Abrégé de biochimie appliquée: Nouvelle édition 9782759819089

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE Nouvelle édition

Grenoble Sciences Grenoble Sciences est un centre de conseil, expertise et labellisation de l’enseignement supérieur français. Il expertise les projets scientifiques des auteurs dans une démarche à plusieurs niveaux (référés anonymes, comité de lecture interactif) qui permet la labellisation des meilleurs projets après leur optimisation. Les ouvrages labellisés dans une collection de Grenoble Sciences ou portant la mention Sélectionné par Grenoble Sciences (Selected by Grenoble Sciences) correspondent à : X des projets clairement définis sans contrainte de mode ou de programme, X des qualités scientifiques et pédagogiques certifiées par le mode de sélection (référés anonymes puis comité de lecture interactif dont les membres sont cités au début de l’ouvrage, X une qualité de réalisation assurée par le centre technique de Grenoble Sciences. Directeur scientifique de Grenoble Sciences Jean BORNAREL, professeur émérite à l’Université Joseph Fourier, Grenoble 1 Pour mieux connaître Grenoble Sciences : https://grenoble-sciences.ujf-grenoble.fr Pour contacter Grenoble Sciences : Tél : (33) 4 76 51 46 95, e-mail : [email protected] Livres et pap-ebooks Grenoble Sciences labellise des livres papier (en langue française et en langue anglaise) mais également des ouvrages utilisant d’autres supports. Dans ce contexte, situons le concept de pap-ebook. Celui-ci se compose de deux éléments :  un livre papier qui demeure l’objet central avec toutes les qualités que l’on connaît au livre papier,  un site web compagnon qui propose : › des éléments permettant de combler les lacunes du lecteur qui ne possèderait pas les prérequis nécessaires à une utilisation optimale de l’ouvrage, › des exercices pour s’entraîner, › des compléments pour approfondir un thème, trouver des liens sur internet… Le livre du pap-ebook est autosuffisant et certains lecteurs n’utiliseront pas le site web compagnon. D’autres l’utiliseront et ce, chacun à sa manière. Un livre qui fait partie d’un pap-ebook porte en première de couverture un logo caractéristique et le lecteur trouvera le site compagnon du présent livre à l’adresse internet suivante : https://grenoble-sciences.ujf-grenoble.fr/pap-ebooks/abrege-marouf-tremblin Grenoble Sciences bénéficie du soutien du Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et de la Région Rhône-Alpes. Grenoble Sciences est rattaché à l’Université Joseph Fourier de Grenoble. ISBN 978-2-7598-1776-5 © EDP Sciences, 2015

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE Nouvelle édition

Abderrazak MAROUF Gérard TREMBLIN

17, avenue du Hoggar Parc d’Activité de Courtabœuf - BP 112 91944 Les Ulis Cedex A - France

Abrégé de biochimie appliquée - nouvelle édition Cet ouvrage, labellisé par Grenoble Sciences, est un des titres du secteur Sciences de la Vie de la Collection Grenoble Sciences d’EDP Sciences, qui regroupe des projets originaux et de qualité. Cette collection est dirigée par Jean BORNAREL, professeur émérite à l’Université Joseph Fourier, Grenoble 1.

Comité de lecture :  Antoine DELON, Professeur à l’Université Joseph Fourier, Grenoble 1  Guy HERVÉ, Directeur de recherche émérite au CNRS, Paris  Françoise MOREL, Professeur à la faculté de médecine de l’Université Joseph Fourier, Grenoble 1  Philippe NORMAND, Directeur de recherche au CNRS, Lyon  Jean PELMONT, Professeur honoraire à l’Université Joseph Fourier, Grenoble 1  Paulette VIGNAIS, Directeur de recherche honoraire au CNRS, Grenoble Cet ouvrage a été suivi par Laura CAPOLO pour la partie scientifique et par Sylvie BORDAGE & Anne-Laure PASSAVANT du centre technique Grenoble Sciences pour sa réalisation pratique (figures et mise en page de la 1re édition : Ariane MANDRAY et Valérie SZCZUPAL). L’illustration de couverture est l’œuvre d’Alice GIRAUD, d’après des éléments fournis par les auteurs.

Autres ouvrages labellisés sur des thèmes proches (chez le même éditeur) Glossaire de biochimie environnementale (J. Pelmont)
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biologistes et des biochimistes (A. Marouf & G. Tremblin)
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Competence in Scientific English (J. Upjonh et al.) Et d’autres titres sur le site internet : https://grenoble-sciences.ujf-grenoble.fr

PRÉFACE DE LA PREMIÈRE ÉDITION Une biochimie appliquée a existé sur un mode empirique depuis la nuit des temps, car il s’agissait de conserver des ressources alimentaires sous forme fermentée, ou encore de tirer de la nature des substances jugées utiles : médicaments, drogues diverses, fibres et matières colorantes. Dans un passé plus récent, la nécessité d’améliorer les procédés et leurs applications n’a fait que stimuler le développement de la chimie biologique moderne. Il est intéressant par exemple de constater que les premières connaissances sur le métabolisme cellulaire ont profité des efforts pour mieux connaître la fermentation de la levure au cours de la fabrication de la bière. Il s’est établi en moins de deux siècles un immense va-et-vient entre les analyses à caractère fondamental et les recherches appliquées, les unes profitant des autres. Les connaissances sur le fonctionnement des êtres vivants se sont accrues à un rythme exponentiel. Elles ont tiré profit du perfectionnement des méthodes d’extraction, d’analyse et de purification des produits naturels, jusqu’à l’explosion actuelle de la biologie moléculaire et de la génomique. On assiste parallèlement à une vaste diversification des procédés qui concerne l’agriculture, la médecine, la science des matériaux et de façon générale tous les secteurs d’activité intéressés par les ressources du monde vivant. Les avancées des connaissances en biochimie fondamentale ont inspiré la découverte de nouveaux procédés dont beaucoup participent à l’essor économique. Inversement les laboratoires bénéficient souvent des subsides de l’industrie. À cela s’ajoute l’apport essentiel des méthodes physiques et d’une instrumentation perfectionnée : cristallographie, résonance magnétique nucléaire et spectroscopies variées pour n’en évoquer que quelques-unes. -PVWSBHF
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plusieurs grands secteurs de la biochimie appliquée. L’expérience des auteurs dans le domaine scientifique et ses applications leur a permis de rassembler de très nombreux exemples de procédés, dont certains ont une importance capitale dans l’industrie ou dans le secteur biomédical. L’objectif était vaste et a nécessité un travail considérable. On trouvera ici une grande quantité de points de repère, et pourquoi pas, des idées de travail. Il intéressera étudiants, chercheurs, techniciens et ingénieurs dans divers secteurs de recherche où les acteurs sont de plus en plus spécialisés et ont parfois du mal à se projeter au-dehors de leur sphère étroite. J’ai eu plaisir à m’instruire en parcourant cet ouvrage, il en sera sans doute de même pour tous les lecteurs intéressés par le secteur appliqué, et je ne peux que conseiller de le découvrir.

Jean PELMONT

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AVANT-PROPOS Ce livre de biochimie appliquée est une réédition revue et augmentée du précédent ouvrage paru en 2009, mais cette fois il est associé à un site WEB dédié. Comme le précédent, il doit : Z permettre au lecteur d’acquérir les connaissances les plus récentes sur les substances et les molécules naturelles exploitées par l’homme ; Z faire le lien entre la biochimie des substances naturelles et leurs applications dans des domaines variés comme l’agriculture, l’environnement, la production d’énergie, l’alimentation animale et humaine, la santé et de nombreux autres domaines plus proches du monde industriel (papeterie, cosmétique, agro-alimentaire, pharmacie, chimie…). L’ouvrage est maintenant divisé en 6 parties et en 19 chapitres. Trois nouveaux chapitres ont été ajoutés : le premier, portant sur la gélatine (chap.  12), complète la partie  III sur les substances d’origine animale, le deuxième, sur les polymères microbiens (chap. 15), abonde la partie IV sur la biochimie des substances d’origine microbienne et le troisième, sur les extrêmozymes (chap. 18), enrichit la partie V sur les applications de l’enzymologie. Le chapitre 8, sur les métabolites des microalgues et des cyanobactéries, a été complètement revu et mis à jour. D’autres données récentes ont été ajoutées ou actualisées, comme la glycomique dans le chapitre 1, la séparation et l’identification des lipides dans le chapitre 3, l’hémoglobine en biochimie médicale dans le chapitre 9 et les cultures de cellules animales dans le chapitre 19. X Plus globalement, la première partie est consacrée aux substances issues du règne végétal (plantes terrestres). En effet, les plantes fournissent un nombre considérable de molécules comme les glucides, les protides, les corps gras, les pigments, les arômes et une grande partie des substances actives des médicaments. Celles-ci sont de nature à intéresser toutes sortes d’activités industrielles, pharmaceutique, agro-alimentaire, cosmétique… La pharmacopée traditionnelle a toujours exploité les « vertus » des plantes médicinales, sans toujours en connaître les principes actifs. La plupart de ces biomolécules sont maintenant bien identifiées et, par synthèse chimique, on est arrivé à en faire des « copies », souvent améliorées. Aujourd’hui, les substances naturelles sont privilégiées dans l’optique d’une utilisation raisonnée et durable des produits de la biosphère. Si les trois premiers chapitres traitent classiquement des glucides, des protides et des lipides végétaux, dans les trois chapitres suivants une attention particulière est portée aux huiles essentielles, à la lignine et aux lectines dont les applications sont de plus en plus nombreuses. X La deuxième partie, divisée en deux chapitres traite, d’une part, des polysaccharides des parois des algues et de leurs applications, dominées par le secteur de l’alimentation

VIII

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

et de la santé, et d’autre part, des métabolites issus des microalgues et des cyanobactéries. Les potentialités d’utilisation des végétaux ou des biomolécules qui en sont extraites, purifiées et/ou modifiées par voie enzymatique et chimique, les font « sortir » du domaine agro-alimentaire vers d’autres nouveaux secteurs industriels comme la production de biocarburants. Les méthodes d’étude (procédés d’extraction, techniques de purification, de séparation et de dosage) sont également présentées. X La valorisation des substances d’origine animale est passée en revue dans la troisième partie. Il s’agit notamment des dérivés sanguins, des sous-produits de l’industrie du lait et du fromage (lactosérum), des ovoproduits. X Les produits issus des micro-organismes, représentés principalement par les protéines, les antibiotiques sont abordés dans la quatrième partie. X L’utilisation des enzymes, secteur en plein essor, fait l’objet de la partie suivante. En raison de leurs rôles et de leurs applications technologiques bien caractérisées, les enzymes font l’objet d’études intensives et leurs modalités d’action sont de mieux en mieux connues. Par ailleurs, l’obtention de produits de qualité optimale suppose une bonne maîtrise de l’action de ces enzymes par la connaissance, non seulement de leur fonctionnement, mais aussi de l’influence de certains effecteurs physico-chimiques comme les conditions d’utilisation (température, pH, présence d’interférants…). Des procédés industriels basés totalement ou partiellement sur les enzymes ont été mis au point. Les enzymes sont devenues, de ce fait, des auxiliaires technologiques incontournables. Les répercussions sur les plans économique et environnemental ne sont plus à démontrer. Le génie génétique, le génie enzymatique, le génie métabolique aidant, il est actuellement possible de produire des souches de micro-organismes fabriquant des enzymes capables d’opérer dans les conditions très spécifiques de l’environnement industriel et/ou de synthétiser des métabolites originaux. Dans cette cinquième partie les enzymes immobilisées, leurs différentes applications dans la transformation des matériaux biologiques et leur utilisation de plus en plus fréquente en bio-analyse sont présentées. Les récents progrès dans le domaine des capteurs enzymatiques sont aussi passés en revue de même que leurs utilisations actuelles. X Enfin, en raison de leur exploitation récente dans l’industrie et des perspectives économiques importantes, actuelles et à venir, les cultures de cellules végétales et animales, leurs contraintes et leurs applications sont présentées dans la dernière partie. X Etant donné les développements très rapides et les innovations techniques continues dans le domaine de la biochimie appliquée, les références bibliographiques deviennent rapidement obsolètes. Nous avons d’abord essayé, dans la mesure du possible, d’intégrer les références les plus actuelles et les plus accessibles pour les étudiants, les lecteurs souhaitant trouver plus d’informations pourront consulter une webographie sur le site dédié. X Le glossaire reprenant les définitions des principaux termes et concepts faisant l’objet du livre, largement abondé, reste placé à la fin de l’ouvrage papier pour en faciliter la consultation ; comme précédemment les termes en gras présent dans l’ouvrage sont définis dans ce glossaire. X Un index des termes utilisés et des espèces citées dans le texte complète le livre.

AVANT-PROPOS

IX

Cet ouvrage, caractérisé par un traitement plus conséquent des métabolites du règne végétal, se démarque de la majorité des ouvrages de biochimie disponibles actuellement où très souvent le végétal est un peu le laissé pour compte, avec parfois un petit chapitre sur la photosynthèse et la biochimie spécifique du chloroplaste en négligeant le métabolisme secondaire (très important dans le règne végétal). Pour beaucoup, la biochimie est essentiellement animale, voire humaine, et cet ouvrage devrait leur ouvrir de nouveaux horizons. Ainsi, c’est volontairement que nous mettons en avant la biochimie du végétal et les nombreuses substances qui en sont extraites, pour certaines produites et, dans tous les cas, abondamment et depuis longtemps utilisées par l’homme. Ce travail vient en complément de la biochimie fondamentale traitée dans d’autres ouvrages de la même collection et s’adresse principalement aux étudiants des cursus scientifiques (sciences de la nature et du vivant, écoles d’ingénieurs…), aux étudiants des licences et masters de biologie, de biochimie, de biotechnologie, aux étudiants des IUT et des BTS à orientation biologique et biochimique, aux étudiants des nombreuses et nouvelles licences professionnelles dont une partie de la formation porte sur les applications de la biologie et de la biochimie, enfin aux cadres et aux chercheurs des industries agro-alimentaires et des sciences pharmaceutiques. La formation de ces lecteurs potentiels étant très disparate, nous avons volontairement placé au début de chaque chapitre quelques rappels des données générales de biochimie structurale et/ou métabolique indispensables pour comprendre la suite du document (évitant ainsi au lecteur le recours à un autre ouvrage plus général de biochimie). Toutefois quelques notions de base en biochimie structurale et métabolique sont malgré tout nécessaires, voire indispensables, pour aborder, sans peine, certaines parties de cet ouvrage. Par contre, certains sujets traités sont souvent difficiles d’accès, particulièrement en langue française. De ce fait, nous espérons que cet ouvrage comblera le manque dans ce domaine.

MODE D’EMPLOI Le présent livre est un abrégé. Il est conçu pour diverses utilisations par le lecteur. C’est un ouvrage qu’il faut cette fois consulter en ayant à sa disposition, soit un ordinateur, soit une tablette, voire même un smartphone, connecté à Internet. En effet, les encarts sont maintenant sur le site WEB dédié, mais des renvois sont placés dans le texte pour signaler l’existence de ces compléments d’information. Plusieurs nouveaux encarts correspondant aux différents chapitres ont été placés sur le site dédié : les tanins, l’huile d’olive, une huile aux multiples vertus, l’huile d’argan, les oméga 3, la biotechnologie des microalgues et son développement, les principales caractéristiques des grands groupes taxonomiques de microalgues et de Cyanobactéries, une hémoglobine extraite de vers marins, le sang artificiel, les anticoagulants du futur, le lait maternel, les exopolysaccharides des bactéries lactiques, l’histoire de la gélatine, l’histoire des enzymes, les parfums, les compléments alimentaires. Les encarts précédemment présents dans l’ouvrage ont été transférés sur le site après mise à jour lorsque cela a été nécessaire.

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

Il s’agit de : le pouvoir sucrant, les interdépendances métaboliques dans le diabète, les öCSFT
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Agrobacterium, la stratégie de l’ARN antisens, le marquage radioactif en biochimie, la discrimination isotopique, l’intolérance au lactose, la résistance aux antibiotiques, les puces à ADN. Le lexique français-anglais est lui aussi en ligne ainsi que les annexes portant sur les codes EC des enzymes et les additifs alimentaires cités dans le texte ainsi que sur les principaux groupes caractéristiques rencontrés dans les molécules organiques. Enfin, la section d’autoévaluation pour chacun des chapitres est proposée de façon plus ludique au niveau du site WEB. Un accès aux réponses des questions à réponses ouvertes courtes (QROC) est proposé sous forme de mots ou de phrase clefs et les réponses au 2$.
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MBDRVJTJtion de leurs connaissances afin de mieux préparer leurs évaluations. Comme dans la précédente édition, une lecture au fil du texte permettra d’acquérir une vision générale de la biochimie appliquée. Des rappels de biochimie structurale ou métabolique au début de chaque chapitre définissent les prérequis. Un certain nombre d’éléments sont disponibles en appui pour le lecteur : liste d’abréviations, de symboles et acronymes ; glossaire de définition des principaux termes et concepts ; index de mots et d’espèces ; compléments d’information et annexes supplémentaires sur le site web. Les outils précédents sont proposés pour une consultation ultérieure de l’ouvrage, ponctuelle ou plus structurée. Par exemple, un lecteur concerné par une technique et/ou une application trouvera dans l’Abrégé une première série d’informations qu’il pourra compléter lors de recherches plus poussées dans les ouvrages cités dans la bibliographie ou dans d’autres ouvrages. Si son étude ultérieure utilise le web, la webographie fournie et le lexique anglais-français lui feront gagner un temps précieux. De nombreux appareils ou instruments couramment utilisés dans les laboratoires sont cités dans cet ouvrage; il est possible à chaque fois de trouver un complément d’information dans le précédent ouvrage des mêmes auteurs, dans la même collection, Mémento technique à l’usage des biologistes et des biochimistes.

REMERCIEMENTS Les auteurs remercient vivement les membres du comité d’édition qui, par leurs remarques FU
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Sylvie Bordage (pour cette nouvelle édition) ainsi que Anne-Laure Passavant pour l’élaboration du site web dédié.

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Centre Universitaire d’Ain Temouchent et Abdelkrim Cheriti, professeur de chimie à l’Université de Béchar, pour la relecture de certaines parties de l’ouvrage, ainsi que tous ses collègues biologistes et chimistes de l’Université d’Oran qui ont apporté leur grain de sel à ce travail par leurs critiques ou leurs suggestions. Il tient, enfin, à remercier son épouse dont la patience a été déjà mise à dure épreuve durant l’élaboration de la première édition et qui, loin de fléchir, a su aussi l’encourager et l’aider, par ses sacrifices incessants, tout au long des péripéties de cette deuxième édition. (ÏSBSE
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tout petit et discret (ce qui n’est pas toujours facile). Il tient aussi à remercier son collègue, MF
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de collaborer à cet ouvrage, lui ouvrant ainsi des perspectives d’activités de fin de carrière qu’il n’avait pas envisagées. Cette collaboration a été fructueuse car, en dehors de cette réédition, un ouvrage commun est paru en 2013, Mémento technique à l’usage des biologistes et des biochimistes, et un autre est en préparation. Il tient enfin à remercier son épouse et ses cinq garçons à qui il dédie ce travail bien qu’aucun ne se soit intéressé à la Biologie et à la Biochimie et qui, de ce fait, ne liront pas cet ouvrage.

Les auteurs Aderrazak Marouf - Gérard Tremblin

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SOMMAIRE Abréviations, symboles et acronymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PARTIE I - SUBSTANCES D’ORIGINE VÉGÉTALE

1 PAGES

1 - Les glucides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 - Les protides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 3 - Les lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 4 - Les huiles essentielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 5 - Les lignines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 6 - Les lectines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

PAGES

7 - Les polysaccharides des parois des algues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 8 - Les métabolites des microalgues et des Cyanobactéries. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

PARTIE III - SUBSTANCES D’ORIGINE ANIMALE 9 - Les produits sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 - Les produits laitiers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 - Les ovoproduits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 - La gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PARTIE IV - SUBSTANCES D’ORIGINE MICROBIENNE

PAGES

221 249 261 275 PAGES

13 - Les protéines d’organismes unicellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 14 - Les antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 15 - Les polymères microbiens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

PAGES

16 - Les enzymes en industrie et en médecine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 17 - Les enzymes immobilisées et leurs intérêts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411 18 - Les extrêmozymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

PAGES

19 - Les cellules végétales et les cellules animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 Bibliographie sommaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 Glossaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473 Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 555

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

ABRÉVIATIONS, SYMBOLES ET ACRONYMES aa

acide aminé

ACCase

acétylcoenzyme A carboxylase

ADN

acide désoxyribonucléique

ADP

adénosine diphosphate

AFNOR

Association Française de NORmalisation

AFSSA

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

AG

acide gras

AGE

acide gras essentiel

AGPI

acide gras polyinsaturé

".1


BEÏOPTJOF
NPOPQIPTQIBUF

".1D


BEÏOPTJOF
NPOPQIPTQIBUF
DZDMJRVF

AOAC

Association des chimistes analystes officiels (Association of Official Analytical Chemists)

APCI

ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

ARN

acide ribonucléique

ARNt

acide ribonucléique de transfert

ATCC

American Type Culture Collection

ATP

adénosine triphosphate

#),


DFMMVMFT
EF
SFJOT
EF
CÏCÏ
IBNTUFS
Baby Hamster Kidney)

BSA

albumine sérique bovine ou albumine de sérum bovin (Bovine Serum Albumin)

CAD

alcool cinnamylique déshydrogénase (Cinnamylic Alcohol Dehydrogenase)

CAS

Service des résumés de chimie (Chemical Abstract Service)

$$.


DISPNBUPHSBQIJF
TVS
DPVDIF
NJODF

CCR

cinnamoyl-CoA réductase

CE

Communauté Européenne

2

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

Chl a

chlorophylle a

CHO

cellules d’ovaires de hamster chinois (Chinese Hamster Ovary)

CLHP

chromatographie liquide à haute performance

CoA

coenzyme A

COSY

COrrelation SpectroscopY

CPG

chromatographie en phase gazeuse

CPL

concentrés protéiques de lactosérum

CTAB

bromure de cétyltriméthylammonium (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)

D

dextrogyre

Da

dalton

DEAE

diéthylaminoéthyl

DHA

acide docosahexaénoïque (DocosaHexaenoic Acid)

DP

degré de polymérisation

DTX

dinophysistoxines

EARSS

Réseaux de surveillance européens de la résistance aux antibiotiques (European Antimicrobial Resistance Surveillance System)

EC

électrophorèse capillaire

EFSA

Autorité européenne de sécurité des aliments (European Food Safety Authority)

EGF

facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor)

ELISA

dosage d'immuno-adsorption par enzyme liée (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

&.$


Enzyme Modified Cheeses

&.)7


FTUFS
NÏUIZMJRVF
EIVJMF
WÏHÏUBMF

EPA

acide eicosapentaénoïque (EicosaPentaenoic Acid)

EPS

exopolysaccharides

ESI

ionisation par électronébulisation (ElectroSpray Ionization)

ETA

acide eicosatétraénoïque (EicosaTetraenoic Acid)

ETBE

ethyl-tertio-butyl éther (Ethyl-Tertio-Butyl Ether)

ex

exemple

FAB

bombardement par atomes rapides (Fast Atoms Bombardment)

FAO

Organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organization)

ABRÉVIATIONS, SYMBOLES ET ACRONYMES FDA

Agence sanitaire des aliments et des produits de santé pour les ²tats-Unis (Food and Drug Administration)

FGF

facteur de croissance des fibroblastes (Fibroblast Growth Factor)

fig.

figure

3

($*3.4 chromatographie en phase gazeuse combinée à la spectrométrie de masse à rapport isotopique (Gas Chromatography/Isotope Ratio Mass Spectrometry) (.&



"TTPDJBUJPO
EFT
HÏMBUJOJFST
&VSPQÏFOT
Gelatin Manufacturers of Europe)

Gy

gray

h

heure

HDL

lipoprotéines de haute densité (High Density Lipoprotein)

)&,


DFMMVMFT
FNCSZPOOBJSFT
EF
SFJO
IVNBJO
Human Embryonic Kidney)

HFCS

sirop de maïs à haute teneur en fructose (High Fructose Corn Syrup)

).#$


Heteronuclear Multi-Bond Correlation

).2$


Heteronuclear Multi-Quantum Correlation

HPL

hydrolysat protéique du lactosérum

HPLC

chromatographie liquide à haute performance (High Performance Liquid Chromatography)

HV

hydroxyvalerate

IFN

interféron

Ig

immunoglobuline

INRA

Institut National de Recherche Agronomique

IPL

isolat protéique de lactosérum

IR

spectroscopie infrarouge

IUPAC

Union internationale de chimie pure et appliquée (International Union of Pure and Applied Chemistry)

,d

constante de dissociation

kDa

kilodalton

kJ/g

kilojoule/gramme

, m


DPOTUBOUF
EF
.JDIBFMJT

,0)


IZESPYZEF
EF
QPUBTTJVN

L

litre

α-La

α-lactalbumine

4 -$.4


ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE DISPNBUPHSBQIJF
MJRVJEF
DPVQMÏF
Ë
MB
TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF
(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)

-$.4.4

DISPNBUPHSBQIJF
MJRVJEF
DPVQMÏF
Ë
MB
TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF
FO
UBOEFN
(Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry) LED

diode électroluminescente (Light-Emitting Diode)

Lf

lactoferrine

β-Lg

β-lactoglobuline

λ

lambda

LCR

réaction de ligature en chaîne (Ligase Chain Reaction)

LDL

lipoprotéines de basse densité (Low Density Lipoprotein)

LPS

lipopolysaccharides

.


DPODFOUSBUJPO
NPMBJSF
PV
NPMBSJUÏ
FO
NPM-

."-%*


EÏTPSQUJPOJPOJTBUJPO
QBS
JNQBDU
MBTFS
BTTJTUÏF
QBS
NBUSJDF
(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

.%4


NÏEJDBNFOUT
EÏSJWÏT
EV
TBOH

min

minute

mm

millimètre

..


NBTTF
NPMBJSF
FO
HNPM

μg

microgramme

μm

micromètre

mol/L

mole/litre

NAD

nicotinamide adénine dinucléotide

NADP

nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

NaOH

hydroxyde de sodium

NGF

facteur de croissance des nerfs (Nerve Growth Factor)

nm

nanomètre

NOESY

Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

OCDE

Organisation de Coopération et de Développement Economique

0(.


0SHBOJTNF
(ÏOÏUJRVFNFOU
.PEJöÏ

0.4


0SHBOJTBUJPO
.POEJBMF
EF
MB
4BOUÏ

0.5


O-méthyl transférase

Pa

pascal

ABRÉVIATIONS, SYMBOLES ET ACRONYMES

5

PAL

phénylalanine ammonia-lyase

pb

paire de bases

PC

phosphatidylcholine

PCR

amplification en chaîne par polymérase (Polymerase Chain Reaction)

PCRq

PCR quantitative

PDGF

facteur de croissance dérivé des plaquettes (Plateled-Derivated Growth Factor)

PE

phosphatidyléthanolamine

PEBD

polyéthylène basse densité

PEG

polyéthylène glycol

PHA

polyhydroxyalcanoate

PHB

polyhydroxybutyrate

PHBV

3-polyhydroxybutyrate 3-hydroxy valérate

pHi

pH isoélectrique

PHV

polyhydroxyvalérate

Pi

phosphate inorganique

PI

phosphatidylinositol

pI

point isoionique

PLA

acide polylactique (PolyLactic Acid)

1.


QPJET
NPMÏDVMBJSF

POU

protéines d’organismes unicellulaires

ppm

partie par million

PVC

chlorure de polyvinyle

3./


SÏTPOBODF
NBHOÏUJRVF
OVDMÏBJSF

ROS

dérivés réactifs de l'oxygène ou espèces réactives de l'oxygène (Reactive Oxygene Species)

RuBisCO

Ribulose 1,5 Bisphosphate Carboxylase-Oxygénase

RX

rayons X

s

seconde

S

coefficient de sédimentation en unités Svedberg S (avec S = 10–13 s)

SDS

sodium dodécylsulfate

4.


TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF

6

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

sp.

species (= espèce ; après un nom de genre, cette abréviation indique qu’il s’agit d’une espèce indéterminée ou quelconque)

SVF

sérum de veau fœtal

tab.

tableau

t/an

tonne/an

Tf

température de fusion

TGF

facteur de croissance transformant (Transforming Growth Factor)

TOF

temps de vol (Time Of Flight)

Tv

température de transition vitreuse

UE

Union Européenne

UHT

ultra haute température

uma

unité de masse atomique

UV

ultraviolet

VIH

virus de l’immunodéficience humaine

VLDL

lipoprotéines de très basse densité (Very Low Density Lipoprotein)

Vmax

vitesse maximale

PARTIE I

SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE 1 - LES GLUCIDES 1.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Classification structurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Oses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Diholosides ou disaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Dérivés glucidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Polysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7. Glucides des parois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8. Glucides de réserve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.9. Cyclodextrines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.ÏUIPEFT
EBOBMZTF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PAGES

9 9 10 14 17 23 23 36 43 48

2 - LES PROTIDES 2.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Acides aminés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. Protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF
EFT
QSPUJEFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

55 55 61 71

3 - LES LIPIDES 3.1. Définition, généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Classification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Lipides simples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Lipides complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5. Isoprénoïdes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6. Importance nutritionnelle et métabolique des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7. Importance médicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8. Lipochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

87 87 88 97 101 118 120 120 133

4 - LES HUILES ESSENTIELLES 4.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Répartition, localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Composition et propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4. Propriétés biologiques et pharmacologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.PEFT
EPCUFOUJPO
EFT
IVJMFT
FTTFOUJFMMFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6. Facteurs affectant la composition et le rendement des huiles essentielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7. Génie métabolique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8. Contrôle des huiles essentielles et méthodes d’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

141 141 142 144 147 150 152 152

5 - LES LIGNINES 5.1. Généralités. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Biosynthèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4. Propriétés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5. Importance économique des lignines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

157 157 159 159 161 171

6 - LES LECTINES 6.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Distribution et localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. Propriétés, rôles physiologiques et toxicité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5. Purification des lectines et utilisations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

173 173 174 174 178

1 - LES GLUCIDES 1.1. INTRODUCTION Anciennement appelés hydrates de carbone, saccharides ou plus communément sucres, les glucides représentent l’un des principaux composants de la matière vivante. Ils sont composés de carbone, hydrogène et d’oxygène, issus plus ou moins directement du dioxyde de carbone et de l’eau par photosynthèse. L’importance des glucides pour les êtres humains est vitale. Nous les consommons directement sous forme d’aliments tels que le pain, la pomme de terre, le maïs, la betterave… et, indirectement, lorsque nous mangeons de la viande, des œufs puisque les animaux se sont eux-mêmes précédemment nourris de glucides contenus dans les végétaux. L’oxydation des glucides fournit une part majeure de l’énergie (17 kJ/g) nécessaire à l’entretien de la vie animale et régénère en même temps le dioxyde de carbone utilisable à nouveau en photosynthèse par les plantes vertes. Idéalement, les glucides doivent constituer 50 à 55 % de l’apport calorique totale, soit 5 g de glucides/kg de poids/jour. Au-delà de leur rôle alimentaire, les glucides, natifs ou modifiés, interviennent dans des secteurs industriels les plus divers, en tant que matière première pour l’élaboration d’autres produits à valeur ajoutée ou en tant qu’additifs alimentaires.

1.2. CLASSIFICATION STRUCTURALE Les glucides sont des composés carbonylés, soit cétoniques (appelés « cétoses »), soit aldéhydiques polyhydroxylés (appelés aldoses). Si ces composés (fig. 1.1) sont sous forme d’unités simples non-hydrolysables, ils sont appelés oses ou monosaccharides, alors que si leurs molécules contiennent plus d’une unité, ils sont appelés osides ou saccharides : disaccharides, trisaccharides, et, en général, polysaccharides ou polyosides suivant leur nombre d’unités constitutives. Ces unités glucidiques ou monomères sont unis par des liaisons glycosidiques ou liaisons osidiques. Lors de l’hydrolyse, une molécule d’eau s’additionne aux fragments obtenus par la rupture de cette liaison. Les osides se subdivisent en deux types de corps : les holosides et les hétérosides ou glycosides. Les holosides donnent à l’hydrolyse uniquement des oses ; le nombre d’oses peut être limité (2-10), ce sont alors des oligosides ou oligosaccharides, si le nombre d’oses est supérieur à 10, on parle de polyosides ou polysaccharides. Les hétérosides donnent un ou plusieurs oses accompagnés d’une molécule non-glucidique : la génine ou aglycone.

10

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE aldoses et leurs dérivés (ex. erythrose, glucose) oses cétoses et leurs dérivés (ex. xylulose, fructose) glucides

hétérosides (ex. anthocyanes, saponosides) osides

oligosides (ex. saccharose, raffinose, verbascose) holosides polyosides (ex. amidon, cellulose, inuline)

Figure 1.1 - Classification des glucides

1.3. OSES (syn. : monosaccharides, sucres simples) Les oses sont des glucides simples dont la molécule est une chaîne d’atomes de carbone comportant plusieurs fonctions alcool et une fonction réductrice carbonyle qui est soit aldéhydique, soit cétonique (fig. 1.2) ce qui permet de les séparer, respectivement, en aldoses (ex. ribose, xylose…) et cétoses (ex. ribulose, xylulose…). triose (C3H6O3)

tétrose (C4H8O4)

pentose (C5H10O5)

hexose (C6H12O6) H

O C

H H H C D-aldoses

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

CH2OH

CH2OH D-glycéraldéhyde

O C

O

O C

D-érythrose

CH2OH D-ribose

CH2OH D-glucose CH2OH

CH2OH CH2OH CH2OH D-cétoses

C

O

CH2OH dihydroxyacétone

H

C

O

C

OH

CH2OH D-érythrulose

C

O

C

O

HO

C

H

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

CH2OH D-xylulose

Figure 1.2 - Séries des aldoses et des cétoses

CH2OH D-fructose

1 - LES GLUCIDES

11

Les oses sont dénommés également, d’après le nombre d’atomes de carbone de leur molécule, en trioses, tétroses, pentoses, hexoses, heptoses… ayant respectivement 3, 4, 5, 6, 7… atomes de carbone. Ces noms peuvent être combinés : on parle parfois d’aldopentoses ou de cétohexoses. Les aldopentoses et les aldohexoses sont les plus répandus des oses. Le glucose est l’aldohexose que l’on rencontre le plus souvent. La numérotation des atomes de carbone se fait à partir du carbone aldéhydique ou, chez les cétoses, de telle façon que le carbone cétonique ait le numéro le plus bas. Tous les oses (excepté le dihydroxyacétone) contiennent un ou plusieurs atomes de carbone asymétriques. Les oses peuvent également se trouver sous forme cyclique en raison de l’interaction du groupe carbonyle avec le groupe hydroxyle sur le carbone C-4 (pour former un furanose) ou sur le carbone C-5 (pour former un pyranose) (fig. 1.3). 6

5

CH2OH

CH2OH

5

O 4

O

1 1

forme furanose

forme pyranose

Figure 1.3 - Formes furanose et pyranose d’un ose Le nom des oses est souvent précédé d’une lettre D ou L : ce préfixe indique que l’hydroxyle porté par l’un des atomes de carbone, le carbone C-5 dans les hexoses, est orienté, à droite (D = dextrogyre) ou à gauche (L = lévogyre) de la molécule écrite selon la représentation de Fisher (fig. 1.4). La grande majorité des oses naturels appartient à la série D ; la configuration L est assez rare chez les sucres (L-rhamnose, L-fucose et L-arabinose). 6

H

1

O

H

HO

C

H

H

C

OH

HO

C

H

C

O

H

CH2OH 6

L-glucose

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

C

H

HO

H

H

O

HO

C

C

HO

1

CH2OH

OH -D-glucopyranose

6

D-glucose

OH

6

CH2OH

OH

CH2OH

1

O

HO

OH

HO OH -D-glucopyranose

1

H

Figure 1.4 - Les deux formes D et L du glucose (représentation de Fischer, à gauche) et les deux isomères α et β (représentation de Haworth, à droite) du D-glucose

12

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La structure cyclique conduit à deux formes isomères, α et β. Pour un D-ose, la forme α est celle où l’hydroxyle anomérique se trouve en dessous du cycle et la forme β est celle où cet hydroxyle se situe au-dessus du plan cyclique. Le tableau 1.1 recense les principaux oses et dérivés d’oses rencontrés chez les plantes. Tableau 1.1 - Principaux monosaccharides et leurs dérivés rencontrés chez les plantes Groupe

Sous-groupe

Exemples

Formule brute

trioses

%HMZDÏSBMEÏIZEF
t
EJIZESPYZBDÏUPOF

C3H6O3

tétroses

%ÏSZUISPTF
t
%ÏSZUIVMPTF
t
D-thréose

C4H8O4

pentoses pentuloses

-BSBCJOPTF
t
%YZMPTF
t
%SJCPTF %YZMVMPTF
t
%SJCVMPTF

C5H10O5

hexoses hexuloses

%HMVDPTF
t
%NBOOPTF
t
%HBMBDUPTF -TPSCPTF
t
%GSVDUPTF
t
%UBHBUPTF

C6H12O6

heptuloses

D-sédoheptulose

C7H14O7

octuloses

%HMZDÏSP%NBOOPPDUVMPTF
t
D-glycéro-D-galacto-octulose

C8H16O8

nonuloses

%ÏSZUISP-HMVDPOPOVMPTF
t D-érythro-L-galacto-nonulose

C9H18O9

acides uroniques

BDJEF
%HMVDVSPOJRVF
t
BDJEF
HBMBDUVSPOJRVF
t
BDJEF
NBOOVSPOJRVF

C6H10O7

pentitols hexitols heptitols

SJCJUPM
t
%YZMJUPM %HMVDJUPM
t
%NBOOJUPM
t
%TPSCJUPM Perseitol

C5H12O4 C6H14O6 C7H16O8

6-désoxy-hexoses

-SIBNOPTF
t
-GVDPTF
t
%RVJOPWPTF
t
D-désoxyribose D-digitoxose

C6H12O5

polyols

désoxy-oses 2,6-didésoxyoses

oses aminés

hexosamines N-acétylhexosamine

HMVDPTBNJOF
t
HBMBDUPTBNJOF N-acétyl-glucosamine N-acétyl-galactosamine

C6H12O4 C6H13O5N C8H15O6N

Les deux trioses, le glycéraldéhyde et le dihydroxyacétone sont des intermédiaires de la glycolyse et du cycle de Calvin. Dans la catégorie des tétroses, l’érythrose-4-phosphate est un intermédiaire essentiel dans la synthèse des composés aromatiques ou aromagenèse. Les pentoses les plus importants, le ribose et le désoxyribose rentrent dans la constitution des acides nucléiques.

1 - LES GLUCIDES

13

L’exemple de l’hexose le plus important et le plus commun dans la nature est le glucose. Les autres hexoses les plus courants sont le fructose, le galactose et le mannose. On les rencontre dans des structures polysaccharidiques (glucose dans l’amidon et la cellulose ; glucose, galactose et mannose dans les hémicelluloses), dans des structures hétérosidiques (glucose, galactose) et aussi à l’état libre dans de nombreux fruits et légumes (fructose, glucose) mais leur taux dépend de l’état de maturité et du mode de conservation du produit qui les contient. Les désoxy-oses sont une autre catégorie d’oses que l’on rencontre surtout chez les végétaux et dans lesquels une ou deux fonctions alcool sont éliminées par réduction. On distingue (fig. 1.5) : X les 6-désoxy-hexoses, comme le L-rhamnose (= 6-désoxy-L-mannose) qui est très répandu, puisqu’il rentre dans la constitution de polysaccharides hétérogènes et de très nombreux hétérosides ; X les 2,6-didésoxy-hexoses, comme le D-digitoxose (= 2,6-didésoxy-D-allose), constituant de certains hétérosides cardiotoniques. OH H 3C O

H3C HO

O

HO OH

HO OH

OH

Figure 1.5 - Structure de deux désoxy-oses : L-rhamnose (à gauche) et D-digitoxose (à droite) Pour illustrer ce groupe de composés glucidiques, nous retiendrons ici un hexose d’une extrême importance, le glucose, qui servira de modèle pour la série des aldohexoses.

GLUCOSE Le glucose est l’un des premiers éléments de la synthèse des glucides dans les feuilles des végétaux lors de la photosynthèse et constitue la source d’énergie majeure dans le métabolisme cellulaire. Cette énergie est libérée tout au long d’une chaîne de réactions de dégradation faisant intervenir de nombreux corps intermédiaires, dont l’adénosine triphosphate (ATP). Universellement présent dans le monde vivant, très abondant dans les fruits mûrs et le miel à côté de son isomère, le fructose, il rentre dans la constitution de nombreux oligosides (saccharose, maltose…) et polysaccharides (cellulose, amidon) des végétaux. C’est notamment l’ose le plus abondant des parois cellulaires. Il est souvent lié à divers principes actifs sous forme de glucosides (ou hétérosides).

STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS Le glucose, de formule C6H12O6, est un composé extrêmement soluble dans l’eau. On le trouve principalement sous forme dextrogyre (D-glucose). En solution aqueuse, le

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

glucose peut exister sous la forme linéaire (dite aldéhydique), mais dans la plupart des cas, cet aldohexose existe sous deux formes cycliques (dites hémiacétaliques) principales et donc deux stéréoisomères : α-D-glucopyranose et β-D-glucopyranose différant uniquement par la configuration du carbone asymétrique créé, le carbone C-1 et où un atome d’oxygène relie les carbones 1 et 5 (notons que, de façon usuelle, les différents atomes de carbone du glucose sont numérotés dans le sens des aiguilles d’une montre. Ainsi, le carbone anomère est noté 1 et celui en position exocyclique porte le numéro 6). Ces deux structures (α et β) diffèrent par la position des groupements –H et –OH liés à un atome de carbone particulier de la molécule, le carbone C-1. Elles sont appelées formes anomères (le carbone C-1 est également appelé un carbone anomère).

APPLICATIONS Industriellement, le glucose est obtenu par hydrolyse acide ou hydrolyse enzymatique (action conjuguée de l’α-amylase et d’amyloglucosidase) de l’amidon. Il conduit, par fermentation, à l’éthanol, à certains acides organiques (lactate, succinate, propionate, acétate, butyrate…) et à d’autres produits dérivés. La nature du produit final de la fermentation dépend du micro-organisme impliqué et des conditions du milieu. Sa déshydratation en milieu acide (qui conduit à l’hydroxyméthylfurfural, voir fig. 1.17), s’accompagne de la formation de nombreux sous-produits. Son isomérisation enzymatique (glucose isomérase immobilisée de Streptomyces) en fructose est utilisée à l’échelle industrielle (aux Etats-Unis, principalement) pour produire des sirops enrichis en fructose à partir de jus glucosés de maïs (HFCS, High Fructose Corn Syrups). Ils contiennent 42 à 90 % de fructose. Les HFCS-42 et HFCS-55 sont employés par les industries agro-alimentaires comme édulcorants dans les préparations liquides (boissons gazeuses, produits laitiers, crèmes glacées, pâtisserie, produits de boulangerie…). Les HFCS-90 sont utilisés en pâtisserie et dans les aliments à faible pouvoir calorifique. Directement assimilable, le glucose est un aliment énergétique important. Lors de traitements médicaux, il est injecté sous forme de soluté isotonique (5 %) ou hypertonique (10 à 50 %). Les solutions injectables (à 5 et 10 %) sont utilisées notamment pour prévenir des déshydratations. Les solutions injectables hypertoniques (à 15, 20, 30 et 50 %) sont destinées à la nutrition parentérale (apport calorique) et au traitement de l’hypoglycémie.

