Die Oxydation aliphatischer Kohlenwasserstoffe durch Bakterien [Reprint 2021 ed.] 9783112585405, 9783112585399

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Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften der DDR Mathematik - Naturwissenschaften - Technik

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Harald Aurich

Die Oxydation aliphatischer Kohlenwasserstoffe durch Bakterien

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

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Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften der DDR Mathematik — Naturwissenschaften — Technik

Jahrgang 1979 • Nr. 16/N

Harald Aurich

Die Oxydation aliphatischer Kohlenwasserstoffe durch Bakterien

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN 1979

Vortraf; v o n Prof. Dr. sc. I l a r a k l Aurich. Physiologisch-chemisches I n s t i t u t d e r Marlin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, g e h a l t e n v o r d e r Klasse B i o w i s s e n s c h a f t e n der Akademie der Wissenschaften der D D R a m 14. D e z e m b e r 1978

H e r a u s g e g e b e n im A u f t r a g e des P r ä s i d e n t e n d e r A k a d e m i e der Wissenschaften der D D R v o n V i z e p r ä s i d e n t Prof. Dr. Heinrich Scheel

Erschienen im Akademie-Verlag, 108 Berlin, Leipziger Str. 3—4 © Akademie-Verlag, Berlin 1979 Lizenznummer: 202 • 100/272/79 Gesamtherstellung: VEB Druckhaus Kothen Bestellnummer: 7(52 784 7 (2010/79;IG,'N) • LSV 1345 Printed in GDR DDK 3 , - M

III den lelzlen Jahren hat sich auf dem Boden der Biochemie und der Mikrobiologie ein neues Forschungsgebiet entwickelt und ein eigenständiges Proiii erworben. das man als „Krdölbiochemie" oder „Biochemie der Kohlenwasserstoffe" bezeielinel. Sein Plnlz liegt zwischen der Erdölmikrobiologie, aus der es hervorging. und der Pelrochemie: mit beiden ist es auch noch eng verbunden. Die eigentliche Entwicklung der Erdölbiochemie begann vor etwa 20 Jahren, nachdem die eisten Forschungslaboratoricn der Erdölindustrie — insbesondere zur Entparaffinierung von Kerosin und Gasöl mit Hilfe von Hefen und zur Gewinnung von Hefeprotein — gegründet worden waren. Vor allem dieses industrielle Interesse trug zum raschen Fortschritt der Erdölbiochemie bei. Hauplgcgenstände der biochemischen Untersuchungen waren die metabolcn Umwandlungen aliphatischer und aromatischer Kohlenwasserstoffe in Mikroorganismen, die Art der Bildung ihrer primären Oxydationsprodukte und deren Einschleusung in ..physiologische" zentrale Bahnen (einschließlich deren Regulation) sowie die Isolierung und Charakterisierung beteiligter Enzyme. Von nicht unwesentlicher Bedeutung sind für die Beschreibung der gefundenen Phänomene Erkenntnisse gewesen, die die Wechselwirkungen — insbesondere hydrophober Natur — zwischen den Erdölbcstandleilen bzw. deren Metaboliten und den Zellstrukluren der Mikroben — insbesondere Proteinen und Membranen — zum Gegenstand hatten. Es gibt über das Forschungsgebiet in der Literatur eine Reihe von übersichlsarlikeln, meist ältere und vorrangig aus mikrobiologischer Sicht verfaßte (z.B. / . G R E L L , 1 9 5 0 : B E E H S T E C I I E R , 1 9 5 4 : F O S T E R , 1 9 6 2 ; van der L I N D E N und

TIIIJSSE,

1965;

MCKENNA

und

KALLIO,

1965;

einige aber auch aus jüngerer Zeil ( K I . u c und RATI.EDCE,

DAVIS,

1967,

MARKOVETZ, 1 9 7 1 ;

IIUMPIIREY, FINNNERTY,

1967), 1977;

1977).

Die folgenden Ausführungen beschränken sich auf die biochemische Konvertierung von mittel- und langkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen (n-Alkane) durch Bakterien. An sieh ist eine große Zahl von Mikroorganismen in der Lage, n-Alknnc zu assimilieren, Aromaten dagegen können nur von einer kleinen Zahl von Species verwertet werden. Die meisten Erkenntnisse — vor allem auch in der industriellen Anwendung — stammen von Hefen (Candida). Erst in den letzten Jahren wurden zunehmend besonders biochemische Ergebnisse mit Hilfe von Bakterien erzielt und neue Einsichten und Perspektiven gewonnen. Zusätzliche Motivation zur Beschäftigung mit dem bakteriellen Alkanstoffwechsel war der Aspekt, daß insbesondere bakterielle Biomassen eine viel größere Variabilität neuartiger Spezialprodukte aus dem Erdöl — gegebenenfalls auch für den Einsatz in anderen Produktionszweigen — erwarten lassen, als dies bei Hefen der Fall ist. Im folgenden soll eine Ubersicht gegeben werden über die primäre Oxydation von n-Alkanen (einschließlich der daran beteiligten Enzyme), wie wir sie von den Ergeb-

1 Als Abkürzungen der Gattungsnamen werden im folgenden verwendet: l's. = Pseudomonas, Ac. = Acinetobacter

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rtissen insbesondere an Pseudomonas putida var. oleovorans, Ps. aeruginosa (auch Ps. sp. 196Aa) und Acinetobacter-Species, z. B. Ac. calcoaceticus und Ac. sp. II01-N (früher Micrococcus cerificans), ableiten können. 1

1. Alkan-Oxydationsproduktc und metabole Bahnen Die bakteriellen Oxydationsprodukte von aliphatischen Kohlenwasserstoffen zeigen eine erhebliche Vielfalt, die von der verwendeten Species und zum Teil auch von der Kettenlänge der Alkane abhängt. In der Regel liegt bei Kettenlängen zwischen Cg und Cu eine gewisse Grenze der Assimilationsfähigkeit. Die meisten Stämme verwerten ausschließlich Alkane mit Kettenlängen, die über dieser Grenze liegen, vermögen aber manchmal auch kürzerkettige zu oxydieren, wenngleich nicht zu assimilieren (ASPEHGER und AURICH, 1 9 7 7 ) . Nur wenige Species assimilieren auch kürzerkettige Alkane (z. B. C6—Cs), wozu beispielsweise Ps. putida lind auch Stämme von Corynebakterien gehören. Ungesättigte und verzvveigtketlige Verbindungen werden im allgemeinen schlechter und z. T. auch nur unvollständig abgebaut. Tabelle 1 Wichtige Oxydationsprodukte der n-Alkane in Bakterien In d e n Strukturformeln sind jeweils nur die E n d e n der Kohlenwasserstoffmolekel dargestellt. Die freien Striche an den C-Atomen stehen symbolisch für H-Atome Strukturspezifität

