Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos [1 ed.] 8400095685, 9788400095680

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ÚLTIMOS TÍTULOS PUBLICADOS 21 International Studbook Gazella Dama Mhorr. Andrés Barbosa y Gerardo Espeso.

23 Las lecciones de la catástrofe del Prestige. Antonio Figueras, Emilio Lora-Tamayo D´Ocón, Joaquín Tintoré, Fiz F. Pérez, J. Albaigés, Francisco Sánchez, M. Anxo Murado García, Emilio Esteban Rodríguez Merino y Ramón Hernán Paadín. 24 Depuración de aguas residuales: modelización de procesos de lodos activos. Manuel Gil Rodríguez. 25 New acoustics. Selected topisc II. Francisco Montero de Espinosa Freijo, Carlos Ranz-Guerra y Jaime Pfretzschner (eds.). 26 Biología y cultivo del mejillón (Mytilus Galloprovincialis) en Galicia. Antonio Figueras Huerta. 27 Prácticas de tratamiento estadístico de datos con el programa SPSS para Windows. Aplicaciones en el Área de Ciencia y Tecnología de Alimentos. Pedro J. Martín Álvarez. 28 Ecología acuática y sociedad de las Lagunas de Ruidera – Aquatic ecology and society of Ruidera Lakes (Central Spain). Miguel Álvarez Cobelas, Santos Cirujano Bracamonte, Esperanza Montero González, Carmen Rojo García Morato, María Antonia Rodrigo Alacreu, Elisa Piña Ochoa, Juan Carlos Rodríguez Murillo, Óscar Soriano Hernando, Marina Aboal Sanjurjo, José Pedro Marín Murcia y Rafael Araujo Armero. 29 El protocolo de Kyoto y su impacto en las empresas españolas. Félix Hernández Álvarez y Pablo del Río González.

Ante la creciente evidencia de que la ingesta de compuestos bioactivos —también denominados ingredientes funcionales o nutracéuticos— puede reducir el riesgo de enfermar e incluso ser parte de la cura de diversas afecciones, su demanda mundial se ha incrementado. Existe, en consecuencia, un gran interés en la preparación y modificación de compuestos bioactivos mediante tecnologías compatibles con la industria alimentaria. En este contexto, la tecnología enzimática aporta la ventaja de que funciona en condiciones suaves, evita la formación de productos secundarios y está ampliamente aceptada en las legislaciones correspondientes como coadyuvantes de procesos. En este libro se presentan varios ejemplos de cómo se aplica la biotecnología enzimática a la obtención sostenible de ingredientes funcionales, o a su modificación para mejorar su biodisponibilidad, solubilidad, etc. Como parte de la sostenibilidad, se plantea el aprovechamiento de recursos naturales iberoamericanos poco explotados y especialmente de sus residuos. Igualmente se ilustra la producción y estabilización de enzimas útiles para este fin. Los trabajos recopilados en este libro proceden de reconocidos investigadores iberoamericanos, miembros de la Red ENZNUT, del Programa Iberoamericano del Ciencia y Tecnología (CYTED).

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

22 Landscapes as cultural heritage in the European research, Proceedings of the Open Workshop Madrid, 29 th October 2004. María Ruiz del Árbol y Almudena Orejas (eds.).

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30 Corrosión en las estructuras de hormigón armado: fundamentos, medida, diagnosis y prevención. José Antonio González Fernández y Juana Miranda Vidales. 31 Histofisiología de moluscos bivalvos marinos. Eduardo Cargnin-Ferreira y Carmen Sarasquete Reiriz.

Francisco José Plou Gasca Georgina Coral Sandoval Fabián

32 Estudio de los suelos del Campo de Calatrava (Ciudad Real) y sus condiciones de fertilidad. José Luis de la Horra Ruiz, Francisco Sarrano Comino y Juan José Calevaris Muñiz. 33 Estudios etnobotánicos en Campoo (Cantabria). Conocimiento y uso tradicional de plantas. Manuel Pardo de Santayana. 34 Comunicación y ciencia médica. Investigar con animales para curar a personas. Enrique Sueiro. 35 Plantas y sabiduría popular del Parque Natural de Montesinho. Un estudio etnobotánico en Portugal. Ana Maria Carvalho. 36 Microtecnología: diario de un proceso. Fabricación de un microacelerómetro. María Cruz Acero, Jaume Esteve, José Antonio Plaza y Emilio Lora-Tamayo. 37 Protagonistas de la química en España: los orígenes de la catálisis. Pedro Bosch Giral, Juan Francisco García de la Banda, Joaquín Pérez Pariente y Manoel Toural Quiroga.

Francisco José Plou Gasca Georgina Coral Sandoval Fabián

ISBN 978-84-00-09568-0

38 Spectroscopy of the Atmospheres. Rafael Escribano e Isabel Tanarro (eds.). 39 Técnicas de análisis y caracterización de materiales (2.ª ed.). Marisol Faraldos y Consuelo Goberna.

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788400 095680

CSIC

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

Francisco José Plou Gasca es investigador científico del CSIC y profesor honorario de la Universidad Autónoma de Madrid. Estudió Ciencias Químicas en la Universidad de Zaragoza y realizó la tesis doctoral en el Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del CSIC bajo la dirección del doctor Antonio Ballesteros. Es especialista en biotransformaciones catalizadas por enzimas inmovilizadas, con aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica y de biocombustibles. Ha realizado diversas estancias en la Universidad de Londres. Es profesor del Máster de Biotecnología de la UAM y vocal de la Junta de la Sociedad Española de Catálisis. Ha participado en un trabajo galardonado con el Premio Europeo de Tecnología Enzimática A-IQS y en una patente que obtuvo el Primer Premio Madri+d 2008 a las mejores patentes. Una de sus publicaciones [con A. Kunamneni, A. Ballesteros y M. Alcalde, «Laccases and their applications: a patent review». Recent Patents on Biotechnology, 2, 10-24 (2008)] recibió en 2012 el premio al artículo más descargado del repositorio institucional Digital CSIC. Georgina Coral Sandoval Fabián es investigadora titular en la Unidad de Biotecnología Industrial del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), perteneciente al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, México). Obtuvo su doctorado en Biología, Salud y Biotecnología lo en el Instituto Nacional de Ciencias Aplicadas de Toulouse, Francia, en 2002. Desde entonces ha trabajado en el CIATEJ, abriendo una nueva línea de investigación en biocatálisis industrial, orientada a los campos de nutracéuticos, biocombustibles y nanomateriales, entre otros. En lo que respecta a aplicaciones en alimentos, sus líneas de investigación se centran en la utilización de enzimas para obtener ingredientes funcionales como lípidos bioactivos, antioxidantes y prebióticos. Coordinó la Red ENZNUT del Programa Iberoamericano del Ciencia y Tecnología (CYTED), entre cuyos grupos participantes se encontraba el Laboratorio de Biocatálisis Aplicada del ICP-CSIC, con el que se ha editado este libro.

Obtención enzimática de cOmpuestOs biOactivOs a partir de recursOs naturales iberOamericanOs

BIBLIOTECA DE CIENCIAS, 40

Francisco José Plou Gasca y GeorGina coral sandoval Fabián

Obtención enzimática de cOmpuestOs biOactivOs a partir de recursOs naturales iberOamericanOs

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS MADRID, 2012

Reservados todos los derechos por la legislación en materia de Propiedad Intelectual. Ni la totalidad ni parte de este libro, incluido el diseño de la cubierta, puede reproducirse, almacenarse o transmitirse en manera alguna por medio ya sea electrónico, químico, óptico, informático, de grabación o de fotocopia, sin permiso previo por escrito de la editorial. Las noticias, los asertos y las opiniones contenidos en esta obra son la exclusiva responsabilidad del autor o autores. La editorial, por su parte, solo se hace responsable del interés científico de sus publicaciones.

Primera edición: 2002 Segunda edición rev. y aum.: 2011

Catálogo general de publicaciones oficiales: http://publicacionesoficiales.boe.es/

© CSIC © Xavier Calvó-Monreal ISBN: 978-84-00-09568-0 e-ISBN: 978-84-00-09569-7 NIPO: 723-12-144-7 e-NIPO: 723-12-145-2 Depósito Legal: M-34386-2012 Maquetación, impresión y encuadernación: DiScript Preimpresión, S. L. Impreso en España. Printed in Spain En esta edición se ha utilizado papel ecológico sometido a un proceso de blanqueado TCF, cuya fibra procede de bosques gestionados de forma sostenible.

ÍNDICE

I.

PREfACIO ................................................................................................... 11 Referencias ................................................................................................... 13

1. ESPECIES IBEROAMERICANAS CON POTENCIAL NuTRACéuTICO .. 1.1. Introducción ......................................................................................... 1.2. Maíz ..................................................................................................... 1.3. uva....................................................................................................... 1.4. Aceituna ............................................................................................... 1.5. Tubérculos y Raíces ............................................................................. 1.6. Aguacate .............................................................................................. 1.7. Nopal y Tuna ....................................................................................... 1.8. Papaya ................................................................................................. 1.9. Agave ................................................................................................... 1.10. Garambullo y Pitaya ............................................................................ 1.11. Pasifloráceas ........................................................................................ 1.12. Capsicum ............................................................................................. 1.13. Conclusiones........................................................................................ Referencias ...................................................................................................

15 15 18 23 27 32 40 43 47 49 54 59 62 67 68

2. APROVECHAMIENTO DE RESIDuOS AGROINDuSTRIALES: COMPOSICIÓN, MODIfICACIÓN ENZIMÁTICA Y EVALuACIÓN DE SuS POTENCIALES APLICACIONES ................................................ 77 2.1. El Jitomate: producción, uso y manejo de desechos ........................... 78 2.2. El bagazo de caña: obtención y aplicaciones....................................... 86 2.3. Conclusiones y perspectivas ................................................................ 100 Referencias ................................................................................................... 101 3. OBTENCIÓN DE POLÍMEROS fuNCIONALES A PARTIR DE DESECHOS AGROINDuSTRIALES uSANDO ENZIMAS OXIDATIVAS ............................................................................................... 109 3.1. Los polímeros y su clasificación.......................................................... 109 3.2. Biopolímeros: almidón, celulosa, quitina/quitosano y lignina ............ 111 3.3. Desechos agroindustriales importantes para la síntesis de biopolímeros ........................................................................................ 115

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Índice

3.4. Enzimas oxidativas: peroxidasas y lacasas.......................................... 118 3.5. Polimerización de fenoles: mono y polifenoles provenientes de desechos agroindustriales ............................................................... 122 3.6. Modificación de polímeros naturales utilizando peroxidasas y lacasas ............................................................................................... 126 3.7. Aplicaciones y perspectivas................................................................. 129 Agradecimientos............................................................................................ 130 Referencias ................................................................................................... 130 4. PRODuCCIÓN DE SuCEDÁNEOS DE GRASA DE LECHE HuMANA CATALIZADOS POR LIPASAS .................................................................. 137 4.1. Introducción ......................................................................................... 137 4.2. Biocatálisis aplicada a la síntesis de sucedáneos de grasa de leche humana................................................................................................. 140 4.3. Trabajos realizados en el ámbito de la Red ENZNuT ........................ 144 Referencias ................................................................................................... 148 5. MODIfICACIÓN DE ANTIOXIDANTES fENÓLICOS MEDIANTE PROCESOS ENZIMÁTICOS....................................................................... 151 5.1. Antioxidantes fenólicos ....................................................................... 151 5.2. Modificación de antioxidantes fenólicos: ventajas del empleo de enzimas ................................................................................................ 153 5.3. Resveratrol: propiedades y modificación de su estructura .................. 154 Agradecimientos............................................................................................ 163 Referencias ................................................................................................... 163 6. OBTENCIÓN ENZIMÁTICA DE fRuCTANOS PREBIÓTICOS TIPO INuLINA............................................................................................. 167 6.1. Microbiota intestinal y prebióticos ...................................................... 167 6.2. fructanos tipo inulina. Oligofructosa y fructooligosacáridos. ............ 170 6.3. Obtención de oligofructosa mediante hidrólisis de inulina ................. 171 6.4. Obtención de fructooligosacáridos a partir de sacarosa ...................... 173 6.5. Inmovilización de enzimas para la obtención de fructanos tipo inulina ... 177 6.6. Conclusiones........................................................................................ 184 Agradecimientos............................................................................................ 184 Referencias ................................................................................................... 185 7. VALORACIÓN DEL SuERO DE QuESERÍA MEDIANTE BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA .................................................................. 191 7.1. El suero de quesería como materia prima para su valoración ............. 191 7.2. Alternativas tecnológicas para la valoración del suero de quesería y sus derivados..................................................................................... 193 7.3. Valoración del suero de quesería mediante biocatálisis enzimática ...... 198 7.4. Conclusiones ......................................................................................... 213 Referencias ................................................................................................... 214

Índice

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8. fACTORÍAS CELuLARES DE PRODuCCIÓN DE PRODuCTOS RECOMBINANTES ..................................................................................... 231 8.1. Introducción ......................................................................................... 231 8.2. Pichia pastoris como ejemplo de factoría celular ............................... 236 8.3. Optimización global del proceso de producción de proteínas heterólogas en Pichia pastoris............................................................. 249 Agradecimientos............................................................................................ 251 Referencias ................................................................................................... 251 9. APLICACIONES DE LIPASAS EN LA SÍNTESIS Y MODIfICACIÓN DE COMPuESTOS BIOACTIVOS ............................................................. 259 9.1. Introducción ......................................................................................... 259 9.2. Síntesis de sitostanol ferulato .............................................................. 264 9.3. Modificación del ácido cafeico mediante acilación enzimática: Síntesis del fenetil éster del ácido cafeico (fEAC) ............................. 266 9.4. Conclusiones y perspectivas ................................................................ 267 Agradecimientos............................................................................................ 268 Referencias ................................................................................................... 268 10. OPTIMIZACIÓN Y RACIONALIZACIÓN IN SILICO DE LA SÍNTESIS DE BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS PARA LA OBTENCIÓN DE PREBIÓTICOS......................................................... 273 10.1. Introducción ......................................................................................... 273 10.2. Materiales y Métodos .......................................................................... 275 10.3. Resultados y Discusión........................................................................ 276 Agradecimientos............................................................................................ 290 Referencias ................................................................................................... 291 11. HIPERACTIVACIÓN DE BIOCATALIZADORES DE LIPASAS ............. 293 11.1. Introducción ......................................................................................... 293 11.2. Hiperactivación de lipasas a través de su inmovilización sobre soportes hidrofóbicos .......................................................................... 296 11.3. Hiperactivación de lipasas solubles e inmovilizadas a través de la adición de detergentes.................................................................................. 297 11.4. Hiperactivación de lipasas inmovilizadas mediante modificación química dirigida con polímeros diseñados a medida ........................... 297 Referencias ................................................................................................... 298 12. LIPASAS CON APLICACIONES NOVEDOSAS: ¿ES POSIBLE PRODuCIRLAS POR fERMENTACIÓN SÓLIDA EMPLEANDO RACIONALMENTE RESIDuOS AGROINDuSTRIALES? ..................... 301 12.1. Introducción ......................................................................................... 301 12.2. Lipasas ................................................................................................. 302 12.3. Aspectos generales de la fermentación en medio sólido ..................... 306

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Índice

12.4. Empleo de residuos agroindustriales para la producción de lipasas por fMS ................................................................................... 313 12.5. Conclusiones........................................................................................ 316 Referencias ................................................................................................... 317 13. ESTRATEGIAS ENZIMÁTICAS EN SÍNTESIS DE COMPuESTOS BIOACTIVOS Y BIOMATERIALES .......................................................... 323 13.1. Introducción ......................................................................................... 323 13.2. Síntesis enzimática de compuestos bioactivos .................................... 324 13.3. Síntesis enzimática de biomateriales poliméricos ............................... 328 13.4. Conclusión .......................................................................................... 331 Referencias ................................................................................................... 331

i. prefaciO La definición consensuada para compuesto bioactivo indica que se trata de sustancias presentes en la naturaleza que han demostrado tener algún efecto en la salud humana, que va más allá de la simple nutrición (Biesalski y cols., 2009). En ocasiones se usa también el término «nutracéutico» como sinónimo. En general, los nutrientes esenciales como vitaminas y minerales no están incluidos en el término «compuesto bioactivo» (Bernhoft, 2010). Cada vez existe más evidencia de que la ingesta de compuestos bioactivos puede reducir el riesgo de enfermar e incluso ser parte de la cura de diversas afecciones como cáncer, enfermedades cardiovasculares y osteoporosis, así como retrasar algunos efectos del envejecimiento (Denny y Buttriss, 2007). Actualmente se está tratando de correlacionar la eficacia de los compuestos bioactivos con su biodisponibilidad, la dosis y los polimorfismos genéticos individuales (Biesalski y cols., 2009). La promesa de una mejor salud y mayor belleza ha aumentado la demanda de compuestos bioactivos, ya sea en su forma natural, o modificados para poder formularse en diversos alimentos o cosméticos. Se prevé que mercado mundial de nutracéuticos alcance uS$ 243.000 millones en 2015, siendo el sector de «alimentos funcionales» el de mayor crecimiento (GIA, 2010). Existe entonces un gran interés en la síntesis y modificación de compuestos bioactivos mediante tecnologías compatibles con la industria alimentaria. En este contexto, la tecnología enzimática presenta diversas ventajas, como el hecho de funcionar en condiciones suaves, evitar productos secundarios (facilitando la purificación) y ser ampliamente aceptada en las legislaciones correspondientes como adyuvantes de procesos. Es así que los compuestos naturales tratados con enzimas siguen conservando la etiqueta o apelación «de origen natural». En este libro se presentan varios ejemplos de esta biotecnología enzimática encaminada a la obtención de compuestos bioactivos de manera ecológica y sostenible, y con características mejoradas para su adecuada formulación (mayor biodisponibilidad, solubilidad, etc.). En dichos casos, cuando los compuestos bioactivos forman parte de productos formulados se les llama también «ingredientes funcionales». Como parte de la sostenibilidad, se plantea el aprovechamiento de recursos naturales poco explotados en Iberoamérica y especialmente de residuos o procedentes de la industrialización de esos cultivos. un listado de cultivos relevantes en Iberoamérica y sus contenidos de nutrientes se presenta en el capítulo 1; mientras que los capítulos 2, 3, 7 y 9 plantean opciones de aprovechamiento residuos, usando alguna biotransformación enzimática.

Prefacio

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En vista de la gran diversidad existente de compuestos bioactivos, una clasificación química (Tabla I.1) es preferida a la clasificación farmacológica o taxonómica debido a que una misma especie o un mismo grupo químico puede tener diferentes efectos biológicos. En los capítulos 4, 5, 6 y 13 se muestran brillantes ejemplos de obtención de algunos de esos compuestos bioactivos usando enzimas. Dado que las enzimas son los biocatalizadores que permiten la obtención ecológica de ingredientes funcionales, en los capítulos 8 y 12 se ilustra la producción de enzimas por dos diferentes sistemas (expresión heteróloga y fermentación sólida), mientras que en los capítulos 10 y 11 se muestran estrategias para estabilizar los biocatalizadores, requisito indispensable para su aplicación industrial. tabla i.1. clasificación química de lOs cOmpuestOs biOactivOs (bernhOft, 2010; hartmann y meisel, 2007) GrupOs/subgrupos GLICÓSIDOS Y OLIGOSACÁRIDOS1 Glicósidos cardiacos (esteroidales) Glicósidos cianogénicos (aminoácidos) Glucusinolatos (aminoácidos con azufre) Saponinas (triterpenoides pentacíclicos o esteroides tetracíclicos) Glicósidos de antraquinona

Inhibición de las bombas de Na+/K+-ATPasa utilización del yodo En el citocromo P450 Inmunomoduladores y antineoplásicos

Oligosacáridos TERPENOIDES Terpenoides de bajo peso molecular (Mono- y sesqui-terpenoides) Diterpenoides (4 isoprenos, C20) Resinas (mezclas de terpenoides) fENILPROPANOIDES Ácidos hidroxicinámicos y derivados

Antibacteriales, antivirales, anticancerígenos, estimulación gástrica Antineoplásicos Antimicrobianos, cicatrización

Aldehídos cinámicos y monolignoles Cumarinas Flavonoides y proantocianidinas (oligómeros de flavonoides) Taninos (polímeros de flavonoides) Lignanos ESTEROIDES

efectos biológicos

Inducción de la peristalsis y de la secreción de agua y electrolitos en el colon. Prebiótico, inmunomodulador

Antioxidantes, antivirales, fungicidas, anticancerígenos, inmunomoduladores, antiinflamatorios, dermatológicos, sistema cardio- y cererebro-vascular Antioxidantes, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos suaves Dermatológicos, antidepresivos, inhibidores del apetito Antioxidantes, antiinflamatorios, anticancerígenos, estrogénicos Astringentes Estrogénicos, antineoplásicos, catárticos Hipocolesterolémicos, anticancerígenos, antioxidantes, hipoglicemiantes, estimulación hormonal

Prefacio GrupOs/subgrupos ALCALOIDES Alcaloides tropano Alcaloides isoquinolina Alcaloides metilxantina Pseudoalcaloides PROTEÍNAS Y PéPTIDOS GRASAS Y ÁCIDOS GRASOS

13 efectos biológicos Anticolinérgicos, analgésicos Analgésicos, anticancerígenos, antibacteriales, inmunoestimulantes Efectos neurológicos y en los receptores de adenosina Efectos en el sistema nervioso central y en el transporte de iones Antihipertensivos, sedantes, antimicrobianos, inmunomoduladores, antitrombóticos, antioxidantes, hipocolesterolémicos Antiinflamatorios, neuroprotectores

Glicona: sacáridos (mono- u oligo-sacáridos) o ácido urónico. Aglicona: Indicada entre paréntesis en los subgrupos.

Todos los trabajos recopilados en este libro, proceden de los miembros de la red «ENZNuT» (http://www.enznut.org) del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED). El programa CYTED tiene como uno de sus objetivos fortalecer el desarrollo tecnológico en Iberoamérica mediante la transferencia de conocimientos y técnicas, el intercambio de científicos y tecnólogos y la promoción de la participación del sector empresarial. También es vocación del programa CYTED servir de puente para la cooperación entre la unión Europea y América Latina en materia de Ciencia y Tecnología. Como parte del programa CYTED, la red ENZNUT ha cumplido fielmente estos objetivos, agrupando a 70 investigadores de 10 países iberoamericanos y logrando hacer sinergia entre los miembros de la red para lograr resultados relevantes tanto en el campo de la Biocatálisis como en el del aprovechamiento de recursos iberoamericanos. Agradecemos en consecuencia al programa CYTED por la financiación de la red durante cuatro años (2008 al 2011) y por supuesto la inestimable colaboración de los miembros de la red ENZNuT en la elaboración de este libro, que esperamos sirva para contribuir al aprovechamiento sostenible de los recursos de nuestra región iberoamericana e incentivar el uso de la biotecnología enzimática en el floreciente campo de los compuestos bioactivos y nutracéuticos. francisco José Plou Gasca Georgina Coral Sandoval fabián

referencias 1. bernhoFt, A. «A brief review on bioactive compounds in plants», en A. Bernhoft (ed.) Bioactive compounds in plants –benefits and risks for man and animals, Oslo, The Norwegian Academy of Science and Letters, (2010), pp. 11-17.

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Prefacio

2. biesalski, h.-k., draGsted, l. o., elmadFa, I. y cols. «Bioactive compounds: Definition and assessment of activity», Nutrition, 25 (2009), pp. 1202-1205. 3. denny, a., buttriss, J. Synthesis Report No. 4 - Plant Foods and Health: Focus on Plant Bioactives. Norwich, Norfolk, Reino unido (2007). 4. GIA. Nutraceuticals: A global strategic business report. San Jose, California, EE.uu., Global Industry Analysts, Inc. (2010). 5. hartmann, r., meisel, h. «food-derived peptides with biological activity: from research to food applications», Current Opinion in Biotechnology, 18 (2007), pp. 163-169.

1. especies iberOamericanas cOn pOtencial nutracéuticO amalia antezana universidad Mayor de San Simón Cochabamba, Bolivia Javier arrizón socorro villanueva Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), México

1.1. intrOducción Iberoamérica es una vasta región, rica en especies vegetales, muchas de ellas con propiedades benéficas para la salud. ¿Quién no se ha deleitado con una pizza cubierta de su típica salsa de jitomate, o quién no ha disfrutado unas tapas, donde una rebanada de jitomate aderezada con ajo y aceite de oliva hace un delicioso bocadillo? El jitomate tiene como cuna a México. Otra especie mundialmente conocida, proveniente de México, es el chocolate, el rey de la confitería, al que, además, actualmente se le atribuyen propiedades antioxidantes y estimulantes del estado de ánimo. Así mismo, la papa, proveniente del Perú y Bolivia, representa un ingrediente indispensable en la cocina internacional, sin ella nadie podría disfrutar unas papas a la francesa. Por otro lado, el nopal, especie que crece en el desierto y semidesierto de toda América y en España y al que mucho tiempo se le consideró como un alimento para ganado o bien un alimento regional a veces poco valorado, hoy constituye una fuente de diferentes sustancias con propiedades benéficas para la salud (Stintizing y Carle, 2005), desde las hojas (Galati y cols., 2002; Galati y cols., 2003; Huang y cols., 2008), los frutos (Castellanos-Santiago y Yahia, 2008) y las flores. Amplia es la lista de especies vegetales que durante siglos han servido de alimento e incluso de medicina a los pueblos mesoamericanos. Así mismo, el conocimiento que las grandes culturas indígenas (Aztecas, Mayas, Incas, entre otros) poseían de las propiedades nutricionales y nutracéuticas de distintas especies vegetales, les permitieron ser una potencia en medicina natural. Buena parte de las moléculas activas de varios medicamentos que hoy en día se producen en el mundo, fueron desarrolladas teniendo como base un sinnúmero de moléculas naturales que se encuentran presentes en las diferentes especies vegetales alimenticias y medicinales que crecen en Iberoamérica. Existe una delgada línea entre el alimento y el medicamento; actualmente, los avances en diversas disciplinas tales como la nutrición, el análisis instrumental, la

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

biología molecular, entre otras, regresan y confluyen en una vieja idea: «el alimento es la medicina del cuerpo, somos lo que comemos». De ahí el auge que han adquirido los conceptos nutracéutico y alimento funcional. El interés por los alimentos funcionales, también llamados farma-alimentos, alimentos diseñados, alicamentos, productos nutracéuticos, productos fitoquímicos, etc. ha crecido considerablemente entre científicos y consumidores desde la década de los 90. En la mayoría de los países del mundo no existe una definición legalmente reconocida o aceptada, excepto por Japón que tiene un sistema regulatorio aprobado para los llamados FOSHU (Alimentos de uso específico para la salud). La necesidad de estos productos fue reconocida en Japón en la década de los 80, cuando estudios demográficos demostraron un aumento en los costos de los servicios de salud por una mayor incidencia de enfermedades crónico-degenerativas, así como por la necesidad de mantener una calidad de vida satisfactoria en personas de edad más avanzada (Mark-Herbert, 2004). En toda América Latina, la industrialización, la urbanización y la globalización de los mercados han tenido un impacto importante en los hábitos de alimentación de la población. América Latina e Iberoamérica no son la excepción y existen simultáneamente problemas de deficiencias y de excesos de nutrientes. Este fenómeno ha sido llamado «Transición Epidemiológica Nutricional», que trae como consecuencia obesidad y desnutrición en los diferentes estratos de la población aunados a enfermedades propiciadas por dichos trastornos. Los alimentos e ingredientes funcionales han atraído el interés tanto de la industria de alimentos como de la farmacéutica, las cuales han apoyado el desarrollo de investigaciones, así como la búsqueda y la comercialización de nuevos productos destinados a varios segmentos de la población. Estos grupos sociales reconocen la importancia de la alimentación y buscan tener una buena salud, no por medio de medicamentos, sino por medio de una alimentación saludable, modificada a las necesidades de la población. Se incluye en estos grupos a personas con alguna enfermedad diagnosticada, como por ejemplo enfermedad cardiovascular o colesterol elevado, o personas que intentan mantener una buena salud (intestinal, por ejemplo), o personas que buscan simplemente «una mejor calidad de vida» (Lajolo, 2002). Actualmente, muchas sociedades tienen graves problemas de salud y los gobiernos gastan cantidades elevadas en medicamentos. Diversas sociedades de consumo, en diferentes partes del mundo, tienen problemas de obesidad y enfermedades crónico degenerativas debidas, en buena parte, a la gran disponibilidad de alimentos preparados, casi listos para ingerirse, los cuales además, en ocasiones, están mal balanceados tanto en macro como en micronutrientes. Este hecho, aunado al sedentarismo de las sociedades modernas, ha contribuido en gran medida a este tipo de enfermedades. En contraposición, existen en el mundo grandes poblaciones, principalmente en los países en desarrollo, que carecen de la cantidad mínima indispensable de nutrientes para sobrevivir. Estos desequilibrios parecen llevar a la necesidad de generar alimentos sanos, equilibrados, completos, que aporten macro y micronutrientes que garanticen la salud a corto y medio plazo. Los avances en la caracterización de fuentes vegetales de alimento han ido revelando la abundancia de moléculas bioactivas que, ingeridas en

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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la dieta diaria, coadyuvan para mantener la salud y/o evitar algunas enfermedades, sobretodo, las enfermedades crónico-degenerativas. Todo lo anterior ha propiciado un aumento en la demanda mundial de alimentos clasificados como funcionales y de productos nutracéuticos. A nivel mundial las predicciones para el 2013 se muestran en las figuras 1.1 y 1.2.

Millones de Dólares

75.000

50.000

25.000

0

2006

2007 Suplementos

2008 Alimentos

2013 Bebidas

figura 1.1. Mercado Mundial de Nutraceuticos (BCC Research). 14

Miles de Millones de USD

12 10 8 6 4 2 0

Japón

USA

Europa

UK

Alemania

Francia

Italia

figura 1.2. Mercado Mundial de los Alimentos funcionales. Adaptada de Bech-Larsean y Scholderer, 2007.

A continuación se describirán algunas de las especies iberoamericanas involucradas frecuentemente en la alimentación de la población de esta región y de las que, además, diferentes estudios científicos han revelado un gran potencial nutracéutico, dada su composición.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

1.2. maíz 1.2.1. Origen y descripción general Sinonimias: Maíz, choclo, millo o elote familia: Gramíneas Género: Zea Nombre científico: Zea mays

figura 1.3. Maíz azul.

El género Zea comprende cinco especies que se sabe son originarias de México y Centroamérica. Entre ellas se encuentra el Zea mays L., que a su vez contiene cuatro subespecies: Zea mays L. ssp. Huehuetenangensis, distribuida en los Altos de Guatemala; Zea mays L. ssp. Mexicana; Zea mays L. ssp. Parviglumis, el teocintle; Zea mays L. ssp. Mays, a la que pertenece el maíz que se cultiva en México (figura 1.4). Las especies actuales de maíz existentes en el mundo son el resultado alrededor de 9.000 años de evolución con la colaboración de la domesticación por parte del hombre. Según las últimas evidencias arqueológicas, la domesticación del maíz data de 8.700 años antes de nuestra era, en la región de Iguala en el estado de Guerrero, concretamente en la localidad de Tlaxmalac. Aunque existen distintas hipótesis relativas al origen del maíz, una de las más actuales está basada en estudios recientes sobre la composición genética del maíz cultivado, que indican que el maíz actual proviene de una especie silvestre conocida como teocintle (Matsuoka y cols., 2002). Los teocintles son plantas rústicas y silvestres que aún se encuentran en varias localidades de México. Al parecer, la especie de teocintle más cercana al maíz actual es el Zea mays ssp parviglumis, que pertenece a la raza Balsas. Dentro de esta raza las poblaciones que más participaron en el

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origen del maíz fueron las ubicadas en los estados de Michoacán, México y Guerrero. Con frecuencia, debido a la poca información sobre su utilidad agrícola y ganadera, algunas especies de teocintle son consideradas como malas hierbas o maleza al grado de que, en determinados casos, algunas de estas especies están en peligro de extinción.

figura 1.4. filogenias de maíz y teocintle con sus antecesores ssp. huehuetenangensis basado en 99 microsatélites. La línea de puntos grises circunscribe el linaje monofilético del maíz. Los asteriscos corresponden a las poblaciones de la ssp. parviglumis base del maíz, todos los cuales son de la cuenca central del río Balsas. (a) Genealogía individual basada en 193 maíces y 71 teocintles. (b) Árbol basado en 95 grupos ecogeográficos definidos. Los números en las ramas indican el número de veces que un clado aparece después de 1,000 remuestreos de bootstrap. Solo se muestran los valores de bootstrap mayores a 900. La flecha indica la posición de los maíces oaxaqueños del altiplano que es basal para todos los otros maíces (Matsuoka y cols., 2002).

Los resultados de las técnicas de biología molecular (microsatélites), utilizadas por Matsuoka y cols. (2002), revelan que la distribución y diversificación del maíz se dio a través de dos linajes: por un lado, el linaje que se difundió desde las regiones altas de México (entre Jalisco y Oaxaca) hacia el oeste y norte de México y posteriormente hacia el este de Estados unidos y Canadá; el segundo linaje migró desde las regiones altas de México (entre Jalisco y Oaxaca) hacia las regiones bajas del oeste y sur de México llegando así a América del Sur y los Andes pasando por Centroamérica y el Caribe (figura 1.5). Entre los maíces más antiguos con rasgos propios de una especie cultivada se encuentran los localizados en Tehuacán, Puebla, que datan aproximadamente del año 3000 A.C. Algo similar ocurre con la evidencia procedente de Guilá Naquitz, Oaxaca, con una antigüedad de alrededor de 3500 A.C., la cual se ha considerado como una de las primeras

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muestras de domesticación; sin embargo, el análisis morfológico muestra que se trata de maíz aún en el proceso de domesticación. No obstante, aún no existe consenso entre los autores dedicados a esta investigación. En concreto, algunos autores discuten el origen Mexicano de algunas especies de maíces andinos. Así, Barroso señala que el maíz más antiguo se ha encontrado al Norte de Paraguay, parte del Mattogrosso en Brasil y la región de Chiquito en Bolivia, con lo que descarta la creencia de que México fue la cuna del maíz. La difusión del maíz hacia el resto del mundo se atribuye principalmente a los españoles, quienes lo llevaron a Europa y posteriormente se difundió en Asía y África.

Figura 1.5. Distribución geográfica del maíz y el teocintle. Centro del maíz Andino caracterizado por su forma de granada de mano con orejas (22 muestras), otros maíces de América del Sur (47), maíz de Guatemala y el sur de México (31), maíz del Caribe (6), maíz del norte de México y de los valles bajos occidentales (15), maíz mexicano de valles altos (20), maíz del este y centro de los EE.uu. (24), maíz del suroeste de los EE.uu. (22), maíz del norte de México (6), ssp. parviglumis (34), y ssp. mexicana (33). El recuadro muestra la distribución de 34 poblaciones de la ssp. parviglumis en el sur de México con las poblaciones basales del maíz (representadas por asteriscos). La línea azul es el río Balsas y sus principales afluentes (Matsuoka y col., 2002)

En la actualidad, el maíz se cultiva a nivel mundial (figura 1.6) y es una especie muy adaptable, lo cual se atribuye a su gran diversidad genética. Es difícil hablar de una estadística exacta de todas las variedades existentes en Iberoamérica. A modo de ejemplo, en Bolivia, según los datos de la Organización de las Naciones unidas para la Agricultura y la Alimentación (fAO), entre los años 1961-2007 la producción de maíz presenta un comportamiento significativamente lineal (Figura 1.7), con un in-

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cremento anual de producción de alrededor 10.000 toneladas. Del total de maíz producido en dicho país, el 20% corresponde a maíz morado. PRODUCCIÓN MUNDIAL DE MAÍZ, PRINCIPALES PRODUCTORES (TONELADAS) Filipinas, 5.200.000 Serbia y Montenegro 6.300.000

Nigeria, 4.779.000 Tailandia, 4.180.000

Egipto, 6.800.000

España, 3.950.700

Ucrania, 7.100.000 Canadá, 8.392.000 Hungría, 9.000.000 Rumanía, 9.965.000 Italia, 10.622.000 Sudáfrica, 11.996.000 Indonesia, 12.013.710

Estados Unidos de América, 280.228.400

Francia, 13.226.000 India, 14.500.000 Argentina, 19.500.000 México, 20.500.000

Brasil, 34.859.600

China, 132.645.000

figura 1.6. Producción mundial del maíz.

En cuanto a las características morfológicas, el maíz es una planta monoica y anual que posee una larga raíz fibrosa y un tallo muy erecto y delgado. Sus hojas son grandes, largas y lanceoladas. Se puede sembrar entre los 500 a 2.400 m de altitud; los meses propicios de siembra son agosto a octubre. Las variedades más cultivadas dependiendo de la altura son: – Morado Canteño se cultiva entre 500-2.400 m. – Morado Caraz, se cultiva encima de los 2.000 m. – Morado PMV-581 se cultiva entre 500-2.400 m.

1.2.2. Contenido nutricional El maíz proporciona sobre todo almidón. Su valor energético es de 359 kcal por cada 100 g. Los nutrientes más valiosos se concentran en el embrión (proteínas), también destacan las grasas que son de buena calidad y varias vitaminas y minerales, particularmente el caroteno (vitamina A) y las vitaminas del grupo B (Tabla 1.1).

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900000 800000

Producción (tons)

500000 700000 400000 600000 300000 200000 100000

1960

1970

1980

1990

2000

2010

Tiempo (años)

figura 1.7. Comportamiento de la producción de maíz en Bolivia (Comunicación personal, Antezana A. universidad Mayor de San Simón, Cochababa, Bolivia). tabla 1.1. cOmpOsición del maíz. lOs valOres están referidOs a pesO frescO nutriente Humedad Proteína Grasa Hidratos de carbono fibra cruda Cenizas Calcio a fósforo a Hierro a Tiamina a Riboflavina a Vitamina C a,b a b

Valores referidos a 100 g de maíz fresco En maíz morado

contenido 10,75 % 9,33 % 3,90 % 74,72 % 2,42 % 1,6 % 7,0 mg 164 mg 8,9 mg 0,24 mg 2,86 mg 3,0 mg

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1.2.3. Propiedades nutracéuticas Diferentes sustancias con propiedades nutracéuticas han sido identificadas y evaluadas en el maíz, destacando los siguientes grupos: – carotenoides: cumplen la función de antioxidantes, evitando la deficiencia de la vitamina A y aquellas patologías asociadas a esta deficiencia. (IFIC, 2009). – fenoles y antocianinas: promueven la regeneración de tejidos conectivos, son antiinflamatorios, promueven el flujo sanguíneo y reducen el colesterol. En una reciente publicación, Cuevas-Montilla y cols. (2011) analizaron el contenido de polifenoles totales y algunas antocianinas de cuatro variedades de maíz Boliviano púrpura y cinco variedades de maíz Boliviano azul. El análisis mostró la presencia de acido ferúlico en un rango de 133-298 mg/100 g de material seco, mientras que el contenido de ácido p-cumárico fue de 252-607 mg/100 g material seco. El contenido de polifenoles totales fue de 311-818 mg equivalentes de ácido gálico por cada 100 g de materia seca. De estos polifenoles totales el 20% fueron polifenoles libres. En 2006, Del Pozo-Insfran y cols. determinaron fenoles y capacidad antioxidante en dos genotipos de maíz azul, uno de Estados unidos y el otro mexicano, así como también analizaron una especie mexicana de maíz blanco. El análisis fue realizado en masa para tortillas y en productos elaborados a base de esta masa (tortillas y chips). La masa elaborada a base de maíz azul mostró un contenido de antocianinas de 314 mg/kg de producto. También se identificaron (+)-catequina, ácido ferúlico esterificado y no esterificado, así como derivados de ácido p-cumárico. Del mismo modo, en la masa de maíz blanco se identificaron derivados del acido ferúlico (88,8 - 816 mg/kg), derivados del acido p-cumárico (6,6 mg/kg), dos derivados del acido proteocatecuico (4,2 y 14,2 mg/kg, respectivamente) y acido gálico (3,9 mg/kg). La capacidad antioxidante de la masa elaborada con las dos variedades de maíz azul fue superior a la obtenida con la masa de maíz blanco. Se observó una disminución del contenido de antocianinas, en los productos procesados: tortillas (57%) y chips (75%). También se atribuyen propiedades antimutagénicas a la fracción de polifenoles de maíces púrpura de la región de los andes (Pedreschi y Cisneros-Zevallos, 2006). – estanoles: pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Según recientes estudios, los maíces son ricos en fitoesteroles y fitoestanoles, los cuales pueden reducir los niveles de colesterol sérico (Harrabia y cols., 2008). En 2008, Jain y cols. evaluaron el efecto de la ingesta de fibra de maíz rica en estanol sobre los niveles de colesterol en sangre en ratones a los que se agregó colesterol en la dieta. Los resultados revelaron una disminución del 29% de colesterol en sangre en los ratones que ingirieron esta fibra de maíz rica en estanol respecto al grupo de ratones que fueron alimentados con una dieta control.

1.3. uva 1.3.1. Origen y descripción general Sinonimia hispánica de la planta: viñedo, parra, vidueño, viduño familia: Vitaceae Género: Vitis Nombre científico: Vitis vinifera

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figura 1.8. Vitis vinífera.

Existe un acuerdo general en que la cuna de la uva abarca la región del mediterráneo y el suroeste de Asia. Variedades silvestres de Vitis vinífera han sido identificadas desde Portugal hasta Turmekistan y desde las orillas del rio Rin hasta la región norte de Túnez. Se considera que Anatolia pudiera ser una de las principales regiones donde se inició el cultivo y la diversificación de variedades (Gökbayrak y Zolylemesoglo, 2010). Actualmente, la producción mundial oficial de uva (todas variedades) reportada por la fAO, asciende a casi 59.000 toneladas por año, encontrándose España y Portugal entre los principales productores de uva a nivel mundial (Estadísticas fAO, ver figura 1.9). PRODUCCIÓN MUNDIAL DE UVA, PRINCIPALES PRODUCTORES (TONELADAS) Egipto, 1.300,00

Brasil, 1.208,68 Sudáfrica, 1.700,00

Australia, 1.834,00 Chile, 2.250,00 Argentina, 2.365,00 Irán, Rep. Islámica de, 2.800,00

Grecia, 1.200,00 Alemania, 1.122,00 India, 1.200,00 Rumanía, 1.027,61 Portugal, 1.000,00 Hungría, 815,00 Moldova, 600,00

Turquía, 3.650,00

Italia, 9.256,81

China, 5.698,00

Francia, 6.787,00 España, 5.879,80

Estados Unidos de América, 6.414,61

figura 1.9. Producción mundial de uva.

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En cuanto a sus características morfológicas, su tronco retorcido y tortuoso presenta una corteza gruesa y áspera que se desprende en tiras longitudinales. Las ramas jóvenes, denominadas sarmientos, son flexibles y muy engrosadas en los nudos; alternando sobre ellas se disponen las hojas, grandes, palmeadas y muy lobuladas, a la vez que dentadas, a las que se las suele llamar pámpanas. Los zarcillos salen enfrente de las hojas y se enroscan y endurecen en cuanto encuentran soporte. La uva es, después de la naranja, la fruta más cultivada en todo el mundo. Pero solo una pequeña parte de la uva producida se consume como fruta; la mayor parte se destina a la fabricación de bebidas alcohólicas, especialmente vino. La uva es uno de los mejores alimentos desintoxicantes; esta fruta es ideal para realizar curas con monodieta, y tiene propiedades antioxidantes. Se recomienda que la uva se coma con piel y semillas, ya que en ellas se encuentran diferentes sustancias antioxidantes. La uva es especialmente nutritiva y al mismo tiempo cumple funciones limpiadoras y regeneradoras. Debe de consumirse esta fruta sola, no como parte de otra comida, debido a su rápida fermentación en el estómago. Las uvas atenúan las varices, disminuyen el riesgo de flebitis y hemorroides, bajan la tensión arterial, alivian los calambres musculares, aminoran las alergias, estimulan las defensas y reducen el estrés y la depresión, aparte de mejorar la gota y la artritis.

1.3.2. contenido nutricional La composición de la uva se muestra en la Tabla 1.2. Su valor energético es de aproximadamente 70 kcal por cada 100 g. Dos tipos de nutrientes destacan en la composición de la uva: los azúcares y las vitaminas del complejo B; por el contrario, la uva aporta pocas proteínas y grasa. Las proteínas, aunque en pequeña cantidad, contienen todos los aminoácidos esenciales. Los minerales están presentes en una cantidad moderada.

1.3.3. propiedades nutracéuticas Estos son los componentes de la uva que merecen una mención especial: – azúcares, en una proporción que oscila entre el 15% y el 30% en peso. Las uvas que se crían en regiones frías suelen tener menos azúcares, mientras que las cultivadas en terrenos cálidos y secos son mucho más dulces. Los dos azucares más abundantes de la uva son la glucosa y la fructosa. Desde el punto de vista químico, se trata de monosacáridos o azúcares simples, que tienen la propiedad de pasar directamente a la sangre sin necesidad de ser digeridos. – vitaminas: con sus 0,11 mg/100 g de vitamina B6, la uva es una de las frutas frescas más ricas en esta vitamina, superada tan solo por la frutas tropicales como el aguacate, el plátano, la chirimoya, la guayaba o el mango. Las vitaminas B1, B2 y B3 o niacina también están presentes en cantidades superiores a la mayoría de las frutas frescas. Todas las vitaminas cumplen, entre otras, la función de metabolizar los azúcares, facilitando que las células puedan «quemar-

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los» químicamente y aprovechar así su energía. La naturaleza da así una muestra más de su designio inteligente, al proporcionar una gran cantidad de azúcares en la uva, pero junto con las vitaminas necesarias para su aprovechamiento energético. La uva contiene también cantidades bastante significativas de provitamina A (7 μg/100 g), de vitamina C (10,8 mg/100 g) y de vitamina E (0,7 mg/100 g). tabla 1.2. cOmpOsición de la uva pOr cada 100 GramOs de parte cOmestible cruda (pamplOna, 2004) nutriente Proteína Hidratos de Carbono fibra Vitamina A Vitamina B1 Vitamina B2 Niacina Vitamina B6 folatos fierro Calcio fósforo Magnesio Potasio Cinc Grasa total Grasa saturada Sodio Vitamina C

contenido 0,66 g 16,8 g 1,00 g 7,0 μg 0,092 mg 0,057 mg 0,350 mg 0,110 mg 0,260 mg 8,9 mg 11,0 mg 13,0 mg 6,0 mg 185 mg 0,050 mg 0,580 g 0,189 g 2,0 mg 10,8 mg

– fibra: La uva contiene alrededor del 1% de fibra vegetal de tipo soluble (pectina), cantidad relativamente importante tratándose de una fruta fresca. – ácidos orgánicos (tartárico, málico, cítrico y otros): son los responsables del sabor ligeramente ácido de la uva. Estos ácidos ejercen una acción paradójica en la sangre, produciendo alcalinización. La alcalinización de la sangre y de la orina facilita la eliminación de los residuos metabólicos, que en su mayor parte son de tipo ácido, como por ejemplo acido úrico. – flavonoides: Compuestos fenólicos que abarcan diferentes estructuras químicas, entre las cuales se encuentran las flavonas, flavanona, catequinas y antocianinas. A estas estructuras se les atribuyen propiedades antioxidantes con diferentes impactos en el organismo. Al parecer, los flavonoides están asociados a efectos antiinflamatorios, anticancerígenos y con la re-

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ducción o control de enfermedades cardiovasculares, reducción de alergias y disminución de riesgos de isquemia (Nijveldt y cols., 2001) El perfil de flavonoides es variable y depende de la variedad y la región de cultivo de las uvas e incluso las distintas partes de la uva (Adams, 2006). En un estudio reciente se encontraron 60 flavonoides y compuestos fenólicos relacionados; entre ellos destacaban 25 antocianinas en forma glucosilada como mono- y di-O-glucósidos, O-acetilglucósidos, O-p-cumaroil-O-diglucósidos y O-p-cumaroil-glucósidos de delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina (Stalmach y cols. 2011). La absorción de los flavonoides parece ser rápida, algunos estudios han demostrado que las procinaidinas, la quercetina y los flavanoles de la uva son detectados a las 2 horas en el plasma de la persona que ingiere la fruta. Igualmente, parece existir una rápida asociación de flavonoides con las grasas del plasma, lo que resulta en una disminución de la peroxidación de estos lípidos en el suero (Xia y cols., 2010) – resveratrol: Detiene la progresión de la arteriosclerosis. Recientemente se ha comprobado que es además un poderoso anticancerígeno. Las fitoalexinas son un amplio grupo de metabolitos secundarios, de bajo peso molecular, fungitóxicos, producidos por las vides y otras plantas en respuesta a varios tipos de estrés, como ataque de patógenos fúngicos o exposición a la radiación UV. Las fitoalexinas de la vid son compuestos fenólicos simples, llamados «resveratroles»; por estar su ruta de síntesis ligada a los antocianos, su mayor fuente son las uvas tintas. Las bayas y las hojas de la vid sintetizan estos «fungicidas naturales» como defensa contra Botrytis cinerea (Podredumbre gris de los racimos), Plasmopara vitícola (Peronóspora), Uncinula necator (Oidio), etc.; y también las bayas producen estas fotoalexinas para protegerse de los rayos ultravioletas. Su importancia en el tema «vino y salud» se debe a que actúan sobre las lipoproteínas de baja densidad o LDL -colesterol malo- transformándolas en lipoproteínas de alta densidad o HDL -colesterol bueno -; además, dificultan la acumulación de plaquetas en las arterias y poseen acción antitumoral, etc. Todo lo expuesto anteriormente ha impulsado el aspecto saludable de la ingesta moderada del vino tinto. En esencia puede decirse que la uva es un alimento que aporta energía a nuestras células y que favorece el buen estado de las arterias, especialmente de las coronarias que irrigan el músculo cardiaco. Además es laxante, antioxidante, diurética, antianémica y antitumoral.

1.4. aceituna Sinonimia hispánica: perla del mediterráneo, oliva familia: Oleáceas Género: Olea Nombre científico: Olea europea

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1.4.1. Origen y descripción general La aceituna u oliva es el fruto del olivo (Olea europea L.) árbol de la familia de las Oleáceas, Dentro del género Olea, que incluye a más de 30 especies, la especie Europea (L), la única con frutos comestibles, a la que pertenece el olivo. Esta especie se divide a su vez en dos grupos principales, O. europea var. Sylvestris (también var. Oleaster) en el que se incluyen todos los tipos de olivos silvestres, y O. europaea var. Sativa (también var. Communis) al que pertenecen los olivos cultivados. Desde el punto de vista agronómico, las variedades de olivo se clasifican en función del destino que se da al fruto. De acuerdo con ello, los cultivares de olivo se clasifican en variedades de almazara, variedades de aceituna de mesa y variedades de doble aptitud, aunque de esta cualidad de hecho participan casi todas las variedades de almazara. Entre las variedades de almazara españolas destacan en orden de mayor importancia: Picual, Cornicabra, Hojiblanca, Lechón de Sevilla, Verdial de Badajoz, Empeltre, Arbequina y Picudo. Entre las variedades de aceituna de mesa españolas destacan Manzanilla de Sevilla y Gordal Sevillana. una variedad de doble aptitud característica es la Hojiblanca. En Portugal, las variedades de almazara a reseñar son: Mora, Picual, Verdeal y Alentejana.

figura 1.10. Olea europea.

Hay un acuerdo general entre los historiadores de que el cultivo del olivo debió iniciarse en Asia Menor, en la región que se extiende desde Siria a Grecia, hace unos 6.000 años, coincidiendo su expansión con el florecimiento de las civilizaciones y culturas que se han desarrollado en la Cuenca Mediterránea. Sin embargo, el inicio del aprovechamiento humano de la planta, si no en la forma que conocemos actualmente, sí en sus formas primitivas silvestres, se pierde en la noche de los tiempos, como lo atestiguan las hojas fósiles encontradas en los yacimientos Pliocénicos y del Paleolítico Superior de Italia y norte de África, o los trozos de acebuche y huesos de aceituna encontrados en excavaciones del Neolítico y la Edad de Bronce en España.

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No se conoce a ciencia cierta en qué momento se introdujo el cultivo del olivo en España, y aunque los historiadores coinciden en adjudicar su introducción a los fenicios (1050 años A.C.), también coinciden en que solo a partir de la llegada de Escipión y sus legiones romanas, el cultivo del olivar empezó a florecer en España. Los españoles llevaron el olivo a las regiones del clima templado de las Américas. Los primeros olivares del nuevo mundo fueron plantados en Centroamérica durante el siglo xvi. Después el olivo pasó a Perú, Argentina y California, y recientemente se ha introducido su cultivo en Australia. Sin embargo, el 98% de todos los olivos del mundo se encuentra en los países ribereños del Mediterráneo. Actualmente, la producción mundial de aceitunas asciende a más de 14 millones de toneladas por año (Datos fAO) siendo España el segundo productor a nivel mundial; Portugal ocupa el noveno lugar. Las aceitunas verdes se cosechan al comienzo de la estación otoñal, mientras que las negras se recogen a partir de diciembre, cuando ya están bien maduras. PRODUCCIÓN MUNDIAL DE ACEITUNA. PRINCIPALES PRODUCTORES Estados Unidos de América 1% Argelia 1% Libia, Jamahiriya Árabe 1% Líbano 1% Portugal 2% Egipto 2% Marruecos 3%

Jordania 1%

Israel 0% Perú 0% Irán, Rep. Islámica de 0% Croacia 0%

Siria, República Árabe 4% Italia 29%

Túnez 5%

Turquía 6%

Grecia 15%

España 26%

figura 1.11. Producción mundial de aceituna.

1.4.2. contenido nutricional En la Tabla 1.3 se muestra la composición de la aceituna; su valor energético es de 115 kcal por cada 100 g. Las aceitunas son un fruto oleaginoso, muy rico en grasas, y por tanto en calorías. Destaca también su contenido en proteínas, superior al de la mayor parte de los frutos, además de poseer un alto valor biológico, ya que contienen todos los aminoácidos esenciales.

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La elaboración de aceite, ya sea para cocina o para la preparación de cosméticos, es el principal destino de las olivas. El aceite de oliva en su fracción saponificable contiene sobre todo triacilgliceroles y algunos ácidos grasos libres que se han separado por hidrólisis de los citados componentes, y que son los que dan acidez a los aceites. tabla 1.3. cOmpOsición de la aceituna pOr cada 100 GramOs de parte cOmestible (pamplOna, 2004) nutriente

contenido

Grasa total

10,7 g

Grasa saturada

1,42 g

Proteína

0,840 g

Hidratos de carbono

3,06 g

fibra

3,20 g

Vitamina A

0,040 mg

Vitamina B1

0,003 mg

Niacina

0,037 mg

Vitamina B6

0,009 mg

Vitamina E

3,00 mg

Hierro

8,9 mg

Calcio

88,0 mg

fósforo

3,00 mg

Magnesio

4,0 mg

Potasio

8,0 mg

Cinc

0,220 mg

Sodio

872,0 mg

Vitamina C

0,900 mg

El aceite de oliva contiene mayoritariamente ácido oleico, en promedio representa un 79% del total de ácidos grasos; este valor puede oscilar entre 57% como mínimo y 82% como máximo en los diferentes aceites de oliva. Los ácidos grasos saturados en conjunto oscilan entre 13 y 20% (Spangenberg y cols., 1998; Pereira y cols., 2002; Issaoui y cols., 2011). A su vez, dentro de estos, los que suelen aparecer como característicos son el ácido palmítico y esteárico, siendo más abundante el primero que el segundo, oscilando el palmítico entre un 11 y un 17% y el esteárico de 1 al 3%. Las citadas variaciones dependen de la variedad de aceituna empleada (Agar y cols., 1998); dentro de una variedad en concreto, factores como

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el clima, el riego o el suelo, etc. modifican, aunque en menor grado, la composición final del aceite. Por último, otros ácidos grasos insaturados representarían un 8% del total. Dentro de estos, el ácido graso presente en mayor proporción es el esencial linoleico, que varía entre un 4 y un 20%, y minoritariamente el otro ácido esencial, el alfa-linolénico que según el reglamento comunitario debe ser inferior al 0.9%. Cuando el aceite de oliva contiene menos ácido oleico, aumentan sobre todo los niveles de los otros ácidos insaturados, especialmente linoleico y, en menor grado, el linolénico. La fracción insaponificable, también denominada componentes menores del aceite de oliva, contiene una gran variedad de compuestos que cumplen asimismo una gran diversidad de funciones. Los componentes del mesocarpio de la aceituna pasan con o sin transformación a formar el aceite de oliva.

1.4.3. propiedades nutracéuticas La piel de las aceitunas es rica en pigmentos vegetales (antocianinas) y en sustancias volátiles que otorgan a las aceitunas su aroma peculiar. La pulpa es rica en fibra vegetal y en triglicéridos (hasta el 30% de su peso). Las aceitunas contienen cantidades significativas de provitamina A y de vitaminas B y E. En cuanto a minerales, el calcio es el más abundante, aunque contiene también cantidades apreciables de potasio, hierro y fósforo. El elevado contenido de sodio se debe a la sal que se le añade durante su remojo en salmuera. Los beneficios de la aceituna y el aceite de oliva sobre la salud han sido puestos de manifiesto a lo largo de numerosos trabajos. En dichos estudios, al menos hasta hace algunos años, el papel principal en cuanto a las bondades del aceite era atribuido al alto contenido en ácido oleico del mismo. Sin embargo, de un tiempo a esta parte, la atención de lo científicos se ha centrado también en los llamados componentes menores del aceite de oliva. Mataix y cols. (2001) citan numerosas trabajos que ponen en evidencia la actividad antioxidante de la fracción fenólica del aceite de oliva ensayada en numerosos modelos biológicos; los estudios aseveran que la adición de pequeñas concentraciones de hidroxitirosol protegen la LDL humana contra la oxidación. Otros estudios demostraron la importancia relativa de la vitamina E en la capacidad antioxidante del aceite de oliva (Quiles y cols., 1999); una vez más se destaca el papel antioxidante de la fracción insaponificable, y la presencia de vitamina E, y por tanto, de la importancia del consumo de aceite de oliva virgen. Todo lo anterior referido al papel de antioxidante de la especie que nos ocupa. Con referencia al aceite de oliva y envejecimiento, el grupo de Mataix y cols. (2001) indican que este último es consecuencia de un daño oxidativo continuo a lo largo del periodo vital. La base de partida, dicen ellos, es estudiar si un aceite consumido habitualmente a lo largo de la vida conduce a un diferente estado oxidativo celular, en función del grado de instauración del citado aceite. Respecto al aceite de oliva, el «efecto edad» se atenúa por el bajo nivel de instauración de la dieta y por tanto, de la membrana mitocondrial. Entonces podríamos concluir al respecto que el aceite de oliva, con un perfil lipídico fundamentalmente monoinsaturado (acido olei-

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co), de una muy baja potencialidad oxidativa y un elevado contenido de antioxidantes fenólicos (vitamina E, hidroxitirosol, et.) representa una de las principales vías para prevenir nutricionalmente el estrés oxidativo en varias situaciones, tales como el metabolismo de xenobióticos, calentamiento de aceites, la práctica deportiva o el envejecimiento celular. La dieta tiene un papel muy importante en el desarrollo de la arteriosclerosis tanto para incrementarla como enlentecerla. El perfil lipídico de los ácidos grasos de la dieta tiene un efecto directo sobre la composición lipídica del plasma y por lo tanto sobre el perfil lipídico de las lipoproteínas haciéndolas más o menos susceptibles a oxidarse. Ha sido demostrado que el aceite de oliva rico en ácidos grasos monoinsaturados aumenta el colesterol HDL y disminuye el colesterol LDL plasmático. Sin embargo, es solo el aceite de oliva virgen el que inhibe la oxidación de las LDL gracias a su alto contenido en compuestos antioxidantes particularmente en tocoferoles y compuestos fenólicos. Además, se ha observado que el aceite de oliva virgen es capaz de modular los procesos de inflamación en la pared del endotelio vascular al inhibir la producción de citoquininas, la adhesión de los leucocitos a la pared arterial y la agregación plaquetaria. Todos estos efectos encontrados con el aceite de oliva virgen se atribuyen a la actividad antioxidante de los componentes de la fracción insaponificable. En resumen, el consumo diario de aceite de oliva, junto a una dieta equilibrada, es muy recomendada para la prevención y el desarrollo de la aterosclerosis y las enfermedades vasculares. De acuerdo a Quiles y cols. (2001), el papel del aceite de oliva con relación al cáncer está empezando a ser dilucidado de forma reciente. Aún no se tienen datos acerca de los mecanismos responsables del papel beneficioso que el consumo de aceite de oliva pueda ejercer previniendo la aparición de determinados tipos de cáncer o inhibiendo o limitando su crecimiento. En el ámbito de la iniciación, todos los indicios apuntan a que el aceite de oliva, o algunos de sus componentes, previenen dicho proceso o lo potencian menos que otras grasas de la dieta porque tienen menores efectos inflamatorios y generan menor daño oxidativo. Desde el punto de vista de la promoción, crecimiento y metástasis, el aceite de oliva genera patrones hormonales que no estimulan dichos procesos, alteran menos el sistema inmune, generan niveles significativamente inferiores de eicosanoides relacionados con el crecimiento tumoral y alteran la expresión génica de los numerosos elementos relacionados con la proliferación celular en menor nivel al que lo hacen otras grasas, fundamentalmente de tipo AGP n-6.

