en seres humanos de enzimas con las propiedades especificas deseadas.

LA "ENZIMOLOG~AINTERMEDIARIA" DE LA QUHMOTRIPSINA MUESTRA LAS C A R A C T E R ~ T I C A SGENERALES DE LA CATÁLISIS ENZIMATICA La quimotripsina cataliza la hidrolisis de los enlaces peptidices en los que el grupo carboxilo es cedido por un aminohcido aromático (Fen, Tir, o Tri) o por uno con un grupo R voluminoso no polar (Met). Igual que muchas otras proteasas, la quimotripsina cataliza también la hidrólisis de ciertos ésteres. Aunque la propiedad de la quirnotipsinapara catalizar la hidriilisis de ésteres no tiene importancia fisiolbgica, si facilita el estudio del mecanismo catalitico.

1

O

D

e-5 Z

Fase de equilibrio

, Fase de "estallido'

Flgura 10-1. pNttrofenilacetato (PNPA) Tiempo (mseg)

El sustrato sintttico p-nitrofenilacetato (figura 10-1) facilita el análisis colorimétrico de la actividad de la quimotripsina, debido a que su hidrólisis libera p-nitrofenol. En un medio alcalino, Cste se convierte en el anión amarillo p-nitrofenilato.

LA CINÉTICA DE FLUJO INTERRUMPIDO REVELA LA "ENZIMOLOG~AINTERMEDIARIA" DE LA QUlMOTRlPSlNA La cinética de la hidrólisis del p-nitrofenilacetato por la quimotripsina puede estudiarse en un aparato de "flujo interrumpido". Estos experimentos utilizan cantidades equivalentes de sustrato (mas o menos cantidades equimolares de enzima y sustrato) y ponderan los fenómenos que tienen lugar en los primeros milisegundos desputs de hacer la mezcla. EI aparato tiene dos jeringas: una para la quimotripsina y la otra para el p-nitrofenilacetato. La mezcla instantanea de la enzima y el sustrato se logra con un dispositivo mecanice que expele con rapidez y de manera simulthnea, el contenido de ambas jeringas en un tubo angosto que pasa a cravts de un espectrofot6metro. La densidad 6ptica como función del tiempo despuds de la mezcla, se registra en un tubo de rayos catbdicos.

La liberación del anión p-nitrofenilato es bifasica La liberacihn del anión p-nitrofenilato tiene lugar en dos fases distintas (figura 10-2): 1) una fase de "esta-

CT + PNPA

Figura 10-2. CinBtica de liberación del anión p-nrtrofenilato cuando la quimotripsina hidroliza al p-nitrofenrlacetato en un aparato de flujo interrumpido. En esta grfifica, el "fenol liberado" se calwfb a partir de la densidad bptica del anión p-nitrofenilato.

Ilido", caracterizada por el desprendimiento mhs rApido del anión p-nitrofenilato y 2) una liberaci6n mhs lenta, subsiguiente, del mismo. El carhcter bifhico de la liberacibn del anión p-nitrofeniEato se comprende en tkrminos de los pasos sucesivos de la catdlisis mostrados en la figura 10-3.

La etapa lenta es la hidrólisis del complejo quimotripsina-acetato (CF-Ac) Una vez que toda la quimocsipsina disponible forma parte del complejo CT-Ac, ya no puede haber más desprendimiento dep-nitrofenilato hasta que se libera quirnotripsina mediante la remocibn hidrolitica lenta del ani6n acetato procedente del complejo CT-AC (figura 10-3). La fase de "estallido" (figura 10-2) corresponde a la conversion de toda la quimotripsina libre disponible en el complejo CT-Ac, con liberaci6n simultánea del ani6n p-nitrofenilato. El p-nitrofenilato (feno[PNPA del ingl~s~p-nifropknylafe) ~ +despds~ de la fase de "estallido" es consecuencia de la formación lenta de quimotripsina libre por hidrbtisis del cornplejo CT-Ac. Esta quimotripsina libre queda entonces disponible para la formación posterior de complejos

~

- tCT-& ucT CT-PNPA

Rapida

RBpida

Lenta

Flgura 1 0 3 . Pasos intermedios en la cathlicis de la hidrblisis del p-nitrofenifacetato por la quimotripsina (CT, quirnotripsina, PNPA,p-nitrofenilacetato; CT-PNPA,complejo quimotripcina-pnitrofenilacetata;CT-Ac, complejo quimotripsina-acetato;fenol, anrbn pnitrofenilato, A F , anibn acetato.) La formación de los complejos CT-PNPA y CT-Ac es rápida en relacibn a la hidrblisis del complejo CT-Ac.

Enzirnas: mecanismos de acci&

CT-PNPA y CT-Ac con iiberacibn concurrente del PNPA. En realidad, la magnitud de la fase de "estallido'' (es decir, los moles dep-nitrofenilato liberados) es directamente proporcional al número de moles de quimotripsina presentes inicialmente.

La señina 195 tiene una funcibn clave en la catálisis El grupo acil del intermediario acil-CT está enlaza'do a un residuo seril altamente reactivo -serina 195de la quimotripsina. La elevada reactividad de la Ser 195 se demuestran por su capacidad (aunque no por la de los 27 residuos seril restantes de la quimotripsina) para reaccionar con el diisopropilfosfofluorjdato ( D 1 P F , d e 1 in g Id S, diisopropylphosphoJuuridate) (figura 10-4). Reacciones análogas tienen lugar con otras proteasas de serina. La fomacihn de derivados de la Ser 195 inactiva a la quimotripsina. Muchas otras proteasas son inactivadas por el DiPF mediante un mecanismo analogo. Estas se conocen como "serina proteasas".

Un sistema relevador de carga funciona como una lanzadera de protones durante la catá!isis Este proceso utiliza tres residuos aminoacil que están bastante separados respecto a su estructura primaria, aunque a distancia suficiente para formar enlaces entre si, en el sentido de la estructura terciaria. Estos residuos son Asp 102, His 57 y Ser 195. Aunque la mayoría de los residuos cargados de la quimotripsina estan en la superficie de la molkcula, los que pertenecen n la "lanzadera" estan "enterrados" en el interior no polar de la mol~cula.Los tres residuos se encuentm alineados en e! orden Asp 102-His 57-Ser 195. Recuérdese que Ser 195 es el residuo acilado durante la catalisis por quirnotripsina. La aproximacibn del ani6n acetato (derivado del pnitrofenilacetato) al Btomo de oxígeno del grupo R de la Ser 195 desencadena el desplazamiento secuencia! de protones que se mueven como "lanzadera" de Ser 195 a travhs de His 57 a Asp 102 (figura 10-5).

'f

. Ol Enz-CH,OH+

F-P=O 4

A

DIPF

S"'

' Sus- (es decir. Ac-)

His

-C-O-H-

- .N

1 13

N-H

O-

A

Ser

Figura 10-5. Operacibn de la lanzadera de protones de la quimotripsina durante la acilacibn de Ser 195 por el sustrate (Sus3

Durante la desacilacion del intermediario acil-Ser

195, los protones se mueveii en direccidn contraria. Se cree que una serie análoga de desplazamiento de protones acompaña la hidrblisis de un sustrato fisio16gico de la quimotripsina, como la es un pCptido. Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina se libera desde los ribosomas como precursor de la enzima sin actividad catalitica denominado preenzima o cirnógeno. Tal como se explicara en el capitulo 1 1, la conversibn de la preenzima quimotripsinbgeno en la enzima activa quimotripsina implica una serie de fenomenos proteoliticos selectivos cuyo resultado final es la formación del sitio activo y el alineamiento del sistema relevador de carga responsable de la catálisis.

Catálisis mediante fructssa-2,6-bifosfatasa La fructosa-2,6-bifosfatasa es una fosfohidrolasa (capitulo 21) que cataliza la remocibn mediante hidrdlisis del fosfato del carbono 2 de la fructosa2,6-bifosfato. La figura 10-6 muestra la funcibn de siete residuos de sitios activos en la catilisis efectuada por esta fosfohidrolasa. Igual que en la catálisis que producen las proteasas de serina, ésta implica una "triada catalitica", aunque una parte de ella consta de dos His y un residuo Glu. También se muestra la estabilizacibn por residuos de Arg y Lis con carga positiva, de la fuerte carga negativa del sustrato.

Y o

Enz-CH,-O-P=O

I I

A

Figura 1 0 4 . Reaccibn del hidroxilo primario de la Ser 195 de quimotripsina con el diisopropilfosfofluoridato (DIPF).