1.4. DIHOLOSIDES OU DISACCHARIDES Groupe de glucides constitués de deux oses unis par une liaison glycosidique, de formule générale C12H22O11. Deux types de diholosides peuvent être distingués : les diholosides réducteurs et les non-réducteurs. Chez les premiers, la fonction réductrice d’un seul ose est impliquée dans la liaison osidique, alors que chez les seconds, cette dernière se fait entre les fonctions réductrices des deux oses. Un seul diholoside non-réducteur a une importance industrielle : le saccharose.

1 - LES GLUCIDES

15

SACCHAROSE C’est le plus important des diholosides du règne végétal et le principal composé organique produit à l’état pur à grande échelle. On le trouve dans toutes les plantes qui font de la photosynthèse où il sert de source de carbone réduit et d’énergie facilement transportables. Ce glucide, le premier composé non-phosphorylé produit à la suite de la photosynthèse, constitue le squelette carboné à l’origine de tous les composés organiques retrouvés dans la plante. Ainsi, ses propriétés physico-chimiques, en particulier sa neutralité électrochimique, son inertie chimique et sa grande solubilité en milieu aqueux, en font un composé facilement exporté des feuilles où il est produit vers les autres organes de la plante. Il constitue, en effet, de loin, l’espèce moléculaire la plus abondante de la sève élaborée transportée dans les cellules vivantes du phloème.

STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS Le saccharose de formule C12H22O11, de poids moléculaire 342, très hydrophile, est d’autant plus soluble dans l’eau que la température augmente. À 25 °C, la solubilité du saccharose est de l’ordre de 1,8 à 2 kg/L d’eau pure ; à 100 °C, elle atteint près de 5 kg de sucre pour la même quantité d’eau. Son hydrolyse est catalysée par les acides ou par une des deux osidases : l’α-glucosidase et la β-fructofuranosidase. Cette dernière enzyme, appelée communément invertase, donne un mélange équimolaire des deux oses dont il est constitué : le D-glucose et le D-fructose (fig 1.6). Son nom scientifique le précise mieux : α-D-glucopyranosyl (1-2) β-D-fructofuranoside. CH2OH CH2OH

O OH

1

2

O OH

O

OH OH

CH2OH OH

Figure 1.6 - Structure du saccharose Le nom d’invertase vient du fait que l’hydrolyse du saccharose s’accompagne d’une inversion du signe du pouvoir rotatoire (fig. 1.7). saccharose (1 mole) []

20°C D

pouvoir rotatoire

=

+ 66,5°

inversion

glucose (1 mole) + 52,7°

+

fructose (1 mole) – 92,4 °

résultante – 19,7°

Figure 1.7 - Inversion du pouvoir rotatoire lors de l’hydrolyse du saccharose

16

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

APPLICATIONS Commercialement, il est produit principalement à partir des tiges de la canne à sucre (Saccharum officinarum, Poacées vivaces) dont le jus en contient entre 13 et 20 % ou des racines tubérisées de la betterave sucrière (Beta vulgaris, Chenopodiacées) dont le jus contient de 14 à 20 % de saccharose. Une troisième source de saccharose, de moindre importance au plan industriel, est constituée par la sève de l’érable à sucre (Acer saccharum, Aceracées), arbre nord-américain dont la sève brute se charge au printemps de saccharose, par suite de l’hydrolyse des polymères de réserve des parenchymes ligneux. La production mondiale de saccharose est actuellement voisine de 140 millions de tonnes, un tiers environ provenant de la betterave, deux tiers de la canne à sucre. L’extraction du sucre est effectuée selon des procédés industriels dans les sucreries. Le principe de l’extraction du sucre, qu’il s’agisse de canne à sucre ou de betterave, est quasi-identique et consiste à isoler le saccharose en éliminant, par étapes successives, les autres constituants de la plante : extraction du sucre des cellules végétales, séparation des impuretés (autres matières organiques et minérales), élimination de l’eau dans laquelle il est en solution, et enfin, cristallisation. On obtient ainsi du sucre blanc. Le sirop restant est soumis à de nouvelles cuissons qui donneront du sucre plus coloré, blond ou roux, du fait de réactions de caramélisation.

Extraction à partir de la canne à sucre Les tiges de la canne à sucre sont découpées en morceaux de 100 mm de longueur et 4 mm de section puis exprimées dans des moulins à cylindres horizontaux tournant lentement. Le jus obtenu (le vesou) est épuré de ses impuretés par filtration, débarrassé de ses protéines par chauffage et ensuite soumis à la défécation par la chaux (ou chaulage). L’addition de la chaux coagule la majeure partie des impuretés odorantes et colorées. Dans ce jus chaulé, on fait barboter du dioxyde de carbone : c’est la « carbonatation », qui provoque la précipitation de la chaux (sous forme de carbonate de calcium), entraînant avec elle les impuretés. Le jus est ensuite filtré afin d’éliminer les impuretés résiduelles, concentré par évaporation à pression réduite jusqu’à cristallisation (sucre cristallisé roux) puis séché. Un raffinage permet d’éliminer les impuretés résiduelles (sels minéraux, matières organiques) par refonte dans l’eau chaude, addition de chaux et de CO2, filtration et recristallisation (sucre blanc cristallisé). Le liquide visqueux résiduel qui contient encore du saccharose et une petite quantité de sucres non-cristallisables, constitue la mélasse. Le rendement moyen est voisin de 115 kg de saccharose et 250-300 kg de bagasse par tonne de canne à sucre.

Extraction à partir de la betterave Les racines de betterave sont râpées ou coupées en rondelles ou en fines lanières (cossettes) de 1 à 2 mm d’épaisseur puis soumises à un jet d’eau chaude (70-80 °C) qui extrait le jus par diffusion (principale différence avec la canne à sucre). Le jus sucré est purifié par chaulage, pour précipiter les impuretés, suivi d’un traitement par le dioxyde de carbone pour précipiter l’excès d’hydroxyde de calcium partiellement dissous. Après filtration, le jus épuré est concentré par évaporation sous vide pour donner un sirop contenant 65 à 70 % de saccharose. Une purification supplémentaire, permettant d’atteindre un taux de sursaturation nécessaire à la croissance des cristaux existants, suivie d’un essorage et d’un séchage, aboutit à l’obtention du sucre blanc cristallisé (à 99,8 %). Le rendement moyen est voisin de 130 kg de saccharose et de 35-40 kg de mélasse à 48 % de saccharose par tonne de betterave.

1 - LES GLUCIDES

17

Extraction à partir de la sève de l’érable Traditionnellement, la sève de l’érable à sucre est recueillie en pratiquant une entaille dans le tronc de l’arbre puis chauffée et brassée, ce qui provoque sa concentration mais aussi le développement d’une coloration et d’arômes caractéristiques du sirop d’érable. Aujourd’hui, l’introduction de l’osmose inverse se répand de plus en plus pour concentrer davantage l’eau d’érable, d’où une économie de combustible et de temps. Le sirop d’érable est composé presque exclusivement de saccharose (plus de 85 % de la matière sèche), d’hexoses et de polyosides divers et possède une teneur en eau de l’ordre de 35 % en poids. Sa composition et ses propriétés rhéologiques sont donc très voisines de celles du sirop de saccharose. L’arôme particulier du sirop d’érable est recherché dans certains produits de biscuiterie ou de pâtisserie. Le sucre est commercialisé sous différentes formes : le sucre blanc est un sucre de betterave ou de canne contenant au moins 99,8 % de saccharose ; le sucre roux de betterave ou de canne contient 85 à 95 % de saccharose et certaines impuretés responsables de sa couleur et de son arôme. L’industrie sucrière offre aux consommateurs et aux industries utilisatrices de sucre une grande diversité de produits : sucre cristallisé, sucre en poudre, sucre glace, sucre en morceaux, pains de sucre, sucre vanillé, sucre fondant, sucre liquide… En dehors de sa consommation directe (sucre en bouche) dans l’alimentation, le saccharose est aussi utilisé dans les industries agro-alimentaires (près de 75 % de la production mondiale) et dans les industries chimiques et pharmaceutiques (environ 5 %). Parmi les dérivés industriels du saccharose, les sucroglycérides sont obtenus par transestérification d’un glycéride naturel (suif, huile de palme…) par le saccharose ; il se forme alors un mélange de mono- et diesters de saccharose et de mono- et diglycérides. Ces substances sont utilisées comme émulsifiants dans la fabrication des laits ré-engraissés pour les veaux ou d’autres aliments. Elles ne sont pas toxiques et sont assimilables. Le saccharose est également une matière première, dont la fermentation produit l’éthanol, le butanol, la glycérine, les acides citrique, lévulinique et gluconique. C’est aussi un ingrédient de certains savons et peut être transformé en esters et en éthers, certains d’entre eux conduisant à des résines dures, insolubles et infusibles. Le sucre inverti, obtenu par hydrolyse totale ou partielle du saccharose, existe soit sous forme d’un mélange 50 % de D-glucose et de 50 % de D-fructose (inverti total), soit en mélanges ternaires, équimoléculaires de saccharose/glucose/fructose. Il est utilisé, en remplacement du saccharose, comme anticristallisant, stabilisant de l’humidité et améliorant de texture pour la pâtisserie, la viennoiserie, la confiserie, la glacerie et la crème fouettée. Dans le domaine pharmaceutique, le saccharose sert d’excipient dans la fabrication de nombreuses formes galéniques administrées par voie orale comme les sirops, les tablettes, les capsules médicamenteuses… Il est aussi utilisé pour masquer l’amertume de certains médicaments.

1.5. DÉRIVÉS GLUCIDIQUES Les dérivés glucidiques renferment, outre le carbone, l’oxygène et l’hydrogène, d’autres éléments comme les groupements carboxyliques, aminés, phosphate ou N-acétyl (fig. 1.8).

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Les acides uroniques (acides D-glucuronique, D-galacturonique…), produits d’oxydation des hexoses (la fonction alcool primaire est oxydée en acide carboxylique), n’existent pas sous forme libre (fig. 1.8) dans les aliments mais sont des constituants des hémicelluloses, des substances pectiques, des mucilages et des gommes. Les sucres phosphatés, comme le fructose 1,6-diphosphate, sont des intermédiaires importants dans la respiration cellulaire et dans la photosynthèse. Les groupements phosphates sont attachés à un ou plusieurs groupements –OH du sucre (fig. 1.8). OH HOOC

HOOC

O

O HO HO

P

OH

OH acide galacturonique

OH

OH O

HO

OH

OH acide glucuronique

O

CH2

CH2

O

OH

P

O

O

OH

OH

CH2OH HO

O OH

HO OH fructose 1,6-diphosphate

NH2 glucosamine

Figure 1.8 - Structure de quelques dérivés glucidiques La chitine, constituant des parois de certains champignons, est formée principalement de dérivés de glucosamine (N-acétyl-D-glucosamine), sucre contenant un groupement aminé à la place du groupement –OH porté par le carbone C-2 (fig. 1.9). Il s’agit d’un polyoside linéaire qui forme des microfibrilles semblables à celles de la cellulose. Les unités N-acétyl-D-glucosamine sont reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1J 4). Son hydrolyse complète libère la glucosamine ou chitosamine alors que son hydrolyse ménagée génère le chitobiose formé par l’union de 2 molécules de glucosamine. OH

AcHN H

O O OH

H

O H

O O

AcHN

O O OH

O H

OH

OH

NH2 O O

OH

AcHN O H O O

AcHN

OH

O H

n

OH

NH2

O H O O NH2

O H

O

O O

O O

Figure 1.9 - Structure de la chitine (en haut) et du chitosane (en bas) AcHN = groupement N-acétyl = –NH–CO–CH3

O

NH2

n

1 - LES GLUCIDES

19

Notons que la chitine est particulièrement abondante dans les carapaces de crustacés (crabes, crevettes…) et dans l’exosquelette des insectes. La chitine isolée de ces différentes sources possède des degrés différents de N-acétylation. Bien que les plantes ne produisent pas de chitine, elles sécrètent des chitinases en réponse à des attaques de champignons pathogènes.

APPLICATIONS La chitine est, entre autres, utilisée comme pansement bactéricide pour soigner les plaies mais aussi dans la production d’emballages biodégradables. Après extraction et N-désacétylation alcaline, on obtient le chitosane (fig. 1.9) qui, selon le degré d’hydrolyse, présente un caractère plus ou moins chargé (groupes amines libres ou sous forme ammonium). Contrairement à la chitine, le chitosane est hydrosoluble et ses groupements aminés peuvent être modifiés par différents substituants. Le chitosane et ses dérivés présentent diverses applications : pansement hémostatique rapide pour les blessures, support de filtration pour l’élimination de particules et divers ions, agent floculant, additif alimentaire à propriété hypocholestérolémiante (piège les graisses dans l’intestin et forme un gel indigestible qui sera éliminé par les voies naturelles, permettant aux graisses saturées de transiter par le système digestif sans être absorbées par l’organisme), agent d’enrobage pour les semences et les fruits (pour retarder la détérioration), fertilisant (apport d’azote), fongicide et bactéricide. Ces propriétés très diversifiées en font un produit actuellement en rapide développement et dont les principaux producteurs sont les Etats-Unis et le Japon. Les polyols sont des dérivés des oses, également dénommés sucres alcools. Ils sont très répandus dans le règne végétal. Industriellement, ils sont produits par hydrogénation catalytique de divers sucres, ce qui entraîne la réduction de leurs fonctions aldhéhyde ou cétone en fonction alcool. Le D-sorbitol est un polyol existant à l’état naturel dans les fruits comestibles de diverses Rosacées, en particulier dans celui du sorbier des oiseaux (Sorbus aucuparia), du prunier, du pommier ainsi que dans le thalle de certaines Algues brunes.

APPLICATIONS Le D-sorbitol est métabolisé lentement chez l’homme et mieux utilisé que le glucose par le diabétique en donnant la même quantité d’énergie (environ 17 kJ/g). De ce fait, il est utilisé comme agent édulcorant1, en substitut du saccharose pour les diabétiques (il est, en effet, converti en D-fructose, lequel est ultérieurement métabolisé en glycogène)2. Il est également utilisé en thérapeutique pour ses propriétés cholécystokinétiques. Toutefois, un excès de sorbitol dans le sang peut entraîner la cataracte. 1

pour des compléments d’information, voir Le pouvoir sucrant sur le site web dédié

2

pour des compléments d’information, voir Les interdépendances métaboliques dans le diabète sur le site web dédié

20

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Sur le plan technologique, d’autres caractéristiques ont fait du sorbitol une substance auxiliaire importante en industrie alimentaire et en particulier dans les produits de confiserie, où il remplace souvent le sucre inverti. On peut les résumer ainsi : heffet hygroscopique, d’où son utilisation comme agent humectant pour fixer l’eau dans de nombreux produits (dentifrices, biscuiterie, confiserie…). L’eau ne s’évapore que très lentement en présence d’une quantité suffisante de sorbitol ; hrésistance au chauffage ; heffet retardateur sur la cristallisation du saccharose et du glucose ; les cristaux formés restent petits et non-décelables dans la bouche. Cette action anticristallisante lui confère un effet cryoprotecteur dans les crèmes glacées tout en leur donnant une texture souple ; hpeu édulcorant (pouvoir sucrant d’environ 0,5 comparé au saccharose) ; hviscosité relativement faible des sirops, facilitant leur utilisation. Industriellement, il est obtenu par hydrogénation catalytique (fig. 1.10) sous pression ou par réduction électrolytique du D-glucose. Il se présente en général sous forme d’un sirop concentré à 70 %. OH

OH O

OH H2, Ni

OH

OH

OH

OH

CH2OH

OH

OH

OH

glucose

sorbitol

Figure 1.10 - Hydrogénation catalytique du glucose en sorbitol Le D-mannitol existe à l’état naturel dans la manne (exsudation sucrée) du frêne (Fraxinus ornus L., Oleacées) et en quantités importantes dans le thalle des algues brunes (Laminaires).

APPLICATIONS Le D-mannitol est préparé industriellement par épimérisation du D-glucose suivie d’une réduction ou par hydrogénation catalytique du D-fructose (fig. 1.11). Il peut aussi être obtenu par fermentation discontinue sous conditions d’aérobie en utilisant une souche conventionnelle de la levure Zygosaccharomyces rouxii. CH2OH HOCH2

CH2OH

O

OH OH fructose

CH2OH HO

OH

O HO

OH

CH2OH

H2

HO

+

HO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

sorbitol

Figure 1.11 - Hydrogénation catalytique du D-fructose

mannitol

1 - LES GLUCIDES

21

Près de la moitié du D-mannitol est excrétée dans les fèces et les urines, le reste est oxydé au niveau du foie. Etant rapidement filtré au niveau glomérulaire et ne subissant pratiquement aucune réabsorption tubulaire, il est à cet effet, par voie parentérale, un diurétique osmotique en fixant l’eau et l’éliminant ensuite avec lui. Il est également à la base d’un procédé d’exploration fonctionnelle du rein. À côté de ses utilisations en thérapeutiques (laxatif, ballonnement, états nauséeux…), il est employé en alimentation humaine et comme édulcorant chez le diabétique. Son dérivé, le mannitol hexanitrate, est bien connu pour ses propriétés vasodilatatrices et est utilisé dans le traitement de l’hypertension. Le mannitol est le moins soluble (18 %, à 25 °C) et le plus hygroscopique des polyols cristallisés. On peut l’utiliser comme agent de saupoudrage pour les gommes à mâcher sans sucre. Ses propriétés d’agent cryoprotecteur font du mannitol un excellent support de lyophilisation. C’est aussi un puissant séquestrant d’ions métalliques, particulièrement en milieu alcalin. Le D-xylitol se trouve dans de nombreux végétaux et spécialement les fruits. Sa production industrielle se fait par hydrogénation catalytique de D-xylose (fig. 1.12) qui provient lui-même de l’hydrolyse des xylanes (hémicelluloses) présents en quantités importantes dans le bois (ex. bouleau), la paille, les coques de noix de coco, les rafles de maïs et autres produits végétaux. xylanes

O

hydrolyse acide

OH

OH OH xylose

OH

H2

OH

OH

OH

OH OH xylitol

Figure 1.12 - Hydrogénation catalytique de D-xylose

APPLICATIONS Saveur sucrée (pouvoir sucrant le plus élevé de tous les polyols, pratiquement équivalent à celui du saccharose), goût rafraîchissant et propriétés anticariogènes font du xylitol un édulcorant de choix largement utilisé pour les confiseries sans sucre (gommes à mâcher, bonbons et dragées). Ses propriétés anticariogènes sont expliquées par le fait qu’il n’est pas fermentescible par les bactéries buccales et que sa consommation provoque une faible diminution du pH salivaire, ne descendant pas au-dessous du pH critique de 5,5 (seuil de cariogénicité). À quantités équivalentes, son apport calorique représente la moitié de celui du saccharose et ne provoque pas une montée de la glycémie. Il est, de ce fait, plus adéquat pour les diabétiques. L’inositol est une molécule apparentée au glucose, que son autre nom hexahydroxycyclohexane (C6H6(OH)6) caractérise mieux : ses 6 atomes de carbone forment un cycle et portent chacun un hydroxyle, ce qui explique sa grande solubilité dans l’eau. Chimiquement, il existe neuf isomères de l’hexahydrocyclohexane, mais seul le meso- ou myo-inositol (fig. 1.13, à gauche et au centre), a une importance physiologique.

22

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Le préfixe myo- vient du fait qu’il a été isolé pour la première fois du muscle cardiaque. On le trouve également dans le cerveau, les muscles squelettiques. C’est un composant de nombreux phospholipides (phosphatidylinositol) rencontrés dans les membranes cellulaires et intervenant dans les mécanismes de signalisation (second messager) lors de l’action des hormones (messagers primaires) sur la surface des cellules cibles. Chez les végétaux, l’inositol se trouve sous forme de dérivé hexaphosphorylé, l’inositol hexaphosphate (IP6) ou phytate (fig. 1.13, à droite), de formule brute C6H18O24P6, dans l’albumen des graines de Céréales, particulièrement dans le son de blé, de riz, de maïs, et dans diverses autres graines et produits végétaux (légumes secs, graines de sésame, certaines noix…) où il constitue une importante réserve de groupements phosphates. On le trouve également sous forme de sels hydrosolubles (de sodium et de potassium) et de sels insolubles (de calcium et de magnésium). Ces derniers sont appelés également phytine. Lors de la germination, l’hydrolyse de la phytine par les phytases produit du myo-inositol libre (non-phosphaté) et du phosphore inorganique (Pi) qui sera utilisé dans les divers processus de phosphorylation. OH OH HO

HO

1

OH

6

2

5

3 4

OH

1

OH

HO

O

O

PO3H2 O

H H OPO3H2 H

OH HO

PO3H2

H

HO OH

PO3H2

O H2O3P

H H

O PO3H2

Figure 1.13 - Structure (à gauche) et conformation (au centre) du myo-inositol et structure de l’acide phytique (à droite) Cependant, l’absorption de certains minéraux (ex. fer, calcium, magnésium, zinc) dans le duodénum et l’ilium peut être compromise par la présence d’aliments contenant des quantités importantes en phytates. Ces derniers forment des complexes avec de nombreux minéraux dans le tractus gastro-intestinal et réduisent leur biodisponibilité.

APPLICATIONS Le myo-inositol, souvent considéré comme une vitamine B8, est un facteur de croissance essentiel pour les cultures de tissus végétaux et pour beaucoup de micro-organismes (levures). C’est aussi un antioxydant naturel, capable de réduire le cholestérol, d’inhiber l’agrégation des plaquettes, d’aider à la régénération des cellules du foie, de stimuler la sécrétion de l’insuline et d’inhiber le développement de certaines formes de cancer (sein, colon, prostate).

1 - LES GLUCIDES

23

1.6. POLYSACCHARIDES Les polysaccharides (ou polyosides, ou glycanes) sont des polymères linéaires ou ramifiés, formés par la condensation, avec élimination d’eau, d’un nombre élevé (de 10 à plusieurs milliers) de molécules d’oses ou de dérivés d’oses liés généralement par des liaisons glycosidiques entre le carbone C-1 (anomère) de l’un et le carbone C-4 ou le carbone C-6 de l’autre molécule osidique. Si ces oses sont des hexoses, le polymère est appelé hexosane ; dans le cas de la condensation de pentoses (xylose, par exemple), on obtient des pentosanes. Deux catégories d’hexosanes ont une grande importance dans la nature : les amidons qui permettent aux plantes d’emmagasiner de l’énergie (glucides de réserve) et la cellulose qui constitue le matériau de base des parois cellulaires (glucides pariétaux) de nombreux végétaux. La troisième catégorie de polysaccharides naturels est celle des pentosanes, renfermant des unités pentoses. Les polysaccharides peuvent être homogènes s’ils résultent de la condensation d’un même ose, ou hétérogènes s’ils sont le résultat de la condensation de différents types d’oses. Les polysaccharides sont habituellement peu ou pas solubles dans l’eau.

1.7. GLUCIDES DES PAROIS La paroi cellulaire est une caractéristique spécifique de la cellule végétale. C’est l’enveloppe la plus externe de la cellule. Elle la protège, maintient sa forme et sa rigidité, et s’oppose à une absorption excessive d’eau. À l’échelle de la plante, elle est responsable du port dressé des végétaux. .FTVSBOU
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épaisse que la membrane plasmique. Chez les plantes terrestres, la paroi (fig. 1.14) est essentiellement composée de polymères glucidiques, cellulose, hémicelluloses et pectines, de protéines pariétales et éventuellement d’autres composées de nature phénolique (lignine et subérine).

lamelle moyenne paroi secondaire paroi primaire

paroi cellulaire

Figure 1.14 - Représentation schématique de la paroi des cellules végétales

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La paroi est composée de trois parties : X paroi primaire, de nature pecto-cellulosique, très hydrophile (jusqu’à 90 % d’eau). La paroi primaire n’existe seule que dans les cellules juvéniles. Elle est extensible, ce qui permet la croissance cellulaire (élongation) ; X paroi secondaire, elle apparaît lors de la différenciation de la cellule. Elle est constituée de cellulose et d’hémicelluloses et est enrichie en composés phénoliques : lignine (pour renforcer la rigidité), cutine et subérine (pour l’imperméabiliser). Cette différenciation s’observe dans les cellules conductrices de sève du xylème (le bois) et dans différents tissus de soutien (sclérenchyme) ou de protection (liège). La paroi secondaire, souvent élaborée par apposition de couches successives, a une matrice résistante et durable qui fournit protection et soutien à la cellule ; X lamelle moyenne, c’est la partie la plus externe de la paroi et elle est commune à deux cellules contiguës. C’est elle qui se forme la première et elle est constituée de matières pectiques qui jouent le rôle de ciment entre deux cellules.

1.7.1. CELLULOSE C’est un polymère naturel qui joue un rôle essentiel dans la structure des plantes et c’est le constituant majeur des fibres végétales (coton, lin, chanvre, jute, ramie…) et des végétaux utilisés dans l’industrie du papier. Dans le bois, principale matière papetière, elle représente 40 à 49 % de la matière sèche chez les Résineux ou Conifères (pin, sapin, épicéa) et 30 à 40 % chez les Feuillus (peuplier, hêtre, charme). La cellulose est la molécule organique la plus abondamment synthétisée sur la planète lors de la photosynthèse. On estime qu’un arbre produit environ 10 g de cellulose par jour et que la biosynthèse mondiale annuelle de cellulose est de 45 à 50 milliards de tonnes. Synthétisée dans le cytoplasme des cellules végétales, la cellulose se dépose à l’extérieur de la membrane plasmique pour former les parois cellulaires et participe au soutien et à la rigidité des tissus. La cellulose se trouve surtout dans la paroi secondaire, accompagnée par les lignines, mais aussi dans la paroi primaire de la fibre. La cellulose se trouve exceptionnellement à l’état presque pur dans les parois cellulaires des poils des graines de coton (95 ± 4 %), ce qui explique l’importance économique de ce produit naturel.

STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES La cellulose est un homopolymère linéaire, de formule brute (C6H10O5)n, résultant de la polycondensation de molécules de l’anhydroglucopyranose (glucose sous forme pyranosique ayant perdu une molécule d’eau), contenant en moyenne 5000 unités liées les unes aux autres par des liaisons glycosidiques de type β-(1J 4) (substitution d’un groupe hydroxyle de l’hémiacétal d’un sucre avec un groupe hydroxyle d’un alcool d’un autre sucre) (fig. 1.15). La longueur de la chaîne semble varier d’une plante à une autre. Sa masse moléculaire est très élevée, de l’ordre de 500 kDa, elle peut atteindre 5000 kDa.

1 - LES GLUCIDES

25

Deux unités d’anhydroglucose constituent une unité cellobiose (dimère fondamental). En raison de sa richesse en groupements –OH (3 par unité structurale), la cellulose présente une grande affinité pour l’eau, on dit qu’elle est hydrophile. OH HO O 4

3

1

2

O CH2OH

CH2OH O HO

4 3

2

OH O 1

OH

HO O 4

O CH2OH

CH2OH O HO

O OH

n

unité cellobiose 1,03 nm

Figure 1.15 - Fragment du polymère de cellulose Les caractéristiques physiques principales, en particulier l’insolubilité dans l’eau, résultent de la masse moléculaire très élevée de la cellulose et de l’interaction des hydroxyles qui forment une multitude de liaisons hydrogène intra- et intermoléculaires faisant obstacle au passage du solvant. Il est possible d’utiliser des solvants faisant intervenir des sels métalliques tels que le lithium. Plus récemment, un nouveau solvant permettant de solubiliser la cellulose a été utilisé industriellement, il s’agit du N-méthylmorpholine-N-oxyde, qui est utilisée en présence d’une petite quantité d’eau. Il existe d’autres solvants de la cellulose parmi lesquels on peut citer des mélanges de type métal/solvants : hydroxyde de cuprammonium (liqueur de Schweitzer), hydroxyde de cupriéthylènediamine (CED) ou de cadmium éthylénediamine (Cadoxen). Il y a formation, dans ce cas, d’un complexe entre le cation métallique, le solvant et les fonctions hydroxyles de la cellulose. Elle peut être hydrolysée par les acides minéraux forts (ex. acide sulfurique 70 % ou acide phosphorique). Son hydrolyse partielle donne du cellobiose (un diholoside) tandis que l’hydrolyse totale donne du D-glucose. Les chaînes de cellulose se regroupent parallèlement en faisceaux dans la paroi primaire pour former des micelles groupées en microfibrilles. Leur cohésion est assurée par des liaisons hydrogène entre les hydroxyles libres d’un glucose et les atomes d’oxygène d’un autre glucose de la chaîne adjacente (chaque unité anhydroglucose, à l’exception des unités terminales, comporte trois groupements –OH). Les fibres de cellulose sont construites à partir de l’agglomération de ces microfibrilles en fibrilles qui s’enroulent dans des directions opposées autour d’un axe central, ce qui donne un produit d’une résistance physique considérable. Elles sont noyées dans une matrice constituée d’autres molécules, généralement des hémicelluloses. L’Homme et les animaux supérieurs ne possèdent pas de cellulases, enzymes capables de dégrader la cellulose en D-glucose contrairement à beaucoup de micro-organismes. Les ruminants tels que le mouton, la vache ou le dromadaire qui se nourrissent d’herbes ou de feuilles, possèdent une microflore cellulolytique dans leur panse. Les celluloses apportées par les fibres végétales sont partiellement transformées en glucose dans le côlon ; celui-ci est en mesure de l’absorber. L’utilisation de la cellulose par les animaux est, cependant, réduite lorsque la plante vieillit, à cause de l’augmentation de la teneur en lignine de la paroi végétale.

26

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

APPLICATIONS Les matériaux cellulosiques représentent la plus importante des sources de carbone organique rapidement recyclables dans la nature. Certains micro-organismes aérobies ou anaérobies (champignons, bactéries) dits cellulolytiques, sont capables de digérer la cellulose. Les sucres formés (cellobiose, glucose) sont rapidement repris par d’autres micro-organismes pour être transformés en acétate, formiate, lactate, éthanol et enfin en dioxyde de carbone. Sur le plan technologique, la cellulose est principalement utilisée par l’industrie papetière qui consomme 95 % de la production mondiale, mais elle joue aussi un rôle important dans plusieurs autres domaines : textile, médecine, audio-visuel, agro-alimentaire… La séparation de la cellulose des autres constituants végétaux (lignine et hémicelluloses notamment) est une étape préalable dans la préparation des pâtes cellulosiques industrielles destinées soit à la fabrication de papiers, soit à des usages chimiques (acétate de cellulose, viscose…). Lors de son extraction, la cellulose réagit différemment à certaines actions chimiques. Il s’en suit que l’on obtient différents types de celluloses suivant la nature des procédés d’extraction mis en œuvre. On distingue trois types de celluloses, plus ou moins en mélange (fig. 1.16) : hla cellulose α, normale, résistante aux alcalis (insoluble dans NaOH concentré) et aux oxydants ; hla cellulose β, assez facilement hydrolysable et qui est précipité par acidification par l’acide acétique ; hla cellulose γ qui comprend les hémicelluloses facilement hydrolysables. -cellulose (insoluble) pâte cellulosique

traitement par NaOH 17,5 %

-cellulose (insoluble) fraction soluble

neutralisation par acide acétique

-cellulose (soluble)

Figure 1.16 - Fractionnement de la cellulose par solubilisation différentielle La connaissance de la proportion de ces différentes celluloses a une grande importance pour certaines applications industrielles. C’est ainsi que la fabrication de la rayonne se fait à partir de la cellulose α. Sur les groupements hydroxyles de la molécule, on peut additionner différents groupements pour obtenir un certain nombre de dérivés de la cellulose aux usages multiples : hLes nitrates de cellulose ou nitrocelluloses sont les plus anciens dérivés cellulosiques obtenus industriellement. Ce sont des esters (R–O–NO2) résultant de l’action de l’acide nitrique sur les groupements hydroxyles de la cellulose. On y distingue la mononitrocellulose, la dinitrocellulose et la trinitrocellulose. Les nitrates de cellulose ont été utilisés dans la fabrication des explosifs et du verre des pare-brises des voitures. Il s’agit d’un sandwich fait d’une feuille de nitrate de cellulose entre deux couches de verre. La feuille de nitrate de cellulose maintient ensemble les plaques de verre ; en cas d’accident, les morceaux cassés restent collés à la feuille de nitrate de cellulose. Elles sont utilisées aussi pour fabriquer des vernis et des textiles synthétiques. Le celluloïd, feuille plastique transparente et flexible, le collodion ou tétranitrate de cellulose, sont également préparés par nitratation de la cellulose. hLes acétates de cellulose sont obtenus par acétylation totale (estérification des groupements hydroxyles par un mélange d’acide acétique, d’anhydride acétique et d’acide sulfurique) de la

1 - LES GLUCIDES

27

cellulose extraite du coton ou de la pulpe de bois et utilisés comme textile (fibres d’acétate). Ce sont les dérivés industriels le plus importants de la cellulose. Ils ont été utilisés dans la fabrication des pellicules photographiques et des bandes magnétiques. Les esters sont aussi appréciés pour leurs capacités filtrantes. Le marché dominant est celui des filtres à cigarettes et des membranes de séparation, notamment d’hémodialyse. hLes éthers de cellulose sont une autre catégorie de dérivés importants dans divers domaines. La carboxyméthylcellulose (CMC), obtenue par action de l’acide monochloracétique sur la cellulose, a une vaste gamme d’applications alimentaires (épaississant et stabilisant), agricoles, pharmaceutiques et industrielles. Elle est utilisée en papeterie pour le traitement des papiers en surface, comme échangeur d’ions (chromatographie d’échange d’ions) et aussi comme agent émulsifiant dans les jus de fruits, crèmes glacées… Elle peut servir de liant pour les comprimés. Contrairement à la CMC, les hydroxypropylméthylcelluloses (HPMC) et les méthylcelluloses (MC) sont non-ioniques et ont une solubilité dans l’eau limitée : solubles dans l’eau froide, mais insolubles dans l’eau chaude. Ceci leur confère une propriété unique pour des texturants alimentaires : ils gélifient à chaud. L’hydroxypropylcellulose et l’éthylméthylcellulose, également partiellement solubles dans l’eau, sont employés surtout comme épaississants et émulsifiants en industrie alimentaire, mais aussi dans des produits médicaux et cosmétiques, pour leurs propriétés filmogènes, cicatrisantes et de rétention d’eau. Carboxyméthylcellulose, méthylcellulose, éthylcellulose, hydroxycellulose sont employés dans la fabrication des colles, en particulier, pour l’encollage des papiers peints. hLe xanthate de cellulose est préparé par action simultanée de la soude (~ 20 %, 18-20 °C) et du sulfure de carbone (20-30 °C) sur la cellulose, selon les réactions suivantes : (C6H10O5)n + n NaOH $ (C6H9O4ONa)n + n H2O (C6H9O4ONa)n + n CS2 $ (C6H9O4O–SC–SNa)n Le xanthate de cellulose hautement purifié, est de nouveau dissout dans la soude diluée, en donnant un liquide sirupeux, la viscose, qui se coagule au contact des acides en donnant une substance transparente et brillante. On obtient ainsi les feuilles de cellophane (pellicule transparente) et les fils de rayonne (fibres lisses), utilisés pour fabriquer les vêtements comme les chemises hawaïennes.

1.7.2. HÉMICELLULOSES STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS Les hémicelluloses sont des polysaccharides hétérogènes existant dans les parois primaire et secondaire des cellules végétales tapissant et reliant entre elles les fibrilles de cellulose et se faufilant dans le réseau amorphe de lignine. Elles se distinguent de la cellulose par la nature de ses éléments constitutifs. Alors que la cellulose donne uniquement du glucose à l’hydrolyse, les hémicelluloses donnent du D-mannose, du D-galactose, du D-xylose, du L-arabinose et, en plus faible proportion, du L-rhamnose et du L-fucose. L’acide D-glucuronique leur est souvent associé. Il s’agit donc d’un polymère hétérogène formé par condensation de ces oses qui se présentent sous la forme pyrannosique, sauf pour le L-arabinose qui est sous la forme furannosique.

28

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Selon la nature de l’ose constitutif, on distingue différents types d’hémicelluloses : X les hémicelluloses sont dites homopolysaccharides lorsqu’elles sont constituées d’un seul monomère (ex. homogalacturonane) ; X par contre, elles sont du type hétéropolysaccharides (cas le plus fréquent) lorsque plusieurs monomères participent à la structure comme les L-arabino-D-glucurono-D-xylanes ou D-galacto-D-gluco-D-mannanes… ; X les hexosanes sont des polymères d’hexoses (oses à 6 atomes de carbones, (C6H10O5)n). En font partie : les D-mannanes (qui dérivent du D-mannopyrannose), les D-galactanes (dérivant du D-galactopyrannose) ; X les pentosanes sont des polymères de pentoses (oses à 5 atomes de carbone, (C5H8O4)n). En font partie : les D-xylanes (dérivant du D-xylopyrannose), les L-arabanes (dérivant du L-arabinofurannose). La gomme arabique est riche en arabanes ; X les méthylpentosanes dont les plus importants sont des polymères du rhamnose ou rhamnanes. Les hémicelluloses représentent 20 à 30 % de la masse du bois de Conifères (bois tendres) et 27 à 40 % de celle du bois des Feuillus (bois durs). Cette proportion dépasse 30 % dans la paille et les rafles de maïs. La variabilité des hémicelluloses est aussi qualitative en fonction de l’origine végétale (Graminées, Feuillus, Conifères…), en fonction de l’origine cytologique et en fonction de sa position à l’intérieur de la paroi cellulaire (lamelle moyenne, paroi primaire, paroi secondaire), mais aussi en fonction des conditions climatiques de culture et de la maturité des plantes. Les exemples qui suivent illustrent cette variabilité. Les bois durs tropicaux comportent 11 à 18 % de pentosanes, alors que ceux des pays nordiques en ont 17 à 32 %, selon leur stade de maturité. Les xylanes se rencontrent, en particulier, chez les Angiospermes (bois des Feuillus et dans les plantes annuelles). Ils représentent 20-25 % des bois durs, 7-12 % des bois tendres et jusqu’à 50 % des feuilles de certaines Céréales et Graminées (sorgho, canne à sucre, kénaf…). Ils résultent de la combinaison d’unités de xylose, sous forme de xylopyrannoses, unis par des liaisons α-(1J 4) et forment une structure linéaire ou faiblement ramifiée. Les divers xylanes diffèrent entre eux par la nature des chaînes latérales comprenant du L-arabinose ou de l’acide D-glucuronique, généralement 4-O-méthylé. Les arabinoxylanes représentent la composante majeure des parois cellulaires de l’albumen et des couches externes des graines de nombreuses Céréales commerciales. Les mannanes sont rarement purs (sans autre substituant), mais le plus souvent, à côté du mannose, on trouve d’autres oses qui leur sont associés : glucose (glucomannanes), acide glucuronique (glucuronomannanes), galactose (galactomannanes)… Les glucomannanes et les galactoglucomannanes sont les constituants majeurs des hémicelluloses des parois secondaires dans les bois tendres mais mineurs dans les bois durs. Les hémicelluloses se différencient de la cellulose aussi par le fait qu’elles sont solubles dans les solutions alcalines diluées (exemple, potasse 15 %) et l’eau bouillante mais insolubles dans les solvants organiques et la liqueur de Schweitzer. Comme la cellulose, elles forment des chaînes, souvent plus courtes et pouvant porter de courtes ramifications substituées.

1 - LES GLUCIDES

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APPLICATIONS L’hydrolyse acide des hémicelluloses conduit aux monomères constitutifs comme le xylose, le glucose, l’arabinose… La fermentation alcoolique des sucres ainsi formés, les transforme en divers produits comme des alcools (éthylique, butanolique) et des acides organiques (acétique, butyrique, lactique…). L’hydrolyse des hémicelluloses à l’aide de xylanases associées à l’acide férulique estérase est une opération industrielle permettant d’obtenir à moindre coût divers produits à valeur ajoutée tels que des monosaccharides et l’acide férulique, à partir de déchets lignocellulosiques à moindre coût. La moindre stabilité des hémicelluloses en milieu acide est mise à profit industriellement pour effectuer leur hydrolyse à l’aide d’acides minéraux dilués ou d’acides organiques. Les pentoses obtenus sont extraits puis transformés en furfural (aldéhyde aromatique), les hexoses en alcool furfurylique (2-hydroxyméthylfurfural) (fig. 1.17). Ce dernier peut également être obtenu par hydrogénation du furfural. hémicelluloses (pentosanes)

OH

H+ H2O

O

OH

HO

H+

O

CHO

H2

O

CH2OH

– 3 H2O

OH D-xylose

furfural

alcool furfurylique

Figure 1.17 - Formation du furfural et du 2-hydroxyméthylfurfural en présence d’acides Etant très réactifs, ces dérivés sont à l’origine de nombreux polymères de synthèse : nylons, polyesters, colles, résines furaniques (condensation du furfural avec le phénol), de pesticides, combustibles pour fusées… Pour des raisons économiques, ces composés ne peuvent actuellement concurrencer les produits existants mais on cherche à exploiter leurs spécificités (conduction d’électricité, photosensibilité, thermorésistance) pour des applications particulières (fibres de verre, pièces d’avions et de freins pour les automobiles…). Le furfural est aussi un excellent solvant sélectif utilisé en raffinage pétrochimique pour séparer les diènes (utilisés dans la fabrication du caoutchouc) des autres hydrocarbures.

1.7.3. PECTINES 1.7.3.1. STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS Les pectines (du grec pêktos = épaissi, figé) ou substances pectiques constituent un groupe de polysaccharides hétérogènes à teneur élevée en acide α-D-galacturonique (GalA). La structure des pectines varie selon l’origine botanique, voire même cellulaire pour une même espèce. L’acide galacturonique peut être seul ou associé à d’autres oses. Un homogalacturonane (HG) est un polymère linéaire constitué d’unités α-D-GalA liées par des liaisons 1-4, tandis qu’un rhamnogalacturonane (RG) est constitué d’unités répétitives [(J 4)-α-D-GalA-(1J 2)-α-L-Rha-(1J) ] auxquelles une variété de différentes chaînes glycaniques (principalement des arabinanes et galactanes) sont attachées aux résidus rhamnose. La longueur des chaînes est aussi variable.

30

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Les pectines sont présentes sous forme insoluble (protopectine) dans la paroi cellulaire primaire des végétaux et en solution (acides pectiques ou acides pectiniques) dans le suc de certains fruits mûrs. Elles représentent 0,5 à 4,0 % du poids de la matière fraîche des plantes (tab. 1.2). Leur masse moléculaire est d’environ 120 kDa. Tableau 1.2 - Composition en pectines de quelques fruits et légumes [d’après Jayani R.S., Saxena S. & Gupta R. : Process Biochemistry 40, Microbial pectinolytic enzymes: A review, 2931-2944, © 2005, avec la permission d’Elsevier]

Fruit/légume

Tissu

Substances pectiques [%]

pêches

matière fraîche

0,1-0,9

cerises

matière fraîche

0,2-0,5

pomme

matière fraîche

0,5-1,6

fraises

matière fraîche

0,6-0,7

banane

matière fraîche

0,7-1,2

pois

matière fraîche

0,9-1,4

pommes de terre

matière sèche

1,8-3,3

tomates

matière sèche

2,4-4,6

carottes

matière sèche

6,9-18,6

pulpe de betterave à sucre

matière sèche

10,0-30,0

pulpe d’orange

matière sèche

12,4-28,0

Les groupements carboxyles (C-6) des pectines peuvent être libres ou plus ou moins estérifiés par le méthanol. Les acides galacturoniques constitutifs peuvent être estérifiées en C-2 et/ou C-3 par de l’acide acétique. Elles se présentent sous forme de sels (pectates de calcium et magnésium) de l’acide pectique ou d’acide pectinique, selon leur degré de méthoxylation : X les acides pectiques sont des polymères linéaires d’unités d’acide D-galacturonique (30 à 50), partiellement estérifiées par le méthanol (pectines peu méthoxylées) et liées par des liaisons glycosidiques α-(1J 4), auxquelles sont associées certains oses (L-rhamnose, D-galactose, L-arabinose et D-xylose) ; X les acides pectiniques (pectines hautement méthoxylées) présentent un degré de méthoxylation élevé (50 à 75 % des groupes carboxyles à l’état estérifié). La caractéristique fondamentale des pectines est la formation d’un gel en phase aqueuse. Les propriétés de ce gel varient selon le degré d’estérification de la pectine. Ainsi, les pectines hautement méthoxylées, dites « à gélification rapide », forment rapidement un gel en milieu acide et en présence de sucres libres. Ce gel n’est pas réversible par chauffage en dessous de 80 °C. Par contre, les pectines faiblement méthoxylées forment un gel en présence de cations divalents (calcium et magnésium), à pH proche de la neutralité et en présence d’une moindre quantité de sucre. Ce gel est réversible par chauffage à 60 °C.

1 - LES GLUCIDES

31

Les protopectines forment les composés pectiques typiques de la lamelle moyenne et de la paroi primaire chez les plantes supérieures. Leur extraction par hydrolyse chimique conduit à l’apparition de fragments inégaux, parce qu’on ne peut pas contrôler l’hydrolyse des liaisons covalentes. Chez les fruits mûrs, la protopectine peut être convertie en acides pectiques. Elle peut aussi être convertie par l’eau bouillante acidulée. La pectine est précipitée par les sels de fer et de plomb. Elle est mise en évidence en microscopie photonique par le rouge de ruthénium, en microscopie électronique après traitement par l’hydroxylamine et le chlorure ferrique.

1.7.3.2. ENZYMES PECTIQUES Les enzymes pectolytiques sont classées suivant leurs points d’attaque (fig. 1.18). Les deux principaux groupes sont les pectinestérases (ou pectine-méthylestérases) et les dépolymérases. pectine-méthyl-estérase 6

6

COOCH3 5 O

O

4

OH

1

COOH O

4

OH

2 3

COOH O

5

O

poly-méthyl-galacturonase + H2O

poly-galacturonase + H2O

1

O

COOCH3 O O

OH

COOCH3 O O

OH

O

OH

2 3

OH

OH pectate-lyase

OH

OH

OH

pectine-lyase

Figure 1.18 - Fragment de molécule de pectine et points d’attaque des enzymes pectiques Les premières agissent sur les liaisons ester en produisant de l’acide pectique et du méthanol et se rencontrent chez les plantes et notamment dans les fruits du genre Citrus et de tomate. Elles sont également produites par de nombreux champignons et bactéries. Les dépolymérases regroupent les enzymes hydrolysant les liaisons glycosidiques. Ce groupe comprend : X les polygalacturonases qui agissent par hydrolyse des liaisons α-(1J 4) de l’acide pectique (acide polygalacturonique) ; X les polyméthylgalacturonases qui catalysent l’hydrolyse des liaisons α-(1J 4) des pectines estérifiées ; X les pectate et pectine-lyases qui agissent par trans-élimination. Les endo-polygalacturonases, produites dans les fruits mous, les champignons et certaines bactéries, agissent préférentiellement sur les pectates. Les exo-polygalacturonases, rencontrées principalement chez les plantes et les champignons, libèrent des monomères de galacturonate par l’attaque des extrémités du polymère sous forme de pectate. Un troisième groupe d’enzymes est représenté par les protopectinases qui sont responsables de la solubilisation de la protopectine en pectine soluble.

32

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

APPLICATIONS Les deux principales sources industrielles de pectine sont : hles zestes de fruits de divers Citrus (Rutacées) : citron, orange, pamplemousse ; les pectines constituent alors les sous-produits de la fabrication des jus de fruits ; hles fruits de diverses Rosacées, en particulier du pommier (Pyrus malus) : les pectines sont extraites alors des marcs de pommes provenant de la fabrication du cidre. Parmi les autres sources de pectines, on peut citer les poires, les cerises, les groseilles et les coings (fruits) ; les graines de tournesol, la carotte, l’écorce de betterave et la gentiane (racines). Pour l’extraction, les fruits sont pressés, le résidu est traité par l’eau chaude (80 °C) acidulée. Après filtration ou centrifugation, la solution de pectine obtenue est précipitée par l’alcool ; la pectine brute est purifiée par redissolution dans l’eau chaude et précipitations répétées par l’alcool à degré croissant et se terminant par l’alcool pur qui élimine l’eau résiduelle. Les pectines peuvent être purifiées également par passage sur colonnes échangeuses d’ions qui éliminent des cations. Une méthode récente d’extraction des pectines fait appel à la technique de cuisson-extrusion, dont l’effet majeur est une augmentation importante de la solubilité des pectines dans l’eau. Elle est moins polluante et garantit un rendement supérieur et à moindre coût à celui de l’extraction par voie acide à chaud décrite ci-dessus. Dans l’industrie agro-alimentaire, la stabilisation des boissons lactées acidifiées est l’une des plus importantes applications des pectines qui, en se fixant aux particules de caséines, les empêchent de sédimenter. Les pectines sont largement utilisées pour leurs propriétés gélifiantes, émulsionnantes (confitures, gelées, crèmes glacées, boissons aromatisées, pâtes à tartiner, gommes à mâcher…) et dans diverses autres domaines (encres, colles). Mondialement, la consommation annuelle est estimée à environ 45 000 t . En raison de leur capacité à adsorber les toxines et de leur activité bactériostatique, les pectines sont utilisées comme agent protecteur de la muqueuse digestive en cas d’affections gastro-intestinales, de gastrites ou de diarrhées. Les pectines sont aussi utilisées pour freiner l’élimination trop rapide de substances médicamenteuses (ex. pénicillines retard, insulines retard) ou comme gélifiant dans la préparation de certaines pommades.

1.7.4. GOMMES GÉNÉRALITÉS, STRUCTURE Les gommes sont des produits végétaux glucidiques s’écoulant, soit naturellement, soit à la suite d’une blessure de l’écorce par les insectes ou les autres animaux, parfois après incision de l’écorce du tronc ou des branches de certains arbres ou arbustes dits gommifères appartenant essentiellement aux familles des Fabacées et des Sterculiacées. Toutefois, on en rencontre chez d’autres familles de plantes telles que des Rosacées, en particulier au niveau de blessures sur le tronc des pruniers ou des cerisiers. Ce sont des composés généralement inodores, fades, plus ou moins solubles dans l’eau, formant alors des solutions colloïdales ou des gels.

1 - LES GLUCIDES

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Les gommes se distinguent des mucilages du fait qu’elles s’exsudent à l’extérieur du végétal et se solidifient par dessiccation au contact de l’air, alors que les mucilages sont des constituants cellulaires normaux, préexistant dans des formations histologiques spécialisées (cellules et canaux) fréquentes dans le tégument externe des graines. Elles se distinguent également des résines parce qu’elles sont insolubles dans les solvants organiques. Les gommes sont des macromolécules hétérogènes, de structure branchée, contenant des acides uroniques. X La

gomme arabique, appelée aussi gomme acacia ou gomme du Sénégal, est un exsudat naturel ou provoqué, obtenu à partir de l’Acacia senegal et de l’A. seyal (Fabacées) et d’autres espèces d’origine africaine se développant dans des régions semi-arides (du Soudan au Sénégal). C’est un polyoside acide dont la chaîne principale est constituée de D-galactopyranose (45 %) relié par des liaisons β-(1J 3), portant des unités de L-arabinofuranose et de courtes chaînes latérales contenant du D-galactose, du L-arabinose, du L-rhamnose, du D-xylose et de l’acide D-glucuronique. Le polyoside est souvent associé à une protéine où l’hydroxyproline, la sérine et la proline représentent près de 50 %. La proportion de la partie protéique par rapport à la gomme varie de 0,1 à 10 % selon les espèces d’Acacia. La gomme arabique se trouve dans le commerce sous forme de poudre, de granules ou de cristaux plus ou moins ronds. La surface extérieure des cristaux est mate et fendillée et leurs cassures sont vitreuses. Leur couleur est jaune blanche à jaune brunâtre. La gomme arabique est fade et inodore et est très soluble dans l’eau.

X La gomme de guar, de nature polysaccharidique, est extraite par broyage des graines de

Cyamopsis tetragonolobus (Fabacées), originaire de l’Inde et du Pakistan. Elle est constituée de chaînes de β-D-mannose liés en (1J 4) avec des ramifications d’une seule molécule de galactose liée α-(1J 6). X La gomme tragacanthe ou adragante est un exsudat visqueux naturel ou provoqué par

incision du tronc ou des branches de Légumineuses (Astragalus gummifer et d’autres espèces du même genre). Elle est composée de deux fractions polysaccharidiques : la tragacanthine, constituée d’acide galacturonique, d’arabinose et de xylose, et la bassorine (ou acide tragacanthique) contenant de l’acide D-galacturonique, du D-galactose, du D-xylose et du L-fucose. Ces deux fractions représentent, respectivement, 30-40 % et 60-70 %. Sa masse moléculaire est de l’ordre de 800 kDa. L’acide D-galacturonique est partiellement méthylé. X La

gomme karaya est un exsudat, naturel ou provoqué par incision du tronc ou des branches, de différentes espèces de Sterculia, surtout S. urens et S. villosa, ou de Cochlospermum. La gomme karaya est constituée essentiellement de polysaccharides ramifiés, de masse molaire élevée, basés surtout sur le D-galactose, le L-rhamnose, l’acide D-galacturonique et l’acide D-glucuronique. La molécule est partiellement acétylée. Dans le commerce, elle se présente sous la forme de poudre légèrement grise, voire rose brune ou de morceaux de différentes tailles.

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

APPLICATIONS La gomme tragacanthe constitue un hydrocolloïde utilisé, en technologie alimentaire comme additif pour sa viscosité aux environs de la neutralité, dans des produits alimentaires comme les sauces de type mayonnaise, des crèmes et desserts glacées… La gomme arabique est utilisée comme agent de texture pour ses propriétés hydrocolloïde, émulsifiante, épaississante et stabilisatrice dans de nombreux produits élaborés à chaud, par exemple en confiserie. C’est aussi un adoucissant très employé dans les maladies inflammatoires. La gomme de guar est utilisée comme additif alimentaire pour ses propriétés hydrocolloïdales et épaississantes. D’autres industries comme la papeterie, le traitement des eaux, le textile, l’utilisent également. La gomme karaya est utilisée comme émulsifiant et épaississant. Elle possède une odeur et un goût typiques d’acide acétique. Diverses autres gommes d’intérêt commercial sont employées comme succédanés ou bien comme agents épaississants en thérapeutique digestive, telles la gomme du fruit du caroubier (Ceratonia siliqua) et la gomme du tamarin (Tamarindus indica).

1.7.5. MUCILAGES GÉNÉRALITÉS, STRUCTURE Les mucilages se rencontrent dans un grand nombre de végétaux et parfois en telle abondance que ces derniers sont appelés plantes mucilagineuses. Ce sont des produits formés durant la croissance normale de la plante mais ils ne sont pas situés à la surface des épidermes sous forme d’exsudats suite à une action bactérienne ou fongique ou suite à une blessure mécanique, comme c’est le cas des gommes. On les rencontre dans les organes les plus divers, dans les fleurs (mauve, guimauve), les feuilles (bourrache, capillaire, guimauve, aloès, pourpier), l’écorce (cannelle), les téguments des graines (moutarde blanche, coing, lin, fenugrec, plantain), les bulbes (oignon), les racines (guimauve), les fruits (caroubier), la pulpe de fruit (cacao)… Les mucilages se retrouvent également dans les exsudats racinaires de certaines plantes où ils jouent un rôle important dans les interactions plantes-micro-organismes. La teneur en mucilage de ces différents organes varie selon les cultivars, la localisation géographique et les saisons. Chez certaines Algues, particulièrement riches en mucilage, ces derniers font l’objet d’une extraction industrielle. On ne leur connaît pas de fonctions biologiques précises dans la plante, mais on considère qu’ils interviennent essentiellement dans l’économie de l’eau (cas des plantes terrestres) ou dans la diffusion de l’eau (cas des Algues). Chimiquement, les mucilages sont des composés apparentés aux gommes et aux pectines mais ils s’en distinguent par certaines propriétés physiques. Alors que les gommes gonflent dans l’eau et forment des solutions visqueuses colloïdales et que les pectines gélatinisent dans l’eau, les mucilages forment, en présence d’eau chaude, des suspensions colloïdales de consistance plus ou moins visqueuse se gélifiant en refroidissant. Ils contiennent les mêmes groupes de sucres que les gommes et les pectines, et se retrouvent

1 - LES GLUCIDES

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souvent sous forme de sels d’acides. Les cations d’accompagnement sont principalement le calcium, le magnésium, le potassium et le sodium. Les acides les plus courants sont les acides uroniques et, principalement galacturonique, bien que d’autres comme les acides sulfoniques peuvent être rencontrés. Certains mucilages sont neutres et ne contiennent pas d’acides mais seulement des sucres simples reliés par des liaisons glycosidiques. Leur hydrolyse libère des pentoses et des hexoses ; l’arabinose, le galactose, le glucose, le mannose, le rhamnose et le xylose étant les plus communs. Par oxydation nitrique, ils donnent de l’acide mucique, formé aux dépens du galactose. Les mucilages sont colorables par le rouge de ruthénium et identifiés habituellement par leurs propriétés physiques ou par spectroscopie infrarouge.

APPLICATIONS Les principales sources industrielles de mucilages sont la mousse d’Islande (lichen), les graines de lin, de coing et l’écorce de l’orme pyramidal. Ils sont obtenus après broyage s’ils sont situés dans l’albumen, mais, le plus souvent, par extraction à l’eau ou à l’aide d’une solution de carbonate de sodium diluée quand ils sont trouvés dans le tégument de la graine. Ils sont purifiés par précipitation avec de l’alcool ou des solutions de sel et sont commercialisés en poudres. Les mucilages trouvent leurs applications dans les produits de beauté (lotions pour les mains et les cheveux), en médecine (laxatifs et diurétiques), en pharmacie (émulsifiants) et en industrie (épaississants, stabilisateurs d’émulsions, liants, impression sur textile et fabrication du papier). D’un point de vue thérapeutique, ce sont des médicaments qui ne sont pas utilisés seuls, mais ils servent à lier certaines substances en les maintenant en suspension. Beaucoup d’espèces de la famille des Malvacées doivent leur action émolliente et pectorale aux multiples cellules à mucilage qu’elles renferment. Les mucilages de la pulpe des feuilles de Aloe vera sont douées d’activité immunomodulatrice. Les mucilages font partie des fibres alimentaires 3.

1.7.6. CALLOSE La callose est un homoglucane composé d’unités de β-D-glucopyranose reliées par des liaisons β-(1J 3). La callose ne fait pas partie de la paroi cellulaire végétale mais elle a une existence temporaire durant certains processus. C’est ainsi qu’on la trouve autour du tube pollinique durant la double-fécondation et dans le phragmoplaste au cours de la division cellulaire. Elle se dépose en hiver au niveau des cribles des tissus libériens servant au transport de la sève et se résorbe au printemps (ex. vigne). Elle apparaît aussi à la mort des cellules ou en cas de blessures (par obstruction des pores) faisant obstacle aux bactéries et champignons. On la trouve également dans les ornementations des spores de champignons. Elle est colorable sélectivement en bleu par le bleu de méthyle ou le bleu d’aniline à pH 8, ce qui permet de la mettre en évidence par fluorescence. Les champignons produisent une endo-1,3-glucanase capable de dégrader la callose. 3

pour des compléments d’information, voir Les fibres alimentaires sur le site web dédié

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

1.8. GLUCIDES DE RÉSERVE 1.8.1. AMIDON 1.8.1.1. GÉNÉRALITÉS Principale forme de réserve nutritive chez les végétaux, l’amidon est présent dans toutes les plantes à tous les niveaux, mais on le trouve préférentiellement dans les organes de réserve (graines, rhizomes, racines tubérisées) où il s’accumule servant alors au développement ultérieur de la plante ou fournissant un aliment à la jeune plantule lors de la germination. L’amidon est particulièrement abondant dans les graines de Céréales (blé, riz, sorgho, maïs, orge, avoine, seigle…) et de Légumineuses (haricot, féverole, fève, pois, pois chiche, lentille…), les racines tubérisées de pommes de terre ou de manioc. Sa teneur atteint fréquemment 70 % par rapport à la matière sèche dans les graines et les tubercules. Ces plantes sont dites amylacées. L’amidon est synthétisé et mis en réserve dans le chloroplaste des tissus photosynthétiques lors de la photosynthèse durant la photopériode. On le trouve aussi en réserve dans des plastes spécialisés appelés amyloplastes dans les organes non-photosynthétiques. Au cours de la journée, le carbone photoassimilé est partiellement exporté sous forme de saccharose pour satisfaire la demande métabolique de la plante, l’excédent étant immobilisé sous forme d’amidon dans les tissus photoassimilateurs, celui-ci sera consommé au cours de la nuit pour permettre la croissance de la plante. En microscopie photonique, l’amidon de ces diverses plantes se présente sous forme de granules intracellulaires constitués de couches emboîtées concentriquement autour d’un point, le hile. Leur forme, leur taille (de 2 à 175 μm) et l’emplacement du hile sont caractéristiques de chaque espèce (tab. 1.3). Ils peuvent être ellipsoïdaux à hile excentré (amidon de tubercules), lenticulaires à hile centré (Céréales : blé, orge, seigle…), polyédriques (maïs, riz) ou réniformes à hile central allongé ou étoilé (Légumineuses), dont le grand diamètre (2 à 150 μm) présente des longueurs variables selon leur provenance, mais ils sont chimiquement semblables. Sous l’action de l’eau tiède, les grains gonflent et leurs couches concentriques se séparent. Tableau 1.3 - Taille des grains d’amidon selon leur origine Origine de l’amidon graines de chénopode

Taille des grains d’amidon [μm] 2

riz

2à5

patate douce

4 à 40

millet

5 à 20

manioc

5 à 35

IBSJDPU
t
TPSHIP
t
NBÕT

10 à 30

CMÏ
t
PSHF
t
TFJHMF

25 à 45

GÒWFT
t
MFOUJMMFT

40 à 70

pommes de terre

60 à 100

1 - LES GLUCIDES

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1.8.1.2. STRUCTURE ET COMPOSITION L’amidon est un homopolymère du D-glucose dont les éléments monomères sont reliés par des liaisons glycosidiques entre les carbones 1 et 4. Il répond à la formule générale (C6H10O5)n dans laquelle n est très grand. En fait, l’amidon est constitué de deux polymères de structures différentes : l’amylose et l’amylopectine. Ces fractions peuvent être séparées au moyen de différentes techniques de solubilisation et de précipitation. Dans la plupart des cas, l’amidon contient de 70 à 80 % d’amylopectine, le reste étant constitué d’amylose. Les amidons provenant de diverses espèces ou variétés de plantes diffèrent par les proportions relatives en amylose et amylopectine ; c’est ce qui explique les propriétés variables des amidons d’origines différentes. C’est ainsi que les amidons de certains génotypes de blé, de maïs, d’orge et de pomme de terre renferment de fortes proportions en amylose (jusqu’à 70 %), tandis que les amidons d’autres variétés de maïs (maïs cireux ou glutineux) sont presque entièrement constitués d’amylopectine (95 à 97 %). Une espèce végétale donnée peut même renfermer plusieurs amidons de composition différente. C’est ainsi qu’on rencontre, par exemple, des variétés de riz riches en amylopectine (riz collants) et des variétés riches en amylose (riz à grains détachés). Dans l’amylose, les monomères de glucose forment une longue chaîne linéaire en hélice. Ces chaînes peuvent comporter de 200 à 6000 unités d’α-D-anhydroglucopyranose associées par des liaisons (1J 4). L’amylopectine est un polymère plus complexe et ramifié en grappe (fig. 1.19), de 10 000 à 100 000 monomères par molécule. Il renferme une chaîne principale (chaîne C) à laquelle sont attachées, par des liaisons α-(1J 6), des chaînes Ø extrémité réductrice latérales (chaînes B) internes portant elles-mêmes chaîne C d’autres chaînes latérales externes non-ramifiées chaîne B (chaînes A), de 24 à 30 monomères en moyenne unis chaîne A par des liaisons (1J 4). De ce fait, c’est l’une des plus grosses molécules biologiques.

Figure 1.19 - Représentation schématique de la molécule d’amylopectine Les chaînes A, non-ramifiées, sont greffées par leur extrémité réductrice sur les chaînes B. Ces dernières sont substituées par leur hydroxyle en C-6 par les chaînes A et reliées par leur extrémité réductrice à la chaîne C. Cette chaîne C est la seule à posséder une extrémité réductrice libre. [d’après Eliasson A.C. et al. : On the Structure of Native Starch - An Analogue to the Quartz Structure, Starch/Stärke 39, 147-152, © 1987, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, avec permission]

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

1.8.1.3. PROPRIÉTÉS L’amidon se présente sous forme d’une poudre blanche, insoluble dans l’eau. Etant donné leur structure peu rigide et très ramifiée, les granules d’amidon, mises dans l’eau bouillante, donnent une solution colloïdale et gélifiante à froid connue sous le nom d’empois d’amidon (la partie fluide est formée d’amylose, et la partie visqueuse d’amylopectine). Celui-ci résulte de l’hydratation des grains qui gonflent et peuvent atteindre jusqu’à 30 fois leur volume initial. L’amidon ne réduit pas la liqueur de Fehling. À froid, il se colore en bleu-violacé en présence d’un réactif, le Lugol (iodo-iodure de potassium), ce qui le distingue des dextrines qui se colorent en rouge. Cette coloration disparaît sous l’effet de la chaleur. L’amylopectine est moins soluble dans l’eau que l’amylose en raison de son poids moléculaire plus élevée et de sa structure ramifiée. L’amidon est hydrolysé par les acides dilués et par des enzymes (amylases). L’hydrolyse acide totale fournit du D-glucose. Par hydrolyse acide contrôlée et action de la température, on obtient des fragments de poids moléculaire plus élevé, les dextrines, colorables par l’iode en violet (amylodextrines) ou en rouge (érythrodextrines). Chez l’homme, l’amidon ingéré est hydrolysé enzymatiquement en plusieurs étapes au cours de la digestion. Amorcée dans la bouche par l’α-amylase de la salive qui coupe les liaisons α-(1J 4) à n’importe quel point à l’intérieur des chaînes d’amylose et d’amylopectine en donnant des dextrines puis du maltose et du glucose. Seuls les points de branchement α-(1J 6) restent intacts. L’hydrolyse se poursuit grâce à la β-amylase (que contiennent également les sucs pancréatiques) qui clive aussi des liaisons α-(1J 4) et qui ne s’attaque qu’aux extrémités non-réductrices de la molécule d’amidon, en ne libérant que du β-maltose. Ce dernier est à son tour hydrolysé en glucose par l’enzyme α-(1J 6)-glucosidase ou isomaltase de l’intestin grêle. Le glucose passe ensuite dans le sang et est transporté vers le foie et les muscles où il est converti en un autre polymère du glucose, le glycogène et mis en réserve. La réactivité des grains d’amidon aux amylases et donc leur digestibilité varie selon leur origine botanique. La teneur en amylose paraît corrélée à la digestibilité. Les traitements hydrothermiques (cuisson) qui entraînent le gonflement des grains, la perte de leur structure cristalline et le passage en solution d’une fraction de l’amylose, facilitent l’amylolyse.

APPLICATIONS La production mondiale d’amidon dépend majoritairement des Céréales, surtout du maïs (représentant à lui seul, près de 80 % de la production mondiale) et, dans une moindre mesure, du blé (8 %). Viennent ensuite la pomme de terre (5 %), le manioc, l’avoine et le riz. La production d’amidon par les végétaux est importante et à titre indicatif, les rendements des principales plantes amylacées sont les suivants : h1 hectare de Céréales ayant un rendement de 60 quintaux fournit environ 4,5 t d’amidon, h1 hectare de pomme de terre avec un rendement de 40 t fournit 6,4 t d’amidon, h1 hectare de manioc avec un rendement de 60 t fournit 9,6 t d’amidon.

1 - LES GLUCIDES

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Une production mondiale d’amidon estimée à plus de 15 millions de tonnes justifie le développement d’une vaste industrie de transformation. En effet, il s’agit d’une matière première industrielle importante intervenant dans la fabrication d’une large gamme de produits (environ 600 produits différents) dont les principaux secteurs utilisateurs sont le secteur agro-alimentaire, la papeterie et cartonnerie, la chimie et la pharmacie ainsi que le textile (fig. 1.20). amidon séchage lavage raffinage

amidon industriel (textiles - colles - adhésifs - plâtres - ciments - cartonnages) amidon alimentaire (confiserie - biscuiterie - patisserie - brasserie - charcuterie - pharmacie) amidon alimentaire raffiné (potages - sauces - entremets - diététique infantile - pharmacie)

cuisson, déshydratation et extrusion

grillage (torréfaction)

amidons prégélatinisés (mines - fonderie - forages - empesage - alimentation animale)

dextrines (gommage - étiquetage - colles - fonderie - apprêts pour textiles) amidons modifiés (papeterie - plastique - textiles - pharmacie - métallurgie) (acétate d’amidon, phosphate d’amidon, amidons anioniques )

modifications chimiques diverses

dérivés complexes (usages spéciaux pour industrie) hydrolyse partielle (_-amylase) + faible séchage concentration hydrolyse partielle (_-amylase + amyloglucosidase)

malto-dextrines (diététique infantile)

sirop de glucose (biscuiterie - confiserie - brasserie tannerie - chimie - pharmacie)

concentration (alimentation - chimie - pharmacie)

hydrolyse totale

sirop à haute teneur en D-glucose

isoglucose (édulcorant dans préparations liquides) isomérisation (glucose isomérase) hydrogénation

mannitol (édulcorant thérapeutique)

épimérisation + réduction cristallisation + fermentation

acides organiques et leurs dérivés (pharmacie - chimie fine)

sorbitol (alimentation - boissons - cosmétiques - plastifiants textiles - liège - papeterie - diététique - stabilisateur d’humidité - produits d’hygiène corporelle) hydrolyse poussée

hydrogénation

fermentation (acides organiques - vitamines résines cationiques - antibiotiques) glycérol (plastiques - plastifiants) éthylène - glycol

Figure 1.20 - Principaux dérivés résultant de la transformation de l’amidon et leurs principaux emplois [d’après Mercier C. & Colonna P. : Starch and enzymes: innovations in the products, processes and uses Biofutur 73, 55-58, 1988]

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La caractéristique principale des dérivés d’amidon demeure la biodégradabilité, mais souvent, les propriétés fonctionnelles des amidons natifs ne remplissent que de manière imparfaite les conditions techniques d’application. C’est pourquoi, en technologie alimentaire, diverses techniques ont été développées afin d’optimiser les propriétés des amidons pour des utilisations particulières en industrie agro-alimentaire (amélioration de la solubilité, rétention d’eau, viscosité, gélification, stabilité aux hautes températures…). Ces transformations peuvent être accomplies au moyen de techniques chimiques (hydrolyse partielle ou totale, oxydation, estérification, éthérification, hydrogénation…) et/ou physiques (traitement hygrothermique, pendant un temps donné), extrusion (passage forcé à travers des orifices de faible diamètre)… La modification de la structure initiale de l’amidon peut aussi être obtenue par la variation des proportions respectives d’amylose et d’amylopectine (sélection variétale ou génie génétique). L’hydrolyse enzymatique de l’amidon se produit dans la nature au cours de la germination de nombreuses semences dont les réserves sont principalement constituées d’amidon. On l’exploite ainsi depuis longtemps en brasserie grâce à l’amylase du malt germé qui est mélangée à l’amidon de pomme de terre à raison de 2 à 3 %. Actuellement, diverses enzymes sont employées pour obtenir différents produits commerciaux : des α-amylases bactériennes pour la liquéfaction de l’amidon, des glucoamylases pour la saccharification, des préparations mixtes pour la production de glucose, des α-amylases fongiques pour la production de maltose… L’utilisation d’amylases d’origine fongique représente la solution potentiellement la plus intéressante dans ce domaine. Les cultures d’Aspergillus niger, plus faciles à optimiser et à contrôler, sont capables de convertir 85 à 90 % de l’amidon en glucose. Une hydrolyse faible engendre des maltodextrines (dextrinisation). C’est l'une des plus importantes applications industrielles. Elle repose sur l’utilisation de l’α-amylase thermostable de Bacillus licheniformis ou B. stearothermophilus, capable d’opérer à des températures supérieures à 100 °C. Dans la pratique, l’enzyme est ajoutée à l’amidon en solution à 30 %. Après chauffage rapide à 105-110 °C pendant 5-10 min, la solution est mise à incuber à une température maintenue en dessous de 100 °C pendant 2 h. Les maltodextrines sont ensuite récupérées par filtration puis déminéralisées par passage sur colonnes échangeuses d’ions et, finalement, séchées. Déshydratées, les maltodextrines sont plus digestes que l’amidon ou les farines et sont utilisées dans les aliments diététiques infantiles. À forte concentration, elles forment des solutions très visqueuses, substituables aux matières grasses dans les produits dits « allégés » car ils sont miscibles aux lipides et donnent des mélanges moelleux. La fabrication du fructose ou isoglucose, obtenu par isomérisation du glucose, est une des utilisations récentes de l’amidon. C’est le plus important des édulcorants fabriqués à partir de l’amidon de maïs ; son pouvoir sucrant est 1,7 fois celui du saccharose et est, de ce fait, très largement utilisé pour la production d’aliments et de boissons sans alcool. Le procédé consiste en une hydrolyse poussée de l’amidon (par action des α-amylases et des glucoamylases). Après filtration et purification, on procède à une isomérisation de ce glucose en fructose par passage dans un réacteur à glucose isomérase immobilisée. À ce stade, la concentration atteint 42 % en fructose, le reste étant du glucose et pour une faible part d’oligosides et de polyosides. Une purification ultérieure par chromatographie permet d’atteindre des concentrations plus élevées en fructose. La production d’isoglucose (sous forme de sirop) a trouvé un marché énorme et sans cesse croissant dans le domaine des boissons gazeuses où il se substitue au saccharose extrait de la betterave ou de la canne à sucre.

1 - LES GLUCIDES

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L’hydrolyse acide totale de l’amidon permet d’obtenir du D-glucose qui, transformé en sorbitol, conduit à la synthèse de l’acide ascorbique (vitamine C). En dehors de son utilisation en thérapeutique, ce dernier constitue également un additif alimentaire pour ses propriétés acidifiantes et antioxydantes. La présence de groupements alcooliques sur le monomère anhydroglucopyrannose permet divers types de réactions qui ouvrent la voie aux amidons « modifiés » : amidons oxydés, amidons réticulés, amidons cationiques… hL’oxydation de l’amidon peut être effectuée par des oxydants tels que l’hypochlorite de sodium, le peroxyde d’hydrogène, le périodate, le permanganate ou le persulfate. L’oxydation par l’hypochlorite est la plus utilisée commercialement en raison de son faible coût. Cette réaction est très dépendante du pH ; elle est rapide à pH 7 et très lente à pH acide ou supérieur à 10. Elle conduit à la formation de groupements carbonyles et de groupements carboxyles réduisant la température de gélatinisation. Les amidons oxydés trouvent leur application dans le domaine alimentaire comme agents liants dans certains aliments. L’oxydation électrolytique de l’amidon aboutit à l’amidon dialdéhydique, employé pour l’amélioration des pâtes à papier, la préparation des colles et le tannage du cuir. hL’estérification de l’amidon est obtenue par réaction de ses hydroxyles libres avec divers acides. Les acétates d’amidon, préparés par réaction avec l’anhydride acétique, sont employés comme épaississants dans les aliments cuits au four ou surgelés, dans les pâtés et les assaisonnements. La réaction avec l’anhydride succinique conduit au succinate d’amidon dont les groupements carboxyliques augmentent la capacité de rétention d’eau du produit final. Ce produit est employé comme épaississant dans les potages et certains aliments surgelés ou comme désintégrant dans des comprimés pharmaceutiques. Mélangé aux phosphates de sodium (monophosphate de sodium, trimétaphosphate de sodium…), l’amidon devient fortement anionique et acquiert un pouvoir épaississant élevé exploité par l’industrie des cosmétiques. hL’éthérification de l’amidon permet la transformation de ses hydroxyles libres en éthers à l’aide de groupements alkyles (–CnH2n+1, ex. méthyl –CH3, éthyl –C2H5, propyl –C3H7…) ou aryles. L’hydroxypropyl d’amidon est produit par réaction de l’amidon en solution alcaline avec l’oxyde de propylène à 50 °C. Les produits obtenus possèdent une meilleure stabilité à pH acide ou alcalin. Ils sont employés comme agents épaississants dans les sauces, pâtés et assaisonnements pour salades. hLes amidons réticulés sont obtenus par l’établissement de liaisons covalentes entre les chaînes de macromolécules (fig. 1.21), plus résistantes que les liaisons hydrogène que l’on trouve à l’état naturel. Les amidons ainsi obtenus sont plus résistants à l’acidité, au cisaillement et à la température, mais sont également plus difficiles à cuire. Ceci signifie que le degré de réticulation devra être déterminé en fonction du procédé auquel l’amidon est destiné. Des amidons ayant des taux de réticulation plus ou moins importants sont proposés sur le marché. amidon

OH

amidon

O

+ Na3P3O9 amidon

OH

O P

amidon

O

+ Na2H2P2O7 O– Na+

Figure 1.21 - Réticulation de l’amidon par le trimétaphosphate de sodium (formation d’un diester phosphaté)

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

hLa fixation de groupements d’ammonium quaternaire sur l’amidon permet d’obtenir des amidons

cationiques ayant une meilleure stabilité, ce qui les destine à certaines applications industrielles comme agents liants dans les détergents ou comme agents floculants en dépollution des eaux pour l’élimination de l’argile, du dioxyde de titanium, du charbon ou du fer. Dans le domaine pharmaceutique, les amidons officinaux extraits des caryopses de Zea mays L., d’Oryza sativa L., de Triticum aestivum L. ou des tubercules de Solanum tuberosum L. (sous forme de poudre blanche très fine) servent d’excipients dans la préparation de tablettes, de comprimés… Par son action émolliente, l’amidon est utilisé contre les affections cutanées, soit en nature, soit sous forme glycérolée (préparation liquide dont le véhicule est le glycérol) d’amidon ou de pâte à l’oxyde de zinc. Une des utilisations biotechnologique récente de l’amidon consiste à fabriquer des produits biodégradables (ex. films de paillage agricole fabriqués à partir d’amidons thermoplastiques) qui vont se dégrader facilement en milieu naturel. Ils sont utilisés aussi dans la fabrication de produits de consommation courante (sacs, emballages alimentaires…) que l’on jette après usage, en remplacement de produits conventionnels (dérivés du pétrole, surtout) non-biodégradables et donc plus polluants. Les amidons thermoplastiques sont constitués de deux tiers d’amidon de pomme de terre et d’un tiers de sorbitol, fabriqué industriellement à partir d’amidon de maïs. Une autre application industrielle de l’amidon est son utilisation pour enrober les fils textiles, afin d’augmenter leur résistance au tissage et de donner un certain apprêt aux tissus. Dans le domaine de la fabrication du papier, l’amidon pur trouve son utilisation comme liant pour assurer la cohésion des fibres de cellulose.

1.8.2. INULINE GÉNÉRALITÉS, STRUCTURE C’est un polysaccharide de réserve présent quasi-exclusivement chez certaines plantes (nombreuses espèces de la famille des Asteracées, oignon, ail), dissous dans les vacuoles où il précipite par l’action de l’alcool absolu sous forme de sphérocristaux qui se déposent le long des parois cellulaires. C’est l’une des rares formes de stockage des glucides, facilement disponibles, chez les végétaux. Sur le plan industriel, les sources les plus intéressantes sont les racines de chicorée (Cichorium intybus) et, dans une moindre mesure, le pissenlit (Taraxacum officinale), l’artichaut (Cynara scolymus), l’aunée (Inula helenium) et le topinambour (Helianthus tuberosus). La teneur en inuline varie de moins de 1 à environ 20 % du poids frais. L’inuline est constituée d’une chaîne d’unités de D-fructofuranosyl (fructosane) liées par des liaisons glycosidiques de type β-(2J1) et d’une à deux molécules de D-glucopyranosyl placées au début de la chaîne (fig. 1.22). C’est donc un glucofructosane. Le degré de polymérisation de l’inuline est variable selon les espèces : de 2-12 chez l’oignon à 2-65 chez la chicorée, par exemple.

1 - LES GLUCIDES

43 OH HOCH2

H

CH2 OH

H

H

H

O

n

HO H H CH2OH

O

O HO

H

Figure 1.22 - Structure de l’inuline

H

HO

H

HOCH2

OH

O

O

CH2OH OH

H

APPLICATIONS Industriellement, l’extraction de l’inuline des racines de chicorée se fait par diffusion dans l’eau chaude. L’extrait brut est ensuite raffiné par des techniques similaires à celles utilisées dans les autres filières de l’industrie du saccharose et de l’amidon (ex. chromatographie d’échange d’ions, évaporation, séchage par pulvérisation…). L’inuline est un polyfructane à valeurs diététique et agro-alimentaire élevées. Elle est utilisée d’une part comme fibre alimentaire 4 soluble ; d’autre part, son hydrolyse chimique ou enzymatique permet la production de sirop de fructose. Le fructose peut être utilisé pour l’alimentation parentérale. La résorption intestinale est lente et ne déclenche pas d’insulino-sécrétion ; son métabolisme est hépatique. Etant facilement soluble et éliminée dans l’urine telle qu’elle est injectée (elle n’est ni réabsorbée, ni emmagasinée), on l’emploie en physiologie expérimentale pour la mesure de la vitesse de filtration glomérulaire (qui est égale donc à la clairance rénale de l’inuline). Par ailleurs, la consommation d’inuline améliore l’absorption du calcium et, par suite, la densité minérale des os pendant les périodes de croissance, ce qui laisse présager pour cette substance un avenir dans les futures stratégies préventives de l’ostéoporose. L’inuline de chicorée forme une émulsion avec l’eau d’où son utilisation comme substitut de matières grasses dans l’élaboration des yoghourts et des crèmes glacées mais aussi dans de nombreuses autres préparations alimentaires.

1.9. CYCLODEXTRINES 1.9.1. STRUCTURE Les cyclodextrines sont des oligosaccharides constitués de 6 à 12 unités de glucose liées en position α-(1J 4) et définissant un cycle (fig. 1.23). Les α-, β-, γ-, δ- et ε-cyclodextrines comportent respectivement 6, 7, 8, 9 et 10 unités de glucose. Seules les trois premières sont commercialisées. À l’état natif (non-substitué), ces molécules hydrosolubles 4

pour des compléments d’information, voir Les fibres alimentaires sur le site web dédié

44

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

et résistantes à l’hydrolyse, présentent une cavité cylindro-conique, relativement hydrophobe, alors qu’elles sont très hydrophiles à l’extérieur. À partir des structures révélées par les rayons X, il apparaît que les groupements hydroxyles secondaires (C-2 et C-3) des unités glucopyranosiques sont localisés sur le bord le plus large de la cavité et l’hydroxyle primaire du C-6 sur l’autre bord, et que les atomes d’hydrogène en C-3, C-5 et l’atome d’oxygène de la liaison interosidique (1J 4) sont tournés vers l’intérieur de la cavité. La dimension de la cavité ainsi créée varie de 0,47 à 0,52 nm pour l’α-cyclodextrine, de 0,60 à 0,64 nm pour la β-cyclodextrine et de 0,75 à 0,83 nm pour la γ-cyclodextrine. OH

O

O O H

OH O OH

HO

0,75 - 0,83 nm

OH O H

cavité hydrophobe

HO

OH

O HO

O

0,8 nm

O

O OH O OH

HO O HO

CH3

molécule incluse (toluène) surface externe hydrophile

OH

HO O

H HO O O

OH H O O HO

H H O O O O

O

OH

O

Figure 1.23 - Structure moléculaire de la γ-cyclodextrine (à gauche) et représentation schématique de sa forme géométrique montrant la cavité cylindroconique centrale (à droite)

1.9.2. OBTENTION Les cyclodextrines sont produites industriellement par transformation microbiologique ou enzymatique de l’amidon ou de la cellulose en présence de l’enzyme, la cyclodextrine glucosyl-transférase ou cyclodextrine transglycosylase (CTGase), extraite de différents bacilles (Bacillus macerans, B. circulans, B. megaterium et B. stearothermophilus). Différent types d’amidon peuvent être utilisés comme substrat, mais c’est l’amidon de pomme de terre qui est le plus utilisé pour la production de cyclodextrines. Les amidons de maïs et de blé sont également utilisés mais ils présentent une teneur trop élevée en amylose qui donne des rendements plus faibles que l’amylopectine.

1.9.3. FORMATION DU COMPLEXE D’INCLUSION Grâce à leur caractère amphiphile (hydrophobe à l’intérieur, hydrophile à l’extérieur), les cyclodextrines sont capables d’inclure dans leur cavité apolaire des molécules hydrophobes pour former des complexes d’inclusion solubles dans l’eau. Il est possible, de cette façon, de former des complexes d’inclusion avec une multitude de substances organiques, de sels ou d’halogènes, aux dimensions compatibles et donc de permettre une « encapsulation moléculaire » par simple agitation de la solution de

1 - LES GLUCIDES

45

cyclodextrines en présence de la molécule destinée à être incluse. De plus, cette inclusion n’est, en général, accompagnée, ni de la formation, ni de la rupture d’une liaison covalente. Les cyclodextrines natives α, β et γ contiennent, respectivement, 18, 21 ou 24 groupements hydroxyles susceptibles d’être modifiés. Les hydroxyles les plus réactifs sont ceux en position C-6 ; les moins réactifs étant ceux en C-3. En raison de la disponibilité de ces multiples groupements sur leurs molécules constitutives, la fonctionnalité des cyclodextrines est grandement améliorée par modification chimique. Celle-ci permet d’obtenir divers dérivés aux propriétés physico-chimiques différentes de celles des cyclodextrines natives et d’élargir ainsi leurs champs d’applications. Ces modifications sont réalisées avec plusieurs objectifs : amélioration de la solubilité aqueuse, modification de la capacité de complexation, introduction de groupements à fonctions spécifiques souvent par substitution de certains hydroxyles.

FACTEURS AFFECTANT LA COMPLEXATION Les interactions mises en jeu entre la cyclodextrine et la molécule incluse peuvent être de natures différentes, en particulier : interactions électrostatiques, interactions hydrophobes et liaisons hydrogène. Il s’en suit que la rupture du complexe peut se faire aisément par méthode thermique, par hydrolyse enzymatique, par modification de pH ou par utilisation de solvants organiques.

Température La température a plusieurs effets sur la formation des complexes de cyclodextrines. La chaleur augmente la solubilité du complexe mais, en même temps, elle est susceptible de modifier sa stabilité. On doit donc souvent trouver un compromis de façon à éviter ces effets indésirables. Bien que la thermostabilité du complexe varie d’une molécule hôte à une autre, la majorité des complexes commencent à se rompre à 50-60 °C, tandis que certains complexes sont stables à des températures plus élevées, notamment si la molécule hôte est solidement liée. Par ailleurs, les molécules volatiles peuvent s’évaporer durant la complexation, notamment si la chaleur est utilisée.

pH Le pH du milieu réactionnel est susceptible d’affecter, à la fois, l’état d’ionisation des molécules destinées à être incluses et de certains groupements qui pourraient exister sur les molécules de cyclodextrines. Il peut donc être utilisé aussi bien pour favoriser la complexation que pour la désorption des molécules liées aux cyclodextrines.

Solvant Le solvant le plus utilisé est l’eau dans laquelle la réaction de complexation est réalisée. Plus la cyclodextrine est soluble dans le solvant, plus les molécules deviennent disponibles pour la complexation. La molécule hôte doit être capable de déplacer le solvant de la cavité de la cyclodextrine si le solvant est complexé à cette dernière. L’eau, par exemple, est facilement déplaçable. Les molécules hôtes peuvent ne pas être solubles dans l’eau, ce qui rend la complexation soit très lente, soit impossible. Dans ces conditions, on utilise des

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

solvants organiques pour les solubiliser. Les solvants ne doivent pas se complexer fortement à la cyclodextrine de manière à faciliter leur élimination ultérieure par évaporation. L’éthanol et l’éther diéthylique sont, de ce point de vue, de bons solvants. Le solvant ne doit pas être en excès ; toute dilution des molécules entraîne un ralentissement de la vitesse de complexation. Les solvants sont également utilisés pour la désorption des molécules hôtes complexées. Une molécule hydrophobe incluse peut avoir une plus grande affinité pour un solvant apolaire que pour la cavité d’une cyclodextrine.

Encombrement stérique Les trois cyclodextrines naturelles α, β et γ ont des diamètres internes différents et sont donc capables d’inclure des molécules de tailles différentes. Les cyclodextrines sont aptes à former des complexes d’inclusion avec des composés ayant une taille compatible avec les dimensions de leur cavité. Généralement, une seule molécule est incluse dans la cavité de la cyclodextrine, bien que dans le cas de quelques molécules de faible poids moléculaire, plus d’une molécule peuvent s’y fixer. La formation de complexes avec des molécules plus larges que la cavité peut être possible. Dans ce cas, plusieurs molécules de cyclodextrine peuvent se lier à la molécule « hôte ». Souvent, seulement une partie de la molécule pénètre dans la cavité pour former un complexe. En conséquence, les ratios molaires 1/1 ne sont pas toujours obtenus, surtout avec des molécules « hôtes » de poids moléculaire faible ou élevé. La substitution des hydroxyles en positions 3 et 6 entraîne généralement un rétrécissement de l’ouverture de la cavité alors que la substitution en positions 2 et 6 entraîne un effet inverse. Le nombre de substituant fixés sur les ouvertures de la cavité peut aussi affecter l’inclusion aussi bien positivement que négativement.

APPLICATIONS Les applications des cyclodextrines sont basées sur la possibilité d’héberger une molécule hôte à l’intérieur de leur cavité. Elles se diversifient de plus en plus et se rencontrent désormais dans les domaines agricole, alimentaire, cosmétique, chimique et pharmaceutique. Leur production industrielle à coûts modérés, leur disponibilité basée sur des produits agricoles abondants ainsi que leur caractère biodégradable confèrent à ces molécules de grandes potentialités économiques. Les principales applications industrielles de l’inclusion par les cyclodextrines sont : hla stabilisation des substances photosensibles, volatiles, d’émulsions, de composés aromatiques…, hla modification de la réactivité chimique d’une molécule par protection de certains de ses groupements fonctionnels, hl’amélioration de la solubilité de substances peu ou pas solubles dans l’eau, hla protection des molécules incluses contre l’oxydation, hla protection des substances contre leur dégradation par les micro-organismes, hla désamérisation, désodorisation et dépigmentation de substances.

1 - LES GLUCIDES

47

En technologie alimentaire, les cyclodextrines sont utilisées comme aides technologiques, par exemple, pour éliminer le cholestérol de produits comme le lait, le beurre et les œufs. L’intérêt de ces molécules réside également dans la possibilité d’inclure une molécule aromatique dans leur cavité centrale et de la stabiliser, surtout si le produit est destiné au stockage à long terme. La molécule incluse est ainsi mieux protégée contre les oxydations. L’ensemble, ajouté à un aliment, permet de libérer peu à peu les arômes qu’il contient, prolongeant leur perception. Elles sont utilisées aussi pour atténuer l’amertume et l’astringence de certains aliments (ex. soja) ou de boissons (ex. naringine et limonine des jus de fruits d’agrumes ou acide chlorogénique et polyphénols du café) et les odeurs désagréables. Dans le domaine pharmaceutique, on utilise les cyclodextrines pour solubiliser, stabiliser, améliorer la biodisponibilité d’un principe actif, pour masquer le goût (amertume des médicaments pédiatriques) ou l’odeur désagréable d’un médicament… Du fait de sa meilleure biodisponibilité, la même quantité de médicament produit un plus grand effet biologique quand il est administré sous une forme complexée à l’aide de cyclodextrines. Par conséquent, la quantité de médicament peut être réduite en maintenant le même effet thérapeutique ce qui est un avantage considérable. On peut, de cette manière, réduire les effets secondaires indésirables éventuels, souvent dus à des doses trop élevées ou à l’effet irritant des médicaments (cas des antiinflammatoires, par exemple) sur le tractus digestif. La solubilité de substances peu ou pas solubles dans l’eau (vitamines, hormones liposolubles…) peut être ainsi considérablement augmentée par leur inclusion dans des cyclodextrines. C’est le cas, par exemple, du Piroxicam, un antiinflammatoire commercialisé en Europe, sous la forme de son complexe d’inclusion avec la β-cyclodextrine sous le nom de Brexin® ; sa solubilité dans l’eau passe ainsi de 30 mg/L à 150 mg/L en présence de β-cyclodextrine. Beaucoup de composés, sensibles à l’oxydation ou à la lumière (vitamines, ubiquinones…), sont eux aussi stabilisés par inclusion dans les cyclodextrines. Cette inclusion pourrait constituer une forme galénique à l’avenir. La solubilité des cyclodextrines naturelles dans les solutions aqueuses est relativement limitée. Pour remédier à ce problème, on a recours à la substitution des hydroxyles par différents types d’éthers. Parmi les dérivés d’intérêt pharmaceutique on trouve les composés suivants : 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine, 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrine, sulfobutyléther β-cyclodextrine, β-cyclodextrine méthylée, et certaines cyclodextrines branchées comme la glucosyl-β-cyclodextrine et la maltosyl-β-cyclodextrine. À titre d’exemple, la solubilité de la β-cyclodextrine dans l’eau est seulement de 18,5 mg/L à température ambiante, celle de son dérivé, la 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine, passe à plus de 600 mg/L dans les mêmes conditions. Actuellement, plus d’une vingtaine de spécialités pharmaceutiques sont commercialisées sous la forme de complexes du principe actif avec une cyclodextrine. La possibilité de « convoyer » un principe actif par les cyclodextrines vers une cellule cible ouvre de nouvelles perspectives dans le traitement de certains cancers. La parapharmacie et la cosmétologie mettent à profit les propriétés complexantes des cyclodextrines et les utilisent comme composants actifs de déodorants, pour la stabilisation et la diffusion contrôlée de parfums dans des articles de toilette.

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Les cyclodextrines forment des complexes avec une grande variété de substances chimiques qui relèvent du domaine agricole tels que les herbicides, insecticides, fongicides, répulsifs, phéromones et substances de croissance. Des résultats intéressants ont été obtenus dans la protection des agrumes et de l’avocatier contre les maladies cryptogamiques causées par Phytophtora, en stimulant les réactions de défense par application au collet des plantes d’une préparation d’un lipide éliciteur, l’acide arachidonique enrobé dans des cyclodextrines. L’inclusion, dans les cyclodextrines, d’insecticides pyréthroïdes permet leur stabilisation et améliore les possibilités d’utilisation de ces produits qui sont sensibles au rayonnement ultraviolet et à l’oxydation. Cette technique permet aussi de prolonger la diffusion de phéromones, comme celles qui jouent un rôle dans l’attraction sexuelle des insectes ravageurs des cultures, ce qui en facilite la destruction. Dans le domaine de l’environnement, il a été montré que la carboxyméthyl-β-cyclodextrine est capable de complexer des métaux comme le cadmium et des composés organiques toxiques tels que l’anthracène, le trichlorobenzène, le biphényl et le DDT (dichloro-diphényl-trichloréthane). Ainsi, les cyclodextrines peuvent augmenter la biodisponibilité des polluants par effet de solubilisation et faciliter ainsi leur dégradation par la microflore du sol. Cette propriété permet d’envisager leur utilisation en décontamination des sites pollués. Enfin, en chimie analytique et préparative, des cyclodextrines chimiquement liées à des supports solides (ex. le gel de silice, par l’intermédiaire d’une chaîne linéaire de 6 à 10 atomes de carbone) sont utilisées comme phase stationnaire pour la séparation d’énantiomères par chromatographie liquide à haute performance en modes phase normale ou phase inverse.

1.10. MÉTHODES D’ANALYSE La structure chimique très hétérogène des glucides végétaux (variation qualitative et quantitative des monosaccharides constitutifs et/ou des types de liaisons dans le cas des oligo- et polysaccharides et la diversité des groupements non-glucidiques lorsqu’ils sont présents…) nécessite le recours à toute une panoplie de techniques chimiques et instrumentales pour sa détermination.

1.10.1. EXTRACTION La préparation des glucides, qu’elle soit au niveau du laboratoire ou dans un but de production industrielle, débute par leur extraction de la matrice qui les contient. À l’échelle du laboratoire, l’extraction à partir des tissus végétaux est généralement précédée de l’élimination des substances interférentes comme les lipides et les lignines. L’extraction des glucides solubles (oses et holosides à petites molécules et fructosanes) se fait habituellement à l’aide d’un alcool (éthanol à 80° ou méthanol) bouillant. L’eau froide en macération pendant plusieurs jours extrait de plus les gommes, les mucilages, les composés pectiques et les tanins 5. L’eau bouillante ou les acides minéraux dilués permettent d’extraire les composés précédents plus l’amidon tandis que la cellulose est extraite par des solutions alcalines diluées ou les acides minéraux concentrés. 5

pour des compléments d’information, voir Les tanins sur le site web dédié

1 - LES GLUCIDES

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L’extraction est suivie d’étapes de purification et de fractionnement afin de séparer le glucide désiré des composants non-glucidiques comme les protéines et des autres molécules.

1.10.2. PURIFICATION La purification des polysaccharides met souvent en œuvre une précipitation (parfois en plusieurs cycles) par addition d’un alcool hydrosoluble comme l’éthanol (au laboratoire) ou le 2-propanol (en industrie). Actuellement, la méthode de choix pour séparer des glucides est la chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Cette technique permet de séparer les oses et oligosides de degré de polymérisation (DP) ≤ 12, grâce à des phases susceptibles de supporter de hautes pressions, dans un temps court et avec une bonne résolution. Les propriétés chimiques et physiques des divers oses, diholosides et triholosides ne diffèrent que très peu. La séparation des glucides par CLHP repose donc sur les différences de conformation, de configuration et de mode de liaison, et est plus difficile que les analyses des autres classes de composés. Aucune colonne ou méthode de CLHP ne permet, à elle seule, de séparer tous les glucides. La chromatographie d’affinité est aussi un outil précieux pour l’isolement des glucides, qu’ils soient libres ou conjugués à d’autres composants. Elle se fait habituellement à l’aide de lectines greffées sur divers supports chromatographiques (Sepharose, Ultrogel…).

1.10.3. IDENTIFICATION ET DOSAGE Parmi les très nombreuses méthodes de dosage des oses et oligosides neutres, les plus courantes sont les méthodes chimiques dont certaines ont été automatisées. Elles sont relativement rapides mais peu spécifiques. Ces méthodes chimiques reposent généralement sur la formation de produits de dégradation des glucides sous l’action des acides forts (ex. phénol sulfurique, orcinol sulfurique), en formant des chromogènes. Le mode de détection usuel, la réfractométrie, est peu sensible mais il est possible de réaliser une détection photométrique complémentaire après complexation chimique. L’amidon est dosé habituellement après hydrolyse acide, par une méthode polarimétrique qui n’est pas spécifique ou par voie enzymatique. Les polyosides pariétaux peuvent être dosés par plusieurs méthodes : X gravimétriques qui permettent, selon les cas, d'estimer les proportions respectives de cellulose, cellulose + lignine ou cellulose + hémicelluloses + lignine ; X de fractionnement par hydrolyses acides progressives qui permettent de caractériser les constituants des parois cellulaires selon leur solubilité dans les solutions acides ; X enzymatiques, consistant à isoler la paroi cellulaire par élimination successive de l’amidon (α-amylase), des protéines (pepsine, pancréatine) et des lipides (éthanol) ; X il existe aussi des méthodes d’analyse très fines de la paroi cellulaire qui permettent de déterminer sa teneur en chacun des oses constitutifs de la cellulose, des hémicelluloses

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

et des substances pectiques. Elles comprennent une hydrolyse acide des polyosides en oses et oligosides (DP ≤ 4), puis leur dérivatisation sous forme de dérivés volatiles. L’analyse des produits d’hydrolyse des polysaccharides se fait ensuite habituellement par chromatographie
TPVT
TFT
EJòÏSFOUFT
GPSNFT

DPVDIF
NJODF
$$.


DPMPOOF
DISPNBtographie en phase gazeuse (CPG), CLHP… La chromatographie sur colonne est souvent VUJMJTÏF
QPVS
EFT
BQQMJDBUJPOT
QSÏQBSBUJWFT

MB
$$.
FU
MB
$1(
TPOU
QBSUJDVMJÒSFNFOU
VUJMFT
dans les travaux analytiques. En CPG, les glucides sont analysés sous forme de composés silylés ou d’acétates d’alditols (fig. 1.24). Les esters méthyliques sont les plus utilisés à cet égard mais ce sont les esters poly-OUSJNÏUIZMTJMZM
5.4
RVJ
EPOOFOU
MFT
NFJMMFVST
résultats. Les pentosanes peuvent être déterminés après leur hydrolyse en pentoses. En conditions acides, ces derniers donnent naissance au furfural (voir fig. 1.17) qui est isolé du milieu réactionnel par distillation. Le furfural réagit avec l’orcinol-chlorure ferrique en donnant un complexe très coloré absorbant à 630 nm. O Ac = H

OH H

H H

H H

OH

H

CH2OAc OAc

O

HO HO

CH3

CH2OH

OH OH

BH3

HO

H

Ac2O

AcO

H

H

OH

H

OAc

H

OH

H

OAc

CH2OH

CH2OAc

Figure 1.24 - Obtention des acétates d’alditols BH3 : borohydrure, Ac2O : anhydride acétique

1.10.4. ANALYSE STRUCTURALE DES POLYSACCHARIDES L’analyse structurale d’une molécule ne peut être envisagée que si un degré de pureté acceptable est atteint. Diverses techniques spectroscopiques sont mises en œuvre en vue de la caractérisation des composés glucidiques dont les plus importantes sont la résonance magnétique OVDMÏBJSF
3./
FU
MB
TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF
4. 
%BOT
MF
DBT
EFT
QPMZTBDDIBSJEFT
MBOBlyse structurale nécessite l’utilisation conjointe de méthodes spectrales et de méthodes chimiques (hydrolyse, dérivatisation, dégradations contrôlées du polymère et de ses dérivés…). L’analyse structurale permet la détermination : X de la composition qualitative en monosaccharides, X des types de liaisons, X de la conformation des molécules (pyranose ou furanose),

1 - LES GLUCIDES

51

X des configurations anomériques (configuration de l’atome de carbone C-1 d’un aldose

ou de l’atome de carbone C-2 d’un cétose, la présence et de la position des substituants, X du degré de polymérisation/poids moléculaire. X de

Cette grande variabilité dans les structures a pour corollaire une certaine diversité dans les méthodes, mais on peut décrire une démarche générale. La détermination de la composition en monosaccharides débute par une hydrolyse acide. Les monosaccharides libérés sont déterminés, aussi bien qualitativement que quantitativement, par CLHP ou par CPG après leur conversion en dérivés volatiles, thermostables. Les liaisons sont déterminées par méthylation qui révèle leur position, la conformation des cycles et la nature des monosaccharides. Dans ces conditions, tous les groupes hydroxyles du polysaccharide sont convertis en éthers méthyliques. L’hydrolyse du polysaccharide complètement méthylé démasque les groupes hydroxyles impliqués dans des liaisons glycosidiques et les révèle sous forme libre (non-méthylée). La détermination des séquences de monosaccharides se fait plus aisément après dépolymérisation partielle du polysaccharide en oligosaccharides au moyen de glycosidases spécifiques et/ou hydrolyse acide. Les glycosidases se répartissent en deux catégories : X Les endoglycosidases coupent des liaisons glycosidiques intramoléculaires et libèrent ainsi des oligosaccharides dont la structure primaire peut être déterminée dans une seconde étape. Ces enzymes n’apportent toutefois que des informations très limitées sur la structure primaire des oligo- et polysaccharides. X Les exoglycosidases libèrent des monosaccharides en s’attaquant à l’extrémité non-réductrice des chaînes glycosidiques. En réalisant une dégradation récurrente des chaînes glycosidiques, ces enzymes permettent, non seulement, de contrôler si l’hydrolyse des oligosaccharides est totale et de déterminer la structure primaire de ces derniers, mais aussi de définir les anoméries α et β de la liaison des monosaccharides libérés.

1.10.5. GLYCOMIQUE Par analogie avec les termes de « génome » et de « protéome », le « glycome » caractérise l’ensemble des glucides des cellules, des tissus, des organes, des fluides… Plus formellement, le terme « glycome » englobe les familles moléculaires des glycoprotéines, des protéoglycanes, des glycolipides, des peptidoglycanes, des lipopolysaccharides et de tous les autres glycoconjugués synthétisés par l’organisme au cours de sa vie. Le terme « glycomique » est utilisé pour décrire les approches expérimentales intégrées pour étudier la structure et le fonctionnement des glycomes. La glycomique est née de la nécessité d’élucider les mécanismes qui sous-tendent les interactions responsables de ces activités. La glycomique fonctionnelle est définie comme étant l’étude systématique des interactions des glycanes avec d’autres macromolécules biologiques, souvent à l’aide de technologies modernes.

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La glycoprotéomique, étude des glucides attachés aux protéines, est considérée comme une branche de la protéomique et est souvent étudiée en combinaison avec d’autres modifications post-traductionnelles. La glycomique et la glycoprotéomique représentent des champs émergents de l’ère post-génomique et se développent activement à la suite de la révolution de la protéomique. La glycoprotéomique structurale s’attache à résoudre plusieurs problèmes inhérents à la nature des glycoprotéines : X les séquences de ces protéines, X la présence de ponts disulfure, X les sites de glycosylation, X la nature des glycanes attachés à chaque site de glycosylation (peut être > 50), X l’assemblage, la configuration anomérique, la ramification et la séquence de chaque glycane. La glycomique complète la génomique (pour l’ADN) et la protéomique (pour les protéines). Il est clair que le glycome varie avec les espèces, les types de cellules, le stade de développement et les conditions environnementales. Si la caractérisation des génomes, transcriptomes et protéomes a connu des avancées importantes, l’analyse des modifications post-traductionnelle ainsi que le répertoire des glucides (glycome) d’un organisme sont insuffisamment connus et exploités. Il y a plusieurs raisons à cela : X La structure ramifiée des oligosaccharides augmente considérablement leur complexité et donc la difficulté à déterminer leurs séquences comparées à celles des polynucléotides et des polypeptides qui sont linéaires. X La microhétérogénéité des oligosaccharides, qui a souvent une signification biologique, complique leur caractérisation par rapport aux polynucléotides et aux polypeptides qui ont des structures primaires uniques. X La biosynthèse des glucides n’est pas sous contrôle génétique direct, il n’existe aucune méthode pour l’amplifier comme la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour les acides nucléiques et des systèmes d’expression (PCRq) pour les protéines. Ainsi, jusqu’à tout récemment, la seule façon d’obtenir des quantités suffisantes d’un polysaccharide spécifique a été de l’isoler de sources naturelles. X Les méthodes de synthèse spécifiques d’oligosaccharides accusent un certain retard sur les méthodes de synthèse des polynucléotides ou des polypeptides. Cela est dû à la ramification des oligosaccharides, leur grand nombre de groupes fonctionnels qui doivent être protégés de façon différentielle lors des réactions d’élongation et la nature chirale des liaisons glycosidiques. X La complexité du glycome d’un organisme dépasse largement celle de son protéome en raison de la diversité de ses constituants et des types d’interactions entre ces derniers et les protéines. -B
HMZDPNJRVF
VUJMJTF
VO
ÏWFOUBJM
EF
UFDIOPMPHJFT
UBC

QBSNJ
MFTRVFMMFT
MB
4.
RVJ
KPVF
un rôle central car c’est la méthode de choix pour élucider les structures primaires de

1 - LES GLUCIDES

53

glycopolymères. Sa très haute sensibilité, associée à la capacité de caractériser les composants individuels au sein d’un mélange complexe, sont les caractéristiques principales EF
MB
4.
QBSUJDVMJÒSFNFOU
EÏUFSNJOBOUFT
EBOT
MB
SFDIFSDIF
FO
HMZDPNJRVF Tableau 1.4 - Techniques mises en œuvre pour la détermination structurale des glycanes Donnée structurale Composition Topologie Conformation

Techniques mises en œuvre 4.
$-)1
&$ 4.
$-)1
&$
3./ 3./
39
4.

Dynamique

3./
%.

Interactions

RX

-ÏMVDJEBUJPO
TUSVDUVSBMF
JNQMJRVF
MVUJMJTBUJPO
EF
MB
3./
BWFD
MFT
BNÏMJPSBUJPOT
SÏDFOUFT
au niveau de la sensibilité. -B
3./
FU
MB
EJòSBDUJPO
EFT
rayons X (RX) permettent de déterminer les caractérisUJRVFT
USJEJNFOTJPOOFMMFT
EF
HMVDJEFT
DPNQMFYFT
&O
TPMVUJPO
-B
3./
FTU
MB
NÏUIPEF
de choix pour étudier la conformation, à travers des paramètres tels que les déplacements chimiques, la mesure de temps de relaxation, les effets Overhauser nucléaires et les constantes de couplage. Les autres techniques d’analyse des glycanes sont fondamentalement semblables à celles utilisées en protéomique : l’électrophorèse capillaire (EC) et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem
$-)14.O
FU
la bioinformatique. La chromatographie d’affinité utilisant des lectines comme ligands est utilisée pour analyser les sites de glycosylation et les séquences de glycanes attachées BVY
QSPUÏJOFT
-B
EZOBNJRVF
NPMÏDVMBJSF
%.
FTU
ÏHBMFNFOU
NJTF
Ë
DPOUSJCVUJPO
QPVS
l’étude structurale des molécules de glycanes. Comme son nom l’indique, elle est utilisée, non seulement pour l’étude de la structure de ces macromolécules, mais également et surtout pour obtenir des informations sur les fluctuations et modifications structurales impliquées dans leur rôle physiologique. Une bibliothèque de glycanes est constituée d’une série de divers glucides ou de leurs dérivés obtenus par synthèse organique, synthèse enzymatique ou isolement de sources naturelles. En dehors de son utilisation comme échantillons étalons pour l’analyse structurale, une bibliothèque de glycanes pourrait servir à l’examen approfondi des interactions en combinaison avec la technologie des puces, qui tend à devenir un outil de recherche puissant pour la glycomique car elle permet aux chercheurs d’identifier les oligosaccharides très facilement et rapidement par correspondance spectrale. Plusieurs bases de données glycomiques sont en cours d’élaboration, et le nombre de séquences de glycane stockées dans ces bases augmente grâce à l’amélioration des techOPMPHJFT
EF
TÏRVFOÎBHF
Ë
IBVUEÏCJU
EFT
HMVDJEFT
DPNNF
MB
4.

54

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

L’une des avancées récentes qui a grandement accéléré la recherche en glycomique est le développement de puces glucidiques pour identifier les glucides qui se lient spécifiquement à une protéine particulière, à l’ARN ou à la surface des cellules. Cette technologie, analogue à celle des puces à ADN, utilise un très grand nombre d’oligosaccharides différents qui sont immobilisés de manière covalente ou physiquement à des sites spécifiques sur une surface solide comme une lame de verre recouverte d’une surface réactive (ex. nitrocellulose) à l’aide d’un robot. Une protéine fluorescente marquée, un ARN ou un type de cellule est ensuite incubé en présence de la puce qui est ensuite rincée, et les oligosaccharides auxquels la protéine, l’ARN ou la cellule se lie sont identifiés par fluorescence à leurs positions correspondantes. En dehors de leur utilisation en recherche fondamentale, les puces glucidiques ont été employées dans des applications aussi diverses que l’identification d’agents pathogènes, le diagnostic de maladies caractérisées par la présence de certains oligosaccharides et l’élaboration de vaccins et de médicaments à base de glucides.

2 - LES PROTIDES 2.1. INTRODUCTION Sous le nom générique de protides, on inclut les protéines, des substances de nature protéique telles que les enzymes, les acides aminés, et tous les composés donnant par hydrolyse un ou plusieurs acides aminés. Les peptides englobent les produits (naturels ou synthétiques) formés par l’union de plusieurs acides aminés et dans lesquels la liaison, dite peptidique (–CO–NH–), a lieu par perte d’une molécule d’eau entre un groupement aminé d’une molécule et un groupement carboxylique d’une autre (fig. 2.1) : O H3N

CH

C

O

R2 O–

+

H+

N

H H

R1

CH

COO –

H3N H2O

CH

C

R1

R2 N

CH

COO –

H

liaison peptidique dans un dipeptide

Figure 2.1 - Formation d’une liaison peptidique R1 et R2 représentent les chaînes latérales de deux acides aminés.

On distingue des di-, tri-, tétra- et polypeptides selon le nombre de molécules d’acides aminés entrant dans leur combinaison. Les protéides incluent tous les autres protides qui se subdivisent en holoprotéides, qui ne donnent par hydrolyse que des acides aminés, et en hétéroprotéides, qui contiennent en outre, des éléments non-protidiques de nature variable (ex. glycoprotéines associées à des glucides ; phosphoprotéines contenant de l’acide phosphorique ; lipoprotéines associées à des lipides ; chromoprotéines associées à des pigments ; nucléoprotéines associées à un acide nucléique). Les protides sont constitués essentiellement de quatre éléments : le carbone, l’oxygène, l’hydrogène et l’azote, mais peuvent contenir aussi d’autres éléments tels que le phosphore, le soufre…

2.2. ACIDES AMINÉS Les acides aminés sont des éléments azotés constitutifs de toutes les protéines, caractérisés par une chaîne (de nature variable) portant au moins une fonction carboxylique sur le

56

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

carbone terminal et une fonction amine sur le carbone asymétrique (sauf pour la glycine) selon la formule générale (fig. 2.2) : H H2N

atome de carbone ()

C*

COOH groupement carboxylique

groupement aminé R chaîne latérale

Figure 2.2 - Formule générale d’un acide aminé R représente une chaîne latérale variable qui différencie les acides aminés les uns des autres.

2.2.1. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES Du point de vue stéréochimique, la molécule possède au moins un atome de carbone asymétrique (C*) en α du groupe carboxyle. Elle est donc chirale et peut présenter deux énantiomères. Près de 300 acides aminés naturels ont été isolés et identifiés mais seulement une vingtaine sont des composants des protéines naturelles (voir tab. 2.1). Ils sont tous sous la forme de L-stéréoisomère. Les acides aminés peuvent s’assembler deux par deux, en libéSBOU
VOF
NPMÏDVMF
EFBV
*MT
GPSNFOU
BMPST
VO
EJQFQUJEF
.BJT
MF
QMVT
TPVWFOU
JMT
TBTTPcient en chaînes ou polypeptides. Si les chaînes sont très longues, les polypeptides sont appelés protéines. Ce sont les proportions relatives de chacun d’eux, leur ordre d’enchaînement (séquence), leur agencement dans l’espace qui confèrent à une protéine donnée ses propriétés biologiques, nutritionnelles et/ou fonctionnelles particulières. Ils sont solubles dans les solvants polaires tels que l’eau et l’alcool mais insolubles dans les solvants apolaires tels que l’éther, l’hexane ou le benzène. Les acides aminés ont deux types de groupements ionisables. Au pH isoélectrique (variable selon l’acide aminé), ils prennent la forme d’ion dipolaire ou ion mixte (fig. 2.3) : R

CH

COOH NH3+

milieu acide

R

CH

COO – NH3+

pH isoélectrique (pHi)

R

CH

COO – NH2

milieu basique

Figure 2.3 - Ionisation des acides aminés selon le pH du milieu Certains acides aminés, de structure plus complexe, comportent soit deux fonctions amines et une fonction acide (acides aminés basiques), soit deux fonctions acides et une fonction amine (acides aminés acides). On connaît aussi des acides aminés soufrés (fréquents chez les Brassicacées), hétérocycliques, aromatiques…

2 - LES PROTIDES

57 Tableau 2.1 - Acides aminés constitutifs des protéines

Chaque acide aminé est désigné par un nom trivial et un nom systématique. Nom/abréviation

Nom systématique

Formule

Acides aminés neutres (un groupe aminé et un groupe carboxylique) glycine/Gly, (G)

acide aminoacétique

alanine/Ala, (A)

acide α-aminopropionique

CH3–CH(NH2)–CO2H

valine/Val, (V)

acide α-aminoisovalérique

(CH3)2–CH–CH(NH2)–CO2H

leucine/Leu, (L)

acide α-aminoisocaproïque

(CH3)2–CH–CH2–CH(NH2)–CO2H

isoleucine/Ile, (I)

acide α-amino-β-méthyl-n-valérique

phénylalanine/Phe, (F)

acide α-amino-β-phénylpropionique

tyrosine/Tyr, (Y)

acide α-amino-β-(p-hydroxyphényl) propionique

sérine/Ser, (S)

acide α-amino-β-hydroxypropionique

HOCH2–CH(NH2)–CO2H

cystéine/Cys, (C)

acide α-amino-β-mercaptopropionique

HSCH2–CH(NH2)–CO2H

thréonine/Thr, (T)

acide α-amino-β-hydroxy-n-butyrique

CH3–CHOH–CH(NH2)–CO2H

NÏUIJPOJOF.FU
.

acide α-amino-γ-methylthio-n-butyrique

tryptophane/Trp, (W)

acide α-amino-β-indolpropionique

CH2(NH2)–CO2H

CH3–CH2–CH(CH3)–CH(NH2)–CO2H CH2 –CH(NH2)–CO2H

HO

CH2–CH(NH2)–CO2H

HSCH2–(CH2)2–CH(NH2)–CO2H CH2–CH(NH2)–CO2H N H

Acides aminés neutres (un groupe aminé et un groupe carboxylique) H2C

proline/Pro, (P)

acide pyrrolidine-α-carboxylique

asparagine/Asn, (N)

acide 2-aminosuccinique 4-amide

glutamine/Gln, (Q)

acide 2-aminoglutaramique

CH2

H2C

N H

CHCO2H

NH2CO–CH2–CH(NH2)–CO2H NH2CO–(CH 2)2–CH(NH2)–CO2H

Acides aminés acides (un groupe aminé et deux groupes carboxyliques) acide aspartique/Asp, (D)

acide α-aminosuccinique

HO2C–CH2–CH(NH2)–CO2H

acide glutamique/Glu, (E)

acide α-aminoglutarique

HO2C–(CH 2)2–CH(NH2)–CO2H

Acides aminés basiques (deux groupes aminés et un groupe carboxylique) arginine/Arg, (R)

acide α-amino-δ-guanidino-n-valérique

MZTJOF-ZT
,

acide α, ε-diaminocaproïque

histidine/His, (H)

acide α-amino-β-imidazolepropionique

NH2 HN=C–NH–(CH2)3–CH(NH2)–CO2H

NH2–(CH 2)4 –CH(NH2)–CO2H CH2–CH(NH2)–CO2H HN

N

58

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

À ces acides aminés protéiques classiquement connus, est venu s’ajouter un autre acide particulier, incorporé durant la traduction, c’est la sélénocystéine (en abrégé Sec) dans laquelle l’atome de soufre de la molécule de cystéine est remplacé par un atome de sélénium (fig. 2.4). Cet acide aminé est rencontré notamment chez le genre Allium (oignon, ail), mais aussi chez des bactéries où il fait partie de certaines enzymes comme la formate déshydrogénase et la glutathion peroxydase. HSe

CH2

CH NH3

COOH

Figure 2.4 - Sélénocystéine

La forme dipolaire peut, en milieu acide, accepter un proton (H+) sur le groupement COO – ; elle peut aussi en milieu alcalin, perdre un proton H+ du groupement NH3. L’acide aminé a donc un caractère amphotère.

APPLICATIONS Les acides aminés présentent des applications très variées, en particulier : hAlimentation humaine : par exemple, le monoglutamate de sodium est un exhausteur de goût utilisé en alimentation humaine pour atténuer les saveurs acides. Il est présent dans les tissus végétaux et animaux (champignons, blé, lait en sont particulièrement riches). Le glutamate est employé dans les potages déshydratés et en boîte, les plats surgelés ou préparés, les sauces… hLa demande de glycine, utilisée dans les aliments pour ses propriétés bactériostatiques, antioxydantes et émulsifiantes, d’alanine pour aromatiser les aliments et de cystéine pour améliorer la texture du pain, a aussi contribué au développement de leur production. hSupplémentation des rations alimentaires des animaux domestiques par des acides aminés présents en trop petites quantités dans la majorité des plantes consommées (méthionine, lysine). hCosmétologie : la cystéine est un revitalisant de la peau et des cheveux. hPharmacie : l’emploi des acides aminés est de plus en plus fréquent en thérapeutique. La glutamine et l’histidine sont utilisés dans les traitements des affections gastriques (ulcères) ; la citrulline et l’ornithine dans les affections hépatiques. hCertains sont utilisés pour leurs effets particuliers : la L-(3,4-dihydroxyphényl)-alanine ou L-DOPA est le précurseur (fig. 2.5) physiologique de la dopamine (3,4-dihydroxyphényl-éthylamine) qui est un neurotransmetteur ayant un rôle important au niveau du cerveau ; sa déplétion dans certaines régions du cerveau est la cause de la maladie de Parkinson. Par sa présence, elle atténue la rigidité et les tremblements des malades. La dopamine est présente naturellement dans la banane (Musa sapientum, Musacées), le genêt (Cytisus scorparius, Fabacées) et chez certaines algues (Monostroma fuscum). Elle se rencontre également chez l’Homme et les animaux, où elle joue un rôle de neurotransmetteur au niveau du cerveau. Il s’agit d’une molécule intermédiaire dans la synthèse des catécholamines (noradrénaline et adrénaline) (fig. 2.5). Elle possède des propriétés adrénergique, sympathomimétique et vassopressive. La dopamine a également une action antiprolactine. La 4-hydroxyisoleucine, acide aminé non-conventionnel isolé à partir des graines du fénugrec (Trigonella foenum-graecum L.), possède des propriétés insulino-stimulantes particulièrement intéressantes : il est capable de réguler la glycémie chez le rat. Cette molécule, qui n’existe ni

2 - LES PROTIDES

59

chez l’homme, ni chez l’animal, et dont les propriétés insulino-stimulantes ont été mises en évidence dès l991, a fait l’objet de plusieurs dépôts de brevet internationaux. Le mécanisme d’action de cette molécule antidiabétique est différent de celui des seuls agents insulino-stimulant utilisés actuellement dans le traitement de cette affection, les sulfonylurées. En effet, la 4-hydroxyisoleucine, en agissant sur les cellules β pancréatiques, stimule la sécrétion d’insuline uniquement lorsque la concentration en glucose du milieu augmente : elle permet ainsi d’éviter les accidents hypoglycémiques observés lors de la prise des sulfonylurées. CH3 HOOC

CH2

NH2

CH2

HO

CH2

NH2

CH2

OH dopa

HO OH dopamine

CH2

CHOH

CH2

CO2 HO

NH2

NH

CHOH

HO OH noradrénaline

OH adrénaline

Figure 2.5 - Voie de biosynthèse simplifiée des catécholamines hLes acides aminés peuvent également servir de matières premières pour la synthèse de produits

divers : peptides pharmaceutiques, agents chélatants (cystéine) et agents surfactants (acides aminés N-acylés) et édulcorants. Cette dernière catégorie est représentée par l’aspartame qui est un dipeptide (L-aspartyl-L-phénylalanine) dont le pouvoir sucrant est de près de 200 fois celui du saccharose qu’il remplace souvent dans les boissons et les aliments à basses calories. Méthodes de production La production industrielle des acides aminés fait intervenir diverses méthodes : hsynthèse chimique (méthionine) ; hextraction à partir des produits naturels (comme les farines de soja). C’est le cas de la tyrosine, la leucine, la cystéine… ; hsynthèse biochimique : t par culture microbienne : transformation, par un micro-organisme, d’une source de carbone en un acide aminé (acide L-glutamique, L-lysine, L-phénylalanine, L-thréonine, L-tryptophane, L-histidine, L-sérine, L-valine). Les matières premières utilisées pour la culture sont assez diverses : acide acétique, mélasse de canne à sucre ou de betterave. La culture se fait dans des réacteurs de grande capacité (60 à 300 m3). A la fin de la culture, les cellules bactériennes sont éliminées par centrifugation et l’acide aminé est purifié, soit par précipitation au point isoélectrique, soit par chromatographie d’échange d’ions. Dans le cas de la production d’acide glutamique (acide aminé produit à la plus grande échelle), des souches bactériennes de l’espèce Corynebacterium glutamicum ainsi que des souches génétiquement modifiées de l’espèce bactérienne Escherichia coli sont les micro-organismes les plus souvent utilisés ; t par bioconversion : transformation, par voie enzymatique, d’un précurseur en un acide aminé : acide L-aspartique (à partir du fumarate et de NH4+), glutamine (à partir du glutamate), L-tryptophane (indole + pyruvate + NH3), L-DOPA (à partir de la phénylalanine).

60

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

2.2.2. ACIDES AMINÉS INDISPENSABLES On désigne ainsi 8 des 20 acides aminés de base que l’organisme humain et les Vertébrés supérieurs ne peuvent pas synthétiser ou qu’ils synthétisent trop lentement par rapport aux exigences continues de la protéogenèse (tab. 2.2). L’histidine (qui ne figure pas dans cette liste) est dite semi-indispensable : elle est d’autant plus indispensable que la vitesse de croissance est plus rapide, comme chez le jeune enfant, mais devenant un acide aminé banal chez l’adulte. Les acides aminés indispensables doivent impérativement être fournis dans l’alimentation, et ce en quantité adéquate pour permettre la synthèse protéique nécessaire à la croissance mais également au renouvellement incessant des protéines de l’organisme. Les acides aminés indispensables interviennent à divers niveaux, notamment dans la synthèse de neurotransmetteurs cérébraux et dans le renouvellement des fibres musculaires. La carence en un seul des acides aminés indispensables a des répercussions plus graves, particulièrement chez le jeune enfant, qu’une restriction protéique globale. Une protéine aura donc une valeur biologique d’autant meilleure qu’elle apportera les acides aminés en proportions équilibrées et en particulier les acides aminés indispensables. Tableau 2.2 - Principales sources d’acides aminés indispensables Acides aminés

Sources

isoleucine

GSPNBHFT
Ë
QÉUF
EVSF
t
MBJU
t
MFWVSF
EF
CJÒSF
t TBVNPO
t
WJBOEFT
SPVHFT
t
WPMBJMMFT

leucine

CMBOD
EPFVG
t
GSPNBHFT
Ë
QÉUF
EVSF
t GPJF
EF
WFBV
t
MBJU
t
MÏHVNFT
TFDT
t
MFWVSF
EF
CJÒSF

lysine

GSPNBHFT
t
GPJF
EF
WFBV
t
MBJU
t
MÏHVNFT
TFDT
t MFWVSF
EF
CJÒSF
t
WJBOEFT
SPVHFT

méthionine

CMBOD
EPFVG
t
MBJU
t
MFWVSF
EF
CJÒSF
t QPJTTPOT
EF
NFS
t
WPMBJMMFT

phénylalanine

GBSJOF
EF
TPKB
t
GSPNBHFT
t
HSBJOFT
EF
$ÏSÏBMFT
t MBJU
t
MFWVSF
EF
CJÒSF
t
WPMBJMMFT

thréonine

GSPNBHFT
t
MBJU
t
MÏHVNFT
TFDT
t
MFWVSF
EF
CJÒSF
t TBVNPO
t
WJBOEFT
SPVHFT

tryptophane

CMBOD
EPFVG
t
GPJF
EF
WFBV
t
MBJU
t MFWVSF
EF
CJÒSF
t
WJBOEFT
t
WPMBJMMFT

valine

GSPNBHFT
t
MBJU
t
MÏHVNFT
TFDT
t MFWVSF
EF
CJÒSF
t
WJBOEFT
t
WPMBJMMFT

L’homme trouve quotidiennement les acides aminés indispensables dans le lait, la viande, le poisson et les œufs qui en sont riches mais en quantités plus ou moins importantes (tab. 2.2). Le riz est riche en certaines protéines ainsi que certains légumes (haricot, pois). Le maïs, le blé et le seigle sont des Céréales qui contiennent également des quantités notables de protéines végétales où l’on trouve certains acides aminés indispensables,

2 - LES PROTIDES

61

mais les Céréales comme les Légumineuses sont souvent déficitaires en un ou plusieurs acides aminés indispensables (en lysine et en méthionine respectivement). On ne peut donc pas parler de besoins absolus en acides aminés mais de besoins relatifs. Dans une alimentation normale, plusieurs protéines sont consommées à la fois et c’est l’ensemble des acides aminés qui en résulte qui sera utilisé pour les synthèses.

2.3. PROTÉINES 2.3.1. DÉFINITIONS Les protéines sont un groupe de composés organiques constitués d’une (ou de plusieurs) chaîne d’acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Si le nombre d’acides aminés est de 2, on parle de dipeptides. Un oligopeptide est constitué de 2 à 10 acides aminés. Les polymères constitués d’un nombre d’acides aminés allant jusqu’à 100 sont appelés peptides. Si ce nombre atteint 10 000 unités ou plus, on parle de polypeptides. Les protéines sont constituées d’un ou plusieurs polypeptides. Acides aminés $ peptides $ polypeptide(s) $ protéine

2.3.2. STRUCTURE Les protéines sont de formes physiques diverses selon leur organisation dans l’espace ou structure. Celle-ci elle est définie par quatre niveaux : X L’ordre d’enchaînement des acides aminés qui forment les chaînes peptidiques constitue la structure primaire qui donne à chaque protéine son caractère propre. Tout enchaînement d’acides aminés comporte nécessairement un acide aminé dit N-terminal porteur d’un groupe aminé libre et un acide aminé dit C-terminal porteur d’un groupe carboxyle libre. La cohésion de cette chaîne d’acides aminés est assurée par des liaisons peptidiques formées par la réaction entre ces groupes (voir fig. 2.1). Cette séquence est aujourd’hui bien connue pour de nombreuses protéines. X La structure secondaire correspond à la disposition dans l’espace de cette chaîne linéaire de base (en hélice α, en feuillets plissés…). Elle résulte de l’établissement de liaisons hydrogène, de ponts disulfures et de liaisons hydrophobes entre les groupements de la chaîne elle-même et qui confèrent à la molécule la plus grande stabilité possible. X La structure tertiaire résulte du repliement de la chaîne sous l’influence des interactions et des diverses liaisons intermoléculaires (ponts disulfures, interactions ioniques, liaisons hydrophobes, liaisons hydrogène et forces de Van der Waals) dans un espace tridimensionnel. Ce repliement lui confère une conformation unique dans l’espace. Elle est conditionnée à la fois par la séquence primaire, le contenu en acides aminés polaires et apolaires ainsi que le solvant. X La structure quaternaire n’intervient que lorsqu’il existe des associations spécifiques entre différentes chaînes polypeptidiques, semblables ou différentes, par des liaisons non-covalentes (liaisons hydrogène, interactions hydrophobes), pour aboutir à un

62

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

ensemble fonctionnel plus complexe. Ces chaînes prises isolément, ne possèdent pas d’activité biologique. Chaque chaîne polypeptidique élémentaire est appelée sousunité et l’on rencontre une grande variabilité dans leurs combinaisons possibles ; les formes les plus fréquemment rencontrées sont les dimères, les tétramères, les hexamères et les octamères. On réserve le nom d’oligomères aux protéines constituées d’un nombre limité de sous-unités, pour les distinguer des polymères dans lesquelles le nombre de sous-unités peut être très grand. La plupart des enzymes endocellulaires sont oligomériques. C’est, en définitive, la structure primaire qui détermine les autres structures. Le remplacement d’un acide aminé par un autre a donc des retentissements au niveau des autres types de structure.

2.3.3. MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES Après la traduction d’un ARN messager en protéine (c’est-à-dire après la synthèse du polypeptide), celle-ci subit une maturation post-traductionnelle au cours de laquelle des changements sont apportés à sa structure. Il peut s’agir, par exemple, de modifications des chaînes latérales ou de la formation de liaisons entre résidus (pontages). La protéine peut être associée à d’autres protéines ou à diverses molécules comme des glucides, par exemple (ce qui donne naissance à une glycoprotéine). De même, au cours de son transfert entre différents compartiments cellulaires, la protéine peut subir une série de transformations biochimiques la modifiant profondément, de telle sorte que la protéine finale est bien différente de la molécule préalablement codée par le gène. Dans 95 % des cas, la protéine finale a une structure plus ou moins modifiée par rapport à celle de la chaîne néo-synthétisée. Ces modifications ont un rôle biologique souvent crucial car elles contribuent à la régulation de l’activité de la protéine, ainsi qu’à sa localisation. Elles peuvent affecter les propriétés intrinsèques du polypeptide sur différents plans : conformation, stabilité, assemblage, activité, régulation, reconnaissance, transport, localisation, translocation… Les types de modifications biochimiques sont nombreux ; les plus connus sont : la formation de liaisons intra- ou intermoléculaires, la glycosylation, l’hydroxylation, la phosphorylation, la méthylation, la prénylation, la sulfatation, l’iodination, la carboxylation, l’acylation, l’ubiquination, l’excision d’un fragment par une peptidase…

2.3.4. DÉNATURATION La dénaturation est un phénomène physico-chimique se traduisant par une modification, plus ou moins importante, de la structure native tridimensionnelle (organisation structurale dans l’espace) d’une protéine (ou de tout autre macromolécule), par rupture de certaines liaisons faibles responsables des structures secondaire et tertiaire avec conservation de la structure primaire (donc sans rupture de la liaison peptidique). La destruction de la structure quaternaire empêche la protéine d’exercer sa fonction.

2 - LES PROTIDES

63

Elle peut être partielle (modification restreinte se traduisant par une baisse d’activité) ou totale, réversible (après suppression des agents qui l’ont provoquée) ou irréversible. Dans le cas des protéines, les forces qui stabilisent cette structure sont les liaisons hydrogène, les attractions électrostatiques et les interactions hydrophobes entre les chaînes latérales d’acides aminés. La dénaturation des protéines résulte en une diminution de leur solubilité (démasquage des groupes hydrophobes), une modification de leurs propriétés biologiques et fonctionnelles des protéines (ex. inactivation des enzymes) et une sensibilité accrue aux protéases. De ce fait, selon les cas et les fonctions que l’on souhaite lui voir remplir, la dénaturation d’une protéine doit être impérativement évitée (ex. pour le maintien d’une activité enzymatique, de propriétés immunologiques) ou au contraire, plus ou moins complètement réalisée (ex. pour l’augmentation de ses propriétés visqueuses, de son pouvoir gélifiant). La dénaturation d’une protéine se produit sous l’action de facteurs variables dont les principaux sont résumés dans le tableau 2.3.

2.3.5. DIVERSITÉ ET FONCTIONS BIOLOGIQUES Suivant leur origine botanique et leur fonction physiologique dans la plante, les protéines végétales se caractérisent par une très grande diversité de structures et de propriétés physico-chimiques. Les protéines se présentent donc sous des aspects physiques différents (ex. protéines fibreuses, globulaires). Elles sont parfois capables de s’associer à d’autres constituants (tab. 2.4). Elles peuvent se trouver en solutions, en solutions colloïdales ou rester sous forme insoluble (ex. gluten, globulines…). Les solutions colloïdales de protéines précipitent par addition d’un électrolyte. Dans la cellule végétale, on distingue : X Les protéines solubles, en solution colloïdale ou insolubles, suivant les milieux dans lesquels elles se trouvent, assurent à ces derniers leur stabilité (propriétés tensioactives), leur homogénéité et leur texture grâce à leurs propriétés épaississantes, liantes, gélifiantes… Au niveau cellulaire, des protéines hydrosolubles sont présentes dans le cytosol, dans le stroma des chloroplastes, dans la matrice mitochondriale et dans le nucléoplasme. L’une des plus importantes par son rôle d’enzyme essentielle dans la fixation du dioxyde de carbone lors de la photosynthèse et des plus abondantes est la ribulose bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO). Localisée dans les chloroplastes, elle représente 40 à 80 % des protéines foliaires totales solubles du soja, de la luzerne et de la plupart des Céréales. X Les protéines insolubles, de poids moléculaire généralement élevé (ex. extensine de la paroi cellulaire), constituent la trame moléculaire de base du hyaloplasme, des structures nucléaires, de la substance fondamentale ou stroma des mitochondries et des chloroplastes. Associées à des lipides, elles participent à l’architecture de tous les systèmes membranaires : plasmalemme, réticulum endoplasmique, enveloppe nucléaire, appareil de Golgi, membranes interne et externe des mitochondries et des plastes.

64

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE Tableau 2.3 - Principaux agents dénaturants des protéines

Nature

Facteur incriminé Effets

chaleur

t

BHSÏHBUJPO
EF
QSPUÏJOFT
øPDVMBUJPO
FU
EÏOBUVSBUJPO
JSSÏWFSsible, par rupture des liaisons faibles qui stabilisent la conformation de la protéine. C’est le facteur le plus souvent impliqué, la thermosensibilité des protéines variant suivant de nombreux facteurs : nature et concentration de la protéine, pH, présence de certains facteurs protecteurs…

froid

t
JOBDUJWBUJPO
EFO[ZNFT t
BHSÏHBUJPO
FU
QSÏDJQJUBUJPO t
EJTTPDJBUJPO
EPMJHPNÒSFT
PV
SÏBSSBOHFNFOU

radiations

t

DBQUBUJPO
EFT
SBEJBUJPOT
VMUSBWJPMFUUFT
QBS
MFT
BDJEFT
BNJOÏT
aromatiques, avec par exemple rupture des ponts disulfure t

GPSNBUJPO
EFTQÒDFT
DIJNJRVFT
USÒT
SÏBDUJWFT
SBEJDBVY
libres) susceptibles d’altérer la structure de la molécule (fragmentation de la chaîne peptidique, agrégation, modification d’acides aminés…) sous l’effet des radiations ionisantes (rayons X, rayons γ…)

traitements mécaniques

t

EÏOBUVSBUJPO
QBS
FYFNQMF
EFT
IÏMJDFT
Ⱥ
TPVT
VOF
BHJUBUJPO
prolongée ou forte ou sous l’action des ultra-sons t

TVSDIBVòF
EF
MhFYUSBJU
FU
EÏOBUVSBUJPO
TPVT
MFòFU
EVOF
homogénéisation ou d’une centrifugation

acides et bases

t

EÏOBUVSBUJPO
TPVT
MFòFU
EFT
Q)
FYUSÐNFT
BDJEFT
PV
BMDBMJOT
en modifiant les charges des groupements ionisables, créant des répulsions électrostatiques intramoléculaires très fortes, d’où déplissement de la protéine

détergents

t

EÏOBUVSBUJPO
GSÏRVFOUF
EFT
QSPUÏJOFT
EF
GBÎPO
JSSÏWFSTJCMF
sous l’action des détergents anioniques (ex. dodécylsulfate de Na, sarkosyl) en créant des interactions avec des molécules d’eau et la rupture de nombreuses liaisons faibles intramoléculaires, d’où un déplissement, et un démasquage de zones hydrophobes qui se tournent alors vers l’extérieur

agents physiques

agents solvants chimiques organiques

t

EÏTUBCJMJTBUJPO
QBS
NPEJöDBUJPO
EFT
JOUFSBDUJPOT
IZESPQIPCFT
par la plupart des solvants organiques (alcool, acétone)

oxydants et réducteurs

t

GPSNBUJPO
EF
MJBJTPOT
EJTVMGVSFT
TPVT
MFòFU
EFT
PYZEBOUT
(ex. oxydation des cystéines en cystines) alors que les réducteurs (ex. dithiothreitol, β-mercaptoéthanol) les coupent

sels et ions

t

BDDÏMÏSBUJPO
EFT
SÏBDUJPOT
EhPYZEBUJPO
EFT
QSPUÏJOFT
TPVT
l’effet de certains ions métalliques

agents chaotropiques

t

GSBHJMJTBUJPO
EFT
MJBJTPOT
IZESPHÒOF
FU
BDDSPJTTFNFOU
EF
MB
solubilité des chaînes latérales apolaires lorsque des agents comme le perchlorate de lithium, l’urée, le chlorure de guanidine sont utilisés à concentrations élevées

2 - LES PROTIDES

65

X Les protéines globulaires, capables de se fixer ou de s’associer à d’autres éléments, sont

souvent douées d’activité biologique plus ou moins caractéristique de tel ou tel compartiment cellulaire (ex. enzymes, protéines de transport…). Dans les cellules, presque toutes les réactions chimiques sont catalysées par des enzymes. On en connaît, à ce jour, plus de 2000 types différents découverts dans les différents organismes vivants, chacun capable de catalyser une réaction spécifique. Ainsi, une enzyme qui hydrolyse le maltose est totalement inefficace envers la cellobiose. Ceci explique, par exemple, pourquoi les ruminants digèrent la cellulose alors que l’homme en est incapable. Certaines de ces protéines doivent leur activité à un groupe prosthétique (coenzyme). X Les protéines de réserve, protéines majeures sans activité biologique, généralement de poids moléculaire élevé et plus ou moins solubles. Les organes de dissémination (bulbes, graines, tubercules) de nombreuses plantes mettent en réserve des protéines nutritives qu’elles mobilisent dès les premiers stades de la germination. Ces réserves assurent l’autonomie des organes dispersés à l’occasion de leur réactivation (conditions favorables). Cette diversité d’aspects, d’associations, de solubilités…, se traduit par des différences importantes de propriétés fonctionnelles naturelles qui font des protéines les constituants chimiques les plus importants des organismes vivants, présentes dans toutes leurs cellules et dans tous les liquides biologiques. Pour croître, entretenir ses divers tissus et assurer le bon fonctionnement de ses divers organes comme celui de son système de défense, l’organisme animal doit synthétiser toute une panoplie de protéines. Pour satisfaire cette nécessité, il doit consommer des aliments protéiques, issus à la fois du monde animal et du monde végétal. Les protéines doivent constituer 15 % de la ration calorique totale, soit 1 g de protéines par kg de poids et par jour. Tableau 2.4 - Principales classes de protéines, selon leur composition protéines simples (holoprotéines)

BMCVNJOFT
t
HMPCVMJOFT
t
HMVUÏMJOFT
t
IJTUPOFT
t
QSPMBNJOFT

protéines conjuguées (hétéroprotéines)

DISPNPQSPUÏJOFT
t
øBWPQSPUÏJOFT
t
HMZDPQSPUÏJOFT
t
MJQPQSPUÏJOFT
t
NÏUBMMPQSPUÏJOFT
t
OVDMÏPQSPUÏJOFT
t
QIPTQIPQSPUÏJOFT
t
porphyrinoprotéines

2.3.5.1. PROTÉINES DE RÉSERVE Les protéines végétales se trouvent en quantités plus ou moins importantes dans les tubercules (ex. pomme de terre), certaines racines (ex. manioc), les feuilles (ex. luzerne) mais elles sont le plus souvent extraites des graines des protéagineux (pois, féverole, haricot, lentilles, lupin…), des oléagineux (soja, arachide, colza, tournesol…) ou de Céréales. Ces dernières couvrent la moitié des besoins protéiques dans l’alimentation humaine et animale, malgré une composition déficitaire en acides aminés essentiels. Le manque de lysine dans les Céréales peut être compensé par celle présente dans les Légumineuses.

66

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Une protéine présente dans une graine en quantité supérieure à 5 % est considérée comme une protéine de réserve. Chez les végétaux, ces protéines de réserve qui sont d’une grande importance, tant pour la plante elle-même au moment du développement de l’embryon lors de la germination que pour l’alimentation humaine ou animale, constituent dans la cellule des graines de nombreux éléments figurés, appelés corpuscules protéiques ou grains d’aleurone, dont la forme et la structure sont souvent caractéristiques d’une espèce donnée. Chez les Légumineuses, les protéines de réserve sont principalement constituées de globulines (60 à 90 %) et de prolamines (10 à 20 %) ; certaines espèces contiennent, en outre, une fraction gluténines (< 15 %) (fig. 2.6). albumines protéines de réserve

globulines

gluténines

prolamines gliadines

 gluten

Figure 2.6 - Principales classes de protéines de réserve chez les plantes 1SPMBNJOFT
FU
HMVUÏOJOFT
EPNJOFOU
DIF[
MFT
.POPDPUZMÏEPOFT
$IF[
MFT
(SBNJOÏFT
(Poacées), par exemple, elles atteignent respectivement la proportion de 40-60 % et de 20-40 % du total des protéines de réserve. Ces deux types de protéines se distinguent par leur solubilité et leur composition en acides aminés : les prolamines sont solubles dans l’alcool à 70 % en présence d’agents réducteurs et sont riches en proline et en glutamine. Les gluténines sont solubles dans des solutions alcalines ou acides diluées et renferment une forte proportion d’acide glutamique. Les prolamines ont reçu des appellations en rapport avec la Céréale dont elles sont extraites. Ainsi, les prolamines majoritaires du blé, de maïs, de seigle, de l’avoine et d’orge sont appelées respectivement, gliadine, zéine, sécaline, avénine et hordéine. Elles sont synthétisées une dizaine de jours après la pollinisation et s’accumulent uniquement dans l’albumen. La régulation de l’expression de leurs gènes est essentiellement transcriptionnelle. Contrairement aux globulines qui sont constituées de protéines de réserve de la graine, les prolamines regroupent la plupart des protéines qui présentent une activité biologique. Ainsi, dans le cas des Légumineuses, cette fraction est constituée d’enzymes (lipoxygénases, uréase, amylase), de lectines (hémagglutinines) et d’inhibiteurs d’enzymes (facteurs antitrypsiques). Les graines de soja présentent une teneur plus élevée que celles des autres Légumineuses en hémagglutinines et en facteurs antitrypsiques.

APPLICATIONS ALIMENTAIRES ET INDUSTRIELLES En technologie alimentaire, les propriétés fonctionnelles des protéines sont exploitées, selon les cas, pour maîtriser et adapter l’hydratation, la texture, la viscosité, l’arôme, l’homogénéité et la stabilité des aliments élaborés (tab. 2.5). Les protéines purifiées de soja et de pois (viciline), par exemple, sont des agents tensioactifs remarquables. Ces protéines à l’état natif ont un pouvoir moussant important et conduisent à des mousses et des émulsions stables. Aux concentrations comprises entre 8 et 14 %, les globulines de

2 - LES PROTIDES

67

soja gélifient après traitement thermique (80-85 °C, 30 min) puis refroidissement (4 °C, 60 min). Les propriétés gélifiantes de la glycinine varient selon les variétés de soja et la fermeté du gel semble liée à la proportion de certaines sous-unités. La β-conglycinine gélifie dès 70 °C. Après refroidissement, la structure du gel est plus dense et le gel plus ferme. La napine (albumine de réserve du colza) présente une bonne capacité moussante et permet de générer des mousses très stables. Tableau 2.5 - Exemples d’utilisation des protéines Traitement

Domaine d’utilisation

Traitement

Domaine d’utilisation

émulsifiants

QSPEVJUT
MBJUJFST
t
QÉUÏT

concentration

alimentation humaine

extrusion

alimentation humaine

coagulation

QIBSNBDJF
t
DIJNJF
mOF
t BMJNFOUBUJPO
t
BDJEFT
BNJOÏT WFSOJT
t
UFYUJMFT
BSUJmDFMT
t pharmacie alimentation animale

gluten

boulangerie

filage

alimentation humaine

protéines « gluten »

alimentation animale (aviculture)

acylation

fixation d’acides gras

gélifiants

conserves de viandes

hydrolyse traitement chimique

Les principales qualités nutritives et technologiques des farines dépendent des protéines de réserve qui, dans le grain de blé, par exemple, sont constituées principalement de gliadines et de gluténines. Les premières sont des molécules monomériques (30-75 kDa) divisées en quatre sousgroupes, α-, β-, γ-, et ω-gliadines selon leurs mobilités électrophorétiques. Par contre, les gluténines forment des structures polymériques suite à l’établissement de liaisons disulfures intermoléculaires. Elles sont divisées en deux groupes d’après leur mobilité électrophorétiques sur un gel de polyacrylamide-SDS : gluténines à haut poids moléculaire (G-HPM) et gluténines à bas poids moléculaire (G-BPM), reliées également par des ponts disulfures. La qualité de la cuisson de la pâte à pain est basée principalement sur la composition qualitative et quantitative des G-HPM et des G-BPM et des gliadines. L’interaction des gliadines et des gluténines, en présence d’eau, aboutit à la formation d’une masse cohérente, insoluble et viscoélastique, le gluten. Ce dernier favorise également la rétention du dioxyde de carbone produit durant la fermentation des sucres par la levure. Ces propriétés sont très largement mises à profit dans la panification et les autres industries céréalières mais aussi lorsque l’on ajoute le gluten dans des formulations alimentaires diverses pour ses propriétés texturantes et adhésives. De plus, les propriétés nutritionnelles de ces protéines permettent d’accroître et de mieux équilibrer la valeur alimentaire des produits diététiques. Par contre, l’ingestion de gluten est aussi la cause de la maladie cœliaque, chez certains sujets prédisposés1. Les protéines végétales sont commercialisées sous forme de concentrats, d’isolats ou d’hydrolysats : hConcentrat : produit protéique issu de sources diverses (ex. concentrats de soja, de pois…). Il se caractérise par : t sa teneur moyenne en protéines qui, selon son origine, peut varier entre 45 et 85 % maximum, t son mode d’obtention. Son enrichissement en protéines est obtenu par l’élimination des composants non-protéiques de la matière première (ex. élimination des lipides, des sucres, des matières minérales) et non par extraction sélective directe comme pour les isolats. 1

pour des compléments d’information, voir La maladie cœliaque sur le site web dédié

68

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Au point de vue nutritionnel, les concentrats sont presque entièrement exempts de facteurs antitrypsiques et autres facteurs antinutritionnels du fait du processus de fractionnement utilisé (acides, température…). hHydrolysat : mélange de molécules de taille plus ou moins importante (ex. polypeptides, oligopeptides, acides aminés) résultant de l’hydrolyse des macromolécules complexes (protéines, polysaccharides…) par actions d’agents chimiques (acides, alcalis) ou d’agents biologiques (enzymes). Au plan nutritionnel, l’hydrolysat présente des avantages certains par rapport à la macromolécule dont il est issu ; étant beaucoup plus facilement assimilable, il sert très souvent dans la fabrication de préparations alimentaires destinées à des malades souffrant de troubles digestifs. Au plan des propriétés fonctionnelles, les hydrolysats ont souvent des qualités gustatives particulières, d’où leur emploi en tant que renforçateurs de goût. Certains d’entre eux (ex. hydrolysat de protéines de soja) ont également des pouvoirs émulsifiants accrus mais leurs capacités gélifiantes sont atténuées sinon détruites. hIsolat : produit protéique issu de sources diverses (ex. soja, pois…), se caractérisant par : t une teneur élevée en protéines (de 80 à 95 %), t son mode d’obtention. Sa richesse en protéines est obtenue par extraction sélective de celles-ci à partir du milieu plus ou moins complexe dans lequel elles se trouvent. L’isolement des protéines végétales est rendu difficile par leurs liens étroits avec les autres composants non-protéiques. Cela nécessite d’avoir recours à diverses étapes d’extraction, de filtration ou de centrifugation, de purification et enfin de dessiccation. Au plan nutritionnel, toutes les protéines alimentaires végétales n’ont pas la même aptitude à satisfaire les besoins en azote et en acides aminés nécessaires à la croissance et l’entretien de l’organisme. Contrairement à la plupart des protéines animales, leur digestibilité par l’homme est moindre et elles sont déficientes en certains acides aminés indispensables. De plus, les protéines des protéagineux tout comme celles des oléagineux sont fréquemment associées à un bon nombre de facteurs antinutritionnels (ex. tanins, facteur antitrypsique, lectines…) – voire parfois toxiques – ce qui les rend non-assimilables pour l’homme et certains animaux (ex. tourteaux de soja). Pour être utilisables en tant qu’ingrédients alimentaires, ces protéines doivent impérativement être débarrassées de ces composants toxiques par traitement chimique ou thermique. Dans le cas d’un traitement thermique, il est nécessaire de porter la plus grande attention aux conditions opératoires si l’on ne veut pas induire les réactions de Maillard2, responsables de la diminution de la valeur nutritive de ces protéines. Le tableau 2.6 donne les principaux facteurs antinutritionnels et agents toxiques rencontrés chez les plantes. À noter encore que les Légumineuses fourragères renferment des facteurs, vraisemblablement des protéines solubles, qui provoquent la météorisation (gonflement de l’abdomen par accumulation de gaz). Cependant, certaines Légumineuses, comme le sainfoin, ne provoquent pas ce phénomène. 2

pour des compléments d’information, voir Les réactions de MAILLARD sur le site web dédié

2 - LES PROTIDES

69

Tableau 2.6 - Facteurs antinutritionnels associés aux protéines végétales Facteur

Plante

Principale action

Détoxification

phytates

Légumineuses

chélation d’éléments minéraux

solubilisation (eau, BDJEF
t
IZESPMZTF
Ë
l’aide de phytases

lipoxygénases

-ÏHVNJOFVTFT
t
pomme de terre

destruction de la vitamine A

traitement thermique (> 60 °C)

acide ascorbique oxydase

pois

oxydation de la vitamine C

traitement thermique

-galactosides

Légumineuses

agents de flatulence

solubilisation (eau, eau-alcool)

inhibiteurs trypsiques

IBSJDPUT
t
QPJT
t
TPKB
t
MV[FSOF

inhibition de la trypsine et de la chymotrypsine

traitement thermique

alcaloïdes

lupin

problèmes neurologiques MBUIZSJTNF
t action tératogène

solubilisation (eau, solvants apolaires, acide)

acides aminés toxiques (-cyanoalanine, acide diamiOPCVUZSJRVF
t
BDJEF
diaminopropionique)

gesse (Lathyrus sativus)

problèmes neurologiques MBUIZSJTNF
t
QSPCMÒNFT
métaboliques osseux

cuisson

hétérosides cyanogènes

NBOJPD
t
TPSHIP
t
goitrogène vesce

cuisson prolongée

tanins

haricots

astringent
BV
HPßU
t DPNQMFYBUJPO
EF
QSPUÏJOFT
t JOIJCJUJPO
EFO[ZNFT
t
antivitaminique

gossypol

coton

PFEÒNF
t
IÏNPSSBHJFT

addition de sulfate de fer (II)

glucosinolates

colza

HPJUSPHÒOF
t
DBSDJOPHÒOF
t altèrent le goût

solubilisation (eau, eau-alcool)

vicine et convicine

haricots

anémie hémolytique

traitement thermique

lectines

IBSJDPUT
t
QPJT

agglutination des HMPCVMFT
SPVHFT
t diminution de l’absorption

traitement thermique

saponines

QPJT
t
TPKB
t
luzerne

BNFSUVNF
t
IÏNPMZTF
t
complexation de protéines alimentaires

TPMVCJMJTBUJPO
FBV
t
traitement thermique

divers polyphénols

IBSJDPUT
t
GÒWFT
t
MV[FSOF
t
DPM[B
t
TPKB
t
UPVSOFTPM

solubilisation (eau, eau-alcool)

70

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

2.3.5.2. PROTÉINES MEMBRANAIRES Bien qu’elles représentent environ 1/3 des protéines totales d’une cellule typique et qu’elles jouent un rôle important dans de multiples processus biologiques, à peine 1 % des structures des protéines membranaires est connu comparé à plus de 45 000 structures de protéines solubles répertoriées dans les banques de données. La raison principale de ce paradoxe vient de la difficulté d’isoler ces protéines incorporées dans la bicouche lipidique des membranes biologiques. En effet, leur isolement ne peut être accompli que par l’utilisation d’un détergent, plus ou moins drastique, pour les solubiliser. Des centaines de types de détergents sont disponibles et leur choix est déterminé par leur capacité à extraire la protéine ciblée tout en préservant sa stabilité et sa pureté. Les protéines membranaires peuvent être classées en deux grands types (fig. 2.7) : X Transmembranaires : ce sont des protéines qui traversent complètement la membrane et dont les deux extrémités sont en relation directe avec, d’une part le milieu intracellulaire et, d’autre part, le milieu extracellulaire. Ce type étant le plus fréquent. L’extrémité N-terminale peut être orientée soit vers la face cytoplasmique, soit vers le milieu extracellulaire. Un cas particulier de protéines transmembranaires est celui où la même chaîne polypeptidique traverse plusieurs fois la membrane, en « serpentin ». Leur extraction nécessite la cassure de la membrane à l’aide d’un détergent fort, un solvant hydrophobe ou un agent chaotropique
FY
VSÏF
,4$/  X Périphériques : ce sont des protéines dont l’attache se fait à la superficie de la membrane, soit par des liaisons électrostatiques, soit par l’intermédiaire d’autres protéines membranaires. Elles sont donc orientées, soit vers l’intérieur de la cellule, soit vers l’extérieur. L’extraction de ces protéines se fait, en général, par simple augmentation de la force ionique ou par l’utilisation d’un agent chaotropique. L’intérieur et l’extérieur de la membrane sont différents en ce qui concerne leurs protéines. oligosaccharide

milieu extracellulaire

2 bicouche lipidique

membrane biologique

1 3

3 4

milieu intracellulaire

Figure 2.7 - Structure schématique d’une membrane biologique typique d’Eucaryote 1 : protéine transmembranaire, 2 : glycoprotéine portant un oligosaccharide dirigé vers le milieu extracellulaire, 3 : protéines périphériques situées vers l’intérieur de la cellule, 4 : protéine périphérique fixée sur une autre protéine membranaire

2 - LES PROTIDES

71

Les protéines membranaires peuvent avoir au niveau cellulaire des fonctions variées dont les plus importantes sont liées à leur localisation à la frontière entre deux milieux différents : X Récepteurs des hormones : lorsqu’ils sont situés sur la membrane, ils assurent le lien entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule. En se fixant spécifiquement à une hormone, ils transfèrent les messages qui déclenchent une réaction spécifique au niveau cellulaire, voire dans l’organe ou dans l’organisme entier. X Canaux ioniques : ce sont des protéines oligomériques dont les sous-unités sont assemblées de manière à former un canal traversant la membrane et que des ions spécifiques (Na+
,+, Ca2+, Cl–, principalement) peuvent emprunter, selon les besoins de la cellule. C’est donc un système régulé. X Transporteurs : contrairement aux canaux ioniques, les transporteurs assurent le transport de certains ions mais en utilisant de l’énergie (transport actif). Ainsi, les ATPases membranaires sont à la fois des enzymes et des transporteurs. L’activité enzymatique concerne soit l’hydrolyse, soit la synthèse des molécules d’adénosine-triphosphate (ATP). Le transport des ions de part et d’autre de la membrane constitue l’autre fonction des ATPases. L’énergie nécessaire à ce transport provient de l’hydrolyse de l’ATP en ADP. Il en existe plusieurs classes, selon l’une ou l’autre des activités enzymatiques et selon le type d’ion transporté. X Enzymes : les protéines kinases sont des enzymes impliquées dans l’activation d’autres protéines par phosphorylation. Elles sont elles-mêmes activées en se liant à des substances spécifiques. Chez les plantes, les principales réactions de la photosynthèse sont catalysées par des protéines membranaires, réunies en unités fonctionnelles, appelées « antennes collectrices », qui sont des composantes des photosystèmes ou unités photosynthétiques. Elles sont constituées de protéines particulières ayant la propriété d’établir des liaisons stables avec les pigments photosynthétiques. Elles sont responsables de la capture efficace des photons et elles transmettent l’énergie d’excitation au centre réactionnel. Ces antennes, incluses dans la membrane des thylakoïdes, constituent les complexes collecteurs de lumière (Light Harvesting Complex, LHC) dont les principales sont dénommées LHC I et LHC II. Ces protéines sont liées à la chlorophylle a et à la chlorophylle b dans des rapports variables. La LHC II est une protéine très abondante sur terre (seconde place derrière la RuBisCO). Sa structure fine a été établie par cristallographie aux rayons X.

2.4. MÉTHODES D’ÉTUDE DES PROTIDES 2.4.1. EXTRACTION L’extraction des acides aminés libres peut se faire, dans la plupart des cas, simplement à l’eau, puisqu’ils sont hydrosolubles. L’extraction des protéines est souvent plus délicate à réaliser que celle des lipides ou des sucres car leurs molécules ont des structures complexes, hétérogènes, parfois en association stable avec des polymères, ce qui impose de nombreuses contraintes.

72

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

En premier lieu, leurs structures natives sont difficiles à maintenir sans altération, plus ou moins importante, de leurs propriétés fonctionnelles. Risque d’oxydation, complexation avec les polyphénols, hydrolyse par les protéases endogènes et dénaturation physique (température élevée, notamment) ou chimique (certains solvants organiques, pH) sont autant de contraintes dont il faudra tenir compte, en les protégeant, lors de leur extraction. La première phase d’extraction des protéines peut se faire par différentes méthodes dont les plus courantes sont résumées dans le tableau 2.7. Tableau 2.7 - Méthodes d’extraction des protéines Méthode

Principe/procédure

lyse cellulaire

en mettant les cellules dans une solution hypotonique, on crée un choc osmotique qui, en permettant à l’eau d’entrer dans la cellule, la fait gonfler jusqu’à ce que les membranes se rompent et libèrent leur contenu dans le milieu

congélation-décongélation

des cycles de congélations (azote liquide) et de décongélations répétés brisent les membranes cellulaires

digestion enzymatique

l’action conjuguée et simultanée de cellulases et de pectinases désagrègent les parois pecto-cellulosiques et libèrent des cellules dénudées (protoplastes) qu’on peut faire éclater, par la suite, par simple choc osmotique

déchiquetage mécanique

les appareils utilisés coupent et cisaillent les tissus avec des lames rotatives tournant à grande vitesse. Cette technique est particulièrement utilisée pour des tissus trop fibreux, difficiles à homogénéiser autrement (feuilles, tiges, graines…)

broyage

divers dispositifs sont utilisés pour broyer le matériel biologique : mortier, potter manuel ou motorisé

lyse mécanique

des agents abrasifs (poudre de diatomée, sable siliceux, particules de céramique…) sont agités fortement en présence des cellules ou tissus qu'on veut lyser

décompression explosive

des cellules pressurisées au gaz (azote) sont brutalement décompressées pour briser les parois résistantes

traitement aux ultrasons

les ondes ultrasoniques causées par un générateur brisent les cellules et en libèrent le contenu

Quelle que soit la méthode d’extraction adoptée, la solution protéique doit être maintenue dans un tampon dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique, sels, antioxydants…). L’aptitude à l’extraction est très variable d’une protéine à l’autre. Elle dépend, notamment, de leur état et de la méthode d’extraction elle-même qui doit être choisie en fonction de l’objectif et du degré de pureté souhaité.

2 - LES PROTIDES

73

2.4.1.1. ETAT DE LA PROTÉINE Des protéines solubles (albumines, globulines) et des protéines insolubles (protéines membranaires, pariétales, habituellement engagées dans des liaisons avec des polyphénols) peuvent coexister dans un même extrait. Leur libération implique des traitements chimiques (par exemple, utilisation d’extractants spécifiques) ou enzymatiques. La précipitation par variation de la force ionique ou du pH doit prendre en compte la polarité de la protéine. Celle-ci dépend du nombre de groupes polarisés par rapport aux chaînes hydrophobes, ainsi que de la structure spatiale.

2.4.1.2. MÉTHODES D’EXTRACTION L’extraction peut être conduite selon l’une des deux approches suivantes :

Méthodes d’enrichissement Quatre étapes principales : X dispersion des différents éléments par traitement mécanique (concassage, agitation…) pour faciliter le fractionnement ; X traitement thermique (50 à 140 °C, durée variable) visant à solidifier une phase (thermocoagulation) ou, au contraire, à la fluidifier (fonte des graisses) ; X extraction proprement dite de la phase solide protéique, la phase liquide contenant les lipides fondus et l’eau, par pressage, filtration ou centrifugation ; X séchage pour éliminer l’eau et extraction solide-liquide des lipides.

Méthodes d’isolement L’isolement nécessite d’abord une mise en solution, puis une extraction par précipitation et extraction solide/liquide, une filtration en fonction de la taille moléculaire, une fixation sur un support « actif » puis une élution sélective. Trois paramètres doivent être pris en considération : X rendement (quantité de protéines extraites/quantité de protéines à extraire) souvent faible pour les protéines végétales (excepté le soja qui contient des globulines solubles) ; X sélectivité (degré de pureté et d’homogénéité, rarement recherché en industrie agro-alimentaire) ; X coût de l’extraction, en fonction de la vitesse (quantité de protéines/unité de temps) et de la concentration de l’extrait. À noter que le rendement et la sélectivité sont rarement compatibles. La mise en solution est le plus souvent effectuée par voie chimique ou, dans certains cas, par voie enzymatique. Cette deuxième méthode est coûteuse et son emploi est limité à certaines protéines. La solubilisation par voie chimique fait intervenir au moins trois facteurs : pH, force ionique et température : X pH : son choix dépend du pHi de la (ou des) protéine(s) désirée(s). L’extraction est souvent meilleure à pH légèrement alcalin ;

74

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

X force

ionique : effet positif marqué sur la solubilité à proximité du pHi, effet négatif aux pH extrêmes. Certaines protéines membranaires peuvent être solubilisées dans des conditions relativement douces ; par exemple, à l’aide d’une solution de force ionique ÏMFWÏF
/B$M

.
 X température : les températures basses sont souvent préférées (moins dénaturantes, elles limitent le développement microbien). Dans le cas des protéines membranaires ou pariétales, il est nécessaire d’ajouter au milieu d’extraction un détergent ionique doux (ex. SDS dilué) ou neutre (Triton X-100, Nonidet) pour les libérer. Les débris cellulaires sont séparés par centrifugation ; la phase soluble est recueillie et soumise à divers traitements. L’extrait ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par filtration ou centrifugation, pour éliminer les grosses particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée.

2.4.2. SÉPARATION ET PURIFICATION Que le but soit analytique ou préparatif, les mêmes principes généraux et les mêmes équipements s’appliquent à la séparation des acides aminés et des protéines. En préalable à toute séparation préparative d’un mélange quelconque, un essai analytique sur le même mélange est réalisé en vue de mettre au point les conditions d’une bonne séparation ultérieure.

2.4.2.1. ACIDES AMINÉS Un système de fractionnement, complètement automatisé, permet de séparer, d’identifier et de doser quantitativement tous les acides aminés d’un hydrolysat protéique en 2 à 4 h. Les acides aminés en solution acide sont déposés sur la colonne échangeuse d’ions, de sorte que tous soient d’abord retenus sous forme R–NH3+. On réalise ensuite un gradient d’élution où le pH et la force ionique augmentent peu à peu. Les acides aminés sont élués les uns après les autres et mélangés automatiquement à la ninhydrine (qui réagit avec leurs fonctions NH2) à la sortie de la colonne puis le tout est conduit à un bain marie où la réaction colorée a lieu. L’intensité de la coloration (absorbance) est lue grâce à un colorimètre à 570 et 440 nm. Cette dernière longueur d’onde est utilisée pour déceler uniquement la proline et l’hydroxyproline. Le chromatogramme apparaît sur un enregistreur qui peut être combiné à un intégrateur des surfaces sous les pics. L’ensemble des opérations est automatisé dans les appareils spécialisés appelés « auto-analyseur d’acides aminés » dont la sensibilité est de l’ordre de 10 nanomoles d’acides aminés.

2.4.2.2. PROTÉINES La séparation des protéines fait appel à diverses techniques qui permettent d’éliminer la majorité des impuretés présentes dans un extrait : précipitation différentielle, dialyse, centrifugation, séparation par chromatographie… La précipitation des protéines est un phénomène physique dû à l’agrégation de leurs molécules. Elle se produit au sein d’un milieu liquide lorsque les protéines qu’il contient ont été rendues insolubles par floculation.

2 - LES PROTIDES

75

Elle peut se faire de différentes manières : X par précipitation isoélectrique : chaque type de protéine a un pHi caractéristique qui détermine son comportement en solution : à ce pH, elle a un minimum d’attrait pour l’eau du milieu dans lequel elle se trouve et donc une solubilité moindre. Cette capacité d’hydratation minimale peut entraîner sa floculation et par suite, sa précipitation presque totale. Dans un milieu protéique complexe, cette particularité est utilisée pour effectuer l’extraction sélective d’un type donné de protéine ; X à l’aide de solvants organiques : limitée à l’utilisation de l’acétone et de l’alcool éthylique ; X à l’aide de polymères (ex. polyéthylène glycol, PEG) ; X par coprécipitation avec des agents adsorbants, puis élution : les sels minéraux neutres comme le sulfate d’ammonium conviennent bien. Ajouté en solution très concentrée ou à l’état solide, il diminue la quantité d’eau disponible pour solvater les protéines et provoque leur précipitation ou relargage. La précipitation différentielle au sulfate d’ammonium est l’une des méthodes qui se prêtent le mieux à de gros volumes. C’est pourquoi on l’utilise très souvent immédiatement après l’homogénéisation pour se débarrasser de la majeure partie des contaminants. La purification se poursuit habituellement par une ou plusieurs techniques chromatographiques dont il existe une très grande diversité de combinaisons phase stationnaire-phase mobile, aptes à résoudre pratiquement tous les cas, mettant à contribution diverses propriétés physico-chimiques des protéines (tab. 2.8). À cette universalité, les techniques chromatographiques ajoutent en plus une plus grande sensibilité et, souvent, une bonne précision, permettant d’obtenir des protéines parfaitement pures dont on peut ensuite étudier l’activité chimique et/ou biologique. Tableau 2.8 - Caractéristiques des principales méthodes chromatographiques utilisées pour la purification des protéines Méthode chromatographique*

Critère de séparation

Résolution

taille moléculaire

faible

chromatographie d’adsorption

polarité

moyenne

chromatographie d’interaction hydrophobe

polarité

moyenne

solubilité

moyenne

charge électrique

moyenne

spécificité biologique

très élevée

différent selon le type de phases

très élevée

chromatographie d’exclusion moléculaire

chromatographie de partition chromatographie d’échange d’ions chromatographie d’affinité chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

* Pour chacune de ces méthodes, il existe de nombreuses combinaisons de phase stationnaire-phase mobile

Habituellement, dans les premières étapes de purification, on utilise des techniques adaptées à la manipulation de gros volumes mais ayant une faible résolution. Ensuite, au fur et à mesure des étapes, on utilise des techniques de plus en plus spécifiques qui sont

76

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

souvent applicables à des préparations de volume réduit. Le choix d’une technique est donc aussi déterminé par la quantité d’échantillon à traiter. -B
DISPNBUPHSBQIJF
TVS
DPVDIF
NJODF
$$.


MB
DISPNBUPHSBQIJF
HB[MJRVJEF
MB
DISPNBtographie liquide haute performance (CLHP), la chromatographie d’affinité, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, l’électrophorèse capillaire et la focalisation isoélectrique nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées. Les chromatographie d’exclusion moléculaire et d’échange d’ions sont plus polyvalentes et peuvent être appliquées à des volumes d’échantillon plus volumineux (échelle industrielle) tout en ayant un assez bon pouvoir de résolution. La complexité de la matrice initiale exige presque toujours l’utilisation de procédures à étapes multiples pour l’obtention d’une grande pureté. Le succès d’une telle procédure, apprécié en fonction de la pureté, de la récupération du produit actif, de la durée totale du processus et de son coût, dépend principalement de l’efficacité de la stratégie de purification adoptée. En effet, l’obtention d’une récupération totale est rarement atteinte par les méthodes individuelles de séparation, moins il faut d’étapes différentes, meilleure est la récupération. Le nombre d’étapes de purification et le temps d’exposition dépendent tous deux du pouvoir de résolution atteint. Ainsi, la CLHP assure une meilleure résolution et des durées d’expérimentation plus réduites que les méthodes classiques sur gels mous (Sephadex, Sépharose…). Cela est particulièrement important lorsque l’on traite des protéines labiles qui ne supportent pas les durées d’exposition trop longues.

2.4.3. CARACTÉRISATION La caractérisation des acides aminés ou des protéines fait partie intégrante de nombreux domaines tels que la biochimie analytique, structurale, métabolique, clinique et alimentaire.

2.4.3.1. ACIDES AMINÉS Il existe des réactions caractéristiques basées sur la complexation des acides aminés avec des réactifs plus ou moins spécifiques : X Réaction à la ninhydrine et formation du pourpre de Ruhemann (fig. 2.8) dont l’absorption maximale se situe à 570 nm. Cette réaction est à la base d’un dosage quantitatif des acides α-aminés à des teneurs de l’ordre du μg.

OH + NH2 OH

2 O ninhydrine

O

O

O CH

COOH

R acide aminé

N O O complexe bleu-pourpre + RCHO + CO2 + 3 H2O

Figure 2.8 - Réaction de la ninhydrine avec les acides aminés

2 - LES PROTIDES

77

X Réaction

à la fluorescamine, réactif plus sensible formant un complexe avec les acides aminés tout comme les amines et pouvant déceler des nanogrammes d’un acide aminé.

Les réactions suivantes peuvent être également utilisées pour caractériser les protides : du biuret : l’addition de quelques gouttes de sulfate de cuivre à une solution contenant des protides en milieu alcalin génère un complexe bleu violacé caractéristique, absorbant à 540 nm (fig. 2.9). Cette réaction se produit aussi avec le biuret (NH2–CO–NH–CO–NH2) d’où son nom. Elle serait due à l’établissement de liaisons de coordination entre les ions Cu2+ et les liaisons peptidiques –CO–NH– de la molécule protéique. Elle se produit donc avec les chaînes polypeptidiques et également avec l’urée, les polyamides, les polyimides. Les acides aminés n’interfèrent pas.

X Réaction

NH R

NH

CH

CO Cu2+

protéine + Cu2+ CO

CH

NH

NH

R

complexe protéine-Cu2+ violet

bleu

Figure 2.9 - Complexation des ions cuivriques avec les liaisons peptidiques dans la réaction du biuret X Réaction

xanthoprotéique : elle permet de mettre en évidence des substances protidiques contenant les acides α-aminés, tyrosine et tryptophane. L’addition de l’acide nitrique à chaud à une solution protidique (introduction du groupe NO2 sur le noyau benzénique contenu dans les deux acides aminés précédents) provoque le virement de sa teinte au jaune orangé (fig. 2.10). NO2

NH2 HO

CH2

C H

tyrosine

COOH + HNO3

NH2 CH2

HO

C

COOH + H2O

H produit jaune

Figure 2.10 - Réaction xanthoprotéique X 3ÏBDUJPO
EF
.JMMPO

TPVT
MBDUJPO
EV
SÏBDUJG
EF
.JMMPO
TPMVUJPO
NFSDVSJRVF
EBOT
MBDJEF


nitrique concentré), les matières protéiques, contenant de la tyrosine, donnent un précipité rouge brique à l’ébullition. Les acides aminés peuvent être caractérisés par spectrophotométrie (certains absorbent dans l’ultraviolet à 230 nm et 280 nm), par séparation selon les procédés de chromatographie de partage sur papier, sur couches minces, sur colonnes, en phase gazeuse (après leur estérification) ou par électrophorèse.

78

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

2.4.3.2. PROTÉINES Les réactions générales précédentes peuvent être également utilisées pour caractériser les protéines. La séparation et la caractérisation des protéines se font le plus souvent, par électrophorèse mono- ou bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide ou par focalisation isoélectrique, méthodes fondées sur les propriétés électriques des protéines. La stratégie générale de détermination de la structure primaire comprend plusieurs étapes successives dont les principales sont : X séparation des chaînes peptidiques individuelles dans le cas d’une protéine oligomérique ; X détermination de la composition en acides aminés libérés par hydrolyse totale acide )$M

.

¡$

I


BMDBMJOF
/B0)

.

¡$

I
PV
FO[ZNBUJRVF
trypsine et/ou d’autres protéases). Cette détermination se fait habituellement au moyen d’un auto-analyseur automatique d’acides aminés ; X passage dans un séquenceur, automatique, qui permet de déterminer l’ordre des acides aminés à partir du résidu N-terminal, selon l’une des réactions suivantes : Z la méthode de dégradation récurrente (réaction d’Edman au phényl isothiocyanate) qui permet une libération d’un nouveau polypeptide, ayant un acide aminé de moins que le précédent, et l’acide aminé N-terminal sous forme de dérivé PTH (phénylthiohydantoïne de l’acide aminé séparé). On peut ainsi connaître de proche en proche la composition complète de la molécule. Cette technique a été automatisée ; Z la réaction de Sanger qui permet le repérage de l’acide aminé N-terminal par le dinitrofluorobenzène et la formation d’un dérivé, le dinitrophényl-acide aminé (voir fig. 2.11). L’hydrolyse de la protéine libère ensuite ce dérivé caractéristique et identifiable par chromatographie ou par électrophorèse. -B
TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF
4.
FTU
VOF
NÏUIPEF
TQFDUSPTDPQJRVF
QFSNFUUBOU
MBOBMZTF
des ions ou radicaux résultant de la fragmentation d’une molécule. Les fragments chargés électriquement sont séparés selon leur rapport masse/charge (m/z) après accélération et déviation par passage dans un champ magnétique. Les données obtenues à l’aide de ce procédé, sous forme de spectre de masse, font apparaître les différents types de fragments formés, ainsi que l’intensité de chaque raie (signal) qui est fonction du nombre d’ions du type correspondant. La détermination de la masse des fragments et leur comparaison avec les banques de données existantes permettent de reconstituer la structure de la molécule. Classiquement utilisée pour déterminer la masse moléculaire des corps organiques, MB
4.
QFSNFU
ÏHBMFNFOU
EF
EÏUFSNJOFS
MFVS
TUSVDUVSF
FU
EPOD
EF
MFT
JEFOUJöFS
%BOT
le cas des protéines, différentes techniques d’ionisation sont employées à cet effet et dont les principales sont : électronébulisation (ESI), bombardement par atomes rapides '"#


JPOJTBUJPO
QBS
MBTFS
-*


EÏTPSQUJPOJPOJTBUJPO
MBTFS
BTTJTUÏF
QBS
NBUSJDF
."-%*
FU
."-%*50'
50'

Time Of Flight ou temps de vol). Dans cette dernière technique, l’échantillon est co-cristallisé avec une matrice sur une plaque métallique. Cette matrice absorbe à la longueur d’onde du laser à azote, ce qui provoque le passage à l’état gazeux des

2 - LES PROTIDES

79

cristaux analyte-matrice et conduit à la formation des ions qui « volent » dans le tube de vol. La masse d’un ion est mesurée en fonction du temps que met cet ion pour arriver jusqu’au détecteur (les petits ions volent plus rapidement que les gros). Ce temps est alors converti en masse sur charge (m/z). O C

O2N

O CH

C

NH

CH

R2

NH2 + F

R1

2,4-dinitrofluorobenzène

O C

NO2

O2N

O C

CH

NO2

NH

CH

NH

R2

R1 dinitrophényl-peptide hydrolyse

O HO

C

O2N

O CH

R2 acide aminé

NH2 + HO

C

CH

NH

NO2

R1 dinitrophényl-acide aminé

Figure 2.11 - Principe de la réaction de Sanger La conformation (structures tertiaire et quaternaire) des protéines est obtenue principalement par la cristallographie par diffraction des rayons X et la résonance magnétique OVDMÏBJSF
3./
CJ
FU
USJEJNFOTJPOOFMMF
-B
QSFNJÒSF
FTU
FòFDUVÏF
TVS
EFT
DSJTUBVY
IZESBtés, la seconde sur des protéines en solution. -FT
BWBODÏFT
SÏDFOUFT
EBOT
MB
4.
POU
DPOEVJU
Ë
MBQQMJDBUJPO
EF
MJPOJTBUJPO
QBS
ÏMFDUSPOÏbulisation couplée à la chromatographie liquide ou à l’électrophorèse capillaire pour l’anaMZTF
EFT
QSPUJEFT
%FQVJT
TPO
JOUSPEVDUJPO
Ë
MB
öO
EFT
BOOÏFT

MB
4.
QBS
MB
NÏUIPEF
."-%*
B
DPOTUJUVÏ
MB
UFDIOJRVF
NBKFVSF
QPVS
MBOBMZTF
EF
QPMZNÒSFT
CJPMPHJRVFT
UFMT
RVF
les peptides, les protéines, les glucides et les oligonucléotides.

2.4.4. DOSAGE Le dosage des protéines peut être envisagé comme but en soi ou comme moyen de suivi de l’efficacité d’un protocole de purification de protéines. Dans ce dernier cas, il est effectué après chaque étape de purification. En fonction de la nature de la protéine d’intérêt, la méthode de dosage utilisée peut être simplement titrimétrique, colorimétrique, spectrophotométrique ou enzymatique, immunologique, biologique… La détermination de

80

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

la quantité totale de protéines est aussi nécessaire pour évaluer le rendement des différentes étapes de purification. Il existe de nombreuses méthodes de dosage, basées sur diverses caractéristiques spectrales ou réactionnelles des acides aminés constituant les protéines. Le choix d’une méthode dépendra, avant tout, des caractéristiques recherchées (précision, sensibilité, rapidité, possibilité de récupérer l’échantillon après dosage…), puis de la facilité de mise en œuvre ainsi que des conditions de dosage (ex. quantité de protéines à doser, présence de substances interférentes dans l’échantillon).

2.4.4.1. DOSAGE TITRIMÉTRIQUE Cette méthode consiste à mesurer la quantité d’azote organique total d’un échantillon. Selon la nature de l’échantillon analysé, il existe un facteur de conversion de l’azote total en protéines totales. Sa mise en œuvre nécessite deux étapes successives : une minéralisation de la matière organique suivie d’une titration
EF
MB[PUF
NÏUIPEF
EF
,KFMEBIM 

2.4.4.2. DOSAGES COLORIMÉTRIQUES La quantification des protides se fait, dans ce cas, par diverses réactions colorées, suite à la complexation des protéines avec certains réactifs (ex. ninhydrine, bleu de Coomassie, réactif de Folin-Ciocalteu…). Ces méthodes sont simples et ne nécessitent pas de moyens lourds mais l’inconvénient est que tous les acides aminés ne réagissent pas de la même manière à ces réactifs (ex. dans le cas de la ninhydrine, seulement 10 % de la proline est dosée dans les conditions standard). De plus, le développement de la réaction de complexation (et donc de la couleur) dépend souvent de la température et de la durée d’incubation. Il est donc nécessaire d’effectuer les dosages sur les témoins et les essais en parallèle et strictement dans les mêmes conditions opératoires pour avoir des résultats reproductibles. Dans de nombreux cas, les réactifs et les espèces chimiques, présents dans le tampon du milieu réactionnel, interfèrent avec le dosage. Dans la méthode de Lowry, basée sur la réaction du biuret (voir plus haut), la coloration est due à l’addition du réactif de Folin-Ciocalteu à la solution protéique en présence d’ions cuivre (sous forme de sulfate de cuivre). Il se forme alors un complexe d’acides phosphotungstique et phosphomolybdique de couleur bleue absorbant entre 720 et 750 nm. La couleur du mélange est stable après 10 min mais elle est sensible au pH (optimum entre 10 et 10,5). La méthode de Bradford, basée sur l’utilisation du bleu de Coomassie G250, est souvent préférée en raison de sa simplicité, de sa rapidité et présentant moins d’interférences que la méthode de Lowry. Le bleu de Coomassie (fig. 2.12), en réagissant avec les acides aminés basiques (notamment l’arginine) et aromatiques, forme un complexe stable par interactions non-covalentes absorbant à 595 nm. Certaines interférences observées avec la méthode de Lowry peuvent être évitées par l’utilisation de l’acide bicinchoninique. Ce dernier réagit avec les complexes de Cu2+ et de protéines de façon très similaire à la réaction du biuret. Il se forme alors des complexes qui prennent une couleur pourpre typique et stable. Cette méthode sensible et rapide

2 - LES PROTIDES

81

convient bien pour des concentrations de 0,1 à 1,2 mg/mL dans sa version standard et pour des concentrations de 0,5 à 10 μg/mL en version microméthode. La réaction n’est pas affectée par la présence de détergents comme le Triton, le SDS ou le Tween 20 jusqu’à une concentration de 1 %. C2H5 acides aminés basiques et aromatiques

+

H2C

N

CH3 C

C2H5 N +

CH2 SO3–

NaO3S NH complexe protéines - bleu de Coomassie bleu (abs max = 595 nm) OC2H5

Figure 2.12 - Réaction du bleu de Coomassie avec les protéines

2.4.4.3. MÉTHODES SPECTROPHOTOMÉTRIQUES Tous les acides aminés absorbent dans l’ultraviolet lointain (longueur d’onde inférieure à λ = 220 nm), ce qui a peu d’intérêt. Le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine ont un maximum d’absorption caractéristique à 278, 275 et 260 nm, respectivement. Le premier a une absorbance 4 fois plus importante que la tyrosine et 20 fois plus importante que la phénylalanine. Cette propriété est exploitée pour une évaluation quantitative des protéines à l’aide d’un spectrophotomètre UV à 280 nm, sans dérivatisation. Cette méthode non-destructive est relativement sensible (50-100 μg), simple et rapide, ce qui la rend particulièrement utile pour suivre l’élution des protéines lors d’une séparation chromatographique. Cette élution peut aussi se faire après dérivatisation (pré-colonne ou post-colonne) des acides aminés avec un réactif fluorescent ou absorbant les UV. Ce type de dosage peut sous-estimer la concentration réelle dans le cas de protéines contenant peu d’acides aminés aromatiques. Des interférences sont aussi possibles avec les acides nucléiques qui absorbent à une longueur d’onde très proche (260 nm). Le tableau 2.9 résume les principales méthodes d’étude des protéines.

2.4.5. PROTÉOMIQUE Le génome ne reflète pas fidèlement la structure et la diversité des protéines fonctionnelles à un moment donné puisque celles-ci subissent, après leur synthèse, des modifications post-traductionnelles susceptibles de les rendre totalement différentes de leur état d’origine. À la différence du génome qui est constant dans toutes les cellules d’une espèce donnée, le protéome est hautement spécifique de chaque type cellulaire.

82

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE Tableau 2.9 - Principales méthodes d’étude des protéines

Paramètre recherché

Méthode utilisée

poids moléculaire

t

ÏMFDUSPQIPSÒTF
TVS
HFM
EF
QPMZBDSZMBNJEF
FO
DPOEJUJPO
dénaturante (SDS) t

ÏMFDUSPQIPSÒTF
TVS
HSBEJFOU
EhBDSZMBNJEF
FO
DPOEJUJPO
non-dénaturante t
DISPNBUPHSBQIJF
EhFYDMVTJPO
NPMÏDVMBJSF t
TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF t
DFOUSJGVHBUJPO
EJòÏSFOUJFMMF

composition en acides aminés

t
TÏRVFOÎBHF

conformation

t
DSJTUBMMPHSBQIJF
BVY
SBZPOT
9 t
3./

purification

t
QSÏDJQJUBUJPO
QBS
EFT
TFMT
QBS
TPMWBOUT
PSHBOJRVFT
QBS
Q)J t
VMUSBöMUSBUJPO
TVS
NFNCSBOFT t
QBSUBHF
DPOUSF
TPMVUJPO
EF
QPMZNÒSF
1&(

t
ÏMFDUSPQIPSÒTF
QSÏQBSBUJWF
TVS
HFM
EF
QPMZBDSZMBNJEF t
GPDBMJTBUJPO
JTPÏMFDUSJRVF t
DISPNBUPHSBQIJF
TVS
EJòÏSFOUT
TVQQPSUT
FO
DPMPOOF

teneur en protéines [ ] = domaine de sensibilité

t
NÏUIPEF
EF
,KFMEBIM t
UVSCJEJNÏUSJF t
NÏUIPEF
EV
#JVSFU
t
BCTPSQUJPO
67
Ë

ON
t
OJOIZESJOF
t
NÏUIPEF
EF
-PXSZ
'PMJO$JPDBMUFV
t

CMFV
EF
$PPNBTTJF
#SBEGPSE
16 atomes de carbone). Les acides gras constitutifs sont généralement saturés. Ils sont présents aussi bien chez les animaux que chez les végétaux. Chez ces derniers, ils rentrent dans la composition d’un revêtement externe de la paroi cellulaire de l’épiderme de la tige, des feuilles et des fruits de certaines plantes, appelé cuticule, relativement imperméable à l’eau et aux gaz (rôle protecteur). Beaucoup d’huiles végétales renferment des quantités, plus ou moins importantes, de cires (tournesol, maïs, colza…) qui se solidifient et provoquent une certaine turbidité à cause de leur point de fusion élevé et parfois même à température ambiante. C’est le cas, notamment, des huiles extraites de graines dont les téguments sont riches en cires. La teneur en cires doit être réduite à moins de 10 ppm pour éviter un tel inconvénient.

3.4. LIPIDES COMPLEXES On distingue les phospholipides (contenant de l’acide phosphorique) et les glycosylglycérides ou glycolipides (liés à un ou plusieurs résidus glucidiques).

3.4.1. PHOSPHOLIPIDES Cette catégorie de lipides comporte deux grands groupes : les glycérophospholipides et les sphingolipides.

98

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.4.1.1. GLYCÉROPHOSPHOLIPIDES Ce sont des 1,2-diglycérides d’acides gras où la fonction primaire du glycérol en C-3 est estérifiée par l’acide phosphorique lui-même lié par une autre liaison ester, avec le groupement hydroxyle d’un second alcool pouvant être : l’éthanolamine, la choline, la sérine, le glycérol ou l’inositol ; les deux autres fonctions alcool du glycérol (en C-1 et C-2) étant estérifiées, chacune, par un acide gras (fig. 3.9). Ils dérivent de l’acide phosphatidique et sont désignés par le préfixe « phosphatidyl » suivi du nom de l’alcool. Par exemple, les principaux phospholipides des graines des Céréales sont la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), et la phosphatidylinositol (PI). Dans les huiles végétales, les deux phospholipides courants sont également les PE et les PC (appelées également céphalines et lécithines, respectivement). O CH2

O

C

O R1

1 CH2

O

O CH

O

C

O

P

R1

O R2

2 CH

O

C

R2

OH

OH CH2

C

OH

O

acide phosphatidique

3 CH2

O

P O

phosphatidyléthanolamine éthanolamine choline phosphatidylcholine sérine phosphatidylsérine phosphatidylglycérol glycérol inositol phosphatidylinositol glycérophospholipides

Figure 3.9 Nomenclature de quelques glycérophospholipides importants Les groupements R représentent les parties lipophiles des chaînes carbonées d’acides gras. Ils peuvent être différents ou identiques. La majorité des acides gras sont des acides gras à longue chaîne, saturée ou diversement insaturée.

Les glycérophospholipides sont les constituants majeurs des membranes de toute cellule vivante (plasmalemme, mitochondries, chloroplastes…) et jouent un rôle essentiel dans le maintien de leur intégrité. Les glycérophospholipides manifestent un comportement amphiphile à l’égard de l’eau. Leurs queues formées d’hydrocarbures sont hydrophobes, tandis que le groupement phosphate (porteur d’une charge négative à pH 7) et les molécules polaires (alcools) qu’ils portent forment une tête hydrophile miscible avec l’eau. Cette propriété explique l’organisation des membranes biologiques en bicouche lipidique : les têtes polaires sont tournées vers le milieu aqueux extracellulaire, les queues apolaires se font face (dirigées vers l’intérieur de la membrane) (fig. 3.10). La PC a été le premier phospholipide découvert. Il existe plusieurs PC différant par leurs acides gras. Les PC végétales renferment, à côté de la choline, soit des acides gras insaturés (tels que les acides oléique, linoléique, linolénique), soit un acide gras insaturé et un acide gras saturé (ex. acide stéarique).

3 - LES LIPIDES

99 têtes polaires

queues apolaires

Figure 3.10 - Organisation de la bicouche lipidique des biomembranes La PC constitue le substrat qui convient le mieux aux phospholipases A, C et D (voir fig. 3.28). Ces enzymes ont été utilisées pour mettre en évidence la distribution des acides gras dans les PC naturelles. On a ainsi pu montrer que, dans de nombreux cas, la position 1 du glycérol est occupée par des acides gras saturés et la position 2 par des acides gras insaturés. Les PC se trouvent dans certains aliments d’origine animale (jaune d’œuf, cœur de bœuf, produits laitiers…), mais elles abondent surtout dans les germes de Céréales, les huiles végétales pressées à froid où elles sont plus ou moins riches en acide gras insaturés. La PC du soja peut contenir jusqu’à 85 % d’acides gras polyinsaturés et surtout de l’acide linolénique (en moyenne, 57 %). Celle des huiles de noix, de noisette et de colza sont aussi riches en acide linolénique.

APPLICATIONS Les PC commerciales sont l’un des sous-produits les plus importants de l’industrie de transformation des huiles végétales en raison de leurs propriétés fonctionnelles et de leurs larges utilisations dans divers produits alimentaires. Elles sont généralement blanchies à l’aide de peroxyde d’hydrogène, avant ou après leur séchage. Le processus de dégommage de l’huile brute peut affecter la qualité des PC. En effet, la plupart des additifs employés pour faciliter le dégommage sont habituellement néfastes pour les PC. C’est l’agent tensioactif naturel le plus utilisé à grande échelle. Actuellement, le soja est la principale source de PC utilisée en industrie agro-alimentaire : margarinerie, chocolaterie, savonnerie… Les PC sont alors récupérées lors du dégommage à l’eau de l’huile de soja. Elles peuvent également être obtenues, de la même façon, à partir d’autres graines oléagineuses, telles que le maïs, le coton, l’arachide et le tournesol, mais la rentabilité est plus faible et la qualité moins bonne dans ce cas. Parmi les applications des PC de soja dans des produits alimentaires, on peut citer : hla complexation des protéines. La capacité à complexer les protéines de la farine (gluten) constitue la base de l’utilisation des PC dans le conditionnement de la pâte à pain. Les proportions habituellement utilisées varient de 0,25 à 0,6 % du poids de la farine ; hla complexation de l’amidon. La complexation des PC avec de l’amidon forment des vésicules ou des liposomes présentant d’excellentes propriétés contre le rassissement du pain ; hle substitut de jaune d’œuf. Les PC possèdent les mêmes caractéristiques émulsifiantes que le jaune d’œuf dans les gâteaux et d’autres produits alimentaires.

100

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.4.1.2. SPHINGOLIPIDES Les sphingolipides diffèrent des glycérophospholipides par le fait que leur structure comporte, à la place du glycérol, la sphingosine (ou une base apparentée), un alcool aminé à chaîne grasse en position 1, lié à un acide gras en position 2 par une liaison amide et la fonction alcool étant estérifiée en C-3 par l’acide phosphorique qui est uni par son autre liaison ester à des structures variées (choline, ou un ou plusieurs résidus osidiques) (fig. 3.11). Les premières classes de sphingolipides ont été nommées en faisant référence aux tissus d’où elles ont été isolées, en général des tissus neuraux comme les cérébrosides. Ensuite, on en a trouvé dans toutes les cellules eucaryotes et plus particulièrement dans les membranes de l’appareil de Golgi et des lysosomes. sphingosine HO

4

5

CH

CH

CH

CH

NH

OC

(CH2)12

CH3 liaison amide acide gras

OH CH2

O

P

monosaccharide

cérébroside

O

Figure 3.11 - Structure d’un cérébroside typique Chez les végétaux, la sphingosine est remplacée par un dérivé, la 4-hydroxydihydro-sphingosine ou 4-hydroxysphinganine qui ne diffère de la première que par l’absence de la liaison éthylénique en position 4.

3.4.2. GLYCOLIPIDES Ce sont des lipides membranaires qui prédominent dans les cellules végétales et dans lesquels les groupements de l’extrémité hydrophile sont constitués d’un mono- ou oligosaccharide, tandis que la partie hydrophobe est constituée d’un acylglycérol. Les glycosyl-diacylglycérols contiennent un sucre lié par une liaison glycosidique à l’hydroxyle en C-3 d’un diacylglycérol (fig. 3.12). Deux diacylglycérols dominent parmi les lipides végétaux : les galactosyl- et les quinovosyl-diacylglycérols qui se rencontrent dans toutes les formes de plastes. Le 1,2-di-O-acyl-3-O-β-D-galactopyranosyl-glycérol est le précurseur des galactosyl-diacylglycérols supérieurs formés par l’addition séquentielle de résidus galactopyranosyl au O-6 du précédent résidu. Ces galactosyl-lipides sont les glycosyl-diacylglycérols dominants chez les plantes. Cependant, le glucopyranosyl existe aussi dans les lipides végétaux, comme c’est le cas du 1,2-di-O-acyl-3-O-D-glucopyranosyl-glycérol dans le tégument du grain de riz. Les chloroplastes contiennent également des glycolipides sulfatés, porteurs d’un groupement sulfonique en position 6 (fig. 3.12).

3 - LES LIPIDES

101

Les glycosyl-diacylglycérols sont les lipides polaires (présence de résidus glucidiques dans leurs molécules) les plus abondants dans la nature. un groupement sulfonique (SO3–) peut être ajouté ici

un second galactose peut être ajouté ici

CH

6

4

HO

CH2

OH

HO

O

5

R1

R2

CH2 1

2 3

O

O

O

OH

Figure 3.12 - Structure d’un monogalactosyl-diacylglycérol R1 et R2 désignent des acides gras. La fixation d’un groupement sulfonique en position 6 donne un sulfonate anionique.

3.5. ISOPRÉNOÏDES Les isoprénoïdes partagent avec les autres lipides la propriété d’insolubilité dans l’eau et de solubilité dans les solvants organiques et se distinguent des autres classes de métabolites secondaires par leur origine commune. Leur unité structurale de base est l’isoprène ou 2-méthyl-1,3-butadiène : CH2=C(CH3)–CH=CH2. Ces unités sont assemblées d’abord en une chaîne insaturée qui est ensuite modifiée par oxydation, réduction ou élimination de carbone. Chez la majorité des plantes étudiées, le précurseur universel de tous les isoprénoïdes est l’acide mévalonique qui se forme à partir de l’acétyl-CoA (voir fig. 3.17). Une autre voie conduisant à la formation du pyrophosphate d’isopentényl mais passant par le 2-C-méthyl-D-érythritol-4-phosphate, a été établie chez diverses bactéries ainsi que chez une algue verte (Scenedesmus obliquus). Les isoprénoïdes constituent la plus grande famille de métabolites secondaires chez les plantes. Plus de 20 000 isoprénoïdes ont été isolés et caractérisés à l’heure actuelle et la liste ne cesse de s’agrandir, ce qui dépasse tout autre groupe de produits végétaux. On y inclut les huiles essentielles, les résines, les stéroïdes et des polymères comme le caoutchouc. Les petites molécules sont isolées principalement des plantes (où elles sont responsables de l’odeur caractéristique du géranium). Les molécules d’isoprénoïdes les plus grandes incluent le phytol (constituant de la chlorophylle), les caroténoïdes, le caoutchouc… et sont surtout abondantes chez les végétaux. Certains isoprénoïdes importants ont aussi été isolés de sources animales (ex. le squalène extrait de l’huile de foie de requin). L’extrême diversité des structures et des propriétés physico-chimiques confère aux isoprénoïdes des activités biologiques très variées. En plus de leurs vertus organoleptiques bien connues (substances odorantes, amères, colorées), de nombreux isoprénoïdes sont doués d’actions biologiques et pharmacologiques : laxatifs, antimitotiques, substances de croissance, vitamines…

102

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Au sens strict, on réserve le terme de terpènes (du nom de l’arbuste méditerranéen le térébinthe) aux hydrocarbures insaturés mais certains composés possédant des fonctions oxygénées, dans leurs groupes substitués (alcool, aldéhyde, lactone…) attachés au squelette de base, sont également considérés comme des composés terpéniques. Certains ont une structure acyclique, d’autres comportent un ou plusieurs cycles et une ou plusieurs doubles liaisons. De ce fait, le terme de terpènes devient inapproprié pour inclure ces composés ; le nom de terpénoïdes est plus générique et tend à remplacer la précédente appellation. Nous utiliserons donc l’une ou l’autre appellation, selon le contexte. Les autres dérivés comportant un noyau stérane sont appelés stéroïdes.

3.5.1. TERPÉNOÏDES La nomenclature utilisée a pour base une unité terpénique en C10 ; les différents terpénoïdes sont obtenus par l’addition de nouvelles molécules C5. Le tableau 3.5 résume la nomenclature adoptée pour les différentes classes de terpénoïdes. Les terpénoïdes inférieurs sont caractérisés par leur volatilité et leur odeur piquante intense. Tableau 3.5 - Nomenclature des différentes classes de terpénoïdes Nom

Précurseur

Localisation

C10 : monoterpénoïdes pyrophosphate de géranyle

IVJMFT
FTTFOUJFMMFT
t
QÏUBMFT

C15 : sesquiterpénoïdes pyrophosphate de farnésyle

IVJMFT
FTTFOUJFMMFT
t
SÏTJOFT
t
QÏUBMFT

C20 : diterpénoïdes

pyrophosphate de géranyl géranyl IVJMFT
FTTFOUJFMMFT
t
SÏTJOFT

C25 : sesterterpénoïdes pyrophosphate de géranyl farnésyl IVJMFT
FTTFOUJFMMFT
t
SÏTJOFT C30 : triterpénoïdes

squalène

SÏTJOFT
t
DJSFT
EFT
GFVJMMFT

C40 : tétraterpénoïdes

phytoène

UJTTVT
WFSUT
t
SBDJOFT
t
QÏUBMFT

Cn : polyterpénoïdes (n = 9 à 105)

pyrophosphate de géranyl géranyl MBUFY
t
DJSFT
EFT
GFVJMMFT

3.5.1.1. MONOTERPÉNOÏDES Ce sont des substances largement distribuées dans le règne végétal puisqu’elles constituent la majeure partie des huiles essentielles qui sont présentes en quantité appréciable chez 60 familles végétales soit environ 2000 espèces. Les monoterpénoïdes sont légèrement volatiles (d’où leur appellation d’huiles éthériques). Les monoterpénoïdes peuvent être linéaires (ex. myrcène), monocycliques (ex. menthol, limonène) ou bicycliques (ex. pinène) (fig. 3.13). La plupart de ces composés possèdent des centres asymétriques et sont donc optiquement actifs. Dans la nature, on ne retrouve fréquemment qu’un seul des stéréoisomères.

3 - LES LIPIDES

103

OH

menthol

myrcène

limonène

α-pinène

β-pinène

Figure 3.13 - Structures de quelques monoterpènes Les substituants figurés représentent des méthyles.

Parfois simplement formées dans le cytosol, ces huiles se rassemblent en gouttelettes ou s’accumulent dans les vacuoles des cellules épidermiques ou du mésophylle de nombreux pétales, ou encore dans des cellules oléifères. Quand la température est élevée, ces essences traversent la paroi cellulaire et la cuticule sous forme de vapeur (parfum de øFVST 
.BJT
TPVWFOU
EFT
DFMMVMFT
HMBOEVMBJSFT
MFT
ÏMJNJOFOU
BDUJWFNFOU
EBOT
EFT
DPNQBStiments intercellulaires ou les rejettent vers l’extérieur du végétal ; ex. le menthol (monoterpène monocyclique) émis par les poils sécréteurs de la menthe.

APPLICATIONS Les fonctions des monoterpènes sont multiples. Certains protègent les végétaux contre les insectes et les animaux, inhibent la croissance bactérienne et/ou fongique (usages thérapeutiques) et attirent les insectes pollinisateurs mais aussi les prédateurs des ravageurs par leurs composés aromatiques (limonène et géraniol, par exemple). Au contraire, d’autres sont toxiques pour les insectes. C’est le cas des pyréthroïdes des feuilles et des fleurs de certains chrysanthèmes (Chrysanthemum spp.). Ces composés neurotoxiques entraînent une hyperactivité, des mouvements désordonnés, voire la paralysie de l’insecte. Ils présentent l’avantage de se dégrader dans la nature et d’être dépourvus de toxicité vis-à-vis des Mammifères. Le myrcène, un des principaux monoterpènes de la résine des Conifères, est utilisé par certains insectes pour la production de phéromones. Le menthol, un des constituants de l’essence de menthe, est très utilisé dans les industries agro-alimentaire, pharmaceutique et cosmétique, pour son arôme. L’α-pinène, un des constituants de l’essence de térébenthine, constitue 20 % de la résine du pin. Il est utilisé comme solvant et pour synthétiser le camphre. Son isomère, le β-pinène, possède des propriétés antiseptiques.

3.5.1.2. SESQUITERPÉNOÏDES Constitués par assemblage de trois unités isoprènes, et donc de 15 atomes de carbone (fig. 3.14). Ils peuvent être acycliques (ex. farnésol), monocycliques (ex. acide abscissique, humulène) ou bicycliques (ex. cadinène, santonine). Ces deux derniers types sont les plus fréquents. D’autres structures peuvent être rencontrées comme des époxydes ou des lactones.

104

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE OH

CH2OH

CO2H

O

famésol

α-cadinène

acide abscissique O C

O O

H

OH

HO

H

O C

HO

OH

HO

OH

O

santonine

gossypol

Figure 3.14 - Structures de quelques sesquiterpènes Les substituants figurés représentent des méthyles.

APPLICATIONS Des dérivés du farnésol, présents chez plusieurs familles de plantes, manifestent des effets analogues à ceux de l’hormone juvénile principale des insectes : ils maintiennent l’état larvaire en bloquant la métamorphose de l’insecte en contact avec ces produits. Comme les monoterpénoïdes, les sesquiterpénoïdes jouent des rôles écologiques très importants. De nombreux sesquiterpénoïdes, principalement des lactones, sont considérés comme des agents protecteurs contre les herbivores. Ce sont des substances amères caractéristiques des plantes de la famille des Asteracées (chicorée, absinthe). On les trouve dans les poils glandulaires de certaines espèces comme le tournesol. Le gossypol (voir fig. 3.14), un dimère sesquiterpénoïque, est un autre exemple de composé protecteur, responsable de la résistance de certaines variétés de coton et des genres proches de Malvacées vis-à-vis de nombreux pathogènes (insectes, champignons et bactéries). Sa toxicité serait due à sa complexation avec des protéines ou des enzymes du tube digestif du prédateur, réduisant ainsi leur digestibilité ou leur activité. Les sesquiterpénoïdes des orchidées jouent un rôle dans l’attraction des insectes pollinisateurs. L’acide abscissique est une phytohormone présente entre autres dans les bourgeons et les graines en dormance. Certaines plantes (menthe poivrée, citron, basilic, sauge…) contiennent des mélanges de monoterpènes et de sesquiterpénoïdes, appelés huiles essentielles (voir chap. 4 Huiles essentielles), responsables de l’odeur caractéristique de leurs feuilles.

3 - LES LIPIDES

105

3.5.1.3. DITERPÉNOÏDES Les diterpénoïdes dérivent biosynthétiquement du géranyl géraniol. Ils peuvent être acycliques (ex. phytol de la chlorophylle), monocycliques (ex. vitamine A), bicycliques (ex. acide agathique), tricycliques (ex. acide abiétique), tétracycliques ou macrocycliques (fig. 3.15) et beaucoup de diterpénoïdes possèdent un système de cycles supplémentaires dans leur chaîne latérale ou sous forme de substitut ester.

HOH2C

HOH2C

phytol (constituant de la chlorophylle)

HOOC

HOOC acide agathique (Conifères)

vitamine A 20 H 11

H3C 2 3

HOOC H3C

18

acide abiétique (Conifères)

13

1

10 9 5

H CH3

6

16 15

CH3

17

CH3

structure moléculaire de base des gibbérellines

Figure 3.15 - Structures de quelques diterpènes importants

APPLICATIONS En général non-volatils et donc présents dans les résines, les diterpènes peuvent avoir de multiples fonctions et applications : hLe phytol se trouve sous forme estérifiée dans la structure de la chlorophylle. hLa vitamine A est nécessaire à la croissance et à la vision. Elle provient de la coupure oxydante du carotène (voir fig. 3.15 et 3.18). L’acide rétinoïque, obtenu par oxydation de la fonction alcool primaire de la vitamine A, est un agent antitumoral. hDe nombreux diterpénoïdes sont réputés comme étant des toxines vis-à-vis des herbivores. Les résines de plantes dont celles des Conifères et de certains arbres tropicaux appartenant à la famille des Fabacées, contiennent souvent des quantités importantes de diterpènes tels que l’acide pimarique et l’acide abiétique (voir fig. 3.15). Ce dernier est le constituant principal (80 %) de la résine de pin. Son utilisation principale est, entre autres, l’encollage du papier, ainsi que la préparation de vernis et de savons de blanchiment. hLes diterpènes de la résine du pin sont le facteur clé de la résistance au ravageur Dendroctonus frontalis.

106

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

hLes gibbérellines (voir fig. 3.15), classe d’importantes substances de croissance chez les végétaux,

de squelette ent-gibbérellane tétracyclique, dérivent des diterpénoïdes. Elles stimulent la croissance en longueur et les divisions cellulaires de certains tissus, entre autres actions. La première gibbérelline découverte le fut par Kurosawa en 1926 chez Fusarium heterosporum.

3.5.1.4. TRITERPÉNOÏDES Ils incluent une variété de composés en C30 de structures très apparentées, se trouvant à l’état libre (acide oléanolique) ou sous forme d’hétérosides (certains saponosides). Leur structure générale, tétra- ou pentacyclique (fig. 3.16), rappelle celle des stéroïdes dont ils ne diffèrent que très peu à tel point qu’il n’est pas aisé de faire la distinction entre ces deux groupes : pour beaucoup d’auteurs, une divergence au niveau biosynthétique (fig. 3.17) serait à l’origine de leur séparation. Les triterpénoïdes et les stéroïdes sont formés biosynthétiquement à partir de l’acétyl CoA par la même séquence de réactions jusqu’à l’obtention du squalène ; ce dernier étant le dernier intermédiaire commun dans cette voie de biosynthèse. 30 22

21

24

20 12 19 1 2

A 3

4

C 18

D

29

26

19

23

18

17

13

11

25

27 25

16

C 26

B

8

21

E 17

D

9 10

20

22 28

16

14 15

A

30

B

15 27

7

5 6

28

24

29

triterpène tétracyclique

23

triterpène pentacyclique

Figure 3.16 - Structure générale des triterpènes Les substituants figurés représentent des méthyles.

3.5.1.5. TÉTRATERPÉNOÏDES Constitués de molécules à 40 atomes de carbone, les tétraterpènes sont à l’origine des caroténoïdes (du grec karôten = carotte), composés biologiques importants, ainsi que des acides caroténoïdiques, moins nombreux et moins abondants. Ce sont des composants largement répandus, présents à la fois chez les végétaux et les animaux, mais ils ne peuvent être synthétisés que par les végétaux, les champignons et les bactéries. Chez les végétaux, on les rencontre surtout dans les fruits (citrons, pêches, abricots, oranges) et dans les légumes (tomates, carottes…). Dans les chloroplastes, les caroténoïdes et leurs dérivés hydroxylés, les xanthophylles (du grec xanthos = jaune et phyllon = feuille), jouent un rôle important dans la phase photochimique de la photosynthèse comme pigments accessoires au niveau des antennes collectrices de l’énergie lumineuse.

3 - LES LIPIDES

107

acétyl CoA (C2) + acétyl CoA (C2)

acétoacétyl CoA (C4) acétyl CoA acide mévalonique (C6)

pyrophosphate d’isopentényle (C5)

isomérisation

pyrophosphate de diméthylallyle (C5)

pyrophosphate de géranyle (C10) pyrophosphate d’isopentényle (C5) pyrophosphate de farnésyl (C15) duplication squalène

stéroïdes (C27)

triterpénoïdes (C30)

Figure 3.17 - Biosynthèse des triterpènes et des stéroïdes Cx désigne le nombre d’atomes de carbone de la molécule.

Plus de 700 caroténoïdes ont été identifiés. Leurs couleurs, jaunes, oranges, brunes ou rouges, sont dues à la présence dans leurs molécules d’un grand nombre de doubles liaisons conjuguées (fig. 3.18) ; ils absorbent fortement la lumière dans le bleu et l’ultraviolet. En automne, lorsque la chlorophylle est détruite, ce sont eux qui, avec les anthocyanes, sont responsables de la coloration des feuilles. On les rencontre également souvent dans les tissus non-chlorophylliens (champignons), dans les bactéries et dans les algues. Les caroténoïdes participent à la coloration des fleurs, des fruits, des racines…, en jaune, orange ou en rouge (ex. la racine de la carotte est riche en carotène, la tomate et le poivron sont riches en lycopène). Contrairement aux caroténoïdes des chloroplastes qui sont assez semblables pour l’ensemble des plantes supérieures (β-carotène, lutéine), ceux des chromoplastes présentent une grande variété de structures (lycopène de la tomate, zéaxanthine du maïs, violaxanthine de la violette, rhodaxanthine de l’if, diatoxanthine des diatomées…). Les caroténoïdes sont le plus souvent des molécules symétriques. Les doubles liaisons permettent de nombreuses configurations cis-trans, mais les caroténoïdes ont, dans leur ensemble, une configuration entièrement trans.

108

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

β α α-carotène 420 ; 442 ; 472 β β β-carotène 425 ; 450 ; 477

γ-carotène 437 ; 462 ; 492

δ-carotène 428 ; 458 ; 490

ζ-carotène 380 ; 400 ; 425

lycopène 448 ; 473 ; 504

phytofluène 331 ; 347 ; 366

7,8,11,12-tétrahydrolycopène 374 ; 395 ; 420

phytoène 276 ; 286 ; 297

Figure 3.18 - Principaux caroténoïdes végétaux Les substituants figurés représentent des méthyles. Les chiffres indiquent les longueurs d’onde au maximum d’absorption dans l’hexane.

3 - LES LIPIDES

109

Les principaux types structuraux de caroténoïdes comprennent (fig. 3.18) : X des hydrocarbures comme le lycopène dont les unités isopréniques terminales ne sont pas cyclisées et les carotènes, avec un ou deux cycles terminaux non-oxygénés ; X les xanthophylles, dérivés cyclisés et oxygénés des carotènes. Les hydroxyles confèrent à ces dernières une polarité plus marquée que celle du β-carotène ou du lycopène ; X des époxydes comme la violaxanthine ; X des dérivés furaniques comme les flavoxanthines. En raison de leur caractère lipophile, leur extraction s’effectue à l’éther de pétrole (parfois à l’aide de chloroforme ou d’alcools). Leur fractionnement est également possible en utilisant les différences de solubilités dans les solvants des différentes catégories de caroténoïdes entre une phase supérieure éthéro-pétrolique et une phase inférieure contenant 90 % de méthanol et 10 % d’eau. Les esters de xanthophylles et les hydrocarbures caroténoïdes se retrouvent également dans la phase supérieure ; les xanthophylles libres dans la phase inférieure. La meilleure méthode analytique et préparative de séparation des groupes de caroténoïdes s’avère être la chromatographie en phase inverse non-aqueuse qui sépare aussi bien les isomères de structure du carotène que les isomères cis-trans du β-carotène. Les propriétés d’absorption lumineuse des caroténoïdes diffèrent selon le nombre de liaisons conjuguées. Ils absorbent les radiations bleues et bleu-violettes du spectre de la lumière solaire. La figure 3.18 montre plusieurs structures de caroténoïdes et leurs différentes longueur au maximum d’absorption dans l’hexane : les carotènes α et β sont très fortement colorés en orangé. Le β-carotène, le plus répandu d’entre eux, est présent dans les chloroplastes, associé à la chlorophylle. Il colore certains fruits (ex. tomate) ou racines (ex. carotte). Le carotène α et le carotène β se distinguent par la position de leurs doubles liaisons aux extrémités cyclisées des molécules (cycles ioniques α et β).

APPLICATIONS Le carotène β constitue la provitamine A des Mammifères ; sa carence provoque la cécité nocturne ou héméralopie. La fonction provitaminique ne s’exerce chez l’homme que dans les limites des besoins physiologiques et une surcharge caroténique ne provoque nullement l’hypervitaminose A. Son action biologique ou thérapeutique est la même que celle de la vitamine A, mais elle est environ 2 fois moins importante. En outre, il inhibe la carcinogenèse. Dans les huiles végétales (certaines variétés d’huiles de palme peuvent en contenir plus de 0,1 %), il est particulièrement sensible à la chaleur et à l’oxydation. Il est transformé en un composé incolore par hydrogénation. Les carotènes sont également utilisés dans la formulation de produits cosmétiques destinés au bronzage en provoquant une coloration de la peau. Les utilisations principales, outre les domaines pharmaceutique et cosmétique, sont alimentaires : colorants naturels de denrées alimentaires diverses (charcuterie, produits laitiers, condiments, potages, confiserie, crèmes glacées, pâtisserie, boissons, sirops…).

110

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La capsanthine, principal caroténoïde du paprika (Capsicum annuum) associée à un autre caroténoïde de la même plante, sont utilisées comme colorant alimentaire (saucisses, fromages…). Cette association de pigments fournie dans la ration alimentaire des poules pondeuses (à raison de 16 mg/kg) permet de colorer le jaune d’œuf. Les xanthophylles (ex. zéaxanthine du maïs, lycopène de la tomate…) sont des pigments particulièrement visibles en période automnale au niveau des feuilles à la suite de l’altération de la chlorophylle, permettant leur démasquage. Leurs hydroxyles (fig. 3.19) peuvent être engagés dans des liaisons glycosidiques avec des sucres ou dans des liaisons ester avec des acides gras. Les propriétés de solubilité des molécules ainsi modifiées sont profondément marquées par le caractère hydrophile ou hydrophobe du substituant. OH β α HO

lutéine OH β

O α

O

HO

violaxanthine

Figure 3.19 - Structures de quelques xanthophylles Les substituants figurés représentent des méthyles.

APPLICATIONS En raison de leur pouvoir colorant, l’emploi des xanthophylles est autorisé en tant qu’additifs alimentaires.

3.5.1.6. POLYTERPÉNOÏDES Les polyterpénoïdes ont une structure linéaire (fig. 3.20). Le caoutchouc et la gutta-percha sont les représentants typiques de cette classe. Le caoutchouc est formé de 500 à plus de 5 000 unités isoprènes en chaînes non-ramifiées aux doubles liaisons de configuration cis. Le caoutchouc et la gutta-percha se distinguent stéréochimiquement d’après la position (respectivement cis et trans) des groupements latéraux CH3. Ils sont contenus dans le latex des vaisseaux laticifères de nombreuses plantes apparteOBOU
Ë
EJWFSTFT
GBNJMMFT

.PSBDÏFT
Ficus), Cucurbitacées (Cucurbita, Citrullus), Euphorbiacées (Hevea brasiliensis, Euphorbia), Apocynacées (Alstonia, Plumeria), Asclepiadacées (Asclepias, Calotropis), Asteracées (Anthemis, Taraxacum) et Sapotacées.

3 - LES LIPIDES

111

caoutchouc : doubles liaisons en position cis

gutta-percha : doubles liaisons en position trans

Figure 3.20 - Structures des principaux polyterpénoïdes

APPLICATIONS L’Hevea brasiliensis d’origine amazonienne est cultivé dans toutes les régions tropicales et exploité pour son latex riche en caoutchouc. C’est un latex laiteux qui s’écoule du tronc de l’arbre lorsqu’on y pratique une saignée et coagule au contact de l’air. Le latex séché est traité au souffre à des températures élevées lors d’une opération dite de vulcanisation qui permet de renforcer les qualités souhaitées du produit fini, et notamment l’élasticité, la résistance et la stabilité.

3.5.2. STÉROÏDES Les stéroïdes sont des substances triterpéniques modifiées, classiquement regroupés avec les lipides. Ils se rencontrent chez la majorité des plantes et animaux. Plus de 300 stérols et composés apparentés ont été identifiés chez les plantes. On y inclut des composés très différents quant à leurs propriétés biologiques tels que les phytostérols et les phytostanols, le squalène, des hormones, des alcaloïdes, des saponines, des glycosides cardiotoniques et des ecdystéroïdes.

3.5.2.1. STRUCTURE GÉNÉRALE Les stéroïdes renferment au moins un noyau stérol ou noyau cyclopentanoperhydrophénanthrène et portent en outre diverses fonctions ou insaturations, ainsi qu’une chaîne latérale aliphatique sur le carbone  C-17. Le cholestérol (fig. 3.21) est l’exemple type de cette catégorie de substances mais d’autres modifications, notamment sur la chaîne latérale, conduisent à une grande variété de produits naturels. Alors que le cholestérol a une chaîne latérale composée de 8 atomes de carbone, les phytostérols les plus courants ont une chaîne latérale de 9 ou 10 atomes de carbone, sur un total de 28 ou 29 atomes de carbone. La chaîne latérale alkyle peut contenir également une double liaison. La nomenclature chimique des stéroïdes est basée sur ce carbocycle avec sa chaîne carbonée latérale. Chaque hydrocarbure tétracyclique parent porte un nom spécifique. Les stéroïdes sont numérotés et les cycles nommés comme le montre la figure 3.21. En général, tous les stéroïdes végétaux portent un hydroxyle en C-3. Chez les végétaux, ils se trouvent à l’état libre ou combiné à des glucides (oses ou oligosaccharides) sous forme d’hétérosides, habituellement par l’intermédiaire de l’hydroxyle

112

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

en C-3 (ex. digitonine, ouabaïne). On les trouve également sous forme d’esters d’acides gras associés à des glucides. Dans les huiles alimentaires, ils sont souvent libres ou estérifiés. Ces esters se rencontrent aussi bien dans les membranes biologiques que dans les fractions cellulaires solubles. 21

22

18

20

12 11 19 1 2 3

HO

A

C 9

10

B

14

D

26 25

cholestérol

27 16

15

7

5 4

8

23

17 13

24

6

brassicastérol

campestérol

sitostérol

stigmastérol

Figure 3.21 - Structures du cholestérol et de quelques phytostérols importants Seule la chaîne latérale est indiquée.

3.5.2.2. PHYTOSTÉROLS ET PHYTOSTANOLS Les phytostérols regroupent l’ensemble des stérols caractéristiques des plantes. Ils constituent, en commun avec divers lipides, les membranes des cellules végétales, jouant un rôle important dans le contrôle de la fluidité et de la perméabilité membranaires. On les trouve dans les graines, les noix et les légumes. Les huiles végétales sont les sources naturelles les plus riches en phytostérols. Les teneurs les plus élevées se rencontrent chez le maïs, le colza, le soja et le tournesol. Plus de 100 types de phytostérols ont été rapportés chez les végétaux, mais les plus importants dans les huiles sont représentés par le sitostérol, campestérol, sigmastérol, Δ7-stigmasténol, Δ5-avénasténol, Δ7-avénasténol.

3 - LES LIPIDES

113

Le brassicastérol est le stérol caractéristique de la famille des Brassicacées (colza). D’autres stérols, de moindre importance quantitative, peuvent se trouver dans certaines huiles végétales : Δ7-9 -stigmatadiénol, fucostérol, ergastérol… Le cholestérol, précurseur de nombreux stéroïdes animaux, existe à l’état de traces chez les végétaux. Les phytostérols des huiles végétales se rencontrent principalement sous forme de stérols libres ou estérifiés par un acide gras au niveau de l’hydroxyle en C-3, notamment par les acides oléique et linoléique (voir section 3.3.3. Stérides) ou glycosylés par un ou plusieurs oses, en chaînes linéaires ou branchées comme dans le cas des saponines. Du point de vue structural, les phytostanols sont très semblables aux phytostérols, excepté qu’ils sont entièrement saturés, alors que les phytostérols ont au moins une double liaison dans leur structure. Ils résultent de l’hydrogénation des phytostérols lors de leur transformation en produits à usage commercial, en utilisant des catalyseurs comme le palladium, le platine, le cuivre ou le nickel. Les phytostanols sont mineurs dans les huiles végétales.

PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES ET APPLICATIONS Chez les animaux, les stéroïdes sont indispensables au fonctionnement de l’organisme (hormones sexuelles, acides biliaires….). Le rôle structural des stérols dans les membranes végétales est analogue à celui du cholestérol dans les cellules animales. La membrane plasmique possède le plus important rapport stérols/phospholipides. Les membranes chloroplastiques contiennent seulement une faible quantité de stérols libres. Certains phytostérols jouent également un rôle important dans le développement de la plante. En outre, il est bien connu que les phytostérols diminuent le taux de cholestérol sanguin (cholestérolémie) qu’il soit alimentaire ou d’origine endogène. L’étroite similarité structurale des phytostérols avec le cholestérol leur permet d’être incorporés dans les membranes cellulaires et de bloquer l’absorption intestinale du cholestérol par inhibition compétitive. De plus, les phytostérols ont une meilleure solubilité que le cholestérol dans les micelles biliaires au niveau de l’intestin grêle. De ce fait, ils forment de complexes phytostérol/cholestérol, ce qui réduit son absorption et augmente son excrétion. Les esters de phytostérols hydrolysés dans l’intestin grêle, sont capables de réduire le taux du cholestérol et des LDL du plasma sanguin d’environ 14 % mais n’ont pas d’effet significatif sur le taux des HDL. On estime qu’une consommation quotidienne de phytostérols est susceptible de réduire le risque de maladies cardiovasculaires jusqu’à 40 %, selon l’âge et suivant d’autres facteurs. Cependant, les phytostérols en excès (plus de 3 g/jour) ont l’inconvénient de réduire l’absorption des carotènes alpha et beta et de la vitamine E ce qui conduit à limiter la prise quotidienne de phytostérols à environ 200 à 400 mg. Aux Etats-Unis et en Europe, les esters de phytostérols et de phytostanols (combinés à des acides gras) sont couramment incorporés dans divers produits alimentaires comme les margarines, les sauces salades, les yogourts… Ils sont aussi commercialisés sous forme de capsules. Le β-sitostérol est utilisé pour le traitement de l’hypertrophie bénigne de la prostate.

114

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.5.2.3. ECDYSTÉROÏDES D’autres stéroïdes, appelés ecdystéroïdes, ont des structures analogues aux hormones de la mue des insectes, mais parfois beaucoup plus biologiquement actifs. On distingue les zooecdystéroïdes des phytoecdystéroïdes selon l’origine de la molécule, mais de nombreux composés sont communs aux deux règnes. Ces composés constituent une vaste famille comportant plus de 300 composés dont l’ecdystérone, hormone active de mue et métamorphose, existe dans plus de 100 familles végétales. Chimiquement, ils se caractérisent par une double liaison en 7, une cétone en 6 et un α-hydroxyle en 14 (fig. 3.22). La majorité d’entre eux porte un hydroxyle en 3, comme c’est le cas de leurs précurseurs stéroïdes. Autour de cette formule générale s’articulent de nombreux dérivés dont les variations portent, par exemple, sur : X le nombre d’atomes de carbone (variant de 19 à 29), X la présence d’un 3-β-OH, d’un 3-α-OH ou d’un groupement 3-oxo, X la présence de groupements hydroxyles sur le noyau stéroïde (en C-1, C-2, C-5, C-11, C-19), X la présence de groupements hydroxyles sur la chaîne latérale (quand elle est présente) en C-20, C-22, C-23, C-24, C-25 et C-26/27, X l’acylation par des acides organiques ou/et la glycosylation. La présence de nombreux groupements –OH, leur confère leur polarité. R2

OH R1 21

22

18

20

12 11 19 1

HO 2 3

HO

A

C 9

10 5

B 6

4

14

D

25

OH 27 16

15

8 7

23

17 13

26

24

OH chromophore

H

O

ecdysone : R1 = R2 = H ; 20-hydroxyecdysone : R1 = OH, R2 = H

Figure 3.22 - Structure de l’ecdysone et de son dérivé actif, le 20-hydroxyecdysone

APPLICATIONS Chez les végétaux, la biosynthèse des phytoecdystéroïdes peut être déclenchée suite aux dommages causés par les insectes phytophages. Leur ingestion par ces derniers interrompt leur cycle de mue, inhibe leur développement, leur croissance et leur reproduction et provoquent leur mort. Ils ont un effet antiappétant efficace sur certaines espèces dont les récepteurs sensoriels sont sensibles à la présence de la 20-hydroxyecdysone, le plus répandu de ces composés. Toutefois, certains

3 - LES LIPIDES

115

insectes polyphages sont insensibles aux phytoecdysones ou possèdent des enzymes capables de les dégrader. L’utilisation de ces composés dans la lutte contre certains ravageurs de plantes est un domaine de recherche très actif, étant donnée leur innocuité pour les Mammifères.

3.5.3. VITAMINES LIPOSOLUBLES Les vitamines sont des substances organiques sans valeur énergétique propre, présentes en quantité infinitésimale dans les aliments et requises par l’organisme à très petite dose pour le maintien de ses fonctions métaboliques vitales (croissance, contrôle des activités enzymatiques, équilibre de l’organisme…). Les animaux sont incapables de synthétiser les vitamines qui doivent leur être fournies par les plantes (sons et germes de Céréales, légumes, fruits verts…), la flore intestinale ou divers produits d’origine animale (lait, viande, foie, cervelle, jaune d’œuf…) dont ils se nourrissent (tab. 3.6). Tableau 3.6 - Vitamines liposolubles rencontrées chez les végétaux Vitamines Appellations et variantes

Sources

A

SÏUJOPM
t
BYÏSPQIUPM
t vitamine antixérophtalmique

légumes (tomate, carotte, poivron, ÏQJOBSE
MBJUVF
t
GSVJUT

D

vitamine antirachitique D2 = ergocalciférol D3 = cholécalciférol

DIBNQJHOPOT
t
absente des autres produits végétaux

E

UPDPQIÏSPM
t
WJUBNJOF
EF
GÏDPOEJUÏ

huiles de germes de blé, d’arachide, d’olive, de soja, de cresson

,

,

QIZMMPRVJOPOF
 OBQIUPRVJOPOF
t
,

MÏHVNFT
WFSUT
ÏQJOBSE
t
UPNBUF
t fruits (fraise)

Les vitamines appartiennent à des classes chimiques très différentes ; on les classe habituellement en hydrosolubles et liposolubles suivant leur solubilité dans l’eau et les alcalis ou dans les solvants organiques (benzène, hexane, éther…). Cette classification ne repose sur aucun caractère structural ou fonctionnel. 4PVT
MF
WPDBCMF
EF
WJUBNJOFT
MJQPTPMVCMFT
PO
SÏVOJU
RVBUSF
WJUBNJOFT

"
,
&
FU
%
%V
QPJOU
EF
WVF
TUSVDUVSBM
MFT
WJUBNJOFT
"
FU
&
TPOU
SBUUBDIÏFT
BVY
UFSQÏOPÕEFT

,
BVY
OBQItoquinones et D aux stéroïdes. La vitamine A joue un rôle principal dans la vision. Elle se forme dans l’organisme (surtout le foie) par oxydation de la provitamine A, d’origine végétale, notamment les carotènes α et β (fig. 3.23), ce dernier fournissant 2 fois plus de vitamine A que le premier. La vitamine  A et son précurseur sont détruits aux fortes températures et sont sensibles à l’oxydation par les lipoxydases, présentes par exemple dans les graines de soja crues. Elle est facilement oxydable par les peroxydes d’acides gras. Les antioxydants, tels que les tocophérols, protègent en partie la vitamine A contre l’oxydation.

116

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE point de clivage β β β-carotène CH2OH β vitamine A

Figure 3.23 - Transformation du β-carotène (tétraterpénoïde) en vitamine A (diterpénoïde) Une scission oxydative par une dioxygénase fournit deux molécules de vitamine A.

La WJUBNJOF
,
öH

FTU
EPVÏF
EF
QSPQSJÏUÏT
DPBHVMBOUFT
*M
FO
FYJTUF
EFVY
QSJODJQBMFT
GPSNFT

,1
FU
,2. La première se trouve dans de nombreuses plantes, particulièrement dans les légumes verts à feuilles (épinards, choux verts…) ; la deuxième est synthétisée par la flore intestinale. La carence en cette vitamine entraîne une tendance aux hémorragies due à l’incapacité de l’organisme à synthétiser la prothrombine, précurseur inactif de la thrombine nécessaire à la coagulation du sang. O CH3 CH3 O

H3C

H3C

3

Figure 3.24 - Structure de la vitamine K

La vitamine D désigne, en fait, un groupe de vitamines dérivées des stéroïdes et dont les plus importants sont la vitamine D2 (ergocalciférol) et la vitamine D3 (cholécalciférol) (fig. 3.25). Le précurseur de la vitamine D2 est l’ergostérol, obtenu à partir des plantes. La vitamine D3 est la forme de vitamine D obtenue à partir du 7-déhydrocholestérol des tissus animaux (peau, foie et rein, successivement) sous l’action des radiations ultraviolettes du soleil. Elle intervient dans le métabolisme phospho-calcique et la formation des os. Une carence en vitamine D est responsable du rachitisme chez les enfants (mauvais développement du squelette) et augmente l’ostéoporose chez les personnes âgées. La vitamine E joue un rôle dans la fécondation et s’oppose aux processus oxydatifs, notamment à l’oxydation des acides gras insaturés. En réalité, la vitamine E, appelée également tocophérols, est un nom générique qui regroupe des antioxydants naturels relativement abondants dans les huiles végétales. La grande stabilité de ces dernières, dans les conditions d’oxydation, est due à la présence d’un taux élevé d’antioxydants naturels, dont les plus importants sont les tocophérols. Les tocophérols caractérisés sont au nombre de huit composés homologues : α-, β-, γ-, δ-, ε-, ζ1-, ζ2- et η-tocophérol (fig. 3.26).

3 - LES LIPIDES

117 28 21

20

11

1 9

2 3

HO

A

10

B

26 19

C 9

2 3

10

A

B

27

4

17 13 14

D

25 26

16

15

8 7

5

HO

6

11

1

15

8

24 23

12

16

7

5 4

14

D

22 20

18

25

17 13

C

21

27

23

12 19

24

22

18

6

7-déhydrocholestérol (peau)

ergostérol

irradiation aux UV

21

22

21

27

12

12 26

19 1

1

9

5

23 17

25 26

19 15

10 3

18

25

23 17

27

22 20

20 18

3

7

HO

9 15

10 5

7

HO vitamine D2 (ergocalciférol)

vitamine D3 (cholécalciférol)

Figure 3.25 - Précurseurs de la vitamine D Les quatre premiers tocophérols ont une structure de benzopyranol substitué par une chaîne saturée composée de trois unités isopréniques. La fonction hydroxyle est en position 6, sur le cycle aromatique et en para de l’atome d’oxygène hétérocyclique. Les divers tocophérols se différencient entre eux par le nombre et la position de groupements méthyle sur le cycle aromatique. L’α-tocophérol possède trois groupes méthyles fixés sur le noyau hydroxychromane en 5, 7 et 8, tandis que le β et le γ n’en ont que deux respectivement en 5, 8 et 7, 8 et le δ un seul en 8. Les quatre autres, appelés tocotriénols, sont proches des tocophérols mais leur structure chimique diffère par leur chaîne isoprénoïde qui comporte des doubles liaisons en 3’, 7’ et 11’. Tocophérols et tocotriénols sont parfois regroupés sous le terme de tocochromanols. Bien qu’in vitro, les tocotriénols démontrent une meilleure activité antioxydante que les tocophérols, leur action biologique in vivo est moindre car ils sont présents en plus faible quantité dans les tissus. Les tocophérols sont des substances liposolubles, pratiquement insolubles dans l’eau et extractibles par les solvants organiques. Ils se présentent sous forme d’huiles visqueuses légèrement colorées en jaune.

118

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE R1 HO

6

5 10 4

H3C

H H3C

8

9 O

10’ 2’

4’

CH3

R3

CH3

H

2

7

R2

3

12’

8’

CH3

tocophérol

R1 HO

H3C 2’

O

R2 R3

4’

CH3 12’

8’

3’

CH3

Groupes méthyles R1 = R2 = R3 R1 = R3 R2 = R3 R3

H3C 7’

11’

CH3

tocotriénol tocophérols

tocotriénols

α β γ δ

ε ζ1 ζ2 η

Figure 3.26 - Structures des tocophérols naturels Les tocophérols se trouvent dans les aliments essentiellement sous la forme libre. Les huiles végétales en sont les aliments les plus riches. Ils sont un des composants des insaponifiables des huiles, fraction non-constituée de triglycérides, isolable par extraction dans un solvant après transformation des acides gras en savons hydrosolubles. La forme la plus active biologiquement est l’α-tocophérol suivie des formes β et γ qui représentent chacune la moitié de l’activité de la forme α. La principale source de la forme α est l’huile d’amande, d’olive vierge et de tournesol. La forme β est la plus abondante dans l’huile de germes de blé ; la forme γ est présente dans l’huile de graines de coton.

APPLICATIONS En industrie agro-alimentaire, les tocophérols sont autorisés à titre d’additifs alimentaires (antioxydants) qu’ils soient naturels extraits d’huiles végétales ou synthétiques. On les utilise également en pharmacotechnie pour les mêmes propriétés, souvent en synergie avec l’acide ascorbique.

3.6. IMPORTANCE NUTRITIONNELLE ET MÉTABOLIQUE DES LIPIDES Le rôle des lipides est à la fois plastique et énergétique. Ils représentent pour l’organisme une forme de réserve de l’énergie. Un gramme de lipide fournit 38 kJ, soit deux fois plus qu’un gramme de glucide (17 kJ) ou de protéine. Les calories alimentaires en excès sont utilisées à la synthèse des graisses. En conséquence, les lipides de la ration alimentaire ne devraient pas représenter un apport énergétique supérieur à 33 % de l’apport

3 - LES LIPIDES

119

énergétique global. Leur qualité nutritionnelle tient au fait qu’ils contiennent une grande variété d’acides gras saturés, monoinsaturés ou polyinsaturés dont certains (acides gras essentiels) ne pouvant pas être synthétisés par l’organisme, doivent donc être apportés par l’alimentation. De par leur diversité de structure, les lipides ont des fonctions métaboliques multiples. Les acides gras essentiels (AGE) possèdent des doubles liaisons placées sur les atomes de carbone C-9 et C-12 (pour l’acide linoléique) et C-9, C-12 et C-15 (pour l’acide linolénique), comptées à partir de l’extrémité de la molécule qui porte le groupement carboxyle (nomenclature Δ). L’Homme comme l’animal, sont pourvus d’enzymes permettant de synthétiser des acides gras saturés allant jusqu’à 18 atomes de carbone, mais leur métabolisme cellulaire est incapable d’insérer des doubles liaisons en positions 12 et 15 et ne peut donc synthétiser aucun des deux acides correspondants. Toutefois, les animaux sont capables d’ajouter d’avantage de doubles liaisons aux AGE en les introduisant entre les doubles liaisons d’origine et le groupement carboxyle ; simultanément, la chaîne de carbone s’allonge du côté du carboxyle par des désaturations complémentaires. Ce processus métabolique produit des dérivés à chaîne longue à 20 et 22 atomes de carbone avec 3, 4, 5 et 6 doubles liaisons (fig. 3.27). Il en résulte deux familles d’acides gras essentiels (les familles ω-6 et ω-3) qui exercent des fonctions vitales pour les cellules et l’organisme : multiplication et différenciation cellulaires, reproduction et croissance, élaboration des structures cellulaires ainsi que la synthèse des prostaglandines, des thromboxanes et des leucotriènes. 12

9

5

3

1

COOH

acide linoléique C18 : 2 Δ9,12 désaturation – 2H 12

9

6

acide γ-linoléique C18 : 3 Δ6,9,12

COOH

élongation + 2C 14

11

8

acide eicosatriénoique C20: 3 Δ8,11,14

COOH

désaturation – 2H 14

11

8

acide arachidonique C20: 4 Δ

5

COOH

5,8,11,14

Figure 3.27 - Biosynthèse de l’acide arachidonique à partir de l’acide linoléique Chacune des deux familles donne naissance à un autre acide gras polyinsaturé en C18 d’importance quantitative mineure, qualitative variable, et à quatre acides gras hautement

120

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

insaturés en C20 et plus, par un système commun, concurrentiel, d’élongases et de désaturases. Les acides gras à 20 et 22 atomes de carbone des familles ω-6 et ω-3 sont de préférence incorporés dans les phospholipides des membranes cellulaires où ils jouent un rôle structural et fonctionnel important, en particulier au niveau de la fluidité membranaire. Dans notre organisme, le transport des lipides est assuré par les lipoprotéines.

3.7. IMPORTANCE MÉDICALE DES LIPIDES Les lipides d’origine animale sont riches en acides gras saturés. Or, il est médicalement établi que les acides gras saturés provoquent des troubles cardio-vasculaires chez l’homme par l’augmentation du processus d’artériosclérose qui rétrécit les artères. Les acides myristique, palmitique et stéarique sont particulièrement athérogènes et favorisent l’augmentation de la cholestérolémie et l’agrégation plaquettaire. À quelques exceptions près, et contrairement aux lipides d’origine animale, ceux d’origine végétale contiennent surtout des acides gras insaturés de deux types : monoinsaturés (acide oléique) et polyinsaturés. Ces derniers, sources d’acides gras indispensables, dont l’acide α-linolénique (ω-3) et surtout linoléique (ω-6) possèdent des activités hypocholestérolémiante et antithrombogène, et sont essentiellement apportés par les huiles végétales. C’est la raison pour laquelle il est particulièrement recommandé de privilégier des matières grasses végétales dans l’alimentation animale et humaine. On obtient ainsi des effets protecteurs parmi lesquels une baisse du cholestérol sanguin. L’apport d’acides gras polyinsaturés impose un apport simultané d’α-tocophérol (vitamine E) nécessaire en raison de sa propriété antioxydante. Une déficience d’acide linoléique dans l’alimentation a pour conséquence une dermatite squameuse (perte excessive d’eau par la peau), une diminution de la croissance, une diminution de la fertilité et une cicatrisation plus difficile des plaies. Une déficience en acide α-linolénique s’accompagne d’une faiblesse générale et de troubles de vision. Les multiples propriétés des acides gras sont aujourd’hui reconnues et ils peuvent désormais constituer le principe actif à l’origine des certaines prescriptions. Les acides gras insaturés de la famille ω-6 exercent des effets hypocholestérolémiants, et ont un rôle de régulation vis-à-vis des systèmes plaquettaire, reproducteur, épidermique et immunitaire. Les acides gras de la série ω-3 exercent un rôle primordial dans la structure et le fonctionnement des systèmes visuels et nerveux. Leurs effets hypotriglycéridémiants complètent ceux des acides gras de la famille ω-6 pour la protection contre les maladies cardio-vasculaires. L’apport d’acide docosahexaénoïque (DHA22 : 6, ω-3) est particulièrement important chez le nourrisson lors de la phase de développement cérébral.

3.8. LIPOCHIMIE La lipochimie décrit l’ensemble des transformations chimiques appliquées aux huiles et aux graisses.

3 - LES LIPIDES

121

La technologie de la lipochimie permet d’extraire les acides gras présents dans les corps gras naturels (sous forme de triglycérides) et de les transformer en produits spécifiques. Aujourd’hui, l’emploi de la lipochimie couvre la majorité des secteurs industriels. Les matières premières qu’elle utilise proviennent essentiellement de l’agriculture (ressources importantes et renouvelables). Près de 10 % de l’huile extraite dans le monde sont utilisés pour la fabrication de produits chimiques organiques et de matériaux apparentés.

3.8.1. OBTENTION DES HUILES VÉGÉTALES Les huiles végétales alimentaires sont extraites de graines ou de fruits. Les plus courantes sont les huiles de soja (Glycine hispida, Fabacées), de tournesol (Helianthus annuus, Asteracées), de colza (Brassica napus, var. oleifera, Brassicacées), d’arachide (Arachis hypogea, Fabacées), de palmier à huile (Elaeis guineensis, Arecacées) qui fournit à la fois l’huile de palme et l’huile de palmiste, d’olivier (Olea europaea, Oleacées) et l’huile de coprah fournie par le cocotier (Cocos nucifera, Arecacées). Les plus utilisées, renferment des acides gras saturés et insaturés en proportions variables (voir tab. 3.3). Il est à noter que les huiles d’une même espèce ne présentent pas forcément la même composition, celle-ci variant avec les conditions environnementales stationnelles, notamment la latitude et le climat, avec l’état et la maturation à la récolte. L’obtention des huiles alimentaires raffinées comprend deux grandes étapes. La première consiste en une extraction par trituration suivie du pressage de la matière première. Elle peut être actuellement combinée à la dissolution de l’huile dans un solvant organique. Les huiles brutes ainsi obtenues contiennent encore de nombreuses impuretés, en proportion minoritaire, mais qui peuvent donner un mauvais goût, une mauvaise odeur, un aspect indésirable, altérer les propriétés fonctionnelles et peuvent même être toxiques, d’où la nécessité de procéder à diverses opérations de raffinage, deuxième étape de la fabrication. Le raffinage aboutit à un produit d’odeur et de goût neutres ; il est la condition indispensable à la bonne conservation organoleptique d’un corps gras modifié. X Extraction par pression : réalisée à l’aide d’une presse hydraulique ou, mieux encore, à l’aide d’une presse à vis sans fin. Avant leur pressage, les graines oléagineuses riches en protéines subissent un gonflement et éclatement dans des « chauffoirs » à 90 °C afin de libérer l’huile en détruisant les structures cellulaires et en coagulant les protéines. X Extraction par solvant : appliquée aussi bien aux graines intactes qu’aux graines partiellement déshuilées par pressage. Actuellement, la majorité des procédés d’extraction des huiles végétales utilise l’hexane (C6H14, point d’ébullition : 68-70 °C, densité : 0,68). L’extraction est menée communément par percolation de l’hexane sur les graines grossièrement broyées, à une température inférieure à 60 °C. La phase organique renfermant l’huile est alors séparée du résidu déshuilé (tourteau de distillation), destiné en général à l’alimentation animale. L’extraction de l’huile à l’aide d’un solvant est plus efficace que la pression ; le taux de récupération de l’huile variant de 95 à 99 %. X Distillation : cette étape permet de séparer l’huile extraite de l’hexane qui est recyclé. X Raffinage : celui-ci permet d’obtenir un produit sans couleur, sans odeur, de goût neutre, plus résistant à l’oxydation, débarrassé de ses substances toxiques ou nocives et adapté à l’emploi désiré (voir tab. 3.7). Il comprend cinq opérations, qui sont successivement :

122

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

1. La démucilagination et le dégommage ou élimination des mucilages et des gommes ainsi que les lécithines, les protéines et autres constituants naturels des graines. Il existe différents types de protocoles de dégommage parmi lesquels le dégommage à l’acide et le dégommage enzymatique. Après leur floculation à l’eau chaude acidulée (habituellement par l’acide phosphorique mais aussi, parfois, par l’acide citrique, l’acide acétique ou l’acide oxalique), les mucilages et les substances colloïdales sont éliminés par centrifugation. L’efficacité de chaque acide dépend de l’huile utilisée. Le dégommage enzymatique des huiles végétales est une méthode plus récente. Sous l’action de la phospholipase A1 (fig. 3.28) (ex. Enzymax®, d’origine microbienne), les phospholipides non-hydratables (sels de calcium et de magnésium de l’acide phosphatidique et de la phosphatidyléthalonamine) sont convertis en lysophospholipides et d’acides gras libres, insolubles dans l’huile, et séparés par centrifugation continue. Les phosphatides hydratables (phosphatidylcholine et phosphatidylinositol) sont séparés de l’huile avec l’eau. La démucilagination enzymatique convient à la majorité des huiles végétales (à l’exception de celles du coton ou de maïs) et permet d’atteindre des taux de phosphore résiduel inférieurs à 5 ppm. La phospholipase A2 est également utilisable pour l’élimination des gommes. Elle agit sur les lécithines et autres phospholipides en enlevant l’acide gras en position 2 (fig. 3.28), ce qui forme des lysophospholipides plus solubles dans l’eau que les phospholipides utilisés comme substrats. phospholipase A1 O phospholipase A2 H2C

O

C

R1

O R2

C

O

HC

phospholipase D O

H 2C

O

P

O

CH2

CH2

N+(CH3)3

O– phospholipase C

Figure 3.28 - Sites d’actions des différentes phospholipases sur une lécithine 2. La neutralisation des acides gras libres et phospholipides résiduels par précipitation alcaline (hydroxyde de sodium dilué) à chaud, sous forme de savons éliminés par centrifugation ou filtration : R–COOH + NaOH $ R–COONa + H2O Les acides gras libres peuvent provenir de l’activité des lipases, initialement présentes à la surface des graines, qui passent dans l’huile brute au cours des opérations de pressage et d’extraction. L’action de ces enzymes étant favorisée par la présence d’eau, celle-ci ne devrait pas dépasser une teneur de 0,2 % dans les huiles brutes. La

3 - LES LIPIDES

123

neutralisation des acides gras libres par la soude, n’est viable économiquement que pour les huiles moyennement acides (celle de tournesol, par exemple) ; elle entraîne des pertes pour les huiles fortement acides par leur hydrolyse alcaline. 3. La décoloration par filtration afin d’éliminer la plupart des pigments colorés résiduels (caroténoïdes, chlorophylle, gossypol) qui nuisent à la bonne conservation de l’huile. Elle se fait habituellement sur des terres adsorbantes, du charbon actif, des silicates d’aluminium ou des combinaisons de ces substances. 4. Le décirage consiste à éliminer les cires contenues dans les huiles végétales et qui peuvent être insolubles à température ambiante. Il peut être réalisé par filtration ou par centrifugation après précipitation des cires par refroidissement rapide (5 à 6 °C). 5. La désodorisation (élimination des aldéhydes et des cétones, responsables d’odeurs et de goûts désagréables) par entraînement à la vapeur d’eau (200-250 °C) sous pression réduite. Les produits odorants entraînés sont condensés dans des pièges refroidis. Les traces de métaux, susceptibles de catalyser les réactions d’oxydation lors du stockage des huiles, sont éliminées par chélation à l’aide d’acide citrique. Après refroidissement, les métaux chélatés sont éliminés par filtration. L’huile purifiée, de couleur claire doit être soigneusement protégée contre l’oxydation des acides gras insaturés par l’oxygène et la lumière. Ce traitement conduit à une huile dite « alimentaire », raffinée et stable. Tableau 3.7 - Principales opérations de raffinage des huiles végétales Opération

Conditions

Composés éliminés

démucilagination et dégommage

eau à 70-80 °C + H3PO4 + centrifugation ou phospholipases

NVDJMBHFT
t
QIPTQIBUJEFT
t
HMZDPMJQJEFT
t
QSPUÏJOFT

neutralisation

t

NÏUIPEF
DIJNJRVF

addition de soude t
NÏUIPEF
QIZTJRVF

EJTUJMMBUJPO

BDJEFT
HSBT
MJCSFT
t
QIPTQIBUJEFT
SÏTJEVFMT
t
BøBUPYJOFT
t
QFTUJDJEFT
organophosphorés

décoloration

adsorption des pigments sur charbon actif, terres adsorbantes ou d’autres matériaux

pigments caroténoïdes FU
DIMPSPQIZMMJFOT
t
HPTTZQPM
t
TBWPOT
t
IZESPDBSCVSFT

décirage

refroidissement rapide suivi de filtration ou de centrifugation

cires

désodorisation

entraînement à la vapeur d’eau (240-250 °C) sous vide, pendant 30 min

BDJEFT
HSBT
MJCSFT
t
DPNQPTÏT
QMVT
WPMBUJMFT
RVF
MIVJMF
BMEÏIZEFT
DÏUPOFT
t QFSPYZEFT
FU
QSPEVJUT
EF
EÏHSBEBUJPO
t TUÏSPMT
FU
UPDPQIÏSPMT
t
QFTUJDJEFT
t
organophosphorés

Bien que dans certains cas, les opérations de raffinage des huiles éliminent ou réduisent la teneur en certaines substances indésirables (aflatoxine de l’huile d’arachide, isothiocyanates de l’huile de colza, gossypol de l’huile des graines de coton, peroxydes…), elles peuvent également réduire ou détruire certains éléments nutritifs (caroténoïdes, tocophérols…).

124

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

D’un point de vue qualitatif, chaque huile possède ses propres spécificités. Cette différenciation provient de leur profil en acides gras qui détermine leurs aspects (fluides ou concrets) mais surtout les destine à des utilisations relativement ciblées.

3.8.2. FACTEURS FAVORISANT L’ALTÉRATION DES HUILES Les huiles sont particulièrement sensibles à l’oxydation, réaction qui génère des composés altérant les qualités organoleptiques (goût et odeur, notamment), la qualité nutritionnelle du produit et qui favorise le développement de micro-organismes aérobies. Leur durée de vie est donc déterminée par l’ampleur de ces réactions d’oxydation auxquelles elles peuvent être soumises. Dans le cas des lipides, ces réactions se traduisent notamment par l’ouverture des doubles liaisons et fixation d’atomes d’oxygène. Les substrats des réactions d’oxydation sont principalement les acides gras insaturés qui s’oxydent, en général, d’autant plus vite lorsqu’ils sont libres et très insaturés. En effet, les acides polyinsaturés à longue chaîne, parce qu’ils se prêtent aux réactions radicalaires, sont particulièrement visés. L’acide linolénique (C18 : 3), par exemple, a un taux d’oxydation 25 fois plus élevé que celui de l’acide oléique (C18 : 1) et deux fois plus rapide que celui de l’acide linoléique (C18 : 2). Les principaux facteurs à l’origine de ces réactions d’oxydation sont, en particulier : X la température : les acides gras saturés ne s’oxydent qu’à une température supérieure à 60 °C, tandis que les acides polyinsaturés s’oxydent même lorsque l’on entrepose des aliments à l’état congelé. De même, les températures atteintes (généralement 150 à 220 °C) lors de la friture de certains aliments, sont susceptibles d’accélérer les réactions d’oxydation, voire même d’induire des coupures des molécules constituant l’huile. La résistance des huiles à la chaleur est variable : il existe pour chacune d’elles une température critique (également appelée « point de fumée ») à ne pas dépasser, au delà de laquelle les huiles produisent des composés toxiques, irritants pour les muqueuses digestives et qui oxydent les caroténoïdes et les vitamines A et E. Par ailleurs, à une température supérieure à 300 °C, le glycérol est transformé en acroléine, substance irritante et toxique. Fort heureusement, cette température n’est atteinte qu’exceptionnellement, les fritures « maison » dépassant rarement 250 °C et celles des collectivités ne dépassant pas 170 °C ; X l’air : l’oxydation des acides gras insaturés par l’oxygène de l’air génère des peroxydes qui se décomposent ultérieurement en dérivés carbonylés aldéhydes et cétones (responsables de l’odeur de rance) et en divers produits oxygénés (alcools, acides…) ; X l’humidité : sa présence facilite l’hydrolyse des lipides générant des acides gras libres et donc une acidité de ces produits ; X la lumière : certaines huiles, comme celles du tournesol, d’olive ou de germe de maïs, supportant mal l’exposition à la lumière, doivent être conditionnées en flacons opaques ; X les contaminants : ils peuvent être des pigments ou des gommes résiduels, des ions métalliques, des traces de détergents… Beaucoup de métaux sont des prooxydants qui exercent un effet catalytique marqué en accélérant la dégradation des lipides, mais

3 - LES LIPIDES

125

certains sont plus actifs (ex. cuivre, fer) que d’autres. Ils peuvent provenir du contact avec des équipements utilisés durant le traitement des huiles ou leur stockage ; X le temps : l’impact des réactions oxydatives est d’autant plus important que le temps d’exposition aux précédents facteurs est plus long. Le principal problème posé par ces réactions réside dans la formation des peroxydes qui sont des molécules cancérigènes et de composés volatils qui donnent au corps gras un goût et une odeur désagréables (rancissement) ce qui le rend impropre à la consommation. C’est la raison pour laquelle les corps gras doivent être conservés au frais, à l’abri de l’air et de la lumière. Certaines huiles végétales résistent mieux à l’oxydation que les graisses animales, caractère en partie lié à la présence de composés possédant des propriétés antioxygène. L’un d’entre eux, l’hydroxytyrosol, isolé à partir d’huile d’olive à un taux de l’ordre de 1/1000, a un pouvoir antioxydant quatre fois supérieur à celui d’un antioxydant de synthèse tel que le BHT (butylhydroxytoluène), que ce soit sur les corps gras animaux ou sur les huiles végétales.

3.8.3. TRAITEMENTS DE TRANSFORMATION La réactivité des lipides, particulièrement basée sur celle des chaînes d’acides gras, est exploitée industriellement pour effectuer des réactions d’halogénation, d’hydrogénation et de fixation. De même, la réactivité de la fonction acide ou ester permet la mise au point de diverses techniques de transformation qui, en intervenant sur la structure des huiles, en modifient leurs particularités, ce qui les destine à des applications ciblées.

3.8.3.1. FRACTIONNEMENT Ce procédé est effectué dans le but de séparer puis de récupérer individuellement les différents constituants des huiles et des graisses en fonction de leurs points de fusion. En effet, les huiles sont des mélanges complexes de molécules (principalement des triglycérides) à points de fusion parfois très différents. Quand une huile est chauffée à son point de fusion puis refroidie lentement jusqu’à ce que les molécules aux points de fusion les plus élevés se solidifient et forment des cristaux, les autres molécules de l’huile restent à l’état liquide. En séparant la partie solide (stéarine) de la partie liquide (oléine), par filtration, le produit initial est alors divisé en deux fractions aux propriétés fonctionnelles et technologiques différentes de celles de l’huile d’origine, permettant des usages différents. Ainsi, les glycérides riches en acides gras saturés (point de fusion élevé) seront séparés des glycérides riches en acides gras insaturés (point de fusion bas). Plusieurs fractionnements successifs peuvent être effectués de cette manière, aboutissant, à chaque stade, à deux fractions qui diffèrent par leurs points de fusion. La méthode ainsi décrite est appelée cristallisation fractionnée. Une deuxième méthode utilisée à l’échelle industrielle est le fractionnement par solvant ou extraction liquide-liquide. Dans ce cas, l’huile est diluée avec un solvant approprié (par exemple hexane, acétone ou furfural) qui est ensuite éliminé avec soin.

126

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.8.3.2. HYDROGÉNATION La fluidité des huiles est liée à leur richesse relative en acides gras insaturés. Le point de fusion des acides gras est d’autant plus élevé que la chaîne est plus longue. La présence de doubles liaisons dans un acide gras abaisse son point de fusion par rapport à celui de l’acide gras saturé correspondant (voir tab. 3.2). En utilisant un procédé catalytique (en présence de sels de cuivre ou de nickel), on réalise la fixation d’hydrogène sur certaines des doubles liaisons –C=C– présentes dans certaines huiles : le produit final est un corps gras ayant de nouvelles fonctionnalités et dont la consistance est solide ou semi-solide (beurre, margarine) à température ambiante (point de fusion élevé). Cette méthode est devenue un processus industriel utilisé par les transformateurs d’huile et les fabricants d’aliments pour « durcir » les huiles et les stabiliser (la chaîne saturée présente une relative inertie chimique) en vue de leur utilisation en margarinerie. Certaines huiles (de colza et de soja, en particulier) sensibles à l’oxydation sont également hydrogénées afin de les stabiliser et de limiter le rancissement en abaissant leur taux d’acide linolénique : ce traitement permet l’utilisation de ces huiles pour la friture. Selon l’usage auquel le produit final est destiné, l’hydrogénation peut être totale ou partielle. Dans le premier cas, tous les acides gras insaturés sont transformés en acides gras saturés ; dans le second, seule une partie des acides gras est hydrogénée. Dans l’huile de colza par exemple, on ramène habituellement le taux d’acide linolénique de 9 % à 1 %. Cependant, l’hydrogénation, en générant des isomères géométriques trans, perçus comme étant impliqués dans des maladies d’artériosclérose (propriété partagée avec les acides gras saturés), et entraîne également une déperdition d’acides gras essentiels et des pigments caroténoïdes éventuellement présents. Les huiles hydrogénées ont également des flaveurs anormales : goût cireux, de plastique ou fruité. Actuellement, on a recours à l’interestérification ou à des huiles dont la composition en acides gras a été modifiée par des techniques de sélection classiques ou par génie génétique.

3.8.3.3. INTERESTÉRIFICATION Les propriétés physiques (point de fusion, viscosité) d’une huile dépendent de la manière dont les acides gras sont positionnés sur les fonctions alcool de la molécule de glycérol. Par conséquent, ces propriétés peuvent être affectées en modifiant leurs places. Cette méthode repose sur le fait que la liaison glycérol-acides gras est rompue à température élevée (160 °C), en présence d’un catalyseur convenable (soude ou méthoxyde de sodium). Dans ces conditions, les acides gras, libérés de leurs positions, se fixent ensuite au hasard sur les trois hydroxyles du glycérol (interestérification libre ou randomisation). L’opération peut être conduite sur une huile pure (elle-même constituée de différents triglycérides) ou sur un mélange de plusieurs huiles ou encore en présence d’acides gras ω-3 (EPA, DHA) ou ω-6 (acide γ-linolénique). En utilisant des catalyseurs biochimiques (lipases), il est possible également de procéder à une interestérification « dirigée » en favorisant les combinaisons d’acylglycérols que l’on veut produire ou en éliminant ceux à bas point de fusion au fur et à mesure de leur formation. L’avantage du procédé enzymatique est qu’il se déroule dans des conditions douces, n’exige pas d’équipements lourds et coûteux, et qu’il produit moins de co-produits. De

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plus, la purification des produits est plus aisée. A cet effet, différentes lipases ayant des spécificités variables, sont actuellement disponibles, mais la plupart d’entre elles sont spécifiques des positions 1 et 3. Ces enzymes peuvent être soit ajoutées directement à l’huile, soit immobilisées. L’interestérification n’engendre, généralement, aucune répercussion sur le plan nutritionnel ; la structure des acides gras n’est pas altérée et la formation d’isomères trans est évitée. Elle constitue, de ce fait, une alternative à l’hydrogénation.

3.8.3.4. TRANSESTÉRIFICATION La transestérification (appelée également alcoolyse) consiste à redistribuer les différents acides gras d’un ester (ex. triglycéride) sur les trois fonctions hydroxyles d’un alcool (ex. glycérol) pour donner d’autres esters. La réaction se fait en présence d’éthylate ou de méthylate de sodium ou les hydroxydes de sodium, de potassium ou de calcium à 200-260 °C sous vide. On obtient finalement, à l’équilibre, un mélange de monoesters, de diesters et de triesters, selon une loi statistique (fig. 3.29). Cette technique permet de préparer avec de l’huile de tournesol et de l’huile de palme totalement hydrogénée une margarine ne contenant pas d’acides gras trans. R1 OH R1 R2

OH +

OH +

OH 1-monoglycéride

OH 2-monoglycéride

OH R1

R3 triglycéride

R2

OH glycérol

R2 OH 1,2-diglycéride

R1 +

OH R3 1,3-diglycéride

Figure 3.29 - Représentation schématique de la réaction de transestérification entre un triglycéride et le glycérol et la formation de mono- et di-glycérides Cette réaction implique l’exécution séquentielle de réactions d’hydrolyse (ou glycérolyse) et de réestérification. Les groupements R1, R2 et R3 sont des chaînes d’acides gras de 8 à 14 atomes de carbone.

3.8.3.5. SAPONIFICATION L’hydrolyse alcaline (potasse ou soude) à chaud des glycérides (esters) conduit au glycérol (alcool) libre et au savon (sel d’acide gras) ainsi qu’à des molécules qui n’ont pas réagi et qui forment la matière insaponifiable d’une matière grasse. Ce processus, utilisé depuis très longtemps dans la fabrication du savon, est appelé saponification (fig. 3.30). Les savons à base de potasse sont dits mous, et ceux à base de soude ou de chaux sont dits EVST
$F
TPOU
EFT
DPNQPTÏT
CJQPMBJSFT
.JT
FO
TPMVUJPO
MF
HSPVQF
hydrophile (–COO –) est plongé dans l’eau, alors que le groupe hydrophobe (–R) est poussé hors de l’eau. Cette

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

orientation des molécules de savon à la limite entre les deux phases fait baisser la tension superficielle tandis que le pouvoir mouillant et le pouvoir moussant de la solution savonneuse et son pouvoir détersif s’améliorent. O CH2

O

C

(CH2)4

CH3

CH2

OH

(CH2)4

CH3 + 3 Na+OH –

CH

OH + 3 CH3

CH3

CH2 OH glycérol

O CH

O

C

(CH2)4

COO – Na+

O CH2

O

C (CH2)4 palmitine

palmitate de sodium = savon

Figure 3.30 - Réaction de saponification Ex. la palmitine est un triglycéride qui réagit avec la soude pour donner le palmitate de sodium et du glycérol.

Les chaînes courtes fournissent au savon son pouvoir détergent et moussant alors que les chaînes longues lui donnent sa structure et sa dureté. Les chaînes polyinsaturées ne peuvent pas être utilisées dans la fabrication d’un savon solide mais une certaine quantité est indispensable dans les savons liquides. Seules les chaînes saturées et monoinsaturées (acide oléique) sont susceptibles d’être utilisées. Le pouvoir détersif des savons résulte de leur tensioactivité : faculté d’abaisser très sensiblement la tension superficielle de l’eau, provoquant le mouillage des surfaces (ou des particules) concernées et favorisant la formation d’émulsions, de suspensions…

APPLICATIONS ALIMENTAIRES ET INDUSTRIELLES Les huiles végétales sont essentiellement constituées de triglycérides et leurs propriétés sont liées à : hla nature des acides gras qui les composent et leur position, hla longueur de la chaîne carbonée, hleur degré d’insaturation (saturés, mono-, ou polyinsaturés) et à la position et à la nature de la double liaison (cis, trans), hla présence de groupements fonctionnels autres que carboxylique (OH, époxydes…) ou de cycles (furane, cyclopentane…). Cette diversité structurale a pour corollaire une diversité fonctionnelle. Des huiles déjà citées pour leur usage alimentaire sont également utilisées dans l’industrie agro-alimentaire comme les huiles de soja, de coprah, de colza, de lin, ainsi que de palmiste. Une huile extraite du ricin (Ricinus communis, Euphorbiacée) est cependant destinée uniquement aux applications industrielles. Parmi les deux secteurs de consommation des huiles et graisses (alimentation humaine et animale, industrie), la consommation industrielle connaît le taux de croissance le plus élevé. L’utilisation des huiles végétales dans les divers secteurs non-alimentaires s’effectue en fonction de leurs propriétés chimiques.

3 - LES LIPIDES

129

On peut distinguer schématiquement trois grandes catégories d’huiles végétales : hles huiles de palme (obtenues à partir de la pulpe du fruit mûr du palmier à huile, Elaeis guineensis et E. oleifera) et de coprah (obtenu à partir de l’albumen séché de la noix de coco, Cocos nucifera) qui contiennent surtout des acides gras saturés ; hl’huile de palmiste (obtenue à partir de la graine du palmier à huile), l’huile de coco (obtenue à partir de l’ensemble pulpe + lait de la noix de coco), de colza nouveau, d’arachide et d’olive qui contiennent surtout des acides gras monoinsaturés (ex. acide oléique) ; hles huiles fluides : soja, tournesol, maïs, pépins de raisin qui renferment surtout des acides gras polyinsaturés en C18. Les deux premières catégories, appelées « huiles concrètes », sont utilisées en proportion importante et croissante à des fins non-alimentaires alors que les huiles fluides (ou tempérées) peuvent être qualifiées d’huiles purement alimentaires. La principale caractéristique de l’huile de palme est sa richesse en provitamine A, son activité vitaminique va de 650 à 1150 UI/g d’huile : 5 à 10 g couvrent le besoin journalier de l’adulte. Elle est formée en majorité des glycérides d’acide palmitique (C16 : 0) et oléique (C18 : 1) avec 10 % d’acide linoléique (C18 : 2). Ses caractéristiques physiques comme huile végétale semi-solide en font un constituant intéressant pour les margarines, les shampooings et les confiseries. Elle peut être fractionnée par cristallisation et séparée en une oléine, plus liquide et une stéarine solide à plus haut point de fusion. L’huile de palme et l’oléine sont particulièrement utilisées dans la cuisson (180 °C) des aliments à l’échelle industrielle « fast-foods ». Elles résistent mieux que toute autre huile à ce traitement car elles n’ont pas d’acide linolénique (C18 : 3) et 10 % seulement d’acide linoléique (C18 : 2). De plus, elles contiennent des tocophérols (vitamines E), antioxydants naturels qui résistent à la température, stabilisant ainsi l’huile contre le rancissement au cours du traitement et du stockage et prévenant la déperdition des acides gras essentiels. L’huile de palme donne un savon de bonne qualité grâce à des acides gras de différentes longueurs de chaîne. Elle s’est imposée sur le marché mondial comme une huile bon marché et de qualité avec près de 16 % de la consommation mondiale. L’huile de coprah est utilisée comme matière première en savonnerie et en margarinerie (Végétaline®). L’huile de palmiste possède une composition très proche de celle de l’huile de coco. C’est une huile contenant 48 % d’acide laurique (C12 : 0) et 15 % d’acide myristique (C14 : 0). Son utilisation est en plein développement et concurrence l’huile de coco. Elle convient parfaitement pour les enrobages chocolatés ou pour les crèmes artificielles. Les huiles de palmiste et de coco sont les seules sources importantes d’acides gras saturés à chaîne courte utilisable dans l’industrie lipochimique. Si l’huile de palmiste est moins employée, c’est à cause de son fractionnement moins rentable par distillation fractionnée des acides gras en C8 et C10 et sa teneur plus élevée en C18. L’huile d’arachide, d’un intérêt nutritionnel plus faible que les huiles polyinsaturées, est cependant une bonne source d’acide linoléique (13 à 43 %). La résistance à la chauffe compense ses faiblesses nutritionnelles. L’huile d’olive, reconnue pour ses propriétés gustatives, supporte sans dommage la cuisson jusqu’à 210 °C.

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

L’huile de soja est une excellente huile pour salades et crudités car, bien que riche en acides gras polyinsaturés et en acide linoléique essentiel, sa teneur en acide linolénique de 5 à 11 % la restreint à des usages d’assaisonnement. En effet, l’altération de cette huile (comme celle, d’ailleurs, des autres huiles polyinsaturées) par oxydation, au cours des fritures est importante. Elle reste, et de loin, le premier oléagineux à être consommé dans le monde. Viennent ensuite les huiles de colza et de tournesol. L’huile de maïs est utilisée en alimentation mais aussi dans diverses applications industrielles (peinture, vernis, savonnerie…). D’autres huiles sont utilisées dans les plastiques et les polymères en quantités limitées, telle l’huile de colza riche en acide érucique. Cette dernière, additionnée en faible proportion (5 à 10 %) à des huiles minérales d’origine pétrolière, entre dans la composition des huiles de coupe destinées à la métallurgie. Le pouvoir lubrifiant élevé de ses acides gras à chaîne longue (18 atomes de carbone), la destine à des utilisations comme lubrifiant pour des machines utilisées en extérieur, susceptibles de subir des pertes accidentelles dans la nature et comme fluides hydrauliques. Elle est biodégradable et sans toxicité pour l’environnement. Pour la rendre impropre à la consommation, elle est dénaturée, généralement par addition d’aniline (2 %), produit aromatique azoté très toxique, donnant à l’huile un goût et une odeur désagréables. Les graines de colza destinées à l’agro-alimentaire humain doivent être exemptes d’acide érucique. Depuis que les méfaits de l’acide érucique sur le système cardio-vasculaire ont été établis, et grâce aux techniques génétiques, des variétés « 0 » (sans acide érucique) sont apparues sur le marché, puis des variétés, dites, double « 0 », contenant encore de plus faibles taux d’acide érucique et de glucosinolates (facteurs antinutritionnels). Aujourd’hui, l’huile de colza commercialisée est presque totalement dépourvue (0-0,3 %) d’acide érucique qui dans les variétés traditionnelles précédemment utilisées, représentait autour de 40 à 45 % de l’ensemble des acides gras. Les utilisations spécifiques de l’acide érucique et de ses dérivés sont nombreuses et dans des domaines divers. Sa longue chaîne mono-insaturée donne lieu à de nombreuses applications en lipochimie : lubrification, production d’agents fluidifiants pour le pétrole et d’adoucissants textiles ou encore d’agents d’érucamides, bases de polymères techniques, d’antimousses et de détergents. La coupure de l’acide érucique par oxydation de sa double liaison donne naissance à l’acide pélargonique à 9 atomes de carbone et l’acide brassylique à 13 atomes. À côté de l’utilisation de ces deux molécules pour la fabrication de détergents et de savons qui nécessitent des chaînes courtes (C6 à C14), l’acide brassylique, un diacide déjà utilisé en parfumerie, peut servir de molécule de base au développement du Nylon 13, par polymérisation. L’ester méthylique de colza, le Diester, a des caractéristiques physico-chimiques comparables à celles du gazole routier (tab. 3.8). Il s’utilise pur ou en mélange en toutes proportions à du gazole comme biocarburant de moteurs diesel et ne nécessite aucune modification des véhicules. Il peut être également mélangé à du fuel domestique comme biocombustible. Diester® – contraction de diesel et ester – est une marque déposée par AVRIL, l'acteur industriel et financier des filières des huiles et protéines. Il présente diverses propriétés : forte biodégradabilité (plus de 98 % en 21 jours), non-toxique, plus faibles émissions de dioxyde de carbone, de monoxyde de carbone et de dioxyde de soufre. La transformation de l’huile de colza en Diester s’obtient en la faisant réagir avec du méthanol (transestérification par le méthanol ou méthanolyse) en présence d’un catalyseur alcalin.

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La réaction se produit à température modérée (50 °C environ). 1 tonne d’huile + 100 kg de méthanol = 1 tonne de Diester + 100 kg de glycérol C3H5(OOCR)3 + 3 CH3OH $ 3 RCOCH3 + C3H5(OH)3 triglycéride méthanol ester méthylique glycérol Tableau 3.8 - Caractéristiques de l'ester méthylique de colza (Diester) [D’après SAIPOL, filiale du groupe AVRIL et producteur du Diester, avec permission]

Caractéristiques

Gazole

Diester®

densité à 15 °C

0,83 à 0,86

0,88

point éclair [°C]

> 55

188

indice de cétane

51

51

< –15

–12 à –15

35,3 à 36,3

33,2

2 à 4,5

4,5

0

11%

TLF [°C] PCI [MJ/l] 2

viscosité à 40 °C [mm /s] oxygène

Indice de cétane : aptitude à l’auto-inflammation. TLF : Température Limite de Filtrabilité (peut être améliorée chimiquement). PCI : Pouvoir Calorifique Inférieur = quantité de chaleur dégagée par la combustion. Point éclair : température à partir de laquelle les vapeurs dégagées sont inflammables.

La méthanolyse est un procédé qui pourrait être appliqué à beaucoup d’autres huiles végétales (comme les huiles de soja, de palme et de microalgues). Une augmentation très forte de la production de ce genre de biocarburant est prévue dans un proche avenir. Les esters d’acides gras de colza ou de tournesol sont également utilisés dans les encres offset en substituts des distillats pétroliers pour répondre à des considérations écologiques. L’auto-oxydation et la polymérisation sont caractéristiques de certaines huiles végétales composées de glycérides très insaturés. L’industrie utilise ces propriétés pour préparer de l’huile cuite, des peintures et des vernis (mélange d’huiles et de résine), particulièrement pour les surfaces extérieures. L’huile cuite est fabriquée à partir d’huiles riches en esters d’acides linoléique et linolénique. Ces huiles, capables de sécher à l’air lorsqu’elles sont déposées en couche mince, sont appelées siccatives : huiles de lin, d’œillette, de noix, de chènevis, de tournesol… Elles sont sombres et visqueuses, sèchent à l’air en formant une pellicule souple et luisante. Au cours de ce séchage, les huiles sont oxydées par l’oxygène atmosphérique. Ce processus est accéléré par addition de siccatifs (oxydes ou sels de cobalt, manganèse, plomb). L’huile de lin est utilisée dans les revêtements protecteurs (peintures, vernis et laques), les encres d’imprimerie et les revêtements antiécaillage pour le béton. La linoxine, polymère oxydé de l’huile de lin (pâte épaisse et élastique) s’emploie pour fabriquer du linoléum et des toiles cirées. Une grande part des huiles et des graisses utilisées dans l’industrie chimique est transformée par l’industrie de la lipochimie. Celle-ci a pour activité principale de scinder les triglycérides des huiles et des graisses naturelles en acides gras et glycérol et de transformer ces acides gras en produits utilisables en chimie.

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

On distingue deux catégories dans les produits de la lipochimie : hles produits de base : acides gras, esters méthyliques, alcools gras, amines grasses et glycérol ; hles dérivés de ces produits de base : amides grasses, composés ammoniacaux quaternaires… Les acides gras et esters méthyliques sont principalement utilisés en tant qu’intermédiaires dans la production de nouveaux composés lipochimiques (alcools gras, esters, amines, amides, sels métalliques, esters de sucre….). Ils sont aussi utlisés à l’état brut. Les débouchés directs des acides gras sont multiples (savons, détergents, lubrifiants, peintures et encres, textiles, caoutchouc…). En revanche, une des rares applications directes des esters méthyliques est la production d’un carburant, substitut du gazole (voir plus haut). Enfin, le débouché principal des alcools gras est le marché des tensioactifs pour leurs propriétés détergentes. Les lubrifiants sont formulés à partir d’huiles de base auxquelles on ajoute des additifs permettant une protection maximum en fonction des besoins requis. Les huiles naturelles peuvent être utilisées en tant qu’huile de base ou en tant qu’additifs (1 à 3 %). Pour les lubrifiants industriels (huile de coupe, huile hydraulique, huile pour forage en mer…), on utilise également des esters d’acides gras à chaînes longues monoinsaturées (C12 à C22), très appréciés pour leur fluidité importante, leur oxydabilité plus faible et leur plus grande stabilité. Les huiles végétales (ou leurs dérivés) les plus couramment utilisées dans l’industrie des lubrifiants sont : l’huile de ricin (hydrogénée), les huiles de coprah et de palmiste, l’huile de tournesol riche en acide oléique et l’huile de colza normale et érucique. L’huile de ricin est très majoritairement (90 %) composée de triglycérides d’un acide gras en C18, l’acide ricinoléique, accompagné d’autres acides gras, également en C18 : oléique (3 %) et linoléique (3-4 %). Chauffés, ces acides se cassent en deux chaînes à 7 et 11 atomes de carbone : Le C7, ou oenanthaldéhyde (à l’odeur de vin), et le C11, ou acide 10-undécénoïque (fig. 3.31), également fabriqué par le corps humain, puisqu’il est présent dans la transpiration, les larmes et les cheveux. Le C7 entre dans la composition des verres Triplex des pare-brise et dans la formulation des lubrifiants pour les substituts des CFC. En plus de leur polyvalence, les formules à base de C7 ont le triple avantage de n’être ni toxiques, ni huileuses et d’être stables à des températures allant jusqu’à 200 °C. Elles peuvent donc être avantageusement utilisées pour la protection des circuits fermés et également pour la protection des tôles et des tubes d’acier contre la corrosion atmosphérique. Le C11 et ses dérivés offrent cependant l’éventail d’applications le plus vaste grâce à sa molécule bifonctionnelle :

H2N NH

(CH2)10

CO

COOH

acide 10-undécénoïque

COOH

acide 11-amino-undécanoïque

n

monomère du polyamide 11

Figure 3.31 - Le C11 et ses dérivés Par amination de la double liaison terminale de l’acide C11, on obtient l’acide 11-amino-undécanoïque qui, par polycondensation, donne le polyamide 11 (voir fig. 3.31). Ce dernier, mieux connu sous le nom de Rilsan, est sans doute l’application du ricin la plus connue. Produit d’origine végétale, le Rilsan, comme le C7 et les autres dérivés du C11, est une matière renouvelable et non-polluante. Possédant toutes les vertus d’un produit « vert », le Rilsan peut être extrudé, injecté, rotamoulé,

3 - LES LIPIDES

133

déposé sur des supports auxquels il confère des propriétés complémentaires : anticorrosion, antiusure, lubrifiant… Mais ces vertus doublent lorsque le Rilsan est réduit en poudre. Celle-ci permet de réaliser des bains fluidifiés. Si l’on trempe une pièce métallique chauffée à une température supérieure à 250 °C dans un « bain » de Rilsan, ce dernier fond sur la surface de la pièce et y forme un film parfaitement étanche. C’est le procédé du « lit fluidisé ». Ces intéressantes propriétés ont valu au Rilsan de nombreuses applications industrielles. Il entre dans la composition de nombreuses peintures pour leur donner une résistance exceptionnelle aux chocs et à l’usure : on retrouve le Rilsan sur les claviers d’ordinateurs, sur le toit des Renault Espace, les sous-vêtements. Il est aussi utilisé comme revêtement des conduites de distribution municipale d’eau, dans les tuyauteries des immeubles… Mais ses principaux marchés, ce sont les paniers de lave-vaisselle, les flexibles de freins des camions, les flexibles offshore, les tuyaux à gaz et pneumatiques, les câbles téléphoniques.

APPLICATIONS PHARMACEUTIQUES ET COSMÉTIQUES D’autres huiles sont largement utilisées en industrie pharmaceutique et en cosmétique, soit comme excipient pour donner de l’onctuosité à des laits et des crèmes dermiques, des pommades ou des potions, soit comme source de substances actives ; ainsi les huiles d’amande douce (fournies par les graines mûres de Prunus dulcis variété dulcis ou amara), d’arganier3, de noisette, d’avocat, de ricin, de sésame, de karité et de cacao sont utilisées en cosmétologie et en dermatologie. L’huile de lin est connue pour ses propriétés purgatives. C’est aussi une source abondante d’acides γ-linoléique et α-linolénique. Les huiles de germe de maïs, de soja, de tournesol, contenant des acides gras insaturés, sont conseillées en cas d’hypercholestérolémie et d’hyperlipémie.

3.9. MÉTHODES D’ÉTUDE 3.9.1. EXTRACTION L’extraction des lipides est habituellement effectuée au moyen de solvants organiques apolaires, comme l’hexane ou l’isopropanol. D’autres solvants peuvent être utilisés pour des lipides particuliers. Ils incluent : l’éther diéthylique et le chloroforme pour des lipides neutres et les lipides de réserve ; l’éthanol ou le méthanol pour des lipides membranaires (plus polaires) ; le chloroforme-méthanol ; le chloroforme-méthanol-eau… L’extraction des lipides des végétaux est souvent rendue difficile à cause des lipases actives qui hydrolysent rapidement les glycolipides et les phospholipides et augmentent ainsi le taux d’acides gras libres dans l’extrait. Une macération préalable dans l’isopropanol permet d’inhiber ces enzymes.

3

pour des compléments d’information, voir L'huile d'argan sur le site web dédié

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.9.2. MÉTHODES ANALYTIQUES GÉNÉRALES 3.9.2.1. MÉTHODES CHIMIQUES Indice d’acide L’indice d’acide d’un corps gras correspond au nombre de mg d’hydroxyde de potasTJVN
TPMVUJPO
ÏUIBOPMJRVF
EF
,0)
OÏDFTTBJSF
QPVS
OFVUSBMJTFS
MBDJEJUÏ
MJCSF
DPOUFOVF
dans 1 g de corps gras dissous dans un mélange éther éthylique/éthanol, en présence de phénophtaléine. L’indice d’acide est déterminé par dosage acido-basique direct ou indirect, à l’aide de potasse alcoolique de concentration connue, le corps gras étant mis en solution dans un solvant organique à une concentration voisine de 40 g/mL.


R–COOH + OH $ R–COO – + H2O BDJEF
HSBT

,0)

DBSCPYZMBUF

Le dosage direct a lieu en présence de phénolphtaléine : virage (entre pH 8,2 et pH 10,0) de l’incolore au rose. Lors d’un dosage indirect, le corps gras est dissous dans un excès précis de potasse alcoolique. L’excès est dosé par une solution d’acide chlorhydrique de concentration connue, en présence de phénolphtaléine : virage du rose à l’incolore. L’acidité d’un corps gras (huiles brutes ou raffinées, graisses, beurres…) résulte de la présence des carboxyles appartenant à des acides gras libres dont la teneur augmente avec le temps de conservation. L’indice d’acide rend donc compte de l’altération hydrolytique des corps gras. Celle-ci est connue sous le nom de rancidité lipolytique. La lipolyse peut être le fait d’enzymes ou d’un traitement thermique, par exemple, lors du raffinage.

Indice de peroxyde L’indice de peroxyde d’un corps gras est le nombre de milliéquivalents d’oxygène contenus dans 1 kg de produit et oxydant l’iodure de potassium avec libération d’iode. Sa détermination consiste à traiter le corps gras en solution dans de l’acide acétique et du chloroforme par une solution d’iodure de potassium qui, en en présence de peroxydes, libèrent l’iode. L’iode libéré est ensuite dosé par une solution titrée de thiosulfate de sodium. L’indice de peroxyde renseigne sur la formation des composés primaires d’oxydation (peroxydes) en cours. Un raffinage soigneux se remarque à l’odeur et au goût neutres du corps gras traité. L’indice de peroxyde doit être aussi proche de zéro que possible et la teneur en acides gras libres doit correspondre à celle obtenue après le traitement de neutralisation. Cet indice n’est plus fiable pour les phases avancées d’oxydation à cause de la décomposition des hydroperoxydes formés en composés secondaires d’oxydation. Ainsi, un indice de peroxyde faible n’est donc pas forcément indicateur d’une absence d’oxydation. Aussi, il est recommandé en général d’associer plusieurs indices pour mesurer le degré d’oxydation d’un lipide.

3 - LES LIPIDES

135

Indice d’anisidine Cet indice mesure la quantité d’aldéhydes présents dans les corps gras. L’auto-oxydation de ces produits au contact de l’air donne naissance à de nombreux dérivés oxygénés dont les aldéhydes, un des responsables du rancissement oxydatif. En réagissant avec l’anisidine, ces derniers donnent des composés colorés, dosés par spectrophotométrie. Les indices d’acidité, de peroxydes et d’anisidine sont des paramètres habituellement déterminés en vue d’apprécier la stabilité des corps gras dans le temps. La présence d’acides gras libres, des indices de peroxyde et d’anisidine élevés, la présence de doubles liaisons conjuguées, témoignent de modifications oxydatives et donc d’un entreposage inadapté ou trop long.

Indice d’iode L’indice d’iode d’un corps gras (graisse ou huile) se définit comme le nombre de g d’iode qui peuvent se fixer (c'est-à-dire s’additionner sur les liaisons C=C) pour 100 g de produit. L’indice d’iode est mesuré par addition au corps gras, d’un excès de monochlorure d’iode en solution (solution de Wijs) dans un mélange d’acide acétique et de cyclohexane. Après un temps donné de réaction, l’iode résiduel (n’ayant pas réagi) est titré par une solution de thiosulfate de sodium. Cette méthode convient uniquement pour les huiles sans doubles liaisons conjuguées. L’indice d’iode n’est pas un critère de qualité de la matière grasse mais il renseigne sur le degré d’insaturation du corps gras. Seuls les composés insaturés (les plus oxydables) sont susceptibles de fixer l’iode par addition. Cet indice augmente en même temps que la proportion des acides gras non-saturés. Il est constant pour une matière grasse donnée.

Indice de saponification L’indice de saponification d’un corps gras (graisse ou huile) est défini comme étant le nombre de mg d’hydroxyde de potassium nécessaire pour hydrolyser (saponifier) complètement 1 g de produit dans les conditions opératoires spécifiées. Une quantité connue d’échantillon est bouillie à reflux en présence d’une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium, puis titrée par une solution d’acide chlorhydrique en présence de phénolphtaléine. Cet indice est inversement proportionnel à la masse moléculaire des acides gras composant les triglycérides.

Matières insaponifiables Par matières insaponifiables on désigne la fraction constituée des substances solubles dans l’huile mais qui, après saponification, ne deviennent pas hydrosolubles mais solubles dans le solvant utilisé pour la détermination (éther éthylique ou éther de pétrole). Elle est constituée essentiellement de stérols (campestérol, brassicastérol, stigmastérol, ergostérol), de cétones, d’alcools gras, de caroténoïdes, de chlorophylle, de cires, de vitamines et provitamines liposolubles (vitamines A, D, E et , 

136

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

3.9.2.2. MÉTHODES PHYSIQUES Parmi les tests les plus couramment utilisés pour l’identification mais aussi pour le contrôle de routine des huiles, on peut citer : la densité relative, l’indice de réfraction, la couleur, la viscosité et le point de fusion. Comme pour les tests chimiques, ces tests sont standardisés.

3.9.3. SÉPARATION ET IDENTIFICATION La séparation et l’identification des lipides se fait généralement par des techniques chromatographiques basées sur les différences d’affinité des espèces chimiques pour le couple de phases chromatographiques : la phase stationnaire (solide ou liquide) et la phase mobile (liquide ou gazeuse). En utilisant des paramètres adaptés au type de molécules, on peut donc séparer les différents constituants d’un mélange. La DISPNBUPHSBQIJF
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de routine pour séparer, à moindre coût, les diverses classes de lipides. Cette technique utilise une couche mince de phase stationnaire comme la silice ou la cellulose sur un support plat (plaque), habituellement en verre ou en aluminium. Une grande variété de combinaisons de phases stationnaires à base de silice et de phases mobiles permet la séparation de pratiquement toutes les classes de lipides. Les méthodes de visualisation sont aussi variées : vapeur d’iode, réactifs spécifiques (tels que le molybdate pour les glycérophospholipides), carbonisation avec l’acide sulfurique… La ninhydrine est utilisée pour localiser les phospholipides associés aux groupements aminés tels que la phosphatidylTÏSJOF
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méthodes de détection, elle est souvent utilisée en premier dans le cadre d’un screening rapide pour mettre au point des techniques plus sophistiquées et plus sensibles. La séparation des lipides neutres peut se faire sur colonne de gel de silice en phase normale, éluée par le chloroforme ou l’acétone, selon leur polarité. Les acides gras sont généralement analysés sous leur forme d’esters méthyliques par chromatographie en phase gazeuse (CPG) avec des colonnes capillaires. Le choix de la méthode de préparation des esters dépend de la nature de la matière grasse à analyser. Cette technique convient bien aux acides gras dont la chaîne hydrocarbonée contient de 8 à 24 atomes de carbone. Leur quantification peut se faire par ionisation de flamme ou, mieux encore, par TQFDUSPNÏUSJF
EF
NBTTF
4.  La chromatographie liquide haute performance (CLHP), comme la CPG, sépare les acides gras individuels. Ces derniers sont habituellement séparés sur une colonne de silice en phase inverse (C18), éluée par le méthanol ou par un gradient acétonitrile-eau. La séparation se produit d’après la polarité, la longueur de la chaîne, et le degré d’insaturation ; les acides gras courts, polaires, insaturés étant élués les premiers. Des phases stationnaires chirales peuvent séparer efficacement des énantiomères de lipides tels que les acides hydroxyeicosatétraénoïques. La CLHP peut être utilisée seule ou en couplage à la spectroNÏUSJF
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4.

3 - LES LIPIDES

137

La spectroscopie par SÏTPOBODF
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EFT
informations très précises sur la structure des lipides. De nouvelles méthodes d’analyse de plus en plus performantes sont actuellement mises en œuvre pour l’analyse, à la fois, qualitative, quantitative et structurale de lipides à des concentrations infinitésimales, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives d’applications comme l’analyse de l’ensemble des lipides dans un système donné (cellules, tissus, organe…). Cet ensemble d’outils et de méthodes a donné naissance à un nouveau concept, celui de la lipidomique (par analogie à génomique ou protéomique).

3.9.4. LIPIDOMIQUE La lipidomique est le champ de recherche émergent dédié à l’étude exhaustive des lipides dans les systèmes biologiques (ou lipidomes). Bien que ces études aient été pratiquées depuis des décennies, le terme « lipidome » n’est apparu dans la littérature qu’en 2001. En 2002 apparait le terme « lipidomique fonctionnelle », définie alors comme étant « l'étude du rôle joué par les lipides de la membrane ». Aujourd’hui, de nouvelles définitions, technologies et applications biologiques sont apparues. La lipidomique fait partie du champ général de la « métabolomique ». Toutefois, la lipidomique est une discipline distincte en raison de l'originalité et de la spécificité fonctionnelle des lipides par rapport à d'autres métabolites. Par exemple, la plupart des composants du lipidome cellulaire sont extractibles avec des solvants organiques ; ils sont donc assez facilement récupérés et séparés des autres métabolites hydrosolubles. Il est clair, cependant, que sans précautions spéciales de nombreuses classes de molécules de lipides (comme les phospho-inositides, très polaires) s'échappent dans le milieu aqueux pendant la séparation de phases. Les lipides forment des agrégats, notamment lorsque leur concentration augmente, sous forme de dimères, d’oligomères, de micelles, de bicouches ou d’autres types agrégats. Cette propriété unique se traduit par des difficultés importantes pour quantifier les différentes espèces de lipides dans leurs formes intactes. Les études antérieures étaient concentrées sur une seule espèce, une classe de lipide ou une voie catalysée par une enzyme, alors que le nombre de lipides dans un système cellulaire est estimé de quelques dizaines de milliers à des millions. Les recherches actuelles en lipidomique incluent l'identification structurale et fonctionnelle et la quantification de la plupart des lipides cellulaires et des espèces moléculaires chimiquement distinctes issues de différentes combinaisons d'acides gras ainsi que leurs interactions les uns avec les autres, avec les protéines et autres constituants in vivo. La lipidomique examine également la dynamique des lipides cellulaires, identifie leur organisation à l’échelle cellulaire et sub-cellulaire et détermine les changements dynamiques qui se produisent durant les perturbations physiologiques et pathologiques. La recherche en lipidomique génère une quantité considérable d'informations décrivant les changements spatiaux et temporels du contenu et de la composition en lipides dans un système donné, se produisant normalement ou après perturbation de son état physiologique (nutritionnel par exemple, influences hormonales, état de santé, niveaux métaboliques…)

138

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

ou pathologique. L'information obtenue est traitée par bioinformatique ce qui permet de mieux comprendre les changements dans le fonctionnement cellulaire. Par conséquent, les études en lipidomique jouent un rôle essentiel dans la définition des mécanismes biochimiques des processus physiologiques et/ou pathologiques liés aux lipides grâce à l'identification des altérations de leur métabolisme cellulaire et l'homéostasie du système sélectionné, qui peut être un type de cellule, un organe ou même un organisme tout entier. Sur le plan analytique, avec les méthodes traditionnelles d’étude, des espèces moléculaires individuelles de nombreuses classes de lipides peuvent être analysées. Toutefois, ces techniques « classiques » manquent souvent de sensibilité ou nécessitent de grands volumes d’échantillons et des procédures laborieuses pour la préparation de l'échantillon. De plus, leur résolution est limitée, c'est-à-dire qu'elles ne permettent d’analyser qu’un ensemble limité d'espèces moléculaires. La CPG a été et est encore souvent utilisée pour l'analyse des lipides, mais des procédures souvent fastidieuses d'hydrolyse et de dérivatisation sont nécessaires pour la plupart des lipides. .BMHSÏ
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la large gamme de concentrations de lipides ont conduit à développer des méthodes plus appropriées axées sur la CPG et répondant aux besoins de la lipidomique, capables de mesurer et identifier tous les lipides dans un seul échantillon simultanément. En conséquence, de multiples approches analytiques, souvent complémentaires, sont couramment utilisées dans le domaine de la lipidomique. %F
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4.
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fluorescence, la CLHP, sont utilisées en lipidomique. Les techniques permettant d'explorer MFT
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4.
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EÏDFOnies vers une sensibilité et une résolution plus élevées, leur miniaturisation a grandement facilité leur utilisation. Il en est de même des techniques de quantification. -FT
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JOOPvations dans les techniques chromatographiques ont conduit, dans une large mesure, au développement de l’analyse à haut débit des lipides. Il est désormais possible d’effecUVFS
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a bénéficié de l’émergence de méthodes d’ionisation douces telles que la désorption/ ionisation laser assistée par matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
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l’ionisation par électronébulisation (ElectroSpray Ionization, ESI) et l’ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). De plus, les nouveaux spectromètres de masse sont équipés de détecteurs de plus en plus sensibles et précis comme le mode de détection en « temps de vol » (Time Of Flight, TOF) pour la détermination des masses moléculaires avec une très grande résolution. Les stratégies utilisées actuellement dans ce domaine incluent également la SM en tandem
4.4. 
En raison de ses grands avantages, de nombreux laboratoires ont adopté l’approche EhBOBMZTF
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changements provoqués par le stress sur les lipides des plantes et les mécanismes bio-

3 - LES LIPIDES

139

chimiques responsables de ces changements. Cette méthode est devenue un outil essentiel pour la recherche en lipidomique. -FT
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directions principales. La première consiste en la caractérisation structurale des différentes classes de lipides et l’identification de nouveaux lipides et espèces moléculaires, principalement grâce à l'analyse des profils de fragmentation après dissociation induite QBS
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la découverte de nouvelles classes de lipides et espèces moléculaires. L'autre direction concerne la quantification des espèces moléculaires individuelles intactes, même celles se trouvant à des taux aussi faibles que la femtomole par mg de protéines cellulaires dans un type de cellule ou dans un échantillon de tissu.

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

4 - LES HUILES ESSENTIELLES 4.1. DÉFINITION Connues aussi sous le nom d’essences ou d’huiles éthérées, les huiles essentielles désignent un ensemble de substances volatiles d’odeur tout à fait caractéristique que l’on extrait de certains végétaux, dits aromatiques, soit par entraînement à la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, soit par expression, par incision de la plante, ou bien parfois par séparation à l’aide de solvants, soit encore par adsorption sur des graisses (enfleurage).

4.2. RÉPARTITION, LOCALISATION Les huiles essentielles sont présentes en quantité appréciable chez environ 2000 espèces de plantes supérieures, réparties dans 60 familles. Le tableau 4.1 en donne quelques exemples. Les huiles essentielles se trouvent en général dans les fleurs et les feuilles, mais on les trouve également dans les fruits, le bois, l’écorce, les racines ou les rhizomes et les graines. Toutefois, leur composition varie dans une plante suivant l’organe utilisé. Cette large distribution des huiles essentielles dans le règne végétal est associée à des structures cellulaires épidermiques spécialisées dans la production de ces substances et/ou leur accumulation : cellules sécrétrices des Lauracées, des Piperacées ou des Zingiberacées, poils sécréteurs externes des Lamiacées et des Geraniacées, poches sécréUSJDFT
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des Conifères. Dans le cas le plus simple, les huiles essentielles se forment dans le cytosol des cellules où elles vont, soit se rassembler en gouttelettes lipophiles, soit s’accumuler dans les vacuoles des cellules épidermiques ou des cellules du parenchyme de nombreux pétales, de même que dans les cellules oléifères. Les végétaux sont plus riches en huiles essentielles par temps chaud ; ces huiles traversent alors la paroi cellulaire et la cuticule et sont rejetées vers l’extérieur sous forme de vapeur. .BJT
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BDUJWFment les huiles essentielles dans des compartiments de stockage intercellulaires, soit les rejettent directement vers l’extérieur, à la surface du végétal.

142

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE Tableau 4.1 - Familles botaniques particulièrement riches en huiles essentielles

Familles

Principales espèces

Organes utilisés

Lamiacées

très nombreuses espèces dont : Basilic (Ocimum basilicum
t Calament (Calamintha spp.
t
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Lavandula spp.
t
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t
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Thymus vulgaris
t
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t
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t
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t
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Mentha x piperata
t .ÏMJTTF
Melissa officinalis)…

feuilles

Apiacées

Cumin (Cuminum cyminum
t
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Carum carvi
t Anis vert (Pimpinella anisum
t
'FOPVJM
Foeniculum spp.
t graines Aneth (Anethum graveolens
t
$PSJBOESF
Coriandrum sativum
t Persil (Petroselinum sativum)

Anacardiacées Pistachier lentisque (Pistachia lentiscus)

.ZSUBDÏFT

Liliacées

Eucalyptus (Eucalyptus globulus
t
.ZSUF
Myrtus communis
t Cajeput (Melaleuca cajuputi
t Niaouli (Melaleuca quinquenervia) Giroflier (Syzygium aromaticum)… Oignon (Allium cepa)

.ZSJTUJDBDÏFT .VTDBEJFS
Myristica fragrans)

Conifères

Pin (Pinus spp.
t
$ZQSÒT
Cupressus sempervirens
t
Epicéas (Picea spp.
t
4BQJO
CBVNJFS
Abies balsamea) Genévrier (Juniperus communis) Cade (Juniperus oxycedrus
t
$ÒESF
Cedrus spp.)…

Agrumes

Citronnier (Citrus limon) t Bergamotier (Citrus aurantium ssp. bergamia) t .BOEBSJOJFS
Citrus nobilis var. reticula) t Oranger doux (Citrus sinensis) t Oranger amer (Citrus aurantium ssp. aurantium
t
1BNQMFNPVTTJFS
Citrus paradisii)…

feuilles, fruits feuilles fruits (clous) bulbes tiges fraîches noix rameaux feuillés rameaux à baies bois

péricarpes

Zingiberacées Gingembre (Zingiber officinalis) t Curcuma (Curcuma spp.)

rhizome

Oleacées

Jasmin (Jasminum officinale)

fleurs

Lauracées

Cannellier (Cinnamomum spp.) Sassafras (Sassafras albidum) Laurier (Laurus nobilis)…

écorce du tronc écorce des racines feuilles

Asteracées

très nombreuses espèces dont : Absinthe (Artemisia absinