133 55 23MB
English Pages 337 [325] Year 2023
Advances in Experimental Medicine and Biology 1423
Panagiotis Vlamos Editor
GeNeDis 2022
Molecular, Chemical, and Cellular Biology
Advances in Experimental Medicine and Biology Volume 1423 Series Editors Wim E. Crusio, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d’Aquitaine, CNRS and University of Bordeaux, Pessac Cedex, France Haidong Dong, Departments of Urology and Immunology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA Heinfried H. Radeke, Institute of Pharmacology and Toxicology, Clinic of the Goethe University Frankfurt Main, Frankfurt am Main, Hessen, Germany Nima Rezaei , Research Center for Immunodeficiencies, Children’s Medical Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Ortrud Steinlein, Institute of Human Genetics, LMU University Hospital, Munich, Germany Junjie Xiao, Cardiac Regeneration and Ageing Lab, Institute of Cardiovascular Sciences, School of Life Science, Shanghai University, Shanghai, China
Advances in Experimental Medicine and Biology provides a platform for scientific contributions in the main disciplines of the biomedicine and the life sciences. This series publishes thematic volumes on contemporary research in the areas of microbiology, immunology, neurosciences, biochemistry, biomedical engineering, genetics, physiology, and cancer research. Covering emerging topics and techniques in basic and clinical science, it brings together clinicians and researchers from various fields. Advances in Experimental Medicine and Biology has been publishing exceptional works in the field for over 40 years, and is indexed in SCOPUS, Medline (PubMed), EMBASE, BIOSIS, Reaxys, EMBiology, the Chemical Abstracts Service (CAS), and Pathway Studio. 2021 Impact Factor: 3.650 (no longer indexed in SCIE as of 2022)
Panagiotis Vlamos Editor
GeNeDis 2022 Molecular, Chemical, and Cellular Biology
Editor Panagiotis Vlamos Department of Informatics Ionian University Corfu, Greece
ISSN 0065-2598 ISSN 2214-8019 (electronic) Advances in Experimental Medicine and Biology ISBN 978-3-031-31977-8 ISBN 978-3-031-31978-5 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-3-031-31978-5 © The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed. The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use. The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. This Springer imprint is published by the registered company Springer Nature Switzerland AG The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland
To Ada, who gave me the chance to embrace the joys of maturity, the spirit of teenage adventure, and the wonder of childhood, simultaneously.
Acknowledgements
I would like to thank Konstantina Skolariki for her invaluable assistance in editing and compiling the conference proceedings. Her contribution, dedication, and attention to detail have been instrumental in the success of our conference.
vii
Contents
1 S etting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases�������������������������������������������������������� 1 Dionysios Cheirdaris, Marios G. Krokidis, Marianne Kasti, Aristidis G. Vrahatis, Themistoklis Exarchos, and Panagiotis Vlamos 1.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 1 1.2 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 2 1.2.1 Preparing and Mounting the Sample���������������������������� 2 1.2.2 Setting Up the AFM Spectroscope�������������������������������� 3 1.2.3 Aligning, Mirror Adjustment, Automatic Approach, Calibrating�������������������������������������������������� 3 1.2.4 Choosing the Experiment-Setting Force Spectroscopy Parameters���������������������������������������������� 7 1.2.5 Summary ���������������������������������������������������������������������� 8 References������������������������������������������������������������������������������������������ 10 2 S tructural Connectivity Changes After Fornix Transection in Macaques Using Probabilistic Diffusion Tractography ���������� 11 Vassilis Pelekanos, Elsie Premereur, and Anna S. Mitchell 2.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 12 2.2 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 12 2.2.1 Subjects ������������������������������������������������������������������������ 12 2.2.2 Experimental Design and Rationale����������������������������� 13 2.2.3 Imaging Data Acquisition �������������������������������������������� 13 2.2.4 Regions of Interest�������������������������������������������������������� 13 2.2.5 Data Pre-processing������������������������������������������������������ 16 2.2.6 Probabilistic Tractography�������������������������������������������� 16 2.2.7 Statistical Analysis�������������������������������������������������������� 16 2.2.8 Fornix Transection�������������������������������������������������������� 17 2.3 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 17 2.4 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 18 References������������������������������������������������������������������������������������������ 18
ix
x
3 D etection and Quantification of Exhaled Breath Condensate and Dyspnea Correlation in Stable COPD: A Proof-of-Concept Study������������������������������������������������� 21 S. Patsiris, N. Vaitsis, I. Nasoula, T. Exarchos, and P. Vlamos 3.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 22 3.2 Material and Methods �������������������������������������������������������������� 22 3.2.1 Subjects ������������������������������������������������������������������������ 22 3.2.2 Ethics���������������������������������������������������������������������������� 23 3.2.3 Setting �������������������������������������������������������������������������� 23 3.2.4 Procedure���������������������������������������������������������������������� 23 3.2.5 Outcome Measurements����������������������������������������������� 24 3.3 Statistical Analysis�������������������������������������������������������������������� 26 3.4 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 26 3.5 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 26 References������������������������������������������������������������������������������������������ 29 4 P rotein Structure Prediction for Disease-Related Insertions/Deletions in Presenilin 1 Gene�������������������������������������� 31 Antigoni Avramouli, Marios G. Krokidis, Themis P. Exarchos, and Panagiotis Vlamos 4.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 31 4.2 Related Work���������������������������������������������������������������������������� 33 4.3 Data Collection ������������������������������������������������������������������������ 33 4.4 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 34 4.5 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 35 4.6 Conclusion�������������������������������������������������������������������������������� 39 References������������������������������������������������������������������������������������������ 39 5 A n Updated Evolutionary and Structural Study of TBK1 Reveals Highly Conserved Motifs as Potential Pharmacological Targets in Neurodegenerative Diseases������������ 41 Louis Papageorgiou, Eleni Mangana, Eleni Papakonstantinou, Io Diakou, Katerina Pierouli, Konstantina Dragoumani, Flora Bacopoulou, George P. Chrousos, Themis P. Exarchos, Panagiotis Vlamos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 5.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 42 5.2 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 44 5.2.1 Dataset Collection and Filtering ���������������������������������� 44 5.2.2 Multiple Sequence Alignment, Conserved Motifs, and Phylogenetic Analysis ������������������������������ 45 5.2.3 Single Nucleotide Polymorphisms, Variants, and Mutation Analysis�������������������������������������������������� 45 5.2.4 Structural Analysis�������������������������������������������������������� 45 5.3 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 46 5.3.1 Dataset�������������������������������������������������������������������������� 46 5.3.2 Multiple Sequence Alignment and Conserved Motifs �������������������������������������������������� 46 5.3.3 Phylogenetic Analysis�������������������������������������������������� 48
Contents
Contents
xi
