El ADN (¿Qué sabemos de?) (Spanish Edition) [1 ed.] 8400105206, 9788400105204

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y Marta Olivares

69. La criptografía. Luis Hernández Encinas 70. La demencia. Jesús Ávila 71. Las enzimas. Francisco J. Plou 72. Las proteínas dúctiles. Inmaculada Yruela Guerrero 73. Las encuestas de opinión. Joan Font Fàbregas y Sara Pasadas del Amo 74. La alquimia. Joaquín Pérez Pariente 75. La epigenética. Carlos Romá Mateo 76. El chocolate. María Ángeles Martín Arribas 77. La evolución del género ‘Homo’. Antonio Rosas 78. Neuromatemáticas. El lenguaje eléctrico del cerebro. José María Almira y Moisés Aguilar-Domingo

79. La microbiota intestinal. Carmen Peláez y Teresa Requena 80. El olfato. Laura López-Mascaraque y José Ramón Alonso 81. Las algas que comemos. Elena Ibáñez y Miguel Herrero 82. Los riesgos de la nanotecnología. Marta Bermejo Bermejo y Pedro A. Serena Domingo

83. Los desiertos y la desertificación. J. M. Valderrama 84. Matemáticas y ajedrez. Razvan Iagar 85. Los alucinógenos. José Antonio López Sáez 86. Las malas hierbas. César Fernández-Quintanilla y José Luis González Andújar 87. Inteligencia artificial. Ramon López de Mántaras Badia y Pedro Meseguer González

88. Las matemáticas de la luz. Manuel de León y Ágata Timón 89. Cultivos transgénicos. José Pío Beltrán 90. El Antropoceno. Valentí Rull 91. La gravedad. Carlos Barceló Serón 92. Cómo se fabrica un medicamento. María del Carmen Fernández Alonso

y Nuria E. Campillo Martín 93. Los falsos mitos de la alimentación. Miguel Herrero 94. El ruido. Pedro Cobo Parra y María Cuesta Ruiz 95. La locomoción. Adrià Casinos 96. Antimateria. Beatriz Gato Rivera 97. Las geometrías y otras revoluciones. Marina Logares 98. Enanas marrones. María Cruz Gálvez Ortiz 99. Las tierras raras. Ricardo Prego Reboredo 100. El LHC y la frontera de la física. El camino a la teoría del todo. Alberto Casas 101. La tabla periódica de los elementos químicos. José Elguero Bertolini, Pilar Goya Laza y Pascual Román Polo 102. La aceleración del universo. Pilar Ruiz Lapuente 103. Blockchain. David Arroyo Guardeño, Jesús Díaz Vico y Luis Hernández Encinas 104. El albinismo. Lluís Montoliu 105. Biología cuántica. Salvador Miret Artés 106. Islam e islamismo. Cristina de la Puente

¿de qué sirve la ciencia si no hay entendimiento?

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¿QUÉ SABEMOS DE?

¿ QUÉ SABEMOS DE?

Pese a lo evidente que pueda parecer hoy, la idea general del ADN, esa larga cadena en forma de doble hélice que porta la información genética de todos los seres vivos, tiene menos de un siglo de edad. Fueron los científicos James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, cuya relación profesional está envuelta en polémica, quienes descubrieron la importancia crucial del ADN en la formación de la vida y consiguieron, tras años de experimentación, dar con su verdadera estructura. Este libro recorre los inicios de una nueva rama de la ciencia basada en la manipulación del material genético que revolucionó la biología y pone bajo el microscopio las técnicas modernas que utilizan el ADN como herramienta con objetivos tan variados como atrapar asesinos, resistir plagas o revertir enfermedades como el cáncer. Carmen Mora Gallardo es licenciada en Biotecnología y doctora en Biociencias Moleculares. Su investigación se ha enfocado en el estudio de la proteína DIDO3 en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC. Forma parte de la asociación Apadrina la Ciencia. Karel H. M. van Wely es doctor en Ciencias Naturales y Matemáticas. Trabaja en el Centro Nacional de Biotecnología, en Madrid, donde investiga la relación entre la división celular, la especialización de las células y el cáncer. Es autor en esta misma colección de El cáncer y los cromosomas y Las células madre.

ISBN: 978-84-00-10520-4

EL ADN

El ADN Carmen Mora Gallardo y Karel H. M. van Wely

51. Los metales en la Antigüedad. Ignacio Montero 52. El caballito de mar. Miquel Planas Oliver 53. La locura. Rafael Huertas 54. Las proteínas de los alimentos. Rosina López Fandiño 55. Los neutrinos. Sergio Pastor Carpi 56. Cómo funcionan nuestras gafas. Sergio Barbero Briones 57. El grafeno. Rosa Menéndez y Clara Blanco 58. Los agujeros negros. José Luis Fernández Barbón 59. Terapia génica. Blanca Laffon, Vanessa Valdiglesias y Eduardo Pásaro 60. Las hormonas. Ana Aranda 61. La mirada de Medusa. Francisco Pelayo 62. Robots. Elena García Armada 63. El Parkinson. Carmen Gil y Ana Martínez 64. Mecánica cuántica. Salvador Miret Artés 65. Los primeros homininos. Paleontología humana. Antonio Rosas 66. Las matemáticas de los cristales. Manuel de León y Ágata Timón 67. Del electrón al chip. Gloria Huertas, Luisa Huertas y José L. Huertas 68. La enfermedad celíaca. Yolanda Sanz, María del Carmen Cénit

El ADN Carmen Mora Gallardo y Karel H. M. van Wely

¿QUÉ SABEMOS DE ?

1. El LHC y la frontera de la física. Alberto Casas 2. El Alzheimer. Ana Martínez 3. Las matemáticas del sistema solar. Manuel de León, Juan Carlos Marrero y David Martín de Diego

4. El jardín de las galaxias. Mariano Moles 5. Las plantas que comemos. Pere Puigdomènech 6. Cómo protegernos de los peligros de Internet. Gonzalo Álvarez Marañón

7. El calamar gigante. Ángel Guerra Sierra y Ángel F. González González 8. Las matemáticas y la física del caos. Manuel de León y Miguel Á. F. Sanjuán

9. Los neandertales. Antonio Rosas 10. Titán. Luisa M. Lara 11. La nanotecnología. Pedro A. Serena Domingo 12. Las migraciones de España a Iberoamérica desde la Independencia. Consuelo Naranjo Orovio 13. El lado oscuro del universo. Alberto Casas 14. Cómo se comunican las neuronas. Juan Lerma 15. Los números. Javier Cilleruelo y Antonio Córdoba 16. Agroecología y producción ecológica. Antonio Bello, Concepción Jordá y Julio César Tello

17. La presunta autoridad de los diccionarios. Javier López Facal 18. El dolor. Pilar Goya Laza y Mª Isabel Martín Fontelles 19. Los microbios que comemos. Alfonso V. Carrascosa 20. El vino. Mª Victoria Moreno-Arribas 21. Plasma: el cuarto estado de la materia. Teresa de los Arcos e Isabel Tanarro

22. Los hongos. M. Teresa Tellería 23. Los volcanes. Joan Martí Molist 24. El cáncer y los cromosomas. Karel H. M. van Wely 25. El síndrome de Down. Salvador Martínez Pérez 26. La química verde. José Manuel López Nieto 27. Princesas, abejas y matemáticas. David Martín de Diego 28. Los avances de la química. Bernardo Herradón García 29. Exoplanetas. Álvaro Giménez 30. La sordera. Isabel Varela Nieto y Luis Lassaletta Atienza 31. Cometas y asteroides. Pedro José Gutiérrez Buenestado 32. Incendios forestales. Juli G. Pausas 33. Paladear con el cerebro. Francisco Javier Cudeiro Mazaira 34. Meteoritos. Josep Maria Trigo Rodríguez 35. Parasitismo. Juan José Soler 36. El bosón de Higgs. Alberto Casas y Teresa Rodrigo 37. Exploración planetaria. Rafael Rodrigo 38. La geometría del universo. Manuel de León 39. La metamorfosis de los insectos. Xavier Bellés 40. La vida al límite. Carlos Pedrós-Alió 41. El significado de innovar. Elena Castro Martínez e Ignacio Fernández de Lucio

42. Los números trascendentes. Javier Fresán y Juanjo Rué 43. Extraterrestres. Javier Gómez-Elvira y Daniel Martín Mayorga 44. La vida en el universo. F. Javier Martín-Torres y Juan Francisco Buenestado 45. La cultura escrita. José Manuel Prieto 46. Biomateriales. María Vallet Regí 47. La caza como recurso renovable y la conservación de la naturaleza. Jorge Cassinello Roldán 48. Rompiendo códigos. Vida y legado de Turing. Manuel de León

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y Ágata Timón

49. Las moléculas: cuando la luz te ayuda a vibrar. José Vicente García Ramos 50. Las células madre. Karel H. M. van Wely

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Colección ¿Qué sabemos de? COMITÉ EDITORIAL

CONSEJO ASESOR

Pilar Tigeras Sánchez, Directora Carmen Guerrero Martínez, Secretaria Ramón Rodríguez Martínez Jose Manuel Prieto Bernabé Arantza Chivite Vázquez Javier Senén García Carmen Viamonte Tortajada Manuel de León Rodríguez Isabel Varela Nieto Alberto Casas González

José Ramón Urquijo Goitia Avelino Corma Canós Ginés Morata Pérez Luis Calvo Calvo Miguel Ferrer Baena Eduardo Pardo de Guevara y Valdés Víctor Manuel Orera Clemente Pilar López Sancho Pilar Goya Laza Elena Castro Martínez

Rosina López-Alonso Fandiño María Victoria Moreno Arribas David Martín de Diego Susana Marcos Celestino Carlos Pedrós Alió Matilde Barón Ayala Pilar Herrero Fernández Miguel Ángel Puig-Samper Mulero Jaime Pérez del Val

Catálogo general de publicaciones oficiales http :// publicacionesoficiales . boe . es

Diseño gráfico de cubierta: Carlos Del Giudice © Carmen Mora Gallardo y Karel H. M. van Wely, 2019 © CSIC, 2019 http://editorial.csic.es [email protected] © Los Libros de la Catarata, 2019 Fuencarral, 70 28004 Madrid Tel. 91 532 20 77 www.catarata.org isbn (csic):

978-84-00-10520-4 978-84-00-10521-1 isbn (catarata): 978-84-9097-827-6 isbn electrónico (catarata): 978-84-9097-828-3 nipo: 694-19-073-3 nipo electrónico: 694-19-074-9 depósito legal: M-28.951-2019 ibic: PDZ/PSAK1 isbn electrónico (csic):

Reservados todos los derechos por la legislación en materia de Propiedad Intelectual. Ni la totalidad ni parte de este libro, incluido el diseño de la cubierta, puede reproducirse, almacenarse o transmitirse en manera alguna por medio ya sea electrónico, químico, óptico, informático, de grabación o de fotocopia, sin permiso previo por escrito del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y Los Libros de la Catarata. Las noticias, los asertos y las opiniones contenidos en esta obra son de la exclusiva responsabilidad del autor o autores.

Catarata,

El Consejo Superior de Investigaciones Científicas y Los Libros de la

por su parte, solo se hacen responsables del interés científico de

sus publicaciones.

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Índice

INTRODUCCIÓN 7 CAPÍTULO 1. La prehistoria del ADN 15 CAPÍTULO 2. El descubrimiento de la doble hélice del ADN 26 CAPÍTULO 3. Encontrar el encanto del ADN en los plásmidos 47 CAPÍTULO 4. Aprender a leer o la secuenciación del ADN 65 CAPÍTULO 5. Aprender a escribir o amplificar el ADN 82 CAPÍTULO 6. Manipulando el ADN con CRISPR/Cas9 100 CAPÍTULO 7. ¿Mejorando la naturaleza? 121 CAPÍTULO 8. Diez preguntas curiosas 128 GLOSARIO 135 BIBLIOGRAFÍA 141

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Introducción

Con una simple mirada a nuestro alrededor podemos encon­ trar vida en toda su increíble diversidad. Desde las plantas verdes, que usan la luz para generar energía, hasta los anima­ les acuáticos y los pájaros, capaces de volar. Por toda esta variedad, o quizá es mejor decir complejidad, es aún más sor­ prendente que la vida en nuestro planeta se base en unos po­ cos principios biológicos y químicos, de los cuales el ADN es sin duda el más universal. Por tanto, sorprende aún más decir que el ADN, o el ácido desoxirribonucleico, ha sido el último de la gran familia de moléculas biológicas en ser caracteriza­ do en detalle. Mientras todos nos damos cuenta de que inge­ rimos carbohidratos y azúcares con las patatas y frutas, grasas con la panceta y proteínas con la carne o el pescado, pocas veces nos damos cuenta de que todos estos alimentos tienen una cantidad considerable de ADN. Creemos que es muy importante llegar a nuestra dosis mínima de vitaminas, esto sí, aunque se trata de miligramos, pero los varios gramos de ADN (miles de veces más) caen en el olvido. La única vez que se ha hablado de forma pública sobre ADN en la comida fue con la incorporación por prime­ ra vez de plantas transgénicas en la dieta humana. Saltaron todas las alarmas porque el consumo de plantas transgénicas suponía ingerir también un ADN “raro” y eso quizá podría 7

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tener efectos en nuestro cuerpo. Pedimos, pues, a los lectores que olviden por un momento (mientras disfrutan de este li­ bro) las historias de cómics y se centren en la parte científica: ¡la historia del ADN ya es lo bastante impresionante sin invo­ lucrar a superhéroes! Nos queda un largo recorrido para ex­ plicar las posibilidades e impedimentos de esta fascinante molécula, pero esperamos hacerlo a raíz de unas cuantas ju­ gosas historias. El objetivo de este libro, sin embargo, no es únicamente mostrar una radiografía de la historia del ADN, sino incluir además los aspectos más humanos de su investi­ gación para unificarlos desde el punto de vista de los propios investigadores. Al final, el descubrimiento del ADN ha su­ puesto un viaje de más de un siglo, aunque lo llevamos en el cuerpo desde el inicio de la humanidad. En relación con el ADN “raro” que comemos con las plantas transgénicas, al fi­­ nal del libro incluiremos una pequeña lista con preguntas fre­ cuentes para resolver posibles dudas. Empezamos. El libro ha sido dividido en capítulos que reflejan las épocas más importantes del ADN. Antes de repa­ sar estos hitos o, mejor dicho, los pasos clave para llegar a los conocimientos actuales sobre el ADN, será útil aprovisionar­ nos de unas definiciones básicas. Estas nos ayudarán a enten­ der, y esperamos que a disfrutar mejor, el resto de capítulos. Tener a mano unos conceptos básicos cambia nuestra pers­ pectiva sobre los científicos del siglo pasado y pone en evi­ dencia su sabiduría, además de su ignorancia. ¡Pero ojo! Es posible, o más bien probable, que una futura generación haga lo mismo con nosotros. Nuestras acciones presentes determi­ narán hacia qué lado se inclinará la balanza. La primera definición o aclaración es, por supuesto, la del propio ADN. Clasificamos el ADN como una molécula por comodidad, pero en realidad es una colección muy varia­ da de moléculas con propiedades muy similares. El ADN es un polímero, lo que significa que está hecho de una concate­ nación de muchas unidades más o menos similares. Pero en contraste con los polímeros químicos que usamos todos los días (pensemos en los plásticos, el pegamento o la goma), el 8

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ADN se compone de cuatro unidades distintas. Las unidades individuales, que llamamos “bases” o “nucleótidos”, llevan la información genética y a veces se comparan con letras del alfabeto. Los nucleótidos son lo bastante similares para ser compatibles y formar cadenas largas, pero lo bastante dife­ rentes para tener un carácter individual y así transmitir infor­ mación. Cada uno de los nucleótidos, indicados con un códi­ go de una letra (A, C, G, y T) es un derivado del azúcar ribosa (que da nombre a su molécula hermana ARN), que ha sido modificado para formar la desoxirribosa, que resulta ser un poco más estable. Los nucleótidos pueden contactar con la cadena opuesta mediante dos o tres dedos y esto determina qué tipo de información transmiten, aparte de estar encade­ nados para crear un esqueleto longitudinal. Figura 1 Representación esquemática del ADN. O

O O O O

O

O

OH

O

N

N

Guanina

N

N O

N

N

NH

O

N

H 2N

N

H 2N

NH 2

HN

H 2N

O

N

O P

O

O

O O O

O

O P O

O

O

O

O

Timina

O

N

N

N

Citosina

O

HN

N N

N

NH 2

N

NH 2

N

N

O

Adenina

N

N

O NH

O

O

O

O

O

O

O O

P O

O

P

O P

O

P

O

P O

OH

O P O

O

Desoxirribosa

O

Fosfato

O

O

Fuente: Adaptado de Wikimedia Commons bajo licencia CC BY-SA 3.0.

Si comparamos esta molécula con otra fuente de infor­ mación, el lenguaje humano, se puede observar que el propio ADN compone tanto el papel (el esqueleto de azúcares) 9

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como las letras escritas en él (las bases ATCG). Por esta ra­ zón, ¡sin duda debe considerarse una de las sustancias más curiosas de nuestro planeta! Un alfabeto con cuatro letras seguramente parece muy pobre, pero los nucleótidos pueden encadenarse en cualquier orden para dar lugar a cadenas con varios millones de letras. Si cambia el orden de las letras, o el número de veces que se repiten, se trata de otra molécula. Lo mismo pasa en el len­ guaje humano, las palabras “alambre” y “rambla” comparten cinco letras, pero tienen significados muy distintos. Es fácil imaginar que el número de combinaciones se dispara con el tamaño de la cadena, añadir una sola letra multiplica por cuatro el número de posibilidades porque existen cuatro nu­ cleótidos distintos. La cantidad de combinaciones es infinita: una cadena de tan solo 150 nucleótidos es suficiente para ge­ nerar más combinaciones diferentes que el número de áto­ mos en el universo. De esta manera, en el lenguaje corriente decimos “el ADN” por conveniencia y porque así aparece en el dicciona­ rio, pero sería más correcto decir “los ADN” igual que nos referimos a “los cromosomas”. Cada cromosoma en una cé­ lula representa exactamente una molécula de ADN: los hu­ manos tenemos en general 46 moléculas distintas de ADN en el núcleo de la célula (heredamos la mitad de nuestra madre y la mitad de nuestro padre) más una en las mitocondrias (esta siempre proviene de nuestra madre), que es más peque­ ña pero igual de importante. Es curioso encontrarse con la situación en el laboratorio donde con toda normalidad un científico dice “las proteínas”, ya que adscribimos propieda­ des y funciones diferentes a cada proteína, pero incluso los compañeros nos miran raro si decimos “los ADN” o “un ADN”. No es porque quede feo usar las abreviaturas en plu­ ral, sino porque consideramos el ADN como una entidad ho­ mogénea. Por estas razones emplearemos “el ADN” en el resto del libro. Sabemos que los humanos tienen 46 cromosomas y por lo tanto 46 moléculas de ADN, porque se genera una copia 10

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exacta cuando se duplica una célula. En realidad, cada célula con un núcleo tiene estos 46 cromosomas, lo cual se traduce en miles de millones de copias exactas en nuestro cuerpo, simplemente porque tenemos tantas células. En la práctica volvemos a la misma idea de antes y podemos hablar del cro­ mosoma 21 como uno solo, porque la secuencia de los cromo­ ­somas 21 es muy similar en todas las personas y por lo tanto nos referimos a una propiedad compartida por un número muy alto de moléculas. La multitud de posibles combinaciones nos lleva a la se­ gunda aclaración, la de secuencia. Visto que los polímeros de ADN presentan propiedades químicas muy homogéneas, el orden de los nucleótidos determina el tipo de información transmitida. La posibilidad de leer la secuencia de un frag­ mento de ADN natural ha sido uno de los logros más impor­ tantes de la biotecnología, que explicaremos en detalle en el capítulo 4. En teoría, una secuencia es exactamente lo que dice, una serie continua de nucleótidos en los cuales las bases crean un patrón determinado. Al final son las bases A, C, T y G las que contienen la información. Además, el número de bases (también kilobases y megabases) corresponde al tamaño del ADN y se presta para calcular las coordenadas de una secuen­ cia dentro de un fragmento más grande. Por supuesto, el ADN no entiende de números: las coordenadas sirven para los cien­ tíficos, pero la célula tiene que comunicarse de otras maneras. Si recordamos las 150 bases del principio de este capítu­ lo, veremos que las cadenas de ADN son mucho más largas de lo necesario para su capacidad teórica de codificación. La razón detrás de este aparente derroche es la manera en que el ADN presenta su información a la célula, en secciones bien definidas con una función propia. Un buen ejemplo de una sección con una función determinada son los genes, pero también se han identificado secciones dedicadas a la replica­ ción o para sujetar un cromosoma dentro del núcleo de una célula. El ADN en el entorno natural casi nunca se encuentra en un estado puro, pero se alberga dentro de las células con las cuales intercambia su información continuamente. 11

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Figura 2 La secuencia física del ADN engloba toda una molécula (podemos decir ‘cromosoma’) desde el principio hasta el final, pero las secuencias funcionales están restringidas en secciones y reconocidas por sus respectivas proteínas (mayúsculas). El ADN está representado por la barra y las proteínas por los globos. En una célula, las proteínas continuamente se cuelgan y descuelgan, y frecuentemente se mueven a lo largo del ADN (flechas). Los números indican un caso hipotético de coordenadas para que los humanos tengamos una referencia, ¡las células no saben contar!

Ha habido, y todavía hay, mucha discusión sobre por qué el ADN derrocha gran parte del espacio disponible. Hemos oído hablar en numerosas ocasiones del “ADN basu­ ra”, que no parece hacer nada salvo abultar los cromosomas (la parte clara en la figura 2). En los últimos años, la comuni­ dad científica está aprendiendo que incluso el ADN basura puede desempeñar algún papel, por ejemplo controlando el acceso al cromosoma por parte de las proteínas. Sobre todo las nuevas técnicas informáticas, que trataremos en los últi­ mos capítulos, han contribuido a descifrar parte de la materia oscura dentro de los cromosomas. Otra observación en rela­ ción con el ADN basura es el coste energético de producir ADN, el cual es varias veces menor que la síntesis de las pro­ teínas. Entonces, generar un cromosoma grande igual que hacen los mamíferos no tiene un especial impacto energético, aunque su replicación sí cuesta más tiempo y todo este ADN requiere espacio. Con la idea de hacer copias de una secuencia, una acción que se realiza “a mano” al igual que copiar un texto con un bolígrafo, cabe la posibilidad de cometer un error y cambiar la información. En el mundo del ADN, un cambio de secuen­ cia se llama “mutación”. Aunque la propia composición del 12

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ADN en dos cadenas protege en parte contra mutaciones, debemos tener en cuenta que toda la información de una cé­ lula se duplica en cada división. La inmensa cantidad de in­ formación para copiar significa que algún pequeño error es a veces inevitable. Justo esto lo vemos reflejado en el día a día, por ejemplo en las enfermedades raras, donde un único cam­ bio fortuito provoca un problema de salud. Después de unas décadas de aprender a estudiar y mani­ pular el ADN, la posibilidad de crear, pero también de desha­ cer mutaciones de manera dirigida, se ha convertido en una de las principales armas de la investigación y en una esperan­ za para la medicina. Del capítulo 4 al 6 describiremos el pro­ ceso de aprendizaje que ha dado lugar a nuestro “dominio” sobre el ADN, y en los capítulos 7 y 8 veremos las posibilida­ des y limitaciones del ADN en aplicaciones prácticas. Pero antes de llegar a esta proyección del futuro, nos parece intere­ sante volver brevemente la mirada a los héroes de siglos pasa­ dos. Empezaremos recordando una época donde la falta de herramientas tecnológicas se compensaba con dedicación, tiempo y una buena mente analítica.

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CAPÍTULO 1

La prehistoria del ADN

“El ADN es una molécula que contiene las instrucciones ge­ néticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria”. Esta simple pero a la vez elabo­ rada definición del ADN es lo primero que encontramos en internet si hacemos una búsqueda para saber en qué consiste esta “microscópica” molécula. Basándonos en esta definición, podemos saber muchas cosas sobre qué hace el ADN. Lo pri­ mero es que está relacionada con los genes, lo segundo es que es vital para los seres vivos y lo tercero es que además se encar­ ga de transmitir nuestra información genética a las siguientes generaciones. Esto que hoy en día nos parece algo bastante elemental, pues llevamos estudiando los cromosomas, el ADN y las proteínas desde la enseñanza secundaria, hace algo más de un siglo era todavía un gran misterio por resolver. Es por ello que para comenzar a contar la historia sobre el ADN debe­ mos empezar por sus antecedentes, ya que todo buen descu­ brimiento no hubiera llegado a ser tan importante de no ser por el trabajo previo realizado por las generaciones anteriores. Situaremos por tanto nuestro punto de partida hacia el año 1866, prácticamente un siglo antes de que Watson y Crick realizaran el famoso descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN, pero a esto llegaremos más adelante. 15

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Teoría cromosómica de la herencia: la ley de los guisantes Actualmente gran parte de la población ha oído hablar de una forma u otra sobre la famosa teoría de la herencia genética, aquella que un monje austriaco formuló cruzando diferentes variedades de guisantes. Esta teoría, que para muchos puede resultar un simple juego de cruces de plantas, constituye para el mundo científico el fundamento de la genética moderna. De hecho, las leyes sobre la herencia mendelianas suponen en la evolución de la biología un hito solo comparable con las leyes de Newton en el desarrollo de la física. En efecto, la he­ rencia genética es una de las muy pocas reglas “fijas” que podemos aplicar de una manera básicamente universal den­ tro del ámbito de la biología. Gregor Mendel consiguió, en 1866, mediante la realiza­ ción de precisos experimentos de cruzamientos y la meticulo­ sa observación de su descendencia, estudiar cómo se here­ daban los caracteres fenotípicos o caracteres físicos de una generación filial a otra y sacar además una estadística. Para ello empleó la planta Pisum sativum, una variedad de la planta del guisante que poseía las características idóneas para reali­ zar estos experimentos sobre la herencia. En total, Mendel estudió siete caracteres diferentes en esta planta, desde la for­ ma y el color de la semilla, el color de las flores y la forma y el color de la vaina, hasta el lugar y el tamaño del tallo. Los experimentos consistieron en cruzar variedades pu­ ras u homocigotas para cada carácter, es decir, planta con semilla amarilla (AA) con planta con semilla verde (aa), y ver el resultado de la primera generación filial. Posteriormente, cruzaba los híbridos de la descendencia entre sí para seguir estudiando la segregación de esos mismos caracteres. De esta forma, la primera generación filial, descendientes de los pa­ rentales puros (AA o aa), serían todos heterocigotos (Aa). Por ejemplo, en el caso de la semilla amarilla y verde, Men­ ­del descubrió que en la primera generación filial todas las semillas eran amarillas (Aa), lo que significaba que el color 16

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amarillo en la semilla era un carácter dominante (A) sobre el color verde, un carácter recesivo (a). Sin embargo, al realizar el cruzamiento entre los híbridos heterocigotos de la primera generación filial (Aa), el resultado fue más diverso. Mendel obtuvo ¾ de la descendencia con la semilla amarilla (AA, Aa, Aa) mientras que solo ¼ tuvo la semilla de color verde (aa). De esta forma comprobó que la herencia de caracteres domi­ nantes (claros en la figura 3) y recesivos (oscuros en la figura 3) se realiza en una proporción de 3:1. Estos resultados cons­ tituyen la primera y la segunda ley de Mendel. Figura 3 Las leyes de Mendel predicen la relación entre genotipo y fenotipo en la mayoría de seres vivos. Si una mutación es dominante, los efectos ya se pueden notar en la primera generación y la posibilidad de que la próxima generación herede la enfermedad es del 50%. En cambio, si la mutación es recesiva, puede pasar desapercibida en la primera generación, pero aparecer en el 25% de los descendientes de la próxima generación.

El mérito de Mendel fue deducir que hacen falta ni más ni menos que dos determinantes (para adelantarnos un poco podemos decir “genes”) de cada carácter para obtener sus resultados. También entendió que estos dos determinantes se separan durante la reproducción para juntarse de nuevo en la siguiente generación. Más adelante realizó experimentos cru­ zando variedades puras de dos caracteres diferentes, como por ejemplo el color y la forma de la semilla, para ver cómo se producía la herencia de dos caracteres independientes. Y 17

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precisamente eso fue lo que descubrió, que la segregación de diferentes rasgos genéticos se hereda independientemente unos de otros, sin que haya relación entre ellos y, por tanto, sin que el patrón de herencia de cada uno se vea afectado. La descendencia de cada carácter sigue el patrón de herencia de la primera y segunda ley de manera independiente. Este des­ cubrimiento supuso la formulación de la tercera ley de Mendel. Las leyes de Mendel ya tienen más de cien años de anti­ güedad, pero de ninguna manera han perdido su apli­­ cación. Por ejemplo, el uso de animales en la experimenta­ ción se beneficia a diario de estas leyes, ya que pueden predecir la herencia de mutaciones importantes para el estudio de fármacos. Muchas mutaciones solo se pueden mantener en una población en heterocigosidad (una copia dominante y una copia recesiva) y las leyes de Mendel nos ayudan a calcular, por ejemplo, el número de animales ne­ cesarios para realizar una prueba a largo plazo. Incluso los humanos nos adherimos a estas leyes, ya que también de­ terminan la aparición de enfermedades hereditarias en las próximas generaciones. Aunque actualmente sabemos que existen excepciones a las leyes de Mendel, como la herencia ligada al sexo (cromo­ somas sexuales X e Y), la penetrancia de un gen o de una mutación específica, el efecto de letalidad, etc., Gregor Men­­ del ya describió los genes como tales, aunque él los llamó “factores” y estableció una serie de reglas de transmisión ge­ nética que, como hemos mencionado antes, siguen siendo válidas hoy en día. Desafortunadamente, sus estudios no se tuvieron en cuenta durante su época y no fue hasta 1900 cuando tres científicos europeos redescubrieron por separa­ do el trabajo del monje austriaco. Hugo de Vries, Carl Correns y Erich von Tschermak llegaron a la misma conclusión que Mendel, aunque muchos años más tarde. Un poco más ade­ lante, William Bateson impulsó el estudio de las leyes de Mendel, publicando en 1902 Los principios mendelianos de la herencia, donde fue el primero en acuñar los términos de gen, genética y alelo. 18

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Sin embargo, no fue hasta ese mismo año cuando Theodor Boveri y Walter Sutton propusieron una base bioló­ gica para los principios mendelianos estableciendo la famosa teoría cromosómica de la herencia. Esta teoría sostiene que los genes se encuentran en los cromosomas y que el lugar ocupado por cada gen se denomina locus (loci si se refiere al lugar ocupado por varios genes). Ambos se dieron cuenta de que la segregación de los factores mendelianos (lo que ac­ tualmente llamamos “alelos”) se correspondía con la segre­ gación de los cromosomas durante la división meiótica (la meiosis es la división que realizan las células germinales o sexuales para producir gametos), de ahí el paralelismo entre cromosomas y genes. Como cualquier propuesta científica, acoplar las leyes de Mendel con las observaciones en la se­ gunda mitad del siglo XIX no fue nada fácil. Varios cien­­ tíficos, entre ellos Oscar Hertwig en 1876 y Eduardo van Beneden en 1883, habían observado la segregación de cro­ mosomas durante la meiosis (la fila intermedia entre la ge­ neración F1 y F2 en la figura 3) en huevos de lombrices de caballo. Un problema con los cromosomas era su naturaleza fugaz, ya que aparecen durante la división de una célula, pero no son visibles antes o después. Finalmente, Boveri realizó experimentos de fertilización entre distintos tipos de erizos de mar, produciendo así los primeros organismos hí­ bridos en un laboratorio (las mulas también son híbridos, aunque en este momento todavía no se sabía). Boveri obser­ vó que se formaban erizos de mar con características de ca­ da donante, lo cual mostraba una relación entre cromoso­ mas de los factores de Mendel. En el cambio del siglo, ¡la genética empezaba a tomar forma tímidamente! Como podemos ver, gracias a los estudios de Gregor Mendel se establecieron muchos conceptos sobre la genéti­ ca y se relacionó los caracteres heredados con los cromoso­ mas y, sin saberlo, con el ADN. No obstante, todavía por aquella época era bien poco lo que se conocía sobre esta molécula tan importante en nuestras vidas. Para saber un poco más debemos ir de nuevo unos años atrás, casi en 19

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paralelo a la publicación de las leyes de Mendel, pero estu­ diando un mundo completamente distinto.