1.5. tubérculOs y raíces De acuerdo a datos estadísticos de la FAO en 2005, la producción mundial oficial de tubérculos y raíces fue de mas de 6 millones de toneladas, siendo Etiopía el mayor productor mundial. Ente los principales productores se encuentran tres países de Latinoamérica: Bolivia, México y Colombia. Dentro de todos los tubérculos y raíces que posee Latinoamérica a continuación se hará la descripción de algunos de ellos: papas, ocas, camotes y yacón.

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PRODUCCIÓN MUNDIAL DE TUBÉRCULOS Y RAÍCES. (Miles de Toneladas) Guinea Bissau, 68 Congo, República Dem. del, 70 Filipinas, 71 Colombia, 76 México, 81 Eritrea, 85 Botswana, 93 Bolivia, 96,83

Japón, 65 Tailandia 60,6 Swazilandia, 46 Malasia, 45 Timor Oriental, 43

Nepal, 110 Perú, 260 Namibia, 295

Papua Nueva Guinea, 306

Etiopía, 3.800,00

Indonesia, 350

Pakistán, 424,62

figura 1.12. Producción mundial de tubérculos y raíces.

1.5.1. papa Sinonimias: Papa, patata familia: Solanaceae Género: Solanum Nombre científico: Solanum tuberosum

1.5.1.1. Origen y descripción general La papa es una planta herbácea anual, con hojas alternas, simples, sin estípulas; inflorescencia cimosa, con flores bisexuales, actinomorfas; cáliz de 5 sépalos unidos, persistente; corola de 5 pétalos unidos, rotados; androceo de 5 estambres, insertos en el tubo de la corola y alternos con sus lóbulos; Gineceo constituido por un pistilo compuesto de 2 carpelos, con 2 loculos, óvulos numerosos, placentación axilar, ovario supero, estilo terminal. El fruto es una baya, semillas con un embrión curvo o recto dentro de un espermo, de sabor desagradable y probablemente venenosa, con semillas fértiles.

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figura 1.13. Solanum tuberosum.

1.5.1.2. Contenido nutricional El valor nutritivo de las papas depende de su porcentaje de materia seca; en promedio es de 20-22%, pero difiere según la variedad (Tabla 1.4), las prácticas de cultivo, las condiciones climáticas del medio y la incidencia de plagas y enfermedades. Los carbohidratos (fécula) son el componente principal, además de pequeñas cantidades de proteínas, vitamina C, tiamina, niacina, hierro, fósforo, calcio y fibra cruda, lo que hace de este cultivo uno de los más importantes para la alimentación. tabla 1.4. cOmpOsición prOmediO (pOr cada 100 G de parte cOmestible) de 4 diferentes variedades de papa (tablas peruanas de cOmpOsición de alimentOs, centrO naciOnal de alimentación y nutrición, institutO naciOnal de salud, lima, 2009) papa amarilla papa chuño sin cáscara papa blanca negro

papa morada deshidratada

energía (kcal)

97

97

agua (g)

74

74,5

14,1

13,1

5,2

2,1

4

8,7

Grasa total (g)

10,1

0,1

0,2

0,2

carbohidratos (g)

22,3

22,3

79,4

74,1

carbohidratos disponibles (g)

19,9

19,9

79,4

74,1

fibra cruda (g)

0,6

0,6

1,9

–

fibra dietética (g)

2,4

2,4

–

–

cenizas (g)

1,0

1,0

2,3

proteína (g)

333

324

3,7

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1.5.1.3. Propiedades nutracéuticas La medicina tradicional de diferentes regiones de America Latina sugiere el uso de jugo de papa cruda para curar inflamaciones debidas a golpes así como también para cicatrizar heridas leves. También es usada como mascarilla para el acné. Reyes y cols., en 2007, identificaron antocianinas y compuestos fenólicos, en papas color púrpura y rojas; el estudio reporta 11-174 mg de cianidina-3-glucósido/100 g y 76181 mg de ácido clorogénico por cada 100 g de producto fresco. El estudio reveló que existe una correlación directa entre el contenido de antocianinas y compuestos fenólicos y la capacidad antioxidante.

1.5.2. Oca Sinonimias: Oca, apiha, apiña, apilla, kawi (en aymara), lamaki (en kallawalla), timbo, quiba, papa roja o huisisai. familia: Oxalidaceae Género: Oxalis Nombre científico: Oxalis tuberosa

figura 1.14. Oxalis tuberosa.

1.5.2.1. Origen y descripción general La oca es una planta perene que se cultiva en la región de los Andes, a una altitud promedio de 3.000 metros sobre el nivel del mar. Originaria probablemente de Sudamérica, tal vez de las regiones altas del Norte del Perú (Emshwiller, 2006).

1.5.2.2. Contenido de nutrientes La oca se caracteriza por contener almidón de buena calidad y en algunas variedades por la cantidad de carotenos. También contiene ácido oxálico, que le puede dar un sabor ácido; este disminuye mediante la cocción, el congelado y el lavado. Se ha

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descrito que la oca contiene además compuestos fenólicos y un antibiótico, el ocatin, con propiedades antifúngicas.

1.5.2.3. Propiedades nutracéuticas Destaca en la oca el contenido en potasio, que puede reducir el riesgo de hipertensión y accidente cerebrovascular al combinarse con una dieta en bajo contenido de sodio (IfIC, 2009).

1.5.3. camote Sinonimias: Camote, boniato, batata, camote (del náhuatl camohtli), chaco o papa dulce moniato, pataca dolce, (Ipomoea batatas) familia: Convolvulaceae Género: Ipomoea Nombre científico: Ipomoea batatas

figura 1.15. Camote (Ipomea batatas).

1.5.3.1. Origen y descripción general El camote es una planta cultivada a escala mundial, originaria del norte de Sudamérica. Existen hallazgos de camote en las costas peruanas que datan de 8000 A.C. Ningún material de la planta ha sido descubierto en sitios arqueológicos de México y solamente hay evidencias indirectas (inferenciales) de Centroamérica. Esto conduce a confirmar la hipótesis del origen sudamericano. Actualmente, la mayor variabilidad del camote se presenta en el Perú (172 variedades), Guatemala (160 variedades) y Colombia (115 variedades). Los españoles lo introdujeron en Europa y lo dispersaron hacia China, Japón, Malasia y las islas Molucas. Los portugueses lo llevaron a la India, Indonesia y África. La planta fue introducida en la Polinesia antes de Magallanes y de allí fue

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dispersada al resto del Pacífico. La evidencia de la introducción del camote antes de Magallanes hacia la Polinesia es mostrada por la reconstrucción lingüística de la palabra Kumara (para designar al camote) en proto-polinesio. Esta palabra ha sido empleada para mostrar el contacto directo entre polinesios y poblaciones andinas de habla quechua. La evidencia lingüística, cuando se combina con la arqueológica sugiere que la planta arribó ya sea al área de fiji, hacia el año 500 A.C. (la alternativa más temprana y más radical) o en el grupo de las islas Sammoa cerca de 1 D.C. (probabilidad mayor) o en las islas marquesas aproximadamente en el año 400 D.C. (Seminario, 2006). Las principales características morfológicas del camote son: – Hábitat: enredadera perenne. Trepa sobre vegetación natural y secundaria; frecuente en orillas de caminos de regiones selváticas bajas caducifolia, trópico seco. Altitud: 800 a los 1550 m – Raíz: tuberosa y comestible. – Tallo: algo suculento pero algunas veces delgado y herbáceo, glabro o pubescente, ramificado. – Hojas: de cordadas a ovadas, enteras, dentadas o profundamente lobadas, de 5 a 10 cm de largo, glabras o raramente pubescentes, ápice agudo a acuminado, mucronado. – Inflorescencia: una cima (monocasios o dicasios) de pocas flores hasta 25. – flores: sépalos oblongos, los externos acuminados y cuspidados, de 10 a 15 mm de largo, pubescentes o ciliados; corola campanulada con limbo color lavanda a púrpura-lavanda y garganta más oscura, blanca en algunas variedades, de 4-7 cm de largo. – frutos y semillas: cápsula ovoide, glabra, café clara a pajiza (Carranza, 2007).

1.5.3.2. Contenido nutricional El tubérculo se caracteriza por su alto contenido de almidón. Bovell-Benjamin (2007) reporta un contenido proteico de 4-27% en hojas y de 1-9% en raíces. Así mismo, el camote se considera como una fuente de beta-caroteno y antocianinas.

1.5.3.3. Propiedades nutracéuticas Algunos compuestos fenólicos, antocianinas y beta-carotenos, se encuentran presentes en distintas partes de la planta (hojas, tallos y raíces). Se ha encontrado mayor correlación entre la actividad antioxidante con la cantidad de compuestos fenólicos (0,011–0,949 mg equivalentes de ácido clorogénico/g de producto) que con las antocianinas y el beta-caroteno contenidos en el camote. La capacidad antioxidante de la pulpa de variedades púrpura fue mayor que la de variedades blancas (Teowa y cols., 2007) Algunos autores han reportado el efecto de los compuestos fenólicos del camote sobre el control del cáncer de estómago y la leucemia, así como también sobre el control de la diabetes. También se ha reportado un efecto inhibidor sobre tumores

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invasivos por parte del ácido clorogénico, al parecer debido a la inhibición de la metaloproteinasa (MMP)-9 (Junga y cols. 2011).

1.5.4. yacón Sinonimias: Jacón, Arboloco familia: Asteraceae Género: Smallanthus Nombre científico: Smallanthus sonchifolius

figura 1.16. Yacon (Sallanthus sonchifolius).

1.5.4.1. Origen y descripción general El yacón es un tubérculo originario de Sudamérica. El yacón se ha usado durante cientos de años como alimento base entre la población Andina. La figura 1.17 muestra las principales zonas de producción del yacón. Se consume, ya sea cocido, como ingrediente en ensaladas, o para preparar bebidas. En ocasiones, se coloca al sol durante algunos días para aumentar su dulzor: la fructosa se eleva de 2 a 22 g, la alfa glucosa de 2 a 7 g, la beta-glucosa de 2 a 6 g y la sacarosa de 2 a 4 g (en 100 g de raíces frescas). Se ha introducido al mercado europeo dadas las características nutracéuticas que se le atribuyen (prebióticas, antidiabéticas, antioxidantes y antimicrobianas). Las plantas de yacón pueden crecer más de 2 m en altura y producir flores pequeñas, amarillas y discretas al final de la temporada de crecimiento. A diferencia de otros vegetales de raíz domesticados por los incas como el olluco o la oca, el yacón no es sensible a los fotoperiodos, y puede producir una cosecha comercial en los trópicos.

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Czech Republic 1994

South-Korea 1998 Hainan 2003

Japan 1985 Taiwan 2000 Philippines 2003

Andean region since 500-1200 A.C.

Brazil 1991

Confirmed yacon cultivation Small scale cultivation cited in literature

From Ecuador to New Zealand 1983

figura 1.17. Zonas de producción del yacón (Ojansivu y cols., 2011).

1.5.4.2. Contenido nutricional El valor nutritivo del yacón está en su contenido de fibra dietética y de los fructooligosacáridos (fOS), un compuesto funcional del grupo de los prebióticos. Su valor energético es de aproximadamente 14-22 kcal por cada 100 g. tabla 1.5. cOmpOsición prOmediO del yacón. lOs valOres están referidOs a cada 100 G de pesO frescO (Ojansivu y cOls., 2011) nutriente Carbohidratos Proteínas Grasa Agua fibra Cenizas Potasio Calcio fósforo Hierro Retinol Caroteno Tiamina Riboflavina Niacina Ácido ascórbico

contenido 9-13,8 g 0,1-4,9 g 100-1500 mg 69-93 g 0,3-3,4 g 0,3-6 g 180-334 mg 6-131 mg 21-309 mg 0,2-0,3 mg 10 mg 0,08-0,13 mg 0,01-0.07 mg 0,1-0,31 mg 0,33 mg 5-13 mg

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1.5.4.3. Propiedades nutracéuticas Diferentes autores han descrito los resultados de algunos estudios clínicos. Geyer y cols. (2008) reportaron efectos benéficos sobre el tránsito intestinal de humanos; los sujetos del estudio ingirieron 20 g de yacón durante 2 semanas. Valentova y cols. (2008) observaron un efecto benéfico sobre el control de los niveles de glucosa y triglicéridos en sujetos con síndrome metabólico, los cuales ingirieron 2,4 g de yacón por día durante 90 días. Por su parte, Lobo y cols. (2007) observaron una mejora en la absorción de minerales al administrar yacón a voluntad a los sujetos del estudio durante 27 días.

1.6. aGuacate Sinonimias: palta, cura, avocado, petro, abacate familia: Lauráceas Género: Persea Nombre científico: Persea americana

1.6.1. Origen y descripción general Los ancestros silvestres de los aguacates modernos deben haber tenido su origen en el sur de México y Centro América. Sus frutos han sido utilizados como alimento, su madera como fuente de combustible y para la elaboración de herramientas y utensilios caseros, e incluso soportes para casas (Zentmyer, 1991). La evidencia más antigua del consumo de esta fruta data de 10.000 años A.C. y fue encontrada en una cueva localizada en Coxcatlán, Puebla (Mijares y López, 1998). En función de sus lugares de domesticación, se distinguen tres variedades que ordinariamente han sido denominadas: antillana, guatemalteca y mexicana. Así, en el códice florentino se mencionan tres tipos de aguacate descritos como: «aoacatl» que podría tratarse de P. americana var. Drymifolia (raza mexicana), «tlacacolaocatl» como P. americana var. Americana (raza antillana) y «quilaocatl» posiblemente P. americana var. Guatemalensis (raza guatemalteca) (Barrientos y López, 2000). En la época colonial los españoles introdujeron el aguacate a otros países americanos y a Europa. A finales del siglo xix y principios del xx, el consumo de aguacate estuvo basado en la producción de plantas de las razas mexicanas y antillana. Posteriormente con la adopción de técnicas de propagación como el injerto y con el descubrimiento del aguacate «fuerte» comenzó el establecimiento de las primeras huertas. En las décadas de los 50, 60 y 70’s comienza el cultivo de las variedades fuerte, Bacon, Rincón, Zutano y criollos raza mexicana. En 1963 se establecen los primeros viveros comerciales de la variedad Hass con una producción potencial entre 18.000 y 20.000 plantas utilizando yemas certificadas procedentes de Santa Paula California, uSA. El establecimiento de los huertos comerciales de esta variedad se extiende y sustituye en el mercado nacional «fuerte» y otras variedades. Con el incremento de la superficie de la variedad Hass, México es actualmente el mayor productor y consumidor de aguacate en el mundo, en promedio produce 1.145 Ton de aguacate al

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año; este volumen representa aproximadamente el 36% de la producción mundial. El consumo per cápita de aguacate en México aumentó de 3 kg en 1970 a 10 kg en los años 90. México exporta cerca del 5% de su producción anual. Actualmente el aguacate mexicano tiene acceso al mercado estadounidense, Japón y Europa (Mijares y López, 1998).

1.6.2. contenido nutricional En la Tabla 1.6. se muestra el perfil promedio de macro y micronutrientes de la pulpa de aguacate variedad Hass. tabla 1.6. cOmpOsición prOmediO de la pulpa de aGuacate frescO var. hass (hulme, 1971). lOs datOs están referidOs a 100 G de pulpa nutriente Humedad Cenizas Proteínas Grasa (Extracto etéreo) fibra cruda Vitamina C Tiamina (B1) Riboflavina (B2) Niacina Ácido pantoténico Piridoxina (B6) Ácido fólico Vitamina A Calcio Hierro Magnesio fósforo Potasio Sodio Cinc Cobre Manganeso Selenio

contenido 67,40 % 2,03 % 2,85 % 15,10 % 7,20 % 9 mg 0,11 mg 0,12 mg 1,92 mg 0,97 mg 0,28 mg 0,06 mg 612 uI 11 mg 1 mg 39 mg 41 mg 599 mg 10 mg 0,42 mg 0,26 mg 0,23 mg 0,40 mg

Como puede apreciarse, el aguacate es un fruto rico en nutrientes, minerales diversos y vitaminas, una de ellas la piridoxina poco frecuentes en las frutas, ade-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

más con alto contenido en lípidos (Tabla 1.7). Específicamente, la fracción saponificable está compuesta por un aceite rico en ácidos grasos insaturados; el 60% de los ácidos grasos son monoinsaturados, el 20% representa la fracción de poliinsaturados y la fracción restante está constituida por ácidos grasos saturados (Rosales y cols., 2005). tabla 1.7. perfil prOmediO de ácidOs GrasOs de aceite de aGuacate var. hass (rOsales y cOls., 2005) componente Grasa saturada Acido palmítico Ácido esteárico Grasa monoinsaturada Ácido palmitoleico Ácido oleico Grasa poliinsaturada Ácido linoleico (omega-6) Ácido alfalinolénico (omega-3)

contenido / 100 g de aceite 11,6 g 10,9 g 0,66 g 70,6 g 2,6 g 67,8 g 13,5 g 12,5 g 0,95 g

En cuanto a carbohidratos, la pulpa de aguacate cuenta con un perfil especial de monosacáridos y oligosacáridos. Azúcares tales como la nonulosa, octulosa y heptulosa están presentes en la pulpa, también se han identificado disacáridos tales como la manoheptulosa (Sephton y Ritchmeyer, 1966).

1.6.3. propiedades nutracéuticas La peculiar composición de las distintas fracciones del aguacate, particularmente sus lípidos y carbohidratos, le confieren propiedades benéficas para la salud. En principio, el aceite, al igual que el aceite de oliva, rico en ácidos grasos monoinsaturados, ha demostrado que una dieta que incluya aceite de aguacate, comparada con una dieta baja en grasa, tiene la capacidad de reducir los riesgos asociados con la acumulación de colesterol y LDL del plasma, manteniendo niveles adecuados de HDL, reduciendo al mismo tiempo el riesgo de la aparición de enfermedades crónico-degenerativas (Rosales y cols., 2005). Por otro lado, su fracción insaponificable le confiere propiedades contra la osteoartritis (Henrotin y cols., 2001). Por su parte, el perfil de mono y oligosacáridos presentes en la pulpa de aguacate, ha demostrado fortalecer el sistema inmune (Piccirilli y cols., 2011); además, le confiere al aguacate propiedades cosmecéuticas ya que este tipo de azúcares se usa en el tratamiento de dermatitis. En cuanto a fitoesteroles, el aceite de aguacate contiene, en promedio 0,24% de estos (Plaza y cols., 2009), con el perfil que se indica en la Tabla 1.8.

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tabla 1.8. perfil de fitOesterOles en aceite de aGuacate var. hass fitoesteroles β-Sitosterol Campesterol Estigmasterol

porcentaje del total de esteroles 89 10 1

1.7. nOpal y tuna Sinonimias: tuna, nopal, pita, penca, higuera de chumbo, higuera de pala, chumbera familia: Cactáceas Género: Opuntia Nombre científico: Opuntia ficus Indica

1.7.1. Origen y descripción general En México, las hojas o cladodios de la Opuntia, son llamadas, «nopal» y la fruta de la Opuntia, es nombrada «tuna». Se presenta en la mayoría de las regiones áridas y semiáridas, de forma silvestre. Este subgénero opuntia es muy amplio Kiesling (1998) reportó que, con base a documentos históricos, evidencias citológicas y taxonómicas, el nopal que hoy conocemos fue domesticado por los mexicanos hace 9.000 años. Kiesling indicó también que la diversidad de especies en la que se ha dividido a este ejemplar es errónea; concluye que la diversidad de especies provienen de la Opuntia ficus indica (2x) que durante la hibridación natural adquirió una ploidia superior (6x, 8x), con plantas aún más vigorosas, de las que se seleccionaron las de frutos mayores y de mejor sabor. A la llegada de los españoles, este proceso ya se habría realizado. Después del descubrimiento de América los marineros que utilizaban a la O. ficus-indica para prevenir el escorbuto, la introdujeron en España donde, en un inicio, se cultivó como curiosidad en los jardines de la nobleza y, más tarde, se difundió en toda la cuenca del Mediterráneo y posteriormente a Sudamérica, Sudáfrica, Australia, India, etc. En las nuevas ubicaciones, nuevas muestras de especies con espinas y sin espinas, desarrolladas a partir de plantas que mostraron rasgos reliquia de los padres del viejo mundo. Distribuyéndose a través de frutos no aprovechados, o quizás de semillas distribuidas por vía endozooica, ya sea por seres humanos, pájaros u otros animales, se produjo una naturalización en los distintos países donde el clima le permitió crecer libremente. Este proceso debió repetirse en numerosas oportunidades produciendo nuevos centros de diversificación infraespecífica. De este modo, las plantas así nacidas se diferenciaron de las cultivadas. La diferencia más notable es la presencia de espinas y, por la diferente segregación de caracteres, tienen fenotipos y características fisiológicas algo diferentes entre sí. Muy seguramente esto fue así también en toda América. La fácil hibridación entre la O. ficus indica y especies nativas podría interpretarse simplemente como una hibridación entre la forma cultivada y extremos de la especie silvestre. Así pues, se considera que

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esta especie, o grupo de especies, es el resultado de una prolongada selección, con cruzas y retrocruzas que produjeron este alto y homogéneo nivel de ploidía, único en el género.

1.7.2. contenido nutricional El nopal está constituido en mayor proporción por agua, carbohidratos (polisacáridos y monosacáridos), lignina y minerales. La cantidad de lípidos y proteínas es baja y relativamente variable en función de la especie. Los nopales son ricos en vitamina C y carotenos. En la Tabla 1.9. se presentan datos promedio de la composición de tres variedades, reportada por Rodríguez-felix y Cantwell (1988). tabla 1.9.- cOmpOsición prOmediO del cladOdiO de tres variedades de nOpal. lOs datOs están referidOs a 100 G de nOpal frescO nutriente Agua (g) Proteína (g) Lípidos (g) Cenizas (g) fibra cruda (g) Carbohidratos (g) Ac. ascórbico (mg) Carotenos (mg)

O. amyclae 92 1,2 0,2 1,2 1,14 4,2 10,4 18,5

O. ficus-indica 91,5 1,0 0,2 1,2 1,1 4,9 9,8 29,8

O. inermes 91,7 1,0 0,2 1,4 1,2 4,7 17,9 38,4

En cuanto a los polisacáridos, que representan el mayor constituyente, se encuentran la celulosa, las pectinas y los mucílagos. Peña y Sánchez (2006) reportaron que el contenido promedio de pectina de 13 variedades de nopalitos, respecto al contenido total de carbohidratos, fue de entre 5,3 y 14,2%, mientras que el contenido de mucílago fluctuó entre 3,8 y 8,5%. Diversos estudios han demostrado la presencia de polifenoles y flavonoides en diversas especies de nopal. Trabajos recientes reportan actividad antirradical (DPPH) y la presencia de kaempferol e isoramcetina en extractos metanólicos de O. monacatha Haw (Valente y cols., 2010). Por otro lado, Guevara-figuero y cols., en 2010, exploraron la composición proximal y el perfil de polifenoles y flavonoides en dos variedades comerciales y 8 variedades silvestres de nopal. La variedad de nopal blanco de las regiones altas, mostró el mayor contenido de proteína. Las variedades silvestres, mostraron mayor contenido de ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido cumárico, ácido 3,4-dihidrobenzoico, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido ferúlico y ácido salicílico) y las variedades comerciales, mayor contenido de flavonoides (isoquercetina, isoramnetina-3-O-glucósido, nicotiflorina, rutina y narcisina). También se ha examinado el contenido de polifenoles y flavonoides en extractos metanólicos de harina de nopal (Santos-Zea y cols., 2011). Se analizaron 9 muestras

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de harina de nopal elaborada con variedades mexicanas. La variedad O undulata mostró el mayor contenido de polifenoles totales; en cambio, los extractos metanólicos de la variedad O. robusta var Gavia, mostraron la mayor capacidad antioxidante, equivalente a la de arándanos y moras. En cuanto a la composición de la tuna, Hernández-urbiola y cols. (2010), estudiaron el efecto del la edad de la planta sobre contenido de minerales de los frutos (tunas) de Opuntia ficus. Se estudiaron frutos orgánicos cosechados a distintas edades (40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 115, 125 y 135 días). Los datos obtenidos se ilustran en la figura 1.18. EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE MINERALES EN Opuntia ficus indica 80

mg/g de producto

70 60 50 40 30 20 10 0

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Edad en días Potasio

Calcio

Fósforo

figura 1.18. Evolución de potasio, calcio y fósforo en Opuntia ficus indica.

En 2010, figuero y cols., estudiaron el contenido de pigmentos y la capacidad antioxidante de 12 variedades Mexicanas de tuna: Cristalina, Mansa y Vaquera (O. albicarpa), Amarilla Diamante (O. ficus-indica), Mango (O. albicarpa), Amarilla Montesa y Pico Chulo (O. megacantha), Pabellón (O. ficus-indica), Rosa de Castilla y Torreoja (O. megacantha), Cacalote (O. cochinera) y TapónAguanoso (O. robusta var Robusta). El contenido de ácido ascórbico fue superior en Cacalote con 25 mg por cada 100 g de tuna. Los cultivares de tuna blanca y amarilla presentaron más clorofila y la tuna blanca tuvo menos caroteno. El mayor contenido de betacianina y betaxantina se encontró en Tapón Aguanoso y Cacalote. La mayor concentración de fenoles se presentó en Tapón Aguanoso, con fruto púrpura, y Amarilla Diamante y Mango, con fruto amarillo. La capacidad antioxidante fue similar en todos los cultivares. En 2003, Galati y cols. analizaron el jugo de tuna de variedades italianas y determinaron el acido ascórbico y los polifenoles totales. En 2011, analizaron el contenido de ácido ascórbico, pigmentos, taurina y capacidad antioxidante de tres diferentes variedades de tunas rojas que crecen en España (Tabla 1.10)

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos tabla 1.10. piGmentOs, pOlifenOles y capacidad antiOxidante en tres variedades de tuna componente

Ac. ascórbico (mg/100 g fruta) Polifenoles (mg eq, ac. gálico/100 g fruta)

O. ficus indica

O. stricta

O. undulata

18,5

23,30

14,50

218,8

204,40

164,60

Carotenoides (mg β-caroteno eq/100 g fruta)

2,58

4,71

6,68

Betacianinas (mg betanina/100 g fruta)

15,2

80,10

24,60

Betaxantinas (mg indicaxantina /100 g fruta)

25,4

–

17,80

Taurina (mg/100 g fruta)

7,70

6,80

11,22

90

87,5

30,0

Isoramnetina (mg/100 g fruta)

49,4

50,3

9,6

Kaempferol (mg/100 g fruta)

7,8

7,7

5,6

Luteolina (mg/100 g fruta)

8,4

15,6

5,9

Capacidad antioxidante (ABTS)

6,7

5,98

1,58

Capacidad antioxidante (DPPH)

5,22

4,72

1,08

Quercetina (mg/100 g fruta)

1.7.3. propiedades nutracéuticas Se aprecian en el nopal como compuestos bioactivos tanto la fibra como el mucílago. La pectina del nopal disminuye las concentraciones de LDL del colesterol del plasma (fernández y cols., 1992 y 1994). El nopal también tiene efecto antihiperglicémico (Román-Ramos y cols., 1995) y se ha demostrado el control de la diabetes por el extracto purificado del nopal (Trejo-González y cols., 1996; Fernández y cols., 1994). Diversos estudios se han llevado a cabo atribuyéndole potencial para combatir gastritis y ulceras gástricas (Galati y cols., 2002); además, se han observado considerables pérdidas de peso en animales alimentados con fibra de nopal en comparación con otro tipo de fibras (Duque, 1998). Otras propiedades funcionales como la capacidad antioxidante, antiinflamatoria, analgésica, antiulcerogénica, hipoglicémica, diurética, antiviral y la capacidad para disminuir el colesterol son mencionadas por Stintzing y Carle (2005). Respecto a las propiedades tecnológicas, el mucílago en presencia de calcio presenta varios campos de aplicación dependiendo de del nivel de gelificación, teniendo uso potencial en la textura de alimentos y bebidas así como cubiertas plásticas de frutas (Goycoolea y Cárdenas, 2003) Se le puede dar uso como defloculante, clarificante, sustituto de grasa, gelificante bajo en calorías, espesante, emulsificante y películas plásticas comestibles, habiéndose aplicado a la formulación de panes, tortillas, galletas, sopas, dulces y bebidas. En cuanto a la tuna, una de las principales propiedades es la capacidad antirradicalaria (Galati y cols., 2003), gracias al contenido y tipo de pigmentos y sustancias polifenólicas con propiedades antioxidantes. En el aspecto biológico, el consumo humano de antirradicales se asocia con retardo del envejecimiento y coadyuva al control del colesterol, entre otras consecuencias.

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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Por su parte, la variedad Opuntia joconostle, una especie que produce tunas ácidas, muy usadas para la preparación de ensaladas o para preparar cocido de carne con verduras, ha demostrado propiedades hipoglucemiantes. Según las costumbres y medicina tradicional del Altiplano de San Luis Potosí - Zacatecas, la cáscara de esta tuna se utiliza para el tratamiento de la diabetes mellitas. Con este antecedente, PimientaBarrios y cols., (2008), en colaboración con el Hospital Regional 46 del Instituto Mexicano del Seguro Social, realizaron un estudio encaminado a comprobar esta hipótesis. El estudio fue realizado con pacientes sanos y pacientes con diabetes miellitus tipo 2. Después de los tratamientos, se llevaron a cabo determinaciones de glucosa, triglicéridos y colesterol en la sangre de estos pacientes, también se determinó insulina. Los autores concluyen que el consumo habitual de la cáscara del fruto de xoconostle puede ser útil para controlar la glucosa sérica en individuos con DM2. En personas sanas puede coadyuvar a prevenir estados de hiperglucemia y niveles altos de colesterol y triglicéridos, que pueden relacionarse con el síndrome metabólico.

1.8. papaya Sinonimia hispánica: lechosa, frutabomba, ababaya, melón zapote, papaya, mamén, mamón familia: Caricaceae Género: Carica Nombre científico: Carica papaya

1.8.1. Origen y descripción general Es una planta de origen centroamericano, conocida y empleada en toda América desde hace varios siglos, aunque hoy día se cultiva en muchos países de otros continentes, principalmente, en Asia y África. Originaria de los bosques de México, Centroamérica y del norte de América del Sur, la planta de la papaya se cultiva en la actualidad en la mayoría de los países de la zona intertropical del orbe. La planta posee un tronco sin ramas (por lo general solo ramifica si su tronco es herido), de una altura entre 1,8 y 6 m, coronado por follaje en forma palmeada, provisto de largos pecíolos. El mismo conserva en especímenes maduros una textura suculenta y turgente, escasamente leñosa: y presenta numerosas cicatrices características, producto del crecimiento y caída consecutiva del follaje superior. La savia es de consistencia lechosa, y tóxica en estado natural para el ser humano, pudiendo producir irritaciones alérgicas con el contacto con la piel. Esta savia lechosa contiene una enzima muy útil, la papaína, empleada como ablandador de carnes. Las hojas de tipo palmeadas poseen largos pedúnculos y lóbulos, midiendo las hojas hasta 24 cm de diámetro y los tallos alrededor de 61 cm de largo. Los frutos poseen una textura suave y una forma oblonga y pueden ser de color verde, amarillo, naranja o rosa, pudiendo pesar entre 500 y 600 g. La talla de los frutos disminuye en función de la edad de la planta. Los frutos y las flores se desarrollan en racimos justo debajo de la inserción de los tallos de las hojas palmeadas. No es exigen-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

te en cuanto a suelos, pudiendo desarrollarse en cualquier terreno. Es una especie más productiva con relación a su tamaño ya que siempre tiene flores y frutos al mismo tiempo. El desarrollo de los frutos produce la caída de las hojas inferiores, por lo que quedan siempre al descubierto por debajo de las hojas. La especie presenta dioecia naturalmente, pero la selección artificial ha producido especímenes hermafroditas. Los indígenas de la amazonia boliviana y brasileña utilizan esta especie: las hojas frescas o secas en infusión para la digestión y también como vermífugo; mientras que las flores se toman en infusión para la bronquitis. El jugo lechoso de los frutos verdes mezclados con las semillas molidas es utilizado como vermífugo o tenífugo. Las especies silvestres de papaya son árboles pequeños y arbustos, con las hojas casi siempre dispuestas hacia el ápice del tallo principal, las flores masculinas se desarrollan en una planta y las femeninas en otra (dioicas) Los frutos son pequeños comparados con los frutos de la especie cultivada y suelen ser aromáticos con sabores dulces y algunos maduran colores muy llamativos. Son consumidos por diferentes comunidades de Bolivia, pero nunca directamente. Antes de consumirse se elimina el látex presente en toda la planta, que suele ser aprovechado por la industria de la carne y la cerveza como fuente de papaína, enzima muy utilizada para el ablandado de carne.

1.8.2. contenido nutricional En la Tabla 1.11 se muestra la composición de la papaya; su valor energético es de 90 kcal por cada 100 g. La papaya contiene un 88% de agua. Su contenido en nutrientes energéticos es bien reducido, tanto en hidratos de carbono (8%), como en proteínas (0,61%) o en grasas (0,14%). La mayor parte de sus hidratos de carbono está formado por los azúcares sacarosa, glucosa y fructosa. Destaca, sin embargo, el contenido vitamínico de la papaya: 100 g de pulpa aportan el 103 % de las necesidades diarias de vitamina C, y el 18% de las de vitamina A, para un adulto. Las vitaminas del grupo B están también presentes, aunque en pequeñas cantidades excepto los folatos, de los que contiene 38 μg/100 g. En cuanto a minerales, la papaya es rica en potasio (257 μg/100g), y contiene cantidades apreciables de calcio, magnesio, fósforo y hierro. La pectina (fibra vegetal de tipo soluble) esta presente en la proporción de 1,8%. La papaína es una enzima proteolítica (que deshace las proteínas), similar a la pepsina contenida en el jugo gástrico. Se encuentra sobre todo en las hojas del árbol y en látex que mana de los frutos verdes, pero es escasa en el fruto maduro.

1.8.3. propiedades nutracéuticas El fruto de esta especie es fácil de digerir, y, además contribuye a facilitar el paso de otros alimentos por el conducto digestivo. La papaya contribuye a neutralizar el exceso de acidez gástrica, y su consumo resulta beneficioso en caso de úlcera gastroduodenal, hernia de hiato y pirosis (acidez de estómago), también es utilizada en la dispepsia biliar y pancreatitis crónica: resulta muy aconsejable para tonificar todos los procesos digestivos y ser muy baja en grasas.

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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tabla 1.11. cOmpOsición prOmediO de papaya (pamplOna, 2004). valOres referidOs a 100 G de fruta fresca nutriente Proteínas

contenido 0,610 g

Hidratos de carbono

8,01 g

fibra

1,80 g

Grasa Total

0,140 g

Vitamina A

0,328 mg

Vitamina B1

0,027 mg

Vitamina B2

0,032 mg

Niacina

0,471 mg

Vitamina B6

0,019 mg

Vitamina C

61,8 mg

Calcio

24,0 mg

fósforo

5,00 mg

Magnesio

10,0 mg

Hierro Potasio

0,100 mg 257 mg

Cinc

0,070 mg

Sodio

3,00 mg

En las afecciones intestinales su acción suavizante sobre las mucosas digestivas y antiséptica, la hace útil en caso de gastroenteritis y de colitis de cualquier tipo: infecciosa, ulcerosa, espática (colon irritable). Investigaciones llevadas a cabo en el Japón, muestran que la papaya, especialmente cuando no está completamente madura, ejerce una acción bacteriostática (que impide el desarrollo de bacterias) y también otros gérmenes enteros patógenos causantes de infecciones intestinales. Es, pues, un alimento muy recomendable en los casos de diarrea infecciosa. El látex de la papaya y en menor proporción la pulpa, ejercen una acción antihelmíntica y vermífuga contra los parásitos intestinales, especialmente las tenias. Por su riqueza en provitamina A, la papaya forma parte de la dieta recomendada para las enfermedades de la piel como eccemas, furunculosis y acné.

1.9. aGave Sinonimia: mezcal, maguey familia: Agavaceae Género: Agave Nombre científico: Agave tequilana

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1.9.1. Origen y descripción general El término Agave es de origen griego «Agavos» y significa admirable. Linneo describió por primera vez la familia Agavacea en 1753, siendo Agave americana la primera especie caracterizada (Gentry, 1982). El género Agave contiene en promedio cerca de 200 especies, de las cuales 75 % se encuentran en México, que es considerado como el centro de origen evolutivo de la planta (Eguiarte y cols., 2000; García-Mendoza, 2002). Los agaves son en general plantas herbáceas, suculentas con hojas fibrosas organizadas en espiral formando una roseta, las hojas contienen normalmente espinas en el borde. En el caso de Agave tequilana weber var. Azul, su producción se realiza de dos maneras: sexual y asexual. La primera con la formación de la inflorescencia después de 8 a 12 años, la segunda a partir de la formación de plántulas a partir de los rizomas llamados hijuelos. Estos son separados de la planta madre y son trasplantados directamente en tierra para la generación de los cultivos. De manera natural las plantas de agave se desarrollan en regiones áridas y semiáridas de México. Algunas de ellas son cultivables, Agave tequilana Weber var. Azul es la especie con las mayores extensiones cultivadas, localizadas en una zona con denominación de origen, principalmente en el estado de Jalisco. fisiológicamente las plantas de agave presentan un metabolismo de tipo ácido-creasuláceas (CAM), el cual se caracteriza por una disminución de la transpiración con la apertura de los estomas durante la noche, que es cuando disminuye la temperatura, permitiendo una disminución de la evaporación (Santamaría y cols., 1995; Nobel y Linton, 1997). Los principales productos de la fotosíntesis son los fructanos (Sánchez-Marroquin y Hope, 1953; Alvárez de la Cuadra, 1996). Estas moléculas son principalmente acumuladas en el corazón de la planta (Wang y Nobel 1998), cuyo tamaño cambia en función de la edad (Arrizón y cols., 2010). En México, la utilización de los agaves para la elaboración de bebidas es una tradición ancestral desde la época prehispánica hasta nuestros días. El consumo de bebidas a base de agave ha tenido un uso ceremonial en diferentes comunidades indígenas del país, este consumo subsiste actualmente en algunas comunidades todavía (Bruman, 2000). Las bebidas derivadas de agave se pueden clasificar en dos grandes grupos, las bebidas no-destiladas como el pulque, donde la savia de la planta es colectada y fermentada con un gran número de bacterias y levaduras participando. El otro grupo está constituido por las bebidas destiladas, donde normalmente los fructanos se hidrolizan por cocimiento para producir un jugo rico en fructosa, el cual es posteriormente fermentado y destilado generando una amplia gama de aguardientes incluyendo el tequila. A continuación se describen las principales bebidas destiladas producidas en México así como las especies de agave utilizadas (Tabla 1.12).

1.9.2. moléculas encontradas en agaves Los agaves en general se caracterizan por acumular fructanos, con la particularidad de ser la fuente la fuente industrial mayoritaria de fructanos ramificados, en especial de la planta A. tequilana cuya producción se encuentra en el orden de millones de toneladas. La estructura de los fructanos de Agave tequilana var. Azul fue por primera vez descrita por López y cols. (2003), mostrando ser una mezcla compleja de moléculas de la familia de los fructanos neo-series, la cual está constituida por

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

51

elongaciones β (2→1) y β (2→6) con puntos de ramificación y una molécula de glucosa interna (fig. 1.19), es posiblemente en este sitio donde comienza la síntesis de fructanos a partir de neo-kestosa (Saldaña-Oyarzábal y cols., 2009). tabla 1.12. especies de aGave utilizadas y reGiOnes de prOducción de diferentes bebidas destiladas y nO destiladas de méxicO de acuerdO a lappe-Oliveras y cOls. (2008) y narváez-zapata y cOls. (2010) Pulque

bebida

especie de agave Agave atrovirans, A.mapisaga, A. pomorium

Tequila

A. tequilana

Mezcal de San Luis Potosi Mezcal de Tamaulipas Mezcal de Zacatecas Mezcal de Michoacán Mezcal de Oaxaca

A. salmiana

Mezcal de Durango Mezcal de Guerrero Mezcal de Yucatan Raicilla Bacanora

A. salmiana A. tequilana, A. salmiana. A.cupreata, A. inaequides. A. angustifolia, A. americana var. oaxaquencis, A. karwinskii, A. marmorata, A. potatorum, A. rhodacanta. A. duranguensis A. cupreata A. fourcroydes A. angustifolia, A. inaequidens, A. maximiliana. A. angustifolia

regiones de producción Centro-Norte de México (San Luis Potosí, Zacatecas, Queretaro, Hidalgo, Tlaxcala, Estado de México, D.f., Puebla, Guanajuato). Centro-oeste y Noroeste de México (Jalisco, Nayarit, Michoacán, Tamaulipas, Guanajuato). Centro-norte de México (San Luis Potosí) Noreste de México (Tamaulipas). Centro-norte de México (Zacatecas) Centro-oeste de México (Michoacán). Sur de México (Oaxaca)

Centro-norte de México (Durango) Sur de México (Guerrero). Sureste de México (Yucatan). Centro-oeste de México (Jalisco). Noroeste de México (Sonora).

figura 1.19. Estructura general de los fructanos de Agave (Lopez y cols., 2003).

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Estas estructuras pueden tener algunas variaciones entre diferentes especies de Agave (Mancilla-Margalli y Lopez, 2006), e incluso dentro de una misma especie pueden existir variaciones en la estructura y composición en función de la edad de la planta (Arrizon y cols., 2010). En las Tablas 1.13 y 1.14 se muestran las variaciones de morfología y de composición general de azúcares encontrados en plantas de A. tequilana de diferente edad. tabla 1.13. mOrfOlOGía y cOntenidOs de azúcar de plantas de A. tequilana de diferentes edades (arrizOn y cOls. 2010)

edad (años) 2 4 6½

morfología diámetro de la peso de la piña (cm) piña (Kg) 18,0 ± 0,5 4,51 ± 0,2 86,1 ± 2,3 32,6 ± 1,3 125 ± 3,6 90,9 ± 0,8

contenido de azúcares (g azúcar/kg agave) azúcares azúcares totales libres fructanos 42,7 ± 1,2 14,9 ± 0,8 27,75 ± 1,1 90,4 ± 0,94 5,1 ± 0,64 85,27 ± 0,75 126,8 ± 1,3 2,96 ± 0,43 123,8 ± 0,87

tabla 1.14. pOrcentaje de azúcares determinadOs pOr hplc de plantas de A. tequilana de diferente edad (arrizOn y cOls., 2010) edad (años) 2 4 6½

fructosa (%) 15,12 ± 0,003 0,91 ± 0,018 0,79 ± 0,005

Glucosa (%) 13,53 ± 0,001 0,49 ± 0,024 0,58 ± 0,005

sacarosa (%) 1,75 ± 0 0,675 ± 0.91 0,74 ± 0.003

fructanos (%) 68,8 ± 0,37 97,1 ± 1,58 93,7 ± 0.5

Aparte de acumular fructanos, los cuales son la materia prima de partida para la producción de bebidas fermentadas y destiladas, las especies de agave son una fuente de saponinas esteroidales como se muestra en la Tabla 1.15; muchas de ellas son glucosiladas.

1.9.3. propiedades nutracéuticas Algunos productos directos del Agave, tales como el «agua miel», son por si mismos alimentos funcionales debido a su composición, ya que se ha encontrado que son una rica fuente de aminoácidos esenciales, vitaminas y neurotransmisores (Ramírez y cols., 2004; Ortiz-Bazurto y cols., 2008). El «agua miel» se obtiene de la sabia recolectada del corazón de los agaves aun estando vivas las plantas, los agaves utilizados para este propósito corresponden normalmente a las especies Agave atrovirans, A.mapisaga, A. pomorium. El «aguamiel» constituye el mosto principal del cual se obtiene el «pulque» por fermentación, esta bebida fermentada podría ser considerada como otro alimento funcional, debido a su gran cantidad de microorganismos probióticos del genero Lactobacillus y Leuconostoc (Lappe y cols., 2008). En muchas comunidades rurales de México, tanto el «aguamiel» como el «pulque» constituyen alimentos indispensables de alto valor nutricional (Lappe y cols., 2008).

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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tabla 1.15. principales sapOninas encOntradas en diferentes especies de aGave saponina Saponina espirostanosídica Yuccagenina, diosgenina. Saponina furostanol-bisdesmosídica. Agabrittonósidos, karataviósido A. Saponina espirostánica

especie de agave Agave macroacantha A. brittoniana

referencia Eskander y cols., 2010 Guerra y cols., 2008. Da Silva y Parente, 2007

A. shrevei

Clorogenina-hexasacárido

A. fourcroydes

Macias y cols., 2007, Da Silva y cols., 2006. Ohtsuki y cols., 2004.

Saponina espirostanica

A. attenuata

Mendes y cols., 2004.

Saponina monodesmosidicaespirostanosidica, saponina bisdesmosidica furanostanolglicosidica Saponina espirostanolbisdesmosídica. Saponina furostanlica

A. iophantha

Abdel-Khalik y cols., 2002

A.americana

Yokosuka y cols., 2000.

A. sisalana

Zou y cols., 2006

Los fructanos de agave tienen diferentes propiedades lo que los hace interesantes para su utilización como ingredientes en la elaboración de alimentos funcionales. Lopez y urias-Silvas (2007) encontraron un efecto prebiótico de fructanos de diferentes especies de agave con los microorganismos Lactobacillus casei y Bifidobacterium breve. Posteriormente urías-Silvas y cols. (2008) mostraron que en ratas alimentadas con fructanos de A. tequilana presentaron una disminución del peso corporal, los mismos fructanos de A. tequilana mezclados con Raftilosa P95 (derivado de inulina de chicoria) en la dieta incrementaron la producción del péptido glucagon (GLP-1), el cual es responsable de regular el apetito. Posteriormente Gomez y cols. (2010) encontraron un aumento en la producción de ácidos orgánicos y en la población celular de las bifidobacterias y lactobacilos con fructanos de A. tequilana de una manera comparable con inulina de achicoria. Posteriormente, en experimentos clínicos en humanos, MinjarezIbañez y cols. (2010) encontró que los fructanos de A. tequilana activan la expresión de la molécula β-defensina-2, la cual está involucrada en la regulación del sistema inmunológico. Los fructanos de A. tequilana modificados también tienen propiedades interesantes, Starbid y cols. (2007) encontraron la forma de acetilarlos químicamente, estos a su vez pueden ser unidos a fármacos y transportarse de manera específica al colon, por lo que pueden usarse como trasportadores o vehículos de fármacos. Los agaves son considerados también como una fuente de fibras comerciales y a sus extractos se le atribuyen propiedades medicinales en la medicina tradicional china por sus propiedades antitumorales, contra la disentería, como insecticidas (Hocking, 1997) y antimicrobianas (Guerra y cols., 2008). En las zonas semi-áridas en México las hojas de A. salmiana se han utilizado como forraje para la alimentación

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

de animales (Pinos-Rodríguez y cols., 2009); sin embargo la dosis debe ser regulada, debido al contenido de oxalato de calcio (franceschi y Nakala, 2005) y de saponinas, las cuales tienen efectos irritantes y antinutricionales (francis y cols., 2002). Esta desventaja depende de la fuente de saponinas, ya que por ejemplo las saponinas de A. americana mostraron actividad antiinflamatoria (Peana y cols., 1997). En general, las agaváceas son una fuente rica de sapogeninas y saponinas, las cuales son precursoras de la síntesis de hormonas esteroidales (Hostettmann y Marston, 1995), lo cual las hace biotecnológicamente interesantes.

1.10. GarambullO y pitaya El garambullo y la pitaya, además de la tuna, crecen de manera silvestre o en forma de cultivos (en menor proporción) en las regiones semiáridas de México. En los últimos años han cobrado interés ya que producen frutos comestibles y son resistentes a la sequía (Pimienta-Barrios y Nobel, 1994). Estas especies forman parte de la dieta local y representan una alternativa para dinamizar la economía de dichas regiones, tan castigadas por la crisis económica.

1.10.1. Garambuyo Sinonimias: Garambullo, Mirtilocactus, Padrenuestro, Quisco familia: Cactaceae Género: Myrtillocactus Nombre científico: Myrtillocactus geometrizans

1.10.1.1. Origen y descripción general La especie alcanza hasta 4 m de altura y es casi arbórea en su hábitat natural. El tronco está bien definido y ramificado con brazos curvados hacia arriba; sin embargo, las plantas en cultivo obtenidas mediante esqueje, no desarrollan tronco y ramifican desde la base dando lugar a tallos de color verde azulado y pruinoso, de entre 6 y 10 cm de diámetro. El garambullo cuenta con 5 ó 6 costillas agudas con piel lisa y fina. Las areolas grandes están separadas entre sí 1,5-3 cm. Posee de 5 a 9 espinas radiales dispuestas en estrella; miden 2 a 10 mm de longitud. Las flores nacen en grupos de 5 a 9 a partir de cada una de las areolas de la parte más alta de las ramas; son pequeñas (2 a 3,5 cm diámetro) y perfumadas, cáliz corto y una fila de pétalos blancos y desplegados. Los frutos miden entre 1 y 2 cm, son globosos y azulados. Son comestibles y en México se consumen frescos o secos.

1.10.1.2. Contenido nutricional De acuerdo a lo reportado por Guzmán-Maldonado y cols. (2010), la composición promedio se muestra en la Tabla 1.16. La Tabla 1.17 recoge el contenido en pigmentos y vitaminas de esta especie.

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico A

55 B

C

figura 1.20. Garambullo: (A) Myrtillocactus geometrizans; (B) flores; (C) frutos. tabla 1.16. cOmpOsición prOmediO en macrO y micrO nutrientes de GarambullO. lOs valOres están referidOs a 100 G de GarambullO frescO componente Proteína fibra

contenido 0,71-0,87 % 3,5-3,6 %

Sólidos solubles

3,07-3,45 %

Extracto etéreo

0,61-0,69 %

Carbohidratos

10,4-10,6 %

Acidez titulable pH K

1,2-1,31 % 3,8-3,9 19,4-23,4 mg

Ca

4,3-5,5 mg

Mg

2,6-3,5 mg

fe

3,5-4,1 mg

Mn

5,3-6,9 mg

P

1,54-1,9 mg

S

1,38-1,9 mg

Zn

0,96-1,28 mg

Cu

0,29-0,32 mg

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

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tabla 1.17. cOntenidO de piGmentOs y vitaminas en GarambullO componente fenoles solubles Taninos condensados Ácido ascórbico Betaninas Bulga-xantinas Acido cafeico Ácido gálico Vainillina

concentración 9,1-10,5 g/kg 1,2-2,9 g/kg 226-497 mg/kg 29,5-36,9 mg/kg 2,4-2,9 mg/kg 8,35-9,47 mg/kg 18,8-25 mg/kg 5,3-6,6 mg/kg

1.10.1.3. Propiedades nutracéuticas Respecto a sus propiedades nutracéuticas se ha reportado que el Myrtillocactus posee actividad antioxidante. Guzmán-Maldonado y cols. en 2010, reportaron algunos valores de actividad antioxidante y observaron diferencias significativas en frutas provenientes de 4 diferentes estados de la república Mexicana (Guanajuato, Querétaro, Hidalgo y San Luis Potosí), siendo los garambullos cosechados en Guanajuato los que mostraron mayor capacidad antioxidante. Al parecer, hasta el momento, no se han realizado estudios in vivo para evaluar el efecto de estas propiedades antioxidantes sobre humanos o animales. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE GARAMBULLO MEXICANO

Milimoles Equivalentes de TEAC/K

40

32 Garambullo de Guanajuato 24

16 Garambullo de Hidalgo 8

Garambullo de San Luis Potosí

Garambullo de Guanajuato

0 Procedencia del Garambullo

figura 1.21. Actividad antioxidantes de garambullo de cuatro regiones de México (Guzmán-Maldonado y cols., 2010).

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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1.10.2. pitaya Sinonimias: pitaya, pitayo, canelón familia: Cactaceae Género: Stenocereus Nombre científico: Stenocereus queretaroensis

1.10.2.1. Origen y descripción general Los pitayos son especies de cactus arborescentes columnares originarios de las regiones semiáridas de México. Pertenecen a la tribu Pachycereae, familia Cactoideae. Constituido en general por un tronco sólido, ramificado, llega a medir 8 m de altura. Los tallos cilíndricos generalmente tienen alrededor de ocho costillas prominentes y un diámetro de 13-18 cm en la madurez.

figura 1.22. Pitaya, Stenocereus queretaroensis.

Las flores crecen en las areolas a lo largo de la mitad superior de una rama, son 10-14 cm de largo, y son de color rojizo con un interior de color blanquecino La fruta (Pitaya) varía de globosos a ovoides, 6-8 cm de longitud y 60 a 160 g (50 a 120 g de pulpa). La pulpa es dulce y puede ser amarilla, blanca, roja o solferino. La fruta madura se recoge desde fines de abril hasta principios de junio. El rendimiento de la fruta aumenta con la edad de la planta pitayas (Pimienta-Barrios y cols., 2004). Las especies más cultivadas son S. queretaroensis, S. grisseus (Haworth) Buxbaum, S. stellatus (Pfeiffer) Riccobono, y S. fricii en ese orden. Stenocereus queretaroensis crece principalmente en los estados de: Jalisco, Colima, Guanajuato, Michoacán, Querétaro y Zacatecas. Sayula Jalisco es una de las regiones de mayor producción de la variedad queretaroensis, ahí se cultivan mas de 1000 ha. Stenocereusfricii es más común en las costas y planicies de Planicies de Jalisco y Michoacán. Por su parte, Stenocereus griseus y Stenocereus stellatus crecen en la región de Puebla y Oaxaca. Particularmente, Stenocereus griseus cubre una amplia región, abarca también los estados de San Luis Potosí, Tamaulipas, Veracruz; algunos autores consideran que esta variedad tuvo su origen en Venezuela y las Antillas.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

figura 1.23. Regiones de México en las que crece Stenocereus (Pimienta-Barrios y Noble, 1994).

1.10.2.2. Contenido nutricional figueroa-Sumano y cols. (2010) reportan datos sobre rangos de nutrientes en las pitayas, a continuación se muestran los contenidos de ellos en la Tabla 1.18. tabla 1.18. cOmpOsición prOmediO de pitaya (fiGuerO-sumanO y cOls., 2010) componente Humedad Proteína (Base seca) Cenizas totales Grasa (Base seca) Acido ascórbico °Bx

pH

contenido 82-85% 8-10% 3,4-5 % 0,9-1,2 % 8-21 mg/100 g de fruta 6,7-8,0 4,3-5,8

1.10.2.3. Propiedades nutracéuticas Según la tradición, las variedades thurberi y gumosus, son utilizadas para el tratamiento de la caspa y de la sarna, respectivamente. Sobre las variedades queretaroensis y griseus, que son las más utilizadas como fruta, no se ha reportado algún uso medicinal, funcional o nutracéutico; sin embargo, su contenido de betalainas podría sugerir algún efecto derivado de su capacidad antioxidante.

Especies iberoamericanas con potencial nutracéutico

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1.11. pasiflOráceas Sinonimias: pasionaria, granadilla, flor de la pasión, granada china Familia: Pasifloraceae Género: Passiflora Nombre científico: Passiflora edulis, Passiflora quadrangularis, Passiflora ligularis, Passiflora laurifolia, Passiflora mollisima

1.11.1. Origen y descripción Los andes es el centro de origen de muchas especies de Pasiflora, la mayoría de ellas son usadas localmente por sus frutos comestibles. Originaria de la zona amazónica del Brasil, se cultiva en muchos lugares del mundo que poseen un clima tropical o subtropical. A partir de ella derivan una serie de variedades. Las pasifloráceas son en su mayoría plantas trepadoras, provistas de zarcillos con flores complejas en las cuales destaca un órgano típico, la corona, que esta formado por apéndices filiformes y coloreados. Los frutos son todos del tipo baya, en su mayoria comestibles. Existen más de 460 especies del genero Passiflora y mas de 20 especies con frutos comestibles, de las cuales la mitad son sembradas por sus frutos y solo cinco son cultivadas comercialmente a escala mundial o regional (P. edulis, P. quadrangularis, P. ligularis, P. laurifolia, P. mollisima). Entre todas ellas, destaca la Passiflora edulis, que, como su nombre indica, se utiliza principalmente por sus frutos comestibles y la que se reconoce generalmente como auténtica Maracuyá. Comprende una serie de lianas trepadoras que crecen en estado natural en las regiones subtropicales de América. Las más reconocidas son: – maracuyá amarillo: (Passiflora edulis f. flavicarpa): Necesita de zonas tropicales para ser cultivada con unas temperaturas constantes y elevadas. Es más resistente a las enfermedades y produce mucho más que otras variedades. Se cultiva fundamentalmente en Sudamérica, Hawai y Australia. – maracuyá púrpura (Passiflora edulis f. edulis). Crece bien en zonas templadas. Suele cultivarse preferentemente en otras zonas de África y la India. A

B

figura 1.24. fruto de: (A) Passiflora edulis; (B) Passiflora quadrangularis.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Otras especies de Maracuyá también cultivadas aunque con un valor alimenticio inferior o una producción menos interesante son: – Granadilla (Passiflora incarnata). Posee frutos de color amarillo que se vuelven naranja al madurar. Al ser menos dulce, se utiliza para la confección de mermeladas, dulces o bebidas en las que se añade azúcar. La planta seca se utiliza en medicina natural para el tratamiento del insomnio y para el tratamiento de problemas nerviosos del estómago. – tumbo gigante, granadilla grande o badea (Passiflora quadrangularis). Es una de las maracuyás más vigorosas, pudiendo alcanzar los 20 metros de altura. Se caracteriza por producir los frutos más grandes, existiendo ejemplares de hasta 15 cm de longitud por 30 cm de diámetro. Al igual que la especie anterior, es poco dulce, por lo que se utiliza para hacer mermeladas o dulces. Los frutos verdes pueden consumirse como verdura. Es muy rica en vitamina A, vitamina C y minerales, como hierro, fósforo y calcio, pero destaca por ser reconocida como la planta que posee un contenido más elevado de vitamina B3 (niacina). La raíz es venenosa y se utiliza para eliminar los gusanos intestinales. En su composición se ha descubierto serotonina, un potente neurotransmisor, necesaria para el buen estado del sistema nervioso y cuyas deficiencias son responsables de patologías como la depresión, ciertos tipos de obesidad, comportamientos obsesivos, insomnio, migrañas, etc. – maracuyá naranja (Passiflora laurifolia). Es una de las menos conocidas. Produce frutos de unos 8 cm de longitud de color naranja-amarillento, que contienen una pulpa de color blanco rosado, muy jugosa y ligeramente ácida muy rica en vitamina B5 (ácido pantoténico) Con este jugo se realizan estupendas bebidas. Muchas veces se utiliza para saciar la sed. Para ello se realiza un pequeño agujero en uno de los extremos y, a través de él, se absorben su líquido. – maracuyá dulce, ouvaca (Passiflora alata). Se caracteriza por producir flores muy vistosas de color rojo y forma estrellada. Produce frutos muy grandes y muy escasos, por lo que resultan muy apreciados. – Passiflora antioquensis. Se caracteriza por ser una de las plantas de este género que produce las flores más largas y los frutos más deliciosos. Crece en estado natural en las selvas de Colombia donde son polinizadas por los colibríes. Sus flores y sus frutos cuelgan de largos pedúnculos. Es una planta muy rara y difícil de encontrar, que muy pocas veces se puede encontrar cultivada. – flor de la pasión (Pasionaria caerulea). Natural de Centroamérica, aparece como planta cultivada en numerosos jardines de clima cálido por su capacidad para aguantar temperaturas más bajas que la mayoría de las plantas de este género. La flor de la pasión es la planta de este género que más se utiliza en medicina natural. – Passiflora laurifolia. Natural de Colombia y Perú, con fruto amarillo de hasta 8 cm y flores con pétalos rojizos por un lado y verdosos por el otro. Al igual que la Passiflora quadrangularis, sus raíces sirven para realizar decocciones con las cuales se eliminan los gusanos intestinales. – Pasionaria mollissima. Produce frutos muy tempranos.

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1.11.2. contenido nutricional Las Tablas 1.19 y 1.20 recogen la composición del fruto del maracuyá y de la fruta de la pasión. Los contenidos energéticos de estas dos frutas son 60 kcal y 97 kcal por cada 100 g, respectivamente. tabla 1.19. cOmpOsición prOximal, mineral, vitaminas hidrOsOlubles y lipOsOlubles del frutO del maracuyá. lOs datOs cOrrespOnden a cada 100 G de fruta fresca nutriente

contenido

Humedad

84,9 g

Proteína

1,5 g

Lípidos

0,5 g

Carbohidratos

12,4 g

Cenizas

0,7 g

Cenizas

0,1 g

Tiamina

0,01 mg

Riboflavina

0,17 mg

Niacina

0,80 mg

Vitamina C

20,00 mg

Vitamina A

173 Equivalentes retinol

Calcio

9,00 mg

Hierro

1,70 mg

fósforo

21,00 mg

1.11.3. propiedades nutracéuticas Passiflora edulis posee un alto contenido de carotenoides, esenciales para el metabolismo, crecimiento y para el buen funcionamiento del organismo. Además es una fuente de proteínas, carbohidratos, minerales y grasas. Tiene un valor energético de 78 kcal, compuesto por carbono, fósforo, hierro, vitamina A, vitamina B2, vitamina C. Baja la presión arterial, se utiliza como tranquilizante. Tiene además un uso medicinal, con el zumo, la pulpa y la infusión de las hojas de maracuyá pueden ayudar a que la persona se relaje, en algunos casos como un sedante para dolores musculares si desea dormir con facilidad por las noches, se toma una infusión al día. Además se debe tomar en cuenta que ciertas especies de flor tienen efectos alucinógenos. Pero si es el caso de cólicos menstruales, es preferible que se siga una prescripción medica para evitar algún daño secundario.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos tabla 1.20. cOmpOsición de la fruta de la pasión (WenKam y millar, 1965). lOs datOs cOrrespOnden a cada 100 G de parte cOmestible cruda nutriente Proteína fibra Carbohidratos Grasa total Vitamina A Vitamina B2 Niacina Vitamina B6 folatos Vitamina C Vitamina E Calcio Hierro Magnesio Potasio fósforo Sodio

contenido 2,2 g 10,4 g 13,0 g 0,7 g 70 Equivalentes retinol 0,13 mg 1,50 mg 0,10 mg 14,0 μg 30,0 mg 1,12 mg 12,0 mg 1,60 mg 29,0 mg 384 mg 68,0 mg 28,0 mg

1.12. CApsiCum Sinonimias: ajís, bixo, bolas, chil, chile verde, chile (fruto), chiles, chili del pico, coralé, corneta, cornetas, cornicabra, cápsico, cuerno de cabra, guinda, guinda de tomatillo, guinda nora, guindilla, guindilla picante, guindillas, guindillas churrusconas, guindillera, guindo, guindo de tomatillo, morrones, ñoras, paprica, piconas, picudillos, piilla picante, pimentero, pimentón, pimentón dulce, pimentón picante, pimienta, pimienta de Indias, pimiento, piperitis, siliquastro familia: Solanaceae Género: Cápsicum Nombre científico: Capsicum spp

1.12.1. Origen y descripción general Los ajíes, chiles o pimientos pertenecen al Género Capsicum. Son generalmente de color naranja, amarillo, rojo o morado. Tienen un fuerte sabor picante al comerlo y por tanto son muy utilizados para preparar diversos platos y resaltar el sabor de los alimentos. Capsicum es un género americano de plantas angiospermas, dicotiledóneas de las regiones tropicales y subtropicales de América, que comprende a los ajís,

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chiles, guindillas o pimientos pertenecientes a la familia de las solanáceas. Tiene una importancia sobresaliente desde el punto de vista cultural y económico. Conocido desde el inicio de la civilización en el Hemisferio Occidental, ha sido parte complementaria en la dieta humana desde cerca de 7500 A.C El género Capsicum incluye 5 especies domesticadas y más de 20 especies silvestres. Los Capsicum han sido domesticados por nativos ancestrales en diferentes partes de Sudamérica y Centroamérica siendo estas especies: C annuum L., C bacatum L., C chínense, C frutences L. y C pubescens. El nombre asignado derivaría del latín capsula, «caja», en alusión a que las semillas están encapsuladas en una especie de caja, o del griego kapto, que significa «picar». El famoso fruto es clasificado como una baya.

Figura 1.25. Diagrama filogenético del género Capsicum.

1.12.2. sinonimias iberoamericanas El fruto de Capsicum se conoce de distintas maneras en Iberoamérica dependiendo del país y del lenguaje que se hable dentro de una región de ese país. Asi tenemos que en México existen varios nombres «Itz» en huasteco, «Chac-ic» o «Maxic» en Maya, «Chilli» en Nahuatl, y «Ng-i» en Otomi, en Bolivia «ullupica», «Locoto», «Pimenton» y también «Arivivi». En Perú puede ser «huayca» y «uchu» en Brasil «Auija» y «quiya» en Chile «tapi», en Arawak es «Ají» (Axí, Agí o Achí) este ultimo nombre también se utiliza en varios lugares de iberoamérica. Son muchas especies hasta ahora descubiertas, la tabla 1.21 muestra la sinopsis de Genero Capsicum y su distribución en el Nuevo Mundo; en la lista mencionan además algunas especies descubiertas a partir de la lista oficial de UN/FAO (1983).

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos tabla 1.21. sinOpsis de GenerO Capsicum y su distribución en américa especie

distribución en el nuevo mundo

C annuum L.

Norte de Colombia hasta sud de EEuu

C. baccatum

Argentina, Bolivia, Brasil, Paraguay, Peru

C. buforum A.T. Hunz.

Brasil

C. campylopodium Sendt.

Brasil (sud)

C. cardemaseii Heiser & Smith

Bolivia

C. chacoense A.T. Hunz.

Argentina, Bolivia, Paraguay

C. chinense Jacq.

Latinoamerica

C. coccineum A.T. Hunz.

Bolivia, Perú

C. cornutum A.T. Hunz.

Brasil (sud)

C. dimorphum O.K.

Colombia

C. dusenii Bitter

Brasil (sud)

C. eximium A.T. Hunz.

Argentina, Bolivia

C. galapagoensis A.T. Hunz.

Islas Galápagos

C. geminifolium A.T. Hunz.

Colombia, Ecuador

C. hookerianum O.K.

Ecuador

C. lanceolatum Morton & Standley

Guatemala, Honduras Mexico

C. leptopodum O.K.

Brasil

C. minutiflorum Hunz

Argentina, Bolivia, Paraguay

C. mirabile Mart. Ex Sendt

Brasil (sud)

C. parbifolium Sendt.

Brasil (norte), Colombia, Venezuela

C. praetermissum Heiser & Smith

Brasil (sud)

C. pubescens R & P.

Latinoamerica

C. schottianun Sendt.

Argentina, Brasil (sud), Paraguay

C. scolnikianum A.T. Hunz.

Perú

C. tovarii nom. Nud.

Perú

C. villosum Sendt.

Brasil (sud)

1.12.3. breve descripción de las principales variedades de Capsicum C. annuum L. Corola blanca, flores: una por nudo. Frutos variados por color y forma. No picantes o dulces. Cultivares: páprika, pimiento.

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C. baccatum L. Con bayas; Corola blanca, pequeña. fruto variado en forma. Cultivares: Limo. C. pendulum Willd (C. peruvianum Haz.). Corola blanca, con partes amarillas y verde. un fruto por nudo. Cultivares: Ají escabeche. C. frutescens L. Corola blanca, dos flores por nudo. Cultivares: Ají picante. C. chinensi Jack. Corola generalmente amarillenta o verdosa. frutos verdes rojos en la madurez y negruzcos al secar, picantes. Cultivares: Ají P’ancca. C. microcarpum Cav. Corola diminuta, blanca. fruto pequeño (1,5 cm.), cónico, rojos. Picantes. Cultivares: Pinguita de mono. C. pubescens R et P. Corola violácea. frutos carnosos, verdes, rojos, amarillos, ovales y esféricos, picantes. Semillas negras. Cultivares conocidos como Locoto. A

B

C

figura 1.26. Variedades de Capsicum baccatum (A) C. frutescens c.v. Aji picante (B) C. chinense c.v (C) Habanero.

1.12.4. contenido nutricional Los ajíes son una fuente importante de nutrientes. Contienen betacaroteno (precursor de la vitamina A), complejo B, vitamina C, hierro, potasio y magnesio. tabla 1.22. valOr nutriciOnal de variedades de Capsicum (pOr 100 G de ají) (cOllazOs, 1996) C. baccatum var. pendulum C. frutescens l C. chinensi C. annuum l. C. pubescens r kcal

39

292

26

57

36

Proteínas (g)

0,9

7

0,7

2,5

1,2

Lípidos (g)

0,7

7,8

0,4

0,8

0,5

Hidratos de carbono (g)

8,8

58,7

6

12,4

8,2

fibra (g)

2,4

22,4

1,4

2,9

1,5

Calcio (g)

31

142

10

21

6

Hierro (g)

0,9

4,9

3

1,3

0,5

Retinol (μg)

445

4412

17

382

35

Ácido ascórbico (mg)

60

23

95

48,5

14,9

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

1.12.5. propiedades nutracéuticas Los ajíes contienen diversas sustancias bioactivas, la más conocida es la capsaicina, sustancia responsable del sabor picante y que se encuentra concentrada en las semillas y membranas. La capsaicina estimula la circulación, tiene un efecto en la regulación de la temperatura y tiene propiedades anestésicas. Por otro lado, las semillas o pepas del ají también tienen una sustancia llamada capsicidina, la cual tiene propiedades antibióticas. Está en desarrollo un remedio para artritis basado en un receptor iónico proteico que se liga a la capsicina para sobrellevar dolores crónicos.

1.12.6. descripción de productos derivados de Capsicum Este género provee muchas especies y variedades usadas en los alimentos aromatizados y populares en la cocina de muchas partes del mundo. Los pimientos, desde los más pungentes hasta los más colorados, con su aroma especial, son además de gran interés por su química, atributos sensoriales y afecciones fisiológicas. Los pimientos pueden ser comercializados frescos, deshidratados, o en extractos (oleorresinas). Una de las clasificaciones más aplicable a las oleorresinas de Capsicum, fue elaborada por The Essencial Oils Association of United States of America (E.O.A) y considera los siguientes tipos: – Oleorresinas de pimentón (paprika oleoresin). Se denominan oleorresinas de pimientos dulces por su contenido prácticamente nulo de compuestos capsaicinoides pungentes y alta concentración de colorantes carotenoides. Se obtiene de la especie Capsicum annuum L. Son derivados de Capsicum muy comercializados, muy utilizados como colorante para alimentos tales como: carne, embutidos, sopas, salsas preparadas, productos lácteos (quesos y mantequillas), bebidas refrescantes. También se utiliza para alimentación animal. – Oleorresinas de pimiento rojo (red pepper oleoresin). Se caracterizan por su contenido de compuestos colorantes y también pungentes, se extraen de variedades Capsicum annuum L. y se utiliza como aditivos en industrias cárnicas, embutidos, sopas deshidratadas, cerdo ahumado, salsas preparadas, productos lácteos, variedades de snack, bebidas gaseosas tipo ginger, productos farmacéuticos y cosméticos. En sus formas pungentes se utiliza para la preparación de salsas tipo «tabasco» y alimentos preparados fuertemente especiados. Otra importante aplicación, por el volumen de producto comercializado, es en los alimentos de consumo animal; así, se utiliza en los balanceados para el pollo en la pigmentación de la carne, en las gallinas ponedoras para la pigmentación de la yema del huevo y en alimentos de peces y crustáceos también para la pigmentación. – Oleorresinas de Capsicum (Capsicum oleoresin). Este grupo incluye oleorresinas de mayor contenido de compuestos capsaicinoides, característicos de la pungencia y se obtienen de las especies denominadas chiles, correspondiente a las variedades Capsicum frutences L. Sus aplicaciones son en la industria farmacéutica en concentraciones de 0,025 – 0,075 % en base emoliente. Está in-

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dicada para el alivio temporal de dolor de artritis reumatoidea, osteoartritis, y neuralgias como herpes zoster. Igual tratamiento se recomienda contra dolores musculares por exceso de elongación. También se usa para uso de defensa personal y para control de animales en aerosoles. La oleorresina pungente de Capsicum por el efecto repelente también se utiliza contra insectos y plagas en algunos cultivos. – absoluto de Capsicum. Obtenido de Capsicum annuum L.Var. longun sendt. El absoluto de Capsicum es soluble a alcohol, tiene un olor similar al tabaco, herbáceo, que puede utilizarse en bases de jasmin, acassia, mimosa. El absoluto debe estar preparado totalmente libre de pungencia para utilizarse en perfumes que inevitablemente serán utilizados en la piel. – carotenoides de Capsicum. Muchos extractos concentrados de carotenoides son también utilizados en la industria alimentaria, por ser pigmentos inocuos y de fácil metabolismo. El β-caroteno es un colorante natural de amplio uso en el área de alimentos, medicamentos y cosmética. En productos farmacéuticos se usan como cubiertas coloradas, suspensiones aceitosas micronizadas en base lipídica de supositorios. También se usan en la preparación de gelatinas coloreadas en cápsulas. En productos cosméticos se usan como suspensiones, emulsiones, lociones, lápices labiales y polvos base. La β-ionona, que es un producto de degradación de los carotenoides, se usa como un importante intermediario en la industria de perfumes.

1.13. cOnclusiOnes Las especies descritas en este capítulo constituyen solo una fracción de toda la gama de especies Iberoamericanas con potencial nutracéutico. Muchas de ellas ya se industrializan en mayor o menor grado; sin embargo, muchos de los procesos que actualmente se aplican, son procesos clásicos, que en ocasiones, no han sido diseñados para conservar ciertas moléculas bioactivas o sustancias de alto valor agregado. Por otro lado, en la mayoría de los casos, los proceso aplicados para el acondicionamiento y conservación, generan una gran cantidad de residuos, cáscaras y semillas para las que no existe proceso alguno que permita su explotación o al menos su acondicionamiento para reducir el impacto negativo que pueden tener sobre el medio ambiente como fuentes contaminantes. En muchas ocasiones pueden llegar a convertirse en un problema de disposición de desechos como es el caso de la industria de la pulpa de aguacate, o la industria de la obtención del jugo de tuna o los nopales. En el caso del agave, uno de los principales destinos de este, en México, es la obtención del jugo extraído del corazón o piña para la fermentación y obtención de bebidas destiladas tales como el tequila, mezcal, bacanora y otras; sin embargo, una gran cantidad de residuos contaminantes son generados en esta industria. Adicionalmente podemos contar las especies de agave que nos son aprovechadas o que se desperdician por no cultivarse dentro de la zona de denominación de origen. Aún existe una amplio abanico de sustancias con potencial nutracéutico de algunas variedades hasta ahora poco explotadas, tal es el caso de las Pasifloras (Carbajal de Pabon y cols., 2010) o las diferentes variedades de Capsicum que ofrecen una

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

amplia gama de sustancias antioxidantes debido a su alto contenido de sustancias de carotenoides. Sin embargo, la extracción y purificación de sustancias naturales por los métodos tradicionales de extracción, involucran en muchas ocasiones manipulación, exposición al oxígeno y/o al calor o sustancias oxidantes. Por ello, una alternativa interesante es el uso de biocatálisis ya sea para extraer, estabilizar o propiciar la solubilización, la biodisponibilidad o incluso la liberación específica. Este libro muestra una serie de trabajos de investigación, orientados a la implementación de métodos de extracción, o estabilización de sustancias con potencial nutracéutico, provenientes, muchas ya sea de residuos de especies vegetales iberoamericanas o de especies subutilizadas.

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2. aprOvechamientO de residuOs aGrOindustriales: cOmpOsición, mOdificación enzimática y evaluación de sus pOtenciales aplicaciOnes m. beatriz Gómez-Patiño daniel arrieta-baez Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN (ENCB-IPN), México roxana lóPez simeón serGio e. domínGuez maribel hernández Guerrero hiram beltrán conde José camPos terán dolores reyes duarte universidad Autónoma Metropolitana unidad Cuajimalpa (uAM-C), México

El aprovechamiento de agro-residuos para obtener productos de mayor valor agregado se está convirtiendo en una alternativa verde dentro de los procesos industriales, claramente enmarcada dentro de la sustentabilidad. Las nuevas tecnologías están evolucionando el campo del aprovechamiento de agro-residuos desde su uso como abono hasta convertirse en materia prima para la producción de energéticos (etanol, biodiesel) y papel, incluyendo su potencial para el desarrollo de nuevos biomateriales y nutracéuticos. Sin embargo, un factor limitante para el aprovechamiento pleno de los residuos agrícolas es la naturaleza compleja de su composición estructural. Por ejemplo, en el caso de los residuos lignocelulósicos, su estructura no es fácilmente degradable debido al gran recubrimiento y entrelazado de los polisacáridos presentes (celulosa, hemicelulosa, pectina, etc.) con la lignina (complejo de anillos aromáticos recalcitrantes). Para disponer de estos polisacáridos o monosacáridos de interés y utilizarlos en los distintos procesos, es necesario eliminar los recubrimientos y enlaces entre ellos, pero sin degradar más allá de las unidades monoméricas. Otro factor limitante es la estabilidad de sus componentes. Por ejemplo, en el caso de los residuos de jitomate, su cáscara contiene grasas cuticulares, cutina y otros compuestos hidrofóbicos como el licopeno. La baja estabilidad de este carotenoide ha incitado la búsqueda de suaves procesos de extracción que permitan mantener su actividad antioxidante y ampliar su uso como colorante alimentario. Por otro lado, la posibilidad de recuperar los monómeros de la película impermeable de la cáscara sin degradarlos, permitirían su aprovechamiento para la síntesis de biopolímeros.

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Aunque existen muchas posibilidades de aprovechamiento agroindustrial en México en lo que respecta a sus residuos, en este capítulo se presentan dos casos de estudio que consideramos son de gran importancia. Estos residuos han mostrado tener potencialidad de aplicación industrial tanto en México como en Iberoamérica y son i) residuos de jitomate, y ii) bagazo de caña. En las dos secciones subsecuentes se describe su composición, las posibilidades de modificación enzimática y finalmente las aplicaciones potenciales para cada uno de ellos.

2.1. el jitOmate: prOducción, usO y manejO de desechOs El jitomate (Solanum lycopersicum) o «tomate rojo» es un fruto que pertenece a la familia Solanaceae, generalmente de color rojo debido a la presencia de pigmentos como el licopeno y el caroteno. Posee una forma redondeada y achatada a excepción de algunas variedades de fruto alargado, en ocasiones no es completamente liso sino que presenta gajos más o menos profundos, la sección transversal muestra la epidermis delgada y resistente de color rojo al madurar, al igual que la pulpa, un tanto gelatinosa, que se halla dividida en lóculos donde se alojan las semillas. El jitomate es una de las especies hortícolas más importantes de México debido al valor de su producción y a la demanda de mano de obra que genera. Es el principal producto hortícola de exportación, ya que representa el 37% del valor total de las exportaciones de legumbres y hortalizas y el 16% del valor total de las exportaciones agropecuarias, solo superada por el ganado vacuno. Su cultivo, cosecha y comercialización genera 72.000 empleos directos y aproximadamente 10,7 millones de empleos indirectos. Con base en cifras al 30 de junio del 2010 del Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (COVECA, 2010), el promedio de la superficie sembrada ascendió a más de 53.000 Ha, y la producción obtenida fue de aproximadamente 2 millones de toneladas, dando como resultado un rendimiento de 39 Ton/Ha. Entre los estados de mayor producción se encuentran Sinaloa, Baja California, Michoacán, San Luis Potosí y Jalisco. Como efecto del Programa de Adquisición de Activos Productivos que tiene en marcha la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SIAP/SAGARPA, 2010), la producción de jitomate está cambiando del cultivo a cielo abierto a la modalidad de producción en invernadero. Este cambio de técnica en el sistema de producción repercute en el rendimiento nacional, ya que mientras a cielo abierto se tiene una cosecha de 30 a 40 toneladas por hectárea, en la modalidad de malla sombra se incrementa entre 140 y 160 Ton/Ha, y en la producción en invernadero se eleva hasta 300 o 350 Ton/Ha. La Organización de las Naciones unidas para la Agricultura y Alimentación (fAO, 2008) reporta que hasta el año 2008 México se encontraba en el décimo lugar a nivel internacional de productores de jitomate, siendo el primero China, seguido por Estados unidos. El jitomate, a pesar de ser uno de los productos agrícolas de mayor producción en México, enfrenta un problema importante que repercute económicamente en sus productores: siendo un fruto sumamente perecedero requiere de transportación rápida y eficiente, de no ser así este factor se puede convertir en causa de grandes pérdidas. La SIAP reporta que hasta junio del 2010 la cosecha siniestrada fue de aproximadamente

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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el 3%, aunado a esto, las pérdidas se incrementan cuando llegan a los vendedores de todo el país. Por ejemplo, se ha reportado que en invernaderos y centrales de abasto estas pérdidas representan de un 10 a un 20% de los volúmenes almacenados. Los procesamientos industriales del jitomate producen desechos, principalmente las cáscaras y las semillas, los cuales son difíciles de procesar. Considerando que los residuos agroindustriales son el 20 o 30% de la producción, la cantidad de desechos resulta elevada. Estos generalmente van hacia espacios abiertos ocasionando una contaminación biológica debido a que sirven de alimento para roedores, bacterias, hongos y virus. Lo anterior, crea problemas a la sociedad tales como enfermedades, malos olores, contaminación de agua, suelo y atmósfera. una opción de reciclaje de estos residuos es el uso de la lombriz de tierra Eisenia foetida (Lombriz roja de California) para obtener la vermicomposta, producto orgánico que puede ser utilizado en la agricultura como mejorador de suelo, con excelentes beneficios para las plantas (Marinews, 2010). Actualmente, los residuos agroindustriales del jitomate son generalmente vendidos a precios bajos o, en algunos casos, utilizados como alimentos para animales. En efecto, estos materiales tienen poco valor comercial e incluso algunas veces se tiene que pagar por desecharlos para no incurrir en faltas a regulaciones ambientales. Sin embargo, existen componentes en estos residuos agroindustriales que podrían representar un valor económico si pudieran ser recobrados. Por ejemplo, de la cáscara del jitomate se podrían recobrar cutina y antioxidantes como el licopeno (Baker y cols., 1982). La cutina es un poliéster constituido principalmente por ácidos ω,9- y ω-10dihidroxihexadecanoicos, los cuales podrían tener un valor comercial si se les encontrara uso como modificadores de viscosidad, plastificadores, agentes secantes, bases de pinturas, etc. (Derksen y cols., 1995; Osman y cols., 1999). El licopeno es un carotenoide altamente lipofílico, sin anillos cíclicos y con un gran número de dobles enlaces conjugados, que presenta una actividad antioxidante mucho mayor al β-caroteno (2,5 vs. 1,5 equivalentes de Trolox –TEAC) (Böhm y cols., 2002).

2.1.1. el licopeno El licopeno es un pigmento natural del grupo de los carotenoides con un alto valor nutraceútico. Se encuentra en elevadas concentraciones en los jitomates y algunos productos derivados de este. Recientemente ha cobrado gran importancia debido a que diversos estudios sugieren que puede proveer protección contra determinados tipos de cáncer como el de próstata, estómago y pulmón (Levy y cols., 1995), y otras enfermedades degenerativas influenciadas por la producción de radicales libres. Los dobles enlaces conjugados C-C presentes en el licopeno le dan las características antioxidantes, debido a que pueden fácilmente deslocalizar electrones capturados de los radicales libres. Es por ello que el licopeno presenta una alta demanda por compañías farmacéuticas, cosméticas y de alimentos. Como se mencionó, el jitomate y sus derivados son considerados las mejores fuentes de licopeno. De acuerdo a un estudio realizado por Gross en 1987, el contenido total de licopeno en distintas especies de jitomate, varía entre 90 y 190 mg/g de peso fresco. En otro estudio, Sharma y Le Maguer reportaron en 1996 que un

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

72-92% del licopeno está asociado a la fracción insoluble de agua y a la cutícula, es por ello que los extractos de jitomate y su cáscara contienen elevadas concentraciones de licopeno. Es por ello que los residuos derivados del procesamiento del jitomate, principalmente residuos de semilla y cáscara, podrían ser una excelente fuente de licopeno. Sin embargo, la extracción, manejo y análisis del licopeno deben realizarse bajo condiciones ambientales controladas para minimizar su degradación oxidativa y la formación de diversos isómeros. Se debe evitar su exposición a la luz y solamente debe utilizarse luz amarilla, dorada o roja en los diversos procesos de extracción y análisis. El licopeno y los β-carotenos son solubles en disolventes orgánicos, lo que ha favorecido su empleo en distintas técnicas de extracción. Sin embargo, estos son usualmente tóxicos, caros y peligrosos de utilizar. Es por ello que pensando en el bienestar de los consumidores, así como en el medio ambiente, se han implementado tecnologías alternativas más limpias para extraer este tipo de carotenoides. Entre estos, la extracción usando CO2 supercrítico de licopenos y β-carotenos de residuos industriales del jitomates, ha demostrado buenos resultados. A través de HPLC se lograron purificar 6 mg de licopeno natural a partir de 10 gramos de puré de jitomate. Sin embargo, el licopeno natural purificado contenía 20% de isómeros cis y 3% de compuestos no identificados. Estas impurezas fueron eliminadas utilizando columnas semipreparativas de fase normal (Hakala y Heinonen, 1994). Dentro de los procesos de extracción, enzimas como celulasas y pectinasas han sido empleadas con buenos resultados. Choudhari y Ananthanarayan (2007) optimizaron la extracción de licopeno de jitomate mediante el uso de estas enzimas, dando como resultado un incremento de casi 30% en relación al control utilizando celulasa y 25% con pectinasa, alcanzando rendimientos cercanos a 600 μg/g en residuos industriales. utilizando la cáscara de jitomate los rendimientos han sido mucho mayores, alcanzando 800 μg/g aproximadamente con celulasa (100% de incremento con respecto al control) y alrededor de 1600 μg/g con pectinasa (casi 200% más).

2.1.2. la cutícula La cutícula o membrana cuticular es una membrana continua extracelular de lípidos solubles y polimerizados, que se encuentra en contacto con el medio ambiente (fig. 2.1). La estructura y composición de las cutículas varía según el tipo de planta y órganos, pero está compuesta principalmente de una matriz de cutina y una capa de ceras (Heredia, 2003). De acuerdo a su composición química, las cutículas suelen dividirse en dos grupos: cutinas y suberinas. La suberina, al igual que las cutinas es un polímero natural. Sin embargo este biopoliéster natural está formado por dos dominios: uno alifático y otro aromático (Bernards, 2002). Los dominios aromáticos se derivan principalmente de los ácidos hidroxicinámicos y los componentes alifáticos se derivan de los ácidos grasos celulares comunes. Los principales componentes de la suberina son alcoholes alifáticos, ácidos grasos, ácidos grasos ω-hidroxilados, ácidos α,ω-dicarboxílicos y ácidos aro-

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máticos, todos de cadenas largas que van de los 16 a los 30 carbonos, los cuales pueden estar unidos a través de puentes de glicerol (Gandini y cols., 2006). El peridermo, la epidermis y la hipodermis de las raíces son algunos lugares donde comúnmente encontramos a la suberina (Kolattukudy, 2001).

figura 2.1. Representación esquemática de la cutícula del jitomate.

Las cutinas se pueden definir como una red polimérica de ácidos grasos oxigenados principalmente de las familias C16 y C18 (fig. 2.2), unidos por enlaces éster (Heredia, 2003). Los ácidos grasos que forman la red de cutina se derivan de los ácidos grasos celulares comunes. La cutina se encuentra unida a la cara exterior de la epidermis por una capa de pectina (Kolattukudy, 2001). Monómeros de 16 carbonos

Monómeros de 18 carbonos O

O OH

H3C HO

O HO

OH OH

OH OH HO

H3C

OH O

O HO

HO

OH O

O O

O

HO OH

OH OH

OH

figura 2.2. Ejemplos de monómeros de las familias C16 y C18 que conforman la red polimérica de la cutina.

La cutina se encuentra en las partes aéreas de diversos vegetales, comúnmente en la cáscara de diversos frutos, incluido el grupo de los cítricos. A diferencia de esta, la suberina se localiza principalmente en las raíces, un ejemplo muy recurrido es la papa. Existen casos especiales, como en Arabidopsis, en los cuales podemos encontrar la presencia de cutina y suberina (franke y cols., 2005).

2.1.2.1. Funciones biológicas de las cutículas Las principales funciones de las cutículas son las siguientes: – Restringir la perdida de agua en forma de vapor.

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– Limitar la pérdida e incorporación de sustancias de la parte interna de los tejidos. – Protección contra patógenos, daños mecánicos y ataques de herbivoría (Heredia, 2003; Graça y Santos, 2007). – Transporte de sustancias lipofílicas. – Repelencia de agua y partículas. – Atenuación de la radiación ultravioleta (uV). – Evita la fusión de los órganos durante el desarrollo de la planta (Riederer y Müller, 2006).

2.1.2.2. Características físicas de la cutina La cutícula presenta dos propiedades físicas de particular interés: sus características reológicas y sus características térmicas. Ambas concernientes a la relación entre el agua y la cutícula y consecuentemente, con la cutina. Como se menciona anteriormente, la función de las cutículas, y más específicamente de los lípidos cuticulares, es de servir como una barrera contra el transporte y la difusión de agua. Sin embargo, aún no se conoce cuál es la relación exacta entre las propiedades del transporte molecular y las características mecánicas, es decir las propiedades reológicas de las cutículas vegetales. En el mismo interés científico permanece el estudio de las propiedades térmicas de las cutículas. Petracek y Bukovac (1995), reportaron que la cutícula aislada del jitomate tiende a expandirse y a ser elástica después de hidratarse, por lo cual puede ser susceptible a romperse, sugiriendo que el agua actúa como un plastificante en la cutícula. Esta hipótesis se ha corroborado mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AfM) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de estado sólido (13C CPMAS NMR) en la cutícula aislada de jitomate, determinando que el agua absorbida por la cutina, ciertamente actúa como plastificante, promoviendo la flexibilidad molecular y suavizando las redes poliméricas. Se han realizado pocos estudios concernientes a los cambios térmicos dependientes de los lípidos, cutinas y cutículas aisladas de plantas. Dentro de estos, se ha observado que el calor específico es significativamente elevado. Esto significa que el material cuticular requiere de una gran cantidad de calor para aumentar en 1ºC su temperatura. El valor de calor especifico de la cutina fue de 2-2,5 J K-1g-1, mientras que la celulosa tiene un valor calculado de 1,5 J K-1g-1. Aunque el material cuticular contribuye como una fracción menos de masa al total de las hojas y frutos, podría resultar importante en la termorregulación de la interacción biofísica entre la planta y su medio ambiente. Así pues, la cutina es un polímero amorfo e insoluble, el cual presenta una muy baja absorción y permeabilidad de agua, calor especifico muy alto y además presenta transiciones cristalinas a temperatura ambiente o fisiológica. Estas características colocan a este poliéster natural como un biomaterial industrial y biotecnológico muy interesante, de igual forma que los polihidroxialcanoatos (PHA) u otros poliésteres termoplásticos obtenidos de polimerizaciones químicas o enzimáticas. Debido a sus propiedades biodegradables, sus aplicaciones podrían extenderse a la industria médica, farmacéutica y alimentaria (Benítez y cols., 2004).

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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2.1.2.3. Estudios estructurales de la cutina del jitomate (Solanum lycopersicum) Los ácidos grasos alquil-hidroxilados se consideran monómeros para formación de diferentes poliésteres, los cuales pueden variar en el tamaño de la cadena alifática, como en el tipo de sustituyentes dentro de la cadena (hidroxilos, epóxidos, etc), las características del polímero dependerán entonces tanto del tipo de monómero utilizado, como del tipo de catalizador empleado en la polimerización. La cutícula del jitomate (S. lycopersicum) ha sido ampliamente estudiada describiéndose por lo menos 10 componentes monoméricos, entre los cuales los ácidos n,ω-dihidroxihexadecanoicos son los mayoritarios, principalmente el ácido 9(10),16-dihidroxihexadecanoico (44%) y el 9(10),16-dihidroxihexadecanoato de metilo (25%) (Osman y cols., 1995). Sin embargo, no existe un procedimiento óptimo para extraer dichos componentes, lo cual ha frenado su uso industrial. Debido a ello, pocos son los estudios realizados de polimerización con esos monómeros y de las propiedades de dichos materiales, así como de sus posibles usos en la industria (Osman y cols., 1995 y 1999; Stark y cols., 2000 y 2008).

2.1.2.4. Estudios de la polimerización de componentes cuticulares La cutina es el poliéster más abundante en la naturaleza y constituye la parte estructural cuticular de las hojas y tallos de plantas superiores. Aunque se conoce la composición química de este biopolímero, poco se conoce acerca de la interacción de sus monómeros, tanto en un ambiente geométricamente bien definido, así como en reacciones químicas o enzimáticas. Benítez y colaboradores (Benítez y cols., 2007) estudiaron el autoensamblaje de monómeros lineares de ácidos carboxílicos hidroxilados sobre mica para investigar el efecto del número y la posición de grupos hidroxilos en la interacción de las moléculas. La mayoría de estos compuestos tienden a ensamblarse espontáneamente sobre un sustrato solido, por ejemplo, los alcanotioles en oro o los alcanosilanos sobre silicón y mica (Alves, 1992). En el caso de los ácidos carboxílicos hidroxilados se observó que la combinación de grupos hidroxilos secundarios y primarios (terminales) en la misma molécula, son más efectivos para crear y extender una delgada monocapa debido a las interacciones por puentes de hidrógeno. En el caso del ácido 9(10),16-dihidroxihexadecanoico, monómero principal de la cutina del jitomate, se observó un autoensamblaje espontáneo sobre un sólido, cuando este proviene de una solución. El uso de este monómero demostró que los enlaces por puentes de hidrógeno entre grupos hidroxilos en las posiciones intermedias de las cadenas, son responsables de un crecimiento en dos dimensiones (2D) debido a un empaquetamiento de monocapas alquílicas. La importancia de grupos hidroxilos intemedios en la formación de monocapas más uniformes y más densas fue confirmada con el uso del ácido aleurítico, un ácido carboxílico trihidroxilado. La disponibilidad de grupos hidroxilos intermedios expuestos en los componentes alifáticos, es responsable de la formación de una segunda capa debido a una fuerte interacción cola-cabeza (hidroxiloácido carboxílico) (Benítez y cols., 2007).

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

En el caso de la biosíntesis de estos importantes polímeros protectores, tales como la cutina en plantas superiores, la combinación de grupos hidroxilos terminales (primarios) e intermedios (secundarios) son los más efectivos para crear monocapas extendidas en dos dimensiones. Estos datos son útiles para el uso de monómeros en la síntesis química o enzimática de biopolímeros alifáticos. Existen pocos estudios de la polimerización de los componentes cuticulares para la obtención de bio-poliésteres. En el 2004, Benítez y cols. llevaron a cabo una reacción de esterificación química de la mezcla de monómeros aislados de la cutícula del jitomate utilizando ácido dodecilbenzensulfónico (ADBS) como un catalizador de características surfactantes. La mezcla de monómeros cuticulares contenía principalmente ácidos 9(10),16-dihidroxihexadecanoico (85%, p/p) y ácido 16-hidroxihexadecanoico (7,5%), esta mezcla fue condensada en tolueno a 60-65oC , llevándose a cabo la reacción de esterificación en la interfase del sistema. El producto fue aislado como una película insoluble en diferentes disolventes orgánicos. De acuerdo al análisis de fT-IR y de 13C-RMN de estado sólido (Benítez y cols., 2004), el polímero obtenido presenta características similares a la cutina aislada de frutos y hojas. Las características de biodegradabilidad, baja densidad de entrecruzamiento y la posibilidad de incorporar otros monómeros no tóxicos, tales como el glicerol, le dan a este biomaterial parecido a la cutina, un atractivo industrial importante (Benítez y cols., 2004). Aplicando la metodología anterior, Heredia-Guerrero y cols., (2009), utilizaron el ácido 9,10,16-trihidroxihexacanoico (ác. aleurítico) para obtener un polímero mimético y análogo a la cutina obtenida de plantas. usando 100 mg del ácido dodecilbenzensulfónico se obtuvieron 67,9 mg de poliéster. El mejor rendimiento se observó entre 70 y 80oC. Por debajo de esta temperatura (50 y 60oC), el ácido permaneció sin disolverse en el tolueno por lo que la reacción no tuvo lugar, y por encima de esta (90oC) se obtenía un producto viscoso con crecimiento caótico y sin forma. En consecuencia, se demuestra una vez más que los mejores resultados se obtienen con tolueno como disolvente, a 80oC y ADBS como catalizador.

2.1.2.5. Polimerización del ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico con N,N´diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-dimetilamino piridina (4-DMAP) En el grupo de Arrieta y cols., el ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico fue obtenido de agro-residuos de jitomate utilizando protocolos reportados que involucran métodos enzimáticos y químicos. El monómero fue purificado y caracterizado por técnicas de 1H-RMN y EM. La pureza del monómero fue establecida por análisis de HPLC utilizando un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD) y posteriormente por medio del análisis de espectrometría de masas (IE-MS). La posición del hidroxilo intermediario fue determinada en la posición 10 de acuerdo al análisis de los fragmentos observados en el espectro de masas (Gomez-Patino, 2010; ArrietaBaez y cols., 2011) (fig. 2.3). La N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la 4-dimetilamino piridina (4DMAP) han sido utilizados como catalizadores para llevar a cabo reacciones de esterificación generalmente en compuestos de cadenas cortas (Aryal y cols., 2009;

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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You y cols., 2010). Se ha reportado su uso para obtener con éxito, a temperatura ambiente, algunos poliésteres lineales y ramificados con propiedades biológicas interesantes. Sin embargo, este sistema no ha sido probado en compuestos alifáticos de cadena larga. 7923892

169

100

–H2O 187 169

90 HO 16

95

80 70

10 OH 131

271

55

O 1

235

–H2O

OH

–H2O 253 271

60 41

50 40

131

30 20

155

29

253 271 235 289

10 0

50

100

150

200

250

300

421 350

400

450

577 603 500

550

600 m/2

figura 2.3. Espectro de IE-MS del ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico y el análisis de fragmentación para determinar la posición del hidroxilo intermediario en el carbono 10.

Para determinar la polimerización del ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico en condiciones de temperatura ambiental se realizo un ensayo con la DCC y la 4-DMAP. A 100 mg del ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico (0,347 mmol) disuelto en tolueno, se adicionaron 21,2 mg de 4-DMAP (0,174 mmol) y 71,59 mg de DCC (0,347 mmol). La reacción se dejó en agitación y fue monitoreada por cromatografía de capa fina en un sistema de cloroformo:metanol (9:1, v/v) hasta la desaparición del monómero. Una vez completada la reacción, se filtró y el sólido recobrado fue lavado primero con CHCl3 y después con metanol para ser caracterizado por medio de CP-MAS 13CNMR y Tf-IR (fig. 2.4.). La reacción de polimerización produjo 85 mg de polímero y el análisis espectroscópico demuestra que el uso del monómero mayormente purificado, catalizado con DCC y DMAP, permite la obtención de un polímero de mayor pureza, como se puede observar al comparar el espectro de sólidos obtenido (fig. 2.4.) con aquellos anteriormente reportados (Benítez y cols., 2004). Estos experimentos confirman el potencial de los agro-residuos de jitomate para la síntesis de nuevos biomateriales con propiedades interesantes para la industria.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

1

2

C

A

B

%T

A

BC

180 160 140 120 100 80

60

40

20 ppm 4000

3000

2000 cm-1

1500

1000

700

figura 2.4. Espectros de 13C CPMAS NMR del polímero sintetizado del ácido 10,16-dihidroxihexadecanoico con DCC y DMAP (1) y el análisis de fT-IR del polímero obtenido (-----) y el monómero (---) (2).

2.2. el baGazO de caña: Obtención y aplicaciOnes La caña de azúcar (Saccharum officinarum) es uno de los principales cultivos agrícolas en México. Ocupa el 3,4% de la superficie cosechada (0,69 millones de hectáreas), siendo el principal productor el estado de Veracruz (34-36% del total nacional) seguido de Jalisco (10-12%) y San Luis Potosí (10-12%). En la zafra 2010 – 2011 se molieron en total 44 millones de toneladas de caña y se produjeron cinco millones de toneladas de azúcar en 54 ingenios azucareros (unión Nacional de Cañeros, 2011). A nivel mundial, el principal productor es Brasil con un volumen de producción de 610 millones de toneladas (en 2010). Brasil, India, Tailandia y China aportan el 50% de la producción internacional, mientras México ocupa el 6º lugar con el 3,5% (financiera Rural, 2009). Por cada tonelada de caña se obtiene un residuo de 140 kg de bagazo. Actualmente su uso principal es como sustituto del combustóleo en la generación de energía para la industrialización de la caña en los ingenios. Por ejemplo, en la zafra 20092010 cuando se instalaron calderas más eficientes, hubo un ahorro de 98 millones de litros de combustóleo, lo que significó un consumo de 4 litros de petróleo por tonelada de caña (Zafranet, 2011). Sin embargo, el bagazo de caña es un recurso con potencial para utilizarse en la obtención de productos de mayor valor agregado como papel (Area, 2008), biocombustibles de segunda generación (aquellos obtenidos de biomasa no alimentaria, como los residuos agroindustriales lignocelulósicos) (Cardona y cols., 2010; Quintero y cols., 2010), xilitol, derivados de nutracéuticos o incluso como sustituto integral en biorefinerías.

2.2.1. componentes del bagazo de caña El bagazo de caña es un residuo lignocelulósico constituido (en peso seco) por 51% de celulosa, 24% de hemicelulosa, 21% de lignina y 4% de cenizas y otros compuestos (Sagarpa, 2011). Estructuralmente la lignocelulosa (figura 2.5), a di-

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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ferencia de los materiales celulósicos, está compuesta de fibras de celulosa embebidas en una matriz macromolecular de proteínas, pectinas, lignina y hemicelulosa (Brett y Waldron, 1996). De esta forma, la celulosa no está disponible fácilmente para su conversión a azúcares solubles, etapa previa a la fermentación para la producción de etanol. Esta complejidad proveé una barrera formidable para el rápido ataque microbiano y la solubilización de los azúcares, pero al mismo tiempo convierte a los residuos lignocelulósicos en un reto para ser aprovechados. Pared Celular

Lignina

Pectina

Celulosa

Hemicelulosa

figura 2.5. Complejo lignocelulósico.

2.2.1.1. Celulosa La celulosa es el principal componente estructural de las plantas terrestres, acuáticas y algas (en donde se encuentra en menor proporción en comparación con las de plantas superiores). Es por lo tanto una de las biomoléculas orgánicas renovables y más abundantes por lo que conforma la mayor proporción de la biomasa terrestre. Así mismo, es un polisacárido lineal de peso molecular variable formado exclusivamente por moléculas de glucosa. Se forma a partir de la unión de moléculas de β-glucosa formando enlaces β-1,4-O-glucosídicos. Su unidad repetitiva es la celobiosa, es decir dos unidades de glucosa y su fórmula empírica es (C6H10O5)n, con un valor mínimo de n = 200. La celulosa es por naturaleza recalcitrante, siendo un polímero rígido e insoluble en agua. Su función biológica principal es proveer de fuerza y resistencia a las plantas (donde se encuentra asociada a otros biopolímeros como hemicelulosa y lignina) y a las algas. Así mismo, la celulosa provee a las plantas y algas de una barrera con-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

tra agentes físicos, biológicos y químicos. una de las principales razones de su estabilidad radica en su estructura cristalina. La proporción de regiones cristalinas y amorfas en la celulosa depende de la fuente y métodos de extracción y en esta estructura cristalina es donde existen varios polimorfos de este biopolímero. La celulosa I (figura 2.6) es la celulosa nativa encontrada en plantas, algas y bacterias y es derivada de los procesos biosintéticos y es en realidad una mezcla de los alomorfos Iα y Iβ. En este tipo de celulosa las cadenas están alineadas paralelamente y su estructura es metaestable. La celulosa tipo II (la más estable termodinámicamente) es el resultado del cambio de estructura cristalina del tipo I cuando es regenerada por solubilización y reprecipitación o por mercerización (tensión mecánica y tratamiento alcalino). Este tipo de celulosa también es producida por algunas algas, hongos y por la bacteria Sarcina ventriculi. A diferencia de la celulosa tipo I, las cadenas en la celulosa tipo II están alineadas anti-paralelamente. La celulosa tipo III (IIII y IIIII) es aquella producida a partir de las celulosas tipo I o II al ser tratadas con aminas o amonia. El proceso de obtención de celulosa tipo III es reversible. El último tipo, la celulosa IV (IVI y IVII), es generado por calentamiento de la celulosa tipo III en presencia de glicerol (O´Sullivan, 1997). H

H

O

O H

Celulosa I

H

O

O

O

O

O

O

H

H

O H

H

O

O H

O

H

O

O O

O O

O

O H

H

O

O H

H O

n H

H

figura 2.6. Estructura química de la celulosa Tipo I.

2.2.1.2. Hemicelulosa La hemicelulosa es una estructura muy compleja de polisacáridos constituida por hexosas (C6: manosa, galactosa, glucosa, ácido glucurónico) y pentosas (C5: xilosa

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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y arabinosa), de los cuales la xilosa es el principal (Ingram y cols., 1998). Estos azúcares forman una cadena lineal ramificada unida con enlaces β(1-4) que recubre las fibras de celulosa y se entrelaza con la pectina y la lignina. Además, en las cadenas ramificadas, los ácidos hidroxicinámicos presentes (como el ácido ferúlico) pueden estar esterificados con los alcoholes de los azúcares como la arabinosa (Figura 2.7) (Himmel y cols., 1994). La versatilidad de enlaces y moléculas presentes en la hemicelulosa, hace de ella un polisacárido muy complejo que sirve de enlace a la lignina y de protección a la celulosa, resultando en el fortalecimiento de las paredes celulares lignocelulósicas de las plantas (figura 2.5). i --Xilosaβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4X-i

3 α Arabinosa (Af)

ii

5 Ácido ferúlico (Fer) Fer-OFer-Lignina 5 Af

Ac. glucorónico

α

1

3

2

i

Acetilo 3

ii

--Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4Xβ1–4X--

figura 2.7. Modelo estructural de la hemicelulosa que se entrelaza con la lignina. i) Enlaces glicosídicos; ii) Enlaces éster.

2.2.1.3. Lignina Luego de la celulosa y hemicelulosa, la lignina representa la macromolécula más abundante en los tejidos vegetales. Este biopolímero mantiene unidas a la celulosa y a la hemicelulosa, dando rigidez, flexibilidad y protección a la planta contra insectos y microorganismos (Nada y cols., 1988). Por otra parte, también ayuda al transporte de agua en los tejidos (Kohonen, 2006). Su abundancia es de 27-33% en maderas blandas, 18-25% en duras y de 17-24% en pastos. Por otra parte, existen dos tipos de lignina, la nativa presente en las plantas, y distintos tipos de ligninas técnicas, aisladas luego de los pretratamientos, que son identificadas por la especie y técnica de aislamiento, por ejemplo la lignina sauce-kraft. La lignina se utiliza principalmente para la producción de vainillina sintética y dimetil sulfóxido (DMSO), en menor medida como agente dispersante, emulsificante y secuestrador (por ejemplo de po-

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liaminocarboxilatos), sin embargo, su uso es bajo en comparación con otros biopolímeros (Holladay y cols., 2007). Su composición y su peso molecular varía en función de la especie y del tipo de pretratamiento delignificante, ya que estos rompen algunos enlaces covalentes lo cual modifica de forma muy importante algunas propiedades fisicoquímicas de la lignina (Fengel y Wegener, 1984; Sarkanen y Ludwig, 1971). Así mismo, el contenido de otros grupos funcionales también varía dependiendo del proceso de aislamiento, por ejemplo, la lignina aislada mediante métodos oxidativos (técnica organosolv con oxígeno) tiene más grupos carboxilo en su esqueleto que la extraída mediante métodos no-oxidativos con ácidos o alcoholes. La tabla 2.1 resume la diversidad de propiedades físicoquímicas para tres tipos de ligninas técnicas. tabla 2.1. prOpiedades físicOquímicas de alGunas liGninas técnicas. adaptada de sarKanen, y ludWiG, (1971) tipo/propiedad Peso molecular Peso mol. promedio Polidispersidad Sulfonatos (meq/g) Sulfuro orgánico (%)

Kraft 2.000-3.000 180 2-4 0 1-1,5 Soluble en álcalis (pH > 10,5)

Solubilidad

lignosulfonato Organosolv 20.000-50.000 < 1.000 215-254 188 6-8 2,4 – 6,4 1,25-2.5 0 4-8 0 Soluble en agua Insoluble en agua, (cualquier pH), insoluble soluble en álcali y en en orgánicos. muchos orgánicos.

Con respecto a su estructura, aunque esta es aleatoria y varía en función de la especie y pretratamiento, en general se trata de una red cruzada y ramificada de unidades fenilpropano, biosintetizadas por polimerización deshidrogenante de las unidades cinámicas, guaiaquil y siringil. La figura 2.8 muestra los monómeros constituyentes de la lignina. UNIDADES CINÁMICAS

UNIDADES CINÁMICAS

UNIDADES CINÁMICAS

O OH

OH

OH OH

HO

OH

OH OCH3

OCH3

H3CO

OCH3

CH n

ALCOHOL CUMARÍLICO

HO

O

ÁCIDO CUMÁRICO

HO

O

ÁCIDO HIDROXICINÁMICO

HO ALCOHOL CONIFERÍLICO

HO

O

ÁCIDO FERÚLICO

HO ÁCIDO SINAPÍLICO

figura 2.8. Monómeros fenilpropano de la lignina; la polimerización se da como se indica en el alcohol cumarílico. Adaptada de Sarkanen y Ludwig (1971).

Supramolecularmente los monómeros fenilpropano están unidos de forma entrecruzada mediante uniones C-C y C-O-C (ver figura 2.9), formando muchas estructuras tridimensionales. En su forma natural la lignina está muy entremezclada, con al

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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menos 11 tipos distintos de uniones formadas entre los monómeros que se dan con la variedad de planta de origen. En la lignina natural el tipo de unión predominante es β-O-4, presente hasta en un 58%, mientras que en las ligninas técnicas es menor, y varía según el pretratamiento (Whetten y Sederoff, 1995). La lignina natural tiene menos grupos hidroxilo que la celulosa, es considerada hidrofóbica y en su estado natural es insoluble en todos los solventes comunes. Sin embargo, el proceso delignificante rompe los enlaces covalentes, solubilizando fracciones de bajo peso molecular, que tienden a asociarse mediante uniones no covalentes hacia complejos de mayor peso molecular por la formación de muchos puentes de hidrógeno. Este proceso parece ser reversible y dependiente del solvente y del tipo de lignina. La figura 2.10 muestra un esquema de una posible estructura de la lignina. Las estructuras que forman las ligninas en solución son partículas esféricas, impermeables al solvente y densamente empacadas, debido a la tendencia que presentan los grupos aromáticos a «apilarse». Por otra parte, la estabilidad de soluciones diluidas depende de la alcalinidad, la fuerza iónica y la temperatura (Sarkanen y cols., 1981). HO

OH

OMe

HO

OH

OMe

OH

OH

HO

MeO

O

MeO

HO

OH O OMe

HO

OMe

O

OH

O

OH

OMe HO

O HO

O

OH

HO

MeO O

OH

O

OH

MeO

O

O O

OMe

OMe

HO HO

OH OH

Lignina

MeO

O OMe HO

n

figura 2.9. Estructura de la lignina.

Actualmente los residuos de lignina tienen un uso muy límitado pues son quemados para producir calor que se reutiliza en algunos sistemas del proceso o se usan como complemento en alimentos para animales (Baurhoo y cols., 2008). Cuando la lignina se recupera y aísla, también se utiliza para la producción de vainillina sintética y dimetil sulfóxido (DMSO), en menor medida como agente dispersante, emulsificante y secuestrador (por ejemplo de poliaminocarboxilatos), sin embargo, su uso es bajo en comparación con otros biopolímeros (Holladay y cols., 2007). En el proceso de producción de etanol, la lignina no es convertida a etanol por lo que se requiere de su separación y reutilización, por ejemplo para la producción de calor y electricidad (para mejorar el balance energético del proceso) o para su aprovechamiento en otras aplicaciones como se describirán más adelante.

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2.2.2. degradación enzimática de residuos lignocelulósicos En la naturaleza, la degradación de los materiales lignocelulósicos se lleva a cabo por toda una variedad de actividades enzimáticas producidas por distintos organismos, fundamentalmente bacterias y hongos filamentosos. Para poder degradar totalmente la lignocelulosa los microorganismos secretan hemicelulasas y celulasas. Estas enzimas digieren la hemicelulosa y la celulosa hasta formar azúcares (glucosa y xilosa, respectivamente en un proceso llamado sacarificación) que pueden ser metabolizados por los microorganismos permitiendo su crecimiento. Sin embargo, la pared celular de muchas plantas y subproductos agroindustriales se compone también de pectinas, lignina y ésteres de ácidos hidroxicinámicos, donde el ácido ferúlico es el más abundante y se encuentra unido a residuos de arabinosa o de galactosa, proporcionando rigidez a la pared celular al entrecruzarse con cadenas de pentosanos, arabinoxilanos y hemicelulosa (figura 2.7) (faulds y cols., 1995). Por esta razón se requieren otras enzimas como las esterasas, pectinasas, oxidasas, entre otras para conseguir una total degradación. Las esterasas actúan sinérgicamente con otras enzimas hidrolíticas (hemicelulasas, xilanasas, pectinasas) y algunas oxidasas (peroxidasas y lacasas) que ayudan también en el rompimiento de la lignina para facilitar la completa degradación de la pared celular de las plantas. Las feruloil esterasas provenientes de hongos y bacterias, como Pseudomonas fluorescens, Penicillium funiculosum, Talaromyces stipitatus, Aspergillus niger, han sido purificadas y caracterizadas (Benoit y cols., 2006). El uso de extractos enzimáticos con actividad xilanasa y esterasa se ha empleado en algunos estudios para liberar ácido ferúlico a partir de residuos de cereales (Sancho y cols., 2001). También se han ensayado preparaciones enzimáticas que contienen celulasas (por ejemplo de Trichoderma reesei), y complementado con pectinasas y feruloil esterasas, mejorando las conversiones de hemicelulosa y celulosa (Dien y cols., 2008). En la Tabla 2.2 se presenta una lista de las enzimas que presentan actividad frente a residuos lignocelulósicos (Ponce y cols., 2002; Himmel y cols., 1994). La aplicación de enzimas para favorecer la obtención de azúcares fermentables (AfT) en la producción de etanol presenta ventajas inherentes a la actividad de las enzimas: 1) uso de condiciones suaves de reacción, 2) reducción o eliminación del uso de compuestos químicos dañinos al ambiente, 3) disminución en la formación de subproductos que puedan inhibir la fermentación de los azúcares para la producción de etanol. Por otro lado, el uso de extractos enzimáticos presenta el riesgo de variar cuantitativa y cualitativamente de lote a lote, por lo que es necesario diseñar formulaciones específicas consistentes tanto de hemicelulasas, celulasas, lacasas y cualquier otra enzima necesaria, para alcanzar una mejor y constante eficiencia de degradación del recurso lignocelulósico. Para conseguir esto, se han desarrollado una serie de pretratamientos (mecánicos, térmicos, químicos) que, en ocasiones, se han acoplado con tratamientos biológicos, como la hidrólisis enzimática, brindando buenos rendimientos (Knauf y Moniruzzaman, 2004). El éxito de ambos consiste en encontrar la mezcla adecuada de pretratamientos, que sin ser demasiado agresivos, permitan a las enzimas tener acceso a los polisacáridos para su aprovechamiento. Así mismo, encontrar la mezcla más eficiente de enzimas para cada tipo de residuo agrícola, es un factor trascendente para un mejor aprovechamiento integral del agro-residuo. En el grupo de la universidad Autónoma Metropolitana Cuajimalpa se trabaja en el desarrollo de formulaciones enzi-

Aprovechamiento de residuos agroindustriales: composición…

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máticas para la degradación de residuos lignocelulósicos para su aprovechamiento integral. Se han ensayado diferentes enzimas organizadas por grupos, de acuerdo al sustrato a degradar, encontrando que los cocteles enzimáticos de celulasas enriquecidos con pectinasas potencian la eficiencia de extracción (resultados no publicados). tabla 2.2. enzimas que intervienen en la deGradación de residuOs liGnOcelulósicOs sustrato Celulosa

Hemicelulosa

Pectina Lignina a

actividad enzimática endo-β-1,4-glucanasas β-glucosidasa exo-β-1,4-glucanasas endo-β-D-xilanasas β-xilosidasas arabinofuranosidasa β-manasa endo-arabinasa glucuronidasa acetil xilan esterasas feruloil esterasas pectin esterasa α-1,4-poligalacturonasa o pectinasa endo-pectin liasa lacasa lignina peroxidasa

Clasificación E.C.a 3.2.1.4 3.2.1.21 3.2.1.91 3.2.1.8 3.2.1.37 3.2.1.55 3.2.1.78 3.2.1.99 3.2.1.139 3.1.1.72 3.1.1.73 3.1.1.11 3.2.1.15 4.2.2.10 1.10.3.2 1.11.1.14

E.C. Enzyme Commission.

2.2.3. aplicaciones potenciales de la celulosa y la lignina Como se mencionó anteriormente, el aprovechamiento de residuos lignocelulósicos no se limita únicamente a la industria de biocombustibles y energía ya que es posible también obtener a partir de estos otros materiales con mayor valor tecnológico. En la siguiente sección de este capítulo presentamos una revisión de propuestas alternativas para el uso de celulosa y lignina obtenida a partir de residuos lignocelulósicos: la síntesis y modificación de nutracéuticos, el desarrollo de biorefinerías, el desarrollo de superficies modelo para estudios de fenómenos superficiales y el desarrollo de membranas como nuevos materiales biodegradables.

2.2.3.1. Azúcares derivados de los residuos agrícolas para el desarrollo de nutracéuticos El aprovechamiento de los residuos lignocelulósicos para la obtención de azúcares (glucosa y xilosa mayoritariamente), no solo tiene potencial en el proceso de

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fermentación para la producción de bioetanol. Otra posible aplicación es utilizarlos como materia prima para la síntesis y modificación de nutracéuticos. A continuación se mencionan brevemente algunas de estas aplicaciones: a) Los oligosacáridos, polímeros de azúcares con propiedades probióticas, se encuentran naturalmente en algunos alimentos pero también pueden sintetizarse utilizando una gran variedad de glicosidasas y azúcares (Quirasco y cols., 1995). b) La glicosilación de moléculas nutracéuticas, como los antioxidantes lipídicos (glicósidos de resveratrol (Torres y cols., 2010), de retinol (Einstein y cols., 2009) o de tocoferol (Ponrasu y cols., 2008), es de gran interés debido a que confiere a estas moléculas nuevas propiedades de solubilidad o mejoramiento de su estabilidad (Torres y cols., 2008) permitiendo ampliar sus aplicaciones. c) La síntesis de ésteres glicosilados (Reyes-Duarte y cols. 2008), como surfactantes no iónicos ni tóxicos también resulta de gran interés en el área alimentaria y de cosméticos.

2.2.3.2. Biorefinerías La producción de combustibles (energía) a partir de alimentos genera por su doble finalidad, problemáticas económicas y sociales (Cassman y Liska, 2009), y también una emisión masiva de gases de efecto invernadero por el cambio de uso de suelos (Searchinger y cols., 2008). Por otro lado, las biorefinerías basadas en la valoración de la biomasa lignocelulósica son uno de los desarrollos tecnológicos con mayores posibilidades de sustituir a la industria petrolera en la producción de combustibles y productos químicos a partir de recursos renovables. El concepto de biorefinería se basa en el uso de moléculas de carbono extraídas de plantas para sustituir a los carbonos provenientes del petróleo (figura 2.10) (Octave y Thomas, 2009). Por ejemplo, los azúcares obtenidos pueden ser transformados enzimáticamente con ácidos grasos y formar alquil-glicósidos para ser usados como surfactantes no iónicos de interés particular en las industrias de detergentes, alimentos y farmacéutica (Kim y cols., (2009). También pueden ser hidrogenados para producir compuestos como son el xilitol, manitol y sorbitol. Estos a su vez, se pueden llevar por hidrogenolisis hacia glicoles o hacia otros componentes vía oxidación o halogenación. Por otro lado, la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica puede ser dirigida a la producción directa de derivados como son el furfural, hidroximetil furfural y el ácido levulínico. Estos, a su vez, pueden ser convertidos en una gran variedad de productos químicos intermediarios (Lichtenthaler, 2006). En este sentido, los residuos agroindustriales y de la industria papelera son biomasa lignocelulósica que representa una alternativa de recursos renovables, abundante y barata (Kennedy y cols., 1995). Sin embargo, las tecnologías basadas en este tipo de materiales enfrentan obstáculos técnicos que han evitado su uso generalizado, pues la biomasa está constituida principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina en una estructura rígida, lo que causa la necesidad de pretratamientos para generar materiales susceptibles de catálisis que redunden en la producción de combustibles o productos químicos (Knauf y Moniruzzaman, 2004). Así mismo, los

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procesos biocatalíticos son costosos pues las enzimas se adsorben hasta en un 60% por la lignina residual (Mansfield y cols., 1999). Por otro lado, se ha encontrado que si se remueve a la lignina de estos materiales se necesitan del orden de seis veces menos enzimas para producir la misma conversión catalítica (Yang y cols., 2002). Sin embargo, la remoción de la lignina trae como consecuencia un incremento en los costos de los procesos de conversión de la biomasa en azúcares fermentables. Se cree que la adsorción de celulasas y hemicelulasas sobre lignina es debida a interacciones hidrofóbicas, y en menor medida por interacciones iónicas (Berlin y cols., 2006), pero, a pesar de la importancia que tienen los fenómenos de superficie que ocasionan esta inhibición, estos aún no son del todo comprendidos.

Figura 2.10. Biorefineria. Adaptado de Octave y Thomas (2009).

2.2.3.3. Superficies modelo El enfoque biotecnológico utilizado para resolver el reto de los biocombustibles de segunda generación ha sido mediante ingeniería y reingeniería de bioprocesos (Gray y cols., 2006), o mediante mejora genética de los agentes biológicos utilizados en estos (Alper y cols., 2009). Otra aproximación complementaria específica sobre la etapa de hidrólisis enzimática para la liberación de azúcares fermentables, consis-

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te en estudiar los fenómenos superficiales que ocurren entre los materiales lignocelulósicos y las enzimas; en este sentido, para poder realizar estudios sistemáticos, y dada la complejidad de los substratos naturales, se requieren superficies reproducibles, con composición química y morfológica bien caracterizadas, conocidas como superficies modelo. Utilizando superficies modelo se estudia la interacción de las enzimas con estas y es posible distinguir cuales aspectos de la estructura física y química (cristalinidad, rugosidad, reactividad, etc.) de la superficie de las fibras o agregados de celulosa o lignina tienen un efecto sobre las interacciones observadas experimentalmente (Konturri y cols., 2006). Las superficies modelo son una herramienta de la ciencia de materiales que consisten de una pequeña cantidad de compuesto o compuestos químicamente definidos, que son depositados de forma controlada desde fase gaseosa o líquida sobre una superficie plana e inerte, también llamada substrato sólido. El depósito controlado y sobre diseño del material permite que además de la naturaleza química del sistema, también se encuentren bien definidas su morfología y sus propiedades fisicoquímicas, lo que las vuelve útiles como unidades experimentales para estudios sistemáticos de interacción superficial, o para buscar nuevas aplicaciones nanotecnológicas, que no son posibles utilizando materiales heterogéneos, o de mezclas no definidas. Típicamente estas superficies tienen un grosor del orden de nanómetros, por lo que se les conoce también como películas delgadas. La figura 2.11 muestra la estructura y ordenamiento típico de estas superficies. PELÍCULA DELGADA FUNCIONALIZACIÓN DEL SUBSTRATO SUBSTRATO SÓLIDO

Figura 2.11. Estructura y ordenamiento típico de una superficie modelo. Aquí una película delgada de moléculas es depositada sobre un substrato sólido, que puede ser funcionalizado para aumentar la interacción entre las superficies.

La elección de la técnica de depósito se define en función de las propiedades de la molécula a depositar (composición, solubilidad, densidad, viscosidad, estabilidad, peso molecular), propiedades del solvente (volatilidad, miscibilidad, polaridad), características del medio (fuerza iónica, pH, campo magnético) y propiedades deseadas en la superficie (rugosidad, grosor). En general, el depósito se puede realizar desde fase gas (evaporación y sublimación en vacío, ablación láser), por inmersión en solución (autoensamblado), a partir de una solución (películas abiertas), por depósito por giro (spin coating, en inglés) o por depósitos tipo Langmuir (Seshan, 2002; Erbil, 2006). En estas superficies para estudiar su ordenamiento químico se utilizan técnicas espectroscópicas como son las Espectroscopías de fotoemisión de rayos-X, Raman e Infrarrojo por Transformada de fourier (Hu, 2008). Su topografía (rugosidad, distribución de material, grosor) se estudia con Microscopía de fuerza Atómica (AfM), mientras que para estudiar fuerzas de interacción se utiliza el Aparato de Fuerzas Superficiales o MFA (Riviere y Mihra, 2009). Por otro lado, la go-

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niometría (medición de ángulos de contacto) se utiliza para estimar la energía libre de superficie y la Microbalanza de Cuarzo con Disipación permite el estudio sistemático de grosor, adherencia, viscosidad y estabilidad de superficies modelo, así como las interacciones entre estas superficies y otras moléculas (Konturri y cols., 2006; Lucia y Rojas, 2009). El primer trabajo descrito del uso de superficies modelo de celulosa en vez de materiales naturales data de 1969 (Luner y Sandell, 1969), en el cual se crearon superficies de celulosa regenerada a partir de derivados, y se estudiaron sus propiedades superficiales e hinchamiento. Sin embargo, no fue sino hasta la década de 1990 que Neuman (Neuman y cols., 1993) retoman la investigación con superficies de celulosa (sin modificar) en trabajos orientados al estudio de fuerzas superficiales. La investigación con superficies modelo de celulosa continuó desde entonces utilizando principalmente derivados de celulosa como son la carboximetilcelulosa o trimetilsililcelulosa, regenerándola en este último caso a superficies de celulosa con vapores de ácido clorhídrico (Schaub y cols., 1993). Así mismo, se han presentado diversas soluciones y métodos para su producción, como por ejemplo, utilizando ácido trifluoroacético, el sistema n-óxido n-metilmorfolina y dimetil sulfóxido, y dimetilacetamida con cloruro de litio (Konturri y cols., 2006). Sin embargo, todas estas metodologías implican condiciones ásperas. Las superficies modelo de celulosa se han utilizado como unidades experimentales para medir fuerzas entre superficies (Holmberg y cols., 1997a), para evaluar su fuerza de interacción en presencia de diversas moléculas (Poptoshev y cols., 2000; Holmberg y cols., 1997b) y en estudios de la interacción de estas superficies con enzimas (Eriksson y cols., 2005a; 2005b; Josefsson y cols., 2008; Turon y cols., 2008)., Utilizando superficies modelo de lignina se han descrito estudios orientados al método de producción y caracterización para evaluar la morfología de las superficies en función de métodos de extracción distintos (Pasquini y cols., 2005), o incluso para buscar nuevas aplicaciones nanotecnológicas, como sensores (Pereira y cols., 2007). También se han utilizado para realizar estudios acerca de interacciones con polielectrólitos (Notley y Norgren, 2008), y de autoensamblaje molecular (Pillai y Renneckar, 2009). Para estos estudios, la lignina se ha disuelto de forma satisfactoria en acetona, N,N-dimetilformamida, DMSO, dioxano e hidróxido de amonio, etanol, tetrahidrofurano y cloroformo. Así mismo, en el Laboratorio de Biosistemas de la universidad Autónoma Metropolitana-unidad Cuajimalpa (México) en este momento se están realizando superficies modelo de mezclas lignocelulósicas con la intención de tener superficies más cercanas en su estructura y composición a las que se suelen encontrar las enzimas utilizadas para degradar estos compuestos (Espinosa-Domínguez y cols., 2010).

2.2.3.4. Membranas porosas con estructura hexagonal Los medios porosos son materiales estructurados que han generado un creciente interés debido a sus aplicaciones biotecnológicas. Para obtener un material micro- o nano- poroso se utilizan técnicas convencionales que manipulan macroestructuras para su miniaturización o técnicas de ensamblaje de unidades simples como átomos

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o moléculas para obtener estructuras más complejas. Se utilizan también técnicas híbridas que consisten en la combinación de los dos enfoques mencionados (Ohzono y cols., 2004). De esta manera, para lograr una estructuración regular y obtener materiales porosos, se utilizan copolímeros en bloque (Li y cols., 1996; Park y cols., 1997), partículas inorgánicas (Matsushita y cols., 1997; Park y cols., 1998), esferas de latex (Holland y cols., 1998), bacterias (Davis y cols., 1997; uraki y cols., 2007) y otros moldes biológicos como granos de polen (Hall y cols., 2003). Sin embargo, los inconvenientes son por una parte, la falta de herramientas especializadas para fabricar moldes y por otra, los costos implicados en la remoción necesaria de estos por calcinación o disolución selectiva. Como alternativa para obtener materiales porosos y en específico membranas, se utiliza una técnica de condensación de agua en interfases (TCA) la cual se basa en la precipitación de un material polimérico alrededor de gotas de agua (Widawski y cols., 1994). Para la fabricación de una membrana porosa con la TCA, primero el polímero se disuelve en un solvente no polar y altamente volátil. Posteriormente, la solución de polímero se deposita sobre un substrato (superficie sólida o interfase aire-agua) en una cámara con condiciones de alta humedad (mayor al 50% de humedad relativa). Debido a la evaporación rápida del solvente (proceso endotérmico) la solución actúa como una superficie fría en donde se condensan gotas de agua del ambiente húmedo (figura 2.12a). Dichas gotas de agua adoptan un ordenamiento hexagonal (correspondiente al estado de menor energía y más probable termodinámicamente) y actúan como moldes temporales para la formación de poros. En esta etapa, el polímero se precipita alrededor de las gotas en la interfase agua-solución y de esta manera estabiliza el ordenamiento hexagonal evitando la coalescencia entre gotas vecinas (figura 2.12b). En las últimas etapas de evaporación del solvente, un aumento de presión ocasionado por un aumento local de temperatura (al coexistir menos solvente) genera la apertura de la parte superior de la capa estabilizante de polímero en cada una de las gotas, dando lugar a orificios (poros) en las membranas. Una vez terminada la evaporación del solvente y el agua (figura 2.12c) se genera una membrana porosa con arreglo hexagonal (figura 2.12d). La TCA es aplicable a un gran número de materiales poliméricos y no está limitada al uso de moldes o herramientas. Sin embargo, el polímero utilizado es un factor crítico en la calidad de la membrana. La condensación y ordenamiento de gotas de agua sobre superficies o interfases aire-líquido (principalmente de solventes orgánicos) es un fenómeno común y bien estudiado (Knobler y cols. 1988). Pero en estos casos, debido a la ausencia de polímero, se observa coalescencia entre gotas circundantes derivando tanto en gotas de diferentes tamaños como en la pérdida del orden hexagonal. De este hecho, se resalta la importancia de la presencia del polímero y de sus propiedades en la obtención de membranas porosas con estructura hexagonal. Su arquitectura, concentración en solución, conformación en el solvente, grado de hidrofobicidad-hidrofilicidad (esto es, propiedades tensoactivas y las interacciones de la solución polimérica con agua/medios acuosos) y las propias interacciones entre las cadenas de polímero son factores que determinan el auto-ensamblaje y precipitación) alrededor de las gotas de agua. Todas estas y por lo tanto definen la calidad final de la membrana. Así mismo, mediante la manipulación y control de condiciones como el substrato, tempe-

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ratura, humedad, solvente y concentración de polímero se puede llegar a generar un amplio intervalo de tamaños de poro y mono o multicapas (Hernández-Guerrero y cols., 2005, 2008; Hernández-Guerrero y Stenzel, 2009; Wong y cols., 2006). a)

c)

b)

d)

figura 2.12. Pasos del mecanismo de formación de membranas porosas por la técnica de condensación en superficies (TCS). a) Evaporación del solvente y condensación de agua; b) estabilización del arreglo hexagonal por precipitación del polímero alrededor de gotas de agua; c) evaporación de agua; d) membrana porosa con arreglo hexagonal.

utilizando la TCA pueden generarse membranas porosas con estructura hexagonal a partir de celulosas funcionalizadas las cuales son tratadas en un paso posterior para obtener membranas de celulosa pura (Kasai y cols. 2004; Kadla y cols. 2007). En el Laboratorio de Biosistemas de la universidad Autónoma Metropolitana unidad Cuajimalpa (México) se estudian celulosas tipo II provenientes de agro-residuos industriales, tanto en sus propiedades interfaciales como en su capacidad para estabilizar el ordenamiento hexagonal de las gotas de agua durante la formación de las membranas porosas. Pruebas preliminares muestran que es posible la obtención de membranas porosas a partir de celulosa tipo II pues las membranas obtenidas tienen regiones de poros con ordenamiento hexagonal (figura 2.13). Con el método utilizado en este laboratorio se eliminan tanto la necesidad de regeneración de celulosa como los posibles daños a la estructura de las membranas durante el proceso de regeneración. La homogeneización de los poros para la obtención de membranas de celulosa tipo II es el objeto de estudio de este laboratorio hoy día.

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figura 2.13. Membrana porosa formada a partir de celulosa tipo II. En la imagen de microscopía se observa una región de poros con ordenamiento hexagonal.

2.3. cOnclusiOnes y perspectivas El análisis y propuestas de aprovechamiento de residuos agrícolas para nuevas aplicaciones, ha sido uno de los objetivos de la Red ENZNuT. Los desechos agroindustriales, en especial los del jitomate, representan una fuente importante de materia prima para la obtención de diversos biopolímeros. La generación de un 15 a 20% de desechos originados por la producción, transporte y almacenaje representa una gran cantidad de cáscara compuesta principalmente de ácidos grasos y material cuticular, así como otros componentes hidrofóbicos tales como el licopeno. El componente cuticular, un poliéster compuesto principalmente de ácidos ω,9- y ω,10-dihidroxihexadecanoicos que si pudieran ser recobrados, representarían un valor comercial importante al ser usados como bases biodegradables para polímeros, pinturas, recubrimientos, impermeabilizantes, etc. De la misma manera, se podrían utilizar en la industria farmacéutica, cosmetológica, de alimentos y de biomateriales. La investigación en el campo de biopolímeros obtenidos de residuos agroindustriales continúa tomando importancia. Diferentes industrias están tomando estas opciones para sus productos, principalmente en la producción de bioplásticos. Sin embargo, como se describió anteriormente, se requiere de mayor investigación para incrementar la extracción de monómeros así como para la producción de biopolímeros.

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El bagazo de caña, un residuo lignocelulósico difícil de aprovechar industrialmente por la complejidad descrita previamente, se ha propuesto y estudiado por diferentes grupos de investigación para el aprovechamiento de sus azúcares para obtención de bioetanol. Sin embargo, tanto la lignina como la celulosa, pueden tener aplicaciones de mayor valor agregado como las presentadas en este capítulo (síntesis de nutracéuticos, desarrollo de biorefinerías, superficies modelo y membranas porosas) al igual que otras aplicaciones ya exploradas tales como dispersantes, emulsificantes, vehículos para fármacos, para obtención de carbón activado, adsorción y remoción de metales, obtención de compuestos fenólicos, poliuretanos y poliésteres, en catálisis y en combinación con otros polímeros sintéticos para la obtención de termoplásticos. La Red ENZNuT ha favorecido la colaboración entre distintos grupos de líneas de investigación, no solo de Tecnología Enzimática, sino con otras muy diversas del área de Química, fisicoquímica y Ciencia de Materiales permitiendo el desarrollo multidisiciplinario sobre este tema.

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3. Obtención de pOlímerOs funciOnales a partir de desechOs aGrOindustriales usandO enzimas Oxidativas humberto García arellano Departamento de Ciencias Ambientales. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. universidad Autónoma Metropolitana, unidad Lerma, México erick J. cabrera eduardo torres Laboratorio de Bioinorgánica Aplicada. Centro de Química. Instituto de Ciencias de la Benemérita. universidad Autónoma de Puebla, México

3.1. lOs pOlímerOs y su clasificación Los polímeros son moléculas de muy alto peso molecular que consisten de unidades estructurales repetidas, los monómeros, que usualmente se mantienen unidas por enlaces covalentes formando una cadena. Los primeros polímeros empleados por el hombre fueron productos de origen natural, como el algodón, el almidón, las proteínas, la fibra de celulosa, la lana y el caucho natural; no fue hasta las primeras décadas del siglo xx cuando se desarrollaron los primeros polímeros sintéticos. Así, en 1909 Leo Baekeland introduce la baquelita, un polímero de fenol-cloroformo y en 1911 se obtiene la primera fibra sintética, el rayón, como sustituto de la seda. La síntesis de estos dos polímeros fue suficiente para demostrar el potencial de estos nuevos materiales y es inmediatamente después de la segunda guerra mundial que las nuevas tecnologías para la producción en masa de estos compuestos los hizo disponibles para toda la población. En esta época se desarrollaron compuestos como el nylon, el acrílico, el neopreno y el polietileno entre otros. A partir de ese momento y hasta nuestros días, la industria de los polímeros se ha diversificado y crecido hasta convertirse en una de las de mayor crecimiento a nivel mundial, llegando a representar hasta un 80 % de la industria de síntesis química. Actualmente, la gran mayoría de los polímeros de interés comercial se obtienen por medio de la síntesis química y encuentran aplicaciones en casi todas las industrias y áreas de nuestra vida. un tipo especial de polímeros, los plásticos, tienen un uso preponderante en la preparación de embalajes, pero los polímeros también se pueden encontrar como componentes y partes estructurales de diversos productos que incluyen desde juguetes, automóviles y utensilios del hogar, hasta consumibles y materias primas para la industria aeroespacial. Otros usos más especializados de los

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polímeros incluyen la síntesis de materiales biocompatibles para aplicaciones biomédicas, la síntesis de materiales fotorresistentes empleados en la elaboración de semiconductores y la síntesis de materiales de baja constante dieléctrica para procesadores de alto rendimiento y pantallas de computadoras. La gran versatilidad y aplicabilidad de los polímeros es un reflejo de sus propiedades químicas, físicas y mecánicas y estos a su vez son un reflejo de la estructura molecular (Rubinstein y Colby, 2003; Campbell y cols., 2006). Estructuralmente los polímeros pueden ser lineales, si están formados por una larga cadena de monómeros, o ramificados si contienen ramificaciones unidas covalentemente a la cadena principal. En los polímeros entrecruzados los monómeros de una cadena se encuentran unidos a los monómeros de otra cadena adyacente a través de enlaces covalentes, generando moléculas de alto peso molecular en forma de red tridimensional (Kratochvíl y cols., 1996). La densidad o grado de entrecruzamiento tiene gran influencia en las propiedades mecánicas del polímero. Densidades bajas de entrecruzamiento generalmente resultan en aumentos en la viscosidad, mientras que densidades de entrecruzamiento intermedias resultan en nuevas propiedades elastoméricas y en una mayor resistencia mecánica. Densidades de entrecruzamiento altas pueden resultar en materiales muy rígidos (Dante y cols., 2009). En cuanto al comportamiento térmico los polímeros pueden clasificarse en dos tipos generales. Los polímeros termoplásticos generalmente se producen en un solo paso y se transforman en productos finales en procesos posteriores. Cuando estos polímeros son sometidos a procesos térmicos se vuelven suaves y en este estado pueden ser moldeables (Baeurle y cols., 2006). Al enfriarse, recuperan su rigidez quedando con la forma final con la que fueron moldeados. Estos polímeros pueden ser reciclados ya que cada vez que se someten a procesos térmicos pueden ser moldeados para formar nuevos artículos. Los polímeros termoendurecidos se producen y se forman en un solo paso. Cuando se someten a proceso térmico por primera vez se vuelven suaves y al enfriarse se vuelven permanentemente rígidos (Odian, 2004). Estos polímeros se tornan suaves con calentamientos sucesivos pero no pueden ser remoldeados debido a que el polímero sufre degradación de su estructura con el recalentamiento. Los polímeros termoendurecidos son más fuertes, duros y tienen una mejor estabilidad dimensional que los polímeros termoplásticos. Pueden usarse a temperaturas más elevadas que los termoplásticos y son también químicamente más inertes pero no son reciclables. En cuanto a la naturaleza química de los monómeros que lo constituyen, los polímeros pueden clasificarse en homopolímeros cuando están constituidos por un solo tipo de unidad repetitiva y copolímeros cuando el polímero final es derivado de dos o más especies monoméricas (Odian, 2004). Como ejemplos comerciales de homopolímeros y copolímeros podemos citar al poliestireno y a la resina de estireno-acrilonitrilo (SAN por sus siglas en inglés) respectivamente. Dentro de un copolímero, los monómeros pueden estar organizados de manera alterna y regular, dando origen a copolímeros alternantes (Painter y Coleman, 1997). Los copolímeros periódicos contienen residuos monoméricos organizados en secuencias repetidas alternadas del tipo [XnYm…] en donde n y m usualmente son diferentes. En los copolímeros de bloques (block copolymers) los monómeros están arreglados a manera de secuencias largas de monómeros seguidas de secuencias largas del otro monómero (Painter y

Obtención de polímeros funcionales a partir de desechos agroindustriales…

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Coleman, 1997; Sperling, 2006). Los polímeros injertados (grafted copolymers) son un tipo especial de copolímeros ramificados que contienen una secuencia larga de un monómero, con frecuencia referida como el polímero base, y una o más ramificaciones, los injertos, de secuencias largas del segundo monómero (Odian, 2004). La figura 3.1 resume, de manera esquemática, algunos de los diferentes tipos de polímeros. Los polímeros también se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza en donde juegan un papel esencial para los seres vivos. Los polímeros naturales, también conocidos como biopolímeros son derivados de polisacáridos, proteínas, lípidos, polifenoles y otros grupos de moléculas especializadas que participan en la construcción celular, el almacenamiento de energía y en la conservación y transmisión de la información genética. Los polisacáridos son usados por los organismos vivos para la construcción de membranas y en la comunicación intracelular, así como elementos de reconocimiento molecular en la superficie de las células. Otras funciones incluyen la formación de estructuras de la pared celular y la formación de barreras protectoras alrededor de las células, además de otros usos como emulsificantes y adhesivos. Las proteínas funcionan como materiales estructurales, como elementos de reconocimiento molecular, en el control de funciones celulares y como catalizadores. Los polifenoles y otros polímeros más especializados en la naturaleza son empleados por los seres vivos como adhesivos, elastómeros, en el reconocimiento molecular y en la formación de componentes estructurales (Kaplan, 1998). Algunos de los polímeros naturales tienen un amplio uso a nivel industrial, mientras que otros permanecen infravalorados. Homopolímero Copolímero alternante Copolímero en bloque Copolímero injertado

figura 3.1. Esquema de los diferentes tipos de estructuras que se pueden encontrar en los polímeros.

3.2. biOpOlímerOs: almidón, celulOsa, quitina/quitOsanO y liGnina Dentro de los biopolímeros derivados de polisacáridos tienen especial interés el almidón, la celulosa y la quitina/quitosano. El almidón (figura 3.2) es un polímero de reserva sintetizado por las plantas que consiste en dos cadenas poliméricas principales, la amilosa y la amilopectina. La amilosa es un polímero lineal de moléculas de D-glucosa unidas por enlaces α-1,4 que presenta pesos moleculares del orden de 1x105 a 2x106. La amilopectina también es un polímero lineal de moléculas de Dglucosa unidas por enlaces α-1,4 que presenta ramificaciones de moléculas de glucosa unidas a través de enlaces α-1,6 y tiene pesos moleculares en el orden de 4x107 a

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4x108 (Kaplan, 1993). El almidón tiene interés industrial como biopolímero debido a su bajo costo y alta disponibilidad. La hidrólisis completa de almidón produce glucosa mientras que la hidrólisis parcial produce dextrinas que tienen aplicaciones en la industria alimentaria y del papel. El almidón también ha encontrado algunas aplicaciones industriales en el campo de los polímeros, pero su uso ha estado restringido debido a que sus propiedades mecánicas son limitadas. Esto ha llevado al desarrollo de nuevos almidones modificados usando mezclas de copolímeros y a la síntesis de copolímeros injertados con monómeros acrílicos y vinílicos buscando principalmente dos objetivos: mejorar las propiedades mecánicas y conseguir una mayor biodegradabilidad de los polímeros sintetizados (Narayan, 1989). La celulosa es el polímero natural más abundante sobre la Tierra, es un polímero lineal sintetizado por las plantas que consisten en monómeros de D-glucosa unidos por enlaces β-1,4 (Byrom, 1991) (Figura 3.2). Este tipo de enlace provoca que los ángulos de unión alrededor del oxígeno que conecta a los anillos de glucosa alcancen los 180° mientras que en los enlaces α-1,4 del almidón los ángulos de enlace solo alcanzan 120°. una consecuencia directa de este cambio sutil en la organización del polímero es que la gran mayoría de los animales superiores no pueden digerir la celulosa debido a que carecen del sistema enzimático necesario para degradarla. La celulosa encuentra aplicaciones primordialmente en la industria del papel, en la elaboración de membranas y películas, en la industria de alimentos y en medicina (Kaplan, 1998). En años recientes se ha puesto especial énfasis en el uso de residuos agroindustriales ricos en celulosa para la producción de bioetanol de segunda generación. A diferencia del almidón, la celulosa no puede ser procesada térmicamente debido a que puede sufrir descomposición térmica. Este biopolímero no es soluble en agua ni en la mayoría de los disolventes orgánicos, sin embargo, su solubilidad puede ser incrementada mediante reacciones de derivatización para generar carboximetil-celulosa, metil-celulosa, hidroxipropil-celulosa y otros derivados. Estos productos suelen ser más manejables y presentan mejores propiedades termoplásticas, lo que facilita la formación de películas que pueden tener distintas aplicaciones en la industria de los recubrimientos. Otras modificaciones sobre la celulosa incluyen la fosforilación, la acilación, la nitración, el entrecruzamiento y reacciones para generar polímeros injertados basados en celulosa (Stannett, 1989). La quitina, un polisacárido estructuralmente relacionado con la celulosa, es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza. Es un polímero formado por unidades de N-acetil-D-glucosamina unidas por enlaces β-1,4 (Figura 3.2). Es un polímero sintetizado por insectos y crustáceos como parte fundamental del exoesqueleto y por algunos hongos filamentosos que la incluyen como parte de la pared celular para proporcionar una mayor integridad estructural (Arcidiacono y Kaplan, 1992). La estructura de la quitina es idéntica a la de la celulosa excepto por el reemplazamiento del grupo OH del carbono C2 por un grupo NHCOCH3 en cada una de las moléculas de glucosa del polímero. La principal fuente de quitina la constituyen los residuos de los caparazones de los crustáceos de la industria pesquera. Por otra parte, el quitosano, un polímero constituido por unidades de 2-amino-2-desoxi-Dglucosa unidas por enlaces β-1,4, es sintetizado de manera conjunta con la quitina por algunos hongos como parte de su pared celular (Arcidiacono y Kaplan, 1992). El

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H HO HO

OH

H HO HO

H H

H

O OH

OH

H O HO

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O OH

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Amilopectina

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Amilosa

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OH

HO HO

H OH

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H OH

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H

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H

H H

H

113

H

H

H

H

HO

O

H OH OH

O

H

OH OH

H

OH

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OH

H O

H

H

H

Celulosa

HO H

HO H

H

H

O

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O

OH

H

H

H

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H

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OH

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OH

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H

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H

O OH NH

O

H

CH3

Quitina

OH

H HO

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HO H

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H

H

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H O

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HO H

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H

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NH2

CH3

H

H

NH H

OH

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H O

H

OH

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H

HO H

H

O OH NH2

H

Quitosano

figura 3.2. Estructura química de algunos polímeros naturales de interés en la industría biotecnológica.

quitosano es un copolímero formado por unidades de N-acetil-D-glucosamina y Dglucosamina unidas por enlaces β-1,4 (Figura 3.2). El quitosano es un policatión que se produce a partir de la quitina con una serie de reacciones secuenciales catalizadas por la quitina sintasa y la quitina desacetilasa, de tal manera que este biopolímero puede considerarse como una quitina desacetilada que es soluble en soluciones ácidas diluidas. El quitosano comercial, sin embargo, se produce a partir de la desacetilación de la quitina en reacciones de catálisis básica. El grupo amino primario en la molécula de quitosano le proporciona al polímero un sitio de anclaje para la unión de

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diferentes sustituyentes bajo condiciones suaves de reacción. Esta es una de las características fundamentales que diferencian al quitosano de la celulosa y que le hacen una molécula muy versátil. Algunos trabajos se han enfocado a la obtención de derivados funcionalizados del quitosano a través de modificaciones químicas, formación de injertos e interacciones iónicas (Muzzarelli, 1997). La quitina y el quitosano se han aplicado en el tratamiento de agua y efluentes debido a sus propiedades coagulantes y quelantes, como recubrimientos empleados en la industria textil, como encapsulantes para células y enzimas, en la elaboración de lentes de contacto y piel artificial para la industria farmacéutica, como alimento para ganado y en la industria alimenticia como agente espesante y estabilizante de emulsiones (Matur y Narang, 1990; Hudson, 1998). Otro biopolímero de interés es la lignina. La lignina es un polímero de origen vegetal que constituye el segundo depósito de carbono en la naturaleza, acumulando cerca del 30% del carbono orgánico en la Tierra (Ralph y cols. 2007). Este biopolímero se encuentra ampliamente distribuido en el reino vegetal encontrándose en todas las plantas vasculares. La lignina es un polímero fenólico amorfo que es esencial para la integridad estructural de la pared celular de las plantas, proporcionándoles rigidez y consistencia. Este biopolímero es una macromolécula polifuncional que en la naturaleza se encuentra asociada a moléculas de celulosa y hemicelulosa adyacentes formando estructuras altamente entrecruzadas. Durante el proceso de ensamblaje de la pared celular se sintetizan la celulosa y hemicelulosa y simultáneamente la lignina rellena las cavidades dejadas entre los dos polisacáridos manteniéndolos fuertemente unidos. Este proceso, llamado lignificación, es el que provoca el endurecimiento de las paredes celulares y protege al mismo tiempo al polisacárido de la degradación y del daño químico y físico (Mohanty y cols., 2005). La biosíntesis de la lignina ha sido revisada ampliamente por Argiropoulos y Menachem (1997) y Ralph y cols., (2007). La lignina se sintetiza a través de la vía del ácido shiquímico mediante el acoplamiento oxidativo de tres alcoholes fenil-propanóicos, el cumarílico, el sinapílico y el coniferílico. Estos precursores se unen de manera irregular y aleatoria dando lugar a una compleja estructura tridimensional. Los precursores una vez sintetizados, son transportados a la pared celular en donde son oxidados enzimáticamente. Las enzimas involucradas en esta reacción son variadas aunque predominan lacasas y peroxidasas de alto potencial redox. Después de esta oxidación, los alcoholes fenil-propanóicos son transformados a radicales fenólicos, que son relativamente estables debido a la presencia de sistemas de deslocalización de electrones. Los radicales son acoplados al polímero mediante un proceso aleatorio de polimerización por radicales libres, para extender la compleja red tridimensional de la lignina (Ralph y cols., 2007). La fórmula estructural exacta de la lignina aún no ha sido completamente elucidada, aunque la gran mayoría de los grupos funcionales y unidades que la constituyen ya han sido identificados. Una causa de esta carencia de información estructural definitiva es que no existen métodos efectivos para aislar a este polímero en su forma nativa a partir de las materias primas. El análisis del polímero ha revelado un alto contenido de carbono y un bajo contenido de hidrógeno, lo que sugiere un alto grado de insaturación o la presencia de grupos aromáticos y se ha identificado también la presencia de un gran número de grupos hidroxilo- y metoxilo- asociados al polímero. La topología de las

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ligninas extraídas de diferentes fuentes puede ser diferente, pero todas son consistentes en cuanto a su composición básica (Mohanty y cols., 2005). La lignina contiene en su estructura enlaces muy estables del tipo C-C, C-O-C y β–O-4, siendo el más común el enlace β–aril éter (β–O-4). La presencia de enlaces altamente estables, aunado a la gran complejidad tridimensional del polímero resultan en una estructura muy resistente a la degradación microbiana y enzimática (Singh nee’ Nigam y cols., 2009). Esta es una característica que diferencia a la lignina de otros biopolímeros que presentan enlaces hidrolizables recurrentes a intervalos periódicos a lo largo de su molécula. Las ligninas comerciales generalmente se obtienen a partir de métodos basados en la extracción ácida o con solventes dando como resultado ligninas con un alto grado de fragmentación o degradación y, como consecuencia final, con diferentes características químicas y estructurales. Debido a esta heterogeneidad la lignina y sus derivados tienen un uso limitado en aplicaciones especializadas que requieren materias primas bien definidas (Kubo y cols., 2005). De hecho, se estima que solo se usa un 2 % del total de la lignina disponible para fabricar productos de mayor valor agregado (Glasser y cols., 2000). una de las principales aplicaciones de la lignina y sus derivados se encuentra en la industria de los plásticos, pero su uso ha estado limitado debido a que la incorporación de monómeros o polímeros en la estructura de la lignina no ha producido mejoras en las propiedades requeridas para su uso como materiales estructurales. Sin embargo, estudios realizados por Glasser y colaboradores (1984, 1993) han demostrado que las propiedades físicas de los polímeros basados en lignina pueden ser manipuladas modificando la estructura de la red polimérica así como sus sustituyentes, encontrando que la fragilidad del polímero puede ser reducida incorporando diferentes poliéteres en la estructura. Otros estudios se han enfocado a la mejora del comportamiento termoplástico del polímero modificándolo con polivinil acetato y otros plastificantes (Feldman y cols., 1995; Li y cols., 1997) y a la obtención de fibras compuestas basadas en lignina (Kadla y cols., 2002), aunque los costos tienen que ser reducidos para hacer a estos polímeros más competitivos.

3.3. desechOs aGrOindustriales impOrtantes para la síntesis de biOpOlímerOs Los residuos agroindustriales son generados durante la cosecha y el procesamiento de productos de origen vegetal o animal. Los residuos generados durante la cosecha de productos vegetales comprenden los tallos, hojas, semillas, cáscaras y piel, así como pulpa y paja que se encuentran en cereales, legumbres, frutas y otros productos. Dentro de los residuos generados durante el procesamiento se encuentran las melazas, el bagazo, los residuos oleaginosos de algunas semillas, los subproductos de la molienda del maíz, y otros. En términos generales, los residuos agroindustriales contienen proteínas, polisacáridos, lignina y fitoquímicos y representan una fuente potencial de materiales que pueden ser procesados y reconvertidos para generar productos con aplicaciones en las industrias de alimentos y ganadería, en la recuperación de biopolímeros y generación de biocombustibles así como en la obtención de una gran variedad de químicos con alto valor agregado.

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Se ha estimado que la generación mundial de agro-residuos alcanza las 3.5x103 millones de toneladas (Elkholy y Eltantawy, 2000) y, aunque son una fuente rica en polisacáridos y lignina, generalmente reciben poca atención o son ignorados. Los dos métodos tradicionales de disposición de estos residuos consisten en el compostaje para su uso como fertilizante o como alimento animal, aunque en este último caso su utilización también es limitada debido a su baja digestibilidad. Los agro-residuos son ricos en material lignocelulósico, una estructura cristalina compuesta por celulosa, heteropolisacáridos ramificados como la hemicelulosa, y lignina (Glasser y cols., 2000), de hecho, se estima que la producción mundial de lignocelulosa alcanza los 300 millones de toneladas. Sin embargo, debido al proceso de lignificación, para que estos residuos puedan ser eficientemente utilizados es necesario encontrar métodos económicos y eficientes que permitan separar la celulosa y la hemicelulosa de la lignina. La celulosa puede ser extraída directamente a partir de residuos de la industria maderera y a partir de fibras vegetales empleadas en la industria textil. La forma más pura de la celulosa se encuentra en la borlas de algodón (en donde constituye hasta 85 a 95%), el yute y el cáñamo (60 a 75%) y la madera (40-50%). Otro residuo de especial importancia es el bagazo de caña de azúcar. La caña de azúcar es uno de los cultivos más extendidos en el planeta, cerca de 200 países cuentan con cultivos de esta planta. El mayor productor del mundo es Brasil con cerca del 25% de la producción mundial, seguido por la India, China, Paquistán y Tailandia (Parameswaran, 2009). México es el séptimo productor mundial con una superficie cultivada de más de 700 mil hectáreas que arrojan una producción de 50 millones de toneladas cada año (Bravo Garzón y Cortés García, 2009). Los usos de la caña de azúcar incluyen, además de la producción de azúcar, la producción de melazas, ron, cachaza y etanol. El bagazo de caña de azúcar es un residuo fibroso que resulta después de la molienda y extracción del jugo de los tallos de la caña de azúcar. Es el principal subproducto de la industria de la caña de azúcar llegando a alcanzar el 30% en masa de la materia prima que entra a proceso. El bagazo es un residuo lignocelulósico que contiene 50% de celulosa, 25% de hemicelulosa y 25% de lignina (Pandey y cols., 2000). Dentro de los usos que se le han dado a este residuo se encuentran la generación de electricidad, la elaboración de papel y pulpa de papel así como algunos productos de fermentación como alcohol, alcaloides, hongos, y enzimas. Algunos subproductos y residuos de la industria de los alimentos, como frutas, vegetales y cereales dañados y residuos generados durante la post-cosecha como hojas, semillas, pulpas, piel y cáscara, también contribuyen a la generación de residuos ricos en celulosa (Tabla 3.1). Como se ha comentado anteriormente, la lignina se encuentra entre los biopolímeros más abundantes en la naturaleza. Se estima que el planeta contiene cerca de 3x1011 de toneladas métricas de lignina. Este polímero constituye cerca del 30% en peso seco de las maderas suaves y un 20% de las maderas duras (Sjöström, 1981). Las ligninas son producidas como subproductos en el proceso de fabricación del papel. El volumen mundial de producción anual de ligninas derivadas de esta industria se estima en 100 millones de toneladas (Kubo y cols., 2005) mientras que la industria europea de la pulpa y el papel produce anualmente 11 millones de toneladas, 70% de las cuales se generan en el proceso de blanqueado (Monte y cols., 2009). El proceso de fabricación del papel involucra la separación química o mecánica de las fibras de

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celulosa de la materia lignificada, proceso que se conoce como deslignificación. Durante este proceso se generan residuos ricos en ligninas cuya composición depende de la calidad del papel producido, de las materias primas usadas y de las técnicas empleadas para separar los componentes. La relativa heterogeneidad de las ligninas producidas condiciona su uso y recuperación posterior y, debido a esto, generalmente son tratadas como un material de desecho con bajo valor agregado. Las ligninas se usan predominantemente como combustibles durante el proceso de recuperación química, aunque solo generan una cuarta parte del poder calorífico producido por un combustible común como el diesel. La lignina que llega a ser recuperada mantiene su naturaleza polimérica y, con ciertas modificaciones puede ser empleada en la formulación de aditivos y polímeros termoplásticos y termoendurecidos (Argiropoulos y Menachem, 1997). tabla 3.1. cOntenidO de pOlisacáridOs y liGnina en alGunOs residuOs aGrOindustriales (% pesO secO)a residuo Residuos de origen agrícola Cascarilla de cebada Cascarilla de avena Cascarilla de arroz Cascarilla de trigo Cáscara de algodón Bagazo de caña Granos y semillas Cebada Maíz Trigo Avena Sorgo frutas y vegetales

celulosa

hemicelulosa

lignina

44 41-43 33 30-39 59 40

27 16 26 36 15 29

7 11 7 10 13 13

5,3 2,4 2,1 11,9 2,7 1,3-14

– – – – 2,5 3,8-36

– – – – – trazas-35

Adaptado de Das y Singh, 2004.

a

La quitina y el quitosano son polímeros naturales abundantes y renovables que tienen excelentes propiedades de absorción, biodegradabilidad y biocompatibilidad. La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, cada año se producen más de 1x103 millones de toneladas de este material, principalmente por los animales marinos (Mathur y Narang, 1990). La fuente comercial de la quitina son los residuos de la industria pesquera, mayoritariamente caparazones de camarones, cangrejos y langostas, entre otros (Roberts, 1992). De acuerdo a un estimado, solo en los Estados unidos se procesan anualmente 150,000 toneladas de camarón, 25,000 toneladas de langosta y 85,000 toneladas de cangrejo. Si todo el material de desecho de esta industria se aprovechara para la extracción de la quitina se producirían 15,000 toneladas anuales del polímero. Los principales países productores son India, Polonia, Japón, Estados unidos, Noruega y Australia, mientras que otros países como México y Chile poseen grandes recursos que permanecen sin explotarse (Ravi Kumar, 2000; Dutta y cols., 2004). Los caparazones de los crustáceos están constituidos por entre un 15 y

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20% de quitina, entre 25 y 40% de proteínas y de 40 a 50% de carbonato de calcio. Las cutículas de los crustáceos ya descalcificadas pueden llegar a tener entre 55 y 85% de quitina. Otros componentes de los caparazones son las proteínas, lípidos y algunos carotenoides como la astaxantina (Mathur y Narang, 1990). En términos generales, la producción de la quitina a partir de los residuos de la industria pesquera es un proceso complejo que involucra pasos de lavado, molido y secado, desmineralización y desproteinización. El quitosano comercial, se produce a partir de la desacetilación de la quitina en reacciones de catálisis básica. La quitina se hace reaccionar a alta temperatura con soluciones alcalinas concentradas para eliminar algunos o todos los grupos acetil- que están unidos al grupo amino de la quitina. El producto obtenido, el quitosano, es una mezcla de polímeros con grados de desacetilación y tamaños diferentes. Las condiciones usadas en la desacetilación determinan el peso molecular del polímero y el grado de desacetilación (Bough y cols., 1978). Los componentes polifenólicos de frutas y vegetales han despertado gran interés en años recientes. Esto se debe principalmente a las posibles propiedades benéficas para la salud derivadas de su consumo que incluyen actividades antivirales y anticancerígenas, a la capacidad de inhibir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad y a la reducción del riesgo de sufrir enfermedades coronarias e infartos (Hertog y cols., 1992; Ho, 1992). Muchas de estas propiedades son atribuidas a las propiedades antioxidantes de los polifenoles. La uva, el vino, y especialmente el orujo de uva constituyen una fuente importante de estilbenos como el trans-resveratol, polifenoles como la trans-viniferina (Larrauri y cols., 1996; Rayne y cols., 2008) y otros fitoquímicos como los derivados cis- y trans- de los ácidos caftárico, coutárico y ferruoiltartárico, así como flavonoles glicosilados como la quercetina, kaempferol y rutina (Karadeniz y cols., 2000). La uva es uno de los principales cultivos en el mundo y su cosecha genera unos 60 millones de toneladas cada año. Cerca del 80% de la producción mundial es destinada a la producción de vino y el residuo sólido del proceso, llamado orujo, puede llegar a alcanzar el 20% de la materia prima que entra a proceso. La industria mundial del vino genera anualmente entre 5 y 9 millones de toneladas de orujo (Lafka y cols., 2007). Este residuo es rico en compuestos polifenólicos (Bonilla y cols., 1997) y es también una fuente potencialmente importante de trans-resveratrol. Después de la extracción, los residuos agotados pueden ser utilizados para la obtención de carbón activado (Corcho-Corral y cols., 2005) y otros biomateriales. Otros trabajos han sugerido la obtención comercial de resveratrol y otros estilbenos a partir de otros residuos agrícolas como las raíces de cacahuate (Chen y cols., 2002). Los residuos y subproductos sólidos del procesamiento de otros frutos, como la naranja y la manzana también se han utilizado para la extracción y producción de diferentes productos de valor agregado como ácidos orgánicos, compuestos aromáticos, heteropolisacáricos, oligosacáridos prebióticos y moléculas con actividad biológica (Mamma y cols., 2009).

3.4. enzimas Oxidativas: perOxidasas y lacasas Las peroxidasas (donor: hydrogen peroxide oxidoreductases) son oxidorreductasas que catalizan la oxidación de un electrón de una amplia variedad de moléculas

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usando peróxido de hidrógeno y otros hidroperóxidos como aceptor de electrones (Torres y Ayala, 2010). La reacción clásica catalizada por este grupo de enzimas es la deshidrogenación oxidativa, aunque también catalizan otras reacciones incluyendo la transferencia de oxígeno, la ruptura del peróxido de hidrógeno y algunas halogenaciones peroxidativas. Las peroxidasas son ubicuas en la naturaleza, encontrándose en microorganismos, plantas y animales. La gran mayoría de estas enzimas son glicoproteínas con pesos moleculares entre 35 y 100 kDa que contienen un grupo hemo (tipo b) en el sitio activo (Poulos, 1993; Banci, 1997). Las hemoperoxidasas se encuentran clasificadas en dos grandes superfamilias y cuatro pequeñas superfamilias no relacionadas. La superfamilia de las peroxidasas de origen animal incluye proteínas como la mieloperoxidasa, lactoperoxidasa y la peroxidasa tiroidea, así como otras proteínas aisladas de Drosophila, Caenorhabditis elegans e invertebrados como artrópodos y moluscos (Hiner y cols., 2002). Las enzimas de esta superfamilia son monómeros y dímeros que están constituidos mayoritariamente por α-hélices y contienen un grupo hemo unido covalentemente a la proteína. Las peroxidasas de origen vegetal, fúngico y bacteriano constituyen la segunda superfamilia que se subdivide, a su vez, en tres clases basándose en su origen y en el alineamiento de sus secuencias (furtmüller y cols., 2006; Ruiz-Dueñas, 2010). La clase I incluye peroxidasas extracelulares como la citocromo c peroxidasa y la ascorbato peroxidasa así como las peroxidasas-catalasas de origen fúngico y bacteriano. La clase II incluye peroxidasas fúngicas de alto potencial redox secretadas como la lignina peroxidasa, la manganeso peroxidasa y la peroxidasa versátil. La clase III está constituída por peroxidasas secretadas de origen vegetal como la peroxidasa de rábano (Hiner y cols., 2002). Las proteínas de esta superfamilia son monoméricas y presentan un mismo plegamiento helicoidal. El grupo hemo no está unido covalentemente a la proteína y se ubica en una cavidad interna de la proteína que se comunica con el solvente por uno o dos canales que permiten la entrada del peróxido y de sustratos reductores pequeños (Ruiz-Dueñas, 2010). Las cuatro familias adicionales que complementan esta clasificación comprenden la superfamilia de las catalasas, la superfamilia de los citocromos c peroxidasa que contienen dos grupos hemo, la superfamilia de las peroxidasas decolorizantes y la superfamilia de las hemo-tiolato peroxidasas (haloperoxidasas) a la que pertenece la cloroperoxidasa y la peroxigenasa aromática. El grupo hemo de las peroxidasas es una ferro-protoporfirina IX que contiene, en su estado nativo, un átomo de fe en estado de oxidación +3 (fe+3). El átomo de hierro se encuentra pentacoordinado con los 4 nitrógenos del anillo pirrólico del grupo hemo y con un nitrógeno de una histidina axial (un tiolato de una cisteína en el caso de la cloroperoxidasa). La sexta posición de coordinación no se encuentra ocupada lo que determina que el átomo de hierro permanezca con un alto spin (Banci, 1997). El mecanismo catalítico de las peroxidasas ya ha sido extensivamente revisado (Dunford, 1991; Ortiz de Montellano, 1992; Veitch, 2004). El primer paso en la reacción involucra la adición de H2O2 al fe+3 liberando H2O y dando lugar a la formación del compuesto I. Este compuesto I es un radical catiónico que contiene un centro oxoferril (fe+4=O) que se encuentra dos estados de oxidación por arriba del fe+3. El segundo paso de este ciclo involucra la presencia de un sustrato reductor que lleva a cabo la reducción de un electrón del compuesto I generando el compuesto II. Este es

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un centro oxoferril (fe+4=O) que solo se encuentra un estado de oxidación por arriba del estado nativo. Tanto el compuesto I como el compuesto II son altamente oxidantes, con potenciales redox estimados cercanos a +1 V. El compuesto II se reduce en un electrón por una segunda molécula de sustrato regenerando el estado inicial (fe+3) de la enzima. En presencia de un exceso de peróxido el compuesto II da lugar a la formación del compuesto III, un radical altamente reactivo que puede reaccionar con el anillo de la porfirina provocando la inactivación irreversible de la enzima. Las peroxidasas secretadas por hongos ligninolíticos son de especial interés debido a su alto potencial redox. Estas enzimas están involucradas en la degradación de la lignina y son ampliamente versátiles en la naturaleza. El sistema modificador de lignina secretado por los hongos ligninolíticos está constituido principalmente por cuatro enzimas, la lignina peroxidasa (LiP), la manganeso peroxidasa (MnP), la peroxidasa versátil y la lacasa, aunque se incluyen otras enzimas como la veratril alcohol oxidasa, la aril alcohol deshidrogenasa, la quinona oxido-reductasa, y otras que son menos relevantes. La lignina peroxidasa es una glicoproteína rica en manosa con pesos moleculares entre los 38 kDa y 43 kDa. Esta enzima cataliza la despolimerización oxidativa de una gran variedad de compuestos fenólicos y no fenólicos derivados de la lignina en una reacción que depende de la presencia de H2O2. La LiP juega un papel central en la degradación de la lignina ya que posee un potencial redox cercano a 1.4 V. Esta característica permite que la LiP pueda oxidar, sin el requerimiento de mediadores redox, sustratos aromáticos no fenólicos que no son oxidados por otras enzimas. La lignino peroxidasa utiliza un mecanismo de oxidación por radicales libres para escindir las cadenas laterales de las subestructuras de la lignina y se ha demostrado que es capaz de despolimerizar la lignina in vivo (Shoemaker, 1985; Hammel y cols., 1993). La manganeso peroxidasa es una glicoproteína extracelular que se secreta en múltiples isoformas. La MnP cataliza la oxidación de Mn(II) a Mn(III) dependiente de H2O2. El Mn(III) generado forma un complejo con oxalato u otros quelantes y este complejo funciona como un mediador difusible de bajo peso molecular en la oxidación de sustratos fenólicos, aminas y subestructuras fenólicas derivadas de la lignina (Dashtban, 2010). La MnP presenta potenciales redox menores a los reportados para la LiP y normalmente no oxida derivados de lignina no fenólicos. Las enzimas del sistema de degradación de lignina encuentran aplicaciones importantes en tratamiento de efluentes contaminados con colorantes, fenoles y otros xenobióticos. También se ha estudiado su posible aplicación en la industria de la pulpa y el papel, en la industria textil, en la estabilización de bebidas como vino y jugos, en la industria cosmética y en la elaboración de biosensores (Niladevi, 2009). Otras transformaciones catalizadas por peroxidasas incluyen, además, la transferencia de electrones, halogenación, sulfoxidación, epoxidación, desmetilación, deshidrogenación e hidroxilación (Adam, 1999). Las lacasas (p-difenol:oxígeno oxidorreductasa, EC 1.10.3.2) son oxidasas que contienen cobre y que catalizan la oxidación, de un electrón de orto- y para- difenoles y aminas aromáticas acoplada a la reducción de oxígeno molecular a agua. Las lacasas se encuentran dentro de las enzimas más estudiadas. fueron inicialmente aisladas en 1883 a partir la savia del árbol de la laca (Rus vernicífera) y fueron posteriormente caracterizadas como metaloenzimas. Las lacasas se han detectado en dife-

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rentes organismos que incluyen, además de las plantas, insectos (Sidjanski y cols., 1997) y bacterias (Alexandre y Zhulin, 2000), pero son especialmente abundantes en la gran mayoría de los hongos de la podredumbre blanca (Rodríguez Couto y TocaHerrera, 2006). Las lacasas de origen fúngico son glicoproteínas con pesos moleculares entre los 50 y 130 kDa que presentan grados de glicosilación entre el 10% y un 45% y puntos isoeléctricos entre 3.0 y 7.4. Aunque el papel de estas enzimas todavía no se conoce con detalle, se les considera como uno de los componentes más importante del sistema ligninolítico de los hongos degradadores de la madera. En ensayos in vitro las lacasas son capaces de degradar la lignina pero los productos de bajo peso molecular resultantes de esta reacción son capaces de repolimerizar. Por otra parte, también se ha observado que algunos de los productos de la degradación enzimática de la lignina resultan ser tóxicos para el micelio del hongo. Estas dos observaciones han llevado a plantear que el papel principal de la lacasa no es la oxidación y degradación de la lignina, sino la destoxificación de los productos de bajo peso molecular resultantes de su degradación por medio de su conversión en polímeros no tóxicos para el hongo (Morozova y cols., 2007). El sitio activo de las lacasas contiene cuatro átomos de cobre que se encuentran organizados en un sitio mononuclear tipo T1 y un sitio trinuclear conformado por un sitio tipo T2 y dos sitios tipo T3 (Malmstrom, 1982; Solomon y cols., 1996). Los átomos de cobre se clasifican en tres tipos de acuerdo a sus propiedades paramagnéticas y espectroscópicas. un cobre paramagnético tipo 1 (T1) le da el característico color azul a las lacasas. Este cobre muestra señales de absorción intensas alrededor de los 600-610 nm y está coordinado con dos histidinas y una cisteína que forman una estructura trigonal. un segundo átomo de cobre paramagnético, el cobre tipo 2 (T2), se encuentra coordinado por dos histidinas que forman un complejo tetragonal y no presenta bandas de absorción características en el espectro visible. Dos átomo de cobre tipo 3 forman el sitio T3, este es un centro de cobre binuclear que se encuentra coordinado por seis histidinas y presenta bandas de absorción características a 330 nm. Basándose en el potencial redox del sitio T1 las lacasas pueden clasificarse como lacasas de potencial redox alto (730-790 mV), medio (470-710 mV) y bajo (430 mV) (Eggert, 1998). Dentro de la enzima el sitio T1 es el principal aceptor de electrones provenientes del sustrato reductor, de tal forma que las lacasas solo pueden oxidar directamente sustratos con potenciales redox similares o ligeramente mayores al potencial redox del sitio T1. De esta manera, el potencial redox está directamente relacionado a la capacidad de las lacasas para realizar reacciones de oxido-reducción (Xu, 1997). El número de sustratos que pueden ser oxidados por las lacasas puede ser incrementado usando mediadores redox. Estos mediadores son compuestos de bajo peso molecular que al ser oxidados por la enzima generan radicales catiónicos muy inestables y reactivos que funcionan como intermediarios. Bajo condiciones de difusión controlada los intermediarios pueden oxidar a otros compuestos, incluyendo a algunos que no son sustratos directos de las lacasas debido a su alto potencial redox. Durante este proceso el mediador oxidado se reduce regresando a su estado original para completar el ciclo (Rodríguez Couto y Toca-Herrera, 2006). La gran mayoría de las posibles aplicaciones de las lacasas están basadas en la capacidad de la enzima para generar radicales libres durante la oxidación de diferen-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

tes sustratos y, debido a esta relativa inespecificidad, las lacasas encuentran nichos especiales de aplicación en las industrias del papel, textil y cosmética, así como en la decoloración y destoxificación de aguas residuales, en elaboración de biosensores y en la degradación de xenobióticos y biorremediación (Morozova y cols., 2007). Aplicaciones más especializadas incluyen la deslignificación de la lignocelulosa y la modificación de materiales lignocelulósicos buscando impartirles nuevas propiedades (Bajpai, 1999; Balakshin, 2001).

3.5. pOlimerización de fenOles: mOnO y pOlifenOles prOvenientes de desechOs aGrOindustriales Las enzimas oxidativas como lacasa y peroxidasas tienen la capacidad de oxidar con gran facilidad a los compuestos fenólicos, de hecho muchos de ellos son sus sustratos naturales, cuya oxidación da lugar a componentes de pared celular, o compuestos utilizados en defensa celular (Torres y Ayala, 2010). Las enzimas oxidativas provenientes de hongos son utilizadas por el microorganismo para degradar a la lignina mediante la oxidación de sus fragmentos fenólicos, con esto, la lignina se rompe parcialmente, dejando acceso hacia la celulosa, que es la fuente de carbono para el crecimiento de los hongos. Los fenoles son compuestos orgánicos en cuyas estructuras moleculares contienen al menos un grupo fenol, un anillo aromático unido a por lo menos un grupo funcional hidroxilo como las mostradas en la figura 3.3, y de fácil oxidación dada la disponibilidad y número de electrones en su estructura. La oxidación de fenoles catalizada por enzimas tiene una tendencia lineal respecto al potencial redox de estos compuestos, a mayor potencial mayor dificultad para oxidarlo, mientras que a menor potencial, la velocidad de oxidación es más alta (Ayala y cols., 2007). Las velocidades de oxidación de fenoles por las peroxidasas y lacasas son de las más altas reportadas para estas enzimas y ocurre mediante un mecanismo de oxidación de un electrón (Ortiz de Montellano, 2010), que produce un radical fenólico altamente reactivo. Este radical puede recombinarse con otro radical producido vía enzimática para generar un dímero, o reaccionar con un dímero previamente producido para generar un trímero, este mecanismo no enzimático puede repetirse hasta llegar polímeros de peso moleculares de varios miles (figura 3.4). Los fenoles son sustancias con enorme valor industrial, directamente o en derivados, se usan como desinfectantes, anestésicos tópicos y germicidas. Grandes cantidades de fenol se usan para la producción de formaldehído, resinas y plásticos. Los fenoles como desechos son constituyentes principales encontrados en los efluentes de los procesos de conversión de carbón, hornos de coque, refinerías de petróleo, manufactura de resinas fenólicas, fibras de vidrio, herbicidas y petroquímicos (Beszedits y Silbert, 1990). Se consideran que son carcinogénicos, mutagénicos, teratogénicos y tóxicos aun a bajas concentraciones (1 µg/L). Sin embargo, otra clase de fenoles, como los flavonoides (figura 3.5), son benéficos a la salud y, como se describió en el apartado anterior, son encontrados en los desechos agroindustriales que podrían ser aprovechados mediante el uso de enzimas oxidativas, para generar compuestos con aplicaciones potenciales en el área médica o de alimentos.

Obtención de polímeros funcionales a partir de desechos agroindustriales… OH

OH

OH

123

OH

OH Fenol

Catecol

OH

Hidroquinona

OH

OH Cl

Cl

Cl Fenol

Cl p-Clorofenol

Cl 2,6-diclorofenol

2,4,6-triclorofenol

figura 3.3. Ejemplo de compuestos fenólicos que son sustratos de enzimas peroxidasas y lacasas.

Los flavonoides han sido sujetos de modificaciones catalizadas por enzimas para mejorar aún más sus propiedades biológicas, como el aumento solubilidad en agua, o para conferirle nuevas propiedades. Por ejemplo Yaipakdee y Robertson publicaron el incremento de la actividad anti-ansiolítica de algunos flavonoides después de ser modificados mediante la halogenización de los mismos. Los flavonoides halogenados como la la 6-bromoflavona y la 6-bromo-3-nitroflavona tienen actividades cercanas o superiores a la del diacepam, un derivado de las benzodiacepinas, que es una droga muscular clásica ansiolítica, anticonvulsionante, sedante y relajante de los músculos del esqueleto. Por lo tanto, la halogenación de flavonoides es una importante cuestión de la investigación donde ya se han reportado varios métodos usando enzimas. Por ejemplo, la enzima cloroperoxidasa de Caldaromyces fumago fue capaz de halogenar las flavanonas naranginina y hesperetina (figura 3.5) en presencia de iones bromo o cloro (Yaipakdee y Robertson, 2001). Los productos biohalogenados de ambos flavonoides fueron aislados y caracterizados, resultando ser idénticos a los obtenidos mediante métodos químicos. En otro ejemplo en la literatura se llevó a cabo la polimerización enzimática de dos flavonoides (a través del mecanismo descrito en la figura 3.4), quercetina y kaempferol (figura 3.5), utilizando la lacasa y la tirosinasa de Ustilago maydis. El resultado mostró

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos OH

O*

Peroxidasa H2O2

Acoplamiento

OH

OH

Propagación

OH

OH

Cadena de polímeros

figura 3.4. Ejemplo representativo de la polimerización de fenoles por peroxidasas en presencia de peróxido de hidrógeno.

que la lacasa y la tirosinasa lograron catalizar la polimerización de la quercetina, produciendo agregados con un alto peso molecular y una alta actividad antioxidante, mayor incluso que la mostrada por el monómero del mismo compuesto. Para el caso de kaempferol los agregados alcanzaron grandes tamaños en las primeras 2 horas de la reacción y su capacidad antioxidante también se vió incrementada. Los polímeros de quercetina y kaempferol a bajas concentraciones mostraron un fuerte efecto de secuestro para las especies reactivas del oxígeno (oxidantes) y la inhibición de la lipoperoxidación en células hepáticas humanas (Mendoza y cols., 2006). Otro ejemplo de polimerización de fenoles es la de la catequina (figura 3.5) por la peroxidasa de rábano y la lacasa de Myceliophthora thermophila. El polímero producido mostró propiedades antioxidantes mucho mejores que el monómero de catequina. Para determinar la actividad antioxidante, los autores midieron la capacidad de este polímero de secuestrar radicales libres como el anión superóxido, un radical

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común durante el estrés oxidativo que produce daño celular; así como también midieron la capacidad de la policatequina producida para inhibir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad. a) Familias de flavonoides, núcleo común

1 O

1 2

1 O

3

2 3

O

2 3

O

O

Flavonoides

Isoflavonoides

Neoflavonoides

b) Algunos flavonoides de interés

OH HO

OH

O

OH

OH HO

O

O

OH OH

O O

OH OH

O

HO

O Quercetina

HO OH

OH

OH HO

HO

O

O

OH Rutina

OH

O OH

OH

O

OH

Naringenina

O Kaempferol

OH

OH

OCH3 HO

O

OH HO

O OH

OH

O Hesperetina

OH Catequina

Figura 3.5. Algunos flavonoides de interés utilizados para la modificación de biopolímeros con peroxidasas o lacasas.

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La rutina (figura 3.5) también ha sido polimerizada utilizando la lacasa de M. thermophila, produciendo polímeros de diferentes pesos moleculares en el rango de 7900 a 11000 Da, dependiendo del medio de reacción utilizado. Los polímeros producidos exhibían mayor solubilidad en agua y disolventes que el monómero de rutina, lo que podría facilitar su aplicación con fines médicos ya que los polímeros presentaron mejores actividades antioxidantes que el monómero y una mayor protección a la muerte celular causado por daño oxidativo por radicales libres (Kurisawa y cols., 2003). Adicionalmente, se reportó la polimerización de catequina sobre una superficie polihiédrica de silsesquioxana (POSS). El conjugado presentó una importante actividad antioxidante adicionalmente a las propiedades como alta estabilidad térmica y baja permeabilidad de oxigeno, permitiendo incrementar su potencial de aplicación en bioembalajes solo por mencionar un ejemplo (Ihara y cols., 2005).

3.6. mOdificación de pOlímerOs naturales utilizandO perOxidasas y lacasas Como se mencionó previamente, el quitosano es un compuesto proveniente de la desacetilización (remoción de grupos acilo) de la quitina, desecho de la industria pesquera en especial de la camaronera, con aplicaciones interesantes en las industrias de alimentos, de salud y agrícola. Este biopolímero contiene en su estructura (figura 3.2) grupos hidroxilos y aminos disponibles para reacción, por lo que puede ser modificado por diferentes vías químicas o enzimática para mejorar sus propiedades o incluso crearle nuevas. Un ejemplo de modificación enzimática del quitosano se reportó en el trabajo: Las propiedades antimicrobianas y antioxidantes del quitosano funcionalizado enzimáticamente con flavonoides (Sousa y cols. 2009). En este estudio las fibras del quitosano fueron modificadas con flavonoides usando la enzima tirosinasa de hongo. La enzima oxidó a los flavonoides para producir o-quinonas del mismo compuesto, las cuales son altamente reactivas hacia nucleófilos como el grupo amino del quitosano, esta reacción se ejemplifica en la figura 3.6 para el caso de quercetina. Como resultado de la modificación se incrementó la actividad antioxidante de las fibras del quitosano. Además algunos flavonoides incrementaron la capacidad antimicrobiana del biopolímero contra dos microorganismos patógenos como Bacilus subtillis y Pseudomonas aureginosa (Sousa y cols. 2009), los cuales son agentes infecciosos de hospitales con efectos graves en la salud. En otro trabajo relacionado, basado en el mismo principio de la figura 3.6, la tirosinasa de hongo fue usada para llevar a cabo el injerto de caseína (figura 3.7) sobre el quitosano. Es importante mencionar que la caseína se encuentra en cantidades abundantes en los residuos de la industria lechera. Cuando este dipéptido fue oxidado con tirosinasa y quitosano, hubo un incremento notorio en la viscosidad de la solución, dando como muestra una evidencia física de que la tirosinasa catalizó la inserción del péptido sobre la estructura química del quitosano. Con la metodología empleada a las soluciones que contenían 1 w/w % del quitosano modificado presentaron mayor

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OH Quercetina HO

OH

O

HO

Lacasa

O2

O

O

OH

OH OH

O

Quinona

OH

O

H 2O

O

Quitosano Base de Schiff OH

OH OH

O

O O *

O

O

O HO

HO

NH2 HO

HO

N

NH2

O

O

OH OH

O

Figura 3.6. Modificación enzimática del quitosano con flavonoides catalizada por peroxidasas o lacasas. La reacción es iniciada por la oxidación del compuesto fenólico, seguida por el ataque nucleofílico del grupo amino del quitosano.

viscosidad y propiedades de adelgazamiento de corte; es decir, el quitosano modificado podría ser usado como un agente engrosador de alimentos (que incrementa la viscosidad) (Aberg y col.2004). En otro ejemplo sobre el aprovechamiento de desechos asociados a la biocatálisis, se reportó la preparación de un quitosano modificado con catequina utilizando tirosinasa como biocatalizador. La catequina es un flavonoide presente en las hojas de té verde. Con la inserción de la catequina en la estructura del quitosano, se desarrolló un aditivo para incrementar la viscosidad de alimentos como mayonesa o mermeladas (Wu y cols., 2002). Por otro lado, se ha reportado la modificación enzimática del quitosano con hexiloxifenol (figura 3.7) para alterar sus propiedades reológicas y de superficie, impor-

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tantes en la formación de películas como recubrimiento de alimentos o de medicamentos. El quitosano modificado con hexiloxifenol mostró cambios importantes en su comportamiento fisicoquímico. La medida del ángulo de contacto (parámetro de hidrofobicidad) mostró que la modificación con hexiloxifenol aumentó la hidrofobicidad del quitosano, lo cual es potencialmente útil para generar películas repelentes al agua (Chen y cols., 2000). OOC

NH

O O(CH2)5 -CH3

NH3

Caseína

OH Hexyloxyfenol OH

figura 3.7. Ejemplo de moléculas de naturaleza fenólica diferentes a los flavonoides injertadas en el quitosano mediante tirosinasa.

Además del quitosano, dos biopolímeros presentes abundantemente en los desechos agroindustriales son la celulosa y la lignina. En el trabajo realizado por Elegir y cols., (2008) se llevó a cabo la oxidación de diferentes compuestos fenólicos presentes en compuestos naturales como el ácido caféico, el ácido p-hidroxibenzóico y el aceite esencial isoeugenol (figura 3.8) para la modificación de celulosa a través del mecanismo propuesto anteriormente para el quitosano. La celulosa mostró propiedades antimicrobianas al ser modificada con los fenoles, actividad que previamente no tenia, inhibiendo el crecimiento de algunos microorganismos como Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Para apoyar este estudio, los autores prepararon superficies con la celulosa modificada y monitorizaron el crecimiento de los diferentes microorganismos sobre esta superficie. Después de 24 horas de incubación, el control con celulosa natural permitió el crecimiento de todos los microorganismos ensayados, mientras que la modificada con los compuestos fenólicos inhibió importantemente el crecimiento de Staphylococcus aureus (Elegir y cols., 2008). En un estudio reciente se modificó enzimaticamente la lignina utilizando la lacasa y como sustratos aminas fenólicas, fluorofenoles y algunos preservativos de madera de naturaleza fenólica. Estos sustratos pueden reaccionar con la lacasa de la misma manera que los fenoles descritos anteriormente, generando especies intermedias que reaccionan con los centros nucleofílicos de la lignina. La lignina modificada fue caracterizada utilizando diversas técnicas de espectroscopia, cromatografía y microbiología (Kudunga y cols., 2010).

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OH

O

OH OCH3

COOH

HO HO

OH ácido cafeico

ácido p-hidroxibenzóico CH2OH

CH2OH

H3CO OH alcohol sinapílico

isoeugenol CH2OH

OCH3

H3CO OH

alcohol coniferílico

OH alcohol p-cumarílico

figura 3.8. Ejemplos de compuestos fenólicos con propiedades antimicrobianas y antioxidantes utilizadas para la modificación de biopolímeros usando peroxidasas y lacasas.

3.7. aplicaciOnes y perspectivas La condiciones suaves de reacción como las utilizadas en las reacciones enzimáticas proporcionan un escenario ambientalmente respetuoso para la síntesis o modificación de polímeros, planteando una clara alternativa a la vía química en condiciones drásticas de reacción como altas temperaturas y presiones, empleo de reactivos peligrosos y generación de desechos tóxicos. Los polímeros de flavonoides obtenidos vía enzimática con lacasas, tirosinasas y peroxidasas muestran una mejora importante en la capacidad antioxidante al proveer de más grupos funcionales la estructura química, comparada con el monómero del flavonoide. Estas características mostradas por los poliflavonoides –mejorada capacidad antioxidante por ejemplo- la presentan como una molécula potencial como agente terapéutico para evitar enfermedades relacionadas con los radicales libres, ya que por ejemplo, la oxidación de lipoproteínas de baja densidad puede provocar un aumento en el índice aterogenicidad, que indica el potencial de obstrucción de las arterias (mientras más bajo sea su valor, menor es el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares); así pues, el desarrollo de inhibidores de esta oxidación puede influir en la disminución de enfermedades cardiovasculares. En el área de alimentos, los poliflavonoides, podrían aplicarse como aditivos para evitar la oxidación rápida de frutas o verduras y así alargar su vida de almacenamiento. Además, pueden ser adicionados como elementos nutra-

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céuticos en alimentos para mejorar la ingesta de compuestos antioxidantes, y así ejercer su acción terapéutica desde la dieta. Los polímeros naturales como el quitosano, la celulosa o la lignina pueden formar superficies que los hace interesantes candidatos para la generación de embalajes biodegradables; sin embargo, se presentan algunas limitaciones por su fragilidad mecánica y baja actividad biológica (excepto el quitosano, el cual se caracteriza por su amplio número de funciones biológicas). En este sentido, la modificación enzimática de estos biopolímeros se presenta como una herramienta interesante para mejorarles o proveerles de nuevas actividades biológicas. Los biopolímeros modificados comentados en el apartado anterior, con mejores propiedades antimicrobianas y antioxidantes, podrían ser aplicados para desarrollar embalajes biodegradables o recubrimientos comestibles con actividad protectora para alargar la vida de almacenamiento de alimentos, al inhibir la contaminación por microorganismos y evitar el oscurecimiento de los alimentos por su oxidación. Particularmente interesantes son los biopolímeros modificados con flavonoides ya que ambos componentes pueden ser encontrados en grandes cantidades en los desechos agroindustriales. El quitosano modificado con catequina podría ser utilizado como aditivo para aumentar la viscosidad de alimentos como mayonesas, o de otros productos como cremas. Además, dado que el quitosano se ha utilizado para producir vendas, piel sintética o prótesis, el hecho de que presente actividades antimicrobianas mejoradas o alta capacidad antioxidante potencia aun más esta área de aplicaciones médicas. Por otro lado, la modificación de la lignina con compuestos antioxidantes o antimicrobianos como los fenólicos podría producir a corto plazo materiales resistentes con mayor vida útil y con la capacidad de retener en su estructura el compuesto fenólico, que de otra manera es aplicado sobre la superficie llegando a desprenderse y causar problemas de contaminación al ambiente o toxicidad al contacto. Sin duda, la tendencia mundial a los procesos limpios, el aprovechamiento de recursos abundantes de bajo precio con propiedades interesantes, y la generación de productos considerados naturales, será de gran importancia para el desarrollo y aplicación de procesos enzimáticos, particularmente de las enzimas oxidativas dada su amplio intervalo de sustratos reconocidos, y la facilidad de uso, así como la variabilidad de fuentes de obtención.

aGradecimientOs Los autores agradecen el apoyo otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (Conacyt CB-2007/80986), PROMEP 103.5/11/5880.

referencias 1. aberG, C., chen, T., olumide, A., raGhavan, S., Payne, G. «Enzymatic grafting of peptides from casein hydrolysate to chitosan. Potential for value-added byproducts from food-processing wastes», Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (2004), pp. 788-793.

Obtención de polímeros funcionales a partir de desechos agroindustriales…

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4. prOducción de sucedáneOs de Grasa de leche humana catalizadOs pOr lipasas carla tecelão Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar, Grupo de Investigação em Recursos Marinhos, Instituto Politécnico de Leiria, Portugal Francisco valero Departament d’Enginyeria Química, EE, universitat Autònoma de Barcelona, España GeorGina sandoval Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), México suzana Ferreira-dias Instituto Superior de Agronomia, CEER-Biosystems Engineering, Technical university of Lisbon, Portugal

4.1. intrOducción La leche humana es una emulsión de aceite y agua de elevada riqueza nutricional, proporcionando importantes beneficios para los lactantes desde el punto de vista energético, inmunológico, intelectual y motor. La leche materna está constituida por aproximadamente el 87% de agua y una fracción rica en grasas, sales minerales, vitaminas, enzimas e inmunoglobulinas. Estas últimas desempeñan un papel importante a nivel del sistema inmunitario del lactante. La proteína predominante en la leche humana es la lactoglobulina (80% del contenido proteico), siendo el principal glúcido la lactosa, presente en una concentración del 7%. La leche humana es rica en aminoácidos no esenciales como la cisteína y la taurina, desempeñando un papel preponderante en el desarrollo del sistema nervioso del recién nacido (Silva y cols., 2007). La grasa de leche humana (GLH) constituye una de las principales fuentes de nutrientes y de energía para el recién nacido. La composición de su fracción lipídica, comprende mayoritariamente triacilgliceroles (TAG), cerca del 98%, un 1.3% de fosfolípidos y un 0.4% de colesterol (Jensen, 1996). Los ácidos grasos (AG) son, predominantemente, de cadena larga, con una proporción entre saturados e insaturados del 50%, proporción que varía en función de la dieta alimentaria de la madre (Yuhas y cols., 2006). El ácido palmítico (16:0) es el AG saturado más abundante (18-25%), siendo el ácido oleico (18:1) el AG insaturado más importante (24-39%). Los siguientes ácidos son también de gran importancia en la composición de la leche

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materna: linoleico (18:2n-6; 8-18%), linolénico (18:3n-3; 0,4-2%), láurico (12:0; 4-14%), mirístico (14:0; 3-12%), esteárico (18:0; 5-8%) y cáprico (10:0; 1,5-2,5%). Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, como el ácido araquidónico (20:4n-6) y docosahexaenoico o DHA (22:6n-3), constituyen del 0,1 a 0,5% del total de AG en la leche madura (Silva y Gioielli, 2009; Yuhas y cols., 2006). La presencia de estos ácidos influye en el crecimiento y desarrollo del sistema nervioso central del lactante jugando también un papel fundamental en el desarrollo de masa y mineralización óseos (Innis, 2007; Mu, 2010). La composición en AG y su distribución en los TAG obedece a un patrón característico. El 60-70% del ácido palmítico se encuentra en la posición sn-2 de los TAG, entre el 80 y 90% del ácido oleico se encuentra en las posiciones sn-1 y sn-3 y el 80% del ácido linoleico se distribuye entre las posiciones sn-2 y sn-3 (Jensen, 1999). Como consecuencia, la GLH posee una estructura única en la naturaleza, que se caracteriza por un predominio de TAG de tipo ISI, es decir, AG insaturados en las posiciones sn-1 y sn-3 y AG saturados (esencialmente, ácido palmítico) en la posición sn-2 del triglicérido, lo contrario observado en las restantes grasas naturales. La composición y posición de los AG en los TAG afecta dramáticamente a la digestibilidad y posterior absorción de los nutrientes. Esta situación es más crítica en los lactantes debido a la inmadurez de su sistema digestivo (Lien, 1994; Linderborg y cols., 2000; Willis y cols., 1998). El proceso de metabolismo y transporte de los TAG, tanto en niños como en adultos, ocurre de forma concertada, implicando la acción de varias lipasas que actúan a lo largo del proceso digestivo. La lipasa pancreática hidroliza selectivamente los TAG en las posiciones sn-1 e sn-3, obteniéndose como productos AG libres y 2-monoacilgliceroles que son absorbidos en el intestino grueso (Lien, 1994; Linderborg y cols., 2000; Willis y cols., 1998). La absorción de los AG libres es función del tamaño de su cadena. Los AG saturados de cadena larga (C12:0 a C18:0) no son tan eficazmente absorbidos como los AG de cadena media (C6:0 a C10:0) y los AG insaturados. Los ácidos grasos libres saturados de cadena larga, como por ejemplo el palmítico, pueden formar complejos de calcio insolubles, denominados jabones de calcio, que causan una deficiente absorción del calcio y de los AG saturados en niños alimentados con leche artificial. Esta es también una de las causas de constipación en los primeros meses de vida. Contrariamente al ácido palmítico libre, el monoacilglicerol sn-2monopalmitina es eficientemente absorbido (Lien, 1994; Linderborg y cols., 2000; Willis y cols., 1998).

4.1.1. Influencia de los hábitos alimentarios en la composición de la grasa de la leche humana El estado nutricional de la mujer, su dieta alimentaria, la duración y frecuencia del periodo de lactancia, así como factores psicológicos y ambientales que pueden afectar a la predisposición de la mujer en su alimentación, condicionan la composición de los ácidos grasos en la GLH (forsyth, 1998; Jensen y cols., 1978, Yuhas y cols., 2006).

Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

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Yuhas y colaboradores (2006) realizaron un estudio sin paralelo, sobre el perfil lipídico de la leche madura de mujeres originarias da Australia, Canadá, Chile, China, Estados unidos de América, filipinas, Japón, México y Reino unido, en buen estado de salud, no fumadoras, con edades comprendidas entre 14 y 41 años, en periodo de lactancia exclusiva de un lactante saludable, con edades comprendidas entre 1 y 12 meses. El estudio revela proporciones en AG saturados (predominantemente ácido palmítico) relativamente constantes entre los diversos países, sin embargo a nivel de algunos AG poliinsaturados, particularmente el ácido docosahexaenoico (DHA), es considerablemente variable. Niveles elevados de DHA en la leche son el reflejo inequívoco de una dieta alimentaria de la madre rica en pescado (Chile, filipinas y Japón). Estas evidencias son confirmadas por varios estudios clínicos que demuestran que existe una relación dosificación-respuesta en la composición de la leche materna en mujeres que introducen suplementos de aceite de pescado o de DHA en su dieta alimentaria (Helland y cols., 1998; Makrides y cols., 1996). En el estudio de Yuhas y cols. (2006), los niveles de ácido linoleico eran superiores en leches de madres cuya dieta era rica en maíz (caso de México y Chile). Por lo que respecta a los mayores contenidos de ácido oleico, estos se relacionan con consumos elevados de aceite de colza (Canadá y China). Los niveles más elevados de ácidos láurico y mirístico, observados en la leche de madres filipinas, indican una alimentación predominantemente rica en glúcidos y baja en grasas. El efecto de una dieta alimenticia rica en glúcidos y deficiente en grasas estimula la síntesis de AG de cadena media a partir de glucosa, en el citoplasma de las células de la glándula mamaria. El incremento de estos ácidos pueden registrar valores entre el 10 y el 20% (Hayat y cols., 1999).

4.1.2. importancia de los sucedáneos de grasa de leche humana La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la uNICEf recomiendan la alimentación materna en exclusiva durante los seis primeros meses de vida y promueven campañas de sensibilización entre la opinión pública de la importancia de la lactancia. factores de índole cultural, socio-económica y/o de salud de la madre pueden condicionar su predisposición para amamantar. Ante esta perspectiva el desarrollo de sucedáneos de leche materna, que mimeticen su estructura y composición, se presenta como un desafío para la industria alimentaria. La gran mayoría de las formulaciones de leche infantil se obtienen a partir de aceites vegetales o de leche de rumiantes en las que el contenido de ácido palmítico y de los restantes AG saturados se encuentran esterificados predominantemente en las posiciones sn-1 e sn-3 de las moléculas de TAG (forsyth, 1998; Jensen y cols., 1978); al contrario de lo que sucede en la grasa de leche humana, en el que el ácido palmítico ocupa esencialmente la posición interna del TAG. Estas formulaciones presentan porcentajes en ácido palmítico muy similares a los encontrados en la leche materna. Sin embargo, su esterificación en la posición sn-2 es considerablemente baja. El contenido en ácido oleico es, en general, igual o superior al de la leche ma-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

terna, pero encontrándose predominantemente esterificado en la posición sn-2 (Straarup y cols., 2006). Conseguir fórmulas de leche infantil que posibilite cumplir con los condicionamientos anteriormente expuestos justifica el creciente interés de la industria alimentaria por productos que sean susceptibles de ser comercializados.

4.2. biOcatálisis aplicada a la síntesis de sucedáneOs de Grasa de leche humana Actualmente ya existen en el mercado sucedáneos de grasa de leche humana (SGLH) producidos mediante catálisis enzimática. Estas grasas producidas en el laboratorio son ejemplos de lípidos estructurados. Desde una perspectiva general se pueden definir los lípidos estructurados como TAG modificados, por métodos químicos o enzimáticos, con el objetivo de alterar su composición y/o distribución posicional de los AG en el esqueleto del glicerol (ferreira-Dias, 2010; Xu, 2000). La síntesis de TAG estructurados como SGLH se realiza mediante reacciones catalizadas por enzimas (Biocatálisis). La tecnología enzimática ofrece múltiples ventajas frente a la síntesis química, entre ellas la elevada regio- y estéreo-selectividad de los biocatalizadores, las reducidas o inexistentes reacciones secundarias, que originan la formación de productos no deseables y la posibilidad de operar en condiciones de temperatura y presión moderadas (presión atmosférica y temperaturas inferiores a 70ºC). Es importante resaltar que un producto sintetizado vía enzimática puede ser reconocido como natural siendo clasificado como GRAS (Generally Recognized as Safe). Las lipasas (triacilglicerol acilhidrolasas, E.C. 3.1.1.3.) son enzimas que catalizan la hidrólisis de triacilgliceroles en la interfase aceite/agua; sin embargo en medios orgánicos o con baja actividad de agua, pueden catalizar la reacción inversa de unión del AG al esqueleto del glicerol, mediante reacciones de esterificación o de interesterificación. Como ejemplos comercialmente disponibles de SGLH se pueden citar el BetapolTM, producido por Lipid Nutrition (Holanda) y, más recientemente, el InfatTM fabricado por Advanced Lipids. Esta empresa es el resultado de la fusión en 2007 entre Enzymotec (Israel) y AAK (Suecia). Tanto el BetapolTM como InfatTM se obtienen por acidólisis de grasas vegetales ricas en ácido palmítico en posición sn-2 (por ejemplo estearina de palma doblemente fraccionada), o tripalmitina con mezclas de AG ricas en ácido oleico. Como catalizadores se utilizan lipasas sn-1,3 selectivas, como las de los hongos Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM) y Rhizopus oryzae (http://www.lipidnutrition.com, Junio 2011; Meiri-Bendek y cols., 2011).un estudio comparativo realizado entre la grasa de leche proveniente de madres brasileñas y el SGLH Betapol reveló diferencias substanciales a nivel de las propiedades físico-químicas. El porcentaje de acidez fue considerablemente superior en la GLH (2,84g ácido oleico/100g de muestra) contrastando con 0,05g de ácido oleico/100g de Betapol. La composición de AG en el Betapol fue mayor, con

Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

141

un porcentaje de ácidos grasos saturados (52%) frente al 44% presente en el GLH. El Betapol presentó valores más elevados de ácidos láurico, palmítico y oleico. Por lo que respecta a las propiedades físicas de las grasas en estudio, el Betapol presentó puntos de fusión inferiores a los del GLH del orden de 3 ºC (Silva y cols., 2007). Los trabajos de investigación publicados sobre la síntesis de SGLH describen la utilización de sistemas de reacción en presencia o ausencia de solvente orgánico y su composición obedece, en su mayoría, a un patrón característico. utilizan (i) una fuente de ácido palmítico, (ii) lipasas inmovilizadas con selectividad posicional sn1,3 como biocatalizador e (iii) AG libres (en reacciones de acidólisis) o unidos al esqueleto de glicerol (en reacciones de interesterificación). La Tabla 4.1 presenta ejemplos de estudios, a escalas de laboratorio y planta piloto, de producción de SGLH por catálisis enzimática. Como se puede observar, estos productos se pueden obtener por (i) acidólisis entre un TAG rico en ácido palmítico en posición sn-2 y AG libres o, (ii) por interesterificación entre TAG, generalmente, de grasas naturales. tabla 4.1. prOducción de sucedáneOs de Grasa de leche humana (sGlh) via catálisis enzimática reacción

substratos

biocatalizador

Acidólisis

PPP +AG de aceite de colza con Carica papaya % reducido de latex ácido erúcico Lipozyme RM IM

Acidólisis

Grasa de cerdo + AG de aceite de soja

Acidólisis

PPP + AG de aceite de avellana + ácido esteárico (C18:0)

Lipozyme RM IM

Lipozyme RM IM

modo de operación

tipo de sistema

condiciones optimizadas de reacción

Lotes

[Biocatalizador] = 13,7 SGLH similar a la m-% grasa de leche de Yang y cols. Sin solvente RM= 1:2.4; T= 61ºC; t= 1h madres chinas. (2003)

Lotes

n-hexano

[Biocatalizador] = 10 m-%; RM= 1:12:1.5; T= 65ºC; SGLH t= 24h 47% de C18:1

Sahín y cols. (2005a)

T= 55ºC; t=24h [Lipozyme RM IM]= 10 % RM=1:14.8 [Lipozyme TL IM]= 6 % RM=1:14

SGLH 10% GLA; 45% C18:1

Sahín y cols. (2005b)

SGLH similar al Betapol

Nielsen y cols. (2006)

Acidólisis

Lotes

n-hexano

Acidólisis

Banha + AG de aceite de soja

Lipozyme RM IM

Continuo PBR

RM= 1:3; T= 65ºC; Sin solvente Tempo de residência= 1.5h

Acidólisis

PPP + AG de aceite de avellana + AGPI omega-3

Acidólisis

PPP + ácido oleico (C18:1) PPP + oleato de LIP1 metilo Lipozyme RM IM

Lipozyme RM IM

Mukherjee y Kiewitt (1998)

Lotes

Lipozyme RM IM Lipozyme TL IM

PPP + aceites de Intercoco, de girasol y esterificación de soja

referencia

[Biocatalizador] = 9,9 m-% SGLH con AGPI Sin solvente RM= 1:1; T= 60ºC; t= 6h esenciales

PPP + AG de aceite de avellana + GLA

Lipozyme RM IM

mejores resultados

Lotes

Lotes

Lotes

n-hexano

[Biocatalizador] = 10 m-%; RM= 1:12.4; T= 55ºC; SGLH con AGPI t= 24h omega-3

Sahín y cols. (2006)

n-hexano

[Lipozyme RM IM]= 10 %; PPP + oleato de metilo RM= 1:3; T= 65ºC; t= 24h

Srivastava y cols. (2006)

n-hexano

[Biocatalizador] = 10 m-%; RM= 1:1 (PPP: aceites vegetales); T= 55ºC; t= 12h SGLH

SGLH 49.4% C18:1

Maduko y cols. (2007a)

142

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

reacción

substratos

biocatalizador

modo de operación

tipo de sistema

condiciones optimizadas de reacción

mejores resultados

referencia

[Biocatalizador] = 10 m-%; RM= 1:3 (PPP: aceites SGLH vegetales); 40% C16:0 en T= 55ºC; t= 14.4h posición sn-2

Maduko y cols., (2007b)

InterPPP + aceites de esterificación girasol y de soja

Lipozyme RM IM

Lotes

n-hexano

InterGrasa de cerdo + esterificación aceite de soja

Lipozyme TL IM

Lotes

[Biocatalizador] = 5 m-%; Sin solvente T= 60ºC; t= 14.4h

SGLH

Silva y cols. (2009)

Lotes

[Biocatalizador] = 8,9 m-%; MR= 1:2; T= 60ºC; Sin solvente t= 24h

SGLH con ácido oleico

Tecelão y cols. (2010)

Acidólisis

Lipozyme TL IM Lipozyme RM IM Novozym 435 PPP + ácido oleico Lipase/aciltransPPP + AGPI ferasa de Candida omega-3 parapsilosis

Acidólisis

PPP + AG de aceite de avellana + AG de Neobee (mezcla de AG de cadena media)

Acidólisis

Estearina de palma + AG de aceites de colza, girasol, palmiste y AG esteárico y mirístico Lipozyme RM IM

Acidólisis

Grasa de cerdo + AG de aceite de camelia

InterGrasa de cerdo + esterificación aceite de soja

[Lipozyme RM IM]= 19,78 %; RM= 1:3.35 (AG total); T= 57ºC; SGLH con C8:0, t= 24h C10:0 y C16:0

Lotes

n-hexano

Lotes

[Lipozyme RM IM] = 10,7 m-%; RM= 1:14.6; Sin solvente T= 57ºC; t= 3.4h

SGLH

Lipozyme RM IM

Lotes

Lipozyme [RM IM] = 6,0 m-%; RM= 1:4; Sin solvente T= 45ºC; t= 6.0h

SGLH

Lipozyme TL IM

Continuo PBR

Lipozyme RM IM

n-hexano

T= 60ºC; Tiempo de residencia= 1.0 h SGLH

Ilyasoglu y cols. (2011)

Zou y cols. (2011)

Qin y cols. (2011) Silva y cols. (2011)

leyenda/abreviaturas: t = tiempo de reacción; T = temperatura; TAG = triacilglicerol; AG = ácido graso; RM = razón molar TAG:AG; C18:1 = ácido oleico; PPP = Tripalmitina; LIP1 – lipasa libre de Candida rugosa isoforma 1; [Biocatalizador] = carga de biocatalizador; AGPI = ácidos grasos polinsaturados. PBR = packed bed reactor.

4.2.1. fuente de ácido palmítico La selección de la fuente de ácido palmítico es un punto crítico, ya que se tiene que asegurar la localización mayoritaria de este ácido en la posición interna del TAG. En la producción de SGLH se pueden utilizar tripalmitina o grasas naturales ricas en ácido palmítico en la posición sn-2. La grasa de cerdo, la estearina de palma y la mantequilla constituyen substratos adecuados para la síntesis de SGLH. La grasa de cerdo presenta una composición en AG variable, dependiendo de la raza, sexo, edad y régimen alimenticio del animal de donde se extraiga. A pesar de la variabilidad, la grasa de cerdo presenta una estructura en TAG muy parecida a la leche humana, aunque presenta un menor % de AG poliinsaturados de cadena larga especialmente, de AG esenciales como los ácidos linoleico e linolénico. Es una grasa de bajo valor comercial. Sin embargo, cuestiones de orden ético, religioso y cultural todavía pueden constituir un problema para su utilización en la producción de SGLH. La mantequilla tiene similitud con la GLH por lo que respecta a la composición en AG y su localización en el TAG. Actualmente los SGLH obtenidos a partir de

Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

143

mantequilla no poseen los ácidos araquidónico y docosahexaenoico en su composición (Mu, 2010). La estearina de palma, obtenida por fraccionamiento del aceite de palma, posee un contenido superior en ácido palmítico a la leche humana y se está utilizando como substrato en la síntesis de SGLH. En estudios de laboratorio también se suele utilizar frecuentemente tripalmitina, no obstante este substrato presenta el inconveniente de su elevado coste.

4.2.2. biocatalizadores Las enzimas frecuentemente utilizadas como biocatalizadores en reacciones de síntesis de SGLH son lipasas que posean regioselectividad sn-1,3. El origen de las mismas es esencialmente de fuentes microbianas. La selectividad de las lipasas posibilita la síntesis de moléculas de TAG estructuradas, es decir, moléculas construidas a medida («Taylor-made fat»), con la consecuente modificación de sus propiedades físicas y nutricionales. Esta selectividad comprende (i) la especificidad relativa al substrato, es decir, capacidad de la lipasas por hidrolizar, preferentemente, un tipo de ésteres de glicerol, (ii) la regio-selectividad definida como a la capacidad de discriminar entre las posiciones externas del TAG y la posición interna, (iii) la estéreo-selectividad que describe la capacidad que poseen algunas lipasas de distinguir entre las posiciones sn-1 e sn-3 del TAG y (iv) la especificidad relativa hacia el AG que se traduce en la afinidad de la lipasa por un AG específico o, más frecuentemente, por un grupo de AG (Villeneuve, 2003). La mayoría de los estudios publicados recurren a la utilización de lipasas inmovilizadas de Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM), Thermomyces lanuginosa (Lipozyme TL IM) y Candida antarctica (Novozym 435), comercializadas por Novozymes, Dinamarca (Tabla 4.1). Diversos estudios demuestran que la selectividad de la lipasa se encuentra fuertemente condicionada por la estructura del substrato, especialmente por la dimensión de la cadena carbonosa, el grado de insaturación y la esteroquímica de la molécula, así como por factores físico-químicos como la interfase agua/aceite o hidrófila/hidrófoba y el enlace al centro activo de la enzima. Karabulut y cols. (2010), en reacciones de acidólisis entre la tripalmitina y una mezcla equimolar de AG insaturados C18 (ácidos oleico, 18:1; linoleico, 18:2 y linolénico, 18:3), en n-hexano, observaron que la incorporación molar de los diferentes ácidos grasos al TAG depende del biocatalizador utilizado. Se obtuvieron incorporaciones superiores para el Novozym 435, seguido del Lipozyme RM IM y del Lipozyme TL IM. Para todos los biocatalizadores se observó un incremento de la incorporación molar del ácido a medida que aumentaba su grado de insaturación. Este hecho no se encuentra refrendado por el trabajo de otros autores. Tecelão y colaboradores (2010) estudiaron la incorporación de (i) ácido oleico o de (ii) un concentrado de AG poliinsaturados omega-3, rico en DHA, en la tripalmitina, en un sistema libre de solvente, en la síntesis de SGLH. Todas las lipasas comerciales probadas (Novozym 435, Lipozyme RM IM e Lipozyme TL IM) mostraron una clara preferencia por el AG monoinsaturado, sin registrase diferencias significativas en el grado de incorporación al TAG. Por otro lado, Lipozyme TL IM reportó el menor

144

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

valor de incorporación de AG poliinsaturados en comparación con los restante biocatalizadores probados. En este mismo estudio, una lipasa acil/transferasa de Candida parapsilosis inmovilizada en Accurel MP 1000 no demostró preferencia entre los dos tipos de AG utilizados. Hamam y Shahidi (2008) defienden que el número de dobles enlaces y su localización en la molécula de AG afectan, dramáticamente, a su reactividad. Estos autores postulan que la presencia de tres dobles enlaces en la molécula de AG le confiere una forma característica (en gancho) causando impedimentos estéreo-químicos en el enlace al TAG, en comparación con AG con menor número de dobles enlaces. En estos estudios se utilizaron diversas fuentes de AG en reacciones de acidólisis con el objetivo de obtener un producto similar al GLH. En la mayoría de los estudios publicados la relación dador del grupo acilo/TAG es considerablemente elevada (Tabla 4.1). Generalmente, un aumento de esta relación tiene como resultado niveles superiores de incorporación de AG en el TAG, por causa del desplazamiento del equilibrio de reacción hacia la formación del producto. Es importante tener en cuenta que elevadas concentraciones de AG libres son indeseables en la medida que se aumenta el coste asociado en la separación del substrato sin reaccionar del producto final. La utilización de solventes orgánicos no es recomendada porque (i) se trata de la obtención de un producto para la alimentación infantil, (ii) encarece el proceso y (iii) dificulta la recuperación del producto, además de (iv) constituir una fuente de contaminación ambiental.

4.3. trabajOs realizadOs en el ámbitO de la red enznut Los condicionamientos inherentes a la utilización de la vía enzimática frente a la vía química se encuentran relacionados con el coste del biocatalizador y su inestabilidad intrínseca. La estabilidad operacional del biocatalizador, es decir, la capacidad de mantener su actividad catalítica a lo largo del tiempo de operación, se revela como uno de los factores claves de los procesos biocatalíticos. Por consiguiente se necesitan biocatalizadores con estabilidad operacional elevada y económicamente competitivos. Varios factores pueden afectar a la actividad enzimática en el curso de la biorreacción: la temperatura, el porcentaje de agua, la presencia de productos de oxidación, la configuración del biorreactor y su modo de operación. (Illanes, 1999; Sandoval y cols., 2002; Slotema y cols., 2003). La búsqueda de biocatalizadores con estabilidad operacional elevada y de costes más bajos es un desafío para la comunidad científica, pensando desde el punto de vista de la implementación de los sistemas enzimáticos a escala industrial. En este contexto, los trabajos desarrollados en el ámbito de la red ENZNuT han sido bastante prometedores. En efecto, se ha de referir a los trabajos desarrollados con lipasas no comerciales de bajo coste, como alternativa a los biocatalizadores comerciales disponibles en el mercado, con la vista puesta en la producción de SGLH.

Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

145

Estas lipasas se utilizaron en un sistema de reacción libre de solvente, constituído por tripalmitina, como fuente de ácido palmítico, y ácido oleico (razón molar tripalmitina/ácido oleico 1:2). Las reacciones se realizaron en un reactor enchaquetado a temperaturas iguales o superiores a 60ºC con el objetivo de garantizar que la tripalmitina se encuentre en fase líquida. Como biocatalizadores se probaron (i) la lipasa de Carica papaya (LCP), autoinmovilizada en su látex, extraída de agro-residuos de plantaciones de papaya, (ii) la lipasa heteróloga de Rhizopus oryzae (r-LRO), expresada en la factoría celular Pichia pastoris y (iii) la lipasa 2 de Yarrowia lipolytica, inmovilizada em diferentes soportes. El extracto enzimático de Carica papaya y la lipasa 2 de Yarrowia lipolytica fueron preparados por el grupo de investigación liderado por la Dra. Georgina Sandoval, CIATEJ, México, Tecelão y cols. (2012). La rLRO fue producida y purificada por el grupo de investigación de Ingeniería de Bioprocesos y Biocatálisis Aplicada coordinado por el Prof. francisco Valero, uAB, Barcelona (Arnau y cols., 2010; Guillén y cols., 2011). Los ensayos de biocatálisis se realizaron por el grupo de la Profª Suzana ferreira-Dias, ISA-uTL, Lisboa (Tabla 4.2). En la reacción de acidólisis entre la tripalmitina y el ácido oleico catalizada por la LCP la incorporación molar de este ácido en el TAG se situó alrededor del 25%, valor semejante al obtenido con las lipasas comerciales Novozym 435, Lipozyme RM IM y Lipozyme TL IM (Tecelão y cols., 2010). La utilización de la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae inmovilizada en Eupergit C obtuvo una incorporación de 12,6 mol-% de ácido oleico. La lipasa 2 de Yarrowia lipolytica alcanzó, para un mismo sistema, valores de incorporación substancialmente inferiores (menos de 5,3 mol-%), independentemente del soporte de inmovilización utilizado. Estos resultados parecen indicar una desactivación térmica del biocatalizador (fig. 4.1). En esta figura también se presentan los rendimientos de incorporación calculados teniendo en cuenta que el 100% de incorporación corresponderá a la incorporación de AG en las posiciones sn-1 e sn-3, es decir el 66,6% de incorporación molar, ya que las lipasas utilizadas presentan selectividad sn-1,3. Los prometedores resultados obtenidos con LCP y r-LRO impulsaron el desarrollo de estudios adicionales, sobre el mismo sistema de reacción, con el objetivo de aumentar el rendimiento del bioproceso. Se realizó la modelización y optimización de las condiciones de reacción de la LCP, con el objetivo de investigar los efectos de las variables, razón molar y temperatura, en la incorporación del ácido oleico en la tripalmitina. La razón molar apenas mostró un efecto positivo y lineal en la incorporación del ácido oleico, indicando que un aumento de esta variable se tradujo en un aumento de la incorporación del ácido. Obteniéndose para una razón molar 6.8:1 (ácido oleico/tripalmitina) un valor de incorporación de ácido oleico del 39 mol-% Tecelão y cols. (2012). Los estudios publicados en sistemas de reacción idénticos, utilizándose enzimas comerciales de elevado coste, mostraron valores de incorporación molar de ácido oleico, en condiciones optimizadas, muy parecidos a los obtenidos con la LCP. Es importante destacar que en la literatura estos valores se consiguieron con razones donador de grupo acilo/TAG muy elevadas (Sahín y cols., 2005b; Sahín y cols., 2006).

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

146

tabla 4.2. enzimas nO cOmerciales prOducidas en el marcO de la red enznut y utilizadas en la síntesis de sGlh enzima

Lipasa 2 de Yarrowia lipolytica

Lipasa de Carica papaya Lipasa heteróloga de Rhizopus oryzae

soporte de inmovilización

abreviatura

Lewatit MP 62

Y. lipolytica 1

Amberlite 96

Y. lipolytica 2

Lewatit K 2629

Y. lipolytica 3

Lewatit VP OC 1065

Y. lipolytica 4

Lewatit VP OC 1026

Y. lipolytica 5

Lewatit MP TP 214

Y. lipolytica 6

Auto-inmovilizada en latex da papaya (batch 1)

LCP1

Auto-inmovilizada en latex da papaya (batch 2)

LCP2

Eupergit C

r-LRO

50 45 40

Valor (%)

35 30 25 20 15 10 5 0

Y.lipolitica Y.lipolitica Y.lipolitica Y.lipolitica Y.lipolitica Y.lipolitica 1 2 3 4 5 6 Biocatalizador Incorporación (mol-%)

r-LRO

LCP1

LCP2

Rendimiento (%)

figura 4.1. Incorporación del ácido oleico a la tripalmitina y su respectivo rendimiento molar después de 24 horas de acidólisis, catalizado por diferentes lipasas no comerciales (tabla 4.2), en medio sin solvente, a 60 ºC.

En el ámbito de la Red ENZNuT, se probaron diferentes soportes de inmovilización para r-LRO, concretamente, Accurel MP 1000, Lewatit VP OC 1600 y Sepiolita modificada. Los mayores niveles de incorporación de ácido oleico en tripalmitina se obtuvieron con la lipasa inmovilizada sobre Accurel y Lewatit (alrededor del 22% mol para ambos soportes).

Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

147

Con el objetivo final de implementar el sistema de reacción a escala piloto y/o industrial, es importante seleccionar el biocatalizador, teniendo en cuenta no tan solo su actividad biocatalítica, sino también su estabilidad y mantenimiento a lo largo del tiempo de operación. Por este motivo se probó la estabilidad operacional de LCP y r-LRO en lotes sucesivos de 23h de duración cada uno. Al final del batch la enzima era separada del medio de reacción por filtración y reutilizada en medio fresco. El grado de incorporación molar del ácido oleico en tripalmitina, analizado al final de cada discontinuo, fue el parámetro escogido como indicador de la actividad del biocatalizador al final del mismo. La primera operación en discontinuo se utilizó como referencia (100% de actividad). Los resultados obtenidos para LCP y r-LRO inmovilizada en Accurel y Lewatit se presentan en la figura 4.2. La mayor estabilidad operacional se observó con LCP, seguida de la r-LRO inmovilizada en Lewatit. Cuando la r-LRO se inmovilizó en Accurel, se observó un descenso drástico de la actividad después del segundo discontinuo. Los resultados obenidos con la LCP son muy prometedores, ya que se utiliza una lipasa de coste prácticamente cero, debido a su procedencia de un agro-residuo, para la produción de un producto de alto valor añadido como es el SGLH. Por lo que respecta a los resultados obtenidos con r-LRO, demuestran que la estabilidad operacional de la lipasa depende de una selección adecuada y crítica del soporte. 100

Actividad residual (%)

80

60

40

20

0

1

2

3

r-LRO en Accurel

4 Nº de Batch

5

r-LRO en Lewatit

6

7

LCP latex

figura 4.2. Ensayos de estabilidad operacional: actividad residual de la LCP y la r-LRO inmovilizada en Accurel MP1000 y en Lewatit VPOC 1600, al final de cada lote de 23h, en la reacción de acidólisis de la tripalmitina con ácido olecio a una razón molar (TAG:AG) 1:2.

Los resultados obtenidos en el contexto de la Red ENZNuT, para la producción de SGLH, demostraron la viabilidad de substituir las lipasas comerciales inmoviliza-

148

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

das por lipasas no comerciales, obteniéndose unos claros beneficios desde el punto de vista de reducción de costes del proceso biotecnológico.

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Producción de sucedáneos de grasa de leche humana catalizados por lipasas

149

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150

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

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5. mOdificación de antiOxidantes fenólicOs mediante prOcesOs enzimáticOs Pamela torres salas Francisco J. Plou Gasca antonio ballesteros olmo Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (CSIC), España

5.1. antiOxidantes fenólicOs Estudios epidemiológicos y de intervención clínica llevados a cabo durante la última década han demostrado el efecto beneficioso que posee para la salud la ingesta de alimentos de origen vegetal (frutas, hortalizas, vino tinto, té, aceite de oliva virgen, etc). Las propiedades benéficas que ejercen estos alimentos van más allá de las esperadas debido a la presencia de sus nutrientes, vitaminas y sales minerales, por lo que se ha hipotetizado que estas propiedades adicionales se deban a los metabolitos secundarios que contienen estos alimentos, ocupando un lugar destacado entre estos, los polifenoles (Tomás-Barberán, 2003). Estos constituyentes no-nutricionales de los alimentos, principalmente antioxidantes, han sido ampliamente estudiados en los últimos años mostrando diferentes actividades biológicas, siendo su actividad antioxidante la que ha recibido más interés. En general, un antioxidante es cualquier sustancia que, presente a bajas concentraciones en comparación con el sustrato oxidable, retrasa o inhibe significativamente la oxidación de dicho sustrato. Estas oxidaciones comienzan, en mayor o menor medida, por la presencia de oxígeno, que inicia una reacción en cadena que conlleva la aparición de radicales libres. Sin embargo, el oxígeno es un compuesto esencial para la vida. uno de los procesos por los cuales mantenemos nuestra vida es la ingesta de alimentos, a partir de los cuales obtenemos energía mediante la oxidación de sus componentes. Esto muestra la necesidad de estos procesos oxidativos para el mantenimiento de nuestras estructuras básicas. Pero, durante estos procesos, se forman radicales libres que, en exceso, resultan perjudiciales para el organismo. Estos radicales libres actúan sobre determinadas estructuras biológicas sensibles como el DNA o las membranas celulares. Los antioxidantes previenen el daño oxidativo sobre estas estructuras y, por consiguiente, pueden disminuir la incidencia de cáncer, enfermedades de corazón, esclerosis múltiple y enfermedades autoinmunes (Mitscher y cols., 1997). En general, los antioxidantes se usan para contrarrestar los efectos de la oxidación, utilizándose frecuentemente con este fin como aditivos alimentarios, por ejemplo en alimentos ricos en ácidos grasos poliinsaturados del tipo ω-3 se añaden éste-

152

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

res de ácido áscórbico y tocoferoles (Reyes-Duarte y cols., 2011; Torres y col., 2008) para impedir el enranciamiento. Algunas propiedades deseables en un antioxidante alimentario son: eficacia a bajas concentraciones, ausencia de toxicidad, fácil manejo, bajo precio, y que no confiera al preparado final características indeseables (Williams, 1993). Sin embargo se sospecha que la mayoría de los antioxidantes artificiales pueden ser promotores carcinogénicos (Humeau y cols., 1995), por lo que los antioxidantes naturales, así como sus posibles derivados, han suscitado un gran interés. Por otro lado, estos compuestos también pueden constituir nuevos aditivos promotores de la salud que prevengan procesos oxidativos in vivo. En este caso, además de las características anteriormente mencionadas, un potencial antioxidante debe cumplir los siguientes requisitos: poseer una gran capacidad captadora de radicales libres, ser estable durante el mayor tiempo posible, y ser biodisponible. De estos, el principal problema es encontrar compuestos que sean suficientemente estables en el tiempo a temperatura ambiente, a temperatura del organismo y que sean funcionales el tiempo suficiente antes de ser degradados y/o metabolizados. Entre todas estas sustancias antioxidantes los compuestos fenólicos, que aparecen en numerosos alimentos, son una de las familias más importantes, por lo que su relevancia biológica se ha estudiado en numerosos casos (Astorg, 1997; Diplock, 1994; Wang y cols., 2000). La clasificación de los antioxidantes fenólicos se realiza principalmente en base a su esqueleto carbonado, pudiendo encontrar desde fenoles simples hasta estructuras condensadas muy complejas como los taninos (figura 5.1). En la tabla 5.1 se encuentra una clasificación muy general de este tipo de compuestos. OH

O O HO

2 HO

1

HO

1 3

2

OH 1 O

Ácido cafeico Esqueleto C6-C3

Xanteno Esqueleto C6-C1-C6

1 O

Resveratrol Esqueleto C6-C2-C6

OH O

2

HO

1

2

3

O

3

O Isoflavona Esqueleto C6-C3-C6

Enterolactona Esqueleto (C6-C3)2 OH

figura 5.1. Estructura de algunos antioxidantes fenólicos.

Como se ha comentado anteriormente, la presencia de radicales libres en el organismo puede provocar modificaciones en las estructuras básicas que conllevan la aparición de enfermedades. Sin embargo, el organismo posee unos sistemas de defensa endógenos que lo protegen de los radicales libres que se forman en los proce-

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

153

sos bioquímicos. Estos sistemas biológicos de protección son principalmente las enzimas superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa (Diplock, 1994). Estas enzimas antioxidantes se encuentran ayudadas por una serie de sustancias antioxidantes sintetizadas por el organismo como son el ácido lipoico, la ubiquinona y la N-acetil-cisteína. Sin embargo, todo este sistema no es suficiente para erradicar los radicales libres que se producen en el organismo, por lo que se requiere la necesidad de mantener una dieta rica en antioxidantes: vitamina E, vitamina C, β-carotenos, selenio, polifenoles, etc. tabla 5.1. principales familias de antiOxidantes fenólicOs familia fenoles simples Ácidos fenólicos Xantonas Estilbenos flavonoides Lignanos Ligninas Taninos condensados

estructura Esqueleto C6 Esqueleto C6-CX (X va de 1 a 4) Esqueleto C6-C1-C6 Esqueleto C6-C2-C6 Esqueleto C6-C3-C6 (C6-C3)2 (C6-C3)n (C6-C3-C6)n

ejemplo Resorcinol Ácido cafeico Xanteno Resveratrol Isoflavonas Enterolactona Ligninas sulfonadas Ácido gálico

Este sistema se encuentra en equilibrio hasta que determinadas situaciones de estrés o patologías diversas provocan un aumento de los radicales libres y se produce el daño tisular, que si no se corrige desembocará en la aparición de una enfermedad. Esta hipótesis inicial desencadenó la formulación de la «Teoría oxidante de la enfermedad» (Webb, 2006). Son muchas las enfermedades cuyos estudios han revelado su correlación con los procesos oxidativos: ateroesclerosis, cáncer, enfermedades inflamatorias, cataratas, procesos neurodegenerativos como alzheimer, etc (Azios y cols., 2007; Bertelli y cols., 1995; Jung y cols., 2009; Ramos, 2007).

5.2. mOdificación de antiOxidantes fenólicOs: ventajas del empleO de enzimas El principal problema que aparece en el uso y la formulación de estos compuestos fenólicos en alimentos y fórmulas farmacéuticas y nutracéuticas es su baja estabilidad y/o la modificación que sufren in vivo durante los procesos de destoxificación, en los que las agrupaciones más antioxidantes, como por ejemplo la orto-dihidroxílica, son bloqueadas. una de las aproximaciones más utilizadas para aumentar la estabilidad de un antioxidante sin disminuir su actividad consiste en la modificación de sus grupos hidroxilo mediante la incorporación de diversos azúcares o cadenas lipofílicas de diferente longitud para así modular su balance hidrófilo-lipófilo (Hydrophyle-Lipophyle Balance, HLB), a la vez que se bloquean las posiciones que le confieren inestabilidad.

154

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

La obtención de los derivados anteriormente mencionados se puede realizar mediante una estrategia clásica, por métodos químicos, o mediante el uso de biocatalizadores, es decir, métodos enzimáticos. Los métodos químicos utilizan catalizadores como resinas de intercambio iónico, zeolitas o ácidos/bases fuertes. En general, son procesos en condiciones drásticas que requieren elevadas temperaturas y presiones, que en el caso de los antioxidantes naturales pueden conllevar la oxidación y degradación de los compuestos que se quiere modificar. En el caso de los métodos enzimáticos se utilizan condiciones suaves de operación lo que, aparte de disminuir el consumo energético y por tanto los costes, no ocasiona la degradación de los sustratos (Alcalde y cols., 2006). Otro factor a tener en cuenta es el tratamiento de los efluentes de los procesos, ya que los métodos químicos usan en muchos casos sustancias corrosivas y las aguas residuales resultan altamente contaminantes. Los procesos químicos requieren la manipulación de sustancias ácidas, altamente corrosivas, lo que provoca un alto riesgo laboral. Sin embargo, el uso de biocatalizadores reduce el riesgo de siniestralidad debido a su inocuidad y a las suaves condiciones de proceso. Las enzimas son potentes catalizadores capaces de aceptar un numeroso grupo de compuestos como sustratos. No requieren de los tediosos pasos de protección y desprotección de grupos, ya que poseen enantio-, quimio- y regioespecificidad, hecho que impide la formación de productos intermedios y productos secundarios (Schmid y cols., 2001). finalmente, los productos obtenidos por medio de reacciones enzimáticas pueden ser englobados dentro del término «producto natural» (natural products) según directivas de la unión Europea. Por otro lado, el uso de biocatalizadores inmovilizados, que aumentan su resistencia mecánica y térmica, impide la contaminación debida a sustancias orgánicas. Hay que tener en cuenta que las nuevas políticas mundiales reclaman procesos industriales sostenibles, que sean benignos con el medio ambiente (environmentally benign production processes), movimiento englobado dentro del término «White Biotechnology » (Biotecnología Blanca). Este hecho ha provocado que un gran número de industrias comiencen a implantar nuevos procesos biotecnológicos para la producción de compuestos orgánicos, agroquímicos, farmacéuticos e incluso bioplásticos e ingredientes para alimentación (Jaeger, 2004). El enorme desarrollo en los años 80 del concepto de que la Biocatálisis también puede tener lugar en medios no acuosos (disolventes orgánicos, fluidos supercríticos, etc.) ha hecho posible la utilización de las enzimas en procesos de síntesis en medios no convencionales, en condiciones suaves de presión y temperatura. Este hecho, junto con todo lo comentado anteriormente, hace que los métodos enzimáticos encajen perfectamente con los 10 postulados de la denominada «Química Verde» (Green Chemistry) (Ahluwalia y Kidwai, 2004).

5.3. resveratrOl: prOpiedades y mOdificación de su estructura El resveratrol es una molécula que está siendo intensamente estudiada en los últimos años, dato que se refleja en las 1113 entradas relacionadas con el térmi-

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

155

no «resveratrol» en el motor de búsqueda de documentos SCI Scopus para el año 2010. Es una fitoalexina, lo que significa que se produce en las plantas superiores como mecanismo de defensa. Está formado por un núcleo estilbeno, con tres grupos hidroxilo en su estructura en las posiciones 3-, 5- y 4’- (figura 5.2). Los estilbenos son metabolitos secundarios producidos por algunas familias de plantas como Vitaceae, Arachaceae y Pinaceae (Seeram y cols., 2006). Son sintetizados por una enzima denominada estilbeno sintasa, que combina una molécula de hidroxicinamoil-CoA con 3 moléculas de malonil-CoA para dar el resveratrol. La acumulación de estos productos en la planta se produce como respuesta al ataque de patógenos o a la radiación uV (fritzemeier y Kindl, 1981). Son capaces de inhibir el crecimiento de Botrytis cinerea, Plasmapara viticola y Cladosporium cucumerinum (Dercks y Creasy, 1989). El efecto antimicrobiano de estos compuestos es tal, que la incorporación de la enzima estilbeno sintasa en plantas no productoras de estilbenos, como el trigo y la cebada, aumenta su resistencia al ataque de patógenos (Leckband y Lörz, 1998). OH HO

OH OH

O

HO

O OH OH

OH

Piceido 3-O-β-D-glucosil-resveratrol

O

HO

Resveratrolósido 4'-O-β-D-glucosil-resveratrol

O OH

OH OH

OH OH

OH O

HO

OH

O

OH

HO

OH

HO Glucósido de piceatanol 4'-O-β-D-glucosil-piceatanol

OH

Piceatanol OH

figura 5.2. Estructura de los diferentes estilbenos extraídos en la raíz de Polygonum cuspidatum.

En la naturaleza se han identificado diferentes compuestos derivados del resveratrol en la raíz de Polygonum cuspidatum (figura 5.2). Estos compuestos son el piceatanol (3,5,3’,4’-tetra-hidroxi-estilbeno), su glucósido (4’-O-β-D-glucosil-piceatanol) y dos derivados glucosilados de resveratrol: el piceido (3-O-β-D-glucosil-resveratrol) y el resveratrolósido (4’-O-β-D-glucosil-resveratrol) (Vastano y cols., 2000). El piceido es el polifenol que se encuentra en mayor concentración en la raíz de P. cuspidatum (Lamuela-Raventos y cols., 1995), planta de la que actualmente se extrae. Para aumentar los rendimientos de la obtención de resveratrol a partir de la raíz de la planta japonesa se ha estudiado la hidrólisis de este producto glucosilado (Zhang y cols., 2007). Como se comentó anteriormente, el resveratrol es una molécula inestable en determinadas situaciones ambientales, por lo que conviene estabilizarla antes de incorporarla en formulaciones farmacéuticas, cosméticas y/o nutracéuticas. Además, se ha demostrado que pequeñas modificaciones químicas en el núcleo de este compuesto pueden provocar

156

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

grandes variaciones en su actividad biológica, sobre todo en sus propiedades anticancerígenas (Cardile y cols., 2005). Así, como alternativas clásicas para la estabilización de estos compuestos se tratarán a continuación diversos estudios de acilación y de glicosilación enzimáticas que hemos llevado a cabo recientemente en nuestro laboratorio.

5.3.1. acilación enzimática Con el objetivo de incorporar diferentes restos acilo a la estructura del resveratrol se planteó un estudio de acilación. Inicialmente se abordó la acetilación debido a que el pequeño tamaño del residuo acetilo no suele provocar problemas de impedimentos estéricos y da, generalmente, buenos rendimientos. Debido a la presencia de diferentes grupos hidroxilo en la molécula, se realizó un screening inicial con 6 enzimas de distinta naturaleza (lipasas inmovilizadas en distintos soportes, y además previamente desecadas antes de la reacción), con el objetivo de estudiar la regioselectividad de las enzimas comerciales (Plou y cols., 2003). Las condiciones iniciales de la reacción fueron: 50 mM resveratrol, 750 mM acetato de vinilo, 100 mg/ml biocatalizador, 2-metil-2-butanol (2M2B). Así, según el biocatalizador, se encontraron diferentes productos de acetilación y en distintas proporciones; en todos los casos se observó la aparición de una nueva serie de compuestos. Al comparar los resultados con los publicados por Teng y cols. (Teng y cols., 2005), se observó la formación de un nuevo producto acetilado, mayoritario en el caso de la lipasa de Alcaligenes sp. (Figura 5.3). Se purificó dicho compuesto mediante HPLC semipreparativa y tras realizar espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear, se caracterizó como 3-Oacetil-resveratrol (3). Este producto también apareció con las lipasas de Thermomyces lanuginosus y Pseudomonas cepacia, sin embargo la relación entre el derivado en 3-OH y en 4-OH fue 18:1 en el caso de la enzima inmovilizada de Alcaligenes sp., por lo que se seleccionó esta enzima para realizar un estudio cinético (Torres y cols., 2010). Durante el estudio cinético, además de estos productos monoacetilados, se observó la formación del derivado diacetilado, que también fue caracterizado por HPLCMasas y RMN, identificándose como 3,4’-diacetil-resveratrol (5). finalmente se sintetizaba el derivado triacetilado 3,5,4’- (6) en el que todos los fenoles se encontraban sustituidos. El esquema completo de la reacción se representa en la figura 5.4 Se llevó a cabo un estudio del efecto de la temperatura en la reacción en el intervalo 40-60 ºC (figura 5.5). El aumento de temperatura suele tener un efecto positivo en el rendimiento de la reacción de transesterificación, pero al mismo tiempo suele producir la inactivación del biocatalizador. Se observó un máximo de formación del compuesto monoacetilado (3) correspondiente a una conversión del 75%, en todos los casos, alcanzándose este en menores tiempos al aumentar la temperatura (12 h a 40 ºC, 5 h a 60 ºC). Lo mismo ocurrió con el diacetilado (5), llegándose a alcanzar valores del 60% de conversión (160 h a 40 ºC, 24 h a 60 ºC). También se ensayaron diferentes donadores de acilo (ácidos libres, ésteres etílicos y triglicéridos), pero solo funcionaron los ésteres de vinilo, tanto de ácidos grasos saturados como insaturados. La reacción se llevó a cabo en diferentes disolventes de polaridad media o usando el propio donador de acilo como medio de reacción. En todos estos casos, la reacción funcionaba con alto rendimiento.

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

157

Además de la incorporación de cadenas cortas como el acetilo, se ensayaron cadenas más largas, como el estearato. En este caso, se observó una disminución de los rendimientos de reacción, alcanzándose el 55% de rendimiento del compuesto monoesterificado a tiempos largos de reacción (160 h a 40 ºC). La formación de compuestos diacilados o triacilados fue prácticamente inexistente. 3

2

5

I II 10

12

14 16 18 tiempo de retención (min)

20

22

figura 5.3. Cromatograma HPLC a las 4 h de la reacción de formación de los derivados del resveratrol monoacetilados (2 y 3) y un diacetilado (5) usando como biocatalizadores (I) Novozym 435 y (II) lipasa QLG. Los números de los picos hacen referencia a la figura 5.4. O

OH

O

O

O O

HO

2

4 O

O OH

O

O

OH

O 6 O

HO O

1

OH

OH O O

O O

O

O 5 3 OH OH

figura 5.4. Esquema de la acetilación del resveratrol con la lipasa de Alcaligenes sp. inmovilizada.

5.3.2. Glicosilación enzimática Como se comentó anteriormente, la baja solubilidad en agua que posee el resveratrol junto con su baja estabilidad, limita las aplicaciones de este producto tanto a

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

158

nivel farmacológico como nutracéutico y/o cosmético. Así, la incorporación de una cadena hidrofílica, como un azúcar, incrementa su solubilidad y puede, además, influir en sus propiedas fisicoquímicas y farmacocinéticas (Kren, 2011). En algunos casos se ha observado que puede incluso aumentar la absorción del compuesto a nivel intestinal, favoreciendo el paso a través de los enterocitos (Gee y cols., 1998). 50 °C 100

80

80

Conversión (%)

Conversión (%)

40 °C 100

60 40 20 0

0

20 40 60 80 100 120 140 160 tiempo (h)

60 40 20 0

0

20 40 60 80 100 120 140 160 tiempo (h)

60 °C

Conversión (%)

100 80 3-O-acetil-resveratrol

60

3,4'-di-O-acetil-resveratrol

40

3,5,4'-tri-O-acetil-resveratrol

20 0

0

20 40 60 80 100 120 140 160 tiempo (h)

figura 5.5. Cinéticas de reacción de acetilación de resveratrol a diferentes temperaturas usando la lipasa de Alcaligenes sp.

Al tratarse de OHs fenólicos, la glicosilación suele ofrecer mayores dificultades que la que tiene lugar sobre hidroxilos primarios. En estas reacciones se suelen utilizar medios acuosos tamponados al pH óptimo de funcionamiento de la enzima. No obstante, y debido a que la solubilidad del resveratrol en agua es significativamente baja (aprox. 0,03 g/l, 30 ppm), fue necesario incorporar un codisolvente orgánico, resultando el dimetilsulfóxido (DMSO) el más adecuado (la solubilidad del resveratrol en DMSO es aprox. 16 g/l). Se ensayaron enzimas que transferían residuos de glucosa, de fructosa y de galactosa, empleando diversos donadores glicosídicos (Tabla 5.2). Las condiciones ensayadas fueron: 10 mg resveratrol, 50 mg donador de glicosilo, 65 µl enzima en 1 ml de 0,2 M acetato (pH 5,6) al 50 % de DMSO. Bajo estas condiciones se observó que la enzima ciclodextrinaglucanotransferasa (CGTasa) de Thermoanaerobacter sp. era capaz de glicosilar el resveratrol empleando almidón como donador. No obstante, el rendimiento inicial era muy bajo (2% en 24 h), debido posiblemente a la complejidad de la reacción que se llevaba a cabo.

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

159

tabla 5.2. enzimas ensayadas en la GlicOsilación de resveratrOl enzima α-glucosidasa dextransacarasa CGTasa CGTasa β-fructofuranosidasa β-galactosidasa β-galactosidasa

Organismo Aspegillus niger Leuconostoc mesenteroides Thermoanaerobacter Bacillus macerans Aspergillus aculeatus Bacillus circulans Aspergillus oryzae

donador Maltosa Sacarosa Almidón Almidón Sacarosa Lactosa Lactosa

Grupo transferido glucosilo glucosilo glucosilo glucosilo fructosilo galactosilo galactosilo

Con el fin de aumentar el rendimiento de productos glucosilados, se realizó un estudio del efecto de diversos parámetros de reacción : (1) cantidad de enzima, (2) temperatura, (3) naturaleza y porcentaje de codisolventes, (4) concentración de almidón. Después de un riguroso screening, bajo las condiciones óptimas (10 mg/ml resveratrol, 60 mg/ml almidón, 0,2 M acetato sódico (pH 5,6)/DMSO 80/20 (v/v), 5.6 U/ml CGTasa) se alcanzó finalmente un rendimiento del 50% en 24 h. En la Figura 5.6 puede observarse un cromatograma que muestra la complejidad de la reacción estudiada. D4

M2

D3

M1

Resveratrol

D5

TT*

0

10

20

T7 D3'

T9/T10

TT14

T8

30 40 tiempo de retención (min)

50

60

figura 5.6. Cromatograma obtenido a las 15 horas en la reacción de glucosilación de resveratrol con la enzima CGTasa. La nomenclatura de los productos corresponde a la empleada en la Tabla 5.3.

Se obtuvieron un total de 12 compuestos glucosilados (Tabla 5.3), que fueron purificados mediante HPLC semipreparativa, siendo posteriormente caracterizados por espectrometría de masas y RMN bidimensional (Torres y cols., 2011).

160

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos tabla 5.3. cOmpuestOs GlucOsiladOs de resveratrOl que fuerOn caracterizadOs tipo

Monoglucósido

Diglucósido

Triglucósido

estructura

nomenclatura M1

3-O-α-D-glucosil-resveratrol

M2

4’-O-α-D-glucosil-resveratrol

D3

3-O-α-D-maltosil-resveratrol

D3’

3-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]resveratrol

D4

4’-O-α-D-maltosil-resveratrol

D5

3,4’-di-O-α-D-glucosil-resveratrol

T7

3-O-α-D-maltotriosil-resveratrol

T8

4’-O-α-D-maltotriosil-resveratrol

T9/T10 T9/T10

Tetraglucósidos

nombre

3-O-α-D-maltosil,4’-O-α-D-glucosilresveratrol 3-O-α-D-glucosil,4’-O-α-D-maltosilresveratrol

TT14

4’-O-α-D-maltotetraosil-resveratrol

TT*

Estructura no determinada

Como puede deducirse de la Tabla 5.3, esta reacción forma dos series de derivados glucosilados, en las posiciones 3- y 4’- del resveratrol. En ningún caso se identificaron o caracterizaron compuestos diglucosilados en posiciones 3- y 5-, debido posiblemente a impedientos estéricos dada la proximidad de ambas posiciones. La unión de las glucosas entre sí correspondió, mayoritariamente, a enlaces α-(1→4), como es esperable dado el mecanismo de acción de la enzima CGTasa. Sin embargo, mediante el ensayo de hidrólisis de estos compuestos con amiloglucosidasas (capaces de hidrolizar este tipo de enlaces de manera específica), se determinó también la existencia de un compuesto con enlaces α-(1→2) aunque en menor proporción. Un esquema de la reacción puede observarse en la figura 5.7. Esta reacción dió lugar a una nueva serie de compuestos que no habían sido descritos anteriormente, ya que tanto en la naturaleza como mediante la síntesis química, la incorporación de hexosas al resveratrol da lugar a compuestos con azúcares en configuración β.

5.3.3. propiedades de los derivados de resveratrol Debido a que algunos de los productos obtenidos eran nuevos o no habían sido estudiados en profundidad, se decidió abordar el estudio de sus propiedades con el objetivo de caracterizarlos y estudiar la aparición de posibles nuevas actividades.

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

161

OH O

HO

OH O

OH O OH

OH OH

OH

O

OH

n

HO

OH OH

O

OH

n=0-3 O OH

Resveratrol O

HO

HO O OH n

HO n=0-3

OH O

HO OH

OH OH

OH OH OH

O

OH O n OH

Almidón soluble n aprox. 50

OH

OH

OH O

HO OH

O

OH

OH

O

OH O

O

O OH

OH

HO

HO O

OH OH

OH

O

m n OH

n=0-2 m=0-2

figura 5.7. Esquema de la reacción de glucosilación de resveratrol con la enzima CGTasa.

– Evaluación de la capacidad total antioxidante en equivalentes Trolox (TEAC). Se realizó una adaptación del método previamente descrito por Re y cols. (1999) (Re y cols., 1999) para poder realizar este ensayo en placa de 96 pocillos. Además, debido a la pobre solubilidad de la mayoría de los compuestos obtenidos, así como del propio resveratrol, el ensayo se realizó usando soluciones etanólicas en vez de acuosas, favoreciendo así la solubilidad de los productos a estudiar. Se preparó una solución del catión radical ABTS·+ (2,2’-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato) sal diamónica) mediante la adición de persulfato potásico. Esta solución, en presencia de diferentes antioxidantes, se reduce. De esta manera la actividad antioxidante puede medirse como una variación de la absorbancia de la solución a 734 nm usando diferentes diluciones del antioxidante en cuestión. El valor TEAC se calculó a partir de la recta que representa la disminución de la absorbancia vs concentración, determinándose como el cociente entre las pendientes del antioxidante y la del Trolox (Torres y cols. 2010). Como era de esperar, la incorporación de cualquier cadena al anillo del resveratrol provocó una disminución de la actividad antioxidante (Tablas 5.4 y 5.5). Sin embargo, los derivados en 3-OH eran menos activos que los compuestos modificados en 4’-OH, lo que demostró que la posición 3-OH del resveratrol es la principal responsable de la actividad antioxidante, ya que los derivados modificados en esta posición sufrían una considerable disminución de esta capacidad. – Estudio del enranciamiento en alimentos (RANCIMAT). Los estudios de Rancimat de oxidación acelerada se usaron para determinar la capacidad de

162

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

nuestros compuestos de impedir la oxidación de los aceites. Se usó aceite de soja a una temperatura de 110 ºC a un caudal de oxígeno de 20 l/h y en un rango de conductividad de 200 µS. La dosis del ensayo fue 50 ppm. En este caso, solamente fueron estudiados los compuestos acilados, ya que los derivados glucosilados no serían fácilmente miscibles en el medio graso del ensayo. Los resultados mostraron que los derivados modificados en la posición 3-OH daban compuestos menos activos que los modificados en la posición 4’-OH, llegando incluso a perder toda la actividad antioxidante (Tabla 5.4). También se observó, que los estearatos de resveratrol poseían una mayor eficiencia que sus análogos acetilados, debido, probablemente, a la presencia de una cadena alifática de mayor longitud, lo que facilita su solubilidad y miscibilidad en el medio. tabla 5.4. resumen de las actividades antiOxidantes de lOs cOmpuestOs aciladOs estudiadOs compuesto

a

teac

rancimata

Resveratrol

1,79

8,6

3-O-acetil-resveratrol

0,69

0,0

4’-O-acetil-resveratrol

1,64

5,6

3,4’-di-O-acetil-resveratrol

0,33

0,0

3-O-estearoil-resveratrol

1,02

6,3

4’-O-estearoil-resveratrol

0,44

7,9

Resultado expresado como medida del aumento de la estabilidad en %.

– Concentración Micelar Crítica (CMC). Se realizó el estudio para observar las posibles propiedades tensioactivas de los compuestos glucosilados de resveratrol. Las medidas de tensión superficial se llevaron a cabo mediante el método en placa Wilhelmy. Todos los compuestos obtenidos, con enlaces α-glucosídicos presentaron actividad tensioactiva, a diferencia de las propiedades presentadas por los glucósidos naturales, con enlaces β-glucosídicos, siendo estos últimos además menos solubles en medio acuoso. Los derivados α-glucosilados del resveratrol presentan propiedades tensioactivas; en el caso de los monoglucosilados en las posiciones 3- y 4’-, las propiedades de los dos compuestos son similares. Sin embargo, en los compuestos diglucosilados, el derivado modificado en la posición 3-OH posee una capacidad surfactante superior (Torres y cols. 2011). – Estudio de la actividad antioxidante de los derivados de resveratrol en matrices lipídicas. Los ésteres de resveratrol previamente sintetizados fueron sometidos a un estudio de actividad antioxidante en matrices lípidicas procedentes de pescado, y luego comparados con otros derivados glucosilados. Los resultados de este estudio indican que estas modificaciones no mejoran la actividad antioxidante de los compuestos, aunque confirman la importancia de la posición 3-OH en dicha actividad (Medina y cols., 2010).

Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

163

tabla 5.5. actividad antiOxidante y tensiOactiva de lOs cOmpuestOs GlucOsiladOs estudiadOs compuesto Resveratrol 3-O-α-D-glucosil-resveratrol (M1) 4’-O-α-D-glucosil-resveratrol (M2) 3-O-α-D-maltosil-resveratrol (D3) 4’-O-α-D- maltosil –resveratrol (D4) 3,4’-di-O-α-D-glucosil-resveratrol (D5) a b

teac 1,79 0,75 1,17 0,84 1,0 0,36

cmc (mm) n.d.a 3,33 3,59 n.c.b n.c.b 0,49

Tensión superficial en cmc ( mn/m) n.d.a 50,0 50,5 ≤ 48,8 ≤ 66,7 59,6

solubilidad (g/l) 0,03 > 2,5 > 2,0 n.c.b n.c.b > 0,82

No detectada. No cuantificada.

aGradecimientOs Nos gustaría agradecer el esfuerzo de los Drs. Jesús Jiménez (CIB, CSIC) y Ana Poveda (SIdI, uAM) en la caracterización por RMN de los compuestos sintetizados. A los Drs. José L. Parra y francisco Comelles (IQAC, CSIC) por la medición de las propiedades tensioactivas de los derivados glucosilados de resveratrol. También a las Dras. Soledad Peña y Ana V. ugidos (Biotecnologías Aplicadas S.A., Madrid) por la realización del test Rancimat. finalmente, también agradecer a la Comunidad de Madrid por la concesión del contrato de P. T-S.

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

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Modificación de antioxidantes fenólicos mediante procesos enzimáticos

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6. Obtención enzimática de fructanOs prebióticOs tipO inulina lucía Fernández arroJo bárbara rodríGuez colinas Julio alberto reyes rodríGuez Francisco J. Plou Gasca Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (CSIC), Madrid, España

6.1. micrObiOta intestinal y prebióticOs La microbiota intestinal se encuentra entre las dianas de algunos alimentos funcionales, como son los denominados alimentos probióticos, prebióticos y simbióticos (Guarner, 2000). El interés de la industria alimentaria por desarrollar este tipo de alimentos radica en la creciente importancia que numerosos estudios están atribuyendo a la microbiota intestinal y a su relación con la salud del individuo hospedador (Palou y Serra, 2000). El tracto digestivo representa la mayor superficie de contacto con el medio externo, unos 300 m2, mucho mayor que la superficie de nuestra piel (estimada en 2 m2) y tres veces superior a la superficie de nuestros pulmones, por lo que debe tener un papel importante en la salud del individuo. Durante mucho tiempo se ha subestimado el papel del ecosistema de especies microbianas, variado y dinámico, que se aloja en el tracto digestivo y que hoy se sabe tiene una importante participación en funciones metabólicas, de protección ante infecciones y de modulación del sistema inmune, entre otras (Guarner y Malagelada, 2003). Se denomina microbiota intestinal al conjunto de especies microbianas que residen en el intestino. En el tubo digestivo de un ser humano adulto habita un número muy considerable de microorganismos, 1014 aproximadamente, cantidad diez veces superior a la de células con genoma humano que alberga nuestro organismo. Los microorganismos que pueblan nuestro tracto digestivo van aumentando su concentración desde la boca hasta el recto alcanzando un máximo en el colon, en el que se estima que se encuentran 1012 ufC (unidades formadoras de colonias) por gramo de contenido intestinal (fig. 6.1). Estos microorganismos, en su mayoría bacterias, pertenecen a unas 500 especies distintas, lo que implica que el número de genes codificados en el microbioma supera en más de 100 veces al de los genes del genoma humano (Bäckhed y cols., 2005). Hay algunos autores que consideran a la microbiota intestinal como un «órgano microbiano» situado en el interior del cuerpo del hospedador, y son cada vez más los estudios realizados sobre el efecto del estado y composición de la microbiota intestinal sobre la salud de los individuos (Saulnier y cols.,

168

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

2009). Recientemente, se ha postulado que solo existen tres ecosistemas diferentes en el tracto gastrointestinal de las personas, denominados «enterotipos» (Arumugam y cols., 2011). Dichos autores no encontraron ninguna relación entre los enterotipos y el origen étnico, sexo, peso, o edad de los individuos estudiados. La actividad metabólica de la microbiota intestinal permite la asimilación de nutrientes que no habían sido digeridos (y por tanto absorbidos), la producción de algunas vitaminas (K, B12, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico) y la absorción de minerales (fe, Mg, Ca) (Turroni y cols., 2008). La microbiota intestinal también tiene una función de barrera defensiva contra patógenos de procedencia exógena. una microbiota intestinal sana mantiene un equilibrio entre las distintas especies de modo que evita la sobreproliferación de aquellas potencialmente patógenas (Zoppi, 1997). Asimismo, la interacción de las bacterias de la microbiota con las paredes del intestino tiene efectos sobre la proliferación y diferenciación de las células epiteliales de este, y sobre el sistema inmunitario del individuo. Las bacterias del intestino ejercen un estímulo constante sobre la red de tejido linfoide más extensa del organismo, el tejido linfático asociado al intestino (GALT, gut associated lymphoid tissue), por lo que la microbiota intestinal ejerce una función de modulación del sistema inmune, tanto a nivel local como sistémico (Salminen, 2003). Boca y faringe: 104-106 UFC/g Peptostreptococcus Fusobacterium Bacteroides Estómago: 103-104 UFC/g Streptococcus Staphylococcus Lactobacillus Levaduras Íleon: 104-1010 UFC/g Coliformes Bacteroides Bifidobacterium Clostridium Colon: 1010-1012 UFC/g Bacteroides Bifidobacterium Clostridium Enterococcus

figura 6.1. Esquema del tracto gastrointestinal y microorganismos característicos de las distintas secciones (Adaptado de Mayo y Delgado, 2003).

A los dos años de edad, la microbiota intestinal de un individuo adquiere una composición que tiende a mantenerse estable durante su vida adulta. Sin embargo, existen

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

169

factores externos capaces de alterar la composición y por tanto el equilibrio de la microbiota intestinal (estrés, ingesta de antibióticos, cambios en la dieta, factores emocionales, medioambientales, etc.) (Mayo y Delgado, 2003). El equilibrio de la microbiota se puede reestablecer mediante la ingesta de microorganismos vivos probióticos o mediante el consumo oligosacáridos prebióticos (Gibson y Ottaway, 2000). El término «prebiótico» fue introducido en 1995 (Gibson y Roberfroid, 1995) para oligosacáridos que conseguían modular la composición de la microbiota colónica, estimulando el crecimiento in situ de unos determinados grupos de bacterias endógenas con un consecuente efecto positivo sobre la salud del individuo. Sin embargo, fue hace más de 30 años, en Japón, cuando se desarrollaron los primeros trabajos sobre los hoy denominados prebióticos, al identificarse compuestos presentes en la leche materna que favorecían el crecimiento de las bifidobacterias en el intestino de lactantes (Yazawa y cols., 1978). Se aislaron algunos oligosacáridos con actividad bifidogénica, dando pie a posteriores estudios sobre los efectos que produce la ingesta de algunos carbohidratos sobre la salud en humanos y en animales. Las tres propiedades que ha de tener un ingrediente para que hoy en día pueda ser calificado como prebiótico son: 1. Resistencia a ser hidrolizado y absorbido en su tránsito intestinal superior (por la acción de las condiciones de pH y de las enzimas gástricas). 2. Ser fermentable por la microbiota intestinal. 3. Capacidad de estimular selectivamente el crecimiento y/o actividad de aquellas bacterias intestinales que contribuyen a la buena salud del individuo. una vez que los oligosacáridos prebióticos han alcanzado el colon, son fermentados selectivamente favoreciendo a bacterias beneficiosas como las bifidobacterias y los lactobacilos (Holzapfel y Schillinger, 2002) contribuyendo a una composición de la microbiota más saludable y equilibrada. Entre los efectos beneficiosos de los prebióticos destacan el control del estreñimiento, la reducción de los episodios de diarreas, un alivio de los síntomas de intolerancia a la lactosa, el aumento de la absorción de calcio, la disminución de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas, el control de dislipemias, etc. (Gibson y Ottaway, 2000). Los efectos de la ingesta de oligosacáridos prebióticos sobre la salud del individuo son debidos, primero, a su capacidad de modificar la composición de la microbiota intestinal y, segundo, a los productos liberados al ser fermentados por las bacterias (Hirayama 2002). Estos productos son, en su mayoría, los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) o también denominados ácidos grasos volátiles (AGVs), ácido acético, propiónico y butírico, que reducen el pH luminal y son fácilmente absorbidos a través de la pared intestinal (Greger, 1999). La producción de AGCC lleva asociada una serie de efectos fisiológicos que repercuten en la salud del individuo: protección frente a patógenos, absorción de minerales como el calcio y el magnesio, regulación de la lipogénesis, aporte energético a tejidos periféricos, control de la diferenciación de colonocitos (protegiendo frente al cáncer de colon) (Roberfroid, 2001). Aunque el consumo de probióticos (microorganismos vivos, generalmente bifidobacterias y lactobacilus) también consigue modular la composición de la microbiota intestinal, los prebióticos presentan ventajas para la industria alimentaria: pueden ser fácilmente adicionados a variedad de productos alimentarios al ser solubles en agua, tienen poder edulcorante, son resistentes a altas temperaturas y poseen buenas propiedades organolépticas.

170

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

6.2. fructanOs tipO inulina. OliGOfructOsa y fructOOliGOsacáridOs Los denominados fructanos tipo inulina son compuestos que, junto con los galactooligosacáridos (GOS), isomaltooligosacáridos (IMOS) y la lactulosa, han sido catalogados como prebióticos con el aval de numerosos estudios científicos (Roberfroid, 2007). La Tabla 6.1 resume los principales prebióticos comercializados en Europa y en América, incluyendo los grados de polimerización típicos y la forma de obtención. tabla 6. 1. prebióticOs cOmercializadOs actualmente en la unión eurOpea y américa prebiótico Inulina Oligofructosa

composicióna (Fru)n (Fru)n-Glc (Fru)n (Fru)n-Glc

dpb

enlace

10-50

β(2→1) Extracción de plantas

2-10

β(2→1) Hidrólisis enzimática de inulina

fructooligosacáridos

(Fru)n-Glc

2-4

β(2→1)

Galactooligosacáridos

(Gal)n-Glc

2-4

β(1→4) β(1→6)

Isomaltooligosacáridos

(Glc)n

2-5

α(1→6)

Gal-Fru

–

β(1→4)

Lactulosa a b

método de obtención

Transglicosilación enzimática de sacarosa Transglicosilación enzimática de lactosa Transglicosilación enzimática de almidón hidrolizado Isomerización química de lactosa

fru: fructosa; Glc: Glucosa; Gal: Galactosa. Grado de polimerización.

La terminología empleada en la denominación de los fructanos tipo inulina ha sido en ocasiones inconsistente, confundiendo los distintos tipos de prebióticos dentro esta familia (Kelly, 2008). Se conocen como fructanos aquellos oligosacáridos y polisacáridos que forman parte de la dieta y que se encuentran de manera natural en plantas, en los que la mayor parte de los enlaces glicosídicos de su estructura son entre dos grupos fructosilo. Los fructanos representan el segundo mecanismo más común de almacenamiento de energía en el reino vegetal, tras el almidón (Negro y cols., 2006). Los fructanos pueden ser lineales o ramificados, con enlaces glicosídicos de distinta naturaleza. Cuando los fructanos son lineales y los enlaces glicosídicos entre las unidades de fructosa son del tipo β(2→1), entonces se denominan fructanos tipo inulina (fTI) (Roberfroid, 1993). En la naturaleza los fTI se encuentran en numerosas especies vegetales (más de 36.000), algunas de las cuales se incluyen en nuestra alimentación, en forma de frutas, verduras y cereales, como se muestra en la Tabla 6.2. Los hábitos de vida actuales hacen que el aporte de fructanos tipo inulina por la ingesta de productos naturales no sea, en muchos casos, la suficiente -se recomienda un consumo de 10 g/día (Bouhnik y cols., 2006). Por ello la industria alimentaria está desarrollando alimentos funcionales a los que incorpora este tipo de oligosacáridos prebióticos.

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

171

tabla 6.2. cOntenidO en fructanOs tipO inulina (pOrcentaje en pesO húmedO) de alGunas especies veGetales (chi y cOls., 2011; shepherd y GibsOn, 2006; tunGland, 2003; van lOO y cOls., 1995) vegetal Achicoria Alcachofa de Jerusalén Camassia Diente de león Agavea Ajo Yacón Espárrago Escorzonera Puerro Alcachofa Cebolla Trigo Centeno Cebada Plátano Jicama

parte comestible Raíz Tubérculo Bulbo Hojas Piña Bulbo Raíz Brotes Raíz Bulbo Hojas (corazón) Bulbo Cereal Cereal Cereal fruta Tubérculo

especie Cichorium intybus Heliantus tuberosus Camassia sp. Taraxacum officinale Agave spp. Allium sativum Smallanthus sonchifolius Asparagus officinalis Scorzonera hispanica Allium ampeloprasmus Cynara scolymus Allium cepa Triticum asetivum Secale cereale Hordeum vulgare Musa sp. Pachyrhizus erosus

contenido en fructanos (%) 15,0-24,0 14,0-22,0 12,0-22,0 12,0-15,0 10,0-24,0 9,0-16,0 3,0-19,0 2,0-15,0 4,0-11,0 2,0-10,0 3,0-10,0 1,1-7,5 0,8-4,0 0,5-1,0 0,5-1,5 0,3-0,7 n.d.

n.d. Dato no disponible a El fructano que contiene está altamente ramificado, con enlaces β(2→6).

Los FTI, a su vez, se clasifican en inulina, oligofructosa y fructooligosacáridos (fOS), todos ellos con propiedades prebióticas gracias a la presencia de los enlaces glicosídicos β(2→1). La estructura química de la inulina, oligofructosa y FOS se muestra en la Tabla 6.1. Los fOS son fructanos con alta proporción de glucosa en su estructura (con grados de polimerización entre 2 y 4), mientras que la inulina y la oligofructosa tienen baja proporción de glucosa. La inulina, que contiene cadenas tanto del tipo (Fru)n-Glc como (Fru)n , se obtiene a nivel industrial por extracción directa de las plantas empleando agua caliente. La oligofructosa se obtiene por hidrólisis parcial de la inulina. Los productos comercializados como fOS se preparan mediante síntesis enzimática a partir de sacarosa; el producto final suele incluir glucosa y sacarosa si no ha sido sometido a alguna etapa de purificación adicional.

6.3. Obtención de OliGOfructOsa mediante hidrólisis de inulina La oligofructosa se obtiene mediante hidrólisis controlada de inulina empleando inulinasas. Tanto las cadenas de inulina (obtenida fundamentalmente de achicoria y

172

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

alcachofa de Jerusalén) como la oligofructosa pueden tener una glucosa terminal, unida a la fructosa mediante un enlace α(1→2). Las inulinasas se dividen en endo-inulinasas (EC 3.2.1.7) cuando únicamente hidrolizan los enlaces β(2→1) del interior de la cadena de inulina y exo-inulinasas (EC 3.2.1.80) cuando hidrolizan el extremo β(2→1) de la cadena. El hecho de que una inulinasa tenga actividad «endo» o «exo» depende en gran medida del origen de la enzima (Singh y Singh, 2010). Las exo-inulinasas y endo-inulinasas pertenecen a la familia GH32, y están presentes en plantas y microorganismos como Kluyveromyces marxianus, Aspergillus niger y Bacillus subtilis (Cazetta y cols., 2005). Su aplicación a la hidrólisis de inulina para la obtención de oligofructosa es una tecnología madura (Roberfroid, 2007). Existen preparaciones comerciales que combinan endoy exo-inulinasas, como por ejemplo fructozyme L (Novozymes A/S), que combina una exo-inulinasa de Bacillus stearothermophilus y la endo-inulinasa de Apergillus niger para la hidrólisis total de inulina (Basso y cols., 2010), y otras que solo contienen endo-inulinasas como fructozyme 960 (Novozymes A/S) para la obtención de oligofructosa (Mutanda y cols., 2008). Si la hidrólisis enzimática de inulina se realiza de manera completa se obtienen los denominados jarabes de fructosa (Garcia-Aguirre y cols., 2009), que presentan diversas ventajas frente a otros edulcorantes: su poder edulcorante es cuatro veces superior a la glucosa, no están asociados a procesos como la caries o la diabetes. Por otro lado, la oligofructosa obtenida por la hidrólisis parcial de inulina tiene una amplia gama de aplicaciones en la industria alimentaria, debido a que presenta propiedades edulcorantes similares a la sacarosa y, en especial, a su actividad prebiótica (Chi y cols., 2011). Así, la oligofructosa se emplea en productos de confitería, preparados de frutas, postres de leche, yogurt y quesos frescos, productos de panadería, chocolate, helados y salsas (Kaur y Gupta, 2002). Algunos investigadores han postulado que los fructanos de pequeña longitud de cadena tienen mejores propiedades bifidogénicas que los de mayor grado de polimerización, tanto lineales como ramificados (Bañuelos y cols., 2008; Biedrzycka y Bielecka, 2004; Gibson y Wang, 1994). El empleo de inulinasas para la producción de bioetanol a partir de inulina u otros fructanos ramificados como los del agave ha suscitado interés en los últimos años debido a la amplia disponibilidad de estos polisacáridos en la naturaleza y a que la hidrólisis enzimática es relativamente sencilla (Kunz, 2008; Negro y cols., 2006). Sin embargo, el rendimiento en la producción de bioetanol a partir de inulina sigue siendo bajo comparado con el obtenido mediante hidrólisis de almidón y posterior fermentación de la glucosa por S. cerevisiae (Lane y Morrissey, 2010). No obstante, la utilización de materias primas amiláceas para la producción de biocombustibles es controvertida dado su uso primario alimentario; es por ello por lo que fuentes alternativas como los fructanos (en ocasiones, excedentes, como ocurre con el agave) están siendo estudiadas en el contexto de las biorrefinerías. Existen en la naturaleza fructanos ramificados conocidos como «neoinulinas», que presentan tanto enlaces β(2→1) como β(2→6), con una glucosa terminal unida por enlace α(1→2), creando estructuras no lineales con un grado de polimerización que varía según la planta de donde se extraigan, y que suele oscilar de 3 a 29 (Lopez y cols., 2003; Shiomi y cols., 2006). De estos fructanos ramificados, los fructanos

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

173

del agave Tequilana weber var. Azul han suscitado un especial interés por su alta concentración en las plantas (hasta 120 g/kg en peso fresco) y su potencial aplicación en la producción de oligofructosa y por tanto de prebióticos (Arrizon y cols., 2010). Para la hidrólisis de estos fructanos se han probado preparaciones comerciales como fructozyme L sin que la hidrólisis sea total. Recientemente, se ha reportado la purificación de una inulinasa de una cepa de Kluyveromyces marxianus aislada en la fermentación de los mostos de agave para la obtención de «Mezcal de Guerrero» (Arrizon y cols., 2011), que ha demostrado tener una mayor actividad de hidrólisis sobre los fructanos ramificados que las preparaciones comerciales ya conocidas, haciendo más viable la obtención de oligómeros de fructosa a partir de este tipo de fructanos de agave.

6.4. Obtención de fructOOliGOsacáridOs a partir de sacarOsa Los fructooligosacáridos (fOS) son oligosacáridos de fructosa con una glucosa terminal, en los que los grupos fructosilo se encuentran generalmente unidos mediante enlaces glicosídicos del tipo β(2→1). Los FOS se producen industrialmente a partir de sacarosa utilizando una β-fructofuranosidasa (p. ej. de Aspergillus niger) para generar oligosacáridos de cadena corta, de 3-5 unidades (Vannieuwenburgh y cols., 2002). un aspecto interesante de estas reacciones es la posibilidad de controlar la naturaleza de los fOS formados en función de la procedencia de la enzima. Así, las β-fructofuranosidasas de Aspergillus sintetizan una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa (Nguyen y cols., 2005), las de las levaduras Schwanniomyces occidentalis, Rhodotorula dairinensis y Saccharomyces cerevisiae producen fundamentalmente 6-kestosa (Gutierrez-Alonso y cols., 2009), y la de Xanthophyllomyces dendrorhous se caracteriza por sintetizar neo-kestosa como producto principal (Linde y cols., 2009). La estructura de los fOS (series 1f, 6f y 6G) se representa en la figura 6.2. Los fOS comercializados suelen ser mezclas de oligosacáridos con distintos grados de polimerización conteniendo, además, mono- y disacáridos residuales del proceso de síntesis. Así, una composición típica de fOS comerciales es 25-30% (p/p) de 1-kestosa, 10-15% de nistosa, 5-10 % de fructosilnistosa y 25-30 % de glucosa, como subproducto (Yun, 1996). Estudios recientes muestran que el trisacárido 1-kestosa tiene un mayor efecto prebiótico en comparación con compuestos de mayor grado de polimerización de la misma serie (Bañuelos y cols., 2008). Sin embargo, otros autores postulan que una mezcla de fOS con grados de polimerización variados permitiría extender el efecto prebiótico hacia zonas más distales del colon (Van Loo, 2004). La reacción de transfructosilación mediada por β-fructofuranosidasas tiene lugar en dos pasos. En el primero se forma un intermedio fructosil-enzima, por unión covalente de una molécula de fructosa al centro activo de la enzima, acompañado de la liberación de una molécula de glucosa. En el segundo paso se produce un ataque nucleofílico de un carbohidrato (que puede ser otra molécula de sacarosa), dando como resultado la síntesis del fructooligosacárido correspondiente (p. ej.1-kestosa).

174

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos CH2OH

O

CH2OH

HO HO

F-FOS

OH

O O

CH2OH

OH CH2 1

OH CH2OH

O

O

CH2OH

OH 2

CH2 1 O O

O

CH2 1 O

CH2OH

O

OH CH2OH

OH

CH2 1

OH

O

CH2OH

O

OH 2 CH2

OH CH2OH

O O

2

OH

CH2OH

1-Kestosa

OH

CH2 OH CH2OH

O O

O

OH 2

CH2

OH

O

CH2OH

OH

OH

OH 2

CH2OH

OH O

CH2OH

OH

O

HO HO

OH

O

OH

O

CH2OH

O

HO HO

OH CH2OH

1

CH2OH

O

HO HO

O O

2

OH

2 CH2

CH2

OH

OH CH2OH

OH CH2OH

O O

Nistosa

O O

OH 2

OH 2 CH2

CH2OH OH CH2OH

OH

Fructosilnistosa

O O

OH 2 CH2OH

OH

Fructosilfructosilnistosa CH2OH

CH2OH

O

HO HO OH CH2OH

O

O

O

OH

F-FOS

6

2

O

6

CH2OH

OH

CH2OH

OH O O

OH

CH2OH

OH

OH

O

HO HO

CH2 CH2OH

OH

O O

6-Kestosa

OH

6

O O

2

OH CH2OH

CH2OH OH

OH

6-Nistosa CH2OH

6

O O

OH

CH2OH O

2

HO CH2OH HO

G-FOS

6

OH

OH CH2OH

OH

Neokestosa

O O

O O

OH

6 O

2 HO CH2OH HO

OH

OH

O

CH2OH

OH

OH CH2OH

OH CH2OH

Neonistosa

CH2 O O

OH CH2OH

OH

figura 6.2. Estructuras de los fructooligosacáridos (series 1f, 6f y 6G).

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

175

En el caso en que el nucleófilo sea una molécula de agua, el producto resultante es la fructosa. La preferencia de la enzima por una molécula de agua o de carbohidrato como molécula aceptora va a determinar la tasa de transglicosilación/hidrólisis y, en definitiva, el rendimiento en FOS. Dicha tasa depende de la naturaleza de la enzima pero también de las condiciones de reacción, especialmente de la concentración de sacarosa en la mezcla inicial. En la síntesis de fOS se buscan enzimas que tengan una tasa de transferencia/hidrólisis elevada y el medio de reacción se prepara con sacarosa concentrada (≥ 600 g/l), para así disminuir en lo posible la actividad de hidrólisis y obtener mayores rendimientos de síntesis de fOS. Pectinex ultra SP-L es un cóctel enzimático de Aspergillus aculeatus que se emplea en la industria alimentaria por su actividad pectinasa. En este preparado enzimático se detectó la presencia de actividad β-fructofuranosidasa (Hang y Woodams, 1995). Mediante análisis cromatográfico de los productos de reacción, se comprobó que dicha enzima presentaba una tasa de transglicosilación elevada (Ghazi y cols., 2005). La figura 6.3 muestra un cromatograma típico de la mezcla de reacción, en la que se aprecia que el pico de fructosa es muy pequeño en comparación con el de glucosa, así como la formación de los distintos fOS. 2

4 3 5

6 1 0

5

10 Tiempo retención (min)

15

20

Figura 6.3. Análisis cromatográfico de la mezcla de reacción obtenida con la la β-fructofuranosidasa de A. aculeatus partiendo de sacarosa 600 g/l. (1) fructosa; (2) Glucosa; (3) Sacarosa; (4) 1-Kestosa; (5) Nistosa; (6) fructosilnistosa.

Para un estudio riguroso de la síntesis de FOS se requiere determinar el perfil de productos de transfructosilación a lo largo del tiempo, ya que se trata de una reacción bajo control cinético. La Figura 6.4 muestra el perfil típico de producción de FOS, concretamente con la β-fructofuranosidasa de X. dendrorhous. Se observó un máximo de fOS de 66 g/l, partiendo de una disolución de sacarosa de 410 g/l. A partir de dicho máximo, la concentración de fOS disminuye progresivamente como consecuencia de la actividad hidrolítica de esta enzima.

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

176 80 70 60

[FOS] (g/l)

50 40 30 20 10 0

0

10

20

30

40

50 60 70 80 Tiempo de reacción (h)

90

100

110

120

130

figura 6.4. Cinética de producción de fOS a partir de una disolución de sacarosa 410 g/l con la β-fructofuranosidasa de X. dendrorhous. Condiciones: 0.5 u/ml, tampón 0.2 M acetato sódico (pH 5.6), 50 °C (Linde y cols., 2009).

6.4.1. utilización de melazas para la producción de fOs La melaza es el subproducto de la producción de azúcar a partir de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar. Se trata de un líquido espeso, viscoso, de color pardo muy oscuro y que se aprovecha mayoritariamente para la alimentación animal, aunque una pequeña parte (fundamentalmente de melazas de caña) también se destina al consumo humano y producción de alcohol. Algunas de las propiedades de la melaza se recogen en la Tabla 6.3 (Ghazi y cols., 2006). tabla 6.3. características principales de la melaza de remOlacha azucarera (Ghazi y cOls., 2006) unidades Brixa pH Densidad (g/ml) Sacarosa (g/l)b Betaína (% p/p)

75,1 8,9 1,4 570 5,6

Gramos de sacarosa por 100 gramos de muestra. Dato proporcionado por el fabricante. b Determinado por HPLC. a

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

177

Para que el pH de la melaza fuera más adecuado a la actividad de la enzima, se ajustó el valor a 5,6. una desventaja de esta fuente alternativa de sacarosa es su alta viscosidad, que dificulta su manejo, tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Se realizaron unos ensayos en los que se diluyó la melaza y se estudió el efecto de esta dilución sobre la reacción de síntesis de fOS (Tabla 6.4). tabla 6.4. efectO de la dilución de la melaza sObre la prOducción de fOs cOn la β-fructOfuranOsidasa de A. aculeatus. cOndiciOnes experimentales: 5 u/mla, ph 5,6, 60 °c, 220 rpm. tiempO de reacción de 24 h [sacarosa] (g/l)b 570 475 380 285

1-Kestosa (%)c 33,5 20,6 15,2 9,0

nistosa (%)c 7,8 20,7 22,5 19,7

fructosilnistosa (%)c 0,3 2,5 7,8 12,6

fOs totales (%)c 41,6 43,8 45,6 41,3

[fOs totales] (g/l) 247 217 181 123

a Actividad determinada por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). una unidad de actividad corresponde a la liberación de un µmol de azúcares reductores por minuto. b Concentración de sacarosa inicial tras las diferentes diluciones realizadas. c Valores referidos al total de carbohidratos de la mezcla (en peso).

Los resultados obtenidos con la β-fructofuranosidasa de A. aculeatus mostraron que la melaza permitía la síntesis de fOS con un rendimiento muy aceptable. Se ha descrito también la síntesis de fOS a partir de melaza empleando células de Aureobasidium pullulans, con las que se obtuvo 166 g/l de fOS a partir de una melaza con 360 g/l de sacarosa, es decir, un rendimiento del 46% (Shin y cols., 2004). Este resultado es concordante con los datos obtenidos con la β-fructofuranosidasa de A. aculeatus (Tabla 6.4): a partir de una melaza con 380 g/l de sacarosa, se obtuvieron 181 g/l de fOS, es decir, también un 46% de rendimiento. El uso de la melaza podría ser una buena opción para la reducción de costes de producción de fOS. Esto permitiría obtener un producto enriquecido en fOS viable económicamente para aplicarse, por ejemplo, en alimentación animal. El empleo de la melaza para la preparación de piensos animales presenta una serie de ventajas: es una fuente de carbohidratos económica de alto valor energético, con propiedades organolépticas agradables para el ganado y que evita la formación de polvo durante la fabricación y distribución de los piensos a los animales, al actuar como aglomerante en la formación de los pellets. El enriquecimiento en FOS de la melaza para piensos animales aportaría beneficios a la salud del animal, según se ha descrito en diversos trabajos (Xu y cols., 2003). No obstante, la difícil eliminación del color de las melazas durante las operaciones downstream podría limitar el uso de estos fOS en productos destinados al consumo humano.

6.5. inmOvilización de enzimas para la Obtención de fructanOs tipO inulina La aplicación a gran escala de enzimas glicosídicas para la obtención de fTI puede verse favorecida si se inmoviliza la enzima en un soporte sólido. Este proceso fa-

178

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

cilita la separación del biocatalizador -con la consiguiente detención de la reacciónsu reutilización y, en algunos casos, un aumento de su estabilidad operacional (Plou y cols., 1999). Además, permite operar con reactores de diferente configuración (lecho fijo, lecho fluidizado, tanque agitado, reactores de membrana, etc.). De los distintos métodos de inmovilización enzimática descritos (adsorción, unión covalente, entrecruzamiento, atrapamiento, encapsulación, etc.), las técnicas basadas en la adsorción no suelen ser adecuadas para este tipo de enzimas ya que, al tener lugar las reacciones en un medio acuoso, la enzima se desprende progresivamente del soporte (lixiviación), a no ser que se lleve a cabo un proceso de entrecruzamiento con reactivos bifuncionales. En este sentido, la inmovilización covalente mantiene la enzima fuertemente anclada al soporte sólido evitando así su desorción. La Tabla 6.5 recopila algunos de los trabajos publicados de inmovilización de enzimas para la síntesis de fTI. De los numerosos métodos de inmovilización covalente descritos, los basados en soportes epoxi-activados son muy utilizados. Estos soportes tienen grupos oxirano (o epóxido) que pueden reaccionar con grupos nucleofílicos de las cadenas laterales de los aminoácidos que conforman la proteína, dando lugar a enlaces covalentes estables. tabla 6.5. trabajOs publicadOs de inmOvilización de enzimas para la síntesis de fOs (utilizandO β-fructOfuranOsidasas) y OliGOfructOsa (utilizandO inulinasas) soporte Sílice porosa

enzima β-fructofuranosidasa de Aureobasidium sp. Resina de intercambio iónico β-fructofuranosidasa de Aureobasidium pullulans Polimetacrilamida epoxiβ-fructofuranosidasas de activada Aspergillus niger y Aspergillus japonicus Membrana cerámica (activada β-fructofuranosidasa de con glutaraldehído) A. niger Eupergit C (soporte acrílico β-fructofuranosidasa de epoxi-activado) Aspergillus aculeatus Sepabeads EC (polimetacrilato β-fructofuranosidasa de epoxi-activado) A. aculeatus Quitosano (activado con β-fructofuranosidasa de glutaraldehído) A. japonicus Amberlita IRA900 β-fructofuranosidasa de A. aculeatus Quitosano Inulinasa de A. niger

inmovilización Covalente Adsorción iónica Covalente Covalente

referencia (Hayashi y cols., 1992) (Yun y cols., 1995) (Chiang y cols., 1997)

(Nishizawa y cols., 2000) Covalente (Tanriseven y Aslan, 2005) Covalente (Ghazi y cols., 2005) Covalente (Cheng y cols., 2005) Adsorción iónica/ (Csanadi y Sisak, entrecruzamiento 2006) Covalente (Nguyen y cols., 2011) Alcohol polivinílico Atrapamiento (Cattorini y cols., Inulinasa de A. niger (Lentikats) 2009) Sepabeads EA (polimetacrilato Endoinulinasa de A. niger Covalente (Basso y cols., amino-activado) 2010) y exoinulinasa de Bacillus stearothermophilus

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

179

Existen en el mercado una serie de soportes sólidos epoxi-activados constituidos por una matriz de polimetacrilato (Sepabeads, Dilbeads, etc.), con propiedades mecánicas mejoradas respecto a los clásicos Eupergit (formados por una matriz de poliacrilamida). La unión covalente de la enzima en este tipo de soportes ocurre cuando un grupo oxirano de la partícula sólida reacciona con un grupo nucleofílico de la proteína (figura 6.5.). Dicho grupo nucleofílico podrá ser del tipo amino, tiol, fenol o carboxílico, presentes en las cadenas laterales de los aminoácidos de la proteína, o bien en los extremos amino- y carboxilo-terminal, dependiendo del pKa del aminoácido y, por tanto, del pH del medio. Soporte O

OH

Enzima

H2N

H N

O

O

figura 6.5. unión covalente de enzimas a soportes epoxi-activados a través de los grupos amino.

En el trabajo desarrollado en nuestro laboratorio, se probaron dos tipos de soportes epoxi-activados Sepabeads, EC-EP3 y EC-EP5, cuyas propiedades químicas y texturales fueron estudiadas (Tabla 6.6). En las imágenes de microscopía electrónica de barrido del soporte Sepabeads EC-EP3 (fig. 6.6), se observa la heterogeneidad en el tamaño de las partículas y una rugosidad en la superficie que se traduce en un elevado volumen de poro. tabla 6.6. características de lOs sOpOrtes sepabeads ec-e3 y ec-ep5

soporte

Superficie Grupos tamaño de específica bet partícula epóxido (m2/g)c (µm)b (µmol/g)a

volumen tamaño total de medio de contenido poros poro de agua (cm3/g)d (nm)d (%)e

Sepabeads EC-EP3

106

7-225

43

1,19

130

60

Sepabeads EC-EP5

23

19-215

9

1,67

800

65

Dato del fabricante Determinado mediante porosimetría de intrusión de Hg c Medida mediante isotermas de adsorción de N2 d Combinación de los datos de porosimetría de Hg e isotermas de N2 e Determinado mediante el método de Karl fischer a

b

Se ensayaron dos tampones de inmovilización de pH diferente a dos concentraciones con el fin de seleccionar las condiciones con las que se conseguían mayores rendimientos de inmovilización de enzima activa. En la Tabla 6.7 se recogen los resultados obtenidos, en los que se observa que el tampón más adecuado de los ensayados fue el de carbonato sódico 0,3 M (pH 9,0).

180

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

figura 6.6. Microfotografías SEM del soporte Sepabeads EC-EP3. Aumentos: A, 25x; B, 60x; C, 5000x y D, 8000x. tabla 6.7. efectO del tampón en la inmOvilización de la β-fructOfuranOsidasa de A. aculeatus en sepabeads ec-ep. cOndiciOnes de inmOvilización: 30 mG de prOteína pOr cada GramO de sOpOrte, 24 h de incubación a temperatura ambiente en aGitadOr de rOdillOs tampón de inmovilización actividad proteína inmovilizada soporte concentración inmovilizada (mg/g (u/g biocatalizador)b sepabeads biocatalizador)a ph (m) 0,3 10,3 0,74 Carbonato sódico (pH 9,0) 0,5 8,3 1,2 EC-EP3 0,3 2,9 4,2 fosfato potásico (pH 5,5) 0,5 1,0 0,67 0,3 17,5 15,2 Carbonato sódico 0,5 10,5 0,69 (pH 9,0) EC-EP5 1,0 10,3 0,79 0,3 6,4 3,2 fosfato potásico (pH 5,5) 1,0 3,6 2,9 a b

Determinada mediante análisis, por el método Bradford, de las soluciones de inmovilización. Determinada mediante el método del DNS. Una unidad de actividad corresponde a la liberación de un μmol de azúcares reductores por minuto.

Los resultados de los ensayos de inmovilización en Sepabeads EC empleando distintos tampones mostraron que, en general, las inmovilizaciones realizadas a pH

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

181

9,0 conseguían retener más cantidad de proteína en el soporte que a pH 5,5 (Tabla 6.7). Esta mayor carga enzimática obtenida a pH 9,0 no se veía reflejada en un aumento de la actividad por gramo de biocatalizador. Esto podría deberse a que, aunque a pH 9,0 la reactividad de los grupos amino es mayor que la de los carboxilos a pH 5,5 (por lo que sería razonable que se inmovilizase más cantidad de proteína a través de enlaces amino/epóxido que carboxilo/epóxido). Sin embargo, a pH 9,0 la enzima deja de ser estable y su actividad es muy inferior que a pH 5,5 (según los resultados que se obtuvieron de estabilidad frente al pH), por lo que es de esperar que aunque a pH 9,0 haya más cantidad de proteína inmovilizada, esta se encuentre en una conformación poco activa. En cuanto a la concentración del tampón, se ha descrito que una mayor fuerza iónica contribuye a una mejora en la inmovilización en soportes epoxi-activados (Mateo y cols., 2002; Wheatley y Schmidt, 1999). Sin embargo, en los resultados obtenidos variando la concentración del tampón y a igualdad del resto de condiciones, se observó el efecto contrario (menos proteína inmovilizada a mayor concentración de tampón). Para explicar este sorprendente resultado sería necesario estudiar en detalle el comportamiento de esta enzima a diferentes valores de fuerza iónica. De los dos tipos de soportes Sepabeads empleados, fue el EC-EP5 el que dio mejor resultado: era capaz de retener mayor cantidad de proteína, a igualdad de condiciones de inmovilización, que el EC-EP3. Sin embargo EC-EP3 tenía casi 5 veces más grupos epóxido por gramo de soporte que EC-EP5. Si todos esos grupos epóxido estuvieran accesibles a la proteína, sería de esperar que EC-EP3 consiguiese inmovilizar mayor cantidad de proteína por gramo de soporte, como se representa en los modelos A y B de la fig. 6.7. Para entender si la proteína tenía acceso a la mayor parte de los poros de EC-EP3 (de diámetro medio 130 nm), se estimó un tamaño aproximado de la β-fructofuranosidasa de A. aculeatus de 9.8 nm, por lo que la proteína dimérica podría tener como un diámetro máximo entre 20 y 25 nm, aproximadamente, notablemente inferior a los 130 nm de diámetro medio de poro del EC-EP3. Según cálculos realizados en colaboración con el Dr. Alberto del Monte de la Universidad de la Habana (Cuba), en los que se tenían en cuenta las especificaciones del soporte EC-EP3 y el tamaño estimado de la proteína, se determinó que el rendimiento máximo teórico de inmovilización era de 61 mg de proteína por gramo de soporte, 6 veces más que los 10 mg/g conseguidos experimentalmente con dicho soporte. una posible explicación de los resultados obtenidos con EC-EP3 y EC-EP5 sería que, en lugar de inmovilización covalente mediada por los grupos epóxido, se estuviese dando mayoritariamente una inmovilización por adsorción en multicapa dentro de los poros de las partículas. La adsorción en monocapa no explicaría nuestros resultados ya que los valores de proteína inmovilizada por gramo de biocatalizador deberían de ser mayores en EC-EP3 que en EC-EP5 debido a la mayor superficie específica del primero. La inmovilización por adsorción en multicapa, según los modelos C y D de la fig 6.7, sí podrían explicar los resultados: EC-EP5 (con volumen de poro de 1.67 cm3/g) consigue inmovilizar más proteína que EC-EP3 (con volumen total de poros de 1.19 cm3/g). También explicaría los resultados obtenidos en los ensayos en los

182

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

figura 6.7. Modelo de inmovilización covalente mediante grupos epóxido (puntos en la superficie) en: (A) partículas EC-EP5 (diámetro medio de partícula 139 µm, y diámetro medio de poro de 800 nm), y en (B) partículas EC-EP3 (diámetro medio de partícula 77 µm, y diámetro medio de poro de 130 nm), y modelo de inmovilización por adsorción (C) en partículas EC-EP5 y (D) en partículas EC-EP3.

que se variaba la masa de proteína ofrecida por cada gramo de soporte. Así, se obtenían mayores cantidades de proteína inmovilizada cuanto mayor era la relación masa de proteína a masa de soporte. Sin embargo, al determinar la actividad por miligramo de proteína inmovilizada en EC-EP5 (Tabla 6.8), se obtenían valores cada vez menores al quedar ocultas las enzimas cubiertas por la siguiente monocapa. En el caso de EC-EP3 la actividad específica de la enzima inmovilizada no variaba tanto con la carga proteína/soporte, posiblemente por tratarse de poros menos voluminosos en los que la proporción de moléculas de enzima no accesibles para el sustrato sería menor. tabla 6.8. actividad pOr miliGramO de prOteína inmOvilizada en lOs sOpOrtes ec-ep5 y ec-ep3 relación proteína/ soporte (mg/g) 60/1 100/1 200/1 a

actividad de la proteína inmovilizada (u/mg) a ec-ep5 ec-ep3 1,17 0,67 0,86 0,74 0,47 0,60

Determinada mediante el método del DNS. una unidad de actividad corresponde a la liberación de un μmol de azúcares reductores por minuto.

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

183

Adicionalmente, se ensayó la inmovilización directa (es decir, sin realizar un ajuste previo del pH) del preparado enzimático Pectinex ultra SP-L (cuyo pH es 4,8), también durante 24 h, a temperatura ambiente. Se probaron varias proporciones de solución enzimática/gramo de soporte, variando así la carga de proteína disponible. Los resultados obtenidos quedan reflejados en la Tabla 6.9, de los que se extrae que en todos los casos se consiguieron mejores actividades que en la inmovilización que se realizó ajustando previamente el pH. De todos los ensayos el mejor resultado se obtuvo cuando la proporción de carga proteica a inmovilizar por peso de soporte era la máxima ensayada (200 mg/g) con la que se consiguió un biocatalizador con 25,9 u/g. tabla 6.9. efectO de la carGa prOteica en la inmOvilización directa de pectinex ultra sp-l en sepabeads ec-ep. cOndiciOnes de inmOvilización: 24 h de incubación a temperatura ambiente en aGitadOr de rOdillOs soporte sepabeads EC-EP3

EC-EP5 a b

relación proteína: soporte (mg/g) 60/1 100/1 200/1 60/1 100/1 200/1

proteína inmovilizada (mg/g biocatalizador)a 21,1 22,7 31,4 17,3 27,1 54,7

actividad inmovilizada (u/g biocatalizador)b 14,1 16,9 18,8 20,3 23,4 25,9

Determinada mediante análisis, por el método Bradford, de las soluciones de inmovilización. Determinada de forma directa mediante el método del DNS. una unidad de actividad corresponde a la liberación de un μmol de azúcares reductores por minuto.

Se escaló la inmovilización del biocatalizador con EC-EP5 mediante el método directo (sin ajuste de pH de la disolución enzimática), obteniendo en esta ocasión un actividad de 21,5 u/g. Este biocatalizador se empleó en reacciones batch para evaluar su estabilidad operacional. Así, se realizaron varios ciclos de reacción, incubando en tubos Eppendorf una cantidad de biocatalizador con una disolución de sacarosa 600 g/l (preparada en tampón acetato sódico 0,2 M pH 5,6), a 50ºC y 600 rpm. Tras 24 h de reacción la mezcla se centrifugó y se separó el sobrenadante, cuya composición fue analizada por HPLC. El inmovilizado se lavó con tampón acetato y se reutilizó para el siguiente ciclo de reacción. Se evaluó la actividad de transfructosilación del inmovilizado (mediante análisis de HPLC) en cada uno de los ciclos (fig. 6.8). Se repitió el ensayo para una solución de melaza, ajustada a pH 5,6, con una concentración inicial de sacarosa de 590 g/l. Los resultados mostraron que el biocatalizador, tras 5 ciclos de reacción, perdía un 36% de su actividad inicial en el caso del ensayo con sacarosa pura y un 55% en el ensayo con melaza. Este hecho confirmaba que una parte de la enzima no estaba unida por enlace covalente sino que podía estar adsorbida en multicapas, por lo que se producía progresivamente su desorción o lixiviación.

184

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Actividad relativa de transfructosilación (%)

100

80

60

40

20

0

0

1

2

3

4

5

6

Ciclos de reacción Sustrato sacarosa

Sustrato melaza

figura 6.8. Estabilidad operacional del inmovilizado de Pectinex en Sepabeads EC-EP5 en sucesivos ciclos de 24 h en reacciones batch, tanto para reacciones con sacarosa como con melaza.

6.6. cOnclusiOnes Los fructanos tipo inulina tienen un gran potencial dada su amplia disponibilidad y sus propiedades prebióticas. Su obtención a partir de residuos agroalimentarios como las melazas o mediante hidrólisis controlada de polisacáridos abre excelentes perspectivas desde del punto de vista industrial. La oligofructosa se obtiene mediante hidrólisis controlada de inulina (obtenida fundamentalmente de achicoria y alcachofa de Jerusalén, sin descartar nuevas materias primas como el yacón o el agave) empleando inulinasas. Por otro lado, aunque las β-fructofuranosidasas tienen como función principal la hidrólisis de la sacarosa, a altas concentraciones de sustrato estas enzimas catalizan la producción de fructooligosacáridos por vía sintética. Resulta fundamental el desarrollo de bioprocesos integrados para la sobreproducción de las enzimas de mayor tasa transglicosilación/hidrólisis, su inmovilización efectiva y la producción de oligosacáridos estimuladores de la microbiota (prebióticos).

aGradecimientOs Agradecemos al resto de miembros del Grupo de Biocatálisis Aplicada del CSIC por su apoyo, en especial a los Drs. Antonio Ballesteros, Miguel Alcalde e Iraj Ghazi por su participación en distintas etapas de este proyecto. La aportación de los Drs.

Obtención enzimática de fructanos prebióticos tipo inulina

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Malcolm Yates (ICP-CSIC) y María Luisa Rojas (uNED) en la determinación de las propiedades texturales de los soportes es digna de mención. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España (Proyectos BIO200767708-C04-01 y BIO2010-20508-C04-01). Agradecemos el apoyo prestado por el programa CYTED dentro de la red ENZNuT. Queremos asimismo mencionar las becas concedidas por los programas JAE-CSIC y fPI a Julio Alberto Reyes y Bárbara Rodríguez, respectivamente. Agradecemos a Ramiro Martínez (Novozymes A/S) por el suministro de enzimas y sus interesantes sugerencias.

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7. valOración del suerO de quesería mediante biOcatálisis enzimática andrés illanes Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile

7.1. el suerO de quesería cOmO materia prima para su valOración El suero de quesería puede ser considerado como un co-producto de la elaboración de queso y caseína. El suero de quesería o suero de leche (en adelante, simplemente suero) es el líquido residual, de aspecto claro y amarillento, obtenido luego de que la caseína de la leche es precipitada mediante enzimas o ácidos minerales u orgánicos. Los ácidos minerales y orgánicos se emplean preferentemente para la obtención de caseína, mientras en la elaboración de queso es más frecuente el uso de enzimas coagulantes (Britz y Robinson, 2008). La renina o quimosina extraída del estómago de terneros lactantes, empleada tradicionalmente como coagulante, ha sido gradualmente desplazada por variantes de origen microbiano (Neelakantan y cols., 1999) y quimosinas recombinantes (Johnson y Lucey, 2006). Estas últimas, producidas en hongos filamentosos (Aspergillus oryzae) y levaduras (Kluyveromyces lactis) como hospederos, están disponibles comercialmente desde hace más de veinte años y actualmente son las más empleadas en la elaboración de queso (van Dyjk, 1999). El suero contiene toda la lactosa de la leche, una alta proporción de las sales minerales, una pequeña cantidad de caseína y la mayor parte de las demás proteínas, denominadas proteínas de suero. Representa alrededor del 90 % del volumen de la leche y retiene el 55 % de sus nutrientes. La composición típica de la leche y el suero bovinos se presenta en la Tabla 7.1. La lactosa (β-D-galactopiranosil-α-D-glucopiranosa) es un disacárido de escaso poder edulcorante y significativamente menos soluble que sus monosacáridos componentes, que se encuentra presente en la leche de los mamíferos terrestres en proporciones que oscilan entre el 2 y el 10 %; los mamíferos marinos tienen en su leche un contenido de lactosa muy inferior, usualmente por debajo del 1 % (Schaafsma, 2002). La leche humana tiene un contenido en torno al 7 %, mientras la leche bovina solo en torno a 4.8 % (Gänzle y cols., 2008). Representa el mayor aporte calórico de la leche y productos lácteos pero, debido a deficiencias de actividad lactásica a nivel intestinal, la lactosa es pobremente digerida por una parte significativa de la población mundial. Las intolerancia a la lactosa está étnicamente asociada, siendo de alta

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incidencia en etnias americanas, estimándose que el nivel de intolerancia está por sobre el 50 % en América del Sur (Vesa y cols., 2000) y que en Chile un 40 % de la población sufre algún grado de intolerancia (Lacassie y cols., 1978). La actividad lactásica intestinal tiende a desaparecer con la edad por lo que la incidencia de intolerancia a lactosa es muy elevada en senescentes. En la práctica dicho problema representa un escollo para la utilización del suero en la formulación de alimentos, lo que hace aconsejable su procesamiento, según se analizará en la sección 7.2. tabla 7.1. análisis prOximal de leche y suerO bOvinOs (smithers y cOls., 1996) componente Caseína Proteínas de suero Lactosa Grasa Cenizas Sólidos totales

leche (% b. húmeda) (% b. seca) 2,8 21,9 0,7 5,5 4,9 38,3 3,7 28,9 0,7 5,4 12,8 –

suero (% b. húmeda) (% b. seca) 0° la configuración se considera competente catalíticamente, pero la actividad total del derivado inmovilizado se penaliza un 1.11 % por cada ángulo que el centro activo se desvíe de su posición óptima. Esta penalización puede conducir o no a la pérdida total de actividad del derivado inmovilizado, en dependencia de la configuración de la enzima en el derivado inmovilizado. %CCP 5 cCp 3 %CC (1) n Supp. CC 5  %CCP (2) i5l Cuando se multiplica el DA por la penalización (1.11 %) se obtiene el porcentaje de derivado inmovilizado no competente catalíticamente. Por tanto, la diferencia entre el producto anterior y 100 es el porcentaje de derivado inmovilizado Competente Catalíticamente (%CC) en un clúster determinado. El %CC de cada clúster es transformado en el Porcentaje de derivado inmovilizado Competente Catalíticamente en la Población total (%CCP) como se muestra en la ecuación 1. finalmente, la Competencia Catalítica del Soporte (Supp. CC) se calcula sumando los %CCP de todas las configuraciones posibles (n) cuando la proteína es inmovilizada en un soporte determinado (ecuación 2).