LAS COENZIMAS PARTICIPAN DIRECTAMENTE EN LA CATALISIS ENZIMÁTICA La participación directa de las coenzimas para las enzimas conocidas como arninotransferasas, o, con mayor frecuencia, como transaminasas se explican en

transaminacas implica los mecanismos de ping pong que se expusieron en el capitulo 9, con liberacion de un producto antes de agregar el segundo sustrato (figura 10-7).

E-P Fru-6-P

E Fru-2,6-P,

Arg

307

His

392 *rg 257

HIS asa

E-P H,O

EmP,

Catálisis por fructosa-2,6-bifosfatasa. (1) La mrga negativa cuádruple del sustrato unido se estabiltza por las interacciones d e carga a carga con brg 257. Arg 307, Arg 352 y LIS 356. Uno d e los integrantes de la trfada catalitica, Glu 327, estabiliza la carga positiva d e His 392 (2) La nucleofilica His 392 ataca al carbono 2 del grupo fosforilo, y transfiere el fosfato a His 258 con formación d e un fosfate intermedio Se desprende fructosa 6-fosfato d e la enzima (3) Un segundo ataque nucleofilico por una rnol&culade agua. posiblemente asistida por Glu 327 que actua como base, forma fosfato inorgánico. (4) Se desprende ortofosfato inorg8nim desde Arg 257 y Arg 307 (Reproducida con autorizaci6n de Pilkic SJ et al ,6-Phosphofructo-2-kinaselfrucose-2,6-bisphosphatase. A rnetabotic signaling enzyrne Annu Rev Biochem 1995,64:799 ) Figura 1 0 4 .

seguida. Las transaminasas catalizan el intercambio de grupos alfa amino de los aminoacidos por grupos alfa 0x0 de los alfa oxoacidos del piruvato, oxnlacetato o aIh cetoglutarata; estas reacciones son fundamentales para la biosintesis y el catabolismo de los aminoácidos (capitulas 30 y 3 1). Lo mismo que muchas reacciones que requieren coenzimas, la catálisis por medio de las

E-cHo

dcH0-E

'

A I ~

LOS RESIDUOS EN EL SITIO CATAL~TICOPUEDEN ACTUAR COMO CATALIZADORES ~ci~oaÁsicos Una vez que el sustrato se ha unido al sitio catalítice, los grupos funcionales cargados {o con posibilidad de tener carga) de las cadenas laterales de residuos aminoacil cercanos, pueden participar en la catálisis al funcionar como catalizadores Acidos o bhsicos, Existen dos amplias categorías de catllisis acidobásica efectuada por enzimas: la catálisis Acida (o blsica) general y especifica. Por otro lado, aunque las reacciones cuyas velocidades varían en respuesta a los cambios en la concentraci6n de M' o II3O1son independientes de las concentraciones de otros hcidos o bases presentes en la soluci6n, se dice que están Sujetas a catálisis ácida específica o bhsica especifica. Por su parte, se dice que las reacciones con velocidades sensibles a todos los ácidos (donadores de protones) o a todas las bases (aceptores de protones}en Ia solucibn,astán sujetas a catálisis hcida general o básica general.

Las variaciones del pH y de las concentraciones de amortiguador establece la diferencia entre catálisis acidobásica general y la especifica Si la velocidad de la reacci6n cambia como una función del pH a concentracion constante de amortiguador, se dice que es catálisis básica específica (cuando el pH es superior a 7) o catalisisiicida específica (con pH menor a7). Si seeleva lavelocidad de lareacci6n apH constante con los incrementos en la concentración del amortiguador, sediceque esthsujetaa catálisis bhsica general (cuando el pH es mayor de 7) o cathIisis hcida general (con pH inferior a 7).

N,

/CHzNHaLE-CH2~H2 \

Pir

-E

\

KG

E-cHo

\

Giu

Figura 10-7. Mecanismode ping pong de la transaminacibn. E-CHO y E-CH2NH2 representan los complejosenzima-fosfato de piridoxal y enzima-focfato de piridoxamina. respectwamente. (Ala, alanina; Pir. piruvato; KG, alfa-cetoglutarato, Glu,

glutamato.)

Como ejemplo de catálisis ácida especifica, considérese la conversihn de un sustrato (S) a un producto (P). El proceso tiene dos pasos, una transferencia de protones rápida y reversible,

seguida por un pasa más lento y, por tanto, determinante de la velocidad, de reordenamiento del sustrato protonado a producto:

El aumento de la concentracibn del ion hidronio [ H d 3 + jincrementa la velocidad de la reacción aI elevar la concentraci6n de SH', el acido conjugado del sustrato. que es a su vez el sustrato para el paso determinante de la velocidad en la reacción global. Expresado de manera matemhtica, Velocidad

=

dlpl dt

=

WH 7

donde P = producto, t = tiempo, k = constante especifica de la velocidad y [SH '1 = concentracion del acido conjugado del sustrato. Dado que la concentraci~nde SH' depende de las concentraciones de S y de &O', la expresibn general de la velocidad para las reacciones catalizadas ácido especificas es:

Nótese que un requisito de la catálisis hcida especifica es que la expresión de la velocidad contenga $610 términos para S y para h O + . Ademas, considbese que, en adicibn a la catlilisis ácida especifica descrita antes, hay también catalisis por el ian irnidazolio de un amortiguador imidazblico. Puesto que el imidazol es un ácido débil (pK, aproximadamente 7), es un donador de protones malo; por eso la reacción

es lenta y determina la velocidad para la reacción global. Nótese que el paso rhpido y el lento estan invertidos cuando el mecanismo cambia de catfilisis Bcida especifica a general. Las expresiones de velocidad para la cathlisis hcida general con frecuencia son complejas por lo cual no se describen aquí.

LA MUTAGENESIS DlRlGlDA A UN SITIO PROPORClONA NUEVAS PERSPECTIVAS Las técnicas de la biologia molecular proporcionan herramientas poderosas para la investigacion del me-

canismo de accibn de las enzimas. Destaca entre ellas la posibilidad de alterar a voluntad Ia secuencia de bases de nucleótidos de los genes y expresar las proteínas en huespedes unicelulases como células de mamíferos cultivadas o la bacteria EScherichia col[ En combinaci6n con estudios de la estmctura tridirnensional en solución por cristalografía con rayos X 'y con investigaciones cinkticas clasicas, estas tdcnicas moleculares proporcionan nuevas perspectivas sobre los mecanismos de accibn de las enzirnas. Cuando los datos físicos y cinhticos indican que un residuo aminoacídico dado desempefia una funcibn especifica en la catiilisis (es decir, que sirve como una base general o como un reactivo de transferencia de grupo), la posibilidad puede ser respaldada mediante el cambio del aminoacido por otro incapaz de ejecutar Ia funcián postulada. En algunos casos, esto puede lograrse con la modificaci6n química de la enzima. Sin embargo, un enfoque mhs general consiste en emplear la mutagenesis dirigida a un sitio para modificar el gen que codifica la enzima, luego expresarlo y caracterizar la enzima mutante. Por la alteración de la secuencia de bases de un codón especifico, la mutagknesic dirigida a un sitio, puede reemplazar un aminoácido dado por cualquier aminohcido proteínico deseado. Asimismo, la mutagénesis dirigida a un sitio puede producir numerosas mutantes en un punto. Un oligonuclebtido corto (es decir, un mer-F 9) que codifica un aminohcido mutante, generado por síntesis automatizada, es templado in vjtro al gen original aislado. Luego se produce un gen mutante por adición de DNA polisomerasa, DNA ligasa y trifosfatos de ribonucle6tidos. A continuación, ese gen se traslada a un vector para expresion detrfis de un promotor potente, se expresa y la enzima mutante que se obtiene es purificada para examinar SLIS propiedades.

LOS IONES METALICOS PUEDEN FACILITAR LA FIJACIÓN Y LA CATÁLISIS DEL SUSTRATO Mfis de 25% de las e n z i m a contienen iones metálicos firmemente unidos o los necesitan para su actividad. Las funciones de éstos se estudia por medio de la cristalografía con rayos X, e imágenes de resonancia rnagnktica (IRM), y resonancia del spin del electrón (RSE). Junto con el conocimiento de la formación y [a degradaci~nde los complejos metAlicos y de las reacciones dentro de las esferas de coerdinacion de los iones methlicos, proporcionan una perspectiva de sus funciones en la cathlisis enzimática, las cuales se considerarAn más tarde. Las rnetaloenzimas contienen una cantidad definida de un ion methlico funcional que es retenido

116

e

Binguímicade Harper

(Capíf u10 J O)

durante !a purificación. Las enzimas activadas por metales se unen con &.tos de manera menos firme, pero los necesitan para ser activas. Por tanto, la distinci6n entre rnetaloenzimas y enzimas activadas por metal radica en la afinidad de una enzima particular por su ion metálico. Los mecanismos que emplean los iones metAlicos para desempefiar sus funciones parecen ser semejantes en las metaloenzimas y en las enzirnas activadas por metal.

En la catálisis funcionan complejos ternarios con metales Para los complejos temario5 (de tres componentes) del sitio catalítico (Enz), un ion metálico (M) y el sustrato (S) que presentan estequiometría 1 : 1 : 1, son posibles cuatro disposiciones:

Complejo con puente de sustrato

Complejo con puente

methtico en la piruvatocinasa mantiene un sustrato (ATP) en su lugar y lo activa.

ATP

Piruvatocinasa-

\

Creatlna

B. Complejos cuyo puente es el sustrato (EnaSAfJ Al parecer, la fomaci6n de complejos ternarios de trifosfatos de nucleósido y enzima, metal y sustrato con puentes de sustrato, se atribuye al desplazamiento del HzO desde la esfera de coordinacibn del metal por el ATP: A T P ~+' M ( H ~ o ) ~ ~ATP'

M ( H ~ O )+~3H20 ~'

enzimatico Las enzimas entonces se enlazan, formando el complejo ternario:

Complejo can puente metálico cíclico

Complejo con puente metálico simple

Para las enzimas activadas por metal, las cuatro disposiciones son posibles, mientras que las rnetaloenzimas no pueden formar el complejo EnzSM, debido a que retienen al metal a travds de la purificacidn (es decir, ya son un complejo BnzM). Pueden enunciarse tres generalizaciones: 1) la mayoria, pero no todas las cinasas (ATP:fosfotransferasas) forman complejos con puente de sustrato del tip Enz-nuclebtido-M. 2) Las fosfotransferasas, que utilimn pinivato o fosfoenolpiruvato como sustrato, las enzimas que catalimn otras reacciones del fosfoenolpiruvato y las carboxilasas, forman complejos con puente rnethlico. 3) Una enzima dada puede formar un tipo de puente en el complejo con un sustrato y uno de tipo diferente con otro.

A. Complejos con puente enzimáfico (MEnzS) Se presume que los metales en los complejos con puente enzimático tienen funciones estructurales en el mantenimiento de la conformacibn activa (por ejemplo, la glutamina sintetasa) o forman un puente metiilico hacia el sustrato (por ejemplo, la piruvatocinasa). Ademhs de su función estructural, se cree que el ion

En las reacciones de las fosfotransferasas, los iones met8licos se consideran como activadores de los átomos de fbsforo que ast forman un complejo rigido pol ifosfato-aden ina, de conformación apropiada en el complejo cuaternario activo. C. Complejos con puente metálico

Los datos cristalogrhficos y de secuenciación han establecido que un residuo His interviene en la fijación del metal al sitio activo de muchas proteinas (por ejemplo, carboxipeptidasa A, citocromo c, mbredoxina, rnetamioglobina y metahemogfobina; capitulo 7). Para los complejos binarioc (dos componentes) E n N , el paso limitante de la velocidad es en muchos casos la separación del agua de la esfera de coordinación del ion methlico. En muchas peptidasas, la activación por los iones metklicos es un proceso lento que requiere muchas horas. Es probable que la reacciOn lenta sea et reordenamiento confomacional del compIejo binario EnzM para llegar a la forma activa, por ejemplo:

Enzimas - mecanismos de acciún

Unibn del metal: Rhplda

+

Enz + M(Hfl)s -+ Enz-M{H20)6.,

nH20

Reordenamiento a una conformacibn activa (Enz'): Lenta

En~-M(Hz0)6.~ +

un ion metklico puede "enmascarar" a un nuclebfilo y así prevenir una probable reaccibn secundaria. Finalmente, el control estereoquimico del curso de una reacción catalizada por enzimas, puede lograrse con la propiedad de la esfera de coordinacibn del metal para actuar como un molde tridimensiona! para mantener los grupos reactivos en una orientación espacial especifica (cuadro 10-1).

E l i f4 ! A ( H 2 0 ) ~ . ~

Sin embargo, en las metaloenzimas el compleio ternario con puente metfilico debe formarse mediante Ia combinación del sustrato (S) con el complejo binario EnzM :

Enz-iUi

117

+ S k Enz-M4

/

'. I

o Enz

S

Los iones metálicos desempeñan múltiples funciones en la catálisis

RESUMEN La quimotripsina proteasa (CT) ejempIifica numerosas características generales de la catalisis enzimática, las cuales incluyen la formación de intermediarios unidos a enzima (CT-PNPA y CT-Ac), la naturaleza escalonada del proceso (tres reacciones parciales}, el carácter limitante de la velocidad de una reaccibn parcial sencilla (hidrdlisis de CT-Ac) y Ia liberacihn en secuencia de productos (fenol seguida por acetato). Idas funciones.de aminohcidos p&iculares en el sitio catalitico se mostraron por la función de un residuo Ser (SeriYs)como aceptor de un grupo (Ac-) que es transferido a agua y por las funciones de los residuos Ser, 1-Iis y Asp específicos en la formación d e un sistema relevados de carga. Además, este sistema relevador de carga ejemplifica quc los residuos adicionales bastante separados en el sentido de una estructura primaria (Ser 195, His 57 y Asp 102)

1-0siones methlicos pueden participar en cada 1 de los 4 mecanismos con los que se sabe las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones qufmicas: 1) catálisis acidobásica general, 2) catáIisis covalente, 3) aproximación de los reactantes y 4) induccion de rigidez o tension en la enzima o el sustrato. Además del hierro Cuadro 10-1. Ejemplos escogidos de funciones dc? y el manganeso que funcionan en las proteínas hémilos iones me. el mecani IS cas, los iones metálicos que intervienen más común:nzimas* mente en la catálisis enzimática son ~ g ~~ ' ,n " y ~ a ? 'aunque , otros iones metálicos (por ejemplo, K') Funcion uei iuii irieiaiicu son importantes para la actividad de ciertas enzirnas. IIisnaina riesarninasa Los iones metblicos, al igual que los protones, son Cinasas, liasas, pirii- I valo descarboxilasa ácidos de Lewis (etectr6filos) y pueden compartir un par de electrones para formar un enlace sigma. Ar rbbnica i Activaciiin de un nuclebfilo Ademhs, pueden ser considerados "superácidos", dado En ~rnldicas El meta! actiia como un nucieóque existen en soluci6n neutra, frecuentemente tienen una carga positiva > 1 y pueden formar enlaces pi. Pi ruvato cal-boxilasa, Asimismo (a diferencia de los protones), los metales carboxiplcptidasa, pueden servir como plantillas tridirnensionaies para la alcohol dr:shidrogeorientación de los grupos bhsicos en la enzima o el nasa sustrato. IWeinas ftmt sin k m Donación nes pi (n) -- m ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, , . Por otro lado, los iones metálicos pueden aceptar Piruvato cinasa, pirue y orienia electrones a travhs de los enlaces sigma o pi para vato carlioxilasa, activar electrófilos o nucleófilos (catálisis acidobksica adeni latoci -- . general). Mediante la donaci6n de electrones, los Fosfotrancf crasa, Dnsionales metales pueden activar a los nuclebfilos o actuar como xilosa isi3rnerasa, nucleófi~osellos mismos. La esfera de coordinación .. i1 hemoproteirids -de un metal puede atraer a la enzima y al sustrato * Adaptado de Mildvan AS Meials in enzyme cat;alysis Vol 2. (aproximación) o crear una distorsión que produce Pagc 456 in The Enzymes Boyer P U, Lardy H , Myrhack K quelatos en una o en otro (rigidez o tensión). Ademas, (editors) Academrc Press 1970

6 L u

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118 * Rioquimica de Hurper

pueden formar porciones contiguas del sitio catalítico de una enzima. La proteblisis selectiva de la preprotefna quimotripsinbgeno inactiva crea el sitio activo de la quimotripsina y lleva los tres residuos que conforman el sistema relevador de carga a una distancia, uno de otro, que permita formar enlaces. Durante la catllisis, los residuos del sitio catalitico pueden actuar como ácidos (Glu, Asp) o bases (His. Arp, Lis) generales. La adicion de sustratos y la liberación de productos pueden proceder en

{Capitulo 10)

forma ordenada o de una manera aleatoria. Bajo un mecanismo de ping pong (por ejemplo, transaminación), la reaccibn avanza a travks de los fenómenos alternos de adicibn de sustrato y liberacibn de producto. Los iones methlicos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis mediante la creacibn de varias clases de complejos puente, constítuidoc por enzima, metal y sustrato. Los iones met8licos pueden actuar como catalizadores acidos generales o facilitar la aproximaci6n de los reactantes.

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Enzirnas: regulación de actividades Victor W. Rodwell, PhD

de un medicamento provoca cambios significativos en el metabolismo de otro (capitulo 61). En este capitulo, algunos ejempIos escogidos muestran los mecanismo^ que regulan los procesos metabólicos mediante la cantidad o eficiencia catalítica de las cnzimas. La intención es establecer las características de los patrones globales de regulación. En todo el libro se hace referencia a otros muchos ejemplos espectficos para mostrar las diversas caracterís-ticas de la regulación metabólica.

IMPORTANCIA BIOMEDICA ¿De qué manera Ias células y ios organismos íntegros regulan y coordinan el metabolismo global? Esta pregunta interesa a los trahaiadores en áreas de las ciencias biornkdicas tan diversas como chncer, cardiopatias, envejecimiento, fisiologia microbiana, diferenciación, rnetakorfosis, accihn h-onal y de Fármacos. En todas estas áreas, se han encontrado ejemplos importantes de regulaciiin n o m a l o anormal. Por ejemplo, muchas celulas canmrosas exhikn anormalidadesen Ia regulación de su complemento enzimático (carecen de induccion o de represiOn); caso que ejemplifica la conclusi6n ya establecida, de qtic las alteraciones del control qenktico son fen6menoS fundamentales en las c&lulascañcerosas. De nuevo, ciertos virus onctjgenos contienen un gen que codifica para una tirosina proteincinma. Cuando esta cinasa actúa en las células del hugsped, puede fosforilarmuchas proteínas y enzirnas que normalmente no lo estAn y, por tanto, conducir a cambios importantes en el fenotipo celular. Al parecer, un cambio de esta naturaleza es la base de ciertos tipos de transformacibn oncogenica vira!. La accibn de los famiacos proporciona otro ejemplo importante que comprende la regulación enzimática, pues la induccidn enzimática es una causa bioquimica importante en las interacciones medícamentosas, situaciones en las que la administracibn

LA R E G U L A C I ~ W DEL METABOLISMO LOGRA LA HOMEOSTASIA El concepto de regulación homeostática del medio interno emitido por Claude Bernard a finales del siglo XIX hizo hincapie en la facultad de los animales para mantener constante su medio intracelular a pesar dc los cambios en el exterior. Este concepto impIica que todas las reacciones necesarias catalizadas por enzimas se efectúan a velocidades que responden a cambios tanto en el medio interno como en el externo. Una cCIula u organismo pueden considerarse enfermos cuando no responden o lo hacen inadecuada o incorrectamente a una seiial interna o a un esmés externo. El conocimiento de los factores que afectan las velocidades de las reacciones catalizadas por enzirnas, es esencial para entender el mecanismo de la homeostasia en las células normales y para comprender la base molecular de la enfermedad.

El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional Todas las reacciones quirnicas, incluyendo las catalizadas pos enzimas, son en cierto grado reversibles*. Dentro de la celula viva, sin embargo, es posible que no se produzca la reversibilidad porque los productos

* Una reacciiin fácilmente reversible tiene un pequeao valor numérico de AG, micntras que una con un valor negativo grande para AG podría llamarse "realmentc irreveriihle" cn casi todas las siiuacioncs bioquimicas.

120

Bioquimica de Harper

de reacciiin son removidos con rapidez mediante reacciones adicionales catalizadas por enzimas. El flujo de metabolitos en una celulavivaes análogo al flujo de agua en un acueducto el cual aunque es capaz de transportar agua en ambas direcciones, en la prhctica el fiujo es unidireccional. El flujo de metabotitos en la d l u l a también lo es en gran parte. El equilibrio verdadero, lejos de ser característico de la vida, se alcanza s61o a la muerte de la célula. La célula viva es un sistema dinámico estacionario conservado por un flujo unidiseccional de metabolitos (figura 1 1-1). En las cklulas maduras, las concentraciones medias de los metabolitos permanecen relativamente constantes durante periodos considerables*. La flexibilidad del sistema estacionario s e manifiesta en los delicados desplazamientos y equilibrios mediante los cuales los microorganismos conservan constante el medio intemo, a pesar de Ias amplias variaciones en alimentaciiin, ingestibn de minerales y agua, rendimiento de trabajo o temperatura externa.

Las velocidades de reacción responden a las necesidades fisio~ogicascambiantes Para que la vida proceda de una manera ordenada, debe regularse el flujo de metabolitos a travks de las vías anabólica y catabólica. Es preciso que todos los fenómenos quimicos necesarios tengan lugar a velocidades congruentes con los requerimientos del organismo en relacidn con su medio. La produccidn de ATP, la sintesis de precursores macromoleculares, el transporte, la secreción y la resorción tubular, deben responder todos a cambios suti les del medio celular, del brgano y del animal integro. Se necesita que estos procesos sean coordinados y, además, respondan a cambios a corto plazo del medio externo (por ejemplo, la adicibn o la eliminaci6n de un nutriente), ncl como a sucesos intracelularcs periddicos (por ejemplo, la replicación del DNA). I-lasta ahora, los detalles moleculares de la regulacibn son mejor comprendidos en las bacterias, las cuales carecen de las complejidades del control hormonal o neurológico y en las cuales los estudios genéticos pueden llevarse a cabo con facilidad para analizar los acontecimientos moleculares. Sin embargo, nuestra comprensihn de la regulacibn rnolecular en la célula animal está en un estado de rhpida expansibn. En tanto que la regulacion metab6lica en los mamíferos difiere de modo signifi-

(Capibulo I 1)

/

grandes

\m

Figura 11-1. Una oélula ideal en estado de estabilidad. Obsérvese que el flujo de rnetabolitos es unidireccional.

cativo, de los fenómenos superficialmente semejantes de las bacterias, la regulacibn de los procesos metab6licos en &as ser6 el ejemplo a discutir debido a que proporciona un marco conceptual de referencia para considerar la regulación en el ser humano

TRES MECANISMOS GENERALES REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTI~A El flujo neto de carbono de una reacción catalizada enzirnAticamente podria ser influido: 3 ) cambiando la cantidad absoluta de enzima presente, 2) alterando el tamaiio del conjunto de reactantes distintos de la enzima y 3 ) alterando la eficacia catslitica de la enzima. Las tres opciones son utili~adasen casi todas las formas de vida.

Las velocidades de síntesis y degradación determinan la cantidad de enzima La cantidad absoluta de una enzima presente esta determinada por su velocidad de sintesis (k,) y por Ia velocidad de su degradación (b,} (figura 1 1-2). La cantidad de una enzima dentro de una celula puede

Enzima

Aminoácidos

* Sin emhargo, si ocurren osciiaciones de corta duración en las concentraciones del meiaholito y de la enzima y tienen gran importancia fisiológica.

Figura 11-2. La cantidad de enzima se determina por el balance neto entre la sintesic de la enzima su degradación Las K, y Kdegson las mnstantes de velocidad para el proceso completo de sintesis y degradacibn, respectivamente

Enztmar: regulación de uctividudes

elevarse ya sea por un incremento en su velocidad de síntesis (incremento de k,), por una disminución en su velocidad de degradacibn (disminucion de h,), o por ambos. De manera semejante, una cantidad menor de enzima puede resultar de una disminucihn de k,, de un incremento en kdq, O deambos procesos. En el ser humano se encuentran ejemplos de cambios tanto en k, como en k+. En todas las formas de vida, la síntesis de enzimas a partir de los aminoAcidos y su degradacibn hasta aminohcidos son procesos distintos catalimdos por conjuntos de enzimas por completo diferentes. La regulación independiente de la sintesis y de la degradacihn de las enzimas se logra asl, fhcilmente (figura 11-2).

Los inductores pueden estimular la síntesis de enzirnas Las celulas pueden sintetizar enzimas especificas en respuesta a la presencia de inductores especificos de peso molecular bajo. Por ejemplo, Escherichia colr cultivada en glucosa no cataboli~arala lactosa debido a la falta de la enzima beta galactosidasa, que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa, Si al medio de cultivo se agrega lactosa o algunos otros beta galactosidos, hay inducción de síntesis de beta gaIactosidasa y entonces el cultivo puede catabolizar la Iactosa. Aunque muchos inductores son sustratos para la enzima que inducen, ciertos compuestos estmcturalmente semejantes al sustrato pueden ser inductores, pero no sustratos; se les llama inductores gratuitos. A la inversa, un compuesto puede ser un sustrato, pero no un inductor. Frecuentemente, un inductor estimula a varias enzirnas de una ruta catabdlica(por ejemplo, tanto la beta galactosidopemeasa como la beta galactosidasa son inducidas por lactosa). Las enzimas cuya concentraci6n en una ctIula es independiente de un inductor agregado se denominan enzimas constitutivas. Una enzima particular puede ser constitutiva en una cepa, inducible en otra, y ausente en una tercera. Las células capaces de ser inducidas por una enzima particular, por lo general contienen una cantidad basa1 pequefía medible de esta enzima, aun en ausencia del inductor agregado. La herencia gendtica de la ctlula determina así, tanto la naturaleza como la magnitud de la respuesta al inductor. t o s términos "constitutiva'" e "inducible" son, por tanto, términos relativos, como "caliente" o "frio", que representan los extremos de un amplio espectro de respuestas. La induccibn enzimhtica tambitn existe en las células eucariotas. Ejemplos de enzimas inducibles en los animales son la triptbfano pirrolasa, la treonina deshidrogenasa, la tirosina alfa cetoglutaratotransaminasa, la invertasa, las enzimas del ciclo de la ula HMG-COA reductasa y el citocromo P450.

121

Los productos finales reprimen la síntesis de enzimas La presencia de un metabolito biosintktico en el medio de crecimiento bacteriano, puede reducir la nueva síntesis del mismo por medio de la represión. Tanto en la induccion como la represión participan elementos cis, secuencias especificas de DNA ubicadas en la parte superior de la cascada de genes que codifican una enzima dada, y proteínas reguladoras trunTactuantes. Además, metabolitos especificos sirven corno correpresores o coinductores que al enlazarse a proteínas transactuantes, lo mismo fortalecen que debilitan su integracihn con un elemento cis. Por tanto, los valores intracelulares altos de un metabolito como una purina o un aminoácido pueden interrumpir la síntesis de las enzimas que participan en su propia biosíntesis. Por ejemplo, en Salrnonelh typhirnurrum, la adición de histidina reprime la síntesis de todas las enzimas que intervienen en su biosíntesis, mientras que la adicibn de leucina reprime la síntesis de las tres primeras enzimas peculiares para su biosíntesis. Despues de la eliminación o del agotamiento de un intermediario biosintético esencial del medio, de nuevo se produce la biosintesis enzirnitica. Esto constituye lo que se denomina dessepresión. Los ejemplos anteriores muestran la represibn por retroalimentación con el. producto, típica de Ias vias biosinttticas de las bacterias. Por otro lado, la represión por catabolito es un fenómeno relacionado que se refiere a la facultad de un intermediario en una sucesi6n de reacciones catabólicas catalizadas por enzimas para reprimir la sintesis de las enzimas catab0Iicas. Este efecto fue observado primero en cultivos de E. coli creciendo en una Euente de carbono (X) distinta de la glucosa. Se not6 que la adición de glucosa reprimía la síntesis de las enzimas encargadas de1 catabolismo de X y este fenómeno fue inicialmente llamado el "efecto de la glucosa*'. Puesto que otros nutrientes oxidables diferentes a este carbohidrato producen efectos semejantes, se ndopt6 el tdrrnino represidn por catabolito, la cual es mediada por el cAMP. Los mecanismos moleculares de la inducción, la represion y la desrepresidn se dcscribirhn en el capitulo 4 1.

EL RECAMBIO DE PROTE~NAS TIENE LUGAR EN TODAS LAS FORMAS DE VIDA Los procesos combinados de síntesis y degradacibn de [as enzimas constituyen el recambio enzimático reconocido como una propiedad característica de las c&IuIasde los tiamíferos, mucho tiempo antes de que

se mostrara que también tenia lugar en las bacterias. La existencia del recambio de proteínas en el ser humano se dedujo de experimentos dietkticos hace bastante más de un siglo, aunque fue hasta el trabajo clásico de Schoenheimer, justamente antes y durante la 11 Guerra Mundial, que se estableció concluyentemente. Midiendo las velocidades de incorporación de aminoácidos rnarcados con NI5 a las proteinas y los índices de pCrdida de NI5 de las proteinas, Schoenheimer concluyó que las proteínas están en un estado de "equilibrio dinamico", un concepto extendido desde entonces a otros constituyentes del cuerpo, incluyendo los Iípidos y los ficidos nucleicos.

Las velocidades de degradación de las enz'imas específicas están sujetas a regulación La degrada~ionde proteínas de mamfferos por vías que dependen de ATP y ubiquitina, asi como las independientes dc ATP, se describen en el capitulo 3 1. La susceptibilidad de una enzima a la degradacibn proreolitica depende de su ~onfomacibn.La presencia o la falta de sustratas, coenzirnas o iones metálicos, que pueden modificarla, alteran lasusceptibilidad proteolítica. De este modo, laconcenmci61-ide sustratos, de coenzímas y posiblemente de iones en las cklulas puede, influenciar las vclocidades a las cuales son degradadas enzimas especificas. La arginasa y la triptófano oxigenasa (tripthfano pirrolasa) e,jemplifican estos conceptos. La regulación de las cifias hephticas de arginasa puede incluir ya sea un cambio en k, o en L,. Despudc de la ingestidn de una dieta abundante en protehas, los valores hepriticos de arginasa se elevan debido a un incremento en la velocidad de su sintesis. Los mismos valores también aumentan en los animales hambrientos. Aquí, sin embargo, es la degradación de la arginasa la que está disminuida, en tanto que k, permanece inalterada. En un segundo ejemplo, tanto la inyeccidn de glucocorticoides como la ingestión de triptófano aumentan 30s valores de triptofano oxigenasa en los mamíferos. El efecto de las hormonas es la elevacibn de la velocidad de síntesis de la oxigenasa (aumento de k).El triptófano, sin embargo, no ejerce efecto sobre k, pero abate be, estabilizando la oxigenasa respecto a la digestibn proteolitica. Estos dos casos contrastan con la inducción enzimática en las bacterias. En el caso de Ia arginasa, el incremento en la ingesti6n de nitrhgeno por una dieta abundante en proteinas puede elevar las cifras hepáticas de arginasa (capitulo 3 1). El aumento en Ia velocidad de síntesis de la arginasa se parece así, superficialmente, a la induccibn por sustrato en las bacterias. En el caso de la triptdfano pirrolasa, sin embargo, aun cuando el triptbfano puede

actuar como un inductor en las bacterias (afecta k,), su efecto en los marniferos sc qjerce solamente sobre el proceso degradante (abate kd,,). Los valores enzimaticos en los tejidos de marniferos pueden ser alterados por una amplia gama de factores fisiologicos, hormonales o dietéticos. Se conocen ejemplos para una diversidad de tejidos y vias metabólicas, pero nuestro conocimiento es fragmentario acerca de los detalles molecularec que intervienen para producir estos cambios. Los glucocorticoides incrementan Ia con~entración de tirosina trancaminasa estimulando su k,. Este fue el primer caso cSaro de una hormona reguladora de la sintesis dc una enzima de mamíferos. La insulina y cl glucagbn, no obstante sus cfectos fisiológicos mutuamente antagbnicos, incrementan k,, de manera independiente, de 4 a 5 veces. El efecto del glucagón probablemente es mediado a través del cAMP.

La síntesis de ciertas enrimas

como precursores inactivos tienen ventajas en la regulación La actividad enzimatica puede regularse con la conversión de una proenzima inactiva a la forma catalítica activa. Para volverse catallticamente activa, la proenzima debe experimentar una proteólisis limitada, un proceso acompañado de cambios en la conformación que revelan o "crean" el sitio catalítico. Esto se mostrara después en relacibn con la enzima quimotripsina.

MUCHAS PROTEASAS SE SECRETAN COMO PROENZIMAS SIN ACTIVIDAD CATAL~TICA Ciertas proteinas se elaboran y secretan en forma de proteinas precursoras inactivas conocidas como proproteínas. Cuando son enzimas, las proproteinas se denominan proenzimas o cimógenos. La conversion de una proteína en proteina madura implica la proteólisis selectiva, proceso que convierte la proproteina en una forma que tiene la actividad típica de la proteina madura (su actividad enzimfitica} mediante uno o más "cercenamientos" proteoliticos sucesivos. Los ejemplos de proteinas elaboradas como proproteinas incluyen la hormona insulina (proproteina = profnsulina), las enzima5 digestivas pepsina, tripsina y quimotnpsina (proproteínas = pepsindgeno, tripsindgeno y quimotripsinógeno, respectivamente), varios factores de la cascada de la coagulacibn sanguínea y de la disolución del cohgulo (capitulo 59), y la proteina cotágena del tejido conjuntivo (proproteina = procoIágena}.

La conversibn de proquimotripsina (pro-QT), polipéptido de 245 residuos aminoacilo, en la enzima alfa quimotripsina activa implica tres cercenamientos y la formación de un intermediario activo conocido como piquimotripsina (pi-QT) (figura 1 1-3). En la alfa quimotripsina las cadenas A, B y C permanecen integradas en virtud de la presencia de dos enlaces disulfuro entre las cadenas (figura 1 1 4 ) .

estar disponible un conjunto completo de los aminohcidos precursores. Como consecuencia, cl proccso de secrecidn puede ser de lentitud relativa con relación a la demanda físiológica.

Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a la demanda fisiológica

forma madura con actividad fisiológica ejernplifica

¿Por qu$ cicrias proteínas se secretan en la forma inactiva? Algunas son necesarias practicamenlc en todo momento, mientras que otras (como las enzimas de la fomacidn y disolucilin del coágulo sanguíneo) se requieren sólo de manera intermitente. Más aún, cuando estas últimas se necesitan de urgencia, Ciertos procesos flsiologicos como la digestión son intermitentes, pero bastante regulares y predecibles (aunque éste pudo no ser el caso para los seres humanos primitivos). Otros, como la formacibn y disolución de coágulos sanguíneos y la reparación tisular, tan rolo deben estar "en Iinea", para responder a la presibn de una necesidad fisiológica o fisiopatológica. Puede apreciarse con facilidad que el proceso de formación y disoluci6n de coágulos sanguíneos debe ser coordinado en el tiempo para alcanzar Ia homeostasia. Además, la sintesis de proteasas como proteinas precursoras sin actividad catalítica sirve para proteger el tejido de origen (por ejemplo, el pfincreas) de la autodigestibn, lacual puede presentarse en lapancreaiitis. La sintesis de nuvo de las protehas que se requieren puede no efectuarse con la rapidez suficiente para responder a la presión de una demanda fisiopatolégica como es la pérdida de sangre. Más aun, debe

La activación de la proquimotripsina requiere de proteolisis selectiva El e.jernplo de conversihn de una proproteína a s u

los principios generales siguientes de tal conversión: 1) El proceso implica la proteblisis selectiva que, en algunos casos, sb10 requiere un cercenamiento proteolítico Único. 2) Los productos polipéptidos se pueden separar o permanecer integrados a la proteína madura. 3) El proceso puede (o no) cumplirse con cambio significativo en el peso molecular. 4) La principal consecuencia de la proteólisis selectiva es alcanzar una nucva conformación. 5) Si la proproteína es una enzima, el cambio mencionado en Ta conformación origina el sitio catalítico de la enzima.En taI virtud, la proteolisis selectiva de una proenzima puede verse como un proceso que desencadena cambios esenciales en la conformación que "crean" el sitio catalitico.

Obskrvese que mientras His 57 y Asp 102 se encuentran sobre el peptido B de la alfa quimotripsina, Ser 195 se encuentra sobre el peptido C (figura 1 1-3). La proteblisis selectiva de la proquimotripsina (quimotripsinógeno) facilita la aproximación de los tres residuos del sistema relevador de carga, lo cual muestra la manera en que la proteólisis selectiva da lugar al sitio catalítico. Nótcse que el contacto y los residuos

Figura 113.Convessi611de la proquimotripsina {pro-QT) a pi-quimotflpsina (pi-QT) y de manera subsecuente a la enzima madura alfa quimotripsina (alfa-QT) con actividad catalitica.

S-S

S-C

S-

S

Flgura 1 1 4 Enlaces de disulfuro intra e tntercadenas de la alfa quirnotripsina (alfa-QT).

cataliticos pueden localizarse sobre diferentes cadenas de péptidos, pero mantenerse a una distancia que permita formar enlaces con el sustrato enlazado.

EXISTEN MÚLTIPLES OPCIONES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD CATAL~TICA Si una modificacibn fisiológica altera el grado de la actividad enzimatica, se puede preguntar si la cantidad de enzima ha cambiado o si la enzima es un catalizador más o menos eficaz. A todos los cambios de la actividad enzimatica sin modificación de la cantidad de enzima presente se les denominara como "efectos en la eficacia catalítica".

LA SEPARACIÓNDE ENZIMAS EN COMPARTlMlENTOS FACILITA LA R E G U L A C I ~ NDEL METABOLISMO No se puede pasar por alto la importancia de la disposicidn en compartimientos de Tos procesos metabhlicos en las ct5lulas eucariotas, que incluyen las de los mamíferos. La IocaZización de los procesos metabólicos especificas en el citosol o en los organelos subcelulares facilita la regulación de estos procesos independientemente de los que suceden en otras partes. La extensa formación de compartimientos de los procesos metabolicos tipicos de las formas superiores de vida confiere asi el potencial para un ajuste fino de la regulación del metabolismo. Al mismo tiempo, plantea problemas con respecto a lamovilizacion de metabolitos a través de las barreras de los compartimientos. Estos metabolitos pasan las barreras mediante "mecanismos de lanzadera", que convierten el metahlito en una forma permeable para la barrera del compartimiento, lo cual va seguido por el iransporte y la conversión a la forma original en el otro lado de la barrera. En censecuencia, estas interconversiones requieren, por ejemplo, formas citosólicas y mitocondriales de la misma actividad catalítica. Puesto que estas dos formas de la enzima están fisicamente separadas, su regulación independiente se facilita. En el capitulo 18 se

describe la función de los "mecanismos de lanzadera" para poder lograr el equilibrio de Ias confluencias metabblicas dc equivalentes reductores, del ciclo del hcido cltrico y de otros intermediarios anfibólicos.

LAS ENZIMAS PUEDEN FORMAR COMPLEJOS MACROMOLECULARES La organización de un conjunto de enzimas quecatalizan una secuencia de reacciones metabhlicas, coordina a las enzimas y a los canales intermediarios a lo largo de una via metabdlica. La alineacibn apropiada de las enzirnas puede facilitar la transferencia del producto entre las enzimas sin equilibrio previo con las confluencias metabblicas. Esto permite un modo más fino de control metabólico que el posible con los componentes aislados del complejo. Además, los cambios de confomacl6n en un componente del complejo puede transmitirse por interacciones de proteína con proDe este iriodo teína hacia otras ennimas del ~omple~jo. es posible laamplificacion de los efectos reguladores.

LAS CONCENTRACIONES LOCALES DE SUSTRATOS, COENZIMAS Y CATIONES PUEDEN REGULAR LAS ENZIMAS La concentracién intracelular media de un sustrato, una coenzima o un ion methlico puede tener escaso significado para el camportamiento rn vivo de una enzima. Es necesaria la informaci6n sobre las concentraciones de metabolitos esenciales en la vecindad inmediata de la enzima en cuestibn. Sin embargo, aun la medicibn de las concentraciones de metabolitos en compartimientos celulares diferentes no toma en cuenta las discontinuidades locales en su concentraci6n dentro de los compartimientos, causadas por factores como la proximidad al sitio de entrada o de producción de un metaboiito. Por último, generalmente se le da poca importancia a la discrepancia entre la concentracibn total y libre del metabolito. Por ejemplo, aunque la concentración total del 2,3-difosfoglicerato en los eritrocitos es extremadamente alta, la concentracidn

Enzimas: regulucidn de actividades

libre de bisfosfoglicerato (es decir, no unida a la h e m e globina) es comparable a la de otros tejidos. Consideraciones semejantes se aplican a otros metabolitos en presencia de proteínas que los fijan de modo eficaz y que reducen su concentracibn en estado libre. Una hiphtesis del enfoque cinético de MichaelisMenten es que la concentración del sustrato total es igual en esencia a la concentración del sustrnto libre. Como se anot6, esta suposicibn puede no ser vilida in vivo, donde es posible que las concentraciones de los sustratos libres se aproximen a las de la concentracibn de enzimas. Los iones metálicos que desempefian funciones catalíticas y estructurales en mas de una cuarta parte de todas las enzimas conocidas (capitulo 103, pueden tener tambien funciones reguladoras particularmente en las reacciones en que el ATP y otros polianiones son sustratos, Se observa la tlpica actividad mhxima cuando el cociente molar de ATP a metal es casi la unidad. El exceso de metal o de ATP son inhibitorios. Dado que los di y trifosfatos de nucleósidos forman complejos estables con los cationes divalentes, Ias concentraciones intracelulares de 30s nucle6tidos pueden influir sobre las concentraciones intracelulares de los iones methlicos libres y, por tanto, la actividad de ciertas enzimas.

CIERTAS ENZIMAS SON REGULADAS POR EFECTORES ALOSTÉRICOS La actividad catalítica de ciertas enzimas reguladoras es controlada por efectores alostericos de peso molecular bajo que por lo general tienen poca o ninguna semejan72 estructura1 con los sustratos o coenzimas para la enzima reguladora. La inhibición por retroalimentacibn se refiere a la inhibición de la actividad de una enzima inicial en una vía biosintktica, por medio de un producto final de esa vía. Para la biosíntesis de D a partir de A, catalizada por las enzimas En21 a Enq, Enzi EUQ

Eny

A+B+C-+

D

una concentraci6n alta de D, inhibitii de manera típica la conversion de A en B. Esto no implica un simple "retraso" de los intermediarios sino la capacidad de D para unirse a Enzl e inhibirla. Asi, D actúa como un efector alostérico negativo o inhibidor por retroalimentacihn de Enz,. Por tanto, la inhibicidn por retroalimentaci6n de Enzl mediante D regula la slntesis de D. De manera tlpica, D se une a la enzima sensible en un sitio alost4rico remato del sitio catalítico. La cinetica de la inhibición por retroaccion puede ser no competitiva, competitiva, parcialmente compe-

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titiva, no acoplada o mixta. Es la más común en tas vias biosinttticas. Frecuentemente, el inhibidor por retroacciones es la ultima molkcula pequefia antes de una macromol~cula(por ejemplo, arninohcidos antes de proteínas o nucleótidos antes de ácidos nucleicos). La regulacibn por retroacción tiene Iugar generalmente en el paso mhs temprano, funcionalmente irreversible*, que es exclusivo para una serie biasintética particular. Un ejemplo muy estudiado es la inhibición de aspartato transcarbamilasa bacteriana por CTP (véase después y capitulo 36). Frecuentemente, una ruta biosintkticapuede estar ramificada, sirviendo la porción inicial para la síntesis de dos o mBs metabolitos esenciales. La figura 1 1-5 muestra los sitios probables de inhibición por setroacción simple en una vía biosintdtica ramificada (por ejemplo, para aminoácidos, purinas o pirimidinas). Los Si,S2y S3 son precursores de los cuatro productos finales (A, B, C y D). El S4 e5 un precursor de B y C y S, es precursor únicamente de D; de este modo, las secuencias:

constituyen sucesiones de reacciones lineales de las que puede esperarse sean inhibidas por sus productos finales. De nuevo, la biosintesis d e nucleotido (capitulo 36) proporciona ejemplos especificas.

Circuitos múltiples de retroalimentación regulan vías biosintéticas ramificadas Múltiples asas de retroalimentación (figura 3 1 4) proporcionan control fino adicional. Por ejemplo, si B se encuentra en exceso, disminuye el requerimiento de S.La capacidad de B para disminuir la producción de S2 confiere asi una ventaja biolbgíca. Sin embargo, si el exceso de B puede inhibir no 5610 la porción de la vía particular de su propia síntesis, sino tambitn porciones comunes a la de la síntesis de A, C o D, un exceso de B deberá reducir la síntesis de los cuatro productos finales. Claramente esto es indeseable. Sin embargo, existen mecanismos para evitar esta dificultad. En la inhibicidn por retroalimentación acumulativa, el efecto inhibidor de dos o mhs productos finales sobre una sola enzima reguladora es estrictamente aditivo.

* Uno favorecido fuertemente (en terminos termodinamicos) en una sola dirección, esto es, uno con un gran AG negativo

(Capítulo 11)

Flgura 11-5. Sitios de inhibicibn por cetroalimentaubn en una via biosintética ramificada. SI o S5 son intermediariosen la biosintesis de los prcdudos finales R a D, las flechas rectas representan las entimas que catalizan las conversiones indicadas. Las flechas curvas representan asas de relroalimentacibn e ~ndicanlos sitios probables de inhibicibn por retroalimentación medlante productos finales esnecificos.

En la inhibici6n por retroalimentaciónconcertada o multivalente, la inhibicibn completa se produce sólo cuando dos o más productos finales están presentes en exceso. En la inhibición por retroalimentación cooperativa, un solo producto final presente en exceso inhibe la enzirna regladora, pero la inhibición que se observa cuando se encuentran dos o m& productos finales excede, con mucho, a los efectos aditivos que se ven en la inhibición por retroalimentación acumulativa.

del ingles, cyfidine triphosphate}. Después del tratamiento con compuestos mercuriales, la aspartato transcarbamilasa pierde su sensibilidad a la inhibicion por el CTP,pero retiene su actividad completa para la slntesis del carbamilaspartato. Esto sugiere que el CTP esta unido a un sitio (alostérico) diferente del de cada sustrato. La ATCasa consiste en múltiples protómeros cataliticos y reguladores. Cada protómero catalitico contiene cuatro sitios aspartato (sustrato) y cadaprotbmero regulador por lo menos dos sitios CTP (reguladores}.

Los sitios catalíticos y alostéricos muestran diferencia espacial Monod observ6 la falta de semejanza estructural entre el inhibidor por retroalimentacibn y el sustrato para la enzima cuy a actividad regula. Dado que los efectos no son kocstéricos con un sustrato, sino alostéricos (ocupan otro espacio), este investigador propuso que las enzimas cuya actividad es regulada por efectores aIost&ricos(por ejemplo, los inhibidores por retroalimentacidn) fijan el efector en un sitio alostérica físicamente distinto del sitio catalítico. Las enzimas alostdricas son, pues, enzirnas cuya actividad en el sitio catalítico puede ser regulada por la presencia de efectores en un sitio atostérico. Varias pruebas apoyan

La enzima alosterica más estudiada es la aspartato transcarbamilasa La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la primera reaccibn peculiar a Ea biosintesis de las pirimidinas (figura 1 1-7). La ATCasa es inhibida por retroacción mediante el trifosfato de citidina (CTP, Carbami'-

fosfato

+

L-Aspartato

O

- o-C, II HzN

CHP I H

I

Figura ll4. lnhibicibn milltiple por retroalimentacidn por una via ramificada biocint&titica. Sobrepuestas a las asas de retroalimentaciónsimple (flechas curvas de guiones) estfin las asas de retroalimentacidnmúltiples (flechas curvas eontinuas) que regulan las enzirnas comunes a la biosíntesis de varios productos finales

4

o

'

c\

C

H

COO -

Figura 11-7. Reacción de la aspartato transcarbamilasa (ATCa sa) .

Emimus: regulación de actividades

127

la existencia de sitios alosttricos fisicamente distintos en las enzimas reguladas; entre ellas está la siguiente:

1 ) LE. eenzirnas reguladas, modificadas portkcnicac químicas o fisicas apropiadas, frecuentemente se vuelven insensibles a sus efectores alostkricos sin alteración de su actividad catalítica. La desnaturalización selectiva de los sitios alostéricos ha sido lograda mediante tratamiento con derivados del mercurio, con urea, rayos0X, enzima proteoliticas, fuerza ilinica o pH exmmos. envejecimientode O a 5 "C opor congelación o calentamiento. 2) Lo efectos alostéricos frecuentemente protegen el sitio catalitico de la desnaturalización en condiciones en las cuales los propios sustratos no lo hacen. Dado que parece inverosfmíl que un efector unido al sitio catalitico proteja cuando no lo hacen los sustratos, esto sugiere un segundo sitio alostérico en cualquier otra parte de la molkcula enzirnAtica. 3) En ciertas células mutantes, bacterianas y de mamíferos, las propiedades para ia regulacion de las enzimas reguladoras tienen modificadas sus propiedades para la regulacidn, pero sus propiedades catalíticas son idénticas a las del tipo nativo de donde deriv6 la mutante. Así, la estructura de Ios sitios alost&ricosy catalitica son geneticamente distintos. 4) Los estudios sobre uni6n de sustratos y de efectos alost&ricosa las enzima5 reguladas muestran que cada uno se puede unir independientemente del otro. S) En ciertos casos (por ejemplo, ATCasa), el sitio alostkrico se halla colocado en un protómero diferente al que posee el sitie catalitico.

Las enzírnas alostericas por lo general muestran una cinética sigmoidea de saturación con sustrato En la figura 1 1-8 se muestra la velocidad de reaccibn catalizada por una tipica enzima alosttrica medida a varias concentracianes del sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor alostdrico. Cuando este último falta, se observa una cindtica de saturacidn hioerbólica normal. En su presencia. la curva de sahraciiin por sustrato es dis&rsionada de una hipdrbola a una curva sigmeidea, que a concentraciones altas de sustrato puede coincidir con su forma hiperbdlica. Nótese la analogía de la relacion con las curvas de saturación de 0 2 de la rnioglobina y la hemoglobina (capitulo 7). El anhlisis cinktico de la inhibicibn por remalimentaci6n parece ser competitivo, no competitivo, pmcialmente competitivo de otros tipos. Si aconcentraciones

Figura 11-8. Curva sigmoide de saturación para el sustrato en presencia de un inhibidor alostérico.

elevadas de S, hay actividad comparable en presencia o ausencia del inhibidor aIostkrico, la cindtica superficialmente se parece a la de una inhibicibn competitiva. Sin embargo, dado que la curva de saturacibn por el sustrato es sigmoide y no hiperbólica, no es posible obtener resultados significativos graficando los datos para la inhibicibn alostérica por la tkcnica del doble recíproco. Este método de análisis fue elaborado para la inhibicibn competitiva con el suskato en el sitio catalítico. Puesto que los inhibidores alost&ricosactúan en un sitio diferente (alóstérico), el modelo cinético ya no es válido. El carácter sigmoide de la curva de v respecto a [S] en presencia de un inhibidor alostérico, refleja el fenómeno de cooperatividad. A bajas concentraciones de sustrato, la actividad en presencia del inhibidor es baja con relacibn a la que se observa en su ausencia. Sin embargo, cuando [S] aumenta, el grado de inhibición se vuelve m e w s intenso. Estas cinéticas son congruentes con la presencia de dos o más sitios de uni6n de sustrato que actuan reciprocamente, donde la presencia de una molécula de sustrato en un sitio catalitico facilita la unión de una segunda molkcula del mismo en un segundo sitio. La cooperatividad de la fijacibn del sustrato se describid en los capitulos 7 y 9: la curva sigmoide de saturación de Oz se forma a consecuencia de las interacciones cooperativas entre cuatro sitios de fljacj6n de oxígeno que se localizan en los diferentes protbmeros de hemoglobina y en el uso de la escala de Hill para cuantificar la cooperatividad.

(Capítulo I 1)

Los efectos alostéricos pueden ser en Kmo sobre,,Y , La referencia a fa cinktica de la inhibición como "competitiva'k ''no competitiva" respecto al sustrato lleva implicaciones mecanicistas que son desorientadoras. Es preferible referirse a dos amplias clases de enzimas reguladas, las de la serie K y las de la serie V. Para !as mzimas alostkricas de la serie K, la cinética de saturacibn por sustrato es competitiva en el sentido de que Kmse eleva sin efecto alguno sobre Vmk.Para las enzimas de la serie V el inhibidor alostdrico abate V , sin afectar la Km aparente. Probablemente las alteraciones en Kmo en V , resultan de cambios conformacionaies en el sitio catalitico, inducidos por Ia fijacion del efector alostérico en el sitio alostérico. Para una enzima alostérica de la serie K, este cambio en la conformación puede debilitar los enlaces entre el suctrato y los residuos que se fijan a &l.Para una de la serie V, es posible que el efecto primario sea alterar la orientacion o la carga de los residuos cataliticos, de modo que V,,, disminuya. Sin embargo, se pueden observar efectos intermedios sobre Kmy Y ,, consecutivos a estos cambios en la confomacibn.

LA REGULACIÓN POR RETROALIMENTACI~N,NO ES SINÓNIMO DE INHIBICIÓN POR WETROALIMENTACIÓN En ambas clases de ctlulas, de mamíferos y bacterianas, los productos finales retroalimensan y controlan su propia síntesis. En muchos casos, esto involucra la inhibicibn por retroalimentacibn de una enzima biosintCtica inicial. Sin embargo, se debe distinguir entre regulacibn por retroalimentaci6n, un termino fenomenol~gicoexento de implicaciones mecanísticas, e inhibición por retroalimentación, un mecanismo para fa regulación de numerosas enzimas bacterianas y de mamíferos. Por ejemplo, el colesterol de la dieta restringe la sintesis de1 procedente de acetatos en los tejidos de los mamíferas. No obstante, esta regulación al parecer no hace intervenir a la inhibicibn por retroalimentacidn de una enzima inicial de la biosintesis del ~olesterol.Una enzima inicial (HMG-COA reductasa) es afectada, pero el mecanismo comprende la interrupción de la expresibn de los genes que codifican para la formacibn de la HMG-Coh reductasa mediante el colesterol o un metabolito derivado de él. El colesterol agregado directamente a la HMG-COA reductasa no tiene efecto sobre su actividad catalitica.

La fijación cooperativa de un sustrato confiere una ventaja fisiológica Las ventajas de la cinCtica de fijación cooperativa de3 sustrato son anklogas a aquetlas que se producen por la fijación cooperativa del O? a Ia hemoglobina. h concentraciones bajas de sustrato, el efector alostérico es un inhibidor eficaz. De este modo, la regulación es más eficiente en el momento en que la necesidad es máxima, es decir, cuando la concentración intracelular de los sustratos es baja. Si se comienza a disponer de más sustrato, entonces es menos necesaria una regulación rigurosa. Cuando la concentración del sustrato se eleva, el grado de inhibicion disminuye y se formauna cantidad mayor de producto. Al igual que con la hemoglobina, la curva sigrnoide de saturacion del sustrato en presencia del inhibidor también asegura que cambios relativamente pequefíos en la concentraci6n del sustrato ocasionan grandes modificaciones en la actividad. Asl, se logra un control sensible de la actividad catalitica mediante cambios pequefios en la concentración del sustrato. Finalmente, por analogla con las diferencias en l a curvas de saturacion de 01 de hemoglobinas de diferentes especies, las enzimas reguladoras de orígenes distintos pueden tener curvas sigmoideas de saturacibn desplazadas a la izquierda o a la derecha para acomodarse a los llmites de las concentraciones de sustrato que prevalecen in vivo.

LA MODIFICACIÓMCOVALENTE REVERSIBLE REGULA ENZIMAS ESENCIALES DE MAM~FEROS La modulacibn reversible de laactividad catalitica de las enzimas puede producirse por la adherencia covalente de un grupo fosfato a uno o mhs residuos Ser, Tri, Tir o His. Las enzimas que experimentan modificacibn covalente con regulacilin concomitante de su actividad se denominan "enzimas interconvertibles". Las enzirnas interconvertibles existen en dos condiciones de actividad, una de eficacia catalítica elevada y otra de baja eficacia. Dependiendo de la enzima de que se trate, el catalizador más activo puede ser la fosfoenzima o la que no posee grupo fosfato (cuadro 1 1-1).

Las enzirnac pueden tener numerosos sitios de fosforilación Un residuo seril especifico es fosforilado, formando el O-fosfoseril o un residuo tirosil es fosforilado para formar el residuo O-fosfotirosil. Aunque una enzima interconvertible puede contener muchos residuos Ser o Tir, la fosforilación es sumamente selectiva y se produce s61o en un pequefio nUmero de sitios posibles. Probablemente estos sitios no f m e n parte del sitlo

E m i m m : reqialacihn de actividades

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Cuadro 1 1-1. Ejemplos de enzimas dc mamíferos cuya actividad catalítica está alterar'acihn-de!

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