5.3.4 Single Nucleotide Polymorphisms, Variants, and Mutation Analysis�������������������������������������������������� 49 5.3.5 Structural Analysis�������������������������������������������������������� 51 5.4 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 54 References������������������������������������������������������������������������������������������ 54 6 S emantic and Population Analysis of the Genetic Targets Related to COVID-19 and Its Association with Genes and Diseases�������������������������������������������������������������������������������������� 59 Louis Papageorgiou, Eleni Papakonstantinou, Io Diakou, Katerina Pierouli, Konstantina Dragoumani, Flora Bacopoulou, George P. Chrousos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 6.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 60 6.2 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 62 6.2.1 Dataset Collection and Filtering ���������������������������������� 62 6.2.2 COVID-19-Related SNPs �������������������������������������������� 62 6.2.3 Data Mining and Semantics Analysis �������������������������� 62 6.2.4 Population Analysis������������������������������������������������������ 63 6.3 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 63 6.3.1 COVID-19-Related Key Terms and SNPs�������������������� 63 6.3.2 Genomic Grammar������������������������������������������������������� 64 6.3.3 Disease Ontologies������������������������������������������������������� 66 6.3.4 Population Analysis������������������������������������������������������ 68 6.4 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 71 References������������������������������������������������������������������������������������������ 72 7 A DRA2B and HTR1A: An Updated Study of the Biogenic Amine Receptors Reveals Novel Conserved Motifs Which Play Key Role in Mental Disorders������������������������������������ 79 Louis Papageorgiou, Evangelia Christou, Effrosyni Louka, Eleni Papakonstantinou, Io Diakou, Katerina Pierouli, Konstantina Dragoumani, Flora Bacopoulou, George P. Chrousos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 7.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 80 7.2 Methods������������������������������������������������������������������������������������ 85 7.2.1 Database Sequence Search�������������������������������������������� 85 7.2.2 Genetic and Evolutionary Analyses������������������������������ 85 7.2.3 Specific Conserved Motif Extraction���������������������������� 85 7.2.4 Molecular Modeling of the 5-HTR1A Intracellular Domain ���������������������������������������������������� 85 7.2.5 Structural Comparison�������������������������������������������������� 86 7.3 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 86 7.3.1 Dataset and Multiple Sequence Alignment������������������ 86 7.3.2 The Conserved Signaling Motifs of the GPCRs ���������� 88 7.3.3 Phylogenetic Analysis�������������������������������������������������� 91 7.3.4 Molecular Modeling of the HTR1A Intracellular Domain ���������������������������������������������������� 91
Contents
xii
7.4 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 92 7.4.1 Structural and Functional Description of ADRA2B and HTR1A���������������������������������������������� 92 7.4.2 Description of the 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A Intracellular Domain Model�������������������� 94 7.5 Conclusion�������������������������������������������������������������������������������� 96 References������������������������������������������������������������������������������������������ 96 8 A Genomic Study of the Japanese Population Focusing on the Glucocorticoid Receptor Interactome Highlights Distinct Genetic Characteristics Associated with Stress Response������������������������������������������������������������������������ 101 Thanasis Mitsis, Louis Papageorgiou, Eleni Papakonstantinou, Io Diakou, Katerina Pierouli, Konstantina Dragoumani, Flora Bacopoulou, Tomoshige Kino, George P. Chrousos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 8.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 102 8.2 Materials and Methods�������������������������������������������������������������� 105 8.2.1 The Dataset ������������������������������������������������������������������ 105 8.3 Identification of Target Genes�������������������������������������������������� 106 8.4 SNPs Filtering, Annotation, and Analysis�������������������������������� 106 8.5 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 107 8.6 Discussion �������������������������������������������������������������������������������� 108 References������������������������������������������������������������������������������������������ 111 9 S creening of Phyllanthus niruri Leaves Phytoconstituents for Antiviral and Antibacterial Activity by Molecular Docking Studies�������������������������������������������������������������������������������� 115 Panjugula Manisha, Kusampudi Preethi Alekhya, Avulapati Tejaswini, Konda Swathi, and K. Venkat Sai 9.1 Introduction������������������������������������������������������������������������������ 116 9.2 Molecular Docking ������������������������������������������������������������������ 116 9.2.1 Scrodinger �������������������������������������������������������������������� 116 9.3 Results�������������������������������������������������������������������������������������� 117 9.3.1 Ligand Interaction�������������������������������������������������������� 117 9.4 Results and Discussion ������������������������������������������������������������ 118 9.4.1 Molecular Docking (Schrodinger)�������������������������������� 118 9.5 Conclusion�������������������������������������������������������������������������������� 121 References������������������������������������������������������������������������������������������ 122 10 S creening of Phyllanthus niruri Plant Active Constituents for Anticancer and Antifungal Activity by Insilico Methods ������ 123 Avulapati Tejaswini, Kusampudi Preethi Alekhya, Panjugula Manisha, Patnam Nageswari, and Konda Swathi 10.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 124 10.2 Molecular Docking ���������������������������������������������������������������� 124 10.2.1 Schrodinger ���������������������������������������������������������������� 124 10.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 125 10.4 Ligand Interaction������������������������������������������������������������������ 125
Contents
xiii
10.5 Molecular Docking (Schrodinger)������������������������������������������ 125 10.5.1 Anticancer Activity ���������������������������������������������������� 126 10.5.2 Antifungal Activity ���������������������������������������������������� 129 10.6 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 131 References������������������������������������������������������������������������������������������ 131 11 S creening of Phyllanthus niruri Root Phytoconstituents for Antibacterial, Antifungal, Anticancer, and Antiviral Activities by Molecular Docking Studies �������������������������������������� 133 Kusampudi Preethi Alekhya, Panjugula Manisha, Avulapati Tejaswini, Patnam Nageswari, and Konda Swathi 11.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 134 11.2 Experimental Method�������������������������������������������������������������� 135 11.2.1 Molecular Docking ���������������������������������������������������� 135 11.3 Results and Discussion ���������������������������������������������������������� 137 11.3.1 Molecular Docking (Schrodinger)������������������������������ 137 11.4 Antiviral Activity�������������������������������������������������������������������� 137 11.5 Antibacterial Activity�������������������������������������������������������������� 138 11.6 Antifungal Activity ���������������������������������������������������������������� 140 11.7 Anticancer ������������������������������������������������������������������������������ 143 11.8 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 145 References������������������������������������������������������������������������������������������ 146 12 O mics Analyses in a Neural Stem Cell Model of Familial Parkinson’s Disease�������������������������������������������������������������������������� 149 Sofia Notopoulou, Ioannis Gkekas, and Spyros Petrakis 12.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 149 12.2 Materials and Methods������������������������������������������������������������ 150 12.2.1 Construction of Tet-On Sleeping Beauty Transposon Plasmids�������������������������������������������������� 150 12.2.2 Culture of Small-Molecule Neural Precursor Cells (smNPCs)���������������������������������������������������������� 151 12.2.3 Generation of Tet-On EYFP-SNCA A53T smNPCs���������������������������������������������������������������������� 151 12.2.4 Immunofluorescence �������������������������������������������������� 151 12.2.5 Immunoblotting���������������������������������������������������������� 151 12.2.6 Mass Spectrometry Analysis�������������������������������������� 151 12.2.7 Network Modeling������������������������������������������������������ 152 12.2.8 Protein Abundance and Enrichment Analysis������������ 152 12.2.9 Prediction of Network Regulators������������������������������ 152 12.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 153 12.3.1 Generation of Tet-on EYFP-SNCA A53T smNPCs���������������������������������������������������������������������� 153 12.3.2 A Proteomics Analysis Indicates Reversed Patterns in PD-Like Versus Control smNPCs ������������ 153 12.3.3 Enrichment Analysis Reveals Critically Affected Biological Pathways and Potential Kinases�������������������������������������������������� 153 12.4 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 155 References������������������������������������������������������������������������������������������ 158
xiv
13 S creening of Spirulina Components for Anti-Parkinson’s and Anti-Alzheimer’s Activity by in Silico Methods and Docking Studies������������������������������������������������������������������������ 161 Lavanya Sara, Ravooru Thanmayee, Perabathina Venkata Satyakavya, Tejaswini Avulapati, and Konda Swathi 13.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 162 13.2 Materials and Methods������������������������������������������������������������ 163 13.2.1 Molecular Docking (AutoDock) �������������������������������� 164 13.3 Results and Discussion ���������������������������������������������������������� 165 13.4 Boiled Egg Representation ���������������������������������������������������� 165 13.4.1 Molecular Docking (AutoDock) �������������������������������� 168 13.5 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 174 References������������������������������������������������������������������������������������������ 174 14 A ngiotensinogen, Angiotensin-Converting Enzyme, and Chymase Gene Polymorphisms as Biomarkers for Basal Cell Carcinoma Susceptibility���������������������������������������� 175 Christos Yapijakis, Iphigenia Gintoni, Sevastiana Charalampidou, Antonia Angelopoulou, Veronica Papakosta, Stavros Vassiliou, and George P. Chrousos 14.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 176 14.2 Methods���������������������������������������������������������������������������������� 177 14.2.1 Ethics Statement��������������������������������������������������������� 177 14.2.2 Subjects ���������������������������������������������������������������������� 177 14.2.3 Genotyping������������������������������������������������������������������ 177 14.2.4 Statistical Analysis������������������������������������������������������ 178 14.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 178 14.4 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 178 References������������������������������������������������������������������������������������������ 180 15 C linical and Molecular Genetic Analysis of Cases with Ectodermal Dysplasia���������������������������������������������� 181 Christos Yapijakis, Anna Douka, Iphigenia Gintoni, Konstantinos Agiannitopoulos, Dimitrios Vlachakis, and George P. Chrousos 15.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 182 15.2 Subjects and Methods ������������������������������������������������������������ 182 15.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 183 15.4 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 185 References������������������������������������������������������������������������������������������ 186 16 T he Impact of Genetic Variability of TGF-Beta Signaling Biomarkers in Major Craniofacial Syndromes���������������������������� 187 Christos Yapijakis, Sofianna Davaria, Iphigenia Gintoni, and George P. Chrousos 16.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 188 16.2 Transforming Growth Factor-Beta (TGF-β) �������������������������� 188 16.3 TGF-β in Craniofacial Development�������������������������������������� 189
Contents
Contents
xv
16.4 Genetic Variability of the TGF-β Genes in Craniofacial Syndromes������������������������������������������������������ 189 16.5 Clefts of the Lip and Palate���������������������������������������������������� 189 16.6 Tooth Agenesis������������������������������������������������������������������������ 190 16.7 Loeys-Dietz Syndrome ���������������������������������������������������������� 190 16.8 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 190 References������������������������������������������������������������������������������������������ 191 17 C ognitive Rehabilitation for Patients with Schizophrenia: A Narrative Review of Moderating Factors, Strategies, and Outcomes ���������������������������������������������������������������������������������� 193 Maria Skokou, Lambros Messinis, Grigorios Nasios, Philippos Gourzis, and Euthymios Dardiotis 17.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 194 17.2 Method������������������������������������������������������������������������������������ 194 17.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 194 17.3.1 Genetics���������������������������������������������������������������������� 195 17.3.2 Symptoms ������������������������������������������������������������������ 195 17.3.3 Pharmaceutical Agents Enhancing or Inhibiting Cognitive Function and Recovery������������������������������ 195 17.3.4 Other Factors Related to the Patient �������������������������� 195 17.3.5 Cognitive Rehabilitation Techniques�������������������������� 195 17.4 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 197 References������������������������������������������������������������������������������������������ 197 18 C omputational and Functional Insights of Protein Misfolding in Neurodegeneration �������������������������������������������������� 201 Marios G. Krokidis, Themis P. Exarchos, Antigoni Avramouli, Aristidis G. Vrahatis, and Panagiotis Vlamos 18.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 201 18.2 Protein Misfolding and Neurodegenerative Diseases ������������ 202 18.3 Experimental Approaches for Protein Structure Analysis and Folding�������������������������������������������������������������� 202 18.4 Computational Approaches and Protein Folding�������������������� 203 18.5 In Silico Methods�������������������������������������������������������������������� 204 18.6 Monte Carlo Simulations�������������������������������������������������������� 204 18.7 Hydrophobic Collapse and Diffusion-Collision Models�������� 204 18.8 Protein Folding Models���������������������������������������������������������� 205 18.9 Conclusions���������������������������������������������������������������������������� 206 References������������������������������������������������������������������������������������������ 206 19 I dentifying Network Biomarkers for Alzheimer’s Disease Using Single-Cell RNA Sequencing Data�������������������������������������� 207 Ioannis Aslanis, Marios G. Krokidis, Georgios N. Dimitrakopoulos, and Aristidis G. Vrahatis 19.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 207 19.2 Related Work�������������������������������������������������������������������������� 209 19.3 Methods���������������������������������������������������������������������������������� 210 19.4 Experimental Results�������������������������������������������������������������� 211
Contents
xvi
19.5 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 212 References������������������������������������������������������������������������������������������ 212 20 A Consensus Gene Regulatory Network for Neurodegenerative Diseases Using Single-Cell RNA-Seq Data�������������������������������������������������������������� 215 Dimitrios E. Koumadorakis, Marios G. Krokidis, Georgios N. Dimitrakopoulos, and Aristidis G. Vrahatis 20.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 215 20.2 Methods���������������������������������������������������������������������������������� 217 20.2.1 Algorithms Overview�������������������������������������������������� 217 20.2.2 Construction of the Consensus Network�������������������� 218 20.3 Experimental Analysis������������������������������������������������������������ 219 20.3.1 Consensus-GRN Algorithm Comparison�������������������� 219 20.3.2 Algorithm Overlaps���������������������������������������������������� 220 20.3.3 Subnetworks and Key Regulators ������������������������������ 220 20.4 Conclusions���������������������������������������������������������������������������� 221 References������������������������������������������������������������������������������������������ 222 21 S patial Organization of Gene Expression in Systems of Cellular Differentiation and Autoimmune Diseases ���������������� 225 Kyrgos Themistoklis and Nikolaou Christoforos 21.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 225 21.1.1 Genome Organization ������������������������������������������������ 225 21.1.2 TCF3/TCF7L1 and Its Role in Development ������������ 226 21.1.3 Previous Work������������������������������������������������������������ 226 21.2 Data and Methods ������������������������������������������������������������������ 226 21.2.1 Data ���������������������������������������������������������������������������� 226 21.2.2 Methods���������������������������������������������������������������������� 226 21.3 Results������������������������������������������������������������������������������������ 227 21.3.1 Clusters ���������������������������������������������������������������������� 227 21.3.2 Domains of Focal Deregulation���������������������������������� 229 21.3.3 Functional-Topological Networks������������������������������ 230 21.4 Discussion ������������������������������������������������������������������������������ 231 References������������������������������������������������������������������������������������������ 232 22 H uman Breast Milk Omics and Neurodevelopment�������������������� 235 Eleni Papakonstantinou, Panagiotis Vlamos, Flora Bacopoulou, George P. Chrousos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 23 I nsilico Screening of Pentacyclic Triterpenoids against Vascular Dementia Target’s������������������������������������������������������������ 237 Rathna Roja, Shanker Kalakotla, Arun Reddy Ravula, Hemanth Kumar Boyina, S. K. Navanita, Pillalamarri Bala Sri Vallika, Kiran Gangarapu, Krishna Prasad Devarakonda, and Vasudha Bakshi 23.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 237 23.2 Materials and Methods������������������������������������������������������������ 238 23.3 Results and Discussion ���������������������������������������������������������� 238 References������������������������������������������������������������������������������������������ 243
Contents
xvii
24 E ndosymbiosis in Nature and the Gut-Brain Axis������������������������ 245 Eleni Papakonstantinou, Konstantina Dragoumani, Flora Bacopoulou, George P. Chrousos, Elias Eliopoulos, and Dimitrios Vlachakis 24.1 Primary Endosymbiosis���������������������������������������������������������� 246 24.2 Secondary Endosymbiosis������������������������������������������������������ 247 24.3 Tertiary Endosymbiosis���������������������������������������������������������� 248 24.4 Gut-Brain Axis������������������������������������������������������������������������ 248 References������������������������������������������������������������������������������������������ 249 25 E ffective Preprocessing of Single-Cell RNA-Seq for Unravelling Alzheimer’s Disease Signatures �������������������������� 251 Apollon Zoiros and Aristidis Vrahatis 25.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 251 25.2 Framework Design������������������������������������������������������������������ 252 25.3 Preprocessing Methodology���������������������������������������������������� 253 25.4 Integrated Analysis and Results���������������������������������������������� 255 References������������������������������������������������������������������������������������������ 256 26 M olecular Docking Studies of Phyllanthus niruri Root Phytoconstituents for Antibreast Cancer Activity Using Multiple Proteins������������������������������������������������������������������������������ 257 Preethi Alekhya Kusampudi, Ajay Verma, Puchakayala Mounika, Pendlimarri Sreelatha, and Konda Swathi 26.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 257 26.2 Experimental Method�������������������������������������������������������������� 258 26.2.1 Molecular Docking ���������������������������������������������������� 258 26.2.2 Ligand Docking���������������������������������������������������������� 260 26.3 Results and Discussion ���������������������������������������������������������� 264 26.3.1 Molecular Docking (Schrodinger)������������������������������ 264 26.3.2 Prediction of Interacting Amino Acid Residues with Proteins������������������������������������������������ 269 26.4 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 270 References������������������������������������������������������������������������������������������ 270 27 R epurposing Marketed Drugs as Antidepressants with In Silico, In Vivo, and In Vitro Screening Methods�������������� 271 Palupanuri Naveena, K. K. Usha, Meeniga Swetha, Menta Hemalatha, and Konda Swathi 27.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 271 27.2 Materials and Methods������������������������������������������������������������ 272 27.3 Experimental Methodology���������������������������������������������������� 272 27.4 Experimental Results and Discussion������������������������������������ 273 27.5 Conclusion������������������������������������������������������������������������������ 278 References������������������������������������������������������������������������������������������ 278
xviii
28 I nfections, Vaccinations, and Risk of Alzheimer’s Disease (AD)/Dementia: Probable Involvement of Reactivated Herpes Simplex Virus Type 1�������������������������������� 279 Ruth F. Itzhaki References������������������������������������������������������������������������������������������ 280 29 L ipid Profiling in Alzheimer’s Disease ������������������������������������������ 281 Cristina Zivko, Ram Sagar, Ariadni Xydia, and Vasiliki Mahairaki 29.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 281 29.2 Lipids in the Brain������������������������������������������������������������������ 282 29.2.1 Structural Components����������������������������������������������� 282 29.2.2 Lipid Signaling ���������������������������������������������������������� 283 29.3 Lipid Alterations in AD���������������������������������������������������������� 283 29.4 Conclusive Remarks and Future Perspectives������������������������ 284 References������������������������������������������������������������������������������������������ 285 30 P athological Roles of INPP5D in Alzheimer’s Disease ���������������� 289 Yung Ning Chu, Aika Akahori, Sho Takatori, and Taisuke Tomita 30.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 289 30.2 Microglia and Alzheimer’s Disease���������������������������������������� 290 30.2.1 Beneficial and Adverse Roles of Microglia in Alzheimer’s Disease Pathogenesis�������������������������� 290 30.2.2 Genetic Links Between Microglia and Alzheimer’s Disease �������������������������������������������� 291 30.2.3 TREM2 and Alzheimer’s Disease������������������������������ 291 30.3 Physiological and Pathological Roles of INPP5D������������������ 292 30.3.1 Genetic Link Between INPP5D and Alzheimer’s Disease �������������������������������������������� 292 30.3.2 Physiological Functions of INPP5D �������������������������� 292 30.3.3 Experimental Evidence of INPP5D in the Pathogenesis of Alzheimer’s Disease���������������� 294 30.4 Concluding Remarks�������������������������������������������������������������� 296 References������������������������������������������������������������������������������������������ 297 31 C hronic Stress, Depression, and Alzheimer’s Disease: The Triangle of Oblivion ���������������������������������������������������������������� 303 Chrysoula Dioli, Georgia Papadimitriou, Anastasia Megalokonomou, Carlos Marques, Nuno Sousa, and Ioannis Sotiropoulos 31.1 Introduction���������������������������������������������������������������������������� 303 31.2 Conclusions���������������������������������������������������������������������������� 310 References������������������������������������������������������������������������������������������ 310 Index���������������������������������������������������������������������������������������������������������� 317
Contents
1
Setting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases Dionysios Cheirdaris, Marios G. Krokidis, Marianne Kasti, Aristidis G. Vrahatis, Themistoklis Exarchos, and Panagiotis Vlamos
Abstract
Keywords
The clinical pathology of neurodegenerative diseases suggests that earlier onset and progression are related to the accumulation of protein aggregates due to misfolding. A prominent way to extract useful information regarding single-molecule studies of protein misfolding at the nanoscale is by capturing the unbinding molecular forces through forced mechanical tension generated and monitored by an atomic force microscopy-based single- molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). This AFM-driven process results in an amount of data in the form of force versus molecular extension plots (force-distance curves), the statistical analysis of which can provide insights into the underlying energy landscape and assess a number of characteristic elastic and kinetic molecular parameters of the investigated sample. This chapter outlines the setup of a bio-AFM-based SMFS technique for single- molecule probing. The infrastructure used as a reference for this presentation is the Bruker ForceRobot300.
Atomic force microscopy · Single molecule force spectroscopy · Protein probing · Force-distance curves
D. Cheirdaris (*) · M. G. Krokidis · M. Kasti · A. G. Vrahatis · T. Exarchos · P. Vlamos Bioinformatics and Human Electrophysiology Laboratory, Department of Informatics, Ionian University, Corfu, Greece
1.1 Introduction According to histopathological findings with respect to neurodegenerative diseases, a common feature across these diseases, a hallmark of neurodegeneration, is the toxic gain of function connected with the presence of aggregates of associated misfolded proteins and/or oligomers. How misfolding causes the clinical phenotype of neurodegeneration is not clear yet. It is not clear whether misfolding is a cause, a side effect, or a contributing factor in neurodegeneration. It is a fact though that research interest is shifted for a couple of decades toward studying the mechanistic pathways of misfolding at the smallest possible scale. Single-molecule approaches allow characterization of individual interacting molecules in real time and close to physiological conditions and have become essential tools for understanding of association/disassociation processes of biomolecular complexes together with intermediate states and the underlying energy landscape [1]. AFM force spectroscopy allows to mechanically stretch and unfold a single protein that is attached between the microscope’s cantilever
© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 P. Vlamos (ed.), GeNeDis 2022, Advances in Experimental Medicine and Biology 1423, https://doi.org/10.1007/978-3-031-31978-5_1
1
2
tip and a substrate surface. The concept is to move the AFM tip in a vertical direction (perpendicular to the sample surface) instead of scanning the sample horizontally (the alternative mainly used in mapping/topographic imaging experiments), in order to probe the molecular sample on the nanoscale. This way, the AFM measures the range of interaction forces between the tip and the sample as a function of the distance the tip covers, either while approaching the sample, or while retracting from it. For the experiment to be meaningful, a large amount of data, force versus distance plots recorded at each iteration, needs to be stored and analyzed. State-of-the-art spectroscopes provide integrated automated routines and software for experiment design. They also have the possibility to be integrated into an inverted optical microscope, enabling fluorescence microscopy (e.g., epifluorescence, confocal, FRET) simultaneously with force experiments. AFM single-molecule force spectroscopy is conducted in the following procedure: protein sample preparation and mounting, spectroscope setup and calibration, data acquisition through iterated approach-retract cycles, and data analysis. We focus on the first two stages in this presentation.
1.2 Methods 1.2.1 Preparing and Mounting the Sample An initial difficulty in this fairly straightforward approach is that more than one (single) molecule may be bound between the tip and the substrate, because of the inherent protein property of sticking to various surfaces by nonspecific absorption [2–3]. To overcome this difficulty, a modular protein chain consisting of many similar or identical protein subunits may be probed. If such a modular protein chain binds to the tip and surface, the exact anchoring points become irrelevant because the force onto a protein inside the chain is transduced via its neighbors and their connection can be exactly determined [2]. Also, the unfolding of such a highly repetitive
D. Cheirdaris et al.
structure leads to a repetitive force versus extension signal when probed with AFM. By taking advantage of this repetitive fingerprint, it is possible to select traces where only one single molecule is bound between a cantilever tip and a surface [3]. In order to study proteins that do not occur naturally as modular protein chains, different protein engineering approaches evolved. For example, one can insert the protein of interest into a naturally occurring modular protein or can directly construct polyprotein chains using coiled coils (“cysteine engineering”) [4]. The molecular details and options of preparing the sample and the coverslip are beyond the scope of this presentation, and the mounting of the sample into the spectroscope is relatively trivial. The first step is to apply the protein buffer on the selected substrate slide. Circa 100 μL of diluted (purified protein to 10–100 μg/mL) in phosphate-buffered saline (PBS) buffer solution protein is enough to form a drop in the center of the coverslip. The coverslip is usually rounded with a diameter between 22 and 25.4 mm and thickness between 0.13 and 0.2 mm and can be mica, clean glass, or gold-coated glass. The drop of diluted protein will form a spherical droplet on gold-coated slides (as this surface is more hydrophobic), or the drop of protein will spread across the surface on glass slides (as this surface is more hydrophilic). PBS buffer solution is a universal practice for maintaining constant pH in the sample, and the sample is left to incubate for at least 20 min (20–60 min.) in ambient conditions before the experiment. The second step is to mount the sample and the coverslip in the sample holder (Fig. 1.1). It is crucial to avoid arbitrary movement between the sample and the tip (drifting, vibrations) due to unstable sample mounting. Coverslip and sample are attached to the sample holder through a metal ring called fluid cell, which has inlet and outlet connections for liquid and gas. Spectroscope’s stage has both positioning arms (C) to hold the sample holder and positioning screws (B) to move it in the xy directions. When the sample is in the desired position, screws are rotated slightly backward to de-couple the sample from the arms.
1 Setting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases
Fig. 1.1 Figure of the mounting stage. (a) cantilever rotation screws. (b) sample holder rotating screws. (c) sample holder positioning arms. (d) inner sample holder (Bruker)
Magnetic contacts underneath the stage keep the coverslip in position. The standard sample holder can fit standard petri dishes, microscope slides, and custom fluid cells through which one may adjust the desired sample volume, concentration, or pH without unmounting the sample.
1.2.2 Setting Up the AFM Spectroscope The following steps should be followed in order to set up the spectroscope until the alignment and calibrations can take place. Mounting the cantilever tip: The tip is fixed (screwed) to a cantilever holder, which is locked into the spectroscope’s head for scanning. There are numerous choices for cantilevers depending on the probed sample and the planned experiment. For protein samples, the softest possible cantilevers are preferred. A standard choice especially for mechanically stronger proteins is the Bruker MLCT cantilever (MLCT-BIO-DC) with a k value of about 0.001 Nn/Nm according to the manufacturer. The holder consists of a transparent glass body and an edge to firmly screw the tip. The surfaces of the holder are polished to allow the transmission of the laser beam, which detects the deflection. The support chip of the cantilever shapes an angle of 10° between piezo and tip so that the tip always contacts the sample first.
3
Mounting the cantilever in the head: In order to mount or unmount the cantilever holder into the spectroscope’s head, the head must be in an upright position. The holder is held in the head’s steel disk with a clamp mechanism. Once it is placed properly, the holder’ s notches lined up with the head’s metal tabs, and it is locked in position by a 90° turn and a counterclockwise rotation of the finger grips on the rim of the head’s steel disk. Mounting the head on the stage: The head can now be moved from the upright position to touch the precision stage. The feet of the head should be carefully placed exactly on the designated foot spots (see figure above) so that their height can be electronically adjusted. In the correct position, the cantilever should be right above (but still far away from) the sample. Approaching the sample (coarse approach): The head can be raised or lowered using the foot stepper motors managed by the spectroscope’s software through designed arrows in the corresponding window (image below). This is an initial approach routine in order to save time compared to automated approach routines, but since there is no feedback from cantilever, the cantilever might come to collision with the sample. Individual motors can be moved independently (Fig. 1.2).
1.2.3 Aligning, Mirror Adjustment, Automatic Approach, Calibrating Laser Detection Alignment When performing force scans, the deflection is detected by a laser beam, which should be focused on the cantilever. The laser beam is automatically switched on when the head is on the stage (indication light on) but can also be manually switched on and off. The beam’s position is detected by a four-piece photodiode. The adjustment of the beam onto the top of the cantilever and on the photodiode is crucial before any experiment starts and especially each time the cantilever is mounted/unmounted into the head. The integrated camera, illumina-
D. Cheirdaris et al.
4 Fig. 1.2 Stepper motor coarse approach and retract control window (Bruker)
Image 1.1 Camera view and laser detector align windows in ForceRobot300 software (BiHELab)
tion, and alignment settings window simplify the procedure (Image 1.1). The user should choose the desired focus point (click on the cantilever tip) (above, left), and the laser spot is aligned by the detector. Laser spot should be as close to the center of the detector as possible for maximum force sensitivity (above, right). The beam position can be optimized in its perpendicular and parallel direction. Once the position is optimized on the cantilever, it does not require re-alignment, unless the bending of the cantilever during experimental conditions (thermal drift, molecular absorption) dictates re- alignment of the photodiode. This adjustment process is also done from the corresponding software window and is successful when the vertical and lateral deflections are
stabilized (over some time) as close to 0 volts as possible, and the reflected beam falls onto the center of the detector (Fig. 1.3). Sum refers to the total signal (in volts) received by all four quadrants of the photodiode. In case is it zero, the laser beam does not fall onto the detector. In case it is close to zero but the laser spot is aligned on the cantilever, the laser path should be adjusted by tilting a head-integrated mirror. Mirror Adjustment The mirror is tilted through a screw on the head. In order to minimize drift, there is a release mechanism that holds the screw out of contact with the mirror when not in use. The user should adjust the mirror by gently rotating the screw until the maximum achievable sum (volts) value, bearing in mind that the sum value depends on the shape of the cantilever and
1 Setting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases
5
Fig. 1.3 Plane view of the four-piece photodiode and the detected laser spot used for alignment (Bruker)
whether it is metal coated. The mirror should also be adjusted when changing from liquid to air operation and vice versa. That is because when cantilever is immersed in liquid, the optical path from the beam reflected from its tip is changed due to the difference in refractive index between air and liquid. The mirror is used to correct for the difference in angle of the optical path.
Automatic Approach Unlike the initial sample approach, automatic approach uses the vertical deflection signal as feedback, so it must follow the photodetector laser alignment, and both lateral and vertical deflections must be close to 0V. By clicking the approach button in the shortcut toolbar, the stepper motors start moving toward the sample, and the z piezo extension/ retraction is displayed in a horizontal bar. The spectroscope head provides an active scanner (piezo) with a z-range of about 6.5 μm, meaning that this is the maximum cantilever tip movement, whereas the piezo stage an active scanning area of 100 × 100 μm2 on the xy plane. At each z piezo movement step, the deflection is checked as feedback, until the surface is detected. Piezo displacement at this point serves as a setpoint. The approach can be set either with feedback on, or with constant velocity. A number of approach parameters can be preferably adjusted (extend time/velocity, target height, and gains) before the initiation of the process. When it is successfully completed, a blue light illuminates on the spectroscope’s head to inform the user. Then, (i) the
z-range bar shows a vertical red line corresponding to the target height and should be at the middle under default approach options, and (ii) the status in the system status panel should be idle, meaning the head is all set to start a force spectroscopy measurement. It should be noted that z-piezo movement range can be set to different values according to the nature of the sample and the desired resolution. Larger z-ranges provide a faster approach, whereas shorter ranges offer larger resolution.
Cantilever (Spring Constant) Calibration The final crucial step before the actual force spectroscopy experiment is the calibration of the cantilever, the acquisition of the actual sensitivity (conversion into units of length), and spring constant (conversion into units of force) values of the cantilever. The latter is provided by the cantilever manufacturer according to its shape (length, width, thickness), but since it is extremely sensitive to thickness, quoted values are rather indicative and unreliable. There are two methods to calibrate cantilevers: contact-based and contact- free methods. In contact-based method calibration is conducted in two discrete steps: (1) the definition of sensitivity s by the acquisition of force-distance curve on a hard substrate (hence contact-based method) and (2) the calculation of the spring constant k by a thermal noise measurement. Sensitivity can be measured by the repulsive con-
D. Cheirdaris et al.
6
tact segment of a force-distance curve on a hard substrate, as in this region the movement of the piezo should correspond to the deflection of the cantilever: Vdet = s x , thus sensitivity units are V nm/V and by Hooke’s Law : F = kx = k det . The s piezo movement is used to calibrate the measured deflection, and sensitivity s is essentially given by the slope of the deflection versus distance plot segment of the repulsive contact (Fig. 1.4). Spectroscopes provide calibration management toolboxes for automated calibration procedure. In ForceRobot300 software calibration manager (above figure), the user should load the (latest) force-distance curve, choose sensitivity tab (up left), choose the contact base method (up right), and then click select the fit range (up left button) and drag the fit range (green line) directly into the linear repulsive part of the line. The slope of the fit is automatically transferred to the sensitivity box (down right). The cantilever spring constant k is measured by the thermal noise method and requires prior evaluation of the sensitivity s derived in the previous step. The thermal noise method relies on measuring the free fluctuations of the cantilever and relates them to the spring constant by applying the equipartition theorem [5]. Under the tab Thermal Noise in the calibration manager toolbox (ForceRobot300), the user can adjust parameters affecting calculation: temperature and angle (10° by default as noted above) and add a correc-
tion factor (numbers multiplied with spring constant values). Correction factors are applied to take into account the difference between z and angular deflections since the detection system is primarily sensitive to angular deflections and therefore has a slightly different sensitivity for the measurement of the thermal noise. Default integrated correction factors have been calculated by Butt and Jaschke [6]. Usually, the correction factor 0.817 is used corresponding to the first resonance (first or highest peak). The first resonance is preferred for calibration as it has the largest amplitude (the best signal-to-noise ratio). In some cases (e.g., very soft cantilevers in liquid), the second resonance is more reliable. Both resonances have different z and angular deflection ratios, so different correction factors are needed. For the second resonance (peak), the correction factor of 0.251 is used. The thermal noise experiment collects a set of continuous spectra (25 by default) and averaged. The more spectra collected, the smoother the result is. The resulting frequency spectrum should peak at the cantilever’s resonance frequency (Image 1.2). The resonance must fit with a Lorentz curve (similarly to the linear fit for sensitivity calculation) by the toolbox choice, and the area under the (average vs. frequency) curve gives the spring constant value. The calculated spring constant should be within the range quoted by the manufacturer and ideally very close to the nominal value (0.01N/m
Fig. 1.4 Contact-based calibration management window (Bruker)
1 Setting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases
7
Image 1.2 Thermal noise calibration tab with a correction factor of 0.251 used for spring constant calibration (BiHELab)
for Bruker MLCT, meaning that a force of 10pN would cause a deflection of ≈1 nm for this cantilever). If the sensitivity and spring constant checkboxes are active (figure above), the spring constant is applied to all feedback modes, that is, the vertical deflection is displayed in units of force or length in oscillating modes. If the thermal noise method is applied in fluid, each resonance peak is damped, reducing both amplitude and frequency. The resonance is in this case very low and susceptible to noise, which makes fitting difficult. In this case, the second peak (first overtone) could give a more reliable fit, and the corresponding correction factor is used. The alternative for calibrating cantilevers is the contact-free method in which no force versus distance plot is required. Thus, it is suitable for more delicate calibration (very sharp and sensitive tips) when the risk of damaging the cantilever needs to be eliminated. The drawback of this method is that not as straightforward as the contact-based. It requires multiple details about the dimensions and physical properties of both cantilever and medium (environmental condi-
tions) and assumptions over the calibration conditions, considerably more input choices from the user; it posts various (dimensional) limitations, and the correction factor choice is far from arbitrary. Calibration is required after every cantilever change and each time the experimental conditions change from air to liquid and vice versa. A way to crosscheck calibration is through the actual force spectroscopy experiment: If the force versus distance curve has an initial region that does not align well vertically, it is an indication that the spring constant is not calculated correctly during the calibration [3].
1.2.4 Choosing the Experiment- Setting Force Spectroscopy Parameters The primary user choice after calibration is about the experiment to be conducted. Force spectroscopes offer two basic choices, contact mode force spectroscopy, and contact mode force mapping (Image 1.3).
D. Cheirdaris et al.
8
Image 1.3 Basic experimental options (modes) regarding force spectroscopy (BiHELab)
Contact mode means that the cantilever deflection is monitored and the cantilever height is adjusted in order to keep the deflection constant, thus maintaining constant force. Of course, other signals are detected, such as the lateral deflection, which is of no importance as it represents arbitrary friction. In the force mapping measurements, a series of force spectroscopy measurements are recorded in a grid in order to probe the investigated surface in specific prechosen locations. ForceRobot300 software offers a scan settings and parameters control window depending on the absolute, basic, or advanced spectroscopy modes. Absolute force spectroscopy (or force fishing) requires a force wheel control and allows for driving precise distances of z piezo and repeated before rupture measurements once there is a domain of interest spotted. In the basic mode, two main parameters need setting. The relative setpoint and the baseline. The cantilever moves toward surface until the setpoint is reached, so piezo movement (z length, also to be set by user) is relative to this setpoint. When the set value is reached, piezo retracts at the total distance of z length. Additional features are z movement (constant duration and/or speed) and (optional) timing settings (e.g., delay). Baseline can be adjusted to correct vertical deflection over time. Without adjustment, relative setpoint corresponds to the absolute value of vertical deflection. In advanced spectroscopy mode, the user can control various settings for the applied force,
piezo movement speed, and timing choices, depending on the desired experimental plan. Force ramps and clamps can be combined with length ramps and delays, allowing composition of desired parameters, such as triggers, ramps, and pulling speeds (Fig. 1.5). The upward F button dictates keeping the applied force upward until reaching a specified value, whereas the downward F is used for normal, safe, or engage approach during the process of contacting the sample. The horizontal F dictates a constant applied force (force clamp) in case one wants to observe the height. Horizontal (constant) height z option is practically useless in force spectroscopy contact mode experiments. This way user can easily set force threshold for the approach, approach speed, delay time over the sample (contact time), and the length and speed of retraction.
1.2.5 Summary After the abovementioned preparation steps, the spectroscopy experiment can run, and the force- distance curves are generated (Image 1.4). Data can be saved, classified, and filtered for ad hoc statistical analysis by the spectroscope’s integrated software, or exported to be managed otherwise. Future work includes force spectroscopy experiments on proteins associated with neurodegenerative diseases to evaluate and compare
1 Setting Up a Bio-AFM to Study Protein Misfolding in Neurodegenerative Diseases
Fig. 1.5 Advanced force spectroscopy experiment (Force ramp) designer (Bruker)
Image 1.4 Force versus distance plot with ForceRobot300 (BiHELab)
9
D. Cheirdaris et al.
10
adhesion properties regarding environmental conditions and disease progression status. As an epilogue, the outline of AFM Force spectroscopy experiment steps (with contact mode spring constant evaluation) is given, as an elementary user’s guide: 1. Place the sample (coated surface) on the AFM stage with c.100 μL of measurement buffer (PBS) to form a drop. 2. Mount the cantilever on the cantilever holder taking care to not let it dry, as this may damage the attached sample. 3. Immerse the cantilever in the measurement buffer on the protein-coated surface trying to avoid long-lasting contact with air, as it might affect the sample. 4. Carefully approach the cantilever to the buffer droplet, ensuring that the tip is sufficiently away from the surface (at least 20 μm). 5. Focus the laser beam at the end of the cantilever trying to maximize the sum signal on the photodiode. 6. Adjust the position of the reflected beam near the center of the segmented photodiode (aim for zero vertical and horizontal deflection). 7. Determine the sensitivity s by the slope of the fitted linear repulsive part of the force- distance curve. 8. Acquire the spring constant k using the known sensitivity s and the thermal fluctuation spectrum of the cantilever. 9. Engage the cantilever on the surface trying to minimize the applied force and time in con-
tact for minimum thermal noise and maximum accuracy. 10. Repeatedly acquire force-distance curves by varying loading rate (approach/retract velocity). If necessary, adjust buffer concentration in long-lasting experiments.
Acknowledgments This research has been co-financed by the European Union and Greek National Funds through the Operational Program Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation, under the call Regional Excellence (Research Activity in the Ionian University, for the study of protein folding in neurodegenerative diseases) (FOLDIT) MIS 5047144.
References 1. Sumbul F. and Rico F., (2019), Single Molecule Force Spectroscopy: Experiments, Analysis and Simulation, Methods in Molecular Biology, vol.1886, 163–189 2. Bornschloegl T. and Rief M. (2011), SingleMolecule Protein Unfolding and Refolding Using Atomic Force Microscopy, Single Molecule Analysis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 783 3. Scholl, Z.N. and Marszalek, P.E. (2018). AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy of Proteins. In: Lyubchenko, Y. (eds) Nanoscale Imaging. Methods in Molecular Biology, vol. 1814 4. Carrion-Vazquez, M. (2000). Mechanical design of proteins studied by single-molecule force spectroscopy and protein engineering. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 74(1–2), 63–91. 5. Hutter J.L. and Betchhoefer J. (1993), Calibration of atomic-force microscope tips, Rev. Sci.Instrum. 64: 1868–1873 6. Butt H.J. and Jaschke M. (1995), Calculation of thermal noise in atomic force microscopy, Nanotechnology 61
2
Structural Connectivity Changes After Fornix Transection in Macaques Using Probabilistic Diffusion Tractography Vassilis Pelekanos, Elsie Premereur, and Anna S. Mitchell
Abstract
The fornix, the limbic system’s white matter tract connecting the extended hippocampal system to subcortical structures of the medial diencephalon, is strongly associated with learning and memory in humans and nonhuman primates (NHPs). Here, we sought to investigate alterations in structural connectivity across key cortical and subcortical regions after fornix transection in NHPs. We collected diffusion-weighted MRI (dMRI) data from three macaque monkeys that underwent bilateral fornix transection during neurosurgery and from four age- and cohort-matched control macaques that underwent surgery to implant a head-post but remained neurologically intact. dMRI data were collected from V. Pelekanos (*) School of Medicine, University of Nottingham, Nottingham, UK e-mail: [email protected] E. Premereur Laboratory for Neuro- and Psychophysiology, KU Leuven, Leuven, Belgium e-mail: [email protected] A. S. Mitchell Department of Experimental Psychology, University of Oxford, Oxford, UK Department of Psychology, Hearing and Speech, University of Canterbury, Christchurch, New Zealand e-mail: [email protected]
both groups at two time points, before and after the surgeries, and scans took place at around the same time for the two groups. We used probabilistic tractography and employed the number of tracking streamlines to quantify connectivity across our regions of interest (ROIs), in all dMRI sessions. In the neurologically intact monkeys, we observed high connectivity across certain ROIs, including the CA3 hippocampal subfield with the retrosplenial cortex (RSC), the anterior thalamus with the RSC, and the RSC with the anterior cingulate cortex (ACC). However, we found that, compared to the control group, the fornix- transected monkeys showed marked, significant, connectivity changes including increases between the anterior thalamus and the ACC and between the CA3 and the ACC, as well as decreases between the CA3 and the RSC. Our results highlight cortical and subcortical network changes after fornix transection and identify candidate indirect connectivity routes that may support memory functions after damage and/or neurodegeneration. Keywords
Anterior cingulate · Hippocampus · Anterior thalamus · Retrosplenial cortex · Fornix · Diffusion-weighted MRI · Probabilistic tractography
© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 P. Vlamos (ed.), GeNeDis 2022, Advances in Experimental Medicine and Biology 1423, https://doi.org/10.1007/978-3-031-31978-5_2
11
V. Pelekanos et al.
12
2.1 Introduction The fornix is a major white matter tract that carries numerous subcortical and cortical projections to and from the hippocampal formation. Tracer studies in nonhuman primates (NHP) have revealed that efferents from the extended hippocampal system and subicular complex to the anterior thalamic nuclei (ATN) almost exclusively use the fornix (e.g., [34, 35]). Interestingly, the fornix also carries projections linking hippocampal areas with the prefrontal cortex (PFC; [2, 29, 32]). Studies in NHPs and humans have revealed that damage to the fornix causes deficits in learning and memory and can produce anterograde amnesia (e.g., [1, 9, 12, 13, 18, 30, 37]). Intriguingly, microstructural integrity of the fornix has been indicated as a predictive biomarker of memory decline [22], while recent clinical trials revealed that deep brain stimulation of the fornix improved cognitive functions in small groups of patients with Alzheimer’s disease ([10]; for a recent review see [19]). Given that the fornix comprises a massive tract with many subcortical and cortical afferent and efferent connections, it is important to know how the connectivity across the relevant network of regions might change if the fornix was damaged. After fornix damage, it is likely, for instance, that the hippocampal formation and the thalamic nuclei communicate indirectly, through cortical areas, with candidate areas being the retrosplenial cortex (RSC) and/or the frontal cortex, in particular the anterior cingulate cortex (ACC) among others [3]. Evidence to support such a hypothesis stems from the fact that the hippocampal connections often use multiple routes (e.g., [34, 35]), while the strong indirect (as well as direct) connections between the hippocampal formation and the PFC, as well as their critical interactive role in memory processes, have been emphasised in human and animal literature (for reviews, see [3, 11]). Here, we sought to investigate how region-by- region structural connectivity among the fornix- related regions changed after fornix transection
in NHPs. Particular connectivity alterations might suggest that indirect connections between cortical and subcortical regions do indeed occur in cases where the direct connections (i.e., via the fornix) are not available or diminished due to damage and/or neurodegeneration. We used diffusion-weighted magnetic resonance imaging (dMRI), which allows the investigation of structural connectivity in detail, and we employed probabilistic diffusion tracking to quantify connectivity.
2.2 Methods 2.2.1 Subjects The present study used seven male rhesus macaque monkeys (Macaca mulatta) aged 5 years at the beginning of the study. Three of the monkeys (experimental group) were housed together and participated in behavioural training to learn an adapted version of the object-inplace discrimination task ([12], see below). Subsequently, the experimental group underwent neurosurgery to receive a selective bilateral fornix transection. The remaining four monkeys (control group) were housed together in a separate group, were trained on a passive visual fixation task, and remained neurologically intact. All monkeys received MRI scans consisting of T1-weighted structural MRI, resting-state functional MRI, and diffusionweighted MRI, at various time points during the course of the experiments, under general anaesthesia (see below). All experimental procedures were performed in compliance with the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act of 1986. A Project License was reviewed by the University of Oxford Animal Care and Ethical Review Committee, and the Home Office (UK) approved and licensed all procedures. The housing and husbandry complied with the ARRIVE guidelines of the European Directive (2010/63/EU) for the care and use of laboratory animals.
2 Structural Connectivity Changes After Fornix Transection in Macaques Using Probabilistic Diffusion…
2.2.2 Experimental Design and Rationale We analysed the dMRI data acquired at key time points from the experimental and control groups to assess the fornix-transection-related changes in structural connectivity (as quantified by the number of streamlines connecting certain brain regions – see 2.6 Probabilistic Tractography). For the experimental group, we analysed the data acquired at time point 1, that is, preoperatively of the fornix transection (‘ExpPreop’) and at time point 2, that is, postoperatively (‘ExpPostop’). For the control, we similarly analysed the data acquired at time point 1 (‘ConPreop’) and time point 2 (‘ConPostop’). Importantly, between time points 1 and 2, the control group monkeys were also operated under general anaesthesia, to receive a head-post implanted onto the skull, but remained neurologically intact. Therefore, these monkeys were a suitable baseline control for our fornix-transected animals. Scans took place at around the same time for the two groups, and the time difference between the scans at time point 1 and 2 were equal for the two groups (~2 years). The experimental group was trained [20] on a variant of the object-in-place scene discrimination task [12] that assesses learning of visuospatial memories in NHPs [24]. For details on the task and related findings on the resting-state functional connectivity and white matter integrity, see Pelekanos et al. [26]. The control group was trained on a passive visual fixation task, which has also been described in detail previously [27]. Briefly, we had collected fMRI data, while the awake monkeys were presented with images of visual objects, aiming to identify visual selectivity to object categories in the ventral visual stream and in higher-order visual areas (for reviews, see [15, 25]). In the current study, however, we have not investigated any training or task-related effects.
13
channel phased-array receiver coil, together with a radial transmission coil (Wind-miller Kolster Scientific). Anaesthetised monkeys were placed in the scanner in a feet first prone position with their head secured in an MRI-compatible stereotaxic frame (Crist Instrument). For details on the induction and maintenance of the anaesthesia, see Pelekanos et al. [26]. For the dMRI data acquisition, we used an echo planar imaging sequence with the following parameters: voxel size = 1 mm isotropic, b values = 1 and 1000, 60 isotropically distributed diffusion-encoding directions, TR = 8.3 s, and TE = 102 ms, with alternating phase-encoding directions (anterior-posterior, posterior-anterior). We collected six averages (all 60 diffusion- encoding directions and 11 b0 images in each average) in the two phase-encoding directions within a single dMRI scan session.
2.2.4 Regions of Interest
To investigate the effects of fornix transection on structural connectivity, first, we selected regions of interest (ROIs), bilaterally, on the basis of their anatomical projections to the macaque hippocampal formation. To this end, we considered regions in the PFC that have been shown to project to the hippocampus. In particular, we selected the ventromedial and orbital PFC (areas 11, 13 and 14), as well as the ACC (areas 24, 25 and 32) [2]. Along these lines, we included the dorsolateral PFC (area 9) that has also been shown to project to the hippocampal formation [14]. We also included the RSC (areas 29 and 30) that receives dense hippocampal inputs [8, 17]. Finally, our ROIs included the core areas of the fornix route, namely, the hippocampal formation (hippocampus’ CA1, CA2, CA3, CA4 subfields, and the subicular complex [subiculum, prosubiculum, presubiculum, parasubiculum – ‘Sub’, ‘pros’, ‘pres’, ‘paras’, respectively, in Figs. 2.1 and 2.2), as well as the ATN (anteroventral nucleus and 2.2.3 Imaging Data Acquisition anteromedial nucleus – ‘thal_AVN’ and ‘thal_ AMN’, respectively, in Figs. 2.1 and 2.2). All MRI data were collected using a horizontal We delineated the cortical and subcortical 3 T MRI scanner and a custom-made four- ROIs according to the parcellations in Van Essen
14
Fig. 2.1 (a–b) Postop–Preop mean difference in the normalised number of tractography streamlines within the experimental group (a) and within the control group of monkeys (b). Panel c shows the interaction between the two groups. Values >0 indicate increases in connectivity, and values