10.3. resultadOs y discusión El programa RDID1.0 se empleó para calcular los parámetros: LIGRe, RI, cCP, SIR, aIP, cIP, eCP, tMQ y eMQ; para la inmovilización de las enzimas xilanasa de Humicola insolens, inulinasa de Aspergillus awamori e invertasa de Aspergillus niger en varios soportes: Glioxil-Sepharose, MANA-Sepharose, Sepabeads EC-EP3, Eupergit C, Eupergit C 250 L, Amberjet™ 1600 H y Amberlite™ IRA900 Cl. Se compararon todas las predicciones y se seleccionaron las condiciones de inmoviliza-

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

277

ción óptimas en cada uno de los soportes ensayados (carga de proteína y pH de inmovilización óptimos), además se seleccionó el mejor soporte para la inmovilización de cada enzima. En la Tabla 10.1 se muestran los datos de los soportes que emplea el programa RDID1.0 en las predicciones. tabla 10.1. características de lOs sOpOrtes cOnsideradas pOr el prOGrama rdid1.0 para llevar a cabO las predicciOnes soporte

sbeta

dpb

Gac

Glioxil-Sepharose CL 2Bd

11,43

1383

28,57

Glioxil-Sepharose CL 4Bd

23,57

1023

71,42

Glioxil-Sepharose CL 6Bd

35,71

507

100,0

MANA-Sepharose CL 2Bd

11,43

1383

28,57

MANA-Sepharose CL 4Bd

23,57

1023

71,42

MANA-Sepharose CL 6Bd

35,71

507

100,0

Sepabeads EC-EP3e

43,0

2147

106

Eupergit C

57,0

100

300

49,3

1800

600

200

100

–

200

100

–

f

Eupergit C 250 L

g

Amberlite™ IRA900 Cl Amberjet™ 1600

h

h

residuos reactivos de la proteínai NTermj y e-Lysk

CTerml, Asp y Glu

NTerm, e-Lys, Cys, y Tyr CTerm, Cys, Asp y Glu NTerm, e-Lys, Arg, y His

Área superficial del soporte (m /g), Diámetro de poro del soporte (Å), Grado de activación del soporte (µmol/g), d Datos tomados de Molina, 1993, e Datos tomados de Mateo y cols., 2002, f Datos tomados de Boller y cols., 2002, g Datos tomados de Gómez de Segura y cols., 2004, h Datos tomados de Zagorodni, 2006, i Datos tomados de Hermanson y cols., 1992, j Residuo amino terminal, k Epsilon amino de lisina, l Residuo carboxilo terminal. a

2

b

c

10.3.1. Predicción de la configuración más probable de la proteína en el derivado inmovilizado En las Tablas 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6 y 10.7 se muestran los resultados del programa RDID1.0 sobre las predicciones de la configuración más probable de los derivados inmovilizados de xilanasa, inulinasa e invertasa para cada uno de los soportes analizados. También se reportan los valores de competencia catalítica del soporte para cada derivado inmovilizado. Las predicciones se llevaron a cabo a varios valores de pH para los soportes activados con funciones aldehído (Glioxil-Sepharose CL 2B, Glioxil-Sepharose CL 4B y Glioxil-Sepharose CL 6B) y los soportes activados con grupos epóxido (Sepabeads EC-EP3, Eupergit C y Eupergit C 250 L). Estas variaciones de pH para realizar las predicciones se deben a la influencia del pH sobre la reactividad de las lisinas, tirosinas y cisteínas; estos grupos presentan marcadas diferencias en sus valores de pKa, lo que permite establecer un orden de reactividad.

278

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Sin embargo, la reactividad de los ácidos aspártico y glutámico es muy similar debido a la cercanía en sus valores de pKa, por lo que no tiene sentido ensayar varios pH, pues nunca se logrará un orden de reactividad bien diferenciado. Lo mismo ocurre con las probabilidades de interacción de las histidinas, lisinas y argininas cuando el soporte es una resina de intercambio catiónico; y con los ácidos aspártico y glutámico en una resina de intercambio aniónico. Por este motivo, en los soportes activados con grupos amino (monoaminoetil-N-aminoetil(MANA)-Sepharose CL 2B, MANA-Sepharose CL 4B, MANA-Sepharose CL 6B) las predicciones se llevaron a cabo a pH 5,0; y en el caso de las resinas de intercambio iónico se realizaron a pH 7,0. Las predicciones para los soportes activados con grupos MANA y los intercambiadores aniónicos coinciden debido a que los grupos interactivos de la proteína son los mismos (ácidos aspártico y glutámico), solo varía la reactividad de estos grupos a pH 5,0 y 7,0. La única diferencia de grupos interactivos son las cisteínas que deben ser tomadas en cuenta en las resinas de intercambio aniónico, pero ninguna de las tres enzimas presentan cisteínas en la superficie accesible al solvente, por esa razón los grupos interactivos coinciden para ambos soportes. Xilanasa de Humicola insolens (Tablas 10.2 y 10.3): Cuando la inmovilización se lleva a cabo en soportes activados con grupos aldehído se predicen dos configuraciones, pero solo una de ellas (clúster No. 1) es catalíticamente competente (fig. 10.1A). A pH 8,0 el clúster No. 2 es apenas reactivo (cCP = 0,2); en consecuencia, la inmovilización a este pH no compromete la obtención de un derivado inmovilizado (unipuntual) catalíticamente competente. En la inmovilización a este pH usualmente el único residuo reactivo es el NTerm (Hermanson y cols., 1992), ya que el pKa de los e-Lys está generalmente por encima de 10,0 y la probabilidad de que estén desprotonados a pH 8,0 es muy baja. Por otra parte, a pH 10,0 se ve favorecida la interacción multipuntual, y con ello la estabilización del derivado inmovilizado. Ahora bien, el CP del clúster 2 (catalíticamente incompetente) aumenta considerablemente a este pH de inmovilización, obteniéndose más de un 30 % de derivado inmovilizado catalíticamente incompetente. Por estas razones, consideramos que el pH óptimo de inmovilización para esta enzima en soportes activados con grupos aldehído es pH 9,0; ello es debido a que existe un equilibrio entre la posibilidad de obtener derivados inmovilizados altamente estabilizados (con multienlace enzima-soporte) y la obtención de una población de derivados inmovilizados con una alta competencia catalítica (90 %). Los soportes activados con grupos epóxido aparentemente no son una alternativa viable para la inmovilización de la enzima xilanasa de Humicola insolens. Esto se debe a que varias configuraciones son catalíticamente incompetentes, y una de ellas (clúster 2) es la configuración más probable. No obstante, si el único soporte disponible es un soporte epóxido el pH de inmovilización óptimo sería pH 10,0. Esto se debe a que a pH 10,0 se eleva el CP de los clústers que permiten obtener derivados inmovilizados catalíticamente competentes (clústers 1, 4 y 5). Si el pH de inmovilización decrece disminuirá también la competencia catalítica del soporte (Supp. CC). Las predicciones del programa RDID1.0 para los soportes activados con grupos MANA y los intercambiadores aniónicos indican que solo una de las cinco posibles configuraciones es catalíticamente incompetente (clúster 1). Consecuentemente, los soportes MANA y las resinas de intercambio aniónico son mejores so-

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

279

portes para inmovilizar la xilanasa que sus homólogos epóxido con valores de Supp. CC por encima del 40 %; pero aún se quedan por debajo que los soportes activados con funciones aldehído, los cuales se mantienen en la preferencia con un Supp. CC = 63,3 %. tabla 10.2. predicciOnes de la cOnfiGuración más prObable de la enzima xilanasa de Humicola insolens en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs ccp o ecp soportes Glioxil

MANA (pH 5,0)

Epóxido

Aniónico (pH 7,0)

Catiónico (pH 7,0)

no.

residuos por clúster

ph 8,0

ph 9,0

ph 10,0

1

NTerm- K177-K179

0,98

0,89

0,67

2

K140-K177

0,02

0,11

0,33

1

E43-D56-D164

0,29

2

E67-E219-D221

0,29

3

D151

0,10

4

D148

0,11

5

CTerm-E67

1

Y49-Y144-Y223

0,01

0,03

0,21 0,08

2

Y139-K140-Y158

0,04

0,15

0,20

3

Y131-Y139-Y158-Y214

0,37

0,41

0,31

4

Y100-Y128-Y144-K177-K179-Y223

0,02

0,09

0,21

5

NTerm-Y100-Y223

0,56

0,32

0,20

1

E43-D56-D164

0,30

2

E67-E219-D221

0,30

3

D151

0,10

4

D148

0,10

5

CTerm-E 67

0,20

1

NTerm-R36-H46

0,11

2

NTerm-R70-R74-R76

0,19

3

R74-K76-K177-K179

0,22

4

K140-K177-H197

0,13

5

R36-H46-R116-R167

0,19

6

R70-R93

0,11

7

R157

0,05

Las predicciones indican que las resinas de intercambio catiónico son los peores soportes para la inmovilización de la xilanasa de Humicola insolens con los valores de Supp. CC más bajos.

280

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Es importante tener en cuenta cuál es la naturaleza de los grupos de la proteína que forman parte del centro activo de la enzima y de los sitios de unión a sustrato. En el caso de esta enzima formando parte del centro activo hay dos ácidos glutámicos (E121 y E212), pero ninguno de ellos tiene accesibilidad al solvente, por lo que no comprometen la utilización de los soportes MANA y las resinas de intercambio aniónico. tabla 10.3. valOres de da, %cc y supp. cc de la enzima xilanasa de Humicola insolens en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs soporte Glioxil (pH 9,0)

MANA (pH 5,0)

Epóxido (pH 10,0)

Aniónico (pH 7,0)

Catiónico (pH 7,0)

no. clúster 1 2 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

da 26° 111° 141° 29° 80° 35° 6° 0° 120° 152° 10° 50° 141° 29° 80° 35° 6° 110° 10° 95° 52° 87° 21° 180°

%cc 71,1 0 0 67,8 11,2 61,2 93,3 100 0 0 91,1 44,5 0 67,8 11,2 61,2 93,3 0 91,1 0 42,3 3,4 76,7 0

%ccp 63,3 0 0 19,7 1,1 6,7 19,6 8 0 0 19,1 8,9 0 20,3 1,1 6,1 18,7 0 17,3 0 5,5 0,7 8,4 0

supp.cc 63,3 %

47,1 %

36,0 %

42,6 %

31,9 %

Inulinasa de Aspergillus awamori (Tablas 10.4 y 10.5): En el caso de la inmovilización en soportes activados con grupos aldehído son muy interesantes los resultados. Es imposible determinar a simple vista el pH óptimo de inmovilización debido a que ninguna configuración es catalíticamente incompetente. Debido a esto fue necesario calcular Supp. CC a cada pH de inmovilización y luego compararlos. A pH 8,0 el Supp. CC = 21,8 %, a pH 9,0 el Supp. CC = 28,9 % mientras a pH 10,0 el Supp.

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

281

CC = 34,0 %. Cuando se comparan estos valores obviamente el pH de inmovilización óptimo es pH 10,0; además, se favorece la estabilidad del derivado inmovilizado debido al aumento de las probabilidades de multienlace. No obstante, llama la atención el hecho de que los valores de Supp. CC estén por debajo del 40 % cuando no hay ninguna configuración catalíticamente competente. Esto se puede explicar fácilmente analizando los valores de DA: si bien es cierto que ninguna configuración está imposibilitada totalmente, los valores de DA son bastante elevados, solamente en el clúster No. 4 tiene un %CC elevado, lo que trae como consecuencia valores Supp. CC bajos. 1

2

3

4 63,3%

A 26°

B

44,2% 76°

54,0% C 0°

Figura 10.1. Configuraciones más probables de cada derivado inmovilizado en el soporte óptimo desde el punto de vista de competencia catalítica del soporte. (A) Xilanasa de Humicola insolens, (B) Inulinasa de Aspergillus awamori, (C) Invertasa de Aspergillus niger. (1) Clúster más probable, (2) Grupo funcional de soporte, (3) Configuración más probable de la proteína en el derivado inmovilizado, (4) Supp. CC. (…) Posición óptima del centro activo. (→) Entrada del centro activo.

282

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos tabla 10.4. predicciOnes de la cOnfiGuración más prObable de la enzima inulinasa de Aspergillus awamori en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs

soportes no. 1 2 Glioxil 3 4 5 1 2 3 4 MANA (pH 5,0) 5 6 7 8 1 2 Epóxido 3 4 5 1 2 3 4 Aniónico (pH 7,0) 5 6 7 8 1 2 3 Catiónico (pH 7,0) 4 5 6

residuos por clúster ph 8 K390-K415-K417-K443 0,02 K200-K212-K225-K247-K257 0,03 K118-K222-K225 0,01 K118-K247-K359-K381-K390-K479 0,03 NTerm-K531-K381-K36-K84-K118 0,91 E64-D96-E146-D147-E181-E183-E209-D459-E460 D455-D459-E460-D509-D23-E64 E229-E283-D285-D292-D294 D196-E197-D219-D223 E76-D159-D196-D219-D251-D325-D473-D524-D528 D23-E76-E82-D158-D159-CTerm E523-D524-D473-D440-E394-D294-D251 D440-D455-D459-E460-D509 K390-K415-K417-K443 0,01 Y180-Y184-K200-K212-K222-K225-Y233-K257 0,07 Y47-K118-K247-K359-K381-K390-K479-Y530-K531 0,05 K118-Y155-Y166-Y184-K222-K225 0,07 NTerm-K36-K84-K118-Y155-Y344-K381 0,80 E64-D96-E146-D147-E181-E183-E209-D459-E460 D455-D459-E460-D509-D23-E64 E229-E283-D285-D292-D294 D196-E197-D219-D223 E76-D159-D196-D219-D251-D325-D473-D524-D528 D23-E76-E82-D158-D159-CTerm E523-D524-D473-D440-E394-D294-D251 D440-D455-D459-E460-D509 K417-K443-H452-R514 NTerm-K36-H80-K84-K381-R382-R387-H512-K531 R526-K479-K390-R387-R382-K381-K247 K118-K200-K222-K225 K359-K381-R382-R387-K479-R526-K531 K200-K212-K225-K247-K257

ccp o ecp ph 9 ph 10 0,08 0,13 0,13 0,21 0,06 0,11 0,15 0,24 0,58 0,31 0,16 0,12 0,10 0,08 0,18 0,12 0,14 0,10 0,04 0,08 0,20 0,23 0,14 0,22 0,21 0,21 0,41 0,26 0,18 0,11 0,10 0,08 0,18 0,12 0,13 0,10 0,08 0,23 0,21 0,12 0,21 0,15

En el caso de los soportes activados con grupos epóxido se obtienen dos configuraciones catalíticamente incompetentes (clústers 2 y 4); sin embargo, la configuración más probable es catalíticamente competente (clúster 5). A pH 8,0 disminuye considerablemente la reactividad de los clústers 2 y 4, por lo que no se compromete la actividad catalítica del derivado inmovilizado; sin embargo, a este pH tan bajo solamente el residuo NTerm está reactivo lo que hace imposible obtener enlaces multipuntuales proteína-soporte, por lo que podría verse afectada la estabilidad del derivado inmovilizado. No obstante, a pH 9,0 y 10,0 se eleva el CP de los clústers que permiten obtener derivados inmovilizados catalíticamente competentes, y si

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

283

comparamos los valores de Supp. CC a ambos pH (18,5 % y 24,2 %, respectivamente) podemos concluir que el pH de inmovilización óptimo es pH 10,0. Además del aumento en la eficiencia catalítica del derivado inmovilizado, a este pH también se ven favorecidas las interacciones multipuntuales proteína-soporte, y con ello la estabilidad del derivado inmovilizado. A pesar de ello solo el 24,2 % de la población será catalíticamente competente, por lo que los soportes aldehído se prefieren para inmovilizar esta enzima a sus homólogos epóxido con un Supp. CC superior al 30 %. tabla 10.5. valOres de da, %cc y supp.cc de la enzima inulinasa de Aspergillus awamori en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs soporte Glioxil (pH 10,0)

MANA (pH 5,0)

Epóxido (pH 10,0)

Aniónico (pH 7,0)

Catiónico (pH 7,0)

no. clúster 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6

da 88° 75° 82° 4° 72° 180° 151° 69° 37° 8° 118° 71° 180° 82° 101° 3° 106° 81° 180° 151° 69° 37° 8° 118° 71° 180° 180 76 12 80 18 61

%cc 2,32 16,7 8,98 95,6 20,1 0 0 23,4 58,9 91,1 0 21,2 0 8,98 0 96,7 0 10,1 0 0 23,4 58,9 91,1 0 21,2 0 0 15,6 86,7 11,2 80,2 32,3

%ccp 0,30 3,52 0,99 22,9 6,22 0 0 2,21 4,89 16,7 0 3,04 0 0,74 0 20,8 0 2,65 0 0 2,29 4,62 16,1 0 2,91 0 0 3,53 18,0 1,32 16,6 4,78

supp.cc

34,0 %

26,9 %

24,2 %

25,9 %

44,2 %

284

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

Las predicciones del programa RDID1.0 para los soportes activados con grupos MANA y los intercambiadores aniónicos indican que la mitad de las ocho posibles configuraciones son catalíticamente incompetentes (clústers 1, 2, 6 y 8). Consecuentemente, los soportes MANA y las resinas de intercambio aniónico no son buenos candidatos para inmovilizar la inulinasa ya que poseen valores de Supp. CC muy bajos. Debido a que sus homólogos epóxido presentan valores de Supp. CC similares, los soportes aldehído se mantienen en la preferencia con un valor de Supp. CC de 34,0 %. Las predicciones indican que las resinas de intercambio catiónico son los mejores soportes para la inmovilización de la inulinasa de Aspergillus awamori con el valor de Supp. CC más elevado, 44,2 % (fig. 10.1B). No obstante, a la hora de seleccionar el mejor soporte hay que tener en cuenta el posterior uso del derivado inmovilizado, y a pesar de que la eficiencia catalítica de los soportes activados con grupos aldehído es menor que los intercambiadores catiónicos, la fortaleza de la interacción proteína-soporte es mayor en los soportes aldehído. El enlace covalente de los soportes glioxilos es más estable que la interacción iónica de los intercambiadores, con lo que se evita la desorción de la enzima elevándose considerablemente la estabilidad operacional del derivado inmovilizado. En el caso de la inulinasa, al igual que la xilanasa, hay varios residuos del centro activo y del sitio de unión a sustrato que corresponden a grupos reactivos de la proteína con varios tipos de soportes. Estos residuos son D189, E241 y Y313, pero ninguno de ellos tiene accesibilidad al solvente, por lo que no comprometen la utilización de los soportes epóxido, MANA y las resinas de intercambio aniónico. Invertasa de Aspergillus niger (Tablas 10.6 y 10.7): La inmovilización covalente de esta enzima sobre soportes activados con funciones aldehído y epóxido no es en absoluto recomendable. Esto se debe a la abundancia de lisinas y tirosinas en las cercanías del centro activo, lo que trae como consecuencia el bajo porcentaje de retención de la actividad funcional de estos derivados inmovilizados. No obstante, las condiciones óptimas para la inmovilización de esta enzimas en este tipo de soportes sería pH 10,0 y pH 8,0 para los soportes activados con grupos aldehído y epóxido, respectivamente. En estas condiciones se pueden obtener los mejores valores de Supp. CC, aunque son muy bajos. Las predicciones en los soportes activados con grupos MANA y los intercambiadores aniónicos son la alternativa más favorable para la inmovilización de esta enzima, a pesar de existir tres configuraciones catalíticamente incompetentes (Fig. 10.1C). Para los intercambiadores aniónicos las predicciones son aún mejores que los soportes activados con grupos carboxilos, pero es necesario señalar la mayor estabilidad que le confiere a los derivados inmovilizados el enlace covalente de los soportes MANA comparados con la interacción electrostática de los intercambiadores. Por eso, a pesar de tener valores de eficiencia catalítica inferiores a los intercambiadores aniónicos, proponemos el soporte MANA como el óptimo para la inmovilización de esta enzima debido al equilibrio entre eficiencia catalítica y estabilidad de estos derivados inmovilizados. Por su lado, las resinas de intercambio catiónico son mejores soportes para la inmovilización de la invertasa de Aspergillus niger que los soportes activados con gru-

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

285

pos glioxilo y epóxido, pero sus valores de Supp. CC quedan por debajo de los soportes MANA y los intercambiadores aniónicos. Esta enzima es un ejemplo interesante, debido a la existencia en la superficie de la proteína de un residuo del centro activo (D113) que forma parte de uno de los clústers, el clúster No. 5; este hecho inhabilita totalmente la posible actividad catalítica del derivado que adquiera esta configuración. No obstante, el Supp. CC de los dos soportes que se ven afectados (MANA e intercambiador aniónico) son los más elevados cuando se comparan con el resto de los soportes analizados. tabla 10.6. predicciOnes de la cOnfiGuración más prObable de la enzima invertasa de Aspergillus niger en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs ccp o ecp soportes Glioxil

MANA (pH 5,0)

Epóxido

Aniónico (pH 7,0)

Catiónico (pH 7,0)

no.

ph 8

ph 9

ph 10

1

NTerm-K111

residuos por clúster

0,99

0,91

0,64

2

K394-K472-K504

0,01

0,09

0,36

1

E271-D179-E263-E267-E439-E443-E452D454-D201-E226-D185-E346-E444

0,29

2

E209-E214-D222-E389-E470-E484-E485D486-E581-E585

0,23

3

D163-E214-D222-E226-E389-E470

0,13

4

E55-D82-D163-D172-D113

0,14

5

E405-D408-E55-D113-D566

0,12

6

E444-E632-E634

0,09

1

NTerm-K384-K472-K504-Y619-Y647

0,95

0,75

0,52

2

K111-Y135-Y149-Y249-Y261

0,03

0,13

0,25

3

K111-Y149-Y404

0,02

0,12

0,23

1

E271-D179-E263-E267-E439-E443-E452D454-D201-E226-D185-E346-E444

0,21

2

E209-E214-D222-E389-E470-E484-E485D486-E581-E585

0,34

3

D163-E214-D222-E226-E389-E470

0,33

4

E55-D82-D163-D172-D113

0,03

5

E405-D408-E55-D113-D566

0,08

6

E444-E632-E634

0,01

1

R442-R459-R519

0,14

2

NTerm-H43-R46-R162-R166-R167-K384K472-K504

0,35

3

R487-K504-R519-R626

0,19

4

NTerm-H43-K111-R161-R166-R167

0,21

5

K111-R151-H180

0,10

286

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

10.3.2. Optimización de la carga de proteína a inmovilizar Para determinar la cantidad inicial óptima de proteína a inmovilizar se calcularon para cada soporte los parámetros tMQ y eMQ. En la Tabla 10.8 se muestran los resultados de las predicciones de las enzimas en cada soporte. Para estos cálculos es necesario conocer el área superficial y el diámetro de poro de cada material. tabla 10.7. valOres de da, %cc y supp. cc de la enzima invertasa de aspergillus niger en cada unO de lOs sOpOrtes ensayadOs soporte Glioxil (pH 10,0)

MANA (pH 5,0)

Epóxido (pH 8,0)

Aniónico (pH 7,0)

Catiónico (pH 7,0)

no. clúster 1 2 1 2 3 4 5 6 1 2 3 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5

da 165° 68° 110° 0° 37° 105° 180° 85° 81° 170° 180° 110° 0° 37° 105° 180° 85° 11° 75° 60° 125° 170°

%cc 0 24,5 0 100 58,9 0 0 5,65 10,1 0 0 0 100 58,9 0 0 5,65 87,8 16,7 33,4 0 0

%ccp 0 8,74 0 23,2 7,5 0 0 0,44 9,59 0 0 0 34,0 19,9 0 0 0,01 12,6 5,93 6,41 0 0

supp. cc 8,74%

31,13 %

9,59 %

54 %

25,0 %

En la Tabla 10.8 podemos observar que los intercambiadores iónicos (Amberlite™ IRA900 Cl y Amberjet™ 1600) presentan los mayores valores de tMQ. Esto se debe a que cuando se calcula la tMQ solo se tiene en cuenta el área superficial de soporte, y estos soportes presentan la mayor de ellas. Sin embargo, cuando se introduce el factor de corrección OEC, el valor de cantidad de proteína a inmovilizar disminuye bruscamente debido a que el diámetro de poro de estos soportes es muy pequeño y, por consiguiente, las restricciones difusionales serán considerables para al inmovilizar cada una de las enzimas en estos materiales.

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

287

Cuando se analizan los resultados en los soportes base agarosa (Sepharose CL 2B, Sepharose CL 4B y Sepharose CL 6B) para las tres enzimas los mejores resultados se obtienen con el soporte Sepharose CL 4B. En estos soportes, como consecuencia del aumento del área superficial disminuye el diámetro de poro. Sepharose CL 2B presenta el mayor diámetro de poro, gracias a esto es el menos restringido difusionalmente de los tres con los valores de OEC más elevados; sin embargo, su capacidad está limitada debido a su baja área superficial. El soporte Sepharose CL 6B presenta la mayor área superficial y, consecuentemente, tiene el mayor valor de tMQ; pero su diámetro de poro es muy pequeño y la cantidad de proteína a inmovilizar disminuye considerablemente por esta causa. En cambio, el material Sepharose CL 4B presenta una equilibrio entre área superficial y diámetro de poro; esto explica por qué los valores de eMQ son mayores que sus homólogos. tabla 10.8. predicciOnes del prOGrama rdid1.0 para la Optimización de lOs estudiOs de carGa de cada prOteína en cada sOpOrte analizadO enzima

mmq (µmol/g)a

tmq (mg/g)b

Oec

emq (mg/g)b

Sepharose CL 2B

1,29

32,8

1,0

32,8

Sepharose CL 4B

2,67

67,7

0,67

45,3

Sepharose CL 6B

4,05

102,6

0,19

19,0 123,6

soporte

Xilanasa Sepabeads EC-EP3

4,88

123,6

1,0

Eupergit C

6,46

163,8

0,07

Eupergit C 250 L

5,59

141,7

1,0

141,7

Intercambiadores Iónicos

27,2

689,9

0,07

46,6

Sepharose CL 2B

0,44

29,1

0,39

11,3

Sepharose CL 4B

0,90

60,0

0,23

13,8

Sepharose CL 6B

1,37

90,9

0,11

Inulinasa Sepabeads EC-EP3

11,06

9,95

1,65

109,4

0,34

Eupergit C

2,18

145,1

0,06

Eupergit C 250 L

1,89

125,5

0,71

89,1

Intercambiadores Iónicos

9,21

610,8

0,06

37,2

Sepharose CL 2B

0,27

21,2

0,26

5,46

Sepharose CL 4B

0,56

43,8

0,17

7,45

Sepharose CL 6B

0,86

66,4

0,09

1,04

80,0

0,23

Eupergit C

1,37

106,0

0,06

Eupergit C 250 L

1,18

91,7

0,41

37,9

Intercambiadores Iónicos

5,78

446,3

0,06

26,3

Invertasa Sepabeads EC-EP3

37,7 8,82

6,24 18,7 6,25

Cantidad maxima de proteína expresada en µmol de proteína por gramo de soporte. Valor teórico (tMQ) y estimado (eMQ) de la máxima cantidad de proteína inmovilizada, expresada en mg de proteína por gramo de soporte.

a

b

288

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

un análisis similar puede llevarse a cabo con los soportes activados con grupos epóxido (Sepabeads EC-EP3, Eupergit C y Eupergit C 250 L). Los tres soportes presentan una elevada área superficial comparados con los soportes base agarosa, pero a su vez menores que los intercambiadores. En Tabla 10.8 se puede observar como decae cantidad de proteína a inmovilizar en Eupergit C una vez introducido el factor de corrección OEC; ello es debido a que, a pesar de tener la mayor área superficial de los tres, es el de menor diámetro de poro. Por otro lado, el soporte Eupergit C 250 L presenta una mayor tMQ que su homólogo epóxido Sepabeads EC-EP3, y a pesar de que el diámetro de poro del segundo es mayor que el del primero, la relación no se invierte al calcular la eMQ. Podemos concluir que, en términos de cantidad de proteína a inmovilizar, el mejor soporte para las tres enzimas es Eupergit C 250 L, debido a que presenta la mejor proporción área superficial:diámetro de poro.

10.3.3. ¿cómo seleccionar las condiciones óptimas de inmovilización? En el epígrafe anterior concluimos que el soporte ideal en términos de carga de ligando para las tres enzimas era Eupergit C 250 L. Pero esta conclusión se contradice con los soportes óptimos para cada enzima seleccionados en el epígrafe 10.3.1 en base a la funcionalidad de los derivados inmovilizados. ¿Cómo seleccionar entonces el mejor soporte para la inmovilización de cada enzima? Para responder a esta interrogante se calcularon los valores de actividad específica de la enzima soluble (Spec. EA, expresada en u/mg de proteína) de cada una de las enzimas en estudio, y conociendo la eMQ podemos estimar la actividad teórica máxima (tMA, expresada en u/g de soporte, ecuación 3) de cada derivado inmovilizado. Además, con los valores de Supp.CC se pudo predecir la actividad residual teórica (tRA, expresada en u/g de soporte, ecuación 4). tMA 5 AE 3 eMQ tRA 5

tMA 3 Supp. CC

(3)

(4) 100 Se compararon las predicciones de los parámetros tMA y tRA de aquellos derivados inmovilizados de cada enzima entre los cuales era difícil determinar el óptimo. En los tres casos se tomó en cuenta el soporte Eupergit C 250 L como el mejor en cuanto a cantidad de proteína a inmovilizar. En el caso de los mejores soportes desde el punto de vista funcional para la comparación se tomaron, en el caso de la xilanasa, Glioxil-Sepharose CL 4B; para la inulinasa, Glioxil-Sepharose CL 4B y Amberjet™ 1600, y en la invertasa se analizaron MANA-Sepharose CL 4B y Amberlite™ IRA900 Cl. En el caso de las dos últimas enzimas se tomaron dos soportes debido a las ventajas que confiere la inmovilización covalente en los soportes aldehído y carboxilo en cuanto a estabilidad comparados con la interacción iónica que tiene lugar en los intercambiadores iónicos. En la Tabla 10.9 se muestran los valores de actividad específica obtenidos y las predicciones de tMA y tRA para cada caso.

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

289

Xilanasa de Humicola insolens: Al observar los valores de tRA mostrados en la Tabla 10.9 podemos concluir que el mejor soporte para la inmovilización de la enzima xilanasa de Humicola insolens es Eupergit C 250 L con la mayor tRA a pesar de de poseer un Supp.CC inferior al derivado inmovilizado en GlioxilSepharose CL 4B. Este resultado se explica debido a que el soporte epóxido excede en área superficial y diámetro de poro a su homólogo aldehído, lo que compensa el bajo porcentaje de retención de actividad funcional de este derivado inmovilizado y hace que el derivado xilanasa-Eupergit C 250 L sea no el más eficiente pero sí el más funcional. Inulinasa de Aspergillus awamori: En la Tabla 10.9 se demuestra que el derivado inmovilizado inulinasa-Eupergit C 250 L, a pesar de poseer el más bajo Supp. CC, es el de mayor tRA. Esto se debe a la compensación del bajo porcentaje de retención de la actividad funcional con la elevada cantidad de proteína inmovilizada. Invertasa de Aspergillus niger: Al observar los resultados de las predicciones de tRA mostrados en la Tabla 9 podemos afirmar que el mejor soporte para inmovilizar esta enzima es Amberlite™ IRA900 Cl. tabla 10.9. actividades teóricas máximas de lOs derivadOs inmOvilizadOs de xilanasa, inulinasa e invertasa en lOs mejOres sOpOrtes en cuantO a cantidad de prOteína a inmOvilizar y retención de la actividad funciOnal enzima

soporte Glioxil-Sepharose CL 4B Xilanasa Eupergit C 250 L Glioxil-Sepharose CL 4B Inulinasa Eupergit C 250 L AMBERJET™ 1600 MANA-Sepharose CL 4B Invertasa Eupergit C 250 L AMBERLITE™ IRA900 Cl a

act. esp. (u/mg) 22,15 75a

51,67b

emq 45,34 141,7 13,85 89,1 37,2 7,45 37,9 26,3

tma 1004 2738 1039 6682 2787 385 1961 1362

tra 636 987 353 1619 1231 120 188 735

Tomado de Arand y cols., 2002, b Tomado de Nguyen, 2003.

No obstante, a la hora de seleccionar el mejor soporte hay que tener en cuenta el posterior uso del derivado inmovilizado. El enlace covalente es más estable en el tiempo y bajo condiciones extremas de temperatura y pH que la interacción iónica, evitándose la desorción de la enzima y elevándose considerablemente la estabilidad del derivado inmovilizado. Es importante tener en cuenta que las predicciones realizadas con el programa RDID1.0 dependen de la geometría del archivo de la estructura 3D de cada proteína (obtenidos experimentalmente o por modelación por homología). Estos archivos son obtenidos en condiciones especiales que no necesariamente coinciden con el ambiente natural de estas moléculas. Por este motivo, si la configuración de la proteína

290

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

soluble difiere considerablemente de la que adquiere en el archivo de coordenadas, no se ajustará a la realidad por lo que la predicción será errónea. No siempre es posible obtener resultados satisfactorios en la búsqueda de un derivado inmovilizado óptimo y funcionalmente competente mediante variaciones del pH de inmovilización. Existen casos en los que, aún con la aplicación de los algoritmos matemáticos de la estrategia DRDI, no es posible obtener de manera mayoritaria configuraciones funcionalmente competentes. En estos casos se puede recurrir a las tecnologías del DNA recombinante, específicamente la mutagénesis sitio-dirigida como una vía para solucionar el problema. Esta técnica posibilita sustituir residuos aminoacídicos o incluir otros nuevos en la secuencia de la proteína, con el objetivo de lograr una mayor concentración de residuos interactivos de la proteína en el lado opuesto al sitio activo. Es muy importante tener en cuenta, que los cambios generados no deben provocar alteraciones de la conformación de la proteína que afecten su actividad funcional. La interacción entre los algoritmos DRDI y la técnica de mutagénesis sitio-dirigida puede desarrollarse en dos sentidos. 1) Empleo de los algoritmos DRDI para validar in silico la efectividad de las variaciones generadas en la superficie de la proteína, mediante la técnica de mutagénesis sitio-dirigida para un proceso de inmovilización orientada y 2) Realizar un análisis in silico, antes de aplicar la técnica de mutagénesis sitio-dirigida. En el primer caso, se realizan predicciones con el archivo de estructura tridimensional de la proteína modificada por mutagénesis dirigida. Una vez obtenido el análisis de clústeres y calculada la probabilidad de configuración de los nuevos clústeres, se puede predecir si los nuevos residuos modificados producen el efecto deseado en el proceso de inmovilización orientada. En el segundo caso, con el empleo de programas como el Swiss-PDB Viewer y PROPKA pueden generarse mutaciones en el archivo de estructura tridimensional de la proteína nativa y obtener una nueva estructura, que corresponda a la proteína modificada in silico. Con este nuevo archivo de estructura tridimensional se realizan las predicciones, mediante el programa RDID1.0 y se analiza si los cambios realizados generan el efecto deseado. La aplicación del programa RDID1.0 puede constituir una herramienta muy útil para los investigadores, cuando se disponen de varias variantes para realizar la mutagénesis o se desean modificar en la proteína varios sitios a la vez. Esta aplicación puede suministrar elementos que permitan excluir las vías menos prometedoras para obtener inmovilizaciones orientadas, con altos porcentajes de retención de actividad funcional.

aGradecimientOs Expresamos nuestro agradecimiento a INfORMATICA ddmm, Bergamo, Italia, al Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, España, a la universidad de La Habana y a la Red ENZNUT (108RT0346) del CYTED, por el financiamiento de proyectos que han soportado parte de esta investigación. Agradecemos también al señor Ramiro Martínez de Novozymes A/S, Madrid, España por suministar las muestras de xilanasas y las sugerencias para su empleo.

Optimización y racionalización in silico de la síntesis de biocatalizadores…

291

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

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11. hiperactivación de biOcatalizadOres de lipasas José m. Palomo José m. Guisán Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (CSIC), España

11.1. intrOducción La mejora de la actividad catalítica de las enzimas es importante para su desarrollo en distintas aplicaciones industriales, en particular, en aquellos procesos donde la enzima sea muy selectiva, pero presente una baja actividad hacia los sustratos (fukuda y cols., 2008; Patel, 2006) un ejemplo que representa este problema son las lipasas. Estas son acil-glicerol hidrolasas (EC.3.1.1) con elevada actividad catalítica en la interface entre agua y aceite, pero con muy baja actividad hacia aceites solubles o sustratos no naturales (Verger, 1997). Este peculiar comportamiento de estas enzimas se basa en un complejo mecanismo catalítico. En medios acuosos homogéneos, las lipasas existen generalmente, en un cierto equilibrio entre una conformación cerrada (inactiva y mayoritaria en estas condiciones), donde el sitio activo se encuentra aislado del medio de reacción a través de una cadena polipeptídica denominada «lid»; y una conformación abierta (activa), donde el lid es desplazado y el sitio activo se encuentra totalmente expuesto permitiendo la difusión del sustrato (Brzozowski y cols., 1991) (figura 11.1). De este modo, el desarrollo de estrategias que permitiesen desplazar este equilibrio hacia la forma abierta y activa de la enzima podría traducirse en un incremento en la actividad catalítica de la lipasa. La inmovilización de lipasas sobre soportes hidrofóbicos (ej., octil-Sepharose, octadecil-Sepabeads, etc.) (Bastida y cols., 1998; Palomo y cols., 2002) mediante adsorción interfacial a baja fuerza iónica permite fijar la conformación abierta de esta enzima en fase sólida (figura 11.1), representando un método simple y elegante para obtener catalizadores de lipasas altamente activos. La naturaleza hidrofóbica del soporte influye en la hiperactivación final alcanzada por la enzima (fernández-Lorente y cols., 2008. Esto dependerá en parte de la naturaleza hidrófoba del «lid» (ej. número de aminoácidos hidrófobos) así como del área que rodea el sitio activo de la lipasa. La presencia de aditivos, en particular aquellos con cierto grado de hidrofobicidad, constituye un método interesante para incrementar la actividad catalítica de enzimas (Mogesen y cols., 2005). De hecho, en el caso de las lipasas, los detergen-

294

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

tes habitualmente pueden prevenir la interacción negativa entre el agua y los bolsillos hidrófobos o la cara hidrófoba del «lid», además de desplazar el equilibrio conformacional hacia la forma abierta (Figura11.2). Por ejemplo, la liofilización o la preparación de CLEAs (agregados de enzimas entrecruzadas) de lipasas en presencia de detergentes han sido estrategias óptimas para obtener lipasas altamente activas (Lopez-Serrano y cols., 2002). Además, el simple entrecruzamiento de lipasas previamente soportadass en fase sólida con un agente bifuncional (ej. glutaraldehído) mejoró la activa de la enzima comparada con la no modificada (Palomo y cols., 2007).

Sitio catalítico «lid» cerrado

Medio acuoso homogéneo

Conformación cerrada (inactivo)

Soportes Hidrófobos

«lid» abierto Conformación abierta (activa)

Lipasa inmovilizada

Área hidrófoba Área hidrófila

figura 11.1. Inmovilización de lipasas sobre soportes hidrófobos.

En el caso de lipasas solubles, la adición de detergentes tiene dos efectos, ruptura de agregados bi-moleculares lipasa-lipasa (Palomo y cols., 2003) y estabilización de la conformación abierta de moléculas individuales (figura11.2). En este sentido, el uso de lipasas inmovilizadas en condiciones de disociación (ej. en presencia de detergentes) puede permitir tener moléculas de enzima inmovilizadas totalmente dispersas, pudiéndose estudiar el efecto de la interacción entre la molécula de lipasa y el detergente. utilizando enzimas inmovilizadas en soportes macroporosos, micelas de detergente de pequeño tamaño (ej., 18 kDa para el dodecilsulfato sódico (SDS)) podrían entrar a través de los poros e interaccionar con la enzima inmovilizada en el interior del soporte. La modificación química de las cadenas laterales de los aminoácidos se ha usado ampliamente para introducir una gran variedad de grupos químicos en proteínas y mejorar sus propiedades (Hackenberger y cols., 2008). La gran mayoría de estrategias de modificación química de proteínas utilizan ciertos grupos en la cadena lateral de los aminoácidos (como grupos β-carboxilo del ácido aspártico y γ-carboxilo del ácido glutámico o ε-amino en lisinas) (Hackenberger y cols., 2008). Sin embargo, esta aproximación es a menudo un método de modificación inespecífica ya que las proteínas contienen varios de estos grupos a través de toda su estructura. De este modo, la modificación química dirigida constituiría un méto-

Hiperactivación de biocatalizadores de lipasas

295

do más adecuado. La cisteína sería, siempre y cuando no esté formando puentes disulfuro, un grupo conveniente para esta modificación selectiva, basado en la reacción de intercambio tiol-disulfuro entre su grupo sulfidrilo en la cadena residual y otro en la molécula a incorporar. Esta es una interacción no covalente pero especifica hacia compuestos tiolados. Este aminoácido puede estar presente de manera natural en las proteínas o puede ser incorporado genéticamente en su estructura sin detrimento en la actividad de la enzima. De este modo, lipasas con una cisteína libre, previamente inmovilizadas covalentemente, pueden ser modificadas específicamente a través de una conjugación intercambio tiol-disulfuro con moléculas diseñadas a medidas (ej. polímeros, péptidos tiol activados) (figura 11.3) (Godoy y cols., 2010). Sitio catalítico «lid» cerrado

Detergente

Actividad Moderada

Conformación cerrada (inactivo)

«lid» abierto Actividad Mejorada

Conformación abierta (activa)

Área hidrófoba Área hidrófila

figura 11.2. Lipasas en presencia de detergentes.

N SH

Polímero PDP- activado

S S

S S HS

N

0.5 M tampón fosfato pH 8.0,2 h

Lipasa Inmovilizada NH3+

Polímero-PDP:

H3N

+

NH3+ H N O NH3+

Dext 1500-NH2, Dext 6000-NH2

S

N S

H N

ε343 5 8080 M–1cm–1

Lipasa específicamente modificada

NH3+

S

–

OOC

O

O

SS

N

O

PEG1500-COOH, PEG35000-COOH

Figura 11.3. Modificación química dirigida de lipasas inmovilizadas.

296

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

11.2. hiperactivación de lipasas a través de su inmOvilización sObre sOpOrtes hidrOfóbicOs Diferentes lipasas de distintas fuentes: Las lipasas de Candida antárctica (fracciones A y B) (CAL-A, CAL-B), Thermomyces lanuginose (TLL), Rhizomucor miehei (RML), Lecitase ultra (LECI), Mucor Javanicus (MJL), Rhizopus niveus (RNL), Pseudomonas fluorescens (PfL), Geobacillus thermocatenulatus (BTL2), Candida rugosa, Thermus thermophilus o Alcaligenes sp. (QL) se inmovilizaron sobre distintos soportes (Sepharose o Sepabeads) con grado de hidrofobicidad diferentes (modificados con grupos butil, hexil, octil, octadecil) a baja fuerza iónica (5-25 mM). tabla 11.1. hiperactivación de diferentes lipasas mediante inmOvilización sObre diferentes sOpOrtes hidrófObOs lipasa BTL2

CAL-B TLL CRL RML ANL

soporte

Grupo funcional

actividada (%)

Sepharose

octyl

300

Sepharose

butyl

200

Sepabeads

octadecyl

120

Sepharose

octyl

200

Sepabeads

octadecyl

110

Sepharose

octyl

2000

Sepharose

octyl

250

Sepabeads

octadecyl

110

Sepharose

octyl

750

Sepabeads

octadecyl

500

Sepharose

octyl

180

Sepabeads

octadecyl

150

Sepharose

octyl

130

Sepabeads

octadecyl

130

LECI

Sepharose

octyl

220

TTL

Sepabeads

octadecyl

400

CAL-A

Sepharose

octyl

200

MJL

Sepharose

octyl

300

PfL

Sepharose

octyl

150

RNL

Sepharose

octyl

600

QL

a

100% se refiere a la actividad de la enzima soluble en la hidrólisis de p-nitrofenilfosfato (pNPP).

Esto provocó un aumento significativo de la actividad catalítica de estas enzimas inmovilizadas, comparada con su forma soluble hacia sustratos completamente solubles. En función de la enzima fue posible incrementar la actividad catalítica desde 2 hasta 20 veces en la reacción de hidrólisis de p-nitrofenilpropionato (pNPP) (Tabla 11.1).

Hiperactivación de biocatalizadores de lipasas

297

11.3. hiperactivación de lipasas sOlubles e inmOvilizadas a través de la adición de deterGentes La adición de una cierta concentración de detergente sobre una solución lipásica bien de enzima soluble o inmovilizada puede alterar incrementando enormemente la actividad catalítica de la misma. Detergentes neutros (Tritón X-100, Tritón X-45, laurato de sacarosa), catiónicos (CTAB), o aniónicos (SDS) presentan efectos diferentes en función de la lipasa a la cual se aplican. La Tabla 11.2 muestra la hiperactivación alcanzada sobre distintos biocatalizadores de lipasas a la concentración óptima de detergente (aquella donde se consigue el mayor valor de actividad del biocatalizador) que va desde (0,001%-1%, v/v) dependiendo de la enzima utilizada en la hidrólisis de pNPP a pH 7 y 25ºC. tabla 11.2. efectO de la adición de deterGentes en la actividad de lipasas biocatalizador

detergente Triton X-100

Glioxil-PfL

Triton X-45 CTAB SDS

concentracióna (w/v) (%) 0,1

actividadb (%) 372

1

330

0,01

817

0,1

117

Triton X-100

0,01

293

BrCN-PfL

CTAB

0,01

613

CTAB

0,01

800

LECI

CTAB

0,1

12000

LECI

Triton X-100

0,001

150

BrCN-TLL

SDS

0,001

700

BrCN-BTL2

Triton X-100

0,01

275

Glioxil-BTL2

Triton X-100

0,1

290

RML

Laurato de Sacarosa

0,5

2000

Triton X-100

0,1

239

Triton X-45

0,1

196

0,001

97

BrCN-CAL-B

SDS

La mayor concentración para conseguir el valor de actividad más alto. b 100% se refiere a la actividad de la enzima soluble en la hidrólisis de pNPP. a

11.4. hiperactivación de lipasas inmOvilizadas mediante mOdificación química diriGida cOn pOlímerOs diseñadOs a medida una lipasa termo-resistente de Geobacillus thermocatenulatus (BTL2) fue expresada en E. coli, purificada e inmovilizada por unión covalente unipuntual sobre un

298

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

soporte de agarosa activado con BrCN (BrCN-BTL2) (13). Esta enzima presenta en su estructura 3D nativa una cisteína (Cys64) con acceso a solvente que puede ser objeto de una modificación química dirigida. De este modo, distintos tipos de polímeros activados con un grupo sulfidrilo protegido con 2-PDS fueron preparados para un intercambio tiol-disulfuro selectivo en la modificación de la actividad catalítica de la enzima (figura 11.3). Dextranos aminados (Dext-NH2) y PEG monocarboxilados (PEG-COOH) de distintos tamaños fueron utilizados como polímeros. El biocatalizador BrCN-BTL2 se reduce con ditiotreitol (DTT) (para mantener la Cys64 en forma reducida), se lava bien y se adiciona el polímero 2-PDS activado a pH 8 en tampón fosfato sódico 0,5 M durante 2 h (13). La Tabla 11.3 muestra los resultados de hiperactivación de la enzima tras la modificación química dirigida en la reacción de hidrólisis de p-nitrofenilbutirato (pNPB) a pH 7 y 25 ºC. tabla 11.3. mejOra de la actividad catalítica de preparaciOnes brcn-btl2 mediante la mOdificación diriGida cOn pOlímerOs diseñadOs a medida Modificación – Dext1500-NH2 Dext6000-NH2 PEG1500-COOH PEG35000-COOH

actividad pnpb a 9,98 19,23 17,32 18,53 16,20

a La actividad específica fue definida como: μmol x min–1 x mglip–1.

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12. lipasas cOn aplicaciOnes nOvedOsas: ¿es pOsible prOducirlas pOr fermentación sólida empleandO raciOnalmente residuOs aGrOindustriales? eduardo mateos díaz Juan carlos mateos díaz JorGe a. rodríGuez González Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), México

12.1. intrOducción En la actualidad existe un creciente interés por el desarrollo de tecnologías más sustentables y amigables con el ambiente, el cual se ve reflejado en la búsqueda de nuevos biocatalizadores enzimáticos que sustituyan a los catalizadores químicos clásicos. Las lipasas (EC. 3.1.1.3) se encuentran sin lugar a dudas entre los biocatalizadores más empleados tanto en la industria como en la investigación y esto se debe principalmente a su versatilidad. Estas enzimas son capaces de aceptar un gran número de sustratos, incluso muchos de ellos sintéticos. No obstante, existen lipasas que son selectivas y presentan una regio y enantioselectividad marcada que las hace atractivas para la resolución de mezclas racémicas. Además, se ha demostrado que algunas lipasas pueden funcionar en solventes orgánicos y catalizar reacciones de esterificación, inter-esterificación, alcohólisis, acidólisis y aminólisis, entre otras (Schmid y Verger, 1998). Sin embargo, la producción de estas enzimas es aun un proceso costoso y su aplicación se ve limitada a la investigación a nivel laboratorio o a la síntesis de moléculas de alto valor agregado. una solución que se ha propuesto en los últimos años para solucionar este problema es la utilización de la fermentación en Medio Sólido (fMS) para su producción. Esta tecnología permite el empleo de residuos agroindustriales para el cultivo de microorganismos, abatiendo los costos de producción y posibilitando la incursión más generalizada de las lipasas a la industria. No obstante, aun hay grandes desafíos técnicos por superar, ya que por una parte no existen suficientes diseños de biorreactores para FMS a escala industrial y por otra parte, aun es necesario conocer y modelar el crecimiento de microorganismos sobre distintos sustratos sólidos para poder controlar y finalmente decidir la estrategia de producción más adecuada (Holker y cols., 2004). A pesar de todos estos obstáculos, en los últimos años se han publicado varios trabajos acerca de la produc-

302

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

ción y optimización de lipasas en FMS y en algunos casos incluso se han purificado y caracterizado. Sin embargo, en muchas ocasiones, la aplicación final del biocatalizador se deja de lado y la atención se enfoca generalmente en obtener una mayor actividad lipasa global empleando en ocasiones sustratos que no son adecuados, lo que ha llevado a que muchas de estas enzimas queden olvidadas. Es por este motivo que a continuación se hará una revisión de la producción de lipasas por fermentación en medio sólido utilizando residuos agroindustriales con un enfoque racional que permita hasta cierto punto analizar cómo influyen ciertos factores en la expresión de la actividad que se busca. Se comenzará con un panorama general acerca de las lipasas, sus aplicaciones y los distintos sistemas que existen para su producción. Posteriormente se abordarán aspectos generales que deben de considerarse para el empleo de la fermentación en medio sólido. finalmente se hará una revisión crítica en la que se analizarán algunos trabajos acerca de la utilización de residuos agroindustriales para la producción de lipasas con lo que se pretende ilustrar la importancia de disponer de métodos que nos permitan seleccionar y optimizar de manera más específica la actividad enzimática requerida para la aplicación final y no solo la actividad lipasa global.

12.2. lipasas Las lipasas (EC 3.1.1.3) son enzimas interfaciales cuya función natural es hidrolizar los enlaces éster presentes en los acil-gliceroles insolubles en agua liberando ácidos grasos y llegando en ocasiones a producir glicerol. Sin embargo, se ha observado que también son capaces de aceptar otros tipos de ésteres carboxílicos totalmente o parcialmente solubles en agua, como es el caso de ésteres sintéticos (p.ej. ésteres de p-nitrofenilo (pNP), ésteres de vinilo, ésteres de resorufina, entre otros). Además, en el caso de compuestos racémicos o con varios grupos hidroxilo, estas enzimas pueden llevar a cabo la reacción con una alta enantio- y regio-selectividad (Pandey y cols., 1999, Schmid y Verger, 1998). Por si fuera poco, al ser enzimas adaptadas a las condiciones desnaturalizantes de las interfases lipídicas, algunas de ellas muestran una mayor estabilidad en solventes orgánicos, posibilitando las reacciones de esterificación, trans-esterificación e incluso aminólisis y tiólisis (Schmid y Verger, 1998). Todas estas características han hecho que las lipasas encuentren diversas aplicaciones en la industria de los alimentos, cosmética, de los detergentes, síntesis química y farmacéutica (Mahapatra y cols., 2009, Ozyilmaz y Gezer, 2009, Tan y cols., 2010, Wang y cols., 2011, Belhaj-Ben Romdhane y cols., 2010, Andrade y cols., 2010). No obstante, como ya se mencionó con anterioridad, muchos de los trabajos que se han publicado sobre lipasas no siguen una estrategia clara que permita enfocar los esfuerzos durante el diseño del medio de cultivo y la producción para encontrar la actividad enzimática que contemple la aplicación final del biocatalizador. Por esto último es indispensable emplear y/o desarrollar métodos de búsqueda y selección enfocados a una aplicación dada, comenzando desde la selección del microorganismo, la concepción del medio de cultivo para la inducción de una actividad lipasa determinada, hasta el empleo del biocatalizador en la reacción de interés.

Lipasas con aplicaciones novedosas: ¿es posible producirlas por fermentación…

303

12.2.1. microorganismos productores de lipasas Las lipasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza ya que juegan un rol muy importante en la degradación de los lípidos. Se han aislado a partir de animales, plantas y microorganismos, sin embargo, las provenientes de estos últimos han adquirido una mayor importancia a nivel industrial, debido a su fácil producción y purificación, por lo que a la fecha existen varios trabajos en los que se ha logrado purificar y caracterizar lipasas provenientes de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Vale la pena mencionar que la selección del microorganismo adecuado es crucial para la obtención de una lipasa con aplicación potencial. Por ejemplo, en el caso de las lipasas bacterianas el género que más destaca es sin lugar a dudas Bacillus. Alkan y cols. (2007) produjeron una lipasa extracelular a partir de Bacillus coagulans por fMS empleando residuo de melón y adicionándolo con aceite de oliva. Los mejores resultados fueron obtenidos a las 24 h produciendo 78.069 u/gramo de materia seca (gms) adicionando 1 % de aceite de oliva. El género Pseudomonas también es fuente de lipasas interesantes. Mahanta y cols. (2008) produjeron una lipasa a partir de una cepa resistente a solventes de P. aeruginosa por fermentación sólida utilizando una torta de semilla de Jatropha curcas, obteniendo una actividad de 625 u/g a las 120 h de fermentación. Dentro de las levaduras, el género Candida es el productor de lipasas por excelencia. Basta con mencionar las lipasas de C. rugosa y de C. antarctica las cuales ya han sido ampliamente estudiadas, comercializadas y empleadas en un gran número de aplicaciones (Vorlova y cols., 2002, de Maria y cols., 2006, Benjamin y Pandey, 1998, Benjamin y Pandey, 2000, Habeych y cols., 2011, Le Joubioux y cols., 2011, SilRoy y Ghosh, 2011). Benjamin y Pandey (2000) produjeron lipasas a partir de C. rugosa mediante fMS sobre torta de aceite de coco y salvado de trigo. Después de la purificación se identificaron 3 lipasas: LipA, LipB y LipC. Dominguez y cols. (2003) produjeron lipasas extracelulares de Yarrowia lipolytica CECT 1240 utilizando nylon y diferentes residuos agro-industriales, obteniendo los mejores rendimientos de actividad global (23.000 u/L) con nuez triturada. Finalmente los hongos filamentosos representan la principal fuente de lipasas comerciales, las cuales han sido obtenidas principalmente a partir de géneros como: Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Geotrichum y Rhizomucor. Varias lipasas de A. niger han sido identificadas y algunas de ellas purificadas y caracterizadas (Adham y Ahmed, 2009, Sandana Mala y cols., 2007, Contesini y cols., 2009, falony y cols., 2006, Mahadik y cols., 2002). Kamini y cols. (1998) produjeron una lipasa extracelular con cierta resistencia a la presencia de detergentes a partir de A. niger empleando torta de aceite de sésamo, obteniendo 363 u/gms después de 72 h de fermentación. Sun y cols. (2009) produjeron una lipasa minoritaria, Lip2, a partir de Rhizopus chinensis cultivado en fMS con salvado y harina de trigo. Esta enzima mostró una potencial aplicación en la síntesis de ésteres. Por otro lado, Leal y cols. (2006) produjeron la lipasa de Penicillium restrictum por fMS utilizando torta de babasú obteniendo 21,8 u/gms en condiciones óptimas. Es evidente que las lipasas que han encontrado aplicaciones se han obtenido a través de la estrategia clásica que consiste en aislar, seleccionar, optimizar, purificar y caracterizar una actividad lipasa determinada en hidrólisis con sustratos típicos

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

(p.ej. triglicéridos, ésteres de p-nirofenilo, ésteres de vinilo). Cabe señalar que en muchas ocasiones este procedimiento no garantiza que la enzima pueda emplearse en una aplicación determinada (p.ej. resolución racémica, síntesis en medios no convencionales, entre otras). Es por esta razón que es muy importante enfocarse desde el inicio en la aplicación y utilizar métodos de búsqueda y selección adecuados implementando así una estrategia racional y dirigiendo la inducción de la actividad deseada, a través de una modificación del medio de cultivo.

12.2.2. aplicaciones de las lipasas A lo largo del texto se hace hincapié en la importancia de realizar la búsqueda de lipasas enfocada a una aplicación novedosa determinada. Pero ¿Qué potenciales aplicaciones han encontrado las lipasas hasta ahora? Como ya se ha mencionado, las lipasas son biocatalizadores muy versátiles que han logrado encontrar varias aplicaciones industriales principalmente en alimentos, farmacia y elaboración de detergentes. A continuación se citarán algunos ejemplos de sus diferentes aplicaciones industriales.

12.2.2.1. Lipasas en la industria alimenticia En la industria alimenticia las lipasas han sido empleadas para conferir sabores deseados a los quesos y otros alimentos. En quesos maduros, los triglicéridos contenidos en la leche se hidrolizan lentamente por acción de las lipasas secretadas por los microorganismos, lo que les confiere su sabor característico. Este proceso puede acelerarse y modularse mediante el empleo de lipasas exógenas producidas por distintos microorganismos (Heidt y cols., 1996). Las lipasas también han sido utilizadas para producir acil-gliceroles modificados que no pueden ser obtenidos por inter-esterificación química convencional (Novo Pat. AU-8432681, 1985). Estas enzimas también se han empleado para sintetizar ésteres de ácidos grasos con azúcares, los cuales sirven como edulcorantes y emulsificantes en alimentos (de Paula y cols., 2005, ferrer y cols., 2005). Por ejemplo las lipasas inmovilizadas de C. antarctica y M. miehei ya han sido utilizadas para la síntesis de ésteres de cadena corta con propiedades saborizantes (Gatfield, 1997, Larios y cols., 2004, Su y cols., 2010). Por otra parte, la lipasa de Mucor miehei fue empleada exitosamente para incrementar las propiedades funcionales de la clara de huevo, hidrolizando los triglicéridos residuales de la yema contaminante en este producto (Macherey y cols., 2011). La lipasa de Pseudomonas sp. fue capaz de llevar a cabo la hidrólisis enantioselectiva (e.e. > 99% a 50 % de conversión) de lactonas racémicas, que son fragancias ampliamente distribuidas en la naturaleza (Enzelberger y cols., 1997). Finalmente, Sabally y cols. (2007) realizaron la transesterificación del ácido dihidrocafeíco con aceite de pescado catalizada por la lipasa de Candida antarctica, demostrando que es posible sintetizar alimentos con propiedades nutracéuticas (Sabally y cols., 2007).

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12.2.2.2. Lipasas en la industria farmacéutica Mediante las técnicas de síntesis químicas convencionales no es posible obtener medicamentos enantio-puros; algunas veces en el mejor de los casos se tiene una mezcla racémica donde un enantiómero tiene la actividad deseada y el otro es inactivo, generando un producto con un 50% pureza; sin embargo, muchas veces el enantiómero que no tiene la actividad deseada, genera efectos secundarios indeseados, haciendo necesaria su eliminación de la mezcla racémica. Las propiedades de las lipasas más explotadas en la industria farmacéutica para la resolución de mezclas racémicas son su selectividad y su capacidad de realizar síntesis en solventes orgánicos. Parmar y cols. (1996) realizaron una revisión de la gran variedad de sustratos que las lipasas pueden aceptar para producir compuestos enantio-enriquecidos que posteriormente pudieran utilizarse para la síntesis de fármacos enantio-puros (Parmar y cols., 1996). Cui y cols. (1997) reportaron la esterificación enantioselectiva del (S)-naproxeno catalizada por la lipasa de Candida antarctica B (CALB) en iso-octano (Cui y cols., 1997). Villeneuve y cols. (2005) demostraron la capacidad de distintas lipasas (Rhizomucor miehei, Candida antarctica B y Candida rugosa) para sintetizar ésteres de fitoesteroles con actividad hipocolesterolémica (Villeneuve y cols., 2005). Por último, distintos derivados de ácidos hidroxicinámicos con actividad antioxidante, antiviral y antitumoral, han sido sintetizados exitosamente empleando CALB, demostrando el gran potencial de las lipasas para la síntesis de fármacos de nueva generación (Widjaja y cols., 2008, Kurata y cols., 2010).

12.3.2.3. Lipasas en la industria de los detergentes La utilización de las lipasas para la formulación de detergentes ha sido una de las primeras aplicaciones de estas enzimas. ,s fueron introducidas en la formulación de estos a mediados de los 80’s y desde entonces diferentes lipasas se han utilizado para este fin. Estas enzimas deben ser termoestables y además tolerar otros compuestos que puedan estar presentes en el ciclo de lavado. Misset y cols. (1994) señalaron que la lipasa de Pseudomonas alkaligenes podría ser un buen candidato para su utilización en detergentes, por su alta actividad en condiciones de lavado, como pH alcalino (7-11), alta temperatura (hasta 60 °C) y resistencia a la presencia de surfactantes aniónicos y no iónicos (Misset y cols., 1994, Pandey y cols., 1999). Lipolase®, lipasa de Humicola lanuginosa sobre-expresada en A. oryzae, fue de las primeras enzimas comercializadas para este fin por Novozymes, uno de los pioneros en fabricación de enzimas (Ladefoged y cols., 1995). Mientras que Lumafast®, su contraparte comercializada por Genencor, se trata de la lipasa recombinante de Pseudomonas mendocina expresada en Bacillus sp. Lo anterior muestra que la tendencia en la aplicación de lipasas en la industria de detergentes involucra el diseño de lipasas recombinantes e inclusive quimeras que combinen una alta termoestabilidad y resistencia a valores de pH alcalinos.

12.2.3. producción de lipasas La producción de lipasas comerciales por lo general se lleva a cabo por fermentación sumergida (fSm) en cerca del 90% de los casos. Actualmente, grandes esfuerzos se reali-

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Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

zan para justificar el empleo de la fermentación en medio sólido para la producción de estas enzimas. Entre las ventajas de este tipo de cultivo se menciona una mayor productividad volumétrica, la producción de enzimas con mejores propiedades y los bajos costos de producción. Sin embargo, la falta de fermentadores a escala industrial de fMS ha limitado hasta la fecha el uso de esta técnica (Holker y cols., 2004). A pesar de todo, varios estudios en fMS se han realizado e incluso en muchos de ellos se llevan a cabo comparaciones entre la fMS y la fSm, con diferentes enfoques y en muchos casos, la fMS resulta económicamente más atractiva que la fSm (Viniegra-Gonzalez y cols., 2003, Castilho y cols., 2000, Tengerdy, 1996). No obstante, como se ha mencionando, a pesar de que algunos trabajos se justifican con aplicaciones industriales (mejoramiento de propiedades de alimentos, nutracéuticos, fármacos, etc.), solo pocos trabajos se han dedicado verdaderamente a ir en busca de la actividad requerida para dicha aplicación. Sun y cols. (2009) encontraron dos lipasas de Rhizopus chinensis cultivado en fMS, la Lip1 que es mayoritaria y la Lip2, minoritaria. Ellos se interesaron en la actividad lipasa responsable de la síntesis de ésteres empleados como saborizantes, por lo que su estrategia fue purificar ambas lipasas y ensayarlas en síntesis. Sorprendentemente la Lip2, que era minoritaria, resultó ser la mejor para la aplicación que ellos buscaron. Por otra parte, Mateos-Díaz y cols. (2006) produjeron, purificaron y caracterizaron la lipasa de R. homothallicus producida por fMS y fSm y compararon ambas enzimas. Ellos encontraron que a pesar de tratarse de la misma enzima (peso molecular y N-terminal idénticos), la lipasa producida por fMS poseía una mayor actividad específica y termoestabilidad, y que además, solo la lipasa producida por fSm era capaz de hidrolizar la posición interna de pseudoglicéridos sintéticos, que era la aplicación buscada en ese caso (Mateos Diaz y cols., 2006). Wolski y cols. (2009) llevaron a cabo un estudio comparativo de la propiedades de los extractos crudos obtenidos a partir de la fMS y la fSm de Penicillium sp., encontrando que en ambos casos, la estabilidad enzimática ante el pH y la temperatura cambiaron. Estos estudios indicaron que en ambos sistemas (fMS y fSm), los microorganismos producen enzimas con diferentes propiedades, ya sea por inducción de enzimas diferentes, al favorecer modificaciones post-traduccionales que les confieren dichas características o bien por la interacción de las enzimas con moléculas que solo están presentes en alguno de los dos sistemas (p.ej. surfactantes). Viniegra-González y cols. (2002) realizaron una comparación entre la fMS y la fSm basados en un análisis matemático, tomando como modelo A. niger y encontraron que debido a la naturaleza de la fMS al emplear bagazo de caña, el microorganismo crece como si se encontrara en un reactor de lote alimentado con abundante disponibilidad de oxígeno y lento abastecimiento de sustrato. Esto resulta en una mayor producción de biomasa, una menor proteólisis y por ende, una mayor productividad (Viniegra-Gonzalez y cols., 2003).

12.3. aspectOs Generales de la fermentación en mediO sólidO La FMS ha sido definida como el cultivo de microorganismos sobre sólidos húmedos en ausencia parcial o total de agua libre (Krishna, 2005, Holker y cols., 2004).

Lipasas con aplicaciones novedosas: ¿es posible producirlas por fermentación…

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En ocasiones puede ser necesario agregar a la fracción sólida (soporte), ciertos nutrientes mediante un medio de impregnación, para enriquecer y equilibrar el medio de fermentación en su composición final. Existen varios reportes en la literatura en los que se han utilizado diferentes residuos agro-industriales como soporte o bien como medio de impregnación. Esto sin lugar a dudas, disminuye los costos de producción de enzimas, el cual fue el tema de estudio de Castilho y cols. (2000), quienes compararon la producción de lipasa a partir de Penicillium restrictum por fMS y fSm. Ellos encontraron que para la producción de 100 m3 de extracto concentrado de lipasa, la fSm requería una inversión inicial 78% mayor que para la fMS, entre otras ventajas importantes desde el punto de vista económico. Sin embargo, el criterio de elección de un soporte no debe ser solo basado en el costo. Es importante no olvidar que la etapa de fermentación (producción) es decisiva para obtener la actividad que pueda llevar a cabo la aplicación que se busca. Tomando en cuenta que se desea obtener una lipasa para una aplicación dada, hay que considerar que tanto el medio sólido (soporte y medio de impregnación) como los diferentes parámetros de la fermentación (humedad, pH, temperatura, aireación, etc.) tendrán un efecto profundo en el perfil de la actividad lipasa que se obtendrá y esto es de especial importancia cuando se emplean microorganismos con la capacidad de producir más de una lipasa.

12.3.1. fermentadores para la fms En los procesos fermentativos, el fermentador provee un ambiente que favorece el adecuado crecimiento y la producción de metabolitos del microorganismo. Para el diseño y fabricación de fermentadores para fMS se deben tener en cuenta diferentes factores como: técnica de inoculación y muestreo, equipo de esterilización, medio para la fermentación, aireación, monitoreo y control de los distintos parámetros de fermentación, entre otros. A la fecha se han propuesto varios diseños de fermentadores para la fMS, sin embargo la elección del fermentador adecuado es todavía un tema de discusión, debido a los diversos criterios que deben tomarse en cuenta; tales como: el tipo de microorganismo y sustrato, tipo de metabolito a obtener, la heterogeneidad del medio, etc. A continuación se hará una breve descripción de los tipos de fermentadores más empleados en fMS.

12.3.1.1. Fermentador de charolas El fermentador de charolas para fMS es el diseño más sencillo de todos (figura 12.1). Las charolas empleadas por lo general están construidas de madera, plástico o metal. Este fermentador consiste en una cámara, dentro de la cual, se hace circular aire a una temperatura y humedad controladas alrededor de un cierto número de charolas. Generalmente las charolas se encuentran apiladas una sobre la otra, dejando siempre el espacio suficiente entre cada una para permitir el flujo adecuado del aire y lograr una buena transferencia de calor y masa. El medio de fermentación sólido es esparcido sobre las charolas procurando formar una capa uniforme de menos de 3

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cm de espesor. La parte superior de la charola se encuentra descubierta y en ocasiones el fondo de la charola está perforado para maximizar la disipación del calor y el intercambio de gases. Inicialmente, las charolas con el sustrato se esterilizan (en caso de ser necesario), se inoculan y son llevadas a la cámara de fermentación, en donde se incuban durante un determinado lapso de tiempo, bajo las condiciones adecuadas para el cultivo del microorganismo en cuestión. Después de la fermentación, los metabolitos de interés son extraídos del fermento sólido. La principal ventaja del fermentador de charolas es su simplicidad, bajo costo de inversión inicial y de operación. Además es posible emplearlo tanto a escala laboratorio como a nivel industrial, sin embargo se requiere de una gran superficie, ya que la capa de fermento sólido sobre las charolas no debe exceder de un espesor crítico (estimado en 3 cm) para mantener la temperatura en el rango deseado. Además, requiere de mucha mano de obra lo que lo hace ideal para su empleo en países en vías de desarrollo donde los costos de mano de obra son bajos (Rajagopalan y Modak, 1995, Krishna, 2005, Mitchell y cols., 2003).

Cámara de fermentación

Fermento sólido

Charola de fermentación

figura 12.1. Representación esquemática de una cámara de fermentación con charolas clásica. figura adaptada a partir del trabajo de Mitchell y cols. (2006).

12.3.1.2. Fermentador de lecho empacado En el fermentador de lecho empacado, el sustrato sólido se coloca en el interior de una columna y se hace pasar un flujo de aire a través del lecho, tal y como se muestra esquemáticamente en la figura 12.2. La temperatura puede ser controlada a través de una chaqueta con líquido (agua). Sin embargo, si la geometría del soporte es muy heterogénea, es posible la formación de gradientes axiales de humedad debi-

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do a que el flujo de aire no pasa de igual manera a través de todo el sistema. Lo que en ocasiones puede resultar en la pérdida de humedad en el sustrato. Por otra parte, no es recomendable que el diámetro de la columna exceda los 5 cm, limitando este tipo de reactores a aplicaciones a nivel laboratorio. Además, la caída de presión puede llegar a ser un factor importante, ocasionando la canalización del flujo de aire o la ruptura del lecho lo que finalmente limita la transferencia de calor y masa. Al igual que el fermentador de charolas, las columnas siguen siendo un sistema simple que permite un mayor control del proceso y posibilita el empleo de capas de sustrato más altas, debido a que el factor geométrico crítico para el control de la temperatura es el diámetro de la misma (Durand y cols., 1993). Además debido a sus características, brinda la posibilidad de trabajar en condiciones estériles, sin embargo el diseño de la misma no permite la toma de muestras y para realizar estudios cinéticos, es necesario sacrificar una columna completa para cada tiempo de muestreo. Debido a estas particularidades, estos fermentadores son convenientes en las primeras etapas del desarrollo del bio-proceso, ya que permiten realizar fácilmente estudios de caracterización y optimización de la composición del medio de cultivo y de esta manera obtener datos que permitan realizar estudios cinéticos (Mitchell y cols., 2006). Recirculador Columnas de fermentación Baño de agua Sensor de O2 y CO2

Entrada de aire

Visualización de la respirometría

Difusor de aire

figura 12.2. Esquematización de un sistema clásico de fermentación sólida en columnas.

12.3.1.3. Fermentador de tambor rotatorio El fermentador de tambor rotatorio se originó en el intento de mejorar los problemas que impone la heterogeneidad del medio (figura 12.3). Consta de un contene-

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dor cilíndrico que gira alrededor de su eje con un cierto grado de inclinación. Puede o no tener deflectores en la parte interna para mejorar el mezclado. El fermento se encuentra en el interior del tambor rotatorio ocupando a lo más el 40% del espacio. una gran desventaja de este tipo de fermentador es que en el caso de hongos o microorganismos susceptibles a la agitación (p.ej. hongos no septados) ocurre daño y la muerte de las células. Además, al poseer partes móviles, sus costos de operación se incrementan. En general el fermentador de tambor rotatorio no ha tenido mucho éxito a excepción de algunos pocos casos (Stuart y Mitchell, 2003, Krishna, 2005, Mitchell y cols., 2006). (a)

rotación

Flujo de aire

Vista orilla

Vista lateral Flujo de aire Deflectores

figura 12.3. Esquema de las diferentes vistas de un fermentador de tambor rotatorio. Imagen adaptada del trabajo de Mitchell y cols. (2003).

12.3.2. Factores que influyen en el desempeño de la FMS 12.3.2.1. Microorganismos La FMS se puede llevar a cabo empleando hongos filamentosos, levaduras o bacterias, sin embargo los hongos filamentosos se han destacado de los otros microorganismos, ya que se encuentran adaptados naturalmente a la fMS. Esto es debido a la forma en la que crecen, formando filamentos (hifas) que penetran en los intersticios del sustrato sólido colonizándolo más eficazmente. Además, soportan entornos con una baja actividad de agua y condiciones de alta presión osmótica (Raimbault, 1998). Asimismo, los hongos son buenos productores de enzimas extracelulares (las cuales son más fáciles de recuperar) y crecen generalmente en medios muy simples, lo que disminuye los costos de producción. Sin embargo, existen algunos casos de producción de enzimas en los que se han utilizado cepas bacterianas con éxito como ya se mencionó precedentemente.

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12.3.2.2. Humedad y Actividad de Agua La humedad es la relación porcentual que indica la fracción peso de agua en el medio sólido y es un factor muy importante en la fMS que debe ser controlado dependiendo de cada caso en particular. Los niveles muy bajos de humedad producirán problemas de difusión de los nutrientes, bajas velocidades de crecimiento y baja estabilidad de las enzimas producidas (Lonsane y cols., 1985, Moo-Young y cols., 1983). Mientras que, los altos niveles de humedad dificultarán el intercambio de gases, producirán aglomeración de partículas y propiciarán el crecimiento de contaminación bacteriana (Gowthaman y cols., 2001). Por lo tanto, el nivel de humedad a controlar en una fMS depende del microorganismo que se quiera cultivar. Por ejemplo para las bacterias, el nivel de humedad debería ser mantenido por arriba del 70%; mientras que, para los hongos filamentosos, el nivel de humedad puede estar comprendido en un rango de humedad de entre 20-70% (Pandey y cols., 2001). La actividad de agua (aw) es la relación entre la presión vapor del agua en el medio sólido con respecto a la presión vapor del agua pura e indica que tanta de esa agua se encuentra disponible para los diferentes procesos metabólicos del microorganismo. Resulta más adecuado hablar en términos de actividad de agua, ya que el porcentaje de humedad no toma en cuenta la interacción del agua con los diferentes soportes sólidos, sustratos y solutos. Es importante subrayar que la actividad de agua no es constante durante la fermentación, ya que el mismo crecimiento microbiano cambia la geometría del soporte sólido y el tipo de interacción con el agua cuando los sustratos son consumidos. Sin embargo, es importante hacer notar que en general, una actividad de agua reducida, limita la velocidad de crecimiento y la producción de biomasa (Oriol y cols., 1988).

12.3.2.3. pH y Temperatura El pH es una variable muy importante en cualquier proceso fermentativo. Esto probablemente se debe a que a lo largo de la fermentación el pH cambia gracias a la actividad del microorganismo (p.ej. producción o consumo de ácidos orgánicos). Cada microorganismo posee un rango de pH óptimo para su desarrollo o bien para la producción de metabolitos. Los hongos filamentosos pueden crecer bien en valores de pH que van desde 2 hasta 9, siendo el óptimo entre 3,8 y 6. Por otra parte las levaduras crecen mejor en el rango de 2,5 a 8,5 con su óptimo entre 4 y 5. La capacidad de los hongos para crecer en estos rangos de pH es aprovechada para evitar la contaminación bacteriana, sobre todo cuando se trabaja en valores de pH bajos, donde el crecimiento fúngico se ve favorecido. Sin embargo, en la fMS a diferencia de la fSm, el pH no puede ser controlado durante la fermentación debido a la heterogeneidad del medio. Además la fuente de nitrógeno seleccionada para el cultivo microbiano puede también ejercer un efecto relativamente fuerte sobre el pH. Para intentar controlar el pH en la fMS, frecuentemente se selecciona una fuente de nitrógeno adecuada, como por ejemplo la urea y se utilizan soluciones tamponadas. Otra variable física que influencia contundentemente el desempeño de una FMS es la temperatura. Al igual que en el caso del pH, los hongos son capaces de crecer en un rango relativamente amplio de temperatura (de 20 a 55 °C). Además el óptimo

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de crecimiento puede diferir al óptimo de producción de la actividad enzimática de interés. Sin embargo, el control de la temperatura en fMS es un verdadero reto, ya que los métodos convencionales que se utilizan para disipar el calor en fSm no funcionan adecuadamente en fMS debido principalmente a las bajas velocidades de transferencia de calor ocasionada por la presencia del sólido (el aire atrapado en los poros del sólido no es buen conductor del calor). Esto da como resultado la formación de gradientes de temperatura y por lo tanto puntos calientes dentro del fermentador que ocasionan una disminución de la productividad importante o incluso la muerte del microorganismo (Mitchell y cols., 2003, Mitchell y cols., 2006). Es por esta razón que uno de los aspectos más estudiados en lo que respecta al diseño de fermentadores para fMS, es precisamente las técnicas de remoción de calor. Es evidente que este problema se agrava cuando se requiere operar a gran escala. Hasta la fecha los mejores métodos utilizados para remover el calor son el mezclado axial (p.ej. reactor PlafactorTM, Biocon), placas de enfriamiento refrigeradas (p.ej. reactor Zymotis) y la aireación forzada. Sin embargo, es crucial el control de la temperatura y la humedad del aire utilizado, ya que un exceso de humedad en este, podría producir un cambio de humedad en el sólido propiciando la contaminación bacteriana, mientras que un aire deficiente de humedad podría secar el fermento sólido. No obstante, en muchas ocasiones, el enfriamiento evaporativo utilizando aire no saturado en humedad ha sido empleado (Raimbault, 1998), ya que posee una eficiencia de remoción de calor superior a la conducción y la convección (Laukevics y cols., 1984). Cabe señalar que, este método resulta en la pérdida de grandes cantidades de humedad que deberán ser repuestas para evitar un efecto negativo en el cultivo microbiano.

12.3.2.4. Aireación La aireación es también un factor muy importante, ya que tiene gran influencia en la demanda de oxígeno por parte de los microorganismos durante los cultivos aeróbicos y juega un papel muy importante en los fenómenos de transferencia de calor y masa. El aire provee oxígeno, arrastra al dióxido de carbono y a otros metabolitos volátiles fuera del medio heterogéneo. Por lo tanto, la velocidad de aireación es una manera de controlar los requerimientos de oxígeno para el crecimiento de microorganismos, la producción de metabolitos volátiles y la acumulación del calor metabólico. Además existen muchos factores que pueden afectar la velocidad de transferencia de oxígeno, entre los más importantes se encuentra la velocidad de flujo del aire, la geometría y porosidad del medio sólido y la profundidad de la cama del fermento (Lonsane y cols., 1992).

12.3.2.5. Soportes para la FMS La principal función del soporte en la fermentación sólida es brindar una superficie de anclaje para el crecimiento del microorganismo. Además, en la mayoría de los casos este soporte también aporta nutrientes y puede jugar un papel en la inducción de cierto tipo de enzimas. De manera general, se clasifican los soportes empleados en FMS en dos grandes grupos: los sustratos naturales, que habitualmente consisten en productos o residuos agroindustriales (p.ej. granos, frutos, pulpas, residuos de frutos, bagazos,

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cascarillas, etc.) y los inertes que son sólidos que no aportan nutrientes al microorganismo y su función es exclusivamente como anclaje (p.ej. espuma de poliuretano, agrolita, vermiculita, etc.). un sustrato natural puede ser soporte inerte para un microorganismo que no tiene la maquinaria enzimática para degradarlo. La utilización de soportes naturales permite el aprovechamiento de los residuos agroindustriales y convierte a la fMS en un proceso muy sustentable. Los soportes inertes por su parte ofrecen la ventaja de permitir el estudio de los parámetros de crecimiento microbiano. Además, permiten también la realización de estudios controlados de inducción de enzimas, utilizando mezclas de soportes inertes y sustratos naturales o medios de impregnación con inductores específicos. Esta clase de estudios juegan un papel importante en el diseño racional de estrategias para obtener enzimas con aplicaciones novedosas por fermentación en medio sólido. Además, la utilización adecuada de un soporte sólido permite la inmovilización directa de la enzima en el mismo, como lo reportan fernandes y cols. (2007) y Martínez-Ruiz y cols. (2008) (fernandes y cols., 2007, Martinez-Ruiz y cols., 2008, Hernandez-Rodriguez y cols., 2009).

12.4. empleO de residuOs aGrOindustriales para la prOducción de lipasas pOr fms En los últimos años el interés por la utilización de residuos agroindustriales para la producción de enzimas se ha incrementado. La producción de lipasas no ha sido la excepción. Los agro-residuos pueden ser utilizados como soporte o bien adicionados al medio de impregnación. La selección de los residuos agroindustriales más adecuados depende principalmente de la disponibilidad y del costo. Es por eso que las estrategias para la producción de enzimas, en este caso lipasas, deben considerarse regionales y no extrapolarse a todos los entornos geográficos. Incluso la aplicación que se pretende dar al biocatalizador producido debería considerar una necesidad local, de preferencia dentro de la misma industria que lo genera. una vez que se conoce qué residuos se encuentran disponibles, el criterio de selección debe ser estudiado más profundamente. Es en ese punto donde se debe pensar en la aplicación. Primero es conveniente diseñar un método de búsqueda y selección que detecte la actividad deseada, es decir aquella que tiene la aplicación y no simplemente la actividad lipasa total producida. Por lo que es de gran importancia la estrategia empleada para detectar la lipasa deseada, desde el aislamiento del microorganismo productor hasta la aplicación final de la lipasa. Para lograr lo anterior, se puede partir de medios de cultivo químicamente definidos que permitan la identificación de la actividad lipasa de interés (p.ej. empleo de diferentes inductores e indicadores para la detección de la actividad), métodos para la cuantificación de la actividad con diversos sustratos (p.ej. espectrofotometría, zimogramas, titulación, entre otros) y ensayos para la aplicación final (p.ej. síntesis y/o hidrólisis de un compuesto en particular, resolución de moléculas quirales, entre otros). Como se mencionó precedentemente, Mahanta y cols. (2008) produjeron lipasa por fMS sobre residuo de Jatropha curcas con la cepa resistente a solventes P. aeruginosa (Mahanta y cols., 2008). A partir del aceite Jatropha se obtienen triglicéridos que posteriormente pueden ser transformados química o enzimáticamente en biodie-

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sel, el residuo de la extracción no puede disponerse como alimento para animales ya que es tóxico y por lo tanto se genera un problema de contaminación. Mediante la producción de lipasas por fMS con este residuo se solucionaría este problema, estas enzimas a su vez, se podrían emplear para fabricar el biodiesel. Sin embargo, los ensayos de medición de actividad que se realizaron fueron sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP) en hidrólisis y no es posible asociar directamente esta actividad con la actividad de síntesis de alquil ésteres (necesaria para la producción de biodiesel). Para abordar este problema con un enfoque en síntesis sería necesario liofilizar o inmovilizar el extracto obtenido, lo cual puede ser tardado y complicado. Además, en el caso de microorganismos productores de más de una actividad lipasa, este tipo de procesos pueden degradar (liofilización) o adsorber (inmovilización) preferencialmente una actividad que pudiera ser o no la más interesante en síntesis. Por lo tanto, en este punto se justificaría utilizar una estrategia similar a la de Fernandes y cols. (2007) o la de Martinez-Ruiz y cols. (2008), es decir utilizar el soporte fermentado y seco para realizar pruebas de síntesis en solventes orgánicos en lugar de pruebas de estabilidad en mezclas agua-solvente (fernandes y cols., 2007, HernandezRodriguez y cols., 2009, Martinez-Ruiz y cols., 2008). Existen microorganismos que producen más de una lipasa. Tal es el caso de varios hongos filamentosos del género Penicillium y Aspergillus así como levaduras de distintas especies como Candida rugosa y Candida antarctica. Sin embargo, en muchas ocasiones las estrategias seguidas durante la optimización no toman en cuenta esto, por lo que muchas veces puede perderse o diluirse la enzima que tiene la aplicación buscada. Kempka y cols. (2008) utilizaron el método de superficie de respuesta para optimizar la producción de lipasas en Penicillium verrucosum. Analizaron el efecto de diferentes aceites (aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de soya, etc.) adicionados al medio de cultivo, sobre la producción de lipasas y encontraron que no existía diferencia significativa al utilizar cualquiera de los aceites. Los autores mencionaron muchas aplicaciones potenciales de las lipasas. Sin embargo, la optimización no fue enfocada a la producción de alguna de ellas en particular, sino a la obtención de una mayor productividad global. Entonces, si P. verrucosum fuera capaz de sintetizar más de una lipasa y si el perfil de producción de las distintas lipasas con cada aceite fuera diferente, la implementación de estudios zimográficos a las cinéticas de producción, podría ayudar a resolver este problema; ya que, además de identificar la inducción preferencial de una o varias enzimas, proporcionaría información muy útil que complementaría de manera sustancial los estudios comparativos referentes al medio de cultivo (sólido o líquido). Por otra parte Rodriguez (2004) y Rodriguez y cols. (2006) realizaron el mejoramiento del medio de cultivo para Rhizopus homothallicus probando diferentes agroresiduos y aceites empleando un medio químicamente definido. Como sustrato se probaron residuos de oliva y copra de coco, ambos empleando bagazo de caña como soporte, obteniendo 175 y 518 u/g a las 20 h de cultivo (Rodríguez, 2004), respectivamente. También se probaron diferentes aceites empleando bagazo de caña como soporte, como el aceite de maíz, de nuez, de oliva, de cacahuate, de semilla de uva y de girasol, obteniendo una actividad de 442 y 596 u/g con aceite de semilla de uva y de oliva, respectivamente (Rodriguez y cols., 2006). Más tarde, Mateos-Díaz y cols.

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(2006) produjeron, purificaron y caracterizaron esta actividad tanto por FMS como por FSm y obtuvieron una actividad específica de 10.700 y 8.600 U/mg, respectivamente. Afortunadamente, R. homothallicus solamente produjo una lipasa, la misma en ambos sistemas. Sin embargo cada una poseía características diferentes, lo cual fue atribuido a la presencia de surfactantes en el buffer de extracción utilizado en la fMS que se asociaron a la lipasa. Los zimogramas permiten la separación y visualización de las enzimas que poseen una actividad determinada. Existen reportes de zimogramas que permiten la visualización de la actividad lipasa (Singh y cols., 2006). La implementación de técnicas zimográficas, desde que se comienza a trabajar con un microorganismo, permite saber cuántas lipasas podrían estarse expresando como consecuencia de las modificaciones en las condiciones de cultivo o en transcurso del tiempo de fermentación Tal es el caso del trabajo que se está realizando actualmente con el hongo A. ochraceus en nuestro laboratorio. Inicialmente, se realizó la búsqueda de una lipasa capaz de actuar sobre alcoholes con impedimento estérico, utilizando como sustrato modelo a la luteína. Se encontró que una de las cepas aisladas de A. ochraceus, producía una actividad lipasa con esta cualidad. En la figura 12.4 se muestra la producción global de lipasas de A. ochraceus (LAoc) empleando un soporte inerte (espuma de poliuretano) y dos sustratos diferentes (aceite de oliva y cascarilla de maíz) mediante el sistema de fMS en columnas a nivel laboratorio. Cuando se utilizó poliuretano y aceite de oliva como sustrato, la actividad lipasa se comenzó a detectar después de las 24 h de cultivo, llegando a un máximo a las 96 h con un valor de 4,7 u/g, empleando trioctanoína (TC8) como sustrato; al realizar un zimograma usando TC8 como sustrato, se observó la aparición de tres bandas de actividad, indicando la presencia de al menos tres lipasas (figura 12.4A). El extracto enzimático proveniente de esta fermentación fue inmovilizado en Lewatit CNP 105 y la síntesis de dipropionil luteína (Di-PrL) con estas lipasas (LAoc) fue confirmada por cromatografía en capa fina, en donde se probaron también testigos de la síntesis química (DMAP), enzimática (CALB) y sin enzima (figura 12.5). Posteriormente, se realizó una fermentación empleando una mezcla de poliuretano con cascarilla de maíz. Al igual que en el caso anterior, la actividad se comenzó a detectar a partir de las 24 h y la producción máxima se obtuvo a las 96 h con un valor 2,8 u/g. En esta ocasión solo se observó en el zimograma (utilizando TC8) la aparición de una sola banda de actividad lipasa (figura 12.4B). Actualmente, se están realizando pruebas de inmovilización y síntesis de este extracto con el fin de probar si esta enzima es capaz de sintetizar algún éster de luteína. En caso de ser positivo se habría identificado una banda de la lipasa que realiza la síntesis, de lo contrario, esta lipasa sería descartada y la atención estaría focalizada a las otras dos bandas. Este ejemplo muestra claramente como al utilizar diferentes sustratos en el medio de cultivo, el hongo presenta un patrón de expresión de lipasas diferente. Además, es evidente que hay que ser cuidadosos al optimizar y purificar una enzima basándose solo en la actividad enzimática global y no en la aplicación; sin embargo, para lograrlo es necesario, acoplar diversas técnicas analíticas (p.ej. actividad enzimática, zimograma, síntesis), las cuales muchas veces no están disponibles o no han sido desarrolladas aún.

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1

2

3 A

Actividad (U/g)

5 4 A

B

B

3 2 1 0

0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h) Cascarilla de Maíz Aceite de Oliva

figura 12.4. Cínéticas de actividad enzimática y zimograma sobre trioctanoína (TC8) durante la fMS de A. ochraceus empleando aceite de oliva o cascarilla de maíz (CM) como sustrato y poliuretano (Puf) como soporte sólido. A y B representan los picos de máxima actividad con aceite de oliva y cascarilla de maíz, respectivamente. En el carril 1 del zimograma se muestran los estándares y en los carriles 2 y 3 los picos A y B.

12.5. cOnclusiOnes La producción de lipasas por fMS es una alternativa más económica en comparación con la fSm. Esto debido a la posibilidad de utilizar materia prima muy barata como lo son los residuos agro-industriales. Sin embargo, aun existen grandes desafíos por vencer para poder utilizar esta tecnología a gran escala, los cuales están relacionados con la falta de nuevos diseños de fermentadores. A pesar de esto, muchos trabajos han sido publicados en los últimos años, en los que se producen lipasas utilizando fMS y agro-residuos. No obstante, en muchos casos no se ha dado la importancia debida a la(s) aplicación(es) final(es) de la enzima, lo que ha derivado en que muchas de las enzimas caracterizadas no sean las adecuadas para la aplicación deseada. Para resolver este último problema, es necesario implementar nuevas estrategias que consideren la aplicación de las lipasas desde el inicio. Para poder llevar a cabo esta estrategia, se requiere desarrollar métodos de búsqueda y selección que sean específicos de la actividad enzimática buscada, lo cual no siempre es fácil de lograr, tornándose un factor limitante. Aunado a esto, es deseable la utilización de fermentos sólidos secos conteniendo lipasas para ser empleados como biocatalizadores, tanto en reacciones de hidrólisis como en reacciones de síntesis en solventes. Además,

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Di-PrL

M-PrL L 1

2

3

4

5

6

7

Figura 12.5. Cromatografía en capa fina de la síntesis de dipropionil luteína por vía enzimática y química. Abreviaciones: Luteína (L), Mono-propionil luteína (M-PrL) y Di-propionil luteína (Di-PrL); Carril 1, estándares: L y Di-PrL; Carril 2, tiempo inicial de reacción con LAoc; Carril 3, tiempo final de reacción (48 h) con LAoc; Carril 4, duplicado de tiempo final (48 h) con LAoc; Carril 5, tiempo final de reacción (48 h) sin enzima; Carril 6, síntesis enzimática de Di-PrL con la lipasa B de Candida antárctica (CALB) en 48 h; Carril 7, síntesis química de Di-PrL empleando 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Las reacciones enzimáticas fueron realizadas en hexano a 50 °C partiendo de una concentración de luteína 10 mM y una relación molar 1:10 luteína:vinil propionato con 50 mg de enzima/mL. La síntesis química de Di-PrL se realizó con anhídrido propiónico y luteína en diclorometano con una relación molar 1:10 luteína/anhídrido propiónico a 50 °C y 2 mg/mL de DMAP.

se debe tener cuidado cuando se trabaja con microorganismos que producen más de una lipasa, siendo conveniente, en la medida de lo posible, implementar o utilizar diversas técnicas que permitan identificar en extractos crudos, las enzimas que sean capaces de realizar la aplicación deseada (p.ej. actividad de síntesis de una molécula en particular y estudios zimográficos que permitan la visualización de las lipasas presentes en el extracto crudo). finalmente, la implementación de todas estas técnicas de forma racional, permitirá encontrar una mayor proporción de lipasas en la naturaleza con aplicaciones potencialmente novedosas.

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13. estrateGias enzimáticas en síntesis de cOmpuestOs biOactivOs y biOmateriales alicia baldessari Laboratorio de Biocatálisis. Departamento de Química Orgánica y uMYMfOR. facultad de Ciencias Exactas y Naturales. universidad de Buenos Aires, Argentina

13.1. intrOducción La obtención de productos de alto valor agregado mediante reacciones de síntesis orgánica ha contribuido significativamente a elevar la calidad de vida de los seres humanos a través de los siglos y ha llegado a lograr un importante grado de desarrollo. En los últimos años ha crecido la tendencia hacia el mejoramiento de estos procesos, tanto en la reducción de los costos como en el aumento de la calidad, seguridad y cuidado del medio ambiente. La necesidad global de tecnologías limpias, usando materias primas renovables y una correcta implementación de los reactivos químicos peligrosos y los desechos presentan nuevos desafíos tanto para los Química como para la Biotecnología. Ambas ciencias han aceptado el desafío a partir de las iniciativas concretadas en la Química Verde (Baldessari, 2004; Li y Trost, 2008) y la Biotecnología Blanca o industrial (Wohlgemuth, 2009) que han emergido en cada una de sus disciplinas. Por lo tanto es de crucial importancia para el éxito de la implementación y traslado de la ciencia y la tecnología al sector industrial el desarrollo de una interfase común Química-Biotecnología. uno de los principales inconvenientes que enfrenta la síntesis orgánica en la actualidad es el uso de grupos protectores, generalmente muy tóxicos y de difícil disposición, para evitar los problemas de selectividad e incompatibilidad de reactividades en las reacciones. La posibilidad de fabricar moléculas complejas a partir de materias primas sencillas en un mínimo número de pasos, evitando aquellos de protección y desprotección debido a un aumento en la selectividad del proceso, ha hecho dirigir la mirada hacia nuevas tecnologías, entre ellas la Biocatálisis (Gotor y cols., 2008; fessner y Anthonsen, 2009). Las reacciones catalizadas por enzimas no requieren equipamiento complejo ni especial y se llevan a cabo en condiciones suaves de reacción tales como temperatura ambiente y presión normal. El catalizador es biodegradable y se obtiene a partir de fuentes renovables. Hoy en día, la aplicación de algunas enzimas en las industrias de productos de alto valor agregado es práctica y útil, especialmente en el caso de las

324

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

lipasas que no requieren cofactores, son capaces de aceptar un amplio rango de sustratos y además son activas en catalizar variados tipos de reacciones. Las condiciones suaves de reacción, estabilidad y reciclado, tanto como su elevada selectividad, que permite acortar los caminos sintéticos, justifican las ventajas económicas y ecológicas de las conversiones catalizadas por lipasas. Por lo tanto es indiscutible su valor como catalizadores en síntesis de productos industriales. En este capítulo se describirán algunos ejemplos de aplicación de lipasas como catalizadores en reacciones de síntesis de productos comerciales pertenecientes a la industria farmacoquímica y de algunos materiales poliméricos con aplicación biomédica. Se dividirá el mismo en dos partes estando la primera dedicada a la obtención de dos compuestos bioactivos: alfuzosin, usado como medicamento en el tratamiento de la hipertrofia prostática benigna y el bactericida cloruro de lapirio. En la segunda parte se describirán reacciones de síntesis de biomateriales poliméricos catalizadas por lipasas.

13.2. síntesis enzimática de cOmpuestOs biOactivOs En esta parte se describirán dos ejemplos donde las enzimas mejoraron notablemente los procesos sintéticos de productos farmacéuticos como el alfuzosin y el cloruro de lapirio. En ambos casos las enzimas catalizaron reacciones de esterificación, transesterificación y aminólisis. En los compuestos obtenidos la formación de una función amida fue un paso clave del camino sintético.

13.2.1. síntesis de un intermediario de alfuzosin La hipertrofia prostática benigna (HPB) es una enfermedad progresiva asociada a síntomas en el tracto urinario inferior como aumento de la frecuencia, disminución de flujo urinario y del completo vaciado de la vejiga. Esta dolencia, que se manifiesta por el crecimiento de la próstata en los varones, se considera uno de los mayores riesgos en la salud de la sociedad moderna, aumentando la prevalencia de aparición de hiperplasias benignas desde el 8% a los 40 años hasta aproximadamente 90% a los 90. Si bien en un principio se recurrió a la cirujía como terapia, actualmente se utilizan antagonistas del adrenorreceptor alfa-1 como primera línea terapéutica en los pacientes. El alfuzosin (figura 13.1, compuesto 1) es un derivado quinazolínico que provoca la contracción de la próstata y los órganos asociados, reduciendo en esta forma los síntomas asociadas a las HPB. El alfuzosin ha sido preparado tradicionalmente a través de diferentes rutas sintéticas utilizando N-[3-(metilamino)-propil]-2-furancarboxamida (2) como intermediario (Manoury y cols., 1986). La preparación de 2 a partir de ácido 2-tetrahidrofuroico (3) es dificultosa, ya que involucra la síntesis de un anhídrido mixto (4) por tratamiento de 3 con cloroformiato de etilo y trietilamina a bajas temperaturas y bajo atmósfera de nitrógeno (paso i en la figura 13.2).

Estrategias enzimáticas en síntesis de compuestos bioactivos y biomateriales

H3CO

N

CH3

H

N

N

N

H3CO

325

O O

NH2 1

figura 13.1. Estructura del alfuzosin. O O

O OCOEt

ii

O

CN

N CH3

4

5 iii

i

O O

iv OH

O O

ENZIMÁTICO

N

N

H

CH3

H 2

3

figura 13.2. Síntesis del intermediario 2.

Posteriormente, el intermediario nitrilamida 5, producto de reacción de 4 con 3-(metilamino)-propanonitrilo debe ser destilado a presión reducida (paso ii en la figura 13.2). El nitrilo se hidrogena sobre rodio en una solución de amoníaco en metanol a 80 ºC y 840 psi de presión para obtener 2 a través de un reordenamiento que involucra la migración del grupo metilo desde un nitrógeno al otro (paso iii en figura 13.2) (Manoury, 1982). Considerando los buenos resultados obtenidos por nuestro grupo utilizando lipasas en reacciones de esterificación (Baldessari y cols., 1998; Baldessari y cols., 2002; Monsalve y cols., 2005; Monsalve y cols., 2008; Rustoy y cols., 2004) y aminólisis (Monsalve y cols., 2010; Rustoy y col., 2006; Monsalve y cols., 2011), decidimos llevar a cabo la síntesis del intermediario 2 utilizando una lipasa como catalizador. Siguiendo la estrategia enzimática, el producto 2 se obtiene por agregado de Nmetil-1,3-diaminopropano al balón de reacción donde se ha formado el éster etílico del ácido tetrahidrofurancarboxílico, por reacción del ácido 3 con etanol en presencia de lipasa inmovilizada de Candida antarctica B (CAL B) (paso iv en la figura 13.2). Todo el procedimiento enzimático (paso iv) se lleva a cabo en un solo recipiente ocurriendo dos reacciones enzimáticas consecutivas (esterificación y aminólisis) sin

326

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

necesidad de aislar el éster etílico del ácido tetrahidrofurancarboxílico. El etanol actúa como solvente y reactivo de esterificación. La reacción ocurre a temperatura ambiente y la enzima puede ser reusada ya que mantiene el 80% de su actividad luego de 8 ciclos. CAL B muestra alta regioselectividad en la aminólisis del éster, produciendo exclusivamente la amida menos sustituida. Por lo tanto la purificación de 2 es sencilla debido a la falta de productos secundarios. El rendimiento global del producto 2 desde el ácido 3 es 72% (Baldessari y Gros, 2004), considerablemente mejor que el obtenido por síntesis química (41%) (Manoury y cols., 1986). En la Tabla 13.1.se presenta una comparación entre el proceso de síntesis por las vías química y enzimática. tabla 13.1. cOmparación entre el prOcesO de síntesis de alfuzOsin pOr las vías química y enzimática

temperatura presión pasos de reacción catalizador solvente reactivos

hidrogenación escala preparativa regioselectividad

procedimiento químico enzimático Muy bajas (0-5 ºC) y elevada Ambiente (80 ºC) 840 psi en la hidrogenación (iii) Atmosférica 3 1 Muy tóxico Biodegradable y reciclable (80% de actividad después de 8 ciclos) Tetrahidrofurano Etanol Cloroformiato de etilo:muy Etanol tóxico Rodio: tóxico irritante. 3(Metilamino)-propanonitrilo: irritante No es necesaria usando una solución de NH3/ etanol Sí Sí No En la etapa de aminólisis, solo reacciona el grupo amino primario de h2n(CH2)3NHCH3

Estas diferencias muestran la forma en que la metodología enzimática favorece al medio ambiente efectuando una reacción mucho más limpia, que no requiere un gasto energético adicional y utilizando un catalizador reciclable y biodegradable. finalmente, este procedimiento enzimático tan simple resultó exitoso con variados ácidos carboxílicos (cíclicos, de cadena abierta, ceto- e hidroxiácidos, dicarboxílicos, de longitud de cadena variable, saturados e insaturados, etc.) (Baldessari y Mangone, 2001).

13.2.2. síntesis de cloruro de lapirio El cloruro de lapirio (compuesto 7 en la figura 13.3) se comercializa en el país y tiene un gran mercado a causa de sus propiedades antisépticas, siendo activo en in-

Estrategias enzimáticas en síntesis de compuestos bioactivos y biomateriales

327

fecciones de la piel y quemaduras. También tiene aplicación en asepsia quirúrgica y artículos de higiene personal como cremas dentales, antitranspirantes, acondicionadores del cabello y de la piel (Argembaux y cols., 2002; Maruyama y cols., 2001; Sipos, 1977). Los procesos sintéticos tradicionales no han permitido la producción de cloruro de lapirio de alta pureza y con buen rendimiento. Las reacciones empleadas en esta metodología no son selectivas, en cada uno de los pasos se obtienen mezclas de productos requiriéndose complicados procesos de purificación tanto de los intermediarios como del producto final. Esto disminuye notablemente el rendimiento global del proceso (Epstein y Harris, 1942). Además se utilizan agentes tóxicos y sensibles a la humedad como materia prima y reactivos, solventes cancerígenos, trabajando en condiciones drásticas de reacción donde se liberan gases corrosivos e irritantes (Gordon y Ralston, 1945). Todo esto genera la necesidad de trabajar cuidadosamente durante el desarrollo del proceso e incrementar las acciones relacionadas al tratamiento de los efluentes una vez concluido el mismo. OH

Cl O

H2N

CH3CH2OH

O

Cl CAL B

H N

Cl

CAL B

O

8

OH

OH

O

9

10 O LIP

Cl– N+

O

H N

O

O

( ) 10

N

HO

10

O

H N

Cl

()

O

( )

10

O 7

11

figura 13.3. Síntesis quimioenzimática de cloruro de lapirio.

De acuerdo a nuestra estrategia sintética (figura 13.3) el cloruro de lapirio se obtuvo en 4 pasos, tres de los cuales fueron enzimáticos. Los pasos enzimáticos fueron: dos esterificaciones: el primer paso donde se transforma ácido cloroacético (8) en cloroacetato de etilo (9) y el tercero en el que se acila el hidroxilo de N-hidroxietilamida 10 con ácido láurico para obtener 11. El segundo paso, la formación del grupo amida, es clave en todo el camino sintético porque en él la lipasa CAL B cataliza en forma completamente quimioselectiva la aminólisis del cloroacetato de etilo (9) por la hidroxietilamina. En este último compuesto la reactividad del grupo hidroxilo y el grupo amino son semejantes pero la catálisis enzimática permite discriminar entre ellos y solo reacciona el grupo amino quedando exclusivamente 10 como producto. El estudio de los parámetros involucrados en cada una de las tres reacciones enzimáticas permitió conocer las condiciones óptimas. Así CAL B se utilizó en el primer

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

328

paso y Lipozyme RM IM (lipasa de Rhizomucor miehei inmovilizada) y acetona como solvente en el segundo y tercer paso. Debido al comportamiento altamente quimioselectivo desarrollado por las lipasas se obtuvieron productos puros en las diferentes etapas, lográndose de esta manera evitar la mezcla de intermediarios que tiene lugar en la síntesis química tradicional. Esto permitió obtener fácilmente el cloruro de lapirio con alta pureza y rendimiento (Rustoy y Baldessari, 2005). La conjunción de las reacciones enzimáticas selectivas y limpias trae como consecuencia que el producto 7 no esté contaminado con clorhidrato de piridina como ocurre en la síntesis química tradicional. Así, una dispersión acuosa al 1% de cloruro de lapirio preparado enzimáticamente tiene pH de 5 a 6, mientras que una preparación similar efectuada por métodos tradicionales es ácida con pH entre 2,5 y 3,8. Esto resulta una gran ventaja ya que el cloruro de lapirio se aplica en formulaciones farmacéuticas de que no soportan un pH ácido. En resumen, el proceso quimioenzimático presenta una serie de ventajas desde el punto de vista operativo y comercial (Baldessari y Rustoy, 2005): – – – – – – –

Mejor pureza y mayor rendimiento del producto. Eliminación de reactivos tóxicos y sensibles a la humedad Reactivos y solventes menos contaminantes y más económicos Condiciones suaves de reacción. Catalizador enzimático biodegradable Catalizador enzimático insoluble en el medio de reacción, filtrable y reciclable Proceso menos riesgoso, menos contaminante y con menor consumo de energía.

13.3. síntesis enzimática de biOmateriales pOliméricOs En los últimos años se ha incrementado notablemente el uso de polímeros en aplicaciones biomédicas como por ejemplo en liberación controlada de medicamentos, en transferencia de genes, ingeniería de tejidos, etc. Estos biomateriales poliméricos deben cumplir los mismos requisitos que otros biomateriales como: biocompatibilidad, esterilizabilidad, propiedades físicas y mecánicas adecuadas y facilidad de manufactura. A pesar del enorme progreso logrado en las técnicas controladas de polimerización con el objeto de obtener macromoléculas de estructura bien definida, los procesos estadísticos producen polímeros con distribución amplia de peso molecular. Es por ello que ninguno de los métodos tradicionales de polimerización permite la síntesis de polímeros lineales como sistemas monodispersos con secuencias definidas de monómeros. Comparando con las secuencias definidas de los péptidos, el control de la secuencia de monómeros en la síntesis de polímeros sigue siendo uno de los mayores desafíos. Otro desafío consiste en lograr obtener estos biomateriales a través de procesos limpios ya que están íntimamente relacionados con la vida humana. En general los iniciadores en reacciones de polimerización a través de procesos tradicionales suelen involucrar reactivos tóxicos y en algunos casos muy sensibles a las condiciones de

Estrategias enzimáticas en síntesis de compuestos bioactivos y biomateriales

329

reacción. Además resulta dificultoso y hasta imposible que no queden atrapados en la estructura final del polímero por lo que es difícil asegurar la pureza del producto polimérico final. Por lo que hemos comentado en las secciones anteriores de este capítulo la Biocatálisis tiene un futuro muy promisorio en este campo.

13.3.1. Poliésteres hidrófilos Las polimerizaciones catalizadas por enzimas ofrecen una nueva estrategia para la obtención de polímeros de estructuras novedosas y de alta quimio- y estereoregularidad, siendo numerosos los ejemplos descriptos en literatura (Gross y Cheng, 2002). Entre ellos, está muy difundido el uso de lipasas en medio no acuoso para preparar poliésteres (Kobayashi y cols., 2006). En nuestro laboratorio hemos logrado resultados exitosos en la preparación de un poliéster polihidroxilado (12) de bajo peso molecular (figura 13.4). O

OH OH

+

HO

O OH

OH

CAL B

O

OH O

O

n O

figura 13.4. Síntesis enzimática de un poliéster polihidroxilado (12).

utilizando las propiedades regioselectivas de la lipasa de CAL B, a partir de ácido adípico y glicerol se pudo preparar un poliéster biodegradable de alta hidrofilicidad. Además de tener el hidroxilo secundario del glicerol libre, su estructura es regular y con muy baja polidispersión (Iglesias y cols., 1999). Estos materiales biodegradables e hidrófilos tienen aplicación en cultivo de tejidos (Khan y Sefton, 2011; Reis, 2008).

13.3.2 poliacrilamidas A través de la acción catalítica de la lipasa de Candida antarctica B fue posible sintetizar una serie co- y ter-polímeros acrílicos utilizando solamente acrilato de etilo como monómero en una polimerización en cadena (figura 13.5). R O

HOCH2CH2NH2 OEt

O

x

O

y

z

O O OH O NH

CAL B OH

figura 13.5. Síntesis enzimática de co- y terpolímeros acrílicos acrílicos (13).

330

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

La lipasa no solo catalizó la polimerización de acrilato de etilo para formar la cadena de poliacrilato, sino que también resultó activa en una reacción de aminólisis sobre los grupos éster pendientes usando etanolamina como nucléofilo y, en algunos casos, la hidrólisis del éster a ácido carboxílico. Como consecuencia de la triple acción desarrollada por la lipasa en presencia de acrilato de etilo y etanolamina, y dependiendo de la relación etanolamina:acrilato de etilo en la carga, fue posible obtener co- y ter-polímeros de poli(acrilato de etilo), poli(ácido acrílico) y poli(N-(2-hydroxietil)acrilamida) (13). El uso de métodos espectroscópicos permitió determinar, no solo el peso molecular de cada uno de los productos sino también la proporción relativa de carboxietilo, acido carboxílico e hidroxietilamida en los grupos pendientes de la cadena de acrilato (Rustoy y cols., 2007). Los productos mostraron bajo peso molecular y elevada monodispersión. Estos co- y terpolímeros de hidroxialquilacrilamidas, ácido acrílico y acrilato de alquilo, conocidos como poliacrilamidas hidrofóbicamente modificadas, resultan de gran interés por sus aplicaciones biomédicas (Jensen y cols., 2003). En particular son útiles como recubrimientos de las paredes internas de los implantes cardiovasculares, ya que activan el crecimiento de células epiteliales que evitan la adhesión de trombos sobre los implantes.

13.3.3. poliamidoaminas Los buenos resultados obtenidos en la síntesis enzimática de poliacrilamidas hidrofóbicamente suitituidas, nos animaron a estudiar el comportamiento enzimático en una polimerización usando acrilato de etilo como monómero y diaminas en vez de hidroxialquilaminas. Supusimos que se obtendrían poliacrilamidas con grupos pendientes amino en vez de hidroxilo. Pero en presencia de la diamina N-metil-1,3-diaminopropano la lipasa CAL B no catalizó la formación de una cadena acrílica sino que se obtuvo una poliamidoamina (14) como producto de la polimerización enzimática (figura 13.6.) O O

CH3NHCH2CH2NH2 OEt

CAL B

N O NH

n

figura 13.6. Síntesis enzimática de una poliamidoamina (14).

El producto 14 presenta elevada monodispersión y lo que es más interesante una disposición regular y bien definida a lo largo de la cadena macromolecular con una unidad repetitiva novedosa conteniendo solo una función amida. La catálisis enzimática es altamente selectiva, primero CAL B cataliza la síntesis del monómero acrilamida y luego en un segundo paso esta se polimeriza a través de una adición de Michael también catalizada enzimáticamente.

Estrategias enzimáticas en síntesis de compuestos bioactivos y biomateriales

331

Es interesante destacar que todos los biomateriales sintetizados son productos novedosos y las reacciones enzimáticas de polimerización descriptas fueron informadas por primera vez generando nuevos caminos para las síntesis de polímeros. Entre las ventajas presentadas por la aplicación de enzimas en síntesis de polímeros podemos señalar: las condiciones suaves de reacción, la fácil manipulación de los biocatalizadores y el bajo impacto ambiental. Las poliamidoaminas (PAAs) presentan interesantes aplicaciones biomédicas (ferruti y cols., 2002). Estos polímeros no son tóxicos, y como pseudopéptidos catiónicos las PAAs combinan enlaces peptídicos (grupos amida) con grupos amina en el esqueleto, lo que les confiere buena biodegradabilidad. Además presentan excelente biocompatibilidad y baja cito- y hematoxicidad (Dey y Ray, 2003). La ventaja clave de las PAAs comparadas con los péptidos es la ausencia de inmunogenicidad, de ahí su uso creciente en el campo de transfección de genes e ingeniería de tejidos y transportadores en liberación controlada de medicamentos (ferruti y cols., 2007).

13.4. cOnclusión En el presente capítulo analizamos la aplicación de lipasas en la fabricación de productos que utilizamos en nuestra vida diaria. En particular hemos estudiado dos casos de producción de medicamentos donde el uso de lipasas facilitó notablemente el proceso al permitir llevarlo a cabo en condiciones más favorables para el medio ambiente. Además se ha descripto la preparación de biomateriales poliméricos de variada estructura y función, como poliésteres, poliacrilamidas y poliamidoaminas, pero todos ellos relacionadas con la salud humana. Todas las características que hemos presentado manifiestan la utilidad de estos biocatalizadores como alternativa sintética en el desarrollo de procesos que no solo rindan beneficios económicos sino también colaboren en la realización de una existencia mejor en un mundo menos contaminado.

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ÚLTIMOS TÍTULOS PUBLICADOS 21 International Studbook Gazella Dama Mhorr. Andrés Barbosa y Gerardo Espeso.

23 Las lecciones de la catástrofe del Prestige. Antonio Figueras, Emilio Lora-Tamayo D´Ocón, Joaquín Tintoré, Fiz F. Pérez, J. Albaigés, Francisco Sánchez, M. Anxo Murado García, Emilio Esteban Rodríguez Merino y Ramón Hernán Paadín. 24 Depuración de aguas residuales: modelización de procesos de lodos activos. Manuel Gil Rodríguez. 25 New acoustics. Selected topisc II. Francisco Montero de Espinosa Freijo, Carlos Ranz-Guerra y Jaime Pfretzschner (eds.). 26 Biología y cultivo del mejillón (Mytilus Galloprovincialis) en Galicia. Antonio Figueras Huerta. 27 Prácticas de tratamiento estadístico de datos con el programa SPSS para Windows. Aplicaciones en el Área de Ciencia y Tecnología de Alimentos. Pedro J. Martín Álvarez. 28 Ecología acuática y sociedad de las Lagunas de Ruidera – Aquatic ecology and society of Ruidera Lakes (Central Spain). Miguel Álvarez Cobelas, Santos Cirujano Bracamonte, Esperanza Montero González, Carmen Rojo García Morato, María Antonia Rodrigo Alacreu, Elisa Piña Ochoa, Juan Carlos Rodríguez Murillo, Óscar Soriano Hernando, Marina Aboal Sanjurjo, José Pedro Marín Murcia y Rafael Araujo Armero. 29 El protocolo de Kyoto y su impacto en las empresas españolas. Félix Hernández Álvarez y Pablo del Río González.

Ante la creciente evidencia de que la ingesta de compuestos bioactivos —también denominados ingredientes funcionales o nutracéuticos— puede reducir el riesgo de enfermar e incluso ser parte de la cura de diversas afecciones, su demanda mundial se ha incrementado. Existe, en consecuencia, un gran interés en la preparación y modificación de compuestos bioactivos mediante tecnologías compatibles con la industria alimentaria. En este contexto, la tecnología enzimática aporta la ventaja de que funciona en condiciones suaves, evita la formación de productos secundarios y está ampliamente aceptada en las legislaciones correspondientes como coadyuvantes de procesos. En este libro se presentan varios ejemplos de cómo se aplica la biotecnología enzimática a la obtención sostenible de ingredientes funcionales, o a su modificación para mejorar su biodisponibilidad, solubilidad, etc. Como parte de la sostenibilidad, se plantea el aprovechamiento de recursos naturales iberoamericanos poco explotados y especialmente de sus residuos. Igualmente se ilustra la producción y estabilización de enzimas útiles para este fin. Los trabajos recopilados en este libro proceden de reconocidos investigadores iberoamericanos, miembros de la Red ENZNUT, del Programa Iberoamericano del Ciencia y Tecnología (CYTED).

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

22 Landscapes as cultural heritage in the European research, Proceedings of the Open Workshop Madrid, 29 th October 2004. María Ruiz del Árbol y Almudena Orejas (eds.).

Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos

30 Corrosión en las estructuras de hormigón armado: fundamentos, medida, diagnosis y prevención. José Antonio González Fernández y Juana Miranda Vidales. 31 Histofisiología de moluscos bivalvos marinos. Eduardo Cargnin-Ferreira y Carmen Sarasquete Reiriz.

Francisco José Plou Gasca Georgina Coral Sandoval Fabián

32 Estudio de los suelos del Campo de Calatrava (Ciudad Real) y sus condiciones de fertilidad. José Luis de la Horra Ruiz, Francisco Sarrano Comino y Juan José Calevaris Muñiz. 33 Estudios etnobotánicos en Campoo (Cantabria). Conocimiento y uso tradicional de plantas. Manuel Pardo de Santayana. 34 Comunicación y ciencia médica. Investigar con animales para curar a personas. Enrique Sueiro. 35 Plantas y sabiduría popular del Parque Natural de Montesinho. Un estudio etnobotánico en Portugal. Ana Maria Carvalho. 36 Microtecnología: diario de un proceso. Fabricación de un microacelerómetro. María Cruz Acero, Jaume Esteve, José Antonio Plaza y Emilio Lora-Tamayo. 37 Protagonistas de la química en España: los orígenes de la catálisis. Pedro Bosch Giral, Juan Francisco García de la Banda, Joaquín Pérez Pariente y Manoel Toural Quiroga.

Francisco José Plou Gasca Georgina Coral Sandoval Fabián

ISBN 978-84-00-09568-0

38 Spectroscopy of the Atmospheres. Rafael Escribano e Isabel Tanarro (eds.). 39 Técnicas de análisis y caracterización de materiales (2.ª ed.). Marisol Faraldos y Consuelo Goberna.

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788400 095680

CSIC

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

Francisco José Plou Gasca es investigador científico del CSIC y profesor honorario de la Universidad Autónoma de Madrid. Estudió Ciencias Químicas en la Universidad de Zaragoza y realizó la tesis doctoral en el Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del CSIC bajo la dirección del doctor Antonio Ballesteros. Es especialista en biotransformaciones catalizadas por enzimas inmovilizadas, con aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica y de biocombustibles. Ha realizado diversas estancias en la Universidad de Londres. Es profesor del Máster de Biotecnología de la UAM y vocal de la Junta de la Sociedad Española de Catálisis. Ha participado en un trabajo galardonado con el Premio Europeo de Tecnología Enzimática A-IQS y en una patente que obtuvo el Primer Premio Madri+d 2008 a las mejores patentes. Una de sus publicaciones [con A. Kunamneni, A. Ballesteros y M. Alcalde, «Laccases and their applications: a patent review». Recent Patents on Biotechnology, 2, 10-24 (2008)] recibió en 2012 el premio al artículo más descargado del repositorio institucional Digital CSIC. Georgina Coral Sandoval Fabián es investigadora titular en la Unidad de Biotecnología Industrial del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), perteneciente al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, México). Obtuvo su doctorado en Biología, Salud y Biotecnología lo en el Instituto Nacional de Ciencias Aplicadas de Toulouse, Francia, en 2002. Desde entonces ha trabajado en el CIATEJ, abriendo una nueva línea de investigación en biocatálisis industrial, orientada a los campos de nutracéuticos, biocombustibles y nanomateriales, entre otros. En lo que respecta a aplicaciones en alimentos, sus líneas de investigación se centran en la utilización de enzimas para obtener ingredientes funcionales como lípidos bioactivos, antioxidantes y prebióticos. Coordinó la Red ENZNUT del Programa Iberoamericano del Ciencia y Tecnología (CYTED), entre cuyos grupos participantes se encontraba el Laboratorio de Biocatálisis Aplicada del ICP-CSIC, con el que se ha editado este libro.