A 1-Alkene

StrukturSpezifität

-C-C—

Acetylester längerkettiger Alkohole

C -0—C—C-

I

OH 1-AlkanoIe (prim. Alkohole)

I I -c-c—

I HO

OH

i I c—c—

1,2-Diole

0 Alkanale (Aldehyde)

2-Alkanole (sek. Alkohole)

2-Alkanone (Methylketone)

4

I

Y

.—c—c I \ OH

I I • —c—c— I I 0 II I • —c—c—

Fettsäuren

C-COOH

I co-IIydroxyfettsäuren

Dicarbonsäuren

OH

I -C—

HOOC—

I — C—COOH

—C—COOH

n-Alkan (cn)

©

OH

I

,

-c — c I I 2-Alkanole

o

....

1 -Alkene

©

©

-C2-Alkanone

1 -Alkanole

I -CS :C-

©

©

0

/ \ -c—cI

I Epoxide

0 HO

I

OH

I

- c — c I I I 1.2-Dicie i Alkanale

Acetat -OH

0

HO -C I

-Alkanole

\ 2-Hydroxyt fettsäuren

(Cirt) . . . . -C

(Ul - Hydroxyfettsäuren)

COOH

COOH 2-Oxofettsäuren

Fettsäuren

(Dicarbonsäuren)

Abb. 1 Wege der Alkanoxydation bei Bakterien (Hauptweg durch dicke Pfeile markiert). Beteiligte E n z y m e : ® Alkanmonooxygenase (Alkanhydroxylasc), © Alkoholdehydrogenase, (® Aldcbyddeliydrogenase, ® Alkamm-monooxygenasc, © Esterase, ® Alkandelivdrogeiiase, ® Alkenhydroxylase (idcntiscli mit (J) ?)

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Eine Zusammenstellung der wichtigsten Alkan-Oxydationsprodukle l>oi llaklerien zeigt Tabelle 1. Aus dem Vorkommen dieser Verbindungen wurden schon sehr früh mögliche Abbauwege konstruiert, von denen bislang nur ein Teil wirklich richtig bewiesen werden konnte (Abb. I). Der am weileslcn verbreitete Weg ist derjenige über den primären Alkohol (I-Alkanol) und Aldehyd (Alkanal) zur korrespondierenden Fettsäure. Die dazugehörigen Enzyme wurden insbesondere bei Ps. ¡nitida, Ps. acroginosa und Ar. calcixiccticiis studier! (vgl. Alischni11 .'!). Die siihtcrminale O x y d a t i o n , die hei b e s t i m m t e n Psciidomonas-SUimiiwii über d e n Acetylesler des u m 2 C-Alome ä r m e r e n Alkohols f ü h r t (AIJ.KX et al.. Ii)7l). ergibt sich wahrscheinlich a u s der u n v o l l k o m i n e n e n Spezifität der E n z y m e des ] Imiplweges. Spezifisch f ü r diesen W e g sind m i r die m i t d e m Acetylestcr z u s a m m e n h ä n g e n d e n E n z y m e , d a s eslcrbi Idcnde E n z y m , eine flavinabluingige Monooxygennse, u n d das csterspallcndc E n z y m , eine spezifische Esterase. Beide E n z y m e w u r d e n erst in j ü n g s t e r /eil. v o n MAHKOVKIY. (1978) g e n a u e r charakterisiert. Der W e g ü b e r die Olefinc (,J l-.\lkcnc) hei Ps. aeruginosa (CIIOUTE.VU ei «f., J9G2; A Z O I : I A Y et al., 19C3), d e r e n B i l d u n g viele J a h r e u m s t r i t t e n w a r , k o n n t e d u r c h d e n Nachweis einer A l k a n d e l i y d r o g e n a s e u n d der Alkcnh y d r o x y l i e r i i n g z u m 1-Alkohol durch Tn.vxi.F.ns G r u p p e jetzt definitiv bestätigt werd e n (P.VIIKKII et al., 1977). V o r h e r w a r allerdings schon die B i l d u n g der E p o x i d e a u s d e n D o p p e l b i n d u n g e n durch die H y d r o x y l a s c v o n /'s. putida g e f u n d e n w o r d e n .

In allen Fällen ist die Fettsäure das Endprodukt der primären Oxydalionsschritte. Fettsäuren stellen für die Zellen praktisch physiologische Verbindungen dar. Sic können in die Lipoide der Zelle eingebaut und in ihrer Keltenlänge entsprechend verändert bzw. angepaßt sowie auf dem Wege der /J-Oxydalion der Energiegewinnung oder über das Acetyl-CoA auch der Baustollbiosynlhese zugeführt werden. Sie induzieren in den zentralen Bahnen des Cytoplasnias eine Adaptation an ein hohes Angebot an Acetyl-CoA, z. B. durch Eröffnung der anaplerot¡sehen Sequenz des Glyoxylat-Zyklus (Übersicht bei K L E B E R , 1 9 7 8 ) .

2. Beziehungen zwischen Membrantransport und Oxydation linser Gesichtskreis über die Passage der Alkane durch Zellwand und C.yloplasmamcmbran und ihr Zusammenhang mit den primären Oxydationssehrillen — die Enzyme dafür sind fast ausschließlich membrangebunden (!) — wurde in der letzten Zeit nicht unwesentlich durch morphologische Erkennlnisse erweilert. Insbesondere bei Acinclobaclcr (Übersicht zu dieser Gattung s. Ji;.\t. 1978) bat F I . X X E I I T Y mit seinen Mitarbeitern ( K E N N E D Y et al. 1 9 7 5 ; S C O T T und F I . X . X K U T Y . I 9 7 G ) durch subtile Ullraslruktursludien zeigen können, daß während der HexadeeanAssimilation (im Gegensatz z. B. zur Verwertung von Ilefeextrakl) Alkaneinschlüsse in der Zelle gefunden werden, die offensichtlich Kontakt zur Cytoplasmameinbran besitzen (Abb. 2). Sie sind von einer Monoschiehtmembran umhüllt. Außerdem führt Hexadecan als C-Quelle zu einer Vergröberung der elektronenoptisch darstellbaren Cytoplasmastruktur, wahrscheinlich durch die Bildung einer Vielzahl Alkan-haltiger „Submikropartikeln". In den größeren Einschlüssen (und vielleicht

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Eine Zusammenstellung der wichtigsten Alkan-Oxydationsprodukle l>oi llaklerien zeigt Tabelle 1. Aus dem Vorkommen dieser Verbindungen wurden schon sehr früh mögliche Abbauwege konstruiert, von denen bislang nur ein Teil wirklich richtig bewiesen werden konnte (Abb. I). Der am weileslcn verbreitete Weg ist derjenige über den primären Alkohol (I-Alkanol) und Aldehyd (Alkanal) zur korrespondierenden Fettsäure. Die dazugehörigen Enzyme wurden insbesondere bei Ps. ¡nitida, Ps. acroginosa und Ar. calcixiccticiis studier! (vgl. Alischni11 .'!). Die siihtcrminale O x y d a t i o n , die hei b e s t i m m t e n Psciidomonas-SUimiiwii über d e n Acetylesler des u m 2 C-Alome ä r m e r e n Alkohols f ü h r t (AIJ.KX et al.. Ii)7l). ergibt sich wahrscheinlich a u s der u n v o l l k o m i n e n e n Spezifität der E n z y m e des ] Imiplweges. Spezifisch f ü r diesen W e g sind m i r die m i t d e m Acetylestcr z u s a m m e n h ä n g e n d e n E n z y m e , d a s eslcrbi Idcnde E n z y m , eine flavinabluingige Monooxygennse, u n d das csterspallcndc E n z y m , eine spezifische Esterase. Beide E n z y m e w u r d e n erst in j ü n g s t e r /eil. v o n MAHKOVKIY. (1978) g e n a u e r charakterisiert. Der W e g ü b e r die Olefinc (,J l-.\lkcnc) hei Ps. aeruginosa (CIIOUTE.VU ei «f., J9G2; A Z O I : I A Y et al., 19C3), d e r e n B i l d u n g viele J a h r e u m s t r i t t e n w a r , k o n n t e d u r c h d e n Nachweis einer A l k a n d e l i y d r o g e n a s e u n d der Alkcnh y d r o x y l i e r i i n g z u m 1-Alkohol durch Tn.vxi.F.ns G r u p p e jetzt definitiv bestätigt werd e n (P.VIIKKII et al., 1977). V o r h e r w a r allerdings schon die B i l d u n g der E p o x i d e a u s d e n D o p p e l b i n d u n g e n durch die H y d r o x y l a s c v o n /'s. putida g e f u n d e n w o r d e n .

In allen Fällen ist die Fettsäure das Endprodukt der primären Oxydalionsschritte. Fettsäuren stellen für die Zellen praktisch physiologische Verbindungen dar. Sic können in die Lipoide der Zelle eingebaut und in ihrer Keltenlänge entsprechend verändert bzw. angepaßt sowie auf dem Wege der /J-Oxydalion der Energiegewinnung oder über das Acetyl-CoA auch der Baustollbiosynlhese zugeführt werden. Sie induzieren in den zentralen Bahnen des Cytoplasnias eine Adaptation an ein hohes Angebot an Acetyl-CoA, z. B. durch Eröffnung der anaplerot¡sehen Sequenz des Glyoxylat-Zyklus (Übersicht bei K L E B E R , 1 9 7 8 ) .

2. Beziehungen zwischen Membrantransport und Oxydation linser Gesichtskreis über die Passage der Alkane durch Zellwand und C.yloplasmamcmbran und ihr Zusammenhang mit den primären Oxydationssehrillen — die Enzyme dafür sind fast ausschließlich membrangebunden (!) — wurde in der letzten Zeit nicht unwesentlich durch morphologische Erkennlnisse erweilert. Insbesondere bei Acinclobaclcr (Übersicht zu dieser Gattung s. Ji;.\t. 1978) bat F I . X X E I I T Y mit seinen Mitarbeitern ( K E N N E D Y et al. 1 9 7 5 ; S C O T T und F I . X . X K U T Y . I 9 7 G ) durch subtile Ullraslruktursludien zeigen können, daß während der HexadeeanAssimilation (im Gegensatz z. B. zur Verwertung von Ilefeextrakl) Alkaneinschlüsse in der Zelle gefunden werden, die offensichtlich Kontakt zur Cytoplasmameinbran besitzen (Abb. 2). Sie sind von einer Monoschiehtmembran umhüllt. Außerdem führt Hexadecan als C-Quelle zu einer Vergröberung der elektronenoptisch darstellbaren Cytoplasmastruktur, wahrscheinlich durch die Bildung einer Vielzahl Alkan-haltiger „Submikropartikeln". In den größeren Einschlüssen (und vielleicht

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Abb. 2 a Dünnschnilte von Acinetobacter, gewachsen auf Ilefeextrakt ((£)) bzw. Ilexadecan ( ® — (J) nacli pur Ii eller Lyse). Die Wiedergabe der Bilder erfolgt mit freundlicher Genehmigung von Prof. FIN-XEUTY (aus S C O T T und F I X X E H T Y , 1 9 7 G ) . H = Hcxadecaneinschlüsse R = Ribosomen, N = Nuklearsubstanz, PG = Peplidoglykan (Murein), CM = Cyloplasmamembran, OM = äußere Membran, IM = intracyloplasmalische Membran, LM = limitierende Membran um die Hexadecaneinsclilüsse, die Länge der starken Striche entspricht 0,2 [im (in (1) 0,5 fim)

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Abi). 2 b Gefrierätzungen von Acinetobacter nach Wachstum auf Ilefeextrakt (@)bzw. Hexadccan (@) sowie eines Ilexadecan-Partikelchens aus einer Dispersion in 30% Glycerol ((D). Die Wiedergabe der Bilder erfolgt mit freundlicher Genehmigung von Prof. F I N W KIITY ( a u s S C O T T u n d F I . W N E I U T ,

1976).

Abkürzungen s. Abb. 2 a; die Länge der starken Striche entspricht 0,5 Jim (in © 1,0 jj,m)

aucli in (lcn Submikropartikeln) finden sich allerdings nicht nur Alkane, sondern auch Alkanolc und W a c h s c s l c r (SCOTT und FIXNEHTV, 1 9 7 6 ) . Darüber hinaus v e r m ö gen Alkanc die Bildung von intrazellulären M e m b r a n e n (ähnlich den Mesosomen) zu induzieren (KENNEDY und FI.NNEIITY, 1 9 7 5 ; Aunicu et al.,

1977).

Nicht uninteressant sind auch die dabei gewonnenen Befunde über Veränderungen der chemischen Zusammensetzung der Cyloplasmaniembranen (Scorr et al., 197C). Während der ncxadecan-Assimilation steigen in den Membranen die Anteile der neutralen Lipide an — vor allem Alkane und Alkanolc (vielleicht in Form eines stationären Zustandes der Transport- und Oxydationsprozesse). Alkanc lassen sich in Membranen von Hefccxtrakt-gewachscncn Zellen nicht nachweisen. Die Verhältnisse der Phospholipoide untereinander (bei Acinelobacler sind dies vor allem Phosphatidyläthanolainiii, Phosphatidylglycerol und Cardiolipin) werden durch die Alkane nicht bceiiillul.it, möglicherweise jedoch in ihren Kettcnlängcn und im Sättigungsgrad der enthaltenen Fettsäuren, um die Konstanz der Fluidität der Membranen zu erhalten. I m Kulturmedium finden sieh im wesentlichen 3 unterschiedliche Zustandsformen der Kohlenwasserstoffe

(Abb. 3). Neben größeren

Partikeln

oder

Tropfen

(abhängig v o m Schmelzpunkt des verwendeten Alkans) und Spuren an kolloidaldispers gelösten Molekeln (abhängig von der Kellenlänge des Alkans) finden sich auch die Submikropartikeln

(mit mizellarer Struktur), deren Anteil im Verlaufe

der Assimilation ständig steigt. Die Ursache dafür liegt in der Sekretion von Stof-

Zellhülle

Protein-adsonbierte Molekel Abb. 3 Scheinalischc Darstellung möglicher Zuslandsformen von Alkanen im Kulturmedium und in der Zelle. Die verwendeten Dimensionen entsprechen nicht der Wirklichkeit (die Tropfen oder Partikel im Kulturmedium sind im Verhältnis zur Zellgröße beispielsweise etwa lOOfach verkleinert!)

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fcn, die als Detcrgenticn wirken (freie Fellsäuren, Glycolipoide, Peplidolipoide, Lipoproteide) (Ubersicht bei EIUCKSON und NAKAIIABA, 1975). Darüber hinaus finden sich die Bakterienzellen während der Assimilation von Alkuncn zunehmend an der Oberfläche der Partikeln bzw. Tropfen. Diese Konlaklc werden vor allem durch Lipoproteide aus den Oberflächenstrukturen der Zellen vermittelt, deren Bildung während der Kohlenwasserstoff-Assimilation zum Teil erst induziert wird und auch zu einer steigenden Hydrophobierung der Zelloberfläche führt. Uber den eigentlichen Transportmechanismus sind unsere Kenntnisse noch lückenhaft. Er könnte während des Kontaktes der Zelle mit dem Tropfen vor sich gehen, aber auch als Sorption ganzer Submikropartikeln oder in Form einer molekularen Aufnahme (vielleicht mit Hilfe eines Carriers) geschehen (ERICKSOX und NAKAIIARA, 1975). Man weiß, daß sich zuerst ein rasches Gleichgewicht der Alkane zwischen Medium, Zellwand (äußere Membran) und Cytoplasniamernbran einstellt. Die strukturelle Organisation der Alkane in den Membranen ist nicht bekannt. Da auch ein Transport gegen den Konzentrationsgradienten möglich ist, wurde eine Energieabhängigkeit angenommen (FINNEHTY, 1978). ü b e r die Wege zu den lokalen Akkumulationen in der Zelle (Alkaneinschlüsse) gibt es nur Hypothesen, meist werden sie als rein physikalische Phasenlrennung — verbunden mit aktiver metaboler Kompartmentierung — interpretiert. Zusätzlich muß man allerdings in der Zelle mit nicht unbeträchtlichen Anteilen von Kohlenwasserstoffen rechnen, die an Zellproteine (speziell an deren hydrophobe Oberflächenregionen) adsorbiert sind und mit den kolloidal-dispers gelösten Molekeln im Gleichgewicht stehen (Abb. 3). Unter Einbeziehung der Membranbindung der beteiligten Enzyme zur primären Oxydation kann aus all diesen Befunden abgeleitet werden, daß eine primäre Oxydation der Alkane bereits während ihres Transports — gleichsam in den Zellhüllen — möglich ist, vielleicht durch Entnahme der Alkane aus der Membranlipidphase (Oberfläehen-Oxydalions-Modell). In der Membran selbst finden sich dann — als Ausdruck stationärer Zustände — auch Alkohole, weniger dagegen Fellsäuren (Aldehyde praktisch nicht). Allerdings muß dazu ergänzt bzw. eingeschränkt werden, daß auch eine Oxydation der Alkane aus dem Cytoplasma heraus möglich ist, was z. B. die endogene Vcratmung der Alkane nach Entfernung der Nährbodcnkohlenwasserstoffe beweist. Während der endogenen Vcratmung kommt es bereits teilweise wieder zum Abbau der vorher durch die Alkane induzierten Enzyme (Auiucu und EIT.VEB, 1973 und 1977); AsPEnoEn und Aunicrt, 1977), so daß man annehmen muß, daß die Kohlenwasserstoffe als Induktoren ofTensichllich nur von außen (oder während des Transports) wirken können (vgl. auch Abschnitt 4).

3. Die Enzyme des Hauptweges der primären Oxydation Die Umwandlung des Alkans zur Fettsäure verläuft auf dem Ilauptweg der primären Oxydation in drei Schritten (Abb. A ) . Die dazugehörigen Enzyme sollen im folgenden kurz charakterisiert werden. 10

fcn, die als Detcrgenticn wirken (freie Fellsäuren, Glycolipoide, Peplidolipoide, Lipoproteide) (Ubersicht bei EIUCKSON und NAKAIIABA, 1975). Darüber hinaus finden sich die Bakterienzellen während der Assimilation von Alkuncn zunehmend an der Oberfläche der Partikeln bzw. Tropfen. Diese Konlaklc werden vor allem durch Lipoproteide aus den Oberflächenstrukturen der Zellen vermittelt, deren Bildung während der Kohlenwasserstoff-Assimilation zum Teil erst induziert wird und auch zu einer steigenden Hydrophobierung der Zelloberfläche führt. Uber den eigentlichen Transportmechanismus sind unsere Kenntnisse noch lückenhaft. Er könnte während des Kontaktes der Zelle mit dem Tropfen vor sich gehen, aber auch als Sorption ganzer Submikropartikeln oder in Form einer molekularen Aufnahme (vielleicht mit Hilfe eines Carriers) geschehen (ERICKSOX und NAKAIIARA, 1975). Man weiß, daß sich zuerst ein rasches Gleichgewicht der Alkane zwischen Medium, Zellwand (äußere Membran) und Cytoplasniamernbran einstellt. Die strukturelle Organisation der Alkane in den Membranen ist nicht bekannt. Da auch ein Transport gegen den Konzentrationsgradienten möglich ist, wurde eine Energieabhängigkeit angenommen (FINNEHTY, 1978). ü b e r die Wege zu den lokalen Akkumulationen in der Zelle (Alkaneinschlüsse) gibt es nur Hypothesen, meist werden sie als rein physikalische Phasenlrennung — verbunden mit aktiver metaboler Kompartmentierung — interpretiert. Zusätzlich muß man allerdings in der Zelle mit nicht unbeträchtlichen Anteilen von Kohlenwasserstoffen rechnen, die an Zellproteine (speziell an deren hydrophobe Oberflächenregionen) adsorbiert sind und mit den kolloidal-dispers gelösten Molekeln im Gleichgewicht stehen (Abb. 3). Unter Einbeziehung der Membranbindung der beteiligten Enzyme zur primären Oxydation kann aus all diesen Befunden abgeleitet werden, daß eine primäre Oxydation der Alkane bereits während ihres Transports — gleichsam in den Zellhüllen — möglich ist, vielleicht durch Entnahme der Alkane aus der Membranlipidphase (Oberfläehen-Oxydalions-Modell). In der Membran selbst finden sich dann — als Ausdruck stationärer Zustände — auch Alkohole, weniger dagegen Fellsäuren (Aldehyde praktisch nicht). Allerdings muß dazu ergänzt bzw. eingeschränkt werden, daß auch eine Oxydation der Alkane aus dem Cytoplasma heraus möglich ist, was z. B. die endogene Vcratmung der Alkane nach Entfernung der Nährbodcnkohlenwasserstoffe beweist. Während der endogenen Vcratmung kommt es bereits teilweise wieder zum Abbau der vorher durch die Alkane induzierten Enzyme (Auiucu und EIT.VEB, 1973 und 1977); AsPEnoEn und Aunicrt, 1977), so daß man annehmen muß, daß die Kohlenwasserstoffe als Induktoren ofTensichllich nur von außen (oder während des Transports) wirken können (vgl. auch Abschnitt 4).

3. Die Enzyme des Hauptweges der primären Oxydation Die Umwandlung des Alkans zur Fettsäure verläuft auf dem Ilauptweg der primären Oxydation in drei Schritten (Abb. A ) . Die dazugehörigen Enzyme sollen im folgenden kurz charakterisiert werden. 10

Al»l>. 4

Ilauptweg und Enzyme der primären Alkanoxydation bei Bakterien

Das

Hydroxylierungssystem

Das Hydroxylierungssystem wurde besonders bei Ps. putida (COON

und Milarb.) 2 und teilweise auch bei Ac. calcoaceticus

sowie bei Ps. aeruginosa NOSE

var.

(AURICH

olcovorans

und Mitarb.)

(van E Y K und BARTELS, .1970) und Ps. denitrificans

(Kusu-

et al., 1967b) studiert. E s besteht aus drei Proteinen: der eigentlichen Hy-

droxylase

(Alkan-l-monooxygenase),

einem kleinmolekularen

Nicht-Hiim-Eisen-

Prolein (NHIP) vom Rubredoxin-Typ und einer Rubredoxinreduktase (Abb. 5). Die Alkan-l-monooxygenase, die auch liingerkettige Fettsäuren 0 > 12 C-Atoine) in co-Stellung hydroxyliert, bildet aus Alkan und molekularem Sauerstoü zuerst ein Hydroperoxid, das erst in einem 2. Teilschritt durch reduziertes Rubredoxin zum Alkohol und zu Wasser reduziert wird. Die Rückreaktion des oxydierten Rubrcdoxins katalysiert die Rubredoxinreduktase,

die die dafür

notwendigen

Elektronen von einem Pyridinnuklcotid entnimmt. Die Alkan-L-monooxygenase ist ein mcmhrangcbundencs Enzym (Molmasse: 2 Mill.) lind enthält mehrere Eiscnatoino

(MCKKN.VA u n d COON, 1 9 7 0 ; BOYE« et

al..

J971).

Pro

Polypeptidkette (Molmasse: 40 800) findet man je ein l'e-Aloin und einen C\stein-Hest sowie 21 Phospholipoidmolekeln (Rui;ni.\i.i:it et al., 1977). Bei anderen Mikronrganismen enthält das Enzym Cytoelirom P 450, z . B . bei Corynebakterien (CAHDIXI und J i i i TSIILK, 1970) und auch bei Candida tropicalis (fj;m:ARI.T et al., 1971). Das Enzym liy2 Der von COON beschriebene und benutzte Ps. olcovoransStamm zeigt nach Angaben von CHAKRABARTY et al. (1973) übereinstimmende Eigenschaften mit Ps. putida (Biotyp A) und wird in der Sammlung von GLXSALUS als Ps. putida PpG6 bezeichnet. In der letzten Auflage von „BERGEY'S Manual of Determinative Bacteriology" (Eds. R. E. BICIIANAX und N.E.GIBBONS, 8. Aufl., 1974; Williams & Wilkins, Baltimore) ist der Coox'sche Stamm als Ps. putida var. olcovorans (im folgenden meist als Ps. putida bezeichnet) angeführt.

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droxyliert außer Alkalien (in 1-, weniger auch in 2-Stellung) und längerkctligcn Fettsäuren auch A i-Alkene, die zu \.2-F.poxyalkaiicu oder zu A l-Alkciwo-oleu worden. Durch diese l'nspezil'uäUen läßt sich auch die diteriiiiiialc Oxydation der Alkaiic, die bei manchen Species in größerem Umfange wirksam ist (KF.STEII und bovin«, ]!)(!.'{), erklären. Das lluhredoxiu gehört zu den löslichen Eiscu-Schwefel-Proleincii (ohne säurelahilen Schwefel) mit Mohnasseii linier 20 000 (Ptrensox und Coox, 19C8; LOIJI: und Coox, 1971; Ai iucn et al., 1976). Die llubrcdoxinreduklasc ist ein endoplasmatisches Flaviuenzyin (Molmasse: 50— 55 000), dessen Cocnzym leicht ahdissoziiert (Kusuxosi: et al., 1907 a ; U LOA und Coo.x, 1972; CLAUS et al., 1978).

Rubredoxin, oxydiert

Rubredoxin, reduziert

Rubredoxinreduktase

NAD(P) +

NAD(P)H Abb. 5

Reaktionsweise des Systems zur Iiydroxylierung von Alkalien (und auch Fett-

säuren in cu-Stellung), wie wir es bei Ps. putida bei Ac. calcoacelicus

Die

var. oleovorans

und wahrscheinlich auch

antreffen

Alkoholdehydrogenase

Von der Alkoholdehydrogenase

(ADH) lassen sich bei Bakterien unter

Aspekt der Alkan-Assimilation zwei T y p e n voneinander unterscheiden:

dem

Pyridin-

nukleotid-ahhängige E n z y m e (im Cytoplasma, Molmassen u m 2 5 0 0 0 0 ) und Akzeptor-abhängige E n z y m e (membrangebunden, Molmasse unbekannt). Beide wan-

12

dein den primären Alkohol (1-Alkanol) in den korrespondierenden Aldehyd (Alkanal) um. Das entweder NAD- (z.B. bei Ps. aeruginosa; Azour-AY und IIEYDEMAN, 1 9 G 3 ; TASSIN und VAXDECASTEELE, 1 9 7 2 ) oder NADP-abhängige Enzym (z. B. bei Ac. calcoaevlicus; TAUCIIKHT etal., 1 9 7 6 , aber auch bei Ps. aeruginosa; TASSI.N und VANDECASTEELE, 1 9 7 2 ) des 1. Typs entspricht in seinen Eigenschaften — mit gewissen Einschränkungen — der AD II aus Bückcrhcfe.

Der 2. ADII-Typ wurde in Verbindung mit der Alkan-Assimilation bislang bei Ps. putida, bei Ps. aeruginosa und bei Ac. calcoaceticus nachgewiesen (Übersicht bei T A L T I I E R T et al., 1978a). Diese ADH gehört in der Regel zu den Flavinenzymen und ist in den Membranen mit einer Elektronentransportkette gekoppelt. Der primäre natürliche Elektronenakzeptor ist dabei offensichtlich ein Cylochrom (Cyt. c'.'), die terminale Oxydase sowohl bei Ac. calcoaceticus als auch bei Ps. putida wahrscheinlich Cytochrom o (PETERSON-, 1970; A S P E R C E R et al., 1978). In vitro vermag das Enzym die Elektronen auch auf künstliche Akzeptoren (z. B. Diclilorphenol-indophenol) zu übertragen. Sowohl bei Ac. calcoaceticus als auch bei Ps. putida und Ps. aeruginosa kommen beide ADH-Typen nebeneinander vor. Mit der Alkan-Assimilation hängt aber offensichtlich nur das membrangebundene Kicktronentransport-gekoppelte Enzym vom 2. Typ unmittelbar zusammen ('TAUCUICM et al., 1978b). Die Subslratspe/.ifilät der Alkoholhydrogenasen ist im allgemeinen gering. Außer 1-Alkanolcn werden auch 2-Alkanole (in 2-ALkanone), Alkan-l,co-diolc (in a>-ll\(!roxyalkanale), Alkan-l,2-(liole (in 2-Hydroxyalkanale) und -Hydroxyfcltsäuren (mit mehr als :I2 C-Atomen; in Dicarbonsäure-halbaldehyde) umgewandelt. Dadurch werden Abbauwege über die Mclhylketone (2-Alkanone) und Wege zu den Dicarbonsäureii möglich und verständlich.

Die

Aldehyddehydrogenase

Von der Aldehyddehydrogenase sind im Zusammenhang mit der Assimilation aliphatischer Kohlenwasserstoffe bei Bakterien bislang nur Pyridinnukleolid-abhängige Enzyme gefunden worden (Ubersicht bei S O R G E R und A U R I C H , 1978a). Sie sind entweder rein NAD-abhängig (z. B. bei Ps. putida) oder rein NAl)P-abhängig (z. B. bei Ac. calcoaceticus), können aber auch teilweise mit beiden Cofaktoren reagieren (z.B. bei Ps. aeruginosa). Die Aldehyddehydrogenase ist dabei sowohl meinbrangebunden (z. B. bei Ac. calcoaceticus) als auch cytoplasmalisch gefunden worden (z. B. bei Ps. putida). Bei Ps. aeruginosa wurden beide Lokalisationen — jeweils durch differente Enzyme — nachgewiesen, wobei allerdings das membrangebundene Enzym mit der Alkanassimilation unmittelbar verknüpft sein soll ( B E R T R A N D et al., 1973). Die Aldehyddehydrogenasen setzten außer aliphatischen auch aromatische Aldehyde um. Sie

zeigen

eine

ausgesprochene

Substralüberschußhenmiung

(SORGEH u n d

ALIUCII,

1978 b). Die Reaktionen laufen in der Regel in Richtung der korrespondierenden Carbonsäure irreversibel ab.

13

Die cpigenetische Regulation der Enzyme des Hauptweges Kinen nicht unwesentlichen Beitrag zum Verständnis der bakteriellen

Varia-

bilität — insbesondere in der Fähigkeit zum Abbau ungewöhnlicher, unphysiologischer Verbindungen — lieferten die angewachsenen Kenntnisse über autonome cxlraolironiosomale genetische Elemente vom T y p der Plasmide. Bei Ps.

putida

ist dies für Kampfer und Aromaten (Naphthalin, Salicylnt u. a.) seil längerem bekannt. Den Untersuchungen der Gruppe um SHAPIRO ist es zu verdanken, daß wir bei Ps. putida

var.

oleovorans

auch die Genorte über den Alkan(Octan)-Abbau

auf einem degradativen Plasmid (OCT-Plasmid; Molmasse: 2 0 Mill.) lokalisieren können (GRUKD et dl., 1 9 7 5 ; BENSON und SIIAPIRO, 1 9 7 5 und 1 9 7 6 ; NIEDER und SIIAPIRO, 1975). Bei Acinetobacter

konnte FINNERTY (1978) kein Plasmid (im Mol-

massenbereich zwischen 0,5 und 3 0 0 Mill.) finden. Dort liegen die Genorte für die Enzyme der primären Oxydation offensichtlich auf dem Chromosom. Bei Ps. putida finden sich auf dem Plasmid ein Cluster für das hydroxylierende System (alk

ABC)

und ein Cislron (alk 0)

für die Alkoholoxydation. und zwar

für die membrangebundene, Akzeptor-gekoppelte Alkoholdehydrogenase (Abb. 6). Dazu wurden zwei regulative Cistrons (alk R und alli D) lokalisiert (SIIAPIRO, 1978). Die «i/>-(Östrons A, B und C sind dabei offensichtlich zu einem Rcgulon zusammengefaßt (KK.NWEWAI.D und SIIAPIRO, 1977). Der Aldehyddehydrogenasc-Locus {ald B ) , aber auch der Locus für die cyloplasinalischc. Pyridinnukleotid-abhäugige Alkoholdehydrogenase (alc B) liegen auf dem Chromosom. Während die cytoplasmatische Alkoholdehydrogenase, die zwar auch längerketlige Alkanolc zu oxydieren vermag, als konstitutives Enzym direkt OCT-Ploemid olkA

j

olk B

j

alkC

^

hydroxyllerendes System

^

alk 0

^

Acceptor-abhängige.-. ADH

Chromosom prp

alc A

+4 Propionat- Alkohol+

ungeradz. Alkane

Assimilation

ald A Aldehyd -

AlkoholAldehydpermease ? 1

alcB

ald B

++

NAO-abh. Aldehydde- FettsäureAoetatAOH hydrogenase Assimilation + geradzahlige Alkane

Abb. C Genortc für die Enzyme zur primären Alkanoxydation bei Ps. putida sowohl auf dem degradativen OCT-Plasmid als auch auf dem Chromosom (umgezeichnet nach Angabe» von GUUND et al., 1975)

14

mil der Alkan-Assimilation nicht gekoppelt ist (aber cine Substituíionsfunktion bei all; 0"-MuianU'II ausüben kann; BENSON und Su.u'iuo. 1976). werden die A l k a n - I monooxygenase und mit ihr offensichtlich sequentiell koordiniert auch die mernhrangohundene Alkoholdehydrogenase durch Induktion und Repression epigenelisch reguliert (Tab. 2). Die eigentlichen Induktoren sollen die Alkane selbst sein, deren Wirkung von der Fluiditiit der Membran abhängt. Die Induktorerkennung isl an die Intaktheit der Zellhüllen gebunden und erfolgt offenbar bereits während des Transports (SIIAPIRO, 1978). Auch die chromosomal codierlc Aldehyddehydro-

genase ist induzierbar. Induktoren dafür sind aber — ohne direkte Kopplung mit dem Alkan — offenbar die Aldehyde selbst ( A U R I C H und E I T N E R , 1977: SoucEn und Armen. 1978a). Tabelle 2 Fpigciietisehe Regulation der Enzyme für die primäre Alkanoxydation in einigen Baklorien-Species Zusammengestellt nach Angaben von

C.vnDiM

TELS ( 1 9 6 8 ) , I!I:\SON u n d SIIAPIRO ( 1 9 7 5 ) Ü b e r s i c h t e n v o n TAUCIIERT et al.

und JunTsiiuK ( 1 9 7 0 ) , van E T K und B A R -

u n d FE.VXEWALD u n d SIIAPIRO ( 1 9 7 7 )

sowie

den

( 1 9 7 8 a ) u n d SORCER u n d A u m c i i ( 1 9 7 8 a )

AlkanAlkoholmonooxygenase dehydrogenase X AD UnAkzept.abhängig abhängig

Aldehyddehydrogenase

l'x. pntidn wir. oleovorans

induz.

konstit.

induz.

induz.

Ps. aeruginosa

induz.

konstit.

induz.

induz.

konstit.

induz.

induz.

Corunebaetcrium Acinetobacter

sp. ealeoacelic.

induz. induz.

Die Biosynthese der Enzyme für die primäre Alkanoxydation kann auch — Species-spezifisch — reprimiert werden. Als Repressoren sind Fettsäuren (einschließlich Azetat) und Säuren des Citrat-Zyklus (vor allem Succinat) sowohl bei Pseudomonas als auch bei Acinetobacter bekannt ( D A L I I O F F und R E I I M , 1 9 7 5 und 1 9 7 6 ; A Ü I U C I I und E I T N E I I , 1 9 7 7 ) . Auch eine Art Katabolitrepression ist bei Ps. aeruginosa beschrieben ( D A L I I O F F und R E H M , 1 9 7 6 ) . Für Ps. putida kann das alk A, B, CRegulon bereits durch Alkanole reprimiert werden ( C I I A K R A B A R T Y et al., 1 9 7 3 ) , die beispielsweise bei Ps. aeruginosa noch als Induktoren des hydroxylierenden Systems fungieren. Iis war bereits darauf hingewiesen worden, daß mit der Alkali-Assimilation die zentralen Bahnen epigenetisch in dem Sinrve verändert werden, als ob ein hohes Angebot an Fettsäuren einschließlich Acetat vorläge (KLEUEII. 1978), z . B . durch Induktion der Enzyme des Glyoxylat-Zyklus, vor allem der Isocitratlyase (KLEUEII und AUKICII, 1973). Gleichzeitig damit wird auch noch die Biosynthese anderer Enzyme zentraler Bahnen bei der Alkan-Assimilalion verändert, z. B. bei Ac. calcoaccticus die Malatdeliydrogenasc induziert und das Malalcnzym reprimiert (Ubersicht bei KLEBER, 1978.

15

5 . Die E n z y m e des Ilauptweges und ihre hydrophoben Wechselwirkungen mit Membranen und Substraten Der größte Teil der Enzyme zur primären Oxydation der Alkane liegt membrangebunden vor. Einige von ihnen wurden in der Vergangenheit isoliert und gereinigt, z. B. die Alkan-l-monooxygenase aus Ps. putida, von der eine Subeinhcit (Polypeptidkette) mit 2:1 Phospholipoidmolekeln verbunden ist und nur so ihre Aktivität auch in vitro erhält ( R U E T T I X G E R et al., 1977). In der Regel werden bei der Isolierung zuerst die hydrophoben Verankerungen der Enzyme in der Membran durch anionische oder nicht-ionische Detergentien gelöst, wodurch die Enzyme solubilisiert werden. Weder die kinetischen noch die thermodynaniischen Parameter der Enzym-Substrat-Wechselwirkungen ändern sich dabei ( S O U G K K und A U I U C I I , 1978b; S O R G E H et al., 1978). Die Detergentien an den Enzymen können nachträglich durch Phospholipoide wieder substituiert werden. Wir haben bei Ac. calcoacelicus durch vorsichtigen Aufschluß der Zellen und durch ein Schema fraktionierter Zentrifugationen zuerst Zellhüllen gewonnen, die — morphologisch zwar nicht homogen — aber völlig frei von Cytoplasmabcslandteilcn waren (Armen et al., 1977). Von diesen Zellhüllcn ausgehend, gelingt dann leicht eine Solubilisierung z. B. der Aldehyddehydrogcnase mit Detergentien (SoiiG E R und A U I U C I I , 1978b), aber auch mit proteolytischen Enzymen. Die proteolytischen Enzyme trennen die eigentliche Aldehyddehydrogenase mit den aktiven Zentren von ihrer hydrophoben Membranverankerung. Dadurch ist das Enzym löslich geworden und auch ohne Phospholipoidmolekeln aktiv. Außer diesen hydrophoben Peptiden, die der Verankerung solcher Enzyme in der Membran dienen und Wechselwirkungen zwischen Protein- und Phospholipoidleil der Membran ermöglichen, haben die alkanoxydierenden Enzyme alle hydrophobe Domänen an den oder in unmittelbarer Nähe der aktiven Zentren, die der Bindung der hydrophoben Substrate dienen. Solche hydrophoben Regionen sind nicht von der Membranbindung abhängig und werden auch bei anderen Enzymen gefunden, die in der Lage sind, hydrophobe Substrate umzusetzen. Dazu gehört u. a. auch die Alkoholdehydrogcnase aus Bäckerhefe ( S C I I Ö I T und Aunicu, 1973), die wir für solche Studien deshalb vielfach als Modellenzym benutzten. Eine allgemeine Eigenschaft der Enzyme mit hydrophoben Substratbindungsstellen ist die Fähigkeit zum Umsatz von Substraten homologer Reihen (übersieht bei S C H O P P et al., 1976). Dabei sinken mit steigender Kettenlänge die K J I Werte stetig ab (bis etwa zu Kettenlängen zwischen Cio und C12)) d. h. bis in diesen Bereich wird die Bindung des Substrates an das Enzym ständig fester. Als Beispiel ist dies für die Aldehyddehydrogenase aus Ac. calcoaceticus in Abbildung 7 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, daß hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Substrat und Enzym für die Substratbindung entscheidend sind. Eine weitere Erhöhung der Intensität der Substratbindung bei höheren Kettenlängen ist durch Ausdehnungsbegrenzung der hydrophoben Region oder durch begrenzte Raumforderung der Substrate (z. B. durch Knäuelung der Kohlenwasserstoifketten) nicht 16

möglich (Scnfti'i» und Armen. 197.1). Da die Bindnngsinlensiläl der Cofakloren (z. 1!. der Pyridinnukleotide) durch die Kcllenlänge der Subslrale nichl verändert wird (Abb. 7), kann es zur Umkehr der Bindungsfolgc von Cofaklor und Substrat und damit auch zu Veränderungen des Keaktionsniechanismus dieser Enzyme kommen ( S C H Ö P F und Auiucii, 1.976; S O R C E R und Armen, 1.978a und b). Von besonderem Interesse war nun für uns die Frage, auf welche Weise die Enzyme in vitro mit ihren hydrophoben Subslralen reagieren. Wir hallen zuerst ausschließlich mit wässrigen (molekular-dispersen) Lösungen der Subslrale gearbeitet und /.eigen können, daß die Enzyme ihre Substrate aus der wässrigen Phase entnehmen und sie in die hydrophobe Proteinphase überführen (Sciiöi-i' und Armen, 1973). Aus dem Abfall der KJJ-Werlo in homologen Reihen ergaben sich Änderungen der freien Enthalpien (um etwa 5 8 0 kcal/Mol Melhylengruppe), die unler Berücksichtigung der Änderungen der Molrefraktionen für eine — gleichsam iherniodynainisch favorisierte — Überführung der Alkanderivale aus der wässrigen in die hydrophobe l'hase des Proleins sprechen.

C-Atome Abb. 7 Abhängigkeit der „limitierenden" Kji'Werte (als pKji angegeben) clor Aldehyddeliydrogenase aus Ac. calcoaceticus für die Alkanalc in homologer Reihe (Kreise) und für NADP (Dreiecke). Die leeren Zeichen gelten für Ergebnisse mit inlakten Membranen, die schwarzen für das desoxycholalsolubilisierle Enzym (nach Sonciin und Aumcu, 1978 b) Da aber auch beim Übergang von der Lösung zur Dispersion die katalylisclicn Konstanten noch weiter ansteigen und der Nachlösevorgang viel zu langsam isl, um dies zu erklären, prüften wir auch den enzymatisehen Umsatz an den (IrenzIlächen von Suhslratpartikeln und Wasser. Die nach

LIXKWKAVER

und

Ü I IIK

trans17

formierten F u n k t i o n e n zeigten dabei n u r L i n c u r i l ä l (Abb. 8 ) . wenn fiir die Substratk o n z c n t r a l i o n die Oberflächenkonzentralion der P a r t i k e l n eingesetzt wurde (Hotiii: et iil..

I!)7(i). Dies deutele bereits auf eine R e a k t i o n der E n z y m e an der ( ¡ r e n z -

fläche bin. F ü r die Alkoholdehydrogenase stellten wir dazu

Tctradecaiiol-Kugeln

her. deren O b c r l l ä c l i e n k o n z c n t r a l i o n sich a n n ä h e r n d berechnen läßt.

12

10

-/

J 1

I 10

1 20

1 30

Ahl». 8 Beziehungen zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit v (in (tinol/min) und der Tctradecanol-Konzcntration [C|pliys. Bes. Conimun. 42, 4 1 3 - 4 1 9 . van der LIKDEK, A. C. and G. J . E. TIIIJSSE (1965): The mechanism of microbial oxidations of petroleum hydrocarbons. Adv. Enzymol. 27, 469—546. L.oi)I:, E. T. and M. J . COON (1971): Enzymatic co-oxidation. V. J . biol. Chemistry 246, 791-803. MARKOVETZ, A. J . (1978): Vortr. Int. Kongr. Mikrobiol., München MCKKXXA, E. J . and M. J . Coox (1970): Enzymatic co-oxidation. IV. J . biol. Chemistry 245, 3 8 8 2 - 3 8 8 9 . MCKENNA, E. J . and R. E . KAI.I.IO (1965): The biology of hydrocarbons. Annu. Microbiol. 19, 1 8 3 - 2 0 8 .

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