La primera aparición del ADN El siglo XIX fue un periodo en el cual se establecieron múlti­ ples conceptos en biología y bioquímica. Esta etapa se carac­ terizó por la transición del estudio de los organismos, sus ór­ ganos e incluso tejidos a la incertidumbre por saber de qué estaban compuestos. Los pioneros de esta transición fueron Matthias J. Schleiden y Theodor Schwann, que hacia 1838 demostraron que todos los tejidos tenían un origen celular y que tanto animales como plantas estaban compuestos por las mismas unidades fundamentales de organización —las célu­ las—, las cuales a su vez interaccionaban para dar lugar a los organismos complejos. Estos dos científicos, procedentes de diferentes disciplinas (Schleiden era botánico y Schwann, zoólogo) fueron capaces de unificar ambas doctrinas bajo una teoría común: la teoría celular. Veinte años más tarde esta teoría se vería apoyada por otro gran científico, Rudolf Virchow, un médico y político alemán más conocido como “el padre de la patología moder­ na”. Virchow se centró en explicar conceptos sobre el proceso patológico y cómo las enfermedades verdaderamente comen­ zaban en las células primarias individuales y no en los órga­ nos o tejidos como se había supuesto hasta entonces. Y aun­ que Virchow fue nominado hasta tres veces al Premio Nobel de Medicina, la mayoría lo recordamos por su teoría celular cuya base sostiene que toda célula proviene de otra preexis­ tente (omnis cellula ex cellula). La formulación de la teoría celular supuso la refutación de la hipótesis de generación espontánea, donde las nuevas células se generaban a partir de materia no biológica. Aun­­ que este último concepto había prevalecido durante mucho tiempo, nunca fue de todo satisfactorio ni pudo comprobar­ se científicamente. Siguiendo con el nuevo pensamiento, se 20

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realizaron numerosos descubrimientos en el campo de la ge­ nética; Ernst Haeckel propuso en 1866 que era el núcleo, co­ mo orgánulo, el que poseía los factores responsables de la transmisión de caracteres hereditarios, haciendo que el mun­ do científico empezara a prestar mayor atención a este com­ partimento. Alrededor de 1870, Walther Flemming describió la morfología y el comportamiento de los cromosomas y acu­ ñó los términos de cromatina y mitosis.Y, por último, Theodor Boveri, del cual hemos hablado anteriormente, postuló en 1888 que los cromosomas no solo portaban la información genética en una célula, sino que cromosomas individuales lle­ vaban diferentes partes del material genético. ¡Parece fácil ob­ tener resultados una vez que la hipótesis adecuada ha sido propuesta! Es lógico, por tanto, pensar que la primera vez que se descubriera el ADN como molécula sería un gran hito para la comunidad científica, algo digno de los libros de historia y que recordarían las generaciones venideras. Sin embargo, y como en muchas otras ocasiones ha ocurrido en la ciencia, este descubrimiento pasó desapercibido hasta casi un siglo después y, desafortunadamente, pocos somos los que cono­ cemos o nos suena el nombre de su descubridor… hablamos del físico suizo Friedrich Miescher. Miescher, después de acabar sus estudios en 1869, co­ menzó a trabajar en el laboratorio del bioquímico HoppeSeyler, en la Universidad de Tubinga. Su investigación se cen­ tró en el análisis de las proteínas presentes en los leucocitos, células procedentes del pus de vendas quirúrgicas que obte­ nía de un hospital cercano a la universidad. Durante sus ex­ perimentos para determinar la composición química del pus, Miescher aisló por error un material que se caracterizaba por ser rico en fósforo y que presentaba unas propiedades inespe­ radas que no coincidían con las encontradas en proteínas. Había obtenido la primera purificación cruda de ADN y, debido a que había sido aislado del núcleo de leucocitos, lo de­ nominó nucleína, término que todavía se mantiene en el nom­ bre actual del ADN, ácido desoxirribonucleico. 21

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Pero la aportación de Miescher no acaba aquí. Más ade­ lante, en 1874, consiguió aislar de nuevo nucleína a partir del esperma de varios vertebrados. La publicación de este artícu­ lo despertó algo de interés por parte de la comunidad cientí­ fica y en especial en los embriólogos de la época, que intenta­ ban entender los mecanismos que controlaban el desarrollo de los embriones y la transmisión de características de una generación a otra. Hay que recordar que los experimentos de Mendel sobre la herencia no llegaron a ser aceptados hasta el año 1900. En su artículo, Miescher escribió: “Si uno […] quiere asumir que una única sustancia […] es la causa espe­ cífica de la fertilización, entonces debería sin lugar a dudas primero y ante todo considerar la nucleína”. Sin embargo, y aunque Miescher no estaba completamente convencido de que una única sustancia pudiera ser responsable de la trans­ misión de los caracteres hereditarios, con esta afirmación es­ tuvo muy cerca de encontrar la respuesta al enigma del ADN.

La funcionalidad del ADN está en los genes Hasta este momento, y gracias en parte a los experimentos de Miescher, el ADN ya era una realidad entre los científicos (pa­ só a llamarse “ácido nucleico” en 1889 gracias a Richard Alt­­ mann); sin embargo, para la comunidad científica no tenía gran interés porque se desconocía su función. Hoy en día debe de parecer una casualidad muy desafortunada, pero parece que el trabajo de Miescher nunca llamó la atención de Boveri o Sutton. En esa época seguía aceptándose la teoría de las proteí­ nas eran las portadoras de genes y por tanto de la información hereditaria. ¡Otra vez que vemos que una discrepancia entre hipótesis y experimentación ha provocado el estancamiento de la ciencia! Y a pesar del descubrimiento de Miescher, de la con­ firmación de las leyes de Mendel por Correns, De Vries y Von Tschermark, de que Boveri y Sutton postularan que los genes eran las unidades hereditarias localizadas en los cromo­ somas y de otros múltiples descubrimientos al inicio de los 22

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años noventa del siglo XIX, todavía no se había asociado la molécula del ADN a esta extraordinaria función. La percepción de los cromosomas empezó a cambiar gracias a un descubrimiento realizado en 1928 por Frederick Griffith, un médico al servicio del Gobierno inglés que pos­ tuló la teoría del “principio transformante”. Durante sus ex­ perimentos, Griffith consiguió que una cepa de bacteria ino­­ fensiva se volviera infecciosa mezclándola con una cepa bacteriana virulenta previamente inactivada por calor. De esta forma, pensó que la bacteria muerta podría haber trans­ ferido algunas de sus propiedades a la bacteria inofensiva me­ diante algún tipo de químico o molécula que la transformara en una cepa virulenta. Este principio transformante de Gri­­ ffith fue el precursor de los genes. Lo asombroso es que el mérito de Griffith no consistió en propuestas revolucionarias (su publicación original ni siquiera menciona ADN, cromo­ somas o genes), sino en una aproximación meticulosa para resolver un problema en la sociedad, en este caso la neumo­ nía. Griffith combinaba varias técnicas de laboratorio y se­ guía el comportamiento de las bacterias causantes de la neu­ monía con distintos métodos. Finalmente, y quizá lo más importante, explicó en detalle cómo había realizado sus expe­ rimentos y qué relación tenían con otras investigaciones. Años más tarde, en la década de los cuarenta, tres cientí­ ficos del Instituto Rockefeller, Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, continuaron los experimentos de Griffith al otro lado del Atlántico. Había pasado la grave crisis econó­ mica de los años treinta y una guerra mundial, y quizá no fueran los mejores tiempos para pasar en un laboratorio, pe­ ro sí para pensar sobre ciencia. Más importante aún, Fre­­ derick Griffith había citado antiguos trabajos de Oswald Avery en su estudio de 1928 y esto probablemente impulsó a este último a seguir trabajando sobre el principio transfor­ mante. Reconocer la contribución de otros científicos, aun­ que puedan ser competidores, es un principio básico en la ciencia actual. Es por ello que los investigadores del instituto Rockefeller se dieron cuenta de que un extracto puro de este 23

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principio no se veía afectado por el tratamiento de enzimas que digerían proteínas, pero sí por aquellas que digerían ADN. Estos experimentos demostraron que el principio transformante no era otra cosa que ADN y por tanto que los genes están compuestos de esta molécula. Curiosamente, y a pesar de este evidente descubrimien­ to, muchos científicos todavía eran reticentes a aceptar que el ADN, y no las proteínas, era la molécula genética. El simple hecho de no saber cómo el ADN podía pasar la información hereditaria a veces era bastante para ignorar los hechos. Sin embargo, la teoría del ADN como molécula hereditaria se vio apoyada por otros hallazgos anteriores, como el de su compo­ sición, por el bioquímico Phoebus Levene, que en 1924 reve­ ló que el ADN estaba formado por cuatro bases nitrogenadas, adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T); un azú­ car, desoxirribosa, y un grupo fosfato; pero también por otros descubrimientos posteriores: como el de Alfred D. Hershey y Martha Chase, quienes en 1952 confirmaron que el ADN era el portador del material hereditario gracias a sus experimen­ tos marcando el ácido nucleico y las proteínas de bacteriófa­ gos (virus que infectan a bacterias, del griego “lo que come a las bacterias”) y comprobando que durante una infección viral únicamente el ADN entraba dentro de la célula, el cual además podía posteriormente encontrarse en las partículas de la progenie del virus. No obstante, el ADN alcanzó su auge en la historia en 1953 cuando James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins descubrieron su estructura molecular, ha­ llazgo por el cual Watson, Crick y Wilkins recibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1962. Pero esto ya es ma­ teria del próximo capítulo.

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Tabla 1 Línea temporal del ADN hasta 1953. 1838

Matthias J. Schleiden y Theodor Schwann demuestran que todos los tejidos, tanto animales como vegetales, están compuestos por células.

1865

Gregor Mendel descubre mediante experimentos de cruzamiento de guisantes que los caracteres son heredados siguiendo unas reglas específicas (leyes de Mendel).

1866

Ernst Haeckel propuso que el núcleo contenía los factores responsables de la transmisión de caracteres hereditarios.

1869

Friedrich Miescher aísla la molécula de ADN por primera vez y la denomina nucleína.

1882

Walther Flemming describió la morfología y el comportamiento de los cromosomas y acuñó los términos de cromatina y mitosis.

1889

Richard Altmann renombra la nucleína como ácido nucleico.

1900

Carl Correns, Hugo de Vries y Erich von Tschermak redescubren las leyes de Mendel.

1902

Theodor Boveri y Walter Sutton postulan la teoría cromosómica de la herencia asegurando que las unidades hereditarias se localizan en los cromosomas.

1909

Wilhelm Johannsen acuña el término gen para describir las unidades hereditarias.

1928

Frederick Griffith postula que un principio transformante permite transferir propiedades de una bacteria a otra.

1929

Phoebus Levene identifica los bloques que construyen el ADN: las cuatro bases nitrogenadas, el azúcar desoxirribosa y el grupo fosfato.

1944

Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty demuestran que el principio transformante de Griffith no es una proteína, sino ADN, y que este puede funcionar como material genético.

1949

Erwin Chargaff descubre que la composición del ADN varía entre especies, pero determina que las bases están presentes siempre en el mismo ratio: hay el mismo número de T que de A y el mismo número de G que de C.

1952

Alfred Hershey y Martha Chase usan el bacteriófago T2 para confirmar que el ADN es el material genético, ya que se transfiere del virus a la bacteria durante una infección viral.

1953

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins usan rayos X para demostrar que el ADN tiene una estructura helicoidal que se repite regularmente. James Watson y Francis Crick descubren la estructura molecular del ADN: una doble hélice en la que A siempre es complementaria a T y G a C.

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CAPÍTULO 2

El descubrimiento de la doble hélice del ADN

Como ya mencionamos en el capítulo anterior, el descubri­ miento de la estructura del ADN supuso uno de los mayores hitos en la biología. No solo abrió las puertas al mundo cien­ tífico, sino que todavía hoy seguimos empleando ese conoci­ miento heredado de sus descubridores para desarrollar nue­ vas técnicas de secuenciación, terapia génica o simplemente para dilucidar el avance de las células cancerígenas o la infec­ ción de un virus. Y todo esto se lo debemos principalmente a cuatro investigadores: James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins y Rosalind Franklin. Pero ¿qué llevó a estos cuatro investigadores independientes a dar con una de las mayores claves de la biología? ¿Cómo comenzaron a estudiar los áci­ dos nucleicos y a descifrar la estructura de la doble hélice? Para conocer más de su pasado comenzaremos con un breve repaso de sus vidas, qué motivaciones les llevaron al estudio de esta molécula llamada “ADN” y cómo fueron capaces de descubrir, tras varios años de trabajo, “el secreto de la vida”.

Los artífices del descubrimiento. El nacimiento de una idea Aunque el descubrimiento de la doble hélice fue llevado a cabo en el laboratorio Cavendish de Cambridge, no todos los 26

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implicados eran ingleses. Aunque actualmente se encuentra prácticamente retirado de la investigación, James Watson fue un científico estadounidense que obtuvo su doctorado en Zoo­­logía en la Universidad de Indiana. Gracias a una beca posdoctoral, Watson atravesó el Atlántico y se dispuso a estu­ diar Química en Copenhague con el bioquímico Herman Kalckar en el laboratorio de microbiología del doctor Sal­­ vador Luria. Durante esta estancia se formó en la química que estudia la multiplicación de bacteriófagos, organismos que por aquel entonces estaban muy relacionados con el es­ tudio del ADN. Gracias a los experimentos de Avery en 1944, que comentamos en el capítulo anterior, el ADN pare­ cía ser el principio transformante del que hablaba Frederick Griffith 16 años antes y, por lo tanto, el material genético esencial. De esta forma, se pensaba que los virus podrían constituir una forma de ADN puro, que se refiere a que los virus son prácticamente ADN con algunas proteínas que lo envuelven, lo que los hacía ideales para el estudio del material genético o los genes. Curiosamente, Watson comenzó a interesarse por la es­ tructura del ADN alrededor del año 1951, en un pequeño congreso científico en Nápoles, cuando se encontraba traba­ jando en el laboratorio de Luria. A pesar de que su supervisor, Kalckar, no parecía estar nada interesado en el estudio los ge­ nes, Watson quedó muy entusiasmado con la ponencia de Maurice Wilkins sobre los rayos X y los ácidos nucleicos, en la que mostró una imagen del ADN por difracción de rayos X. Según el propio Watson, esta imagen le hizo pensar que, en contra de la teoría de que los ácidos nucleicos eran algo irregu­ lar, si los genes podían cristalizarse como las proteínas, debían entonces de tener una estructura regular posible de elucidar. Además, en aquella época de principios de los años cincuenta todavía no había ninguna estructura tridimensional del ADN publicada, por lo que podría ser el primero en mostrarla. Sin embargo, Linus Pauling, el famoso y reputado quí­ mico estadounidense, también se encontraba interesado en el estudio de la estructura del ADN y quería lograr el Premio 27

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Nobel antes de retirarse de la carrera científica. Para mayor presión, Pauling presentó en 1951 la estructura del alfa hélice de las proteínas conseguida por difracción de rayos X (un alfa hélice es una estructura en espiral que gira hacia la dere­ cha). Esto supuso un gran descubrimiento, pues fue la prime­ ra persona en describir la estructura de una macromolécula muy importante para la biología. Con estos descubrimientos y la ponencia de Wilkins en Nápoles, James Watson pensó que el método que había usado Pauling para describir el alfa hélice podría aplicarse al estudio de los ácidos nucleicos. De esta for­ ma, para aprender cristalografía y llegar a entender la imagen de rayos X realizada por Wilkins, Watson hizo una estancia posdoctoral en el King’s College de Cambridge, concretamen­ te en el laboratorio de Max Perutz. Allí se encontraba también sir Lawrence Bragg, uno de los fundadores de la cristalografía que formuló la famosa ley de Bragg, por la que le dieron el Premio Nobel de Física en 1915 y que todavía es considerada como el principio básico de la cristalografía. Pero lo más im­ portante fue que en ese laboratorio también se encontraba Francis Crick, otro de los descubridores de la doble hélice. Francis Crick, por su parte, fue un físico, biólogo mole­ cular y neurocientífico británico que por el año 1951 trabaja­ ba identificando la estructura de diferentes proteínas en la unidad del químico austriaco Max Perutz. Este se había dedi­ cado durante diez años a estudiar la difracción de rayos X en cristales de hemoglobina y trabajaba en este proyecto en co­ laboración con sir Lawrence Bragg. Aunque Crick trabajara inicialmente con proteínas, su interés por el ADN y su papel en la herencia de los genes le vino a raíz del descubrimiento de Theodore Avery. Es curioso pensar que aunque Francis Crick fuera físi­ co, comenzó a mostrar interés por la biología a partir de la lectura en 1946 del libro de Schrödinger What is Life? Por aquella época todavía se consideraba que aunque los genes eran los componentes fundamentales de las células vivas, estos eran un tipo especial de proteínas. De esta forma, cuando Avery propuso que los genes estaban compuestos por ADN, 28

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comenzó a rondar la idea en la mente de Crick de que las proteínas ya no podían ser consideradas como la piedra de Rosetta que desvelaría el verdadero secreto de la vida. En cambio, sería el ADN el que seguramente proporcionaría la clave de tal descubrimiento y explicaría cómo los genes deter­ minaban diversas características fenotípicas del ser humano. El problema radicaba en que el laboratorio de Francis Crick en Cambridge, el Cavendish, estaba muy focalizado en el estudio de las proteínas mediante el uso de rayos X, no en los ácidos nucleicos. Comenzar a estudiar estas moléculas mediante esta técnica supondría años de puesta a punto y recursos económicos que no estaban dispuestos a emplear en ese centro. Además, en aquel momento, Maurice Wilkins y su laboratorio eran pioneros en el estudio molecular de ADN en el King’s College de Londres. Esto último suponía otro pro­ blema añadido, ya que, en Inglaterra, culturalmente no estaba bien visto realizar investigaciones sobre el mismo tema que otro colega de laboratorio debido a un sentido de la justicia o del “juego limpio”, algo que no ocurría en países como Francia o Estados Unidos. De esta forma, no fue hasta la lle­ gada de Watson al laboratorio de Perutz, y al interés de este último por los ácidos nucleicos, que Francis Crick pudo co­ menzar a pensar y discutir sobre la estructura del ADN libre­ mente. En otra parte de Inglaterra se encontraban nuestros otros dos descubridores. Pertenecientes al laboratorio de John Randall en el King’s College de Londres, Maurice Wilkins y Rosalind Franklin estudiaban la estructura de los ácidos nu­ cleicos empleando las técnicas de cristalografía de rayos X. Rosalind fue una química y cristalógrafa inglesa que, contra­ tada en el laboratorio de Randall para acelerar las investiga­ ciones sobre el ADN mediante rayos X, fue duramente cri­­ ticada por su carácter luchador y sus sucesivas discusiones con Wilkins. Aunque nació en Londres, consiguió su doctora­ do por la Universidad de Cambridge y realizó su estancia posdoctoral en París, donde se convirtió en una cristalógrafa experimentada. A pesar de que se unió al King’s College con 29

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Randall y Wilkins en 1951, dos años después se vio obligada a mudarse al Birkbeck’s College con el investigador J. D. Bernal debido al mal ambiente de trabajo que reinaba en el laboratorio y a sus desacuerdos con ambos científicos. Des­­ graciadamente para Franklin, en aquella época la ciencia se­ guía siendo un mundo de hombres y para una mujer abrirse paso en el mundo científico y ser reconocida objetivamente por su trabajo era una tarea titánica. Por su parte, Maurice Wilkins, nativo de Nueva Zelanda pero prácticamente británico, fue un físico y biólogo que des­ pués de realizar sus estudios de doctorado en Inglaterra se mudó a Estados Unidos a causa de la Segunda Guerra Mun­ ­dial. Allí trabajó en el Proyecto Manhattan, dirigido por Ro­­ bert Oppenheimer, para la construcción de las primeras ar­ mas nucleares, anticipándose al ejército de la Alemania nazi. En este proyecto trabajó en la separación de los isótopos de uranio para la construcción de la bomba atómica. Después de la guerra se mudó a Escocia, donde se dedicó a la física biológica en la Universidad de St Andrews, para finalmente asentarse en el King’s College, donde emplearía la técnica de difracción de rayos X para estudiar la estructura del ADN. Así, nuestros cuatro investigadores, aun comenzando sus carreras en diferentes partes del mundo, contribuyeron a la in­ vestigación y el estudio de la gran molécula de la vida. A conti­ nuación veremos cómo dieron con su estructura.

El descubrimiento de la doble hélice Podemos decir que el inicio del descubrimiento de la doble hélice se produjo cuando Watson entró a formar parte del la­ boratorio de Max Perutz, donde Crick ya daba vueltas a la idea de estudiar la estructura del ADN. Ambos estaban de acuerdo en que para intentar elucidar esa estructura debían utilizar la técnica de rayos X, al igual que Pauling lo había hecho con el alfa hélice; sin embargo, y como ya hemos men­ cionado, ese trabajo pertenecía a Wilkins y Franklin. De esta 30

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forma optaron por enfoques alternativos como, por ejemplo, la generación de modelos físicos de las estructuras. Esto con­ sistía en acoplar modelos a escala de los componentes del ADN ya conocidos, como el azúcar, los grupos fosfato y la base nitrogenada, y colocarlos mediante los enlaces molecula­ res permitidos según las leyes de la química y la física. Además, ambos pensaron que la manera más fácil de abordar el problema era usando la teoría de la navaja de Ock­ ­ham, donde la explicación más sencilla era probablemente la correcta. De esta forma, la hipótesis de que la estructura del ADN era una hélice tenía más sentido que cualquier otra dis­ posición, y comenzaron a abordar su estudio desde ese punto de partida. Pero se encontraron con un problema distinto al de la hélice alfa de Linus Pauling, donde la hélice estaba com­ puesta por una única cadena de polipéptidos, ya que se trata­ ba de una proteína. Sin embargo, durante la conferencia de Nápoles, Wilkins afirmó que la molécula de ADN no podía estar formada por una única cadena, ya que el diámetro ob­ servado según las fotografías de rayos X era más amplio. Por tanto, el ADN debía estar compuesto por la unión de varias cadenas de polinucleótidos. Figura 4 Nucleótido de adenina. Representados en el esquema se observan los grupos fosfato, el azúcar y la base nitrogenada, que en este caso corresponde con la adenina. Los carbonos del azúcar están numerados según el orden propuesto por Alexander Todd. Base nitrogenada Grupos fosfato

5 4

3

2

1

Azúcar

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En 1951, el laboratorio de Alexander Todd acababa de proponer que el puente entre nucleótidos de un fragmento de ADN se realizaba a través de un enlace fosfodiéster entre el carbono 5 de un azúcar y el carbono 3 del azúcar siguiente. Esta información hizo pensar a Watson y Crick que este enla­ ce debía de ser rígido y que, por lo tanto, los grupos azúcares y fosfatos del ADN tendrían una colocación regular. Sin em­ bargo, la disposición y unión entre las bases nitrogenadas de cada nucleótido debía ser irregular, ya que si no todos los fragmentos de ADN serían idénticos. Además, las bases ni­ trogenadas, aunque diferentes, se podían dividir en dos gru­ pos regulares: purinas y pirimidinas. Figura 5 Las bases nitrogenadas. Adenina y guanina se engloban en el grupo de las purinas, mientras que timina y citosina pertenecen al grupo de las pirimidinas.

Adenina

Guanina

Timina

Purinas

Citosina

Pirimidinas

Con toda esta información, y partiendo de la hipótesis de una hélice como posible estructura tridimensional para el ADN, Watson y Crick decidieron contactar con Maurice Wilkins y explicarle su teoría. Según Watson, Wilkins coinci­ día en la idea de la hélice, pero pensaba que se trataba de una hélice triple, es decir, formada por tres cadenas de poli­ nucleótidos. Para confirmar esa hipótesis helicoidal debían estudiar la estructura del ADN con mejores imágenes de rayos X, y aquí es donde entra en escena la cristalógrafa Rosalind Franklin. Según Wilkins, aunque Franklin no había avanzado mucho en el estudio del ADN, las imágenes que ha­­ bía obtenido eran más precisas que las suyas y además había 32

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calculado el contenido en agua de las muestras de ADN con bastante precisión. Este dato, que a priori parece poco signi­ ficativo, fue uno de los cálculos clave para confirmar poste­ riormente la estructura helicoidal. Figura 6 Esquema del enlace fosfodiéster entre nucleótidos de una cadena simple. La columna del azúcar y grupos fosfato se unen entre sí mediante un enlace regular donde se enlazan los carbonos 5 del azúcar de un nucleótido con el carbono 3 del siguiente azúcar. Un nucleótido estaría compuesto por una base nitrogenada, un azúcar y un grupo fosfato. Debido a la numeración del azúcar por Alexander Todd definimos que el ADN tiene un extremo 5-prima que presenta un grupo fosfato y un extremo 3-prima que presenta un grupo hidroxilo. FOSFATO

BASE

C5

AZÚCAR C3 FOSFATO

BASE

C5

AZÚCAR C3 FOSFATO

BASE

C5

AZÚCAR C3 FOSFATO

BASE

C5

AZÚCAR C3

De forma paralela, Francis Crick y Bill Cochran diluci­ daron a la vez, y por vías independientes, la teoría sobre la difracción de rayos X basada en moléculas helicoidales. 33

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Cuando Linus Pauling publicó la estructura de la hélice alfa no existía una teoría general que explicara o probara modelos nuevos y que además confirmara los detalles más precisos de la hélice alfa. Estos dos investigadores consiguieron explicar esta teoría que más adelante serviría para entender mejor las fotografías de rayos X de Rosalind Franklin. De hecho, gracias a los cálculos del contenido en agua que Rosalind había mos­ trado y al patrón de la imagen de rayos X, Francis Crick llegó a la conclusión de que la estructura del ADN era compatible con dos, tres o cuatro cadenas polinucleotídicas que se retor­ cían en un ángulo concreto sobre el eje central. Watson y Crick asumieron que para obtener una estructura lo bastante regular que coincidiese con los patrones de difracción cristalina que Wilkins y Franklin habían observado, este eje central debía estar formado por una columna de azúcar y grupos fosfato. Las bases nitrogenadas se unirían además teniendo en cuenta que debían seguir el patrón irregular que habían previsto an­ teriormente, y les quedaba por descifrar cómo se mantendrían fijadas las cadenas polinucleotídicas para formar la hélice. El primer modelo que desarrollaron, acorde con las me­ diciones de Crick y que casaba con las intensidades de las sombras que se veían en el patrón de rayos X de la imagen de Franklin, resultó ser un modelo de tres cadenas. Estas tres cadenas enroscadas una sobre otra debían producir una repetición cristalográfica de 28 Å (o ángstrom, la décima parte de un nanómetro) a lo largo del eje de la hélice; esta distancia exacta era importante para que coincidiera con las imágenes de Wilkins y Franklin. Además, habían asumido que los grupos fosfato de las tres cadenas se enlazaban entre sí mediante iones de magnesio. Después de una primera reunión entre los grupos de Wilkins-Franklin y Watson-Crick en la que estos últimos pre­ sentaron su modelo de triple hélice, Rosalind se percató de un problema importante que hacía inviable ese modelo: los iones de magnesio que habían colocado como unión de los grupos fosfato debían estar rodeados de capas de moléculas de agua que desafortunadamente Watson y Crick no habían tenido en 34

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cuenta. Este problema hacía poco probable que estos iones fueran eficaces a la hora de sujetar firmemente las tres cadenas entre sí. Con este primer triunfo de Franklin y fracaso de Watson y Crick se enfrió el estudio de la estructura del ADN por parte del grupo de Cambridge, ocasionando además que Watson y Crick tuvieran que volver a dedicarse a sus respecti­ vos trabajos posdoctorales y predoctorales. Aun así, continua­ ban debatiendo sobre los modelos helicoidales de la estructura durante los almuerzos y en sus ratos libres. Este primer fallo les hizo darse cuenta de que cualquier modelo que plantearan donde la parte central de la hélice estuviera formada por la columna de azúcar y fosfato obligaba a los átomos a estar en una disposición que no seguía las leyes básicas de la química. Por tanto, necesitaban replantearse el modelo de nuevo. Durante este periodo de parón experimental, James Watson decidió comenzar de nuevo el estudio los virus. En esta ocasión eligió el virus del mosaico del tabaco debido a que uno de sus componentes fundamentales era el ácido nu­ cleico, por lo que podía continuar estudiando el ADN sin im­ plicarse completamente en su estructura. La única diferencia radica en que el componente nucleico es ARN en vez de ADN, pero Watson pensaba que si lograba entender la es­ tructura del virus, y por ende del ARN, les daría pistas acerca del ADN. Por aquel entonces, además, Marta Chase y Al Hershey habían publicado el experimento donde confirmaron que el ADN era el material genético esencial. Después de nu­ merosos intentos, Watson consiguió sacar una imagen de rayos X de una muestra de virus del tabaco, lo que probó que la es­ tructura era efectivamente helicoidal. Sin embargo, esto no re­ velaba la verdadera estructura del ARN del virus, sino de la cápside viral. De esta forma asumió que para estudiar el ADN debían volver a planearse qué peculiaridades presentaba esta molécula respecto a otros ácidos nucleicos o proteínas. Aquí es donde entraron en juego las observaciones del bioquímico Erwin Chargaff, que como explicamos en el capítulo anterior, analizó, junto con sus alumnos, las proporciones relativas de las bases de purina y pirimidina del ADN. En sus estudios 35

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descubrieron que las proporciones de adenina (A) y timina (T) eran muy similares entre sí, mientras que el número de moléculas de citosina (C) era parecido al de moléculas de gua­ ­nina (G). Además, observaron que estas proporciones varia­ ban según la especie. Donde en unos organismos había un exceso de A y T, en otros existía un exceso de C y G. De­­sa­­ fortunadamente, en aquel momento Chargaff no supo darle ninguna explicación a estas proporciones en las bases nitro­­ ge­­nadas, pero Crick comenzaba a sospechar que esa informa­ ción sería otra de las claves del ADN. Durante casi 30 años los genetistas se habían planteado una hipótesis sobre la duplicación de los genes que implicaba la necesidad de crear una imagen o cadena complementaria (negativa) a partir de la superficie o cadena original (positiva). De esta forma, la cadena complementaria serviría de molde o plantilla para la generación de otra cadena positiva, idéntica a la cadena original. Esta idea de la complementariedad entre cadenas fue clave para descifrar el tipo de fuerzas que debían actuar entre las hélices que formaban la estructura del ADN. Partiendo de esta idea, Francis Crick y John Griffith comenza­ ron a pensar que no podían ser correctas esas primeras hipóte­ sis que postulaban que las fuerzas de atracción que unían las bases nitrogenadas de las cadenas eran los enlaces de hidróge­ no. Este tipo de enlaces no eran específicos, pues los átomos de hidrógeno presentes en las bases púricas y pirimidínicas no tenían una situación fija, sino que se movían de forma aleatoria de un sitio a otro. Sin embargo, Francis Crick pensaba que debía existir algún tipo de atracción más específica entre las superficies planas de las bases nitrogenadas, por lo que pidió a Griffith que realizara cálculos sobre fuerzas de atracción entre los cuatro tipos de bases. Finalmente, aunque todavía con da­ tos preliminares, Griffith informó a Crick de que había una posibilidad seria de que la adenina y la timina se adhirieran entre sí mediante sus superficies planas, al igual que la citosina y la guanina. Casualmente los mismos pares de bases que Chargaff había observado en proporciones similares en el ADN. ¡Parecía que las piezas empezaban a encajar! 36

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Como ya comentamos al principio del capítulo, la carre­ ra por el Nobel y el descubrimiento de la estructura del ADN era algo que también implicaba a Linus Pauling al otro lado del océano. Así, a finales de 1952 llegó una carta de Pauling al laboratorio de Cambridge, donde relataba el hallazgo de la estructura del ADN a su hijo Peter, que se encontraba hacien­ do el doctorado en el laboratorio de Max Perutz. La carta, sin embargo, no especificaba cómo ni qué tipo de estructura era. En febrero de 1953 llegaron dos manuscritos al laboratorio del Cavendish, uno para Peter Pauling y otro para sir Lawrence Bragg. En este manuscrito, Pauling describía una hélice de ADN formada por tres cadenas, manteniendo la columna de azúcar y fosfato en el centro. Precisamente un modelo muy similar al que Watson y Crick habían presentado un año antes a Wilkins y Franklin y que había resultado fallido debi­ do a que los iones de magnesio que unían los grupos fosfato no suponían una sujeción lo suficientemente firme para man­ tener las tres cadenas polinucleotídicas. Al analizar la estructura y la disposición de los átomos esenciales en la cadena, tanto Watson como Crick se dieron cuenta de que Pauling había cometido un error garrafal. En esta estructura, cada grupo fosfato se presentaba unido con el del siguiente nucleótido mediante un átomo de hidrógeno en­ lazado. Así, los fosfatos de la cadena nucleotídica no estaban ionizados y por tanto no poseían carga negativa. Esto era cla­ ramente un error, porque durante años se había considerado el ADN como un ácido (desoxirribonucleico) precisamente por estos grupos fosfato ionizados. Partiendo de esta base, Pauling había propuesto que lo que mantenía unidas las tres cadenas eran enlaces de hidrógeno. Sin embargo, hasta ahora se había asumido que, en condiciones fisiológicas, iones con carga positiva como el magnesio neutralizaban la carga nega­ tiva de los grupos fosfato. No se había descrito todavía un cambio en las leyes de la química donde las propiedades de ácidos y bases cambiaran en moléculas de gran tamaño. De ser así, Pauling no solo habría descubierto la estructura del ADN, sino también una nueva teoría química. Esta suposición 37

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era muy descabellada y, por tanto, la idea de que la estructura estaba equivocada era mucho más sencilla y apetecible para Watson y Crick. Con esta noticia fueron de nuevo a ver a Maurice Wilkins y Rosalind Franklin. Aunque Rosalind seguía pensando que la estructura del ADN no era helicoidal, su trabajo más re­ ciente con los rayos X hablaba de una nueva forma tridimen­ sional del ADN que aparecía cuando estas moléculas estaban rodeadas de una gran cantidad de agua. De este trabajo, Franklin y su ayudante Gosling sacaron una nueva imagen mucho más precisa que las fotografías anteriores del ADN. Esta imagen, la famosa fotografía 51, contenía una nueva “es­ tructura B” que representaba una forma mucho más sencilla que la “forma A” con la que trabajan anteriormente y que denotaba varios parámetros helicoidales cruciales. Figura 7 La fotografía 51. Se trata de una fotografía de rayos X que muestra la estructura helicoidal del ADN. Con ella, Watson y Crick pudieron calcular que la longitud de una vuelta de hélice medía 34 Å, que la distancia entre un par de bases era de 3,4 Å y que el diámetro del ADN era de 20 Å.

Fuente: Cedida por la Unión Internacional de Cristalografía (IUCr). Rosalind Franklin y Raymond Gosling (1953): “The Structure of Sodium Thymonucleate Fibres I. The Influence of Water Content”, Acta Crystallografica, vol. 6, pp. 673-677.

La polémica llegó cuando Wilkins, sin el permiso previo de Rosalind Franklin y su estudiante, mostró esta imagen a James Watson. Este, al observar la nueva estructura B se dio 38

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cuenta de varias cuestiones: la primera, que en esta nueva estructura se reconocía como acertada la idea de Rosalind de que no era la columna de azúcar y fosfato la que se encontra­ ba en el centro de la estructura, sino las bases nitrogenadas, dejando por tanto la columna en el exterior. La segunda, que basándose en los modelos de pares que predominan en la bio­ logía, convenía decantarse por un modelo de ADN compues­ to por dos cadenas de polinucleótidos en vez del modelo de tres cadenas.Y la tercera fue que en esta imagen de rayos X se podía observar una hélice que repetía su pauta cada 34 Å a lo largo del eje helicoidal, por lo que Watson y Crick se dispusie­ ron de nuevo a construir un modelo de ADN usando en este caso las purinas y pirimidinas como eje central de la hélice. Solo había un problema asociado a la colocación de las bases en el centro y era que debían encontrar la forma de enlazar las dos cadenas entre sí teniendo además en cuenta que conte­ nían secuencias irregulares. A pesar de que Wilkins le había enseñado a Watson la fotografía que planteaba la estructura B, realmente no po­ seían las mediciones exactas de la cantidad de agua que había realizado Franklin. Sin embargo, Watson y Crick consiguie­ ron acceder a esos datos sin el consentimiento de Rosalind, gracias a Max Perutz. Este pertenecía a un comité evaluador que recibió un informe realizado por el jefe de Rosalind don­ de se detallaban los últimos resultados de sus investigadores, entre ellos los datos de la fotografía 51. Cuando este informe se envió a Perutz para su evaluación, este a su vez lo compar­ tió con Watson y Crick, con el pretexto de que el informe no era confidencial. De esta forma, al tener las mediciones exac­ tas de la foto de rayos X, Watson y Crick constataron que el modelo en tres dimensiones que estaban construyendo era correcto y cuadraba con los datos de la difracción de rayos X de Rosalind. Así, comenzaron a plantearse el problema de có­ mo unir o enlazar las bases nitrogenadas en el centro de la hélice. Si las bases se colocaban de forma irregular, al retorcer la columna quedarían huecos donde las bases fueran más pequeñas, o las columnas se combarían o tocarían cuando se 39

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topasen con bases de mayor tamaño. Además, después de co­ nocer los manuscritos de J. M. Gulland y D. O. Jordan sobre valoraciones de ácidos y bases del ADN, comenzaron a darle más peso a los enlaces de hidrógeno como forma de unión entre las bases nitrogenadas. En estos textos se planteaba que gran parte de las bases del ADN formaban enlaces de hidró­ geno entre sí y que, además, estos enlaces se podían encontrar incluso en concentraciones muy bajas de ADN. Asimismo, se había descrito por cristalografía de rayos X que cada base pura que se había examinado hasta el momento formaba el mayor número posible de puentes de hidrógeno. De esta for­ ma, la idea era ser capaces de encontrar la norma por la que se regían los enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogena­ das del ADN. Partiendo de esta idea, Watson llegó a una primera hipó­ tesis: una estructura del ADN generada por emparejamientos de las mismas bases entre sí, es decir, la adenina se uniría con otra adenina, la timina con otra timina, y así con las otras dos bases. En esta teoría, cada residuo de adenina formaría dos en­ ­laces de hidrógeno simétricos, con otra adenina colocada con una rotación de 18 grados entre bases. El problema derivado de esta hipótesis es que, al ser las bases púricas y pirimidíni­ cas diferentes entre sí, la estructura de la molécula debería sufrir torsiones hacia dentro o fuera dependiendo del tipo de bases que hubiese en el centro de la columna. Sin embargo, si se probaba la veracidad del modelo también sería consecuen­ te con la idea de la duplicación de genes mediante una cadena molde y otra original. Pero esta teoría sobre los enlaces de pares iguales tenía un problema fundamental: Watson había asumido que la gua­ nina y la timina se encontraban representadas en forma de enoles; sin embargo, Jerry Donohue, uno de los mejores quí­ micos estadounidenses que más sabía de enlaces de hidróge­ no tras Linus Pauling, le rebatió esa presunción argumen­ tando que ambas bases nitrogenadas se encontraban en forma cetónica, no enólica (figura 8). De esta forma, el he­ cho de que los átomos de hidrógeno se encontrasen en sus 40

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posiciones cetónicas hacía casi imposible la unión de las ba­ ses con sus pares iguales. Además, Francis Crick tiró por tie­ rra el mismo modelo de Watson al constatar que el ángulo de rotación de 18 grados que había asumido este último era in­ viable según sus últimos cálculos de cristalografía. Asimismo, como ya mencionamos que Crick estaba bastante interesado en la teoría de Chargaff, el modelo de Watson no ofrecía nin­ guna explicación a estas reglas de proporcionalidad entre nu­­cleótidos. Figura 8 Forma enólica y cetónica de la timina. La forma enólica (izquierda) que planteaba Watson inicialmente contenía el átomo de hidrógeno unido al oxígeno, mientras que la forma cetónica (derecha), propuesta correctamente por Jerry Donohue, presentaba este mismo átomo unido al nitrógeno. ENOL

CETO H

H

H

C

O C

C

O

H

C C O

H

C

N

N

azúcar

C

O C

C

O

H

C

N

H

H

O

N

azúcar

De esta forma, Watson desechó la teoría de que las bases se emparejaban con sus iguales y comenzó a probar distintas posibilidades de enlaces con cada una de las bases nitrogena­ das hasta que, por casualidad, un día observó que si las bases de adenina y timina se unían por dos enlaces de hidrógeno, entonces presentaban una forma idéntica a las bases de gua­ nina y citosina unidas por al menos otros dos enlaces de hi­ drógeno. En ese momento se percató de la naturalidad del enlace y de que no era necesario ajustar ninguna base para que ambos pares tuvieran la misma forma. Con esta disposi­ ción, la doble hélice no tendría que combarse de ninguna 41

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forma antinatural o presentar huecos para que las bases enca­ jaran. Además, este tipo de enlaces daba respuesta al enigma de por qué el número de residuos de purina era igual al de pirimidina. Dado que a consecuencia del enlace de hidrógeno la adenina siempre se iba a emparejar con la timina, y a su vez la citosina solo se uniría con la guanina, las leyes de Chargaff suponían una consecuencia de la estructura de la doble héli­ ce. Y para terminar de confirmar esta hipótesis, la idea de la complementariedad de cadenas también se podía explicar se­ gún este modelo de emparejamiento de bases: como A siem­ pre iba con T, y C siempre se unía a G, ¡si conocías la cadena molde, podrías conocer la cadena complementaria! Figura 9 Esquema final de la doble hélice del ADN. Las bandas grises externas representan las columnas formadas por los grupos fosfato y azúcares que unen los nucleótidos por el enlace fosfodiéster. En la parte central se encuentran las bases nitrogenadas uniendo las dos cadenas polinucleotídicas. A la derecha, una representación molecular sólida, mostrando las diferentes hendiduras que también surgen del modelo. Adenina Citosina Guanina Timina

Fuente: Adaptado de una contribución (Biochemlife) en Wikimedia Commons, bajo licencia CC A-SA 4.0.

Aunque parecía que ya habían desentrañado uno de los mayores hitos de la genética y la biología de aquel momento, Watson y Crick todavía tenían que ser capaces de encajar este modelo de unión de las bases nitrogenadas dentro de la 42

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columna de azúcares y fosfatos del exterior, y que coincidiera con los datos cristalográficos de Franklin. De esta forma, construyeron un modelo tridimensional, encajando las bases nitrogenadas, que cumpliera los requisitos de los datos de ra­ yos X y las leyes de la estereoquímica (la distribución espacial de los átomos que componen las moléculas). Por último, con­ tactaron con Maurice Wilkins para que verificara el modelo que debería dar a esta doble hélice complementaria mediante la comparación de los datos empíricos que ofrecían los rayos X con los patrones de difracción. A los pocos días de recibir la noticia, Wilkins y Franklin confirmaron que los datos procedentes de las imágenes de rayos X respaldaban por completo el modelo de doble hélice y querían publicar estos al mismo tiempo que el anuncio de la complementariedad de bases. Además, Rosalind había descu­ bierto nuevos datos que la llevaron a descartar la teoría anti­ helicoidal y a asumir que la doble hélice y la complementarie­ dad de las bases nitrogenadas encajaban a la perfección con los datos empíricos de cristalografía. Después de la confirmación de la doble hélice comple­ mentaria con todos los datos disponibles, Watson y Crick anunciaron el descubrimiento de forma oficial y comenzaron a notificarlo a diversos laboratorios de todo el mundo espe­ cializados en el ADN. Linus Pauling, que también se encon­ traba en la carrera por descifrar la estructura, se alegró con creces ante tal descubrimiento y la idea de la complementa­ riedad del ADN le pareció fascinante a nivel biológico. Además, diferentes pruebas posteriores continuaban confir­ mando el modelo, como por ejemplo un estudio desarrollado en el Instituto Pasteur de París. Aquí habían hallado que el ADN de los fagos T2, T4 y T6 carecía de citosina, pero en su lugar presentaba una citosina modificada llamada “citosina 5-hidroxi-metilo”. La buena noticia es que esta citosina mo­ dificada se encontraba en la misma cantidad que la guanina y la modificación todavía le permitía generar los mismos puen­ tes de hidrógeno con la guanina, lo cual seguía apoyando la complementariedad de bases. 43

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Con todas las pruebas a favor, el artículo se envió el vier­ nes 2 de abril de 1953 a la revista Nature y fue publicado el 25 de ese mes. De forma paralela, Wilkins y Franklin publicaron otros artículos con sus interpretaciones de las fotografías de rayos X (figura 7), que abarcaban aproximadamente los mis­ mos aspectos que el manuscrito de Watson y Crick, expo­ niendo además sus propios resultados desde la perspectiva de los pares de bases. Después de toda la repercusión ocasionada por el ha­ llazgo de la doble hélice, nuestros cuatro descubridores continuaron sus investigaciones. Francis Crick se dedicó a estudiar el funcionamiento del código genético, convirtién­ dose en uno de los mayores expertos mundiales. Por su par­ te, Maurice Wilkins continuó verificando con su equipo los rasgos esenciales de la doble hélice hasta que varios años después se centró en el funcionamiento y organización de los sistemas nerviosos. James Watson fue nombrado, en 1968, director del laboratorio de biología cuantitativa de Cold Spring Harbor, en Nueva York, y además de escribir varios libros, participó en el Proyecto Genoma Humano de los institutos nacionales de salud de Estados Unidos. Des­­ graciadamente, Rosalind Franklin murió de cáncer de ova­ rio en 1958, con 37 años. En su caso, después de demostrar que los grupos fosfato se encontraban en el exterior de la molécula de ADN y captar la que es considerada hoy en día como una de las fotografías más famosas de la historia, se dedicó a estudiar el virus del mosaico del tabaco. En este campo mejoró las ideas de Watson sobre la construcción helicoidal y realizó cálculos cuantitativos que apoyaban de­ finitivamente la teoría. Finalmente, las disputas entre Franklin, Watson y Crick desaparecieron y aparentemente, según se relata en el libro de James Watson La doble hélice, Watson y Crick aprendieron a valorar su honradez y su lucha por la aceptación de las mujeres científicas en un mundo de hombres. De hecho, re­ lata que Rosalind dejó claro su valor e integridad ejemplar cuando, pese a saber que se encontraba enferma terminal, 44

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continuó realizando un trabajo de gran valía hasta pocas sema­ nas antes de su muerte.

Premio Nobel y repercusiones biológicas En 1962, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins re­ cibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina por su descubrimiento de la doble hélice complementaria de ADN. En el caso de Rosalind Franklin, a causa de su fallecimiento en 1958 no se le reconoció el premio a título póstumo. En el artículo que Watson y Crick publicaron en Nature, Crick añadió una escueta frase al final: “No ha escapado a nuestra atención que el emparejamiento concreto que he­ mos propuesto sugiere inmediatamente un posible meca­ nismo de copia para el material genético”. Así relacionaba la recién descubierta estructura del ADN con la duplica­ ción de genes, un fenómeno con gran repercusión biológi­ ca. De hecho, se dice que este descubrimiento ha sido el más famoso y con más repercusión en la biología desde la publicación del libro de Charles Darwin. Y esta referencia al posible mecanismo de copia del ADN es conocida hoy en día como el dogma de la biología molecular, que establece que la información genética se transfiere del ADN al ARN y de ahí a las proteínas, pero únicamente en esa dirección y no a la inversa. Además, según se cuenta en el libro La doble hélice, Watson ya reflexionó sobre la relación entre el ADN, el ARN y la síntesis proteica. Observó que, de acuerdo a lo publicado por diversos estudios con pruebas experimenta­ les, dado que el ADN eran moléculas muy estables una vez sintetizadas, la síntesis de proteína no debía hacerse par­ tiendo de estos ácidos nucleicos. Sin embargo, era mucho más plausible que el ARN se formara a partir del ADN y que con ese molde de ARN se produjera la síntesis de pro­ teínas, promoviendo así la transferencia de información ge­ nética desde una secuencia de nucleótidos a una secuencia de aminoácidos. 45

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Por lo que vimos posteriormente, no estaba muy equivo­ cado. Además, el propio Crick escribió, en 1958, lo siguiente: “El dogma central. Este plantea que una vez la ‘información’ ha pasado a la proteína no puede volver a salir. En más deta­ lle, la transferencia de información de ácido nucleico a ácido nucleico o de ácido nucleico a proteína es posible, pero la transferencia de proteína a proteína o de proteína a ácido nu­ cleico es imposible. Información significa aquí la determina­ ción precisa de la secuencia, de bases en el ácido nucleico o de residuos de aminoácidos en la proteína”. Se explican así los mecanismos de replicación del ADN, su transcripción a ARN mensajero y la obtención de las pro­ teínas mediante el uso del código genético. Este mecanismo es clave para el funcionamiento biológico de los organismos vivos. Se sabe además que todo el conocimiento generado posteriormente al descubrimiento de la doble hélice ha sido clave en temas de ingeniería genética, avances en secuencia­ ción del ADN, la posibilidad de desarrollar terapia génica y, por tanto, en lo que también se conoce como medicina perso­ nalizada (tratamientos enfocados específicamente a los pa­ cientes según su código genético). Por ello, algunos de estos aspectos y técnicas derivadas de este descubrimiento serán materia de los próximos capítulos.

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CAPÍTULO 3

Encontrar el encanto del ADN en los plásmidos

En varias de las conferencias impartidas por el doctor Watson después de ganar el Premio Nobel comentaba que la publica­ ción de la estructura del ADN había recibido mucha menos atención de la esperada. ¿Tal vez nadie quería reconocer que los dos jóvenes genios habían revelado la estructura de la mo­ lécula más importante de la vida? Quizá es difícil de entender en el siglo XXI, vista la fama alcanzada por los descubridores, pero la humanidad ha tardado medio siglo en poner el descu­ brimiento en perspectiva. Recordemos las listas de países y capitales que nos hicieron aprender en primaria. Por enton­ ces parecía una pérdida de tiempo (y quizá actualmente lo es, ya que se puede buscar en unos segundos en internet) apren­ der dónde están Holanda y Ámsterdam, pero seguro que el sentimiento de muchos habrá cambiado después de haber visitado, o mejor dicho saboreado y disfrutado, la capital de nuestros vecinos norteños. En la bioquímica no suele ser dife­ rente, un cristal de ADN es lo que es, una entidad casi estáti­ ca sin vida aparente. Al final de la historia incluida en el capí­ tulo anterior, la estructura del ADN no es nada más que la descripción de este cristal, da igual si se ha publicado en la re­­ vista más prestigiosa de la época o no. En este capítulo vere­ mos cómo se puede visitar (y hasta apreciar) una molécula de ADN. 47

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Pruebas experimentales Aunque la estructura del ADN directamente sugiere su po­ tencial para almacenar información, los biólogos necesitan una prueba experimental de que realmente esto es así. Com­­ parado con la secuencia de las proteínas, que tiene 20 letras (los aminoácidos) para su alfabeto particular, el ADN tan solo usa 4 (las bases). Es una manera bastante ineficaz de codificar información. Además, el ADN no parecía aportar actividad biológica a las células. Por ejemplo, combinando el ARN con extractos celulares, investigadores contemporáneos a Watson y Crick consiguieron producir pequeñas cantidades de proteína, pero no ocurrió lo mismo con el ADN. Tan solo cuando Alfred Hershey y Martha Chase mostraron que las proteínas simple­ mente formaban una jeringa para inyectar el material genético, el ácido desoxirribonucleico poco a poco fue ganando su sitio entre las moléculas importantes de la vida. Los bacteriófagos han aportado mucha información en las investigaciones iniciales sobre el ADN, pero en la práctica tienen sus limitaciones. La muerte del anfitrión normalmente entorpece el mantenimiento del virus de manera indefinida y estable en el laboratorio. Algunos bacteriófagos con baja ca­ pacidad para romper las bacterias tienen aplicaciones prácti­ cas, pero los más poderosos pueden retrasar bastante la inves­ tigación y se consideran infecciones no deseadas. Afortunadamente, existen otras variedades de ADN de pequeño tamaño que sí permiten una presencia duradera en las bacterias. Estas variedades, los plásmidos, simplemente son pequeños círculos de ADN capaces de replicarse de ma­ nera autónoma separados del cromosoma principal. Por su pequeño tamaño, entre 100 y 1.000 veces menor que el cro­ mosoma, los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra igual que los bacteriófagos. Sin embargo, esta transferen­ cia es menos eficaz porque un plásmido no tiene envoltorio de proteínas y el ADN desnudo sobrevive poco tiempo en el medioambiente a causa de las actividades enzimáticas que lo degradan. Para aumentar el intercambio, algunas bacterias 48

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entran en contacto físico y pasan este material genético a tra­ vés de un tubo denominado “pilus”. ¡Es verdad que algunas bacterias pueden tener sexo! Pero en contraste con los bacte­ riófagos, los plásmidos normalmente transmiten propiedades ventajosas para el anfitrión. Entre las primeras propiedades encontradas con estas características figuraban toxinas capaces de matar bacterias relacionadas para dar una ventaja de crecimiento en condi­ ciones competitivas. Notaban por ejemplo que algunas cepas patógenas de Salmonella podían producir sustancias letales para la Escherichia coli, la bacteria más común de nuestro in­ testino. Podemos entender que la muerte masiva de la Esche­­ richia coli a causa de una infección por Salmonella contribuye al malestar intestinal. Aparte de los genes productores de to­ xinas, los plásmidos contienen genes para proteger al hués­ ped. Vemos claramente que existe una guerra perpetua en­ tre el universo del ADN y los plásmidos que aseguran su propia supervivencia. También entre microorganismos no tan relacionados existe una lucha continua. Muchas espe­ cies de la familia Streptomyces producen antibióticos para eli­­ minar a la competencia en condiciones de recursos limitados. Muchas veces parte de los genes necesarios se sitúan en un plásmido y su replicación independiente ayuda a producir muchas copias de cada círculo (las cuales aseguran la super­ vivencia del propio ADN) y cantidades considerables de an­ tibióticos. Por supuesto, en una guerra hay métodos defensi­ vos al igual que ofensivos y la biología no es diferente. Un grupo importante de plásmidos alberga genes de resistencia a determinados antibióticos y han tenido un papel importante en el auge de la biología molecular. Después del descubrimiento por Alexander Fleming del primer antibiótico (la penicilina), otros investigadores empe­ zaron a buscar otros compuestos con una actividad similar. No todas las especies de bacterias son igual de sensibles a la penicilina (tomar antibióticos de esta familia para combatir un dolor de garganta puede ser completamente contraprodu­ cente), y sobre todo el género Staphylococcus sigue todavía 49

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causando problemas de resistencia clínica. Aunque la penici­ lina fue descubierta ya en 1928, las siguientes décadas no re­ sultaron muy productivas para la microbiología. Solo la Se­­ gunda Guerra Mundial podía manifestar de la manera más brutal que faltaban múltiples armas en el combate contra las infecciones. Experimentos con la Streptomyces y organismos relacionados durante las décadas de los cuarenta y cincuenta del siglo XX nos han dado la mayoría de antibióticos en uso actualmente, por ejemplo, la estreptomicina y la tetraciclina. En el mundo de los microbios hay una defensa contra cualquier ataque y no debe sorprendernos el hallazgo de plás­ midos con genes de resistencia en las bacterias que compar­ ten su medioambiente con la Streptomyces. Encontrar estos genes ha sido un paso muy simple pero a la vez muy impor­ tante, ya que significa la posibilidad de seleccionar específica­ mente en el laboratorio las bacterias con un plásmido. Al principio del libro hemos conocido a Mendel y la deducción de las leyes de herencia por las propiedades fenotípicas. Del mismo modo, gran parte de la investigación biológica requie­ re el seguimiento de propiedades, las cuales pueden ser visi­ bles a simple vista o no. Para el trabajo con bacterias, el méto­ do más fácil sin duda es eliminar las células sin la propiedad deseada con un poco de antibiótico. Esta selección por resis­ tencia a un antibiótico funciona tan bien que la seguimos usando todavía medio siglo después. Sin embargo, simple­ mente seleccionar bacterias es solo una pequeña parte de los requisitos.

Manipular los plásmidos significa cortar y pegar Para convertirse en una herramienta verdaderamente útil ha­ ce falta que los humanos aprendamos a controlar y dirigir los recursos biológicos. Si no es así, el descubrimiento de la es­ tructura del ADN y la existencia de plásmidos simplemente serían meras observaciones académicas dispuestas de forma abstracta. Son toda una serie de técnicas que han permitido la 50

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transición de la observación a la manipulación. Una evolu­ ción tecnológica continua ha hecho posible, por ejemplo, re­ producir un fragmento de ADN de medusa e introducirlo en células de ratón para hacerlas brillar en color verde. Parece ahora que únicamente la imaginación pone los límites, pero para no adelantarnos, volveremos a los principios de la biolo­ gía molecular y miraremos las distintas necesidades paso a paso. Uno de los pasos más importantes para convertir los plásmidos en una herramienta útil ha sido el descubrimiento de unas proteínas capaces de cortar el ADN, llamadas “enzi­ mas de restricción”. Los investigadores que trabajaban con bacteriófagos en los años cincuenta observaron que la trans­ ferencia de un tipo de bacterias a otro tipo relacionado dismi­ nuía considerablemente su virulencia. Entonces, el ADN de los bacteriófagos se adapta a un anfitrión en particular y en­ cuentra problemas para infectar incluso bacterias muy rela­ cionadas. Una vez establecido en la cepa nueva, la virulencia en la cepa antigua normalmente se ve muy reducida. Trabajos en la década de 1960, que estuvo marcada por los avances en técnicas de purificación de moléculas biológicas, han mostra­ do que las bacterias se defienden cortando el ADN en cuanto los bacteriófagos lo inyectan en una nueva célula. Aunque si­ gue un mecanismo distinto, se puede comparar con nuestro sistema inmune. Cada especie de bacterias produce su propia serie de enzimas, cada una de las cuales reconoce una combi­ nación específica de A, T, C y G de entre 4 y 8 bases de lon­ gitud (figura 10). Las enzimas correspondientes se denomi­ nan enzimas de restricción porque la acción de cortar el ADN restringe o limita la proliferación de los bacteriófagos. Dada la escasa longitud de las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción, es muy probable que esa mis­ ma secuencia se encuentre en el cromosoma del anfitrión. Las bacterias, además de cortar el ADN, protegen la secuen­ cia reconocida con una modificación epigenética. En conclu­ sión, cuando entra el ADN del bacteriófago, el equilibrio pro­ babilístico entre restricción y modificación determina si una 51

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infección será productiva: si previamente el ADN viral se cor­ ta, este no consigue matar la bacteria, pero si lo que ocurre antes es que se modifica y protege, entonces habrá adapta­ ción y seguirá adelante el ciclo infeccioso. Figura 10 Estructura cristalográfica de una enzima de restricción (gris claro) en conjunto con un fragmento corto de ADN (gris oscuro). Los trabajos cristalográficos han mostrado que el reconocimiento de secuencias cortas, de entre 4 y 8 bases, se debe al tamaño de las proteínas. La imagen de la izquierda da un punto de vista a lo largo de la doble hélice; la imagen de la derecha se ha girado 90 grados para visualizar la doble hélice. El corte se produce entre en el enlace fosfodiéster entre dos bases y puede dejar una protrusión de 1, 2 o 4 bases.

A principios de los años setenta, los avances técnicos permitieron obtener enzimas de restricción suficientemente puras para usarlas en el laboratorio. Al añadir un poco de una enzima purificada al ADN que está en un tubo de reacción se producen cortes en sitios determinados. Comparado con otras actividades enzimáticas, las enzimas de restricción tie­ nen una especificidad asombrosa y solo atacan determinadas secuencias en el ADN viral. La primera enzima de restric­ ción, llamada “EcoRI” porque proviene de la Escherichia coli, corta eficazmente la secuencia CAATTG, pero no hace nada si cambiamos una sola base. Teniendo en cuenta la estructura del ADN, podemos deducir que esta secuencia leída desde el 52

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otro extremo de la otra cadena también es CAATTG: es un palíndromo. Por su manera de acoplarse al ADN, la gran ma­ yoría de enzimas de restricción reconocen este tipo de palín­ dromos. Si damos por hecho que una letra puede aparecer cada cuatro bases porque hay cuatro letras A, T, C y G, una secuencia de seis letras ocurrirá con una frecuencia promedio de cada 4.096 bases, o unas 1.000 veces en el cromosoma de una bacteria típica. En contraste con el hallazgo de Watson y Crick, con un contenido mayormente académico, el recono­ cimiento de una secuencia específica directamente mostraba posibilidades prácticas y el mundo académico no tardó en aplicar las enzimas de restricción. Figura 11 Separación de fragmentos de ADN según su tamaño. Un plásmido es un ADN circular (izquierda) y fue cortado con varias enzimas de restricción. Después, los fragmentos fueron separados en un gel de agarosa. Dado que el ADN es circular, cortar una vez (con EcoRI) abre el círculo y produce un único fragmento, mientras que cortar dos veces (con EcoRI e HincII) produce dos fragmentos de distinto tamaño. SphI ClaI HincII ScaI PvuI

EcoRV BamHI EcoRI

PstI Amp

AlwNI

Tet

Ori

Rop

NruI

AvaI BspMII

AflIII

SapI

HincII

+

PvuII

EcoRI

EcoRI

El uso práctico de las enzimas de restricción fue demos­ trado en el laboratorio del doctor Paul Berg, en Stanford (California). El doctor Berg y sus colaboradores usaron la enzima EcoRI para generar fragmentos de ADN derivados de dos virus distintos (un bacteriófago y un virus de mono) y posteriormente fusionaron fragmentos de un tamaño conoci­ do mediante una enzima de “soldadura” llamada “ligasa”. El 53

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fragmento de ADN resultante tenía una longitud que sumaba el tamaño de los dos fragmentos iniciales, mostrando así una fusión eficaz y la formación del primer ADN híbrido o re­ combinante. Todavía hoy, el método básico de clonar un ADN consiste en cortar con una enzima de restricción, selec­ cionar los fragmentos por su tamaño (figura 11) y “pegar” los fragmentos con la ligasa para generar moléculas nuevas.

Otro truco más Para sobrevivir en las bacterias, los plásmidos dependen de varias secuencias especiales (podemos decir “genes”) que dirigen la replicación y aportan propiedades particulares como la resistencia a antibióticos. Además, los plásmidos deben mantener su forma circular, la cual evita la degrada­ ción de los extremos del ADN. El peligro de cortar el ADN con una enzima de restricción es aniquilar alguna secuencia esencial o quedarse con una molécula imposible de soldar. Recordemos que las enzimas de restricción son la defensa de las bacterias contra el ADN ajeno ¡y no se puede pensar en una mejor manera que la destrucción de un gen impor­ tante! Durante unas investigaciones, que en retrospectiva pue­ den calificarse de fortuitas, Herbert Boyer y Stanley Cohen, de la Universidad de San Francisco, encontraron un plásmi­ do de resistencia al antibiótico tetraciclina, proveniente de la Salmonella. Por suerte, el plásmido que encontraron daba un único fragmento al cortarlo con la enzima EcoRI y, por lo tanto, abría su estructura circular. En el hueco generado consiguieron insertar un fragmento de ADN proveniente de una rana (cortado también con EcoRI) y volvieron a cerrar el círculo con la ligasa. El resultado de este proceso de “cor­ tar y pegar” fue el primer plásmido recombinante generado por humanos y, al ser introducido en la Escherichia coli, crea­ ron así el primer organismo transgénico artificial en el año 1973. Actualmente disponemos de centenares de enzimas de 54

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restricción distintas, las cuales permiten cortar en el ADN casi cualquier palíndromo de seis bases. Aunque algunas de ellas tienen poco uso, otras ayudan a resolver problemas biológicos de la manera más elegante po­ sible. Pensemos por ejemplo en la enzima NcoI, un derivado de la bacteria Nocardia corallina que corta la secuencia CCATGG. En principio no parece nada especial, hasta que nos damos cuenta de que esta secuencia contiene las tres ba­ ses ATG que corresponden al aminoácido metionina y, por lo tanto, marca el principio de casi cualquier proteína a nivel del ADN. Si tenemos la suerte de que el ATG inicial esté rodea­ do por un perfecto CCATGG (o ayudamos un poco cam­ biando algunas letras), podemos cortar justo la secuencia que corresponde al inicio de la proteína sin llevarnos restos de ADN basura. Es una manera cómoda de fusionar dos se­ cuencias que pertenecen a distintas proteínas en la naturale­ za, pero que son muy útiles en el laboratorio de forma unida. Aparte de las enzimas de restricción, se ha descubierto una variedad de enzimas que actúan sobre el ADN de otras ma­ neras, por ejemplo, uniendo o “pegando” dos fragmentos (li­ gasas), intercambiando ADN entre secuencias similares (re­ combinasas), copiando el ADN (polimerasas) o eliminando bases del extremo del ADN (exonucleasas). La gran variedad de actividades enzimáticas encontradas en la naturaleza hace posible casi cualquier manipulación imaginable. Por lo tanto, podemos decir que las enzimas de restricción han desencade­ nado una verdadera revolución en la biología molecular. Aunque las enzimas han mostrado cómo cortar la doble hélice en sitios controlados, había otro problema que resolver antes de poder trabajar cómodamente con el ADN. Dado que el ADN tan solo usa las cuatro bases A, T, C y G para alma­ cenar información, todas las cadenas de ADN se parecen mucho desde el punto de vista químico. Además, estas cuatro bases son azúcares con un grupo fosfato, en contraste con los aminoácidos que pueden tener carga positiva o negativa y ser hidrofóbicos o hidrófilos. La gran pregunta entonces es cómo distinguir, por ejemplo, entre el ADN cromosómico y los 55

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plásmidos de una misma bacteria.Ya hemos visto que la gené­ tica se ha basado en seguir las propiedades en lugar del ADN mismo, es decir, ha estudiado fenotipos para sacar conclusio­ nes sobre los genotipos subyacentes. La transición a la biolo­ gía molecular incluye la necesidad de identificar las cadenas de ADN de manera directa. En numerosos trabajos, los inves­ tigadores han usado un microscopio de electrones, que son bastante potentes para resolver moléculas de este tamaño. Dado que este método es muy laborioso, los primeros biólogos moleculares pensaron en otra solución y buscaron en el gabinete de productos químicos del propio laboratorio. Entre estos figuraba el agar, un producto que proviene de las algas y tiene gran capacidad de producir una estructura gela­ tinosa en forma de red. Ya en los tiempos de Fleming, el agar fue el producto idóneo para los medios de crecimiento de bacterias por su gran capacidad de absorber agua y difundir nutrientes. Bioquímicos de los años sesenta vieron que deri­ vados más refinados del agar, en concreto unas perlas de con­ densación llamadas “agarosa”, formaban una suspensión po­ rosa sobre la cual se podían filtrar moléculas de gran tamaño. Cuanto más grande es el tamaño de la molécula, más rápido pasa por una columna rellena de pequeñas esferas de agarosa. Aunque esto funciona bien para distinguir entre cromosomas y plásmidos (los cromosomas son unas 1.000 veces más grandes que los plásmidos), su capacidad de resolución es demasiado baja para separar dos fragmentos de ADN corta­ dos con una enzima de restricción. El método mejorado, empleado en la actualidad en todo el mundo, se llama “electroforesis en gel de agarosa”. En esta técnica creamos una sustancia gelatinosa con agarosa para separar los fragmentos de ADN. El gel en el que separamos el ADN se parece mucho al sustrato de las placas de Petri don­ de crecen las bacterias, hecho con agar. Al igual que el almi­ dón, la agarosa se disuelve en agua hirviendo, pero la mezcla se solidifica cuando se enfría. El producto final es una red tridimensional formada por poros de diferentes tamaños, por donde se pueden mover las moléculas de ADN. Aplicando un 56

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campo eléctrico, la carga negativa constante del ADN asegu­ ra una separación homogénea donde el tamaño de los poros hace que las moléculas más grandes encuentren más resisten­ cia y migren más lentamente. Los doctores Boyer y Cohen fueron de los primeros en someter su plásmido a una electro­ foresis, para mostrar que la enzima EcoRI produce fragmen­ tos de distintos tamaños después de insertar ADN de rana. Podemos decir que inauguraron la biología molecular reu­ niendo las técnicas principales en un solo laboratorio.

Cómo obtener un plásmido limpio Una vez que hemos aprendido cómo cortar y pegar fragmen­ tos de ADN, quedan pocos obstáculos para dominar las téc­ nicas básicas de los plásmidos. Casi parece que se puede ha­ cer en casa, y mirando el estado de los laboratorios de biología molecular en sus principios, la verdad es que no es tan com­ plicado. Se han dado, sin embargo, toda una serie de innova­ ciones “de apoyo” a lo largo de las últimas décadas, las cuales carecen del componente espectacular, pero son igual de im­ portantes en el día a día de la investigación. Entre estas, uno de los retos más importantes fue sacar un plásmido de una bacteria, limpiarlo y volverlo a introducir en otra bacteria des­ pués de ser manipulado. Este es un procedimiento que se de­ nomina “clonaje”. El paso de la limpieza es muy importante para evitar que se “cuele” ADN no deseado durante el proce­ so de clonaje, ya que las enzimas de restricción y las ligasas no tienen conciencia del origen del ADN, simplemente cortan y unen los fragmentos que encuentran en el tubo de reacción. Por tanto, los investigadores deben optimizar las condiciones para que las enzimas puedan hacer mejor su trabajo y de esta manera aumentar la probabilidad de éxito. Además, obtener una “gran” cantidad de plásmido (pensamos en unos micro­ gramos, menos que una milésima parte de una aspirina) nos permite introducir ADN en otros organismos, incluso en las células de mamíferos. Aunque la mayoría de investigadores 57

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en biomedicina no estudian las bacterias directamente, el uso de plásmidos es una práctica habitual. Si se conocen las secuen­ cias importantes de otros seres vivos, estas pueden ser introdu­ cidas en un plásmido al igual que la secuencia de la rana en 1973. Los plásmidos de bacterias no se replican en células de mamíferos, pero sí pueden servir como vehículos de un ADN exógeno funcional. Básicamente, conseguir material más limpio hace la vida más fácil a los biólogos. Aunque obtener una gran cantidad de bacterias nunca ha sido un problema, ya que crecen miles de millones en una sola gota de medio de cultivo, la simi­ litud química entre los ADN sí supone un problema. Hemos visto al principio de este capítulo que cada bac­ teria tiene un cromosoma además de los plásmidos y hace falta separar estas moléculas, químicamente similares, para poder realizar manipulaciones posteriores. Aunque la electro­ foresis ha resultado ser un método eficaz para separar frag­ mentos cortados con enzimas de restricción, se satura rápida­ mente si superamos una barrera de un microgramo de ADN. De esta manera, la manera más común de separar plásmido y cromosoma en las fases iniciales de la biología molecular re­ sultó ser la centrifugación en sales de metales pesados, en particular en cloruro de cesio. Desafortunadamente, este mé­ todo requería de centrifugadoras capaces de alcanzar hasta 50.000 veces la fuerza de la gravedad y en consecuencia no era apto para un número elevado de preparaciones. La innovación que ha cambiado todo, popularizando los plásmidos, es la destrucción de bacterias con sosa cáustica. Este método fue inventado por el doctor Chaim Birnboim en 1979. Pensamos normalmente en el ADN como una molécu­ la frágil, pero tiene una resistencia química sorprendente y algunas cadenas de ADN cromosómico han podido persistir desde los neandertales hasta ahora. En el caso de los plásmi­ dos, este ADN se encuentra enrollado en un círculo pequeño (los expertos usan la palabra “superenrollado”, del inglés su­ percoiled), una conformación muy resistente que se parece a una banda elástica doblada varias veces. Con sosa cáustica podemos entonces desintegrar las bacterias e incluso el ADN 58

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cromosómico sin superenrollar. La sosa cáustica abre las membranas, las proteínas, y separa las dos cadenas de la do­ ble hélice del cromosoma. Si revertimos esta situación con un ácido, se produce un colapso y la precipitación de la mezcla de proteínas y cromosoma, dejando en solución un plásmido ya más o menos puro. En pasos posteriores podemos concen­ trar el plásmido usando sus propiedades químicas, ya que no queda otro ADN para interferir. La carga negativa de los fos­ fatos permite captar el ADN en un soporte con carga positi­ va, eliminar otras moléculas y soltar después un plásmido li­ bre de contaminaciones. La miniaturización de equipos y soportes de captura ha hecho posible realizar centenares de purificaciones en paralelo y ha convertido los plásmidos en una herramienta universal.

Al fin, dar un nuevo hogar a los plásmidos Durante los años cincuenta, los investigadores observaron la transferencia de ADN de una bacteria a otra cultivando las dos especies juntas en el mismo frasco. Pero si se eliminan el ADN cromosómico no deseado y las proteínas contaminan­ tes, este procedimiento se vuelve muy poco eficaz, ya que fal­ ta el tubo de transferencia de la bacteria donante. Limpiar los plásmidos ayuda a manipularlos en un tubo de reacción, pero los hace muy frágiles en un ambiente biológico. ¡Hay muy poco riesgo de que los investigadores se conviertan en seres transgénicos! En 1970, los doctores Morton Mandel y Akiko Higa pensaron en un método para introducir un plásmido “desnu­ do” en bacterias. Observaron que el ADN tiene tendencia a precipitar en presencia de sales de calcio e intentaron formar un precipitado lo bastante fino para atravesar la pared de la Escherichia coli. Al final, decidieron cargar las bacterias con la cantidad justa de calcio para saturar el espacio entre las dos membranas celulares (la Escherichia coli es una bacteria gram­ negativa y tiene una membrana interior y otra exterior), 59

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añadir el plásmido y calentar brevemente la mezcla para que entrase el ADN en el interior. El método, conocido como “transformación”, brilla por su sencillez y se sigue usando con pequeñas adaptaciones, aunque no funciona en todas las bac­ terias. En consecuencia, la Escherichia coli se ha convertido en el organismo modelo más popular de la microbiología, hasta que aparecieron técnicas alternativas en los años ochenta. En la actualidad es posible introducir ADN en las células de casi cualquier organismo mediante una variedad de méto­ dos. Muchas veces tenemos que someter las células a un fuer­ te pulso eléctrico, lo cual produce pequeños agujeros en la pared que permiten el acceso del ADN, aunque también es posible encapsular el ADN en liposomas para fusionarlos con la membrana celular o incluso recubrir pequeñas balas de oro con plásmido y dispararlas a las plantas. Al final de cada mé­ todo suele haber un procedimiento para seleccionar las célu­ las que han incorporado el ADN. Justo en este último paso es de mucha ayuda la combinación de plásmidos y bacterias, con unas cualidades muy curiosas. Cuando una bacteria lleva un plásmido, este último se puede replicar centenares de ve­ ces en la misma célula, lo que ayuda en la práctica a obtener mucho ADN en forma de plásmidos. Al mismo tiempo, el plásmido residente no permite la entrada de plásmidos rela­ cionados, es decir, con las mismas señales de replicación. Los plásmidos son un buen ejemplo del “gen egoísta”, tal como explica Richard Dawkins en su famoso libro del mismo nom­ bre, e incluso están dispuestos a cometer fratricidio para pro­ liferar. En la práctica significa que tenemos que buscar plás­ midos “compatibles” de distintas familias cuando queremos introducir más de uno en la Escherichia coli. Por otro lado, esta propiedad asegura que cada bacteria transformada con el ADN contiene una única copia del plásmido producido por el proceso de clonaje. Después de esparcir las bacterias sobre una placa con medio y antibióticos, cada colonia corresponde a la incorporación de una molécula resultante de la ligación. Es como hacer miles de experimentos simultáneos en el tubo de reacción y después separarlos encima del medio con agar. 60

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Para determinar cuáles han tenido éxito, simplemente hace­ mos crecer las colonias una por una y analizamos el conteni­ do del plásmido. Al final, ¡la naturaleza del ADN hace el tra­ bajo duro por nosotros!

El poder de los plásmidos Es una opinión personal, pero nos atrevemos a decir que po­ cos descubrimientos relacionados con el ADN han tenido el mismo impacto que los plásmidos. La amplificación de ADN en un tubo, y la edición genética por CRISPR/Cas, las cua­ les veremos en los próximos capítulos, quizá pueden dar esta impresión, pero ni siquiera han podido reemplazar por com­ pleto el uso de los plásmidos. A partir del primer constructo artificial, los plásmidos han visto una evolución constante para facilitar su manejo. Cuando insertamos ADN de otra especie en un plásmido, normalmente buscamos obtener un resultado final determi­ nado de antemano. Si queremos estudiar la función de cual­ quier gen de los neandertales, debemos aislar antes este gen y después insertarlo en el plásmido deseado. Existen otras es­ trategias, por ejemplo el método “escopeta” de cortar todo el conjunto de ADN de una especie y repartirlo por miles de plásmidos, pero, actualmente, con las bases de datos más completas de las que disponemos, se intenta cada vez más ge­ ­nerar un constructo a medida. Normalmente, el ADN que insertamos no aporta nada a las bacterias —de hecho, a me­ nudo molesta— y podemos considerar entonces que el plás­ mido es un vehículo y el inserto va “de paquete”. Si pen­­ samos en los genes egoístas, el fragmento de ADN que nos interesa a los investigadores normalmente es un parásito, no aporta función al plásmido y solo se amplifica porque está unido físicamente en la misma cadena de ADN. No siempre es tan fácil como está descrito en los párra­ fos anteriores, pero una “evolución dirigida” de plásmidos a lo largo de 40 años ha mejorado considerablemente nuestras 61

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posibilidades. En el primer plásmido construido, insertar o no una secuencia de rana era cuestión de suerte, ya que no había manera de controlar las herramientas rudimentarias iniciales. Poco tiempo después, otros investigadores en el grupo del doctor Boyer, Francisco Bolívar y Raymond Rodríguez, pro­ dujeron plásmidos con resistencia a dos o tres antibióticos. Insertando un fragmento de ADN ajeno en uno de los genes de resistencia, esto volvía a hacer sensible al antibiótico co­ rrespondiente a las Escherichia coli. La selección final se hacía en dos fases: una para elegir las colonias con el plásmido, y por lo tanto resistentes al primer antibiótico, y una segunda para elegir las colonias sensibles al otro antibiótico, que tenían insertado un ADN exógeno. Este procedimiento requería ha­ cer una copia de las colonias de la placa con el primer antibió­ tico a una placa con el segundo, además de bastantes recursos y tiempo. En la actualidad podemos combinar las dos selec­ ciones en una utilizando plásmidos con un gen de resistencia y otro gen capaz de convertir un colorante inocuo que produ­ ce color azul (figura 12). Figura 12 Clonaje con selección de blanco y azul. La inserción de un fragmento de ADN en el gen lacZ impide la producción de la proteína relacionada y genera un fenotipo diferente en las bacterias, dando colonias blancas en la placa Petri. EcoRI ClaI BamHI

ScaI PvuI

lacZ Amp EcoRV lacZ

AlwNI

Ori

Rop

AvaI BspMII

AflIII

SapI

PvuII

Además, los plásmidos han sido sujeto de cambios di­­ rigidos —podemos decir mutaciones—, introducidos por 62

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métodos que explicaremos en el capítulo 5. Estas mutaciones han creado secuencias de reconocimiento para gran variedad de enzimas de restricción, para tener más flexibilidad a la ho­ ra de emparejar inserto y plásmido. Curiosamente, los propios genes de resistencia y conversión de colorante son fragmentos de ADN que provienen de otras bacterias o cromosomas; estos segmentos que ahora parecen formar una parte esencial e inte­ gral de un plásmido han sido clonados anteriormente, transfor­ mando y seleccionando colonias. Entonces, muchas funciones útiles han empezado su vida como inserto, pero después han adquirido un papel integral en el plásmido. Este ciclo de prue­ ba y refinamiento ha marcado el cambio de una biología de observación a una de experimentación dirigida y ha manteni­ do los plásmidos como herramientas esenciales. En un libro que trata de dar una visión global del ADN hay poco sitio para hablar sobre todas las posibilidades actua­ les que los plásmidos nos ofrecen. El contenido de este capí­ tulo quizá ha dado la impresión de que los plásmidos perte­ necen al mundo de las bacterias, pero 50 años de bricolaje molecular han dado para mucho más. A principios de los años ochenta, varios grupos produjeron plásmidos con la ca­ pacidad de replicar en seres vivos muy distintos. Al principio, un plásmido capaz de sobrevivir en bacterias grampositivas y gramnegativas ya era un gran logro, pero se fueron desa­­ rrollado rápidamente otros plásmidos tipo “lanzadera”, por ejemplo para la Escherichia coli y levaduras. Dado que estos plásmidos ayudan a llevar secuencias de un organismo a otro, también nos referimos a ellos con el término “vector”. Desde finales de los años 1980 disponemos de plásmi­ dos con secuencias de Escherichia coli y del virus de leucemia de ratón. Por supuesto, estos trabajos no solo generan un plásmido interesante, sino que también ayudan a aprender cómo funcionan los virus y cómo combatir la enfermedad asociada. Después de eliminar las secuencias que proporcio­ nan la patogenicidad al virus, queda una herramienta muy importante para la manipulación de células de mamífero. En particular, los vectores derivados de retrovirus tienen una 63

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aplicación en el laboratorio porque nos permiten introducir material genético en los cromosomas de los mamíferos. Para poder llevarlo a cabo, todas las manipulaciones genéticas se realizan trabajando con la Escherichia coli, pero el constructo final se introduce en células especializadas en la fabricación de las partículas virales. Cuando estas partículas infectan una cé­ lula nueva, el material genético se inserta en los cromosomas sin producir un virus infeccioso (porque eliminamos los genes necesarios para esta parte del ciclo vital del virus). Si conside­ ramos solo este aspecto técnico del ADN, la terapia génica es una posibilidad real. El proceso funciona muy bien en el labo­ ratorio, donde podemos separar las células y realizar un clona­ je con ellas; el problema para aplicaciones médicas es la dificul­ tad de llegar con el virus a todas las células del cuerpo. El ADN no es el límite en este caso, pero sí la biología celular. Cuanto más entendemos del ADN en su forma bruta, y también sobre la manera en que es interpretado por las cé­ lulas, mejores vectores podremos diseñar. En este sentido, el clonaje de un fragmento de ADN cromosómico de rana en un plásmido no solo ha marcado el inicio de la biología mole­ cular verdadera, sino que ha iniciado un proceso continuo de evolución. En los años setenta, sin embargo, la creatividad con la cual se podía trabajar el ADN se vio limitada al hacer manipulaciones “a ciegas”, solo cortando y pegando. Otra di­ mensión se añade cuando podemos conocer la secuencia exacta, es decir, cuando podemos “leer” y “escribir” el ADN. Esta dimensión se explicará en los próximos capítulos.

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CAPÍTULO 4

Aprender a leer o la secuenciación del ADN

En el capítulo anterior hemos visto que las enzimas de restric­ ción y los plásmidos permiten aislar un fragmento de ADN del resto del genoma de un organismo y clonarlo en la Escherichia coli para su posterior análisis. De la misma mane­ ra, es posible producir una secuencia de aminoácidos codifi­ cada, es decir, una proteína, a través del ADN introducido. Al final, las proteínas son las moléculas que realizan la mayor parte del trabajo en la vida, no solo el trabajo físico de los músculos, sino también las transformaciones químicas. Te­­ niendo en cuenta algunas limitaciones técnicas, es factible producir una proteína de una bacteria en plantas y viceversa. Debido a la posibilidad de aislar un plásmido e introducirlo en las células de otro organismo, ya no existen en el laborato­ rio las barreras naturales de las especies. El clonaje funciona porque nos permite aislar solo las células que contienen el fragmento de ADN adecuado y eliminar el resto; de esta manera, es posible obtener una población homogénea de células productoras. Inicialmente, el uso de los plásmidos se parecía mucho al trabajo gené­ tico realizado en los siglos anteriores. Para ver si un ADN se había transferido al organismo anfitrión, simplemente se buscaban clones con las propiedades deseadas. El lector atento habrá notado, sin embargo, que falta un aspecto 65

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importante. Podemos comprar un libro por el color de la por­­ tada, pero esto no significa que sepamos de qué va la his­­toria. Para enriquecer de verdad nuestros conocimientos hace fal­ ta leer el contenido. Aprender a “leer” ha sido uno de los hallazgos más importantes para la genética, ya que nos ayu­ da a entender cómo los seres vivos usan la información em­ paquetada en el ADN. En varias ocasiones hemos comparado el ADN con una lengua, aunque una muy reducida que solo tiene las letras A, T, C y G. Conocer estas letras permitió a los doc­ tores Watson y Crick componer su modelo de la doble héli­ ce y contrastarlo con los cristales obtenidos por Rosalind Franklin. El lenguaje del ADN en su forma más básica ni siquiera tiene puntuación (carece de espacios, puntos y co­ mas), y se necesita una buena dosis de imaginación para encontrar palabras reales. Quizá sería mejor comparar el ADN con las inscripciones fenicias primitivas en vez de una lengua moderna. Para que una célula pueda interpretar la función de las bases, sobre todo es importante el orden en que aparecen. Quizá en la época de Watson y Crick el orden de las bases parecía irregular, pero hoy en día sabe­ mos que la evolución ha impuesto unas normas bastante estrictas. Una de las reglas más importantes es el código genéti­ co y dicta la relación entre el orden de las bases en el ADN y la producción de proteínas (pensemos en el dogma cen­ tral de Watson y Crick). El mismo Crick ya había demos­ trado, en el año 1961, que la producción de un polipéptido siempre requiere un múltiplo de tres bases. Junto con Sydney Brenner y otros investigadores, Crick descubrió que insertar o quitar una sola base daba lugar a otra pro­ teína y por lo tanto cambiaba el código del ADN. El expe­ rimento Crick-Brenner fue ampliado por los doctores Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei, además de por el grupo de Severo Ochoa. Todos determinaron cuáles de las combinaciones de tres bases (un triplete) daban lugar a la incorporación de qué aminoácido en los ribosomas. 66

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Curiosamente, los mismos tripletes señalaban los mismos aminoácidos en todos los seres vivos, una muy buena indi­ cación de la relación entre ellos. La igualdad de este código genético también indicaba que debía ser posible producir una proteína de un ser vivo en otro; por ejemplo, obtener la insulina humana en una bacteria. Sin embargo, rápidamente científicos de todo el mundo se dieron cuenta de que existían barreras más allá del código genético: que en el laboratorio se pudiera intro­ ducir un gen humano en un plásmido de Eschericha coli no significaba que la bacteria se convirtiera en humana. De al­ guna manera, las señales de alrededor de los tripletes codifi­ cantes suelen ser específicas para los mamíferos o para las bacterias. En la introducción hemos visto que existe una varie­ dad de proteínas para interpretar el ADN. Si una célula no dispone de las proteínas adecuadas para reconocer el prin­ cipio de un gen (por ejemplo la proteína X en la figura 2), este gen simplemente es ignorado. También puede pasar que un fragmento de ADN generado por una enzima de restricción elimine alguna secuencia importante y solo que­ de parte del gen completo. También estos fragmentos de ADN pueden ir “de paquete” en los plásmidos pero no dan lugar a ningún fenotipo. Para poder dirigir el proceso de cortar, pegar y clonar ha sido necesario desarrollar técnicas que nos permitan descifrar de verdad el ADN. Por ello, an­ tes de interpretar un texto hay que aprender a leerlo. Dado que estas técnicas para descifrar el ADN permiten “leer” una secuencia de bases, el conjunto de ellas se llama “se­ cuenciación”.

Un ‘puzle’ de fragmentos de ARN Los primeros intentos de descifrar una secuencia no utiliza­ ban ADN, sino ARN, por la simple razón de que los biólogos de la época disponían de enzimas bien caracterizadas para 67

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fragmentar el ARN. En contraste con la restricción enzimáti­ ca del ADN, las enzimas que actúan sobre el ARN no necesi­ tan palíndromos (el ARN normalmente existe como una sola cadena) y producen multitud de fragmentos muy pequeños con un tamaño de 6 a 9 bases. Una segunda fragmentación, cortando cada fragmento hasta obtener cadenas de 2 a 4 ba­ ses, produce docenas de piezas de “puzle”. Estas piezas son lo bastante simples para ser identificadas con métodos quími­ cos tradicionales. De hecho, a finales de los años 1960, un grupo dirigido por el doctor Frederick Sanger consiguió re­ componer la secuencia del ARN ribosómico de la Escherichia coli. El ARN ribosómico es muy abundante y puede separar­ ­se de las demás moléculas después de romper las bacterias y centrifugar las partículas de los ribosomas. El trabajo consi­ guió descifrar un total de 120 bases o letras, que aunque hoy en día sabemos que es una fracción mínima de los millones de bases que componen un genoma completo, en su momento fue un gran paso en la secuenciación. Antes de inventar el clonaje en plásmidos, secuenciar un fragmento de ADN entre miles de secuencias similares era algo impensable. Los pocos datos de información genética de los años sesenta describen secuencias de moléculas de ARN abundantes, como por ejemplo las que proceden de los vi­ rus. Determinar una secuencia de ADN con las mismas téc­ nicas era un sueño inalcanzable. La falta, hasta una década más tarde, de técnicas de aislamiento de fragmentos peque­ ños y la ausencia de enzimas de fragmentación adecuadas impedía este desarrollo. Recordemos brevemente que la ma­ yoría de enzimas de restricción cortan en palíndromos, los cuales se localizan de manera muy dispersa en el ADN. Aunque existen enzimas que cortan el ADN de manera in­ discriminada, estas son tan poco específicas que producen fragmentos imposibles de analizar. Había que buscar otras maneras que los biólogos conseguirían sí o sí. No poder ha­ cer algo siempre es un reto irresistible para algunas personas y, entre los científicos, convertir lo imposible en una realidad es quizá la motivación principal de su trabajo. 68

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Aislar ADN sin usar un plásmido Una posible solución al problema del aislamiento de fragmen­ ­tos pequeños la exploraron los doctores Maxam y Gilbert, que trabajaban en la Universidad de Harvard (Estados Unidos). En vez de clonar un fragmento de ADN en un plásmido, deci­ dieron aislar un fragmento de ADN que se unía a una proteí­ na reguladora de la actividad génica. Todos los fragmentos de ADN se parecen mucho químicamente, pero cada proteína tiene propiedades bastante únicas y puede separarse de las de­ más; entonces, si se puede obtener una preparación pura de una proteína que reconoce una secuencia de ADN concreta, también este ADN debe haberse purificado junto con la pro­ teína. De esta forma, la secuencia “sobresaldría” por encima del ruido de fondo y podría detectarse. Este fenómeno se pue­ de comparar con la típica “sopa de letras”: una vez que en­ cuentras una palabra es difícil no volver a fijarte en ella. Para llevar a cabo su experimento tuvieron que hacer crecer las Escherichia coli en tanques de 150 litros. Era nece­ sario aislar una gran variedad de enzimas y usarlas en otros ensayos para obtener una cantidad suficiente de ADN. Después de muchos pasos de purificación, Maxam y Gilbert transcribieron el ADN a ARN mediante la enzima ARN po­ limerasa, de la misma forma que sucede con los genes en nuestro cuerpo. Al final, Maxam y Gilbert acababan secuen­ ciando un fragmento de ARN igual que los compañeros ante­ riores. ¡Varios años de trabajo que dieron lugar a una secuen­ cia de tan solo 24 bases! Sabiendo que un pequeño plásmido mide alrededor de 4.000 bases, unas 150 veces más que la primera secuencia de 24 letras, uno puede imaginar el gigantesco trabajo de en­ samblaje y las cantidades inmensas de bacterias necesarias para obtener una secuencia verdaderamente útil. Aunque es­ tos trabajos iniciales despertaron el interés por descifrar se­ cuencias más largas, incluso la secuencia completa del geno­ ma humano, mostraban la gran limitación de la fragmentación del ARN. Algunas secuencias simplemente no se pueden 69

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determinar cortando únicamente con enzimas de restricción, ya que o son secuencias repetitivas (ATATATATAT) y pro­ ducen múltiples fragmentos idénticos, o sencillamente no exis­ ­ten enzimas naturales para cortarlas.

Fragmentos de ADN con un tamaño determinado Tanto el grupo dirigido por los doctores Maxam y Gilbert como el grupo del doctor Sanger eran muy conscientes de la escasa eficacia del método “puzle” y se pusieron a trabajar para encontrar otras opciones. Mientras el doctor Maxam eli­ gió la química, el doctor Sanger atacó el problema usando su experiencia con proteínas (ya en el año 1958 fue galardonado con el Premio Nobel por haber determinado la estructura de la insulina). Ambos grupos coincidieron en la idea de usar una cantidad grande de ADN idéntico, como por ejemplo los plásmidos, ya que estos eran relativamente simples. Cua­ ­tro años después del método “puzle”, los doctores Maxam y Gil­­bert habían desarrollado una serie de reacciones químicas que permitieron leer centenares de bases procedentes de cualquier ADN. El método de Maxam y Gilbert depende del marcaje radiactivo del ADN en un extremo, pero no en el otro; normalmente se usa la enzima kinasa, que transfiere el fos­ ­fato desde el ATP al ADN. Este procedimiento “fija” este ex­ tremo (figura 13). El segundo paso consiste en la fragmentación química del ADN, sin destruirlo por completo, para generar los frag­ mentos. Usando distintos compuestos químicos, la fragmen­ tación puede producirse entre distintas combinaciones de bases. Finalmente, los fragmentos se separan para resolver la secuencia. El tamaño de cada fragmento corresponde a la se­ cuencia a una distancia fija desde el extremo que ha recibido la marca radiactiva. El método de Maxam y Gilbert es univer­ sal, aunque bastante laborioso, y se sigue usando para situa­ ciones en las cuales no se pueden aplicar técnicas alternativas. La gran ventaja de este método es la posibilidad de secuenciar 70

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un ADN sin conocimientos anteriores, ya que se marca con radiactividad el propio ADN que se analiza. Figura 13 Secuenciación química de ADN según Maxam y Gilbert. La primera fila representa una secuencia hipotética con un extremo marcado (asterisco), la segunda fila indica la combinación de bases donde se producen los cortes químicos (en cuatro reacciones distintas) y la tercera fila, los productos que se forman. Finalmente, el gel se lee restando los carriles centrales de los extremos (por ejemplo: cortar en A+G pero no en G significa una A en la secuencia). Vemos que la primera base no se puede leer. El gel se lee de abajo arriba, ya que los fragmentos de ADN más pequeños se mueven más rápido.

Aprovechar lo que proporciona la biología En la misma década, el doctor Frederick Sanger inventó una manera de secuenciar mucho más fácil. Este método usa la actividad biológica de la ADN polimerasa en un proceso pa­ recido a la duplicación de un cromosoma en la propia célula. La observación de la complementariedad de las bases por Watson y Crick ya sugería que la duplicación del ADN se realizaba mediante un mecanismo semiconservador, es decir, sin destruir los enlaces entre los azúcares, pero sí separan­­do las dos cadenas. En el año 1954, los doctores Meselson y 71

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Stahl diseñaron un experimento para comprobar esta hipóte­ sis basado en cargar el ADN con nitrógeno pesado (con una masa de 15 en vez de la masa natural de 14). Meselson y Stahl simplemente alimentaban a la Escherichia coli con nitrógeno 15 durante un tiempo. Después de volver a alimentar las bac­ terias con nitrógeno 14 pudieron separar los cromosomas pe­ sados (con N15) de los cromosomas ligeros (con N14). El experimento mostraba que los cromosomas con masa inter­ media (mitad N15, mitad N14) disminuían, mientras que los cromosomas ligeros aumentaban en número durante el creci­ miento de las Escherichia coli. La única interpretación es la conservación del nitrógeno 15 en cromosomas pesados, sin mezclarse con los cromosomas nuevos ligeros con nitrógeno 14. El ADN usa una cadena como molde para sintetizar la cadena opuesta. Otra indicación importante para Frederick Sanger fue­ ron los experimentos realizados en el grupo de Arthur Kornberg, en Stanford. El doctor Kornberg había trabajado con Severo Ochoa a finales de los años 1940 y los dos habían compartido el Premio Nobel en 1959. Los experimentos de los años sesenta indicaban la importancia de un punto espe­ cífico para que la ADN polimerasa reconozca dónde debe empezar la producción del ADN nuevo. El grupo de Kornberg observaba que añadir ADN desnaturalizado (separando las dos cadenas) promovía la producción de grandes cantidades de ADN por la polimerasa. Dado que el ADN de una cadena parece activar la polimerasa, lo llamaban “cebador” (del in­ glés, primer). La pista final para Sanger fue la descripción de la replicación de los plásmidos, un trabajo realizado por Regis Kelly, del grupo de Kornberg. Dado que los plásmidos no tienen principio ni fin (son círculos), la pregunta era dónde empezaba la ADN polimerasa a incorporar nucleótidos. Regis Kelly descubrió que la apertura de una de las dos cade­ nas abre el plásmido, dando acceso a la polimerasa; entonces la polimerasa reconoce el hidróxido situado en el carbono 5 de la desoxirribosa para acoplar allí el fosfato del carbo­ no 3 de un nucleótido libre. La síntesis de ADN nuevo por la 72

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polimerasa hace crecer la cadena desde el extremo 3-prima (figura 6). El doctor Sanger usó la capacidad natural de la polime­ rasa para incorporar bases nucleotídicas partiendo de una apertura en el ADN y copiando la cadena opuesta. En la prác­ ­tica resulta complicado abrir una sola cadena, ya que las en­ zimas de restricción cortan en ambos lados casi al instante. Los plásmidos usan su propia enzima especializada, que re­ conoce un segmento de ADN bastante largo (“ori” en la figu­ ra 11) y situado lejos del inserto. Esto hace impracticable el uso de esta enzima especializada para la secuenciación. Frederick Sanger decidió apoyarse en una técnica de Alexander Todd, que había conseguido producir fragmentos cortos de ADN por una vía química. La idea genial de Frederick Sanger era diseñar un cebador muy corto, de unas 20 bases, que reconociera un sitio conocido en el plásmido. Este cebador (figura 14) activaba la polimerasa de forma si­ milar al ADN desnaturalizado de Kornberg, pero siempre lo hacía en el mismo sitio, igual que la apertura en una cadena. Por lo tanto, el método de Sanger implicaba conocer de ante­ mano una pequeña parte de la secuencia. En la actualidad, muchos plásmidos incorporan la secuencia de 24 bases deter­ minada por Maxam y Gilbert, situado en el gen lacZ justo al lado de sitios donde se inserta el ADN desconocido. En contraste con la fragmentación, el método de Sanger usa la incorporación de nucleótidos modificados para termi­ nar la nueva cadena de ADN, una para cada letra A, T, C y G. El producto es una colección de cadenas de ADN que termi­ nan en una de las cuatro bases modificadas y que tienen un tamaño conocido. La separación de estas cadenas permite leer la secuencia de bases del molde original de una manera bastante natural, de un lado al otro. La solución del doctor Sanger al problema biológico resultó ser muy curiosa, ya que la lectura de una secuencia larga depende de escribir la última letra del texto de una manera especial. Es decir, conocemos el contenido del texto porque podemos discriminar esta última letra y todo tiene sentido al añadirla al texto anterior. 73

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Figura 14 Secuenciación enzimática de ADN según Sanger. Aunque Frederick Sanger ha desarrollado varias técnicas de secuenciación, el método que ha sobrevivido se basa en la terminación de la cadena recién producida por un nucleótido dideoxi. La polimerasa no puede acoplar otra base a este nucleótido porque carece del grupo hidroxilo en posición C3. La técnica usa cuatro reacciones, cada una dopada con un nucleótido dideoxi específico. La distancia fija entre el cebador y la terminación determina el tamaño del ADN y la lectura se produce de abajo arriba, igual que la secuenciación de Maxam y Gilbert.

Sanger encontró un último problema con la síntesis de ADN en un tubo. Para que la polimerasa pueda duplicar efi­ cazmente un plásmido degrada la cadena de ADN que en­ cuentra enfrente. Entonces, la apertura en una de las cadenas se desplaza a lo largo de la otra cadena mientras el plásmido se duplica. La misma actividad enzimática puede, literalmen­ te, quitar unas bases en las reacciones de Sanger. Esto cambia el tamaño del producto y hace que la banda acabe en otro si­ tio. Frederick Sanger, con el fin de evitar que la polimerasa 74

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eliminase la cadena recién producida (exonucleasa) y me­ diante la integración de diferentes conocimientos y la bús­ queda bibliográfica, consiguió descifrar cómo separar la acti­ vidad polimerasa de la actividad exonucleasa. En el año 1971, Hans Klenow, del Instituto de Bioquímica de Copenhague, había mostrado que las dos actividades enzimáticas se separa­ ran al cortar la enzima con una proteasa. En el caso de Sanger, simplemente empleó el “fragmento Klenow” para sus reac­ ciones de secuenciación y nunca más tuvo problemas de de­ gradación del ADN. En manos de un experto, el método Sanger produce has­ ta 1.000 bases en una sola reacción (o combinación de cuatro reacciones). La técnica es tan eficaz que es responsable de la mayoría de las secuencias conocidas en la actualidad. Los dos métodos de secuenciación de ADN tienen enormes ventajas sobre el método “puzle”, aplicado antes para secuenciar el ARN. Es fácil imaginarlo si pensamos en un libro, que nos gusta leer desde el principio hasta el final y no por partes te­ niendo que recomponer una historia fragmentada. Además, para las técnicas modernas de secuenciación es suficiente con cultivar unos pocos mililitros (aproximadamente un dedal) de Escherichia coli u otra bacteria. Si miramos la historia de los doctores Maxam, Gilbert y Sanger, destaca de nuevo el factor humano. A principios de 1970, los doctores Maxam y Gilbert tenían todas las claves para desarrollar el método de la secuenciación moderna.Ya ha­ bían aplicado la mayoría de las técnicas necesarias en su pu­­ blicación inicial, tanto el uso de cebadores como una enzima polimerasa (aunque de ARN), y además habían utilizado un no­­vedoso método de separación que permitía discriminar dife­ rencias de una sola base en la cadena de ARN o ADN. Sin embargo, Maxam y Gilbert decidieron distanciarse de las enzi­ mas, quizá porque su experimento basado en la purificación de proteínas era una verdadera aventura en aquella época. Al final ambos eligieron el camino “seguro” de la química clásica. Ya que la historia de la biología molecular desde enton­ ces nos ha mostrado el poder de las enzimas y hemos hablado 75

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de las enzimas de restricción, en los próximos capítulos abor­ daremos más en profundidad estas proteínas especiales. Qui­ ­zá haya sido una decisión afortunada, o quizá una visión pro­ digiosa, pero solo en los últimos años hemos visto técnicas químicas capaces de plantarle cara al método Sanger. Por ello, repasaremos estas técnicas de última generación al final del capítulo.

Esto también merece un Premio Nobel Es fácil imaginar el poder que nos da el aprendizaje de la lec­ tura. Marca la diferencia entre no entender ningún libro a tener acceso a toda la información imaginable. No sorprende, por tanto, que los doctores Maxam y Sanger fueran galardo­ nados con el Premio Nobel en 1980, aunque tuvieron que compartirlo con el doctor Paul Berg, que recibió su parte por la aplicación de las enzimas de restricción. La combinación del clonaje de fragmentos de ADN en un plásmido y su pos­ terior secuenciación ha resultado ser un procedimiento muy poderoso y ha supuesto la base de la biología molecular du­ rante décadas. La sinergia entre los dos descubrimientos ha producido un importante efecto bola de nieve, ya que la se­ cuenciación muestra en un fragmento de ADN dónde se lo­ calizan los sitios de corte para las enzimas de restricción mientras estas últimas permiten separar y clonar nuevos frag­ mentos de ADN en plásmidos para su secuenciación. El efec­ to final ha sido impresionante: mientras la genética se basó en seguir características, igual que Mendel, durante todo un si­ glo, la secuenciación ha permitido a los biólogos manipular fragmentos de ADN de manera independiente y controlada en menos de una década. Incluso el Proyecto Genoma Humano, que comenzó en el año 1990, se ha basado parcial­ mente en la secuenciación de fragmentos de ADN humano clonados en Escherichia coli. En el capítulo anterior hemos visto el clonaje escopeta, es decir, la inserción de fragmentos aleatorios en un plásmido 76

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desde un origen conocido en común. Si quisiéramos insertar todo el material genético de un organismo, como podría ser el ADN de una biopsia, con el clonaje escopeta se generarían millones de plásmidos distintos. El conjunto de estos plásmi­ dos se denomina librería, ya que abarca todas secuencias del material de entrada (por lo menos en teoría, dado que algu­ nos genes pueden tener un efecto tóxico y matar a las Es­­ cherichia coli). Por lo tanto, después de secuenciar cada plás­ mido de la librería de manera individual, debemos ser capaces de recomponer la secuencia total de la biopsia. Aunque esta estrategia tiene sus desventajas, como la repetición de secuen­ cias que se solapan entre sí, ha contribuido enormemente a la secuenciación del genoma humano. La técnica de Sanger supuso un avance importante y generó bastantes datos que contribuyeron a impulsar el uso de ordenadores en biología molecular, aunque esto será tema para un capítulo posterior. Al mismo tiempo, su aplicación práctica también conllevó algunas desventajas: para obtener una se­ cuencia a base de una cantidad de ADN mínima se necesitaba un marcaje radiactivo. La lectura final se realizaba exponiendo una radiografía y leyendo a mano cada base. Unos 20 años después de la primera aplicación, varios grupos de investigado­ res consiguieron modificar el método para su uso automatiza­ do. La incorporación de bases fluorescentes en vez de radiacti­ vas permitió detectar cada letra con una combinación de luz láser y cámara digital; aunque la secuenciación fluorescente requiere un equipo especializado, la automatización significa que gran parte del trabajo corre a cargo de un robot. De esta forma, para la mayoría de centros de investigación ya no resul­ taba rentable realizar esta técnica en el propio laboratorio. En la actualidad, lo más común es enviar los fragmentos de ADN por correo postal a una empresa especializada y esperar a que devuelvan los resultados al correo electrónico. Debemos imagi­ narnos que la mayoría de secuencias simplemente sirven para confirmar datos anteriores o experimentos individuales y ni siquiera acaban en las bases de datos. ¡La secuenciación ha llegado a la época actual de usar y tirar! 77

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Leer aún más rápido gracias a la miniaturización El deseo continuo de juntar información genética ha empuja­ do a la ciencia a inventar técnicas cada vez más poderosas. El Proyecto Genoma Humano mostraba que era factible pero no muy práctico dividir nuestros cromosomas en millones de fragmentos para su secuenciación individual. Aunque este proyecto se daba por finalizado en el año 2003, todavía hoy quedan algunos huecos o “espacio en blanco” en el mapa co­ rrespondiente. Recordemos que el número de bases en un genoma puede variar del medio millón (para algunas bacte­ rias muy simples) hasta varios miles de millones (para la ma­ yoría de vertebrados). Dado que las secuencias más largas que podemos determinar de un tirón con la técnica de Sanger miden alrededor de 1.000 bases, la única solución es realizar muchas reacciones a la vez. Para una bacteria simple necesi­ taríamos unos 500 tubos de reacción y para el genoma huma­ no entre 5 y 6 millones. Ni siquiera los robots de laboratorio que actualmente realizan estas manipulaciones pueden ma­ nejar esa cantidad de tubos. Entonces la solución al problema es simple: si no se pueden manejar tantos tubos de reacción, habrá que prescindir de ellos por completo. Así, la última ge­ neración de técnicas de secuenciación combina la miniaturi­ zación con la biología molecular, dando lugar a la secuencia­ ción en un microchip. A mitad de los años noventa, un grupo de investigadores dirigido por el doctor Patrick Brown usaba un robot para or­ denar 48 fragmentos de ADN en una superficie de cristal. Cada mancha o spot de ADN podía hibridar con secuencias específicas y se comportaba igual que una única reacción en un tubo. De esta manera, una pieza única de cristal se conver­ tía en el equivalente de 48 tubos de reacción y el trabajo se realizaba 48 veces más rápido; actualmente podemos ordenar miles de fragmentos en un cristal de 1 x 5 centímetros simple­ mente depositando manchas cada vez más pequeñas. El po­ der usar cantidades mínimas de ADN nos ha mostrado la posibilidad de convertir un pequeño cristal en un laboratorio 78

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completo, aunque solo esto no sea suficiente para realizar la secuenciación. Mientras la hibridación de dos cadenas de ADN no re­ quiere ninguna actividad biológica especial salvo recordar la identidad de las manchas depositadas, la secuenciación de­ pende de la incorporación o “escritura” de nucleótidos indi­ viduales. Además, la secuenciación clásica que hemos visto al principio del capítulo separa las cadenas según el número de bases. Ni siquiera en la actualidad somos capaces de miniatu­ rizar esta separación al nivel de un microchip. De nuevo, la solución consistía en olvidarse de necesidades e inventar un procedimiento completamente nuevo. Finalmente, una serie de inventos a lo largo de los años noventa fueron combinados en una sola técnica que nos permite secuenciar el genoma humano en dos días. Veremos entonces cómo funciona esta “secuenciación de próxima generación” o next generation se­ quencing. Un primer obstáculo para cualquier método masivo es producir bastantes fragmentos para cubrir toda la secuencia deseada. La manera más fiable de fragmentar el ADN es bas­ tante sencilla y consiste en pasarlo por un agujero muy fino a alta presión. La presión destruye el ADN, pero genera frag­ mentos con un tamaño muy reproducible. En contraste con las enzimas de restricción, no sabemos dónde se ha produci­ do la rotura; incluso es probable que la misma secuencia pro­ cedente de células distintas se rompa de maneras diferentes. Esto produce un patrón de fragmentos que se solapan entre sí y permiten complementar sus secuencias mutuamente. El próximo paso es mantener separados todos los frag­ mentos que queremos seguir. Depositar 48 secuencias cono­ cidas en un cristal solo era el principio, ya que el genoma de un mamífero se divide en millones de fragmentos. Usar ade­ más un robot para depositar cada fragmento no solo tardaría mucho tiempo (dividir 50 millones por el número de segun­ dos en un día nos saldría año y medio), sino que también re­ queriría de superficies enormes (medio metro cuadrado po­ niendo 100 manchas por milímetro cuadrado). En este paso 79

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del proceso, la propia biología molecular de los años setenta nos ha ayudado mucho. Usando la enzima ligasa, con capaci­ dad de soldar fragmentos de ADN, podemos añadir una pe­ queña secuencia conocida a un extremo de cada fragmento. Una secuencia de este tipo se denomina “adaptador” y tiene varias funciones; por ejemplo, el adaptador puede incluir una secuencia identificadora (un código de barras) para cada muestra, pero además puede hibridar con otra secuencia que ha sido anclada químicamente en la superficie de un micro­ chip. De esta manera, los fragmentos modificados con un adaptador se pueden fijar en el microchip para ser secuencia­ dos en su sitio (lo que se conoce como fase sólida). El código de barras hace posible mezclar más de una muestra por chip y distinguir la muestra de la que procede cada fragmento sim­ plemente encontrando este código en la secuencia final. Estos pasos son el equivalente a generar una librería de plásmidos, aunque aquí prescindimos del clonaje y ya no ne­ cesitamos la ayuda de la Escherichia coli. En vez de colonias de bacterias en una placa de Petri, el anclaje físico a la super­ ficie del microchip mantiene separados cada fragmento y ase­ gura su análisis individual. El problema es que las manchas que se depositan por el método adaptador son tan pequeñas que una separación clásica de fragmentos es inútil para su detección. Para poder leer este microchip con ADN, un láser escanea la superficie. Cada letra A, T, C, o G tiene su propio color y brilla cuando pasa el láser. La máquina de secuencia­ ción (ya no la manejan humanos) solo tiene que recordar las coordenadas de cada pulso de color y añadirlo a los colores que han surgido antes en el mismo sitio. Al final de todo el proceso, la secuencia de colores se traduce a una secuencia legible. Para poder leer la próxima base, una manipulación química borra el color de la última base y permite la inserción de una base más por parte de la polimerasa. Este paso sigue la misma filosofía que la técnica inventada por Sanger hace más de 30 años. ¡Las buenas ideas siguen vivas! Existen métodos alternativos a la secuenciación en fase sólida, el nombre por el que se conoce a este método. Algunas 80

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de estas técnicas han llegado a niveles de miniaturización tan altos que se acoplan simplemente a un puerto USB de un or­ ­denador. Justo antes de escribir este libro, el último grito fue una expedición a la jungla para secuenciar el genoma de ani­ males y plantas desde la misma tienda de campaña.

Una interpretación sobrehumana Un problema inevitable en la secuenciación masiva, sea como sea la técnica, es que produce millones de secuencias cortas que pueden ser continuas o no. El uso de fragmentos “a lo bruto” significa que las máquinas de secuenciación devuel­ ven millones de secuencias aleatorias. Tan solo después de obtener tantas secuencias nos preocupamos por la manera en que se puede reconstruir la secuencia original. Al igual que con el método de Maxam y Gilbert en los años 1970, la secuenciación masiva produce piezas de “puzle” como las que he­­mos visto al principio del capítulo. El problema es que mientras que los puzles en la época de Maxam y Gilbert se podían resolver con lápiz y papel, los modernos pueden tener hasta 250 millones de piezas. El ser humano ya no es capaz de reconstruir esta inmensa cantidad de información y necesita­ mos la ayuda de los ordenadores para este trabajo.

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CAPÍTULO 5

Aprender a escribir o amplificar el ADN

Aunque las bacterias crezcan muy rápido, el clonaje de un fragmento de ADN requiere dos o tres días de trabajo en el laboratorio. Las colonias en la placa de Petri que hemos mos­ trado en el capítulo anterior necesitan crecer durante toda una noche para que el ojo humano pueda verlas bien. Después, simplemente se toca cada colonia con un palillo de madera es­ terilizado que se transfiere a un medio líquido para que crezca durante otra noche. Para determinar si el clonaje ha tenido éxi­ to, se extraen los plásmidos de varias colonias, se cortan con enzimas de restricción y se separan los fragmentos de ADN en agarosa. Las enzimas de restricción tardan normalmente dos horas en encontrar todas las secuencias que deben reconocer y la separación en el gel necesita otra hora más. Hemos explicado que el clonaje mediante cortar y pegar es muy poderoso y se usa a diario, aunque tiene unas limitacio­ nes importantes. Tenemos a nuestra disposición unas 200 enzi­ mas de restricción, pero todavía encontramos fragmentos de ADN que no se dejan manipular de esta manera. Hay que re­ cordar que casi todas las enzimas de restricción reconocen pa­ líndromos cortos. Algún palíndromo puede aparecer dentro del fragmento que nos interesa y si elegimos mal la enzima, destrui­ mos el fragmento. Hay otros segmentos de ADN donde en mi­ les de bases encontramos muy pocos sitios de reconocimiento 82

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para enzimas de restricción. Además, cortar un genoma com­ plejo con enzimas de restricción produce miles de fragmentos, que necesitan un análisis posterior para su comprobación. El método escopeta es muy útil para crear una librería de frag­ mentos, pero significa testar miles o incluso millones de colo­ nias de Escherichia coli. Si el fragmento que nos interesa no aporta ningún fenotipo especial (al estilo Mendel), hay que bus­­car otras maneras para encontrarlo entre los demás frag­ mentos de ADN. Veamos cuáles son las posibilidades.

Una base molecular prevista por Watson y Crick Por la estructura de la doble hélice de Watson y Crick sabemos que las dos cadenas de ADN son complementarias y se conec­ tan por las bases opuestas (A contra T y C contra G). Estos puentes de hidrógeno trasversales en el ADN mantienen la unión entre las dos cadenas opuestas en un proceso llamado “hibridación”. En las décadas de los sesenta y setenta varios grupos de investigación aprendieron a utilizar esta propiedad química. Cuando se calienta un segmento de ADN, casi hasta que hierva, las dos cadenas se separan y las bases quedan ex­ puestas al exterior. También en la naturaleza las dos cadenas de ADN se separan a menudo para, por ejemplo, su duplicación o su transcripción a ARN. Curiosamente, la separación de las dos cadenas es completamente reversible. Al bajar lentamente la temperatura, cada base busca otra complementaria con la cual formar un puente. En este proceso, bases colindantes se refuer­ zan mutuamente, lo que significa que dos secuencias comple­ mentarias pueden cerrarse como una cremallera mientras se­ cuencias muy diferentes se repelen mutuamente (figura 15). Al principio del libro hemos visto que el ADN con fre­ cuencia abarca miles de bases. La cremallera no necesaria­ mente tiene que ser perfecta para mantener unidas las dos cadenas opuestas, sino que las diferencias permiten tener un par de bases sin hibridar dentro de una secuencia más larga; esto también pasa en la naturaleza y puede dar lugar a una 83

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mutación espontánea. En general, la proporción de desajuste determina si las dos cadenas se mantienen en forma de doble hélice o si se deshacen fácilmente al calentar. En la estructura de la doble hélice podemos apreciar que las bases G y C están uni­ das por más puentes que las bases A y T, tres en vez de dos. Esto también se refleja en la fuerza entre las dos cadenas: es más di­ fícil separar secuencias ricas en G y C que secuencias ricas en A y T. Esta propiedad química e intrínseca del ADN la aprovecha­ ron varios grupos de investigación, que descubrieron que tam­ bién cadenas de distintas procedencias podían hibridarse. Cargar el material genético con radiactividad, simplemente ali­ mentando a un animal o una planta con alimentos radiactivos, permite seguir las moléculas relevantes en experimentos poste­ riores en la forma en que lo hicieron Hershey y Chase. A lo largo de los años sesenta, varios grupos de investigación usaron la hibridación para determinar el grado de similitud entre dis­ tintos tipos de bacterias. Después de anclar los cromosomas de una bacteria en un pequeño filtro, los hibridaban con ADN ra­ diactivo. La proporción de radiactividad que quedaba después de lavar indicaba el grado de relación entre las bacterias. Un logro muy importante se produjo en el año 1975, cuando el doctor Ed Southern, de la Universidad de Edim­­ burgo, decidió combinar la separación de fragmentos de ADN con la hibridación. Al cortar un plásmido, normalmente se ob­ tienen entre dos y cinco fragmentos, que dan un patrón reco­ nocible con distintas “bandas” después de separarlas en el gel. Aplicando esa misma técnica a un conjunto de ADN más com­ plejo, por ejemplo los cromosomas humanos, se obtienen miles o millones de bandas. Aunque este número de bandas también se separen en agarosa, se colocan tan cerca entre sí que el pa­ trón obtenido recuerda a la cola de un cometa. Esta “cola” con­ tiene un registro con secciones de todo el material genético, igual que una librería de ADN, pero ordenadas según el tama­ ño de cada fragmento. Ed Southern se dio cuenta de que la visualización de una única banda dentro de esa cola de cometa podía ser muy útil, ya que permitiría seleccionar unos pocos fragmentos dentro del registro completo. 84

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Figura 15 Esquema de la hibridación entre cadenas complementarias. Normalmente la hibridación combina un ADN inmovilizado (esferas grises) contra el cual se prueba una sonda marcada (asterisco). El grado de similitud entre diana y sonda determina cuánta hibridación se produce (flechas), no hace falta que las dos cadenas sean cien por cien complementarias.

La técnica consiste en abrir la doble hélice del ADN des­ pués de separarlos en fragmentos, pero cuando todavía están en el soporte de agarosa. Mientras otros investigadores her­ vían el ADN para abrir la doble hélice, un proceso que funde la agarosa y hace perder el soporte, Ed Southern aplicaba una solución de sosa que mantenía el gel intacto. Después, todo el ADN abierto se transfería a una membrana, como si estuvié­ ramos haciendo estampación. El proceso es muy rudimenta­ rio, casi artesanal, ya que usa la capilaridad para pasar un lí­ quido por el gel y arrastrar los fragmentos hacia un filtro que capta el ADN. Entonces, en contraste con un clonaje estilo escopeta, donde se producen miles de colonias separadas, la transferencia desde el gel al filtro mantiene todos los frag­ mentos juntos en el mismo soporte (aunque ordenados por su tamaño). La estampación solo es la primera parte, la se­ gunda consiste en revelar la presencia de un solo fragmen­ ­to de interés. Con el fin de detectar un único fragmento, Ed 85

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Southern combinaba varias técnicas de purificación para obte­ ner solo el ADN que correspondía a los genes de los ribosomas (este ADN se repite en muchas copias en el genoma de los vertebrados y por lo tanto es relativamente fácil de aislar). Otros investigadores ya habían mostrado cómo encontrar úni­ camente este ADN, y Ed Southern repitió el procedimiento después de cargar todo el ADN de una rana con radiactividad. El resultado fue un fragmento único de ADN radiactivo con una secuencia determinada llamada “sonda”. Para poder hibri­ dar, la sonda se hierve antes de añadirla al filtro con el ADN estampado. Al igual que el ADN de dos bacterias distintas, las cadenas abiertas del ADN “buscan” su secuencia complemen­ taria e hibridan con ella. En este caso, el ADN radiactivo busca las secuencias más parecidas dentro de la cola de la cometa. El resultado final solo requiere exponer una película a la radiac­ tividad (figura 16). Aunque el doctor Southern no puso nom­ bre a su técnica, la palabra inglesa para una estampación es blot, y otros investigadores rápidamente adoptaron el término Southern blot en honor a su descubridor. Figura 16 Cola de cometa y bandas definidas en un Southern blot. La digestión de un ADN complejo con enzimas de restricción produce un patrón donde es difícil distinguir fragmentos individuales (izquierda). Sin embargo, la hibridación con una sonda específica muestra que cada fragmento migra según su propio tamaño en el gel (derecha). Si la muestra de ADN digerida no contiene una secuencia complementaria, la hibridación no produce ninguna señal.

Gel de agarosa

Southern blot

Fuente: Adaptado de Wikimedia Commons bajo licencia CC BY-SA 3.0.

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Los límites de la hibridación Las posibilidades de la hibridación son evidentes; es un méto­ do de identificación que no precisa de muchos conocimientos previos. Cuando dos fragmentos de ADN hibridan, pode­ mos decir que son más o menos similares aunque no dispon­ gamos de una secuencia exacta. Cuando la hibridación es escasa o ausente, la comparación nos dice que los fragmentos carecen de similitud. Por otro lado, la hibridación no propor­ ciona información exacta, como por ejemplo la secuencia completa. Al final, la hibridación simplemente muestra dónde está un fragmento de ADN interesante en un gel de agarosa. Para obtener clones de este fragmento, el procedimiento co­ mún es cortar el segmento del gel alrededor de la región mar­ cada y generar una pequeña librería. Entonces, la hibridación no nos libera por completo del clonaje, pero reduce mucho la complejidad al indicar qué tamaño de fragmento debemos usar. En vez de hacer un clonaje estilo escopeta con todo el material genético, tan solo hace falta usar alrededor de un 5%. ¡Se simplifica con ello el proceso unas 20 veces! No es nece­ sario usar un gel en la hibridación. Como se muestra en la figura 12, las propias colonias contienen ADN (cromosómico y plásmidos), que se puede abrir para la hibridación y pasar a un filtro. Aplicando una sonda sobre un filtro que ha tenido contacto con estas colonias se pueden identificar los clones (colonias) con el ADN que interese. Después del invento de Ed Southern, rápidamente apare­ cieron técnicas para visualizar otras moléculas en mezclas complejas. Igual que el ADN, también el ARN y las proteínas se dejan separar según su tamaño y transferir a un filtro. Debido a la similitud entre ARN y ADN, un nombre lógico para la detección del ARN es el northern blot, aunque este fue desarro­ llado en el año 1977 por los doctores Alwine, Kemp y Stark, de la Universidad de Stanford. En el mismo estilo de denomina­ ciones, la detección de proteínas (mediante anticuerpos) fue bautizada como western blot. Esta técnica fue inventada en el año 1979 por el grupo del doctor Harry Towbin en Basel. 87

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La hibridación es un método muy potente, pero tiene sus desventajas. El uso de radiactividad para la investigación era muy común en el siglo XX, pero en la actualidad debe evitarse. Afortunadamente, la posibilidad de producir nucleó­ tidos modificados químicamente ha permitido eliminar el uso de agentes peligrosos para la salud. En vez de radiactividad, la fluorescencia (que ya hemos visto en relación con la secuen­ ciación) es una forma de detección que se sigue aplicando. Una desventaja importante es el número de manipulaciones necesarias para obtener un resultado: hay que cortar el ADN con una enzima de restricción, preparar la sonda y si se pre­ tende obtener un fragmento de ADN puro, haría falta repetir parte del proceso para realizar un clonaje. Por tanto, la hibrida­ ción no ha eliminado nuestra dependencia de las enzimas y bacterias. Además, el conjunto de manipulaciones generalmen­ te tarda varios días. Esto quizá no es muy importante en una investigación académica, pero sí en otros entornos como un laboratorio forense. El mundo necesitaba entonces un método rápido, fiable y fácil. En el año 1983, el doctor Kary Mullis, que por entonces trabajaba en una empresa privada, encontró la respuesta en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction).

Una idea fortuita, pero genial La carrera científica de Kary Mullis podría calificarse de atí­ pica, pero sigue el mismo camino errático que ya hemos visto en Watson, Crick y otras grandes personalidades. Mullis deci­ dió cambiar su investigación directamente después de obtener su doctorado en Microbiología y trabajó durante algunos años en cardiología pediátrica, pero rápidamente dejó la ciencia pa­ ra intentar escribir obras de ficción. Al no obtener el éxito que esperaba con la escritura, dirigió una panadería. Finalmente, y con la ayuda de un amigo, Mullis encontró un trabajo en una de las primeras empresas dedicada a la biotecnología, Cetus. El trabajo de Mullis en esta empresa era la producción de 88

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fragmentos de ADN sintéticos marcados radiactivamente para su uso como sonda en una hibridación. La demanda de sondas había subido drásticamente por el desarrollo del Southern blot unos años antes. Mientras que la síntesis química de ADN fue un trabajo manual durante los setenta, a principios de los años ochenta ya era un trabajo automatizado. Gracias a la automatización, Kary Mullis tenía tiempo pa­ ra dedicarse a otras actividades, como por ejemplo la posibili­ dad de secuenciar ADN cromosómico sin tener que clonarlo en un plásmido. El problema consistía en el número de molé­ culas iguales que se podían analizar en un tubo. Cuando una molécula de ADN es muy grande, un peso igual se traduce en un número más pequeño de moléculas y una señal específica más baja en hibridación y secuenciación. En algún momento (esto ocurre bastante rápido), el tamaño de un cromosoma es tan grande que no se pueden disolver bastantes moléculas para la secuenciación de Sanger. Kary Mullis pensó en resolver este problema secuenciando las dos cadenas de ADN al mismo tiempo, es decir, con dos cebadores opuestos. De esta forma, la secuencia de una cadena serviría de verificación para la otra cadena y viceversa, al ser las dos cadenas complementarias. Debido a la automatización del departamento, el ritmo de trabajo era lo bastante relajado como para que los emplea­ dos pudieran dar paseos en coche por los alrededores. En uno de esos paseos, a Mullis se le ocurrió que la presencia de bas­ tantes nucleótidos residuales podría llenar el hueco entre los dos cebadores; si la ADN polimerasa no encontraba ninguna manera de terminar la cadena, el ADN producido incluiría una secuencia donde podría hibridar el cebador opuesto. El mismo efecto ocurre en la otra cadena, ya que es totalmente complementaria. Entonces, la presencia de bastantes nucleó­ tidos en una reacción podría llenar el hueco entre dos cena­ dores en las dos cadenas y así producir un fragmento de ADN completo; de hecho, esta “doble reacción de Sanger” produce dos fragmentos, ya que la técnica empieza por separar las dos cadenas de ADN. Aunque la idea era inútil para secuenciar, sí servía para duplicar un fragmento de ADN, y como Kary 89

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Mullis tenía algo de experiencia con la programación de or­ denadores, sabía que los aumentos habían sido exponenciales. Un experimento mental rápidamente dejaba claro que cada separación de cadenas, hibridación de cebadores y extensión por la ADN polimerasa duplicaría la cantidad del fragmento situado en medio, por lo que al repetir el mismo ciclo ya se producirían cuatro cadenas; el número de fragmentos seguiría aumentando hasta que literalmente se disparase. Repeticiones consecutivas de este proceso podrían producir 8, 16, 32, 64, 128 fragmentos y un número de ciclos no muy alto (unos 25) sería capaz de amplificar el ADN más de 33 millones de veces. Gracias esta amplificación exponencial nació la idea detrás de la reacción en cadena de la polimerasa. El uso de dos cebadores en la reacción tiene otra ventaja, ya que marcan el principio de cada cadena nueva. Por simple matemática, el número de ca­ denas de tamaño limitado rápidamente supera el ADN original y el fragmento amplificado se define por la distancia entre los cebadores. De esta forma, podemos ser capaces de visualizar este fragmento en un simple gel de agarosa. Ya de vuelta en la empresa, Mullis puso en marcha la ejecución práctica de su idea. Comenzó su experimento evitan­ do poner una distancia muy grande entre los dos cebadores e intentó incorporar nucleótidos radiactivos para visualizar mejor el fragmento producido. Uno de los problemas principales era la necesidad de hervir la muestra cada vez para separar las dos cadenas de ADN y permitir la hibridación del cebador. Mullis descubrió que un cebador de unas 20 bases se hibridaba bas­ tante rápido (antes que el propio fragmento) mientras recono­ cía una secuencia específica (hibridaba en un solo sitio). Sin embargo, un problema considerable fue la ADN polimerasa, pues esta enzima, al igual que las demás proteínas, ha evolucio­ nado para funcionar bien a una temperatura determinada, pero pierde su integridad cuando la calentamos demasiado. Es un fenómeno comparable con la coagulación de un huevo al her­ vir, que destruye cualquier actividad enzimática. Mientras la secuenciación solo requiere una aplicación de la polimerasa, el ADN se calienta en cada ciclo de la PCR, por lo que hace falta 90

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añadir un poco de enzima en cada ciclo hasta que la solución no aguante más y se convierta en un huevo cocido. Dentro de una mezcla tan densa, las reacciones biológicas ya son imposibles. No sabemos si los problemas de estabilidad de la ADN polimerasa fueron una de las razones, pero sí que la presenta­ ción de la PCR al mundo fue bastante modesta. Kary Mullis ya contaba con algo de éxito en trabajos anteriores, pues ha­ bía publicado un relato imaginario sobre la posibilidad de in­ vertir el flujo del tiempo en la revista Nature. La revista había ganado más importancia después de la publicación de la es­ tructura del ADN y en ese momento conseguir una publica­ ción fue (y sigue siendo) todo un reto. Según algunas fuentes, la publicación “cosmológica” fue escrita por Mullis en un estado no muy lúcido durante una tarde de aburrimiento. Recordemos que la estructura del ADN fue igualmente una publicación bastante teórica. Sin embargo, dos décadas más tarde, la descripción de la PCR fue rechazada por la misma revista alegando una falta de resultados concretos. El resulta­ do final es que una técnica con una importancia igual al clo­ naje fue publicada en una revista con diez veces menos im­ pacto científico, lo que muestra que el ranking de una revista no es lo más importante. Además, menos de un año después de su mención inicial, grupos de investigación fuera de Es­­ tados Unidos empezaron a aplicar la PCR en el laboratorio.

Resolviendo la desnaturalización de las proteínas Afortunadamente, Kary Mullis pudo patentar su invento debi­ do a su posición en una empresa privada. La patente aseguró su nombre dentro de la historia de la biología molecular, aun­ que dicha patente inicial no cubrió todo el invento y el grupo tuvo que continuar trabajando. El problema de la estabilidad de la ADN polimerasa fue atacado en paralelo mediante el diseño casi matemático de la PCR. El propio doctor Mullis contó que la resistencia al calor por parte de algunas enzimas había dado problemas en el laboratorio. Mientras que la ADN polimerasa 91

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de la Escherichia coli perdía actividad porque la cadena de ami­ noácidos se desplegaba al calentar y se coagulaba cuando de nuevo bajaba la temperatura, una enzima llamada “fosfata­ sa” se volvía a plegar de manera espontánea. En realidad, la fosfatasa era un problema en el laboratorio, dado que elimi­ naba los grupos fosfato de los nucleótidos y prevenía su in­ corporación al ADN. El truco, por lo tanto, era encontrar una ADN polimerasa que se comportara de la misma mane­ ra que la fosfatasa. Varios compañeros de Kary Mullis, entre ellos Susanne Stoffel y David Gelfand, ya habían empezado a buscar ADN polimerasas en las bacterias que sobrevivieran a temperatu­ ras muy altas. Mientras que las Escherichia coli tienen una temperatura óptima de crecimiento de 37 grados —la tem­ peratura de nuestro intestino—, otras bacterias viven en am­ bientes menos protegidos y producen enzimas más robustas. El equipo se centraba en dos candidatas, la Bacillus stea­ rothermophilus, resistente a la esterilización de tuberías en las lecheras, y la Thermus aquaticus, que vive en los géiseres de Yellowstone (seguramente, la cercanía del parque dio pistas importantes). La idea general era muy sencilla: si una bacte­ ria es capaz de sobrevivir en un ambiente como el agua hir­ viendo, también sus enzimas deben de haberse adaptado a las condiciones extremas. A pesar de eso, la práctica no fue igual de fácil, ya que obtener la polimerasa de la Bacillus stea­ rothermophilus fue todo un calvario y este camino se abando­ nó después de un primer fracaso en la propia empresa y otro en una empresa subcontratada. Por experiencia propia, sabe­ mos que los Bacilli producen cantidades grandes de protea­ sas que destruyen cualquier proteína al romper la bacteria. Entonces, es posible que la estabilidad térmica de la enzima no fuera un problema, sino la degradación por las proteasas acompañantes. El proyecto basado en la Thermus aquaticus afortunadamente sí tuvo éxito y varios grupos ya habían ais­ lado una variedad de enzimas termoestables a partir de esta bacteria en los años setenta; además, la ADN polimerasa pa­ recía ser una diana agradecida. 92

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Figura 17 Representación esquemática de la PCR. Empezamos por separar las cadenas del ADN molde, calentando la reacción hasta los 95 grados. Se observa que todos los componentes de la reacción aguantan temperaturas hasta hervir, pero el protocolo no alcanza esta temperatura para evitar que se formen burbujas. La separación de cadenas tarda más o menos un minuto. El segundo paso es enfriar la reacción a una temperatura entre 50 y 60 grados, y esperar un minuto para que los cebadores hibriden. Finalmente, se incrementa la temperatura hasta 72 grados durante un minuto para que la polimerasa copie la cadena de ADN. Esta serie de temperaturas se denominan ‘ciclos’ y pueden repetirse entre 20 y 40 veces. Para asegurar que las cadenas del ADN se separan, añadimos un paso de 5 minutos primero a 98 grados y para acabar bien la síntesis, un paso de 72 grados durante 5 minutos. La cantidad de ADN producida se duplica en cada ciclo.

Un grupo en la Universidad de Cincinnati, en Estados Unidos, ya había mostrado cómo obtener esta enzima en el año 1976. Susanne Stoffel y David Gelfand produjeron una pe­ queña cantidad de la polimerasa a finales de 1985 y otro miem­ bro del equipo, Randall Saiki, juntó por primera vez todos los componentes para mostrar una técnica verdaderamente 93

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funcional. La estabilidad de la polimerasa derivada de la Ther­­ mus aquaticus era tan buena que la detección por radiactividad ya no hacía falta. Esta vez, la investigación donde participaron todos miembros del equipo logró ser publicada en la revista Science, de una importancia igual que Nature pero al otro lado del Atlántico. Es increíble saber que todavía usamos la misma polimerasa derivada de la Thermus aquaticus. Para hacernos la vida un poco más fácil simplemente la llamamos Taq polimera­ sa y, por supuesto, no tenemos que acercarnos a Yellowstone para obtener esta enzima, sino que varias empresas han creado cepas de Escherichia coli que producen Taq polimerasa recom­ binante a través de un plásmido. Ni si quiera las técnicas mo­ dernas escapan a la base de la biología molecular que hemos visto en los capítulos anteriores. Kary Mullis describió su técnica como PCR. Esta crea­ ción ha significado tanto para la biología molecular que fue galardonado con el Premio Nobel de Química diez años des­ pués. En contraste con Watson y Crick, Mullis fue premiado por la aplicación de su técnica en situaciones reales. Es una tendencia que se impone cada vez más en los Nobel de las úl­ ­timas décadas. La PCR en su forma más básica sirve para obtener una cantidad considerable de un fragmento con un tamaño deter­ minado a partir de una cantidad de ADN mínima de entrada, que llamamos “molde”. Ya en 1988, Henry Ehrlich, jefe de Mullis, colaboraba con el sistema forense de California para mostrar que el ADN de un único pelo (un pelo vivo arranca­ do, no uno caído) es suficiente para identificar a una persona por PCR. Uno de los pocos requisitos es conocer algo de la secuencia en ambos lados del fragmento que queremos am­ plificar. Igual que la secuenciación de Sanger, los cebadores de la PCR tienen que hibridar con un ADN complementario. Debido a la resistencia química del ADN, el primer paso del protocolo es eliminar otras moléculas biológicas; en muchos casos, digerir las proteínas con la enzima proteinasa K es su­ ficiente, pero a veces se acompaña de una extracción quími­ ca que elimina cualquier resto de proteína y grasa. El ADN 94

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molde simplemente se mezcla con los dos cebadores, los nu­ cleótidos A, T, C y G, la Taq polimerasa y un búfer adecuado en un tubo de reacción. Además, todo el procedimiento se puede realizar en un volumen de unos 20 microlitros, cien veces menos que el contenido de un dedal. El genio de Kary Mullis se refleja en el protocolo, ya que la práctica actual de PCR implica mezclar todos los reactivos y cambiar la tempe­ ratura de la reacción exactamente como Kullis tenía previsto en su experimento mental (figura 17).

Una técnica sin límites aparentes El procedimiento es tan sencillo que ya a finales de los años ochenta aparecieron máquinas para cambiar la temperatura de los tubos. En su forma más simple, un bloque de metal con control de temperatura y donde entran bien los tubos de la reacción, es suficiente. Por supuesto, hoy en día está todo controlado por un ordenador y se puede seguir incluso por internet. Curiosamente, la máquina de PCR y la propia reac­ ción fueron patentadas por distintas empresas, un hecho que ha dado lugar a unas cuantas batallas legales a lo largo de los años. Esto puede sorprender en un ambiente académico, ya que el descubrimiento del ADN no es considerado algo prác­ tico o aplicable a la sociedad. En cambio, la PCR es muy po­ derosa y tiene gran interés comercial. Sumando el tiempo total que necesita cada paso de la reacción, y multiplicando esto por un número de ciclo promedio de 30, veremos que producir un fragmento por PCR tarda entre dos y tres horas (los cambios de temperatura también requieren tiempo). Si comparamos con el tiempo necesario para clonar una librería de fragmentos e identificar clones mediante métodos clásicos (por lo menos un par de días), vemos claramente la ventaja de la PCR. Además, en un clonaje clásico eliminamos miles de co­­ lonias de bacterias, simplemente porque no podemos ni de­­ seamos analizar tantas. La PCR, por lo menos cuando se eje­­ cuta bien, no solo produce las bandas deseadas en un tiempo 95

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récord, sino que también lo hace casi sin desperdiciar mate­ rial. Resumiendo, la PCR reúne todas las propiedades que podemos desear de una técnica relacionada con el ADN: ne­ cesita muy poco material de partida (el molde), nos permite obtener un fragmento específico y lo hace de forma rápida y limpia. Estas propiedades han contribuido al uso extendido de la PCR en investigación, aunque también es importante en otras aplicaciones. En contraste con otras técnicas de biología molecular, la PCR se usa a diario en diagnósticos médicos, control de calidad de alimentos e investigaciones forenses. El invento de Kary Mullis no solo ahorra tiempo y recur­ sos, sino que puede hacer mucho más que copiar un frag­ mento específico a partir de un molde complejo. Los ejem­ plos en este párrafo se resumen de manera gráfica al final del mismo. Si miramos bien a los cebadores, podemos apreciar que la polimerasa siempre añade un nuevo nucleótido al mis­ mo extremo, donde se sitúa el grupo hidroxilo en el último azúcar. La hibridación correcta de este lado del cebador es muy importante para que funcione la PCR, pero el otro ex­ tremo (con el fosfato suelto) contribuye menos. Los propios inventores de la PCR ya notaron que se pueden introducir extensiones en ese extremo, por ejemplo con una secuencia reconocida por enzimas de restricción (figura 18). Con este truco, el producto de una PCR se puede cortar un poco con una enzima de restricción e insertarse directamente en un plásmido cortado de la misma manera con una ligación. En el capítulo 4 hemos visto la secuencia CCATGG, que es reco­ nocida por la enzima NcoI e incluye un ATG que marca el primer aminoácido de una proteína. La PCR hace nuestro trabajo muy fácil: si incorporamos la misma secuencia en el cebador podemos perfectamente fusionar una proteína por el aminoácido donde debe empezar con otra proteína previa­ mente clonada en un plásmido. Incluyendo una base más o una base menos en el cebador podemos “mover” la secuencia un poco, recordando que cada aminoácido se codifica por exactamente tres bases en el ADN. A esto se le llama marco de lectura (descubierto en el experimento de Crick y Brenner) 96

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y la PCR sirve para ajustarlo según las condiciones de cada clonaje. Dado que los cebadores tienen algo de flexibilidad para su hibridación, la PCR también sirve para introducir mutaciones. Siempre y cuando el extremo 3’ del cebador hibride bien (es donde la polimerasa introduce los nuevos nucleótidos), un pequeño “bulto” entre dos bases no moles­ ta. Mientras el ADN sintético del cebador lleva la mutación, directamente formando una de las dos cadenas del ADN, la polimerasa introduce el mismo cambio en la otra cadena cuando pasa por la enzima del cebador (figura 18). En las reacciones de PCR más corrientes, los cebadores apuntan hacia el interior para amplificar en medio el ADN. Es la manera en que Kary Mullis diseñó su técnica, pero ya en la publicación original animaba a probar otras variantes, por ejemplo, diseñar los cebadores en dirección contraria (lo que parece una locura, ya que la síntesis del ADN nuevo no llega al cebador opuesto), pero si cortamos el ADN con una enzima de restricción y cerramos los fragmentos lineales con una ligasa, esta PCR inversa puede amplificar el círculo que se ha formado. De esta manera es posible amplificar un ADN del cual solo conocemos algo de secuencia en un extremo. De la misma manera, la ligación de dos fragmentos de ADN se puede comprobar con un cebador en cada fragmento. Si los investigadores tienen tiempo y paciencia para diseñar las mo­ léculas de ADN, pueden prescindir por completo de las liga­ ciones. Por ejemplo es posible hacer dos reacciones de PCR donde los ADN resultantes hibriden entre sí, pero solo por un extremo. Cuando este producto de hibridación se expone a la Taq polimerasa, esta rellena los ADN hasta producir uno solo más largo. Después, los cebadores en los extremos pueden amplificar el segmento completo. El poder real de la PCR está en la facilidad con la cual se combina con otras técnicas y otras enzimas. Por ejemplo, dado que funciona con cebadores y una ADN polimerasa, la incorporación de nucleótidos dideoxi en la reacción permite usarla para secuenciar. El descubrimiento de una enzima capaz de transcribir ARN en ADN (la transcriptasa inversa) 97

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permite obtener un fragmento a través del ARN mensajero. Al final, ¡la imaginación de los investigadores supone una li­ mitación más importante que las posibilidades biológicas! Hasta hoy en día, la Taq polimerasa tan solo parece tener un par de desventajas, aunque normalmente no molestan dema­ siado. Figura 18 Las variantes de la PCR simple tienen múltiples aplicaciones. Mientras pequeños cambios en los cebadores sirven para introducir sitios de restricción o mutaciones (arriba), tratamientos anteriores a la PCR, por ejemplo la restricción o la ligación, pueden influir en la producción de una banda o no.

Un factor a tener en cuenta es la velocidad con la cual trabaja la ADN polimerasa: alrededor de 1.000 bases por mi­ nuto. Si queremos producir fragmentos más largos debemos tener paciencia y tener en cuenta que los nucleótidos en la reacción son un recurso limitado. El límite práctico parece estar alrededor de 20.000 bases. Otra desventaja es la muta­ ción espontánea: en contraste con la mayoría de seres vivos, la Thermus aquaticus no parece comprobar si escribe bien o mal el último nucleótido incorporado. Este mecanismo, que pro­ duce una corrección de pruebas, sirve para evitar las muta­ ciones espontáneas. La ausencia de esta corrección tampoco 98

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significa que la Taq polimerasa introduzca cualquier nucleóti­ do en la cadena, sino que el número de errores es más alto, alrededor de una base en cada millón. Para reacciones de PCR muy críticas, varias empresas ya han patentado ADN polimerasas de otras bacterias que viven en ambientes extre­ mos y sí comprueban las letras escritas. La búsqueda de enzi­ mas nuevas no parece haber acabado todavía, como mostra­ remos en el próximo capítulo.

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CAPÍTULO 6

Manipulando el ADN con CRISPR/Cas9

Aquí empieza la historia de cómo una simple curiosidad puede dar lugar al invento posiblemente más útil y segura­ mente más espectacular de la biotecnología reciente. Antes de entrar en los detalles de este sistema, con el nombre téc­ nico CRISPR/Cas9, habría que pensar en las razones detrás de la polémica de un posible Premio Nobel. En los capítulos anteriores hemos mostrado las posibilidades de aislar un fragmento de ADN, modificarlo y propagarlo mediante plás­ ­midos. En este método clásico de ADN recombinante, prác­ ticamente la totalidad de las manipulaciones se hacen con la ayuda de bacterias como la Escherichia coli. Aunque el con­ junto de técnicas es muy poderoso, y se puede obtener casi cualquier secuencia de ADN deseado, también tiene sus li­ mitaciones. En especial, la manipulación de los cromosomas de células de mamíferos es muy complicada, ya que su in­ menso tamaño impide su manejo. Es fácil fragmentar un cromosoma humano para estudiarlo, pero hasta ahora resul­ ta imposible ensamblar una secuencia tan larga e introducir­ la en su totalidad en una célula. Además, existen otros impe­ dimentos, como la necesidad de enrollar el ADN alrededor de unas proteínas andamio (las histonas), que transmiten señales a la célula para identificar la función de cada región de un cromosoma. 100

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Obtener acceso Aunque el tamaño de los cromosomas de mamíferos parece una barrera insuperable, a lo largo de los años ochenta y noventa ya se inventaron métodos para realizar modificacio­ nes genéticas en animales. Mediante la combinación de se­ cuencias de plásmidos y de virus se obtuvieron vehículos capaces de sobrevivir en ambos anfitriones. Por razones de seguridad, es necesario asegurarse de que estos constructos no puedan producir un virus activo en bacterias ni tampoco propagarse una vez introducido en el anfitrión final. Ade­ ­más, la cantidad de ADN que se puede encapsular en una partícula viral es muy limitada, ya que los virus son los cam­ peones de la compactación. Por lo tanto, estos métodos sir­ ven sobre todo para implantar como mucho un par de genes nuevos. Un problema de proporciones aún más grandes es la dificultad para eliminar un fragmento de ADN. El lector atento habrá visto que siempre añadimos más ADN al anfi­ trión final, pero hasta ahora no ha sido posible restar. Como mucho, las células de mamíferos permiten intercambiar un fragmento por otro, aprovechando la predilección de usar la recombinación homóloga para efectuar reparaciones en los cromosomas (figura 19). Hasta bien entrado el siglo XXI, la recombinación homóloga era la manera preferida de efec­ tuar mutaciones en los genes de mamíferos y plantas, aun­ que siempre deja restos de ADN ajeno y por lo tanto no es un método muy limpio. Un gran sueño de los genetistas era liberarse de estas limitaciones y realizar la manipulación del ADN directa­ mente en las células diana. Es necesario superar toda una serie de barreras antes de convertir este deseo en realidad, ya que los cromosomas de estos seres vivos no solo son mi­ les de veces más grandes que cualquier ADN clonado en el siglo XX, sino que también se encuentran separados del me­ ­dioambiente por las membranas celulares, unas formidables barreras protectoras. 101

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Figura 19 La recombinación homóloga funciona por el intercambio de ADN entre secuencias parecidas y en su forma más sencilla promueve la integración de un ADN circular en un cromosoma. Si elegimos bien la diana es posible interrumpir un gen y de esta manera inactivarla. Para eliminar por completo una secuencia de un cromosoma, la manera común es una recombinación doble. En este caso, la secuencia diana sale del cromosoma y se degrada. En ambos casos, una selección con un antibiótico (Ab) suele ser necesaria.

El problema de los cromosomas grandes El tamaño de los cromosomas (hablamos de varios millones de bases) supone un problema muy particular para las herra­ mientas clásicas de genética molecular, en particular para las enzimas de restricción. Hemos visto en el capítulo 4 que estas enzimas tienen una actividad muy específica sobre secuen­ cias cortas de unas seis bases. En teoría, una secuencia de seis bases se presenta de media una vez en cada 4.096 bases y la práctica suele seguir bastante bien esta predicción. En un cro­ mosoma de millones de bases, una secuencia reconocida por una enzima de restricción suele encontrarse miles de veces y el corte con una enzima de restricción causaría por tanto la destrucción completa del cromosoma. Si comparamos esto con el lenguaje humano es fácil de entender: poco quedaría de este libro si cortáramos con tijeras cada vez que encontra­ mos la palabra secuencia. Para hacer una manipulación di­­ rigida en un cromosoma, es decir, para realizar la edición 102

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genética, sería necesario reconocer una secuencia que apare­ ciera tan solo una vez. La idea no es del todo nueva, ya que también es la base de la amplificación de una región exacta mediante PCR. En lugar de escribir de nuevo un fragmento de ADN a coste de perder el resto, lo deseable sería pro­­ gramar una enzima de restricción para que cortara una vez justo donde queremos, dejando todo el resto del genoma in­ tacto. ¡Lo que deseamos es una varita mágica con precisión quirúrgica! El segundo problema es conseguir que la bala de verdad funcione dentro de la célula. En capítulos anteriores hemos visto que no es suficiente simplemente añadir ADN o una enzima a las células, ya que sus membranas componen una ba­ ­rrera eficaz. En el caso de los medicamentos, los compuestos químicos normalmente tienen grupos hidrofóbicos que favo­ recen el paso a través de las membranas. Esta es la razón por la que muchos medicamentos se disuelven tan mal en un vaso de agua. Precisamente la naturaleza de las enzimas y el ADN, que tienen un carácter hidrofílico, complica su acceso a la célula y al núcleo, donde residen los cromosomas. A conti­ nuación vamos a ver en qué medida el CRISPR/Cas9 ha lle­ gado a dar una respuesta a estos dos problemas de la edición genética.

El descubrimiento del CRISPR La historia del último hito en la manipulación genética, al menos en el momento de escribir este libro, empieza con una observación hecha por el investigador Francis Mojica de la Universidad de Alicante. A finales del siglo XX, la amplifica­ ción del ADN mediante PCR y la secuenciación se habían convertido en técnicas estándar y asequibles. Además, el de­ sarrollo de nucleótidos fluorescentes permitía realizar la se­ cuenciación sin el uso de radiactividad, de forma más rápida y a una escala considerable. Uno de los resultados más co­­ nocidos de este avance tecnológico fue la secuenciación de 103

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nuestro propio ADN, conocido como el Proyecto Genoma Humano. Dado que el lenguaje del ADN es universal, otros grupos dedicaban sus recursos a organismos menos conoci­ dos pero igual de interesantes. El ADN del ratón, de la leva­ dura común y de bacterias como la Escherichia coli y la Lac­­ tococcus lactis (la bacteria del yogur) son fruto de la misma época. Aplicando las técnicas descritas en capítulos anteriores (enzimas de restricción, amplificación por PCR y secuencia­ ción) el doctor Mojica encontró una serie de secuencias repe­ tidas en el ADN de Haloferax, una archaebacteria resistente a altas concentraciones de sal en las costas del mar Mediterráneo. Aunque otros ya habían visto repeticiones similares en otros microorganismos, la mayoría de microbiólogos las ignoraban. El interés inicial en la secuenciación de genomas iba dirigido a la identificación de genes que se transcribiesen para produ­ cir proteínas. También pesaba el problema de los ordenadores de la época, que no siempre eran lo bastante potentes para descifrar secuencias repetitivas, convirtiendo su análisis en una verdadera tortura. Unos años más tarde, en el año 2000, el doctor Mojica consiguió reunir datos de proyectos de secuenciación de una veintena de procariotas (el nacimiento de internet propulsaba las bases de datos de genomas completos) mostrando secuen­ cias repetidas con características similares en muchas bacte­ rias. Para algunos investigadores, hacer la misma observación en otro ambiente significa que ya no eres el primero, pero en este caso sí que tenía importancia. Cuando un fragmento de ADN igual o parecido existe en seres vivos muy diversos, y las bacterias con orígenes distintos lo son para los microbió­ logos, es probable que este fragmento de ADN tenga una función conservada e importante para la supervivencia de es­ tas especies. Como norma general, las secuencias repetidas no producen proteínas, y los biólogos rápidamente las califi­ can como ADN basura, pero encontrarlas en otros sitios in­­ dicaba que algún propósito (aunque todavía desconocido) debían tener. Poco a poco, otros investigadores empezaron a mostrar su interés en este campo. 104

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En los primeros años de esta historia distintos grupos de in­­vestigación usaban sus propias abreviaturas para señalar su fa­­milia favorita de secuencias (SRSR, TREP, LCTR, SPIDR). Incluso, la literatura de la época muestra cómo algunas publica­ ciones de un solo grupo usaban abreviaturas distintas (a veces, los científicos tampoco se aclaran). Un grupo de investigación en los Países Bajos y Francis Mojica acordaron usar el nombre de CRISPR, y esta palabra contaba con la sonoridad perfecta para ser recordada por la comunidad científica. CRISPR es una abreviatura de la frase inglesa Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats y se traduce, hasta donde es posible, como “serie de repeticiones palindrómicas cortas interrumpi­ das por espacios regulares”. No parece un nombre muy llama­ tivo en español, pero su éxito está en la pronunciación de la palabra, ya que se refiere al suculento sonido que hace una bol­ sa de patatas cuando la aplastamos entre las manos. La relación con el sonido hace a la palabra inolvidable para los biólogos. Cuando hablamos de “espacios regulares” por supuesto no queremos decir que el ADN del CRISPR tenga huecos. Hablamos, por ejemplo, de los espacios entre los genes en los cromosomas, pero el ADN, por supuesto, forma una cadena continua. Para los biólogos, un espacio en el ADN significa que esta sección todavía no ha sido vinculada con una carac­ terística o función. Lo podemos comparar con las manchas blancas en los mapas antiguos, donde la tierra continúa, pero se desconoce lo que se puede encontrar. A veces, los espacios son exactamente lo que dice la pa­ labra y sirven para crear una distancia fija entre las dos se­ cuencias colindantes. En estos casos, la secuencia del espacio no es importante, sino el número de bases que la compone. A primera vista, lo mismo está pasando con las secuencias CRISPR, ya que presentan secuencias conservadas repetidas (seguramente con una función) alrededor de secuencias apa­ rentemente aleatorias y por lo tanto sin uso directo (los espa­ cios). La abreviatura inglesa ya sugiere que los espacios en realidad son espaciadores, fijando el interés de la comunidad científica en las repeticiones mismas. En el caso del CRISPR, 105

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sin embargo, resulta que justo estos espaciadores tienen la clave para su función. Los doctores Francis Mojica, Christine Pourcel y Alexander Bolotin mostraron justo esto, unos años más tarde, casi al mismo tiempo pero en tres laboratorios distintos. Comparando los espaciadores en el CRISPR con el ADN de bacteriófagos y plásmidos, descubrieron que las mismas secuencias de los espaciadores aparecen dentro de genes importantes para la propagación de elementos de ADN móviles o invasivos. Los espaciadores por lo tanto no son es­ pacios de ningún modo, pero tienen una función en la super­ vivencia de los bacteriófagos y los plásmidos. Poco a poco, el mapa estaba perdiendo su mancha blanca. Si pensamos que la cosa acaba aquí, nos equivocamos. La relación se hace más interesante sabiendo que no todos los bacteriófagos son iguales. A lo largo de los años setenta y ochen­ ta, la comunidad científica identificó docenas de bacteriófagos y plásmidos distintos, y mostró que cada familia se acopla a un grupo distinto de bacterias. Por ejemplo, la mayoría de plásmi­ dos derivados de la Escherichia coli no se mantienen en la Lactococcus lactis y viceversa. Lo mismo ocurre con los bacterió­ fagos, que se especializan en infectar un grupo de bacterias limitado por su ambiente. El salto más importante del doctor Mojica era encontrar las secuencias de los espaciadores del CRISPR de cada bacteria tan solo en los bacteriófagos y plásmidos con capacidad de sobrevivir en la misma bacteria. Entonces, el doctor Mojica fue capaz de acoplar el sistema CRISPR de cada bacteria con sus propios patógenos y propo­ ner, a raíz de esta observación, un papel en la defensa contra una invasión por ADN ajeno. Las secuencias desconocidas, lla­ madas anteriormente “espacios”, han llegado a tener una fun­ ción por su correlación con secuencias conocidas en otros sitios.

Qué hacen los genes Cas Aunque la descripción de las secuencias ajenas en los espa­ ciadores era una pista importante para sugerir una función en 106

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la protección contra el material genético invasor, todavía no estaba nada claro cómo las bacterias conseguían defender­ se. En contraste con los genes que producen una proteína con una actividad enzimática asociada, el problema con las secuencias repetitivas es la dificultad de predecir su función. Afortunadamente, el grupo holandés que dio nombre al CRISPR también encontró una serie de genes “normales” que siempre estaban situados al lado de las repeticiones. Por su situación física en el cromosoma, estos genes se llaman Cas (CRISPR associated genes o “genes asociados con las re­ peticiones CRISPR”). En contraste con el propio CRISPR, los genes Cas son fácilmente reconocibles y traducidos a se­ cuencias de aminoácidos. Por lo tanto, el trabajo de buscar las actividades enzimáticas asociadas era una cuestión de com­ pararlos con proteínas ya descritas. A principios del siglo XXI era un trabajo de minutos para un ordenador conectado a internet. La mayoría de los genes Cas, en un número tan bajo como cuatro en algunas bacterias pero hasta veinte en otras, parecen producir proteí­ nas involucradas en la manipulación de los ácidos nucleicos. La comunidad científica rápidamente llegaba al consenso de que el sistema CRISPR podía apoderarse de secuencias aje­ nas y con la ayuda de los genes Cas usarlas en contra de la invasión del ADN. Dicho de una manera sencilla, CRISPR recuerda cuáles son las amenazas guardando secuencias ex­ traídas de los invasores y los genes Cas probablemente sirven para utilizar el contenido de esta memoria. Para los científi­ cos, tener una secuencia en la memoria es el primer paso para poder manipular esta secuencia, por ejemplo con las técnicas que hemos visto en el capítulo anterior. En cuanto la comuni­ dad científica se dio cuenta de que las bacterias tenían memo­ ria, la carrera para convertir el sistema CRISPR/Cas en una herramienta de edición genética se puso seria. Mientras este proceso de comprensión inicial ha tardado alrededor de una década en completarse, los últimos hallaz­ gos necesarios para dar provecho al CRISPR/Cas se produje­ ron bastante más rápidamente, entre los años 2008 y 2012. El 107

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primero de estos pasos fue el descubrimiento de que CRISPR/ Cas actúa directamente sobre el ADN invasor. Era una ob­­ servación importante, porque experimentos en el gusano Caenor­­habditis elegans habían identificado un sistema basado en el ARN, el ARN interferente, en la misma época. Algunos grupos importantes ya estaban interpretando el CRISPR de la misma manera, aunque no existía evidencia con base en experimentos con bacterias. No podemos decir directamente que se equivocaban, los genes Cas albergan muchas activida­ des enzimáticas distintas y es posible que las bacterias aprove­ chasen más de una manera para atacar a los bacteriófagos. Sin embargo, las consecuencias para el uso de CRISPR/Cas son importantes, ya que el ARN interferente actúa sobre otras mo­ léculas de ARN sin causar modificaciones genéticas. Al final, el ARN es una molécula fugaz que no se propaga de una genera­ ción a otra, mientras que el ADN tiene esa memoria duradera que hemos visto en el primer capítulo. Actuar sobre el ADN significa que las bacterias pueden erradicar la fuente inicial del material genético y que nosotros podemos generar mutaciones en los cromosomas que nunca se pierden. Pocos años después, el grupo dirigido por los doctores Philippe Horvath y Virginijus Siksnys en Lituania mostraba que CRISPR/Cas cortaba el ADN igual que las enzimas de restricción. Además, conseguían eliminar todos los genes in­ necesarios de la serie Cas, usando todavía los métodos clási­ cos de ADN recombinante y plásmidos. Resulta que una úni­ ca proteína, producida por el gen Cas9, es suficiente para cortar un ADN diana con la ayuda de las repeticiones CRISPR. Para reducir el CRISPR/Cas9 a su forma más básica usaron el sistema de una bacteria llamada Streptococcus thermophilus, que está implicada en la elaboración del yogur. Una observa­ ción curiosa, pero no sorprendente, es el elevado número de bacteriófagos que ataca a los Streptococcus, más de 300. ¡La le­ che resulta ser un medioambiente muy salvaje, y los Streptococcus deben tener las defensas en una condición óptima! En paralelo con los doctores Horvath y Siksnys, las doctoras Emmanue­ ­lle Charpentier y Jennifer Doudna, por entonces en Estados 108

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Unidos, se dieron cuenta de que las repeticiones producían unas pequeñas moléculas de ARN en forma de bucle (figura 20). Dentro del bucle de ARN, algunas secuencias tienen contacto con el ADN diana y pueden ser programadas, mientras que otras secuencias forman un puente para guiar a Cas9 al sitio de corte. Al identificar las secuencias relevantes en el ARN guía y descubrir qué secuencias se pueden adaptar para cam­ biar su “programa”, las doctoras Charpentier y Doudna tum­ baban la última barrera que había para el uso generalizado del CRISPR/Cas9. Figura 20 Estructura del CRISPR/Cas9. El CRISPR/Cas9 es una ribonucleoproteína (una combinación de proteína y ácido ribonucleico) en la que una parte del ARN guía reconoce la secuencia diana en el ADN y otra parte recluta la proteína Cas9. Por su proximidad al ADN, la proteína Cas9 corta ambas cadenas del ADN en un extremo de la hibridación entre el ADN y el ARN guía. Bucle de ARN guía para captar Cas9

Híbridación ARN-ADN programable

Sitio aproximado de corte

Fuente: Adaptado por Thomas Splettstoesser para Wikimedia Commons, bajo licencia CC BY-SA 4.0.

Usando el CRISPR/Cas9 como herramienta Todavía utilizamos una combinación de una secuencia guía y Cas9, de la misma forma en que fueron descritas en las publi­ caciones de 2012. Debemos concluir que el trabajo realizado entre los años 2008 y 2012 fue fundamental. Pero justo al escribir estas frases seis años más tarde, y en contra de mu­ chas expectativas, el CRISPR/Cas9 todavía no ha obtenido 109

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un Premio Nobel. Quizá, el gran número de investigadores in­ volucrados es un problema (las normas dictan un máximo de tres personas galardonadas), pero los hallazgos científicos tam­ bién se han visto manchados por unas disputas legales en rela­ ción con patentes y comercialización. Más de una empresa tiene grandes expectativas sobre el uso de CRISPR/Cas9 en biotec­ nología y la producción de animales y plantas transgénicas, in­ cluso más allá del ambiente académico. A raíz de estas posibili­ dades, acabamos este capítulo con una pequeña evaluación de la capacidad de CRISPR/Cas9 para cambiar la genética. Los autores de este libro hemos tenido el placer de traba­ jar con el CRISPR/Cas9 y ha sido muy útil en nuestras líneas de investigación. Existen otras técnicas para manipular direc­ tamente el genoma de mamíferos o plantas, por ejemplo la ruta clásica de la recombinación homóloga. Los métodos al­ ternativos, sin embargo, sufren de una eficiencia muy baja para obtener los productos deseados. A lo largo de todo el li­ bro hemos visto ejemplos de la protección del ADN propio contra la invasión de ADN ajeno, envolviendo los cromoso­ mas propios con membranas y paredes celulares, y mediante enzimas para la degradación de ADN en situaciones de ilega­ lidad. En la edición genética mediante la recombinación ho­ móloga no es diferente, dependemos de la voluntad de las células eucariotas para producir un cambio en el genoma, que frecuentemente produce una pérdida importante en cuestio­ nes de salud y por lo tanto es necesario seleccionar clones con la mutación mediante un antibiótico capaz de eliminar las cé­ lulas no modificadas. Es comparable con la transformación de la Escherichia coli que hemos visto en el capítulo 4: solo podemos imponer nuestra voluntad sobre la naturaleza si da­ mos una ventaja artificial al resultado que buscamos. En la práctica significa introducir un fragmento lineal de ADN en las células, normalmente encapsulando el ADN en liposomas o haciendo agujeros en las células mediante un pulso eléctri­ co. Este primer paso en todo el proceso ya tiene sus limita­­ ciones, igual que los clonajes en la Escherichia coli. Si aplica­ mos demasiados liposomas o electricidad acabamos dañado 110

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las células diana, pero si usamos poco no se produce la capta­ ción del ADN. Aunque las formulaciones han mejorado a lo largo de varias décadas, en la práctica es un buen resultado si alrededor de un 80% de las células aceptan este primer paso. Las enzimas necesarias para la recombinación deben ser aportadas por las propias células, ya que son grandes comple­ jos de hasta 20 proteínas distintas, por lo que es imposible manejarlas del mismo modo que el ADN. Para poder realizar las dos funciones necesarias (recombinación y selección), el fragmento de ADN se produce normalmente en Escherichia coli y tiene un gen de resistencia en el centro y las secuencias homólogas en cada extremo. Una vez introducido el ADN, los investigadores “pierden” el control sobre el proceso. La efi­ ciencia final depende del destino del ADN introducido en cada célula, sobre lo cual tan solo podemos tener control mediante la secuencia del fragmento. La solución más fácil para tratar el ADN introducido es fragmentarlo, igual que hacen las bacte­ rias mediante sus sistemas de restricción. Aunque las células de plantas o mamíferos carecen de enzimas de restricción, el cito­ plasma comprende otra barrera antes de llegar al núcleo con los cromosomas y contiene una serie de enzimas generales (las llamamos “nucleasas”) para la degradación de ADN y ARN. En más del 95% de las células que lo han captado, el ADN li­ neal simplemente es degradado antes de llegar al núcleo. Tan solo en las pocas células donde nuestro fragmento llega al nú­ cleo se pone en marcha la recombinación homóloga. Partimos de un segmento de ADN lineal en esta técnica para favorecer la integración en el cromosoma por dos extre­ mos, con la idea de reemplazar la región central por el gen de resistencia. Es posible usar un plásmido circular, pero estos son sustratos muy malos para las enzimas de los eucariotas y en este caso perdemos el control sobre los dos extremos. Con el fragmento lineal tampoco podemos forzar la recombina­ ción doble perfecta, a veces se produce por un solo lado o en secuencias que no son completamente iguales. El resultado es una mezcla de células sin el gen de resistencia, con el gen de resistencia integrado fuera de la diana, y células con la diana 111

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modificada, como pretendemos. El paso final de esta edición genética clásica es eliminar las células no resistentes con el antibiótico adecuado (un proceso que tarda entre 2 y 20 días) y comprobar que se ha modificado la diana de la manera de­ seada (normalmente con una PCR) en los clones de los su­ pervivientes. Esta parte del procedimiento no es muy diferente a un clonaje en bacterias, pero debemos tener en cuenta que las células de plantas o mamíferos se dividen mucho más lenta­ mente, y su crecimiento hasta tener bastante ADN para la prueba final frecuentemente tarda un mes. Las células que han hecho la recombinación con éxito, una proporción míni­ ma del total, normalmente tienen cambiado uno de los dos cromosomas (somos diploides). Las leyes de Mendel, expli­ cadas en el segundo capítulo, dictan que hace falta crear una planta o animal completo y adulto con estas células, a través de un embrión, para un cruce y la obtención de organismos mutantes homocigotos. Estos pasos ya no necesitan manipu­ lación del ADN. Por supuesto, el crecimiento de un organis­ mo adulto solo es posible si la mutación homocigótica es to­ lerada. ¡Todo el procedimiento puede tardar años! Debemos concluir que la creación de una mutación, en contraste con un transgénico “simple” donde añadimos ge­ nes de manera aleatoria, es un proceso lento, costoso y menos fiable de lo que desearíamos. Un problema importante es la dificultad de controlar dónde se va a producir una recombi­ nación. Las células se pueden resistir a la recombinación aun­ que ofrezcamos secuencias homólogas, ya que la selección con antibióticos se aplica después de este paso esencial. La idea principal del CRISPR/Cas9 es aumentar la efi­ cacia, forzando a las células a generar una acción. Vemos có­ mo unas incisiones bien posicionadas por esta ribonucleo­­ proteína pueden cambiar el panorama de la edición génica. He­­mos visto que el proceso clásico de mutaciones genómicas depende de la recombinación homóloga, un sistema de enzi­ mas que existe en todos los eucariotas y sirve para reparar roturas en los cromosomas. En los mamíferos, la reparación 112

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normalmente se produce por un sistema complementario que simplemente une dos extremos de la cadena de ADN. Este segundo sistema es mucho más activo que la recombinación homóloga, ya que no necesita comparar dos secuencias para encontrar regiones homólogas. Justo la gran actividad de este sistema de unión simple hace que los telómeros necesiten ser protegidos por una estructura especial para evitar la fusión de un cromosoma a otro por sus extremos. En el día a día, el sistema de unión simple repara rápidamente las roturas pro­ vocadas por la luz ultravioleta del sol y nuestras células no tienen que buscar la otra copia del mismo cromosoma para encontrar una región homóloga. Tan solo en la meiosis, nues­ tras células intencionadamente aparean los cromosomas se­ gún su homología. La lentitud del proceso hace que esta divi­ sión celular especializada tarde alrededor de dos semanas. La escasa actividad del sistema de recombinación homóloga ex­ plica la baja eficacia del método clásico para integrar un ADN ajeno en nuestros cromosomas. Sería ideal explotar la activi­ dad del sistema de unión simple. La investigación de las doctoras Charpentier y Doudna ha hecho el trabajo con el CRISPR/Cas9 ampliamente más fácil. Para una recombinación homóloga es necesario clonar unos fragmentos considerables (miles de bases) y situarlos en ambos lados del gen de resistencia. Por el contrario, todo el CRISPR/Cas9 está empaquetado en una única herramienta sencilla, lista para programar. Ambos, el gen del ARN guía y el Cas9 que produce la enzima necesaria, han sido adaptados para su expresión en plantas, levaduras o mamíferos, y clona­ dos (con tecnologías clásicas) en un solo plásmido. La puesta en marcha en el laboratorio solo requiere inicialmente un pe­ queño trabajo de ordenador a través de un portal de internet. Los últimos años han servido para poner en marcha ser­ vicios informáticos que comparan los datos obtenidos en los programas de genomas completos con los requisitos del CRISPR/Cas. Estos programas predicen cuáles son las se­ cuencias reconocidas por el ARN guía, pero que son lo bas­ tante distintivas para poder cortar una única vez con eficacia. 113

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¡Queremos evitar cortar en otro cromosoma de manera im­ prevista! Las secuencias guía son lo bastante cortas para sin­ tetizarlas en un proceso químico, igual que los cebadores de la PCR, y los métodos clásicos en la Escherichia coli se encar­ gan de incorporarlas en el plásmido molde. Entonces, la he­ rramienta final que usamos se parece mucho al resultado pu­ blicado en el año 2012, pero adaptada en unas 30 bases para cortar donde queremos. El ordenador y Escherichia coli han hecho todo el trabajo hasta aquí y posteriormente veremos que las células diana van a hacer el resto. Igual que un ADN lineal en la recombinación homóloga, los plásmidos completos se introducen mediante liposomas o un pulso eléctrico, pero el efecto dentro de la célula es muy diferente. Por ser un ADN circular sin extremos, los plásmi­ dos aguantan más tiempo en la célula, hasta una semana. Además, es fácil introducir miles de copias en cada célula y por la adaptación de los genes a la diana hay pocas células que escapen a la producción del ARN guía y de la enzima en su interior. En los eucariotas, el plásmido se comporta igual que el grupo de genes CRISPR/Cas en las bacterias, pero ataca un único sitio en el cromosoma del anfitrión en lugar de un bacteriófago. El diseño del plásmido y el número de copias se reflejan en la eficacia; muchas veces observamos que más del 90% de las células adquieren el corte adecuado. En com­ paración con la recombinación homóloga, es simplemente asombroso. Con la explicación del descubrimiento del CRISPR/Cas hemos visto cómo funciona, cortando el ADN en un sitio ele­ gido por el investigador. De esta forma, el CRISPR/Cas no cambia la preferencia de las células para la reparación me­ diante unión simple. Una vez que se producen el ARN guía y el Cas9, el cromosoma se abre en el sitio elegido por el inves­ tigador y la célula lo intenta cerrar de nuevo. A primera vista, realizar un corte para volver a pegar los extremos no tiene mucho sentido, pero el sistema de unión simple tiene una desventaja sobre la recombinación que aprovechamos al má­­ ximo. En los breves momentos en que están expuestos los 114

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extremos después de un corte (hablamos de unos minutos) otras enzimas pueden añadir o eliminar unos pares de bases. La contribución de estas enzimas es “pulir” los extremos para formar una unión fuerte, comparable con lijar o rellenar algo para obtener una junta lisa antes de pegarla. Aunque solo se cambien un par de bases entre los millones de un cromosoma, esto puede tener dos consecuencias muy importantes. La pri­ mera es un cambio en la secuencia de la proteína de un gen (cuando la diana del CRISPR/Cas se ha elegido bien), desde un cambio sencillo de un solo aminoácido hasta un cambio en el marco de lectura y el truncamiento de la proteína. Un solo corte con CRISPR bien posicionado puede por lo tanto eli­ minar una proteína por completo. La segunda consecuencia de estas mutaciones pequeñas es un cambio en la secuencia reconocida antes por el ARN guía. Una vez generada la mu­ tación, la célula se libera de la diana y el CRISPR/Cas deja de producir cortes. La producción continua de la misma rotura en un cromosoma significa una selección fuerte, de tal mag­ nitud que en esta aplicación sencilla del CRISPR/Cas ni si­ quiera necesitamos aplicar una selección con antibióticos. Una última ventaja es la posibilidad de cortar al mismo tiempo en los dos cromosomas homólogos, siempre y cuando la secuencia de los dos sea la misma. Este último hecho, que se debe a la alta eficacia, tiene unas consecuencias muy im­ portantes. Recordemos un momento que la recombinación homóloga es tan poco eficaz que requiere un organismo adul­ to y fértil (animal o planta) para pasar de una copia a dos copias mutadas mediante un cruce mendeliano. Este paso de generar un animal transgénico heterocigoto probablemente es el más costoso de todo el procedimiento clásico. Entendemos que la posibilidad de cambiar las dos copias cromosómicas con un solo plásmido significa un ahorro enorme de tiempo y dinero e implica una revolución en la investigación. El CRISPR/Cas abre el camino a la generación de líneas celulares en un laboratorio muy sencillo, sin animalario o in­ vernaderos para cruces. Además, muchos genes en los mamí­ feros son importantes para el cuerpo pero prescindibles para 115

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las células individuales, por ejemplo la insulina u otras hormonas. Resulta factible suprimir una función en célu­ las en una incubadora aunque un animal con órganos complicados no pueda sobrevivir sin la misma. Un factor importante aquí es la posibilidad de reemplazar funciones especializadas en el cuerpo, por ejemplo riñones o pulmo­ nes, controlando bien el ambiente del incubador. También en el entorno comercial, en particular en la edición genéti­ ca de plantas, el CRISPR/Cas rápidamente ha ganado po­ pularidad. Con las nuevas técnicas es relativamente senci­ llo suprimir un gen no deseado, hacer crecer las células en el laboratorio hasta obtener un esqueje e injertarlo en un tron­­co en el campo. Podemos imaginar que el sistema es especialmente po­ deroso para eliminar propiedades no deseadas, por ejemplo la producción de sabores picantes o amargos de algunas plantas. Dado que la reparación por unión simple añade o quita pocos pares de bases a la vez, las empresas biotecno­ lógicas especializadas en este campo han montado impor­ tantes grupos de presión para influir en la legislación, con el objetivo de desclasificar el CRISPR/Cas como técnica de ADN transgénico y liberar el tráfico de plantas generadas por este procedimiento. Sin embargo, la Unión Europea ha decidido mantener la legislación, en parte porque el CRISPR/Cas es aún más potente de lo que hemos visto has­ ta ahora. Usando un solo plásmido, el CRISPR/Cas permite for­ zar a las células a producir pequeñas mutaciones y con estas evitar las incisiones continuadas. No sorprende que rápida­ mente haya surgido la idea de usar una combinación de dos plásmidos. Cada uno de estos se diseña y produce de mane­ ra individual en la Escherichia coli, y se mezclan justo antes de su introducción en las células diana. La matemática del ADN recombinante es completamente permisiva al respeto. Posicionando los sitios donde corta el Cas9 a ambos lados de un gen, el segmento intermedio se libera y las células tie­ nen la tendencia de juntar los laterales olvidando la parte 116

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cortada (figura 21). El cálculo es bastante simple, la unión de los laterales supone una sola reparación mientras que la reinserción del segmento cortado cuesta el doble. Al igual que los fragmentos de ADN que introducimos de manera artifi­ cial en la recombinación clásica, el segmento liberado es dige­ rido rápidamente por la propia célula. ¡El resultado final se puede comprobar con una simple PCR, la falta de la sección intermedia es un signo inequívoco! En nuestro propio labora­ torio hemos conseguido eliminar secciones de varios miles de bases y solo hemos tenido que diseñar dos guías con 30 bases cada una. En los últimos años, estrategias más exóticas han visto la luz, aunque estas todavía tienen que demostrar su uso práctico. Por ejemplo, el sistema CRISPR/Cas no impide la recombinación homóloga, y ha habido intentos de aumentar la eficacia de la recombinación mediante uno o más cortes en el ADN diana. Figura 21 Comprobación por PCR de una mutación generada con CRISPR/ Cas9. A la izquierda, una representación esquemática de los sitios donde ataca cada constructo CRISPR (en este caso en cromosomas humanos) y la situación de los cebadores. A la derecha, el resultado del análisis por PCR separado en un gel de agarosa. Fue todo un éxito.

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1

3 PR IS 4 CR PR IS CR

R

P IS CR

R

P IS CR

4 2+ 3 2+ 4 1+ 3 1+ SIN

Ejecutado con precisión, este método podía ser capaz de reemplazar un gen defectuoso por su equivalente sano y, por lo tanto, tiene especial interés entre los investigadores. Al fi­ nal, tan solo la imaginación parece marcar las fronteras de la edición genética. 117

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Límites y limitaciones Los ejemplos anteriores fácilmente crean la impresión de un mundo de posibilidades, pero un estudio reciente ha mostra­ do otra imagen. La previsión en el momento de desarrollar la técnica era de un incremento adicional de un 10% en la pro­ ducción global de conocimientos biomédicos, pero la realidad está más cerca de la mitad de esto. Quizá podemos culpar a la naturaleza conservadora del mundo de la investigación: es bastante complicado obtener financiación para estudiar un gen sin una función bien descrita. El propio CRISPR/Cas tampoco resuelve todos los problemas asociados con la edi­ ción genética, en contraste con la imagen proyectada a veces por las comunicaciones científicas. Ante todo no eludimos la conclusión de que no hemos logrado escapar del dominio de las bacterias y los plásmidos. Ha habido y todavía hay esfuer­ zos para mejorar la introducción de la proteína Cas9 y el ARN guía directamente, evitando así el uso de un plásmido, pero hasta ahora no se ha conseguido la eficacia deseada. La situación es todavía más complicada en el tratamiento de en­ fermedades en humanos, donde el propio cuerpo actúa de barrera adicional contra la introducción de proteínas y ADN ajenos. También hay algunas limitaciones técnicas, por su­ puesto, una de las cuales muestra que la eficacia del CRISPR/ Cas baja cuando aumentamos la distancia entre dos sitios dia­ na. Esto no es una consecuencia del propio corte, sino de la recombinación. Un segmento muy largo contiene tantas sec­ ciones similares que las células empiezan a seleccionar puntos de recombinación internos que no dan lugar a una modifica­ ción productiva. Además, los genes de los mamíferos suelen ser muy largos, hasta medio millón de bases, una distancia hasta ahora inalcanzable para la edición genética. Otro problema sin resolver es el destino de las células mu­­tadas una vez realizada la edición. En un mundo idóneo no deben quedar restos de ADN ajeno al final del procedi­ miento y la ley es especialmente restrictiva cuando las técni­ cas de ADN recombinante se aplican con fines comerciales. 118

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Por ejemplo, los plásmidos usados para producir el ARN guía y el Cas9 no pueden quedar atrás y se debe comprobar su eliminación en las células diana. En el caso de la recombina­ ción asistida por CRISPR/Cas, una técnica prometedora, el uso de genes de resistencia contra antibióticos ayuda a la dis­ criminación de células con ADN recombinante, pero está su­ jeto a normas muy estrictas. Esto significa que no es posible ejercer una selección posterior al procedimiento, tan caracte­ rística en el mundo del ADN recombinante clásico. Sin selec­ ción, la eficacia baja considerablemente, incluso cuando tra­ bajamos con CRISPR/Cas. En los métodos clásicos con bacterias, la clonación es la solución a la mayoría de problemas de eficacia. Simplemente seleccionamos una serie de colonias y testamos si contienen el plásmido correcto. Este paso elimina el problema de la efica­ cia: si encontramos 2 colonias “buenas” entre 20 hemos teni­ do éxito. Si falla el procedimiento, las bacterias crecen tan rápido que repetir de nuevo el clonaje solo requiere un par de días. Con la manipulación directa de los cromosomas de ma­ míferos no tenemos este lujo, ya que el crecimiento de colo­ nias puede tardar semanas o meses. Cualquier eficacia por debajo del 100% significa que el procedimiento produce una mezcla de células deseadas y no deseadas, y a veces no tene­ mos otra manera salvo la selección con antibióticos para po­ der alcanzar los objetivos en un tiempo razonable. También debemos tener en cuenta que el análisis de los productos re­ quiere, hasta ahora, sacar el ADN para su posterior análisis. El método da igual, la digestión con enzimas de restricción y la PCR son ambos destructivos. En un clonaje podemos dividir una colonia en dos par­ tes, una para el análisis y otra para propagar, pero la manipu­ lación prolongada de células en una incubadora supone un problema adicional. Hay indicaciones de que la estancia fuera del cuerpo puede causar cambios genómicos imprevistos en puntos del genoma donde no enfocamos la atención. En un plásmido de miles de bases no ocurre muy frecuentemente, pero el tamaño del genoma de mamíferos y la larga duración 119

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de los procedimientos pueden ir en detrimento de una modi­ ficación “limpia”. Donde una segunda mutación imprevista puede perturbar los experimentos consecutivos en la investi­ gación, en su uso médico puede causar daños mayores como el cáncer de las células trasplantadas. Los debates sobre el al­­ cance de mutaciones secundarias durante la edición genética probablemente mantendrán ocupadas a varias generaciones de investigadores. Por el momento suponen una barrera para la aplicación de técnicas recombinantes en la medicina. Debemos concluir que el sueño de manipular nuestras células dentro del cuerpo humano es incompatible con la comprobación del resultado posterior. Hasta que se invente un método de análisis de ADN no destructivo, el clonaje pa­ rece ser la única manera fiable de distinguir una edición gené­ tica exitosa. El CRISPR/Cas poco a poco está cambiando nuestro punto de vista sobre las posibilidades, pero todavía no ha conseguido dar una vuelta completa. De momento dis­ ponemos de una manera de cortar el ADN sin sacarlo de las células, que ya es mucho. Pensemos también que las enzimas de restricción fueron descritas antes que la amplificación por PCR. Por lo tanto es posible que el futuro nos dé métodos para leer y escribir el ADN en la propia célula además de cortarlo. ¡Entonces sí dispondremos de una edición genética en toda regla!

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CAPÍTULO 7

¿Mejorando la naturaleza?

En los capítulos anteriores hemos intentado reflejar una serie de descubrimientos y técnicas que han supuesto avances im­ portantes en la manipulación del ADN por parte de la huma­ nidad. La publicación, en 1953, del modelo de doble hélice de Watson y Crick marcó un antes y después, pues constituyó el inicio la biología molecular moderna. Curiosamente, aunque el trabajo era completamente teórico, la estructura del ADN mostraba las posibilidades prácticas de esta molécula. En dé­ cadas posteriores hemos visto el descubrimiento de todo un conjunto de técnicas de apoyo (plásmidos, enzimas, ADN y ARN sintético) con igual o incluso mayor representación en la vida real. Los hallazgos más importantes han implicado el uso de funciones naturales (secuencias ya presentes en otros seres vivos) en los ADN producidos por la humanidad.

Un poco de orden, por favor Antes de llegar a una visión global de nuestro dominio (o no) sobre el ADN, cabe repasar brevemente un último aspecto de la genética moderna. Por supuesto, se trata de nuevo de ampliar las posibilidades de incorporar una nueva técnica y combinarla con conocimientos anteriores, pero esta vez 121

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supone un paso fuera de la propia biología. Hablamos de la aplicación de la informática para analizar el ADN. Casi inmediatamente después de que Sanger publicara la secuenciación en 1975, los biólogos moleculares tropeza­ ron con el problema de la inmensa cantidad de información contenida en el ADN. Leer 1.000 letras quizá no parece mu­ cho (el lector habrá visto 200 veces más al acabar este libro), pero debemos tener en cuenta que también los humanos em­ pezamos con palabras como “mamá” y “papá”. De hecho, las primeras secuencias de ADN habrían parecido muy abstrac­ tas en comparación con las palabras humanas. Estas últimas se interpretan de manera natural y cada una de ellas nos transmite una idea concreta, con verbos, sustantivos y adjeti­ vos. En contraste con el lenguaje humano, una secuencia de ADN contiene información en una forma bruta, casi como los códigos digitales de ceros y unos, por lo que quedaba cla­ ro que recordar las secuencias de ADN era un trabajo perfec­ to para un ordenador. Para manejar el ADN no solo en su forma química, sino como portador de información, la contribución de la infor­ mática ha sido clave. Los primeros programas de análisis biológico ya existían antes de los métodos de Sanger, Maxam y Gilbert, y tenían su aplicación en los polipéptidos. Recor­­ demos que las proteínas también contienen secuencias (es una conclusión del dogma central), en este caso compuestas por aminoácidos. Si consideramos que el “alfabeto” de las proteínas tiene 20 letras (20 aminoácidos) y el del ADN solo 4, la complejidad del último debe ser mucho menor y los cálculos más sencillos. Sin embargo, las cadenas del ADN pueden alcanzar longitudes mucho mayores que una proteína. El polipéptido más largo que conocemos se llama Titin, y tiene unas 27.000 letras, pero la cadena de ADN más larga en nuestro cuerpo (el cromosoma número 1) tie­ ne 10.000 veces más. Algunos mamíferos han evolucionado de una manera que divide el material genético en pocos cro­ mosomas, aunque la cantidad total de información es com­ parable con animales relacionados. Las más grandes de estas 122

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“supermoléculas” pueden llegar a tener alrededor de 2.000 mi­ ­llones de bases. Un uso claro del ordenador es el de almacenar. Un boni­ to ejercicio puede ser intentar leer toda la secuencia en la fi­ gura 14, apuntando letras en una hoja, recordando que la imagen tan solo representa una pequeña parte de una reac­ ción Sanger completa. Pensemos un momento que en los años sesenta y setenta las revistas profesionales se imprimían en papel y llegaban mensualmente al despacho de los científi­ cos. Las primeras publicaciones de secuencias de ADN re­ presentaban directamente el resultado de la electroforesis, dibujando la lectura al lado. Cualquier científico con interés en trabajar con esta información empezaba a copiar letras en una hoja. Seguramente más de una secuencia haya sufrido una “mutación” por un error de escritura. Cuando la técnica de Sanger empezaba a producir secuencias cada vez más lar­ gas, el propio experimento se volvía imposible de representar. Entonces, se dejaron de incluir las típicas fotos con las bandas (a la derecha en la figura 14) en las publicaciones, para dar paso únicamente a la representación de la secuencia misma. Para encajar una secuencia larga en una página, la solución más simple era reducir el tamaño de la composición tipográ­ fica, por lo que los biólogos acababan necesitando una lupa. En 1981, el laboratorio de biología molecular europeo (el EMBL) resolvió el problema al contratar a Greg Hamm. Junto con Kurt Stueber, del instituto de genética de Colonia, que había introducido una colección de secuencias en el or­ denador de la universidad, diseñó el primer formato univer­ sal para almacenar y compartir dicha base de datos. En los primeros años, compartir significaba guardar la informa­ ción en una serie de cintas magnéticas que se enviaban sin coste a cualquier persona interesada. La primera versión te­ nía poco más de medio millón de bases, repartidas entre 387 secuencias; la última versión abarca unos 8 x 1015 bases en más de mil millones de entradas. Si recordamos que 150 nucleótidos producen suficientes combinaciones para supe­ rar en número a todos los átomos en el universo, la cantidad 123

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de información es imposible de imaginar. Afortunadamente, ya no tenemos que pedir cintas magnéticas, internet ha per­ mitido que las bases de datos puedan seguir creciendo. Los nuevos métodos de secuenciación masiva implican incluso un crecimiento exponencial; en los últimos seis años se han producido más datos que en las cuatro décadas con métodos tradicionales. Tanto el tamaño del ADN como el comportamiento pre­ decible de su manipulación favorecen el tratamiento por or­ denador. Por ejemplo, las enzimas de restricción siempre cor­ tan en la misma secuencia corta (entre 4 y 8 bases). Basta con buscar la secuencia adecuada en las cadenas largas para pre­ decir cuáles son los fragmentos que se van a producir en el laboratorio. La separación de moléculas de ADN según su tamaño sigue muy bien la predicción del ordenador, es un proceso muy reproducible. Los primeros programas informáticos para el análisis de secuencias aparecieron ya a finales de los años setenta y nece­ sitaban un ordenador bastante potente para aquel tiempo. Uno de los primeros softwares dedicados exclusivamente al ADN funcionaba con una familia de ordenadores empleados anteriormente para la navegación espacial. Quizá parece ex­ cesivo, pero debemos pensar que justo este tipo de ordenado­ res tenía más presencia en los institutos de investigación. Se ha producido un cambio gradual con la introducción de or­ denadores personales, pero todavía a finales de los años ochenta se utilizaba un ordenador estilo mainframe para ma­ nejar un trabajo equivalente a una tesis de fin de grado de secuenciación. En la actualidad, los ordenadores de casa son más potentes y además tienen conexión a internet. No solo las restricciones del ADN y su clonaje en un plásmido se pueden hacer online, también el diseño de ceba­ dores para PCR, la búsqueda de secuencias similares y el ensamblaje de un genoma a partir de fragmentos se pueden realizar con la ayuda de servidores internacionales como los de EMBL o NCBI. Existe una variedad enorme de análisis, tan solo limitados por la imaginación, la mayoría ofrecidos 124

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gratuitamente (por ejemplo en www.expasy.org). Muchas veces, los propios investigadores diseñan el software con los informáticos antes de ponerlo a disposición del público. En el campo del ADN, la colaboración internacional sí parece funcionar.

¿Podemos escapar de la naturaleza? Un aspecto poco tratado en este libro es el carácter universal del ADN. Con muy pocas limitaciones, cualquiera de las ma­ nipulaciones que hemos visto a lo largo del libro se puede aplicar a cualquier ADN, por separado o en combinación. No hay leyes humanas ni naturales para prohibir la combinación de una restricción y una PCR (cuando una enzima ha corta­ do, la PCR deja de producir una banda), aunque parezcan técnicas muy distintas. La regla básica del derecho “cualquier cosa no prohibida está permitida”, seguramente se puede apli­ car al ADN, que ha demostrado ser la molécula más transfor­ mable sin perder nada de su identidad desoxirribonucleica. Por ello, se ha producido esta amalgama impresionante de téc­ nicas de transformación. El resultado final es la capacidad de producir cualquier secuencia de ADN que nos apetezca. ¿Significa esto que tenemos un dominio total sobre el ADN? Una cosa es componer y producir una secuencia de A, T, C y G, y otra es dar instrucciones dirigidas e interpretables a una célula. Incluso para los genetistas modernos, de alguna manera los herederos de la sabiduría de Watson y Crick, el ADN a veces se parece a un cuadro de Hieronymus Bosch con toda su abundancia de maravillas, pero sin sentido apa­ rente. El proyecto ENCODE representa el esfuerzo interna­ cional por entender mejor estos detalles dentro de nuestros cromosomas y opta de momento por generar un compendio de elementos funcionales en los cromosomas humanos. Igual que el Proyecto Genoma Humano, ENCODE no tiene pre­ cedentes y por lo tanto no hay manera de predecir qué grado de éxito tendrá. 125

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Aparte de nuestros conocimientos parciales, la propia biología impone unos límites en la aplicación del ADN. El clonaje ha aparecido más de una vez en el libro, ya que es el proceso más poderoso que aplicamos para obtener los resul­ tados de la manipulación del ADN. Al final, para que esta manipulación tenga efecto, no queda otra que introducirlo de nuevo en un ser vivo. Para en la práctica aplicar el ADN, tenemos que obedecer a Mendel, al clonaje, a los antibióti­ cos y a cualquier otra ley de la naturaleza. Con la ayuda de la secuenciación hemos identificado las causas de una gran variedad (probablemente la mayoría) de enfermedades he­ reditarias. Pocas veces este conocimiento ha permitido curar la enfermedad, simplemente porque los defectos se produ­ cen a nivel celular en todo el cuerpo. Con las técnicas actua­ les es imposible cambiar una secuencia en todas las células del cuerpo y no tenemos un nuevo hallazgo a la vista. Se puede comparar con una infección vírica, por ejemplo, un resfriado; estos patógenos también intentan sobrevivir in­ troduciendo su material genético en el mayor número de cé­ lulas, pero solo infectan una región localizada del cuerpo (co­ mo la garganta y la nariz). No solo es un efecto de nuestro sistema inmune, el cual tarda unos días en responder, sino de la dificultad de acceso al conjunto de células del cuerpo. Ni siquiera las técnicas más recientes como el CRISPR nos li­ beran de nuestra naturaleza, de ser un organismo donde una multitud de células colaboran para constituir un individuo. Justo esta colaboración nos protege contra amenazas exter­ nas, pero también significa que nuestras células sufren jun­ tas sus debilidades. Quizá es la ley de la naturaleza más difí­ cil de aceptar, pero todos los organismos multicelulares tienen su principio y su fin. Esto de ninguna manera significa que el ADN carezca de aplicaciones prácticas para la humanidad. Hay numerosos matices sin describir en este libro, desde la producción de enzimas recombinantes para la limpieza de ropa hasta el uso del ADN y el PCR para marcar productos susceptibles de robo. Esto podría ser el tema de un nuevo libro. 126

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Tabla 2 Línea temporal del ADN desde 1953. 1960 Watanabe y Fukasawa descubren la transferencia de un gen de resistencia entre distintas bacterias. Aunque no era claro entonces, estos elementos de transferencia son los plásmidos. 1961 El experimento Crick-Brenner muestra que cada aminoácido en una proteína es codificado por un triplete en el ADN y ARN. Nirenberg, Matthaei, y Ochoa descubren la función de los primeros tripletes del código genético. 1970 Smith, Kelly, y Wilcox descubren la primera enzima de restricción. Esta enzima viene de la bacteria Haemophilus influenzae y se llama HindIII. 1971 El grupo liderado por Berg muestra la posibilidad de cortar fragmentos de ADN con enzimas de restricción para su posterior fusión mediante la enzima ADN ligasa. 1973 Boyer y Cohen construyen un plásmido funcional para el clonaje de fragmentos de ADN. 1975 Southern combina la separación de fragmentos de ADN con su hibridación. Sanger desarrolla la secuenciación con cebador y nucleótidos dideoxi. 1977 Maxam y Gilbert describen la secuenciación química (sin cebador). 1981 Puesta en marcha de bases de datos con secuencias de ADN en el EMBL y NCBI. 1986 Mullis publica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 2000 Mojica encuentra secuencias repetitivas en los genomas de varias bacterias. 2005 Disponibilidad comercial de la secuenciación masiva. 2007 El grupo dirigido por Horvath muestra la capacidad del CRISPR/Cas de cortar ADN. 2009 Las doctoras Charpentier y Doudna clonan el sistema CRISPR/Cas en plásmidos para usarlo como herramienta en edición génica.

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CAPÍTULO 8

Diez preguntas curiosas

¿Por qué encontramos tan poco ADN ‘desnudo’ en el medioambiente?

Los biólogos que se interesan por los orígenes de la vida ma­ nejan la hipótesis de que el ADN puede haber existido antes que las células, pero que habría desaparecido hace tiempo. Es posible que el mundo estuviera durante mucho tiempo repleto de ARN y ADN libre, hasta que la evolución dio lugar a la primera célula y a las enzimas. La combinación de ambos es tan poderosa (la célula guarda el ADN en su inte­ rior y un enzima extracelular elimina los ácidos nucleicos externos) que rápidamente fue eliminado todo el ADN libre del medioambiente. Al final no quedó competición para las células. Puesto que el ADN se duplica copiando la cadena opuesta, ¿cómo se produce una mutación?

Aunque la ADN polimerasa de casi todos seres vivos com­ prueba la escritura correcta de la última base que añade a la cadena, a veces esta comprobación puede fallar. Hacerla in­ crementa la fidelidad de la polimerasa, pero no elimina los fa­­ llos por completo. También factores externos, como la radia­ ción con luz ultravioleta, pueden provocar cambios en el ADN, como roturas o mutaciones. 128

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¿Qué es el ADN basura? ¿Sirve para algo?

El término ADN basura es un invento de los humanos que no existe en la naturaleza. Después de completar la secuencia del genoma humano, las secciones largas no parecen codificar para ninguna proteína y por lo tanto no sirven para nada. Estas secciones han recibido el nombre de ADN basura. Unos años más tarde se empezó a entender que las células de mamíferos emplean regiones muy extensas para controlar los genes que sí producen una proteína. Se puede afirmar que somos mamíferos porque controlamos con más atención los genes que tenemos, no porque tengamos más que otros ani­ males. Aunque todavía no estamos seguros del todo, parece que gran parte del ADN basura contiene señales que regulan y controlan el ADN codificante. Si conocemos la secuencia de nuestro ADN, ¿podemos predecir cualquier enfermedad?

Hay algunas enfermedades hereditarias donde una sola muta­ ción tiene un impacto enorme, pero gran parte de la va­­ria­­bi­­ lidad entre dos humanos (puede llegar al 1% de todo el material genético) no tiene una correlación directa con una enferme­ dad. La genética de poblaciones aprovecha la secuencia de mu­ chas personas para calcular una correlación, pero usa la esta­ dística para describir probabilidades. Normalmente, algún alelo puede tener una correlación con alguna enfermedad, pe­ ro no nos da una respuesta afirmativa o negativa. Mendel se­ guía tan solo los fenotipos más evidentes, pero sabemos ahora que existe toda un área gris entre dominante y negativo. ¿La secuencia de nuestro ADN nunca cambia después de nacer?

Si hemos leído bien cómo se produce una mutación, podemos predecir que el número inmenso de células en nuestro cuerpo hace probable que se produzca un error de escritura en algu­ nas de ellas. Una de las enfermedades que tienen su origen en los cambios de nuestros cromosomas es el cáncer, que se pro­ duce en un tejido determinado de nuestro cuerpo. No solo los errores de escritura pueden dar lugar a mutaciones, también la 129

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separación de los cromosomas en la mitosis puede provocar la rotura del ADN por la fuerza física del huso mitótico. ¿Las enfermedades hereditarias se pueden curar con terapia génica?

Lo más probable sea que no. Como ya se ha explicado en los últimos capítulos, la mayoría de enfermedades genéticas afec­ ta a un grupo muy grande de células o incluso al cuerpo en­ tero. Con la tecnología actual es imposible realizar una edi­ ción génica de todas las células. Un campo que despierta mucho interés es el de la manipulación de células madre, por ejemplo las células de la médula ósea. Estas se pueden ex­ traer, modificar en el laboratorio y volver a trasplantar. Solo en el caso de que las células modificadas y trasplantadas so­ brevivan en el anfitrión y puedan compensar la falta de un gen en el resto del cuerpo, podrá producirse una compensa­ ción que reduzca el efecto de la enfermedad. ¿El ADN sirve para recuperar una especie de la extinción?

Con las técnicas de secuenciación modernas es posible obte­ ner la información genética de seres vivos que se han extin­ guido. Si se ha producido hace poco, como los mamuts y neandertales, la reconstrucción del genoma completo es una posibilidad. Falta, por lo tanto, crear por lo menos una célula con este ADN, que simplemente es demasiado grande para producirse de manera sintética. Hace falta realizar un inter­ cambio paulatino con una especie relacionada y hemos visto que las técnicas actuales lo permiten. Cambiar, sin embargo, un único gen no es bastante para reconstruir todo una espe­ cie; probablemente hace falta repetir el procedimiento doce­ nas de miles de veces para introducir todos los genes ajenos y mientras tanto continúa la replicación natural de anfitrión, con la posibilidad de fallo. De momento, las técnicas disponi­ bles no alcanzan la desextinción (aunque en los cómics sí). ¿Es de verdad único el ADN de cada persona?

Cada persona hereda una parte de los cromosomas de su ma­ dre y otra de su padre. La selección de cada cromosoma se 130

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produce durante la formación de las células reproductoras: ovocitos y espermatocitos. Dado que heredamos 23 cromoso­ mas de nuestra madre y el mismo número de nuestro padre, la posibilidad de heredar todos los cromosomas con exactamente la misma secuencia que los de nuestros hermanos es muy baja. Es una consecuencia indirecta de las leyes de Mendel: las ca­ racterísticas situadas en distintos cromosomas raramente se heredan juntas. Además, la selección de los cromosomas en las células reproductoras involucra un proceso llamado “meiosis”, donde fragmentos de distintos cromosomas homólogos se intercambian por recombinación homóloga. Entonces, las se­ cuencias que tienen pequeñas variaciones entre distintas per­ sonas se vuelven a mezclar en cada generación. Tenemos bas­ tantes cromosomas y cada uno es lo bastante grande como para generar más combinaciones que personas en el mundo. Por otra parte, también heredamos mucho material genético con secuencias idénticas a las de nuestra familia; esto es la base, por ejemplo, para las pruebas de paternidad. Una excepción son los gemelos idénticos, pues estos se producen durante la gestación cuando el reparto de material genético ya ha acaba­ do. Para buscar diferencias entre gemelos idénticos hace falta secuenciar todo su ADN y determinar si se ha producido algún pequeño fallo (una mutación) espontánea. No solo el ADN de las personas suele ser único, la mis­ ma técnica de identificación sirve para todos los seres vivos con cromosomas complejos. En 1993, Tim Helentjaris, gene­ tista de plantas de la Universidad de Arizona, consiguió em­ parejar unas semillas de Parkinsonia aculeata (palo verde mexicano) con un árbol determinado. Las semillas se encon­ traron sobre el coche de un sospechoso y el árbol fue el lugar de un homicidio. El ADN de otros árboles de la misma espe­ cie en la zona fue lo bastante distinto para indicar con seguri­ dad que el coche había estado en el lugar del crimen. ¿El ADN recombinante sirve para clonar seres vivos?

La aplicación de las técnicas de ADN recombinante se aso­ cian íntimamente con el proceso del clonaje, pero su relación 131

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es al revés de lo que normalmente pensamos. El clonaje es simplemente cualquier método que sirva para obtener un grupo de células que son genéticamente idénticas. Esto fun­ ciona muy bien con bacterias, ya que crecen rápido y pueden producir millones de células a partir de una sola célula “ma­ dre”. Esparciendo unas pocas bacterias en una placa de Petri obtenemos colonias, cada una de las cuales proviene de una sola célula y, por lo tanto, son genéticamente homogéneas; por lo tanto, no hace falta una manipulación genética para obtener colonias. El proceso, sin embargo, es muy útil para seleccionar fragmentos de ADN únicos. La mayoría de técni­ cas para manipular ADN (el cortar y pegar con enzimas) simplemente son reacciones químicas no dirigidas, lo que sig­ nifica que se producen mezclas de muchas combinaciones de fragmentos de ADN y el proceso de clonaje ayuda para indi­ vidualizar cada combinación (en una sola colonia en la placa de Petri) para su posterior análisis. Entonces, el proceso de clonaje se aplica para obtener el producto genético deseado, pero puede funcionar de manera independiente. ¿Qué pasa con el ADN transgénico de las plantas que comemos?

La primera observación que habría que hacer es la naturaleza del ADN transgénico de las plantas. Este ADN generalmente codifica para resistencias a plagas de hongos o insectos y nor­ malmente proviene de otras plantas. A veces se han usado genes de bacterias al observarse que la bacteria en cuestión mataba a los insectos. Aunque se introduzca un fragmento de ADN de otro organismo (de ahí proviene el nombre transgé­ nico), esto no convierte a la planta en otra especie. En la ma­ yoría de los casos, se cambia menos de una milésima parte del ADN del anfitrión. Para que el ADN transgénico funcione es necesaria la ex­ presión de las proteínas codificadas en él y la transmisión me­ diante semillas a la próxima generación. Si no es así, cada gene­ ración de plantas necesitaría una nueva manipulación genética, que es un proceso lento y costoso. De esta manera, el ADN transgénico casi siempre se introduce en los cromosomas de 132

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algunas células de plantas y a partir de ahí se cultivan las plantas transgénicas en el laboratorio antes de llevarlas a los campos de cultivo. Cuando finalmente comemos estas plantas, nuestro trac­ to digestivo no distingue entre el ADN de la propia planta (más del 99,9% del total) y la minúscula fracción transgénica; ambos se componen de las mismas bases A, T, C y G. Nuestro intestino produce una variedad de enzimas para digerir y aprovechar el ADN, degradando al máximo el ADN de la carne como de las plantas. Tras la digestión, no queda rastro del ADN transgénico y, por lo tanto, no se incorpora el ADN que comemos a nuestro cuerpo.

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Glosario

ADN Ácido desoxirribonucleico. Aunque existan algunos seres

vivos que guardan la información genética en el ARN (al­ gunos virus), la estabilidad química del ADN parece dar una ventaja importante. Las enzimas capaces de atacar el ADN necesitan la ayuda de un metal divalente (normal­ mente magnesio, manganeso o zinc), mientras que las en­ zimas que degradan al ARN funcionan sin ayuda de me­ tales. Agarosa Polisacárido extraído de algas rojas, parecido al almi­ dón, aunque el azúcar monómerico de la agarosa es la aga­ robiosa. La preparación de agarosa a partir del agar consis­ te en la eliminación de contaminantes como la aga­­ro­­pectina. Alelo Expresión fenotípica de dominancia o recesividad. En seres vivos con dos copias de cada cromosoma, cada copia de un gen corresponde con un alelo. ARN Ácido ribonucleico. Puede producir una doble hélice pa­ recida al ADN, pero en la mayoría de células solo se pro­ duce una cadena con funciones transitorias (por ejemplo el ARN mensajero). Blot Estampa de un material biológico en un soporte mem­ branoso como un filtro. La idea del blot es inmovilizar el material de prueba mientras se realizan las incubaciones con una sonda y lavados. 135

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Cebador Pequeño oligonucleótido o polinucleótido que hibri­

da con el ADN diana y presenta un extremo 3-prima (normalmente la última base) donde la ADN polimerasa puede empezar a incorporar nucleótidos nuevos. Es posi­ ble introducir cambios de secuencia o modificaciones co­ mo fluorescencia en el extremo 5-prima. Clon Población de células idénticas producidas en el clonaje. Por defecto, esta población tiene su origen en una única célula, pero el resultado final puede ser una colonia de bacterias en una placa de Petri, así como un ser vivo com­ pleto (la oveja Dolly). Clonaje Proceso de separar una suspensión con muchas cé­ lulas en individuos. En una placa de Petri, cada colonia de bacterias contiene células idénticas (corresponde a un clon). Código genético Combinación de tripletes (secuencias de tres bases) con la instrucción de incorporar un determinado aminoácido por parte de los ribosomas. Dado que existen unos 20 aminoácidos, una combinación de tres bases es el número mínimo que puede codificar para todos los ami­ noácidos (4 al cuadrado son 16, 4 al cubo son 64). Con tres bases incluso hay sitio para codificar el final del poli­ péptido. Gel Red de un polímero de baja densidad con capacidad para retener una solución acuosa. Normalmente, el polímero se produce al disolver por calor, disminuyendo posteriormen­ te la temperatura (por ejemplo, el polisacárido agarosa) o por una polimerización química (como nylon o poliamida). La cantidad de sólido dentro de la fase acuosa determina la porosidad del gel. Un gel más poroso deja pasar moléculas más grandes. Gen Conjunto de nucleótidos en un cromosoma o plásmido que determina la expresión de una característica en el or­ ganismo. La mayoría de genes controla la producción de polipéptidos (proteínas), pero algunos producen un ARN sin traducir.

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Heterocigosidad Hecho de tener los dos alelos de un gen dife­

rentes. Hibridación Unión de dos oligo o polinucleótidos mediante

puentes de hidrógeno entre las bases. Así, el ADN (una doble cadena) normalmente se encuentra en un estado hibridado, pero puede abrirse por calor o un ambiente químico extremo. Tanto el ADN como el ARN tienen capacidad para hibridar (de hecho, la hibri­ ­ dación del ARN es más fuerte). El número de bases complementarias y su distribución en la cadena deter­ minan la capacidad de hibridación entre dos polinu­ cleótidos. Homocigosidad Hecho de tener los dos alelos de un gen idén­ ticos. Librería Colección de fragmentos de ADN que representa el conjunto del material genético de interés. Existen muchas maneras de guardar y usar una librería, por ejemplo inser­ tando los fragmentos en plásmidos de bacterias (antes o después de generar clones individuales). Ligasa Enzima que puede unir dos fragmentos de ADN. En contraste con la recombinación, una ligación une dos frag­ mentos de ADN por sus extremos. Ligación Proceso de unir dos fragmentos de ADN con ayuda de una ligasa. En contraste con una recombinación, la li­ gación solo aprovecha las protrusiones cortas (unas 4 ba­ ses) producidas en el extremo del ADN por una enzima de restricción. Molde ADN (o ARN) de entrada desde donde se amplifica una secuencia mediante PCR. Si la secuencia deseada no está presente en el molde, la PCR no produce una banda de ADN. Nucleótido Bloque de construcción del ADN o ARN. Cada nucleótido consiste en una base (adenina, citosina, guani­ na, o timina) acoplada al azúcar (desoxirribosa en el ADN, ribosa en el ARN) y un grupo fosfato.

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Oligonucleótido Cadena de múltiples nucleótidos que no es

muy larga. Cuando la cadena se hace muy larga hablamos de un polinucleótido. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. El invento más importante de Kary Mullis. Pilus Orgánulo presente en algunas bacterias, que tiene un papel en la transferencia de material genético entre una bacteria y otra. Plásmido ADN circular presente en algunas bacterias. Los plásmidos tienen la capacidad de replicarse de forma independiente del cromosoma principal de las bacte­ rias y se distinguen de los virus por la falta de una en­ voltura proteica. Polimerasa Enzima que produce polímeros mediante blo­ ques de construcción (los monómeros). Las más cono­ cidos son ADN y ARN polimerasas. Polinucleótido Cadena de múltiple nucleótidos. Puede ser de ARN o ADN. Cuando esta cadena es relativamente corta (menos de cien unidades, aunque no hay un lími­ te fijo establecido), también hablamos de oligonucleó­ tido. Proteinasa Enzima con capacidad de degradar otras pro­­ teínas. Recombinación homóloga Intercambio de segmentos entre dos cadenas de ADN basado en secuencias parecidas (homó­­logas). Restricción Corte en el ADN producido mediante una en­ zima presente en microorganismos que tiene una fina­ lidad de defensa frente a elementos genéticos invasivos (bacteriófagos y también transposones). Las secuen­ cias reconocidas por este tipo de enzimas normalmente son cortas. Para evitar la restricción de su propio ADN, cada bacteria produce enzimas que modifican (meti­ lan) esa secuencia. Secuencia Orden de los nucleótidos en un fragmento o segmento de ADN.

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Secuenciación Proceso para determinar una secuencia. Sonda Oligonucleótido o polinucleótido que puede hibri­

dar con una secuencia diana y que ha sido marcado para su seguimiento. Este marcaje puede ser radiactivo o fluorescente. Permite localizar la secuencia diana en un blot o incluso en un tejido animal (se llama hibrida­ ción in situ).

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Bibliografía

Cohen, S. N.; Chang, A. C. H.; Boyer, H. W. y Helling, R. B. (1973): “Construction of biologically functional bac­ terial plasmids in vitro”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 70, pp. 3240-3244. Dahm, R. (2005): “Friedrich Miescher and the discovery of DNA”, Developmental Biology, 278, pp. 274-288. Franklin, R. E. y Gosling, R. G. (1953): “The Structure of Sodium Thymonucleate Fibres I. The Influence of Water Content”, Acta Crystallografica, 6, pp. 673-677. Gilbert, W. y Maxam, A. (1973): “The nucleotide sequence of the lac operon”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 70, pp. 3581-3584. Hershey, A. D y Chase, M. (1952): “Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacte­ riophage”, Journal of General Physiology 36, pp. 39-56. Jinek, M.; Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A. y Charpentier, E. (2012): “A programmable dualRNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, Science, 337, pp. 816-821. Mojica, F. J. M.; Díez-Villaseñor, C.; García-Martínez, J. y Almendros, C. (2009): “Short motif sequences deter­ mine the targets of the prokaryotic CRISPR defence sys­ tem”, Microbiology, 155, pp. 733-740. 141

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Mojica, F. J. M.; Díez-Villaseñor, C.; Soria, E. y Juez, G. (2000): “Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of archaea, bacteria and mitochondria”, Molecular Microbiology, 36, pp. 244-246. Morrow, J. F. y Berg, P. (1972): “Cleavage of Simian Virus 40 DNA at a unique site by a bacterial restriction enzy­ me”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 69, pp. 3365-3369. Mullis, K. B. (1990): “The unusual origin of the polymerase chain reaction”, Scientific American, 262, pp. 56-65. Sanger, F. y Coulson, A. R. (1975): “A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase”, Journal of Molecular Biology, 94, pp. 441-448. Southern, E. (1975): “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Jour­ ­nal of Molecular Biology, 98, pp. 503-517. Watanabe, T. y Fukusawa, T. (1960): “‘Resistance transfer factor’: An episome in enterobacteriaceae”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 3, pp. 660665. Watson, J. D. (2010): The Double Helix - A personal account of the discovery of the structure of DNA, Phoenix, Londres. Watson, J. D. y Crick, F. H. C. (1953): “Molecular structure of nucleic acids”, Nature, 4356, pp. 737-738.

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69. La criptografía. Luis Hernández Encinas 70. La demencia. Jesús Ávila 71. Las enzimas. Francisco J. Plou 72. Las proteínas dúctiles. Inmaculada Yruela Guerrero 73. Las encuestas de opinión. Joan Font Fàbregas y Sara Pasadas del Amo 74. La alquimia. Joaquín Pérez Pariente 75. La epigenética. Carlos Romá Mateo 76. El chocolate. María Ángeles Martín Arribas 77. La evolución del género ‘Homo’. Antonio Rosas 78. Neuromatemáticas. El lenguaje eléctrico del cerebro. José María Almira y Moisés Aguilar-Domingo

79. La microbiota intestinal. Carmen Peláez y Teresa Requena 80. El olfato. Laura López-Mascaraque y José Ramón Alonso 81. Las algas que comemos. Elena Ibáñez y Miguel Herrero 82. Los riesgos de la nanotecnología. Marta Bermejo Bermejo y Pedro A. Serena Domingo

83. Los desiertos y la desertificación. J. M. Valderrama 84. Matemáticas y ajedrez. Razvan Iagar 85. Los alucinógenos. José Antonio López Sáez 86. Las malas hierbas. César Fernández-Quintanilla y José Luis González Andújar 87. Inteligencia artificial. Ramon López de Mántaras Badia y Pedro Meseguer González

88. Las matemáticas de la luz. Manuel de León y Ágata Timón 89. Cultivos transgénicos. José Pío Beltrán 90. El Antropoceno. Valentí Rull 91. La gravedad. Carlos Barceló Serón 92. Cómo se fabrica un medicamento. María del Carmen Fernández Alonso

y Nuria E. Campillo Martín 93. Los falsos mitos de la alimentación. Miguel Herrero 94. El ruido. Pedro Cobo Parra y María Cuesta Ruiz 95. La locomoción. Adrià Casinos 96. Antimateria. Beatriz Gato Rivera 97. Las geometrías y otras revoluciones. Marina Logares 98. Enanas marrones. María Cruz Gálvez Ortiz 99. Las tierras raras. Ricardo Prego Reboredo 100. El LHC y la frontera de la física. El camino a la teoría del todo. Alberto Casas 101. La tabla periódica de los elementos químicos. José Elguero Bertolini, Pilar Goya Laza y Pascual Román Polo 102. La aceleración del universo. Pilar Ruiz Lapuente 103. Blockchain. David Arroyo Guardeño, Jesús Díaz Vico y Luis Hernández Encinas 104. El albinismo. Lluís Montoliu 105. Biología cuántica. Salvador Miret Artés 106. Islam e islamismo. Cristina de la Puente

¿de qué sirve la ciencia si no hay entendimiento?

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¿QUÉ SABEMOS DE?

¿ QUÉ SABEMOS DE?

Pese a lo evidente que pueda parecer hoy, la idea general del ADN, esa larga cadena en forma de doble hélice que porta la información genética de todos los seres vivos, tiene menos de un siglo de edad. Fueron los científicos James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, cuya relación profesional está envuelta en polémica, quienes descubrieron la importancia crucial del ADN en la formación de la vida y consiguieron, tras años de experimentación, dar con su verdadera estructura. Este libro recorre los inicios de una nueva rama de la ciencia basada en la manipulación del material genético que revolucionó la biología y pone bajo el microscopio las técnicas modernas que utilizan el ADN como herramienta con objetivos tan variados como atrapar asesinos, resistir plagas o revertir enfermedades como el cáncer. Carmen Mora Gallardo es licenciada en Biotecnología y doctora en Biociencias Moleculares. Su investigación se ha enfocado en el estudio de la proteína DIDO3 en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC. Forma parte de la asociación Apadrina la Ciencia. Karel H. M. van Wely es doctor en Ciencias Naturales y Matemáticas. Trabaja en el Centro Nacional de Biotecnología, en Madrid, donde investiga la relación entre la división celular, la especialización de las células y el cáncer. Es autor en esta misma colección de El cáncer y los cromosomas y Las células madre.

ISBN: 978-84-00-10520-4

EL ADN

El ADN Carmen Mora Gallardo y Karel H. M. van Wely

51. Los metales en la Antigüedad. Ignacio Montero 52. El caballito de mar. Miquel Planas Oliver 53. La locura. Rafael Huertas 54. Las proteínas de los alimentos. Rosina López Fandiño 55. Los neutrinos. Sergio Pastor Carpi 56. Cómo funcionan nuestras gafas. Sergio Barbero Briones 57. El grafeno. Rosa Menéndez y Clara Blanco 58. Los agujeros negros. José Luis Fernández Barbón 59. Terapia génica. Blanca Laffon, Vanessa Valdiglesias y Eduardo Pásaro 60. Las hormonas. Ana Aranda 61. La mirada de Medusa. Francisco Pelayo 62. Robots. Elena García Armada 63. El Parkinson. Carmen Gil y Ana Martínez 64. Mecánica cuántica. Salvador Miret Artés 65. Los primeros homininos. Paleontología humana. Antonio Rosas 66. Las matemáticas de los cristales. Manuel de León y Ágata Timón 67. Del electrón al chip. Gloria Huertas, Luisa Huertas y José L. Huertas 68. La enfermedad celíaca. Yolanda Sanz, María del Carmen Cénit

El ADN Carmen Mora Gallardo y Karel H. M. van Wely

¿QUÉ SABEMOS DE ?

1. El LHC y la frontera de la física. Alberto Casas 2. El Alzheimer. Ana Martínez 3. Las matemáticas del sistema solar. Manuel de León, Juan Carlos Marrero y David Martín de Diego

4. El jardín de las galaxias. Mariano Moles 5. Las plantas que comemos. Pere Puigdomènech 6. Cómo protegernos de los peligros de Internet. Gonzalo Álvarez Marañón

7. El calamar gigante. Ángel Guerra Sierra y Ángel F. González González 8. Las matemáticas y la física del caos. Manuel de León y Miguel Á. F. Sanjuán

9. Los neandertales. Antonio Rosas 10. Titán. Luisa M. Lara 11. La nanotecnología. Pedro A. Serena Domingo 12. Las migraciones de España a Iberoamérica desde la Independencia. Consuelo Naranjo Orovio 13. El lado oscuro del universo. Alberto Casas 14. Cómo se comunican las neuronas. Juan Lerma 15. Los números. Javier Cilleruelo y Antonio Córdoba 16. Agroecología y producción ecológica. Antonio Bello, Concepción Jordá y Julio César Tello

17. La presunta autoridad de los diccionarios. Javier López Facal 18. El dolor. Pilar Goya Laza y Mª Isabel Martín Fontelles 19. Los microbios que comemos. Alfonso V. Carrascosa 20. El vino. Mª Victoria Moreno-Arribas 21. Plasma: el cuarto estado de la materia. Teresa de los Arcos e Isabel Tanarro

22. Los hongos. M. Teresa Tellería 23. Los volcanes. Joan Martí Molist 24. El cáncer y los cromosomas. Karel H. M. van Wely 25. El síndrome de Down. Salvador Martínez Pérez 26. La química verde. José Manuel López Nieto 27. Princesas, abejas y matemáticas. David Martín de Diego 28. Los avances de la química. Bernardo Herradón García 29. Exoplanetas. Álvaro Giménez 30. La sordera. Isabel Varela Nieto y Luis Lassaletta Atienza 31. Cometas y asteroides. Pedro José Gutiérrez Buenestado 32. Incendios forestales. Juli G. Pausas 33. Paladear con el cerebro. Francisco Javier Cudeiro Mazaira 34. Meteoritos. Josep Maria Trigo Rodríguez 35. Parasitismo. Juan José Soler 36. El bosón de Higgs. Alberto Casas y Teresa Rodrigo 37. Exploración planetaria. Rafael Rodrigo 38. La geometría del universo. Manuel de León 39. La metamorfosis de los insectos. Xavier Bellés 40. La vida al límite. Carlos Pedrós-Alió 41. El significado de innovar. Elena Castro Martínez e Ignacio Fernández de Lucio

42. Los números trascendentes. Javier Fresán y Juanjo Rué 43. Extraterrestres. Javier Gómez-Elvira y Daniel Martín Mayorga 44. La vida en el universo. F. Javier Martín-Torres y Juan Francisco Buenestado 45. La cultura escrita. José Manuel Prieto 46. Biomateriales. María Vallet Regí 47. La caza como recurso renovable y la conservación de la naturaleza. Jorge Cassinello Roldán 48. Rompiendo códigos. Vida y legado de Turing. Manuel de León

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y Ágata Timón

49. Las moléculas: cuando la luz te ayuda a vibrar. José Vicente García Ramos 50. Las células madre. Karel H. M. van Wely

28/8/19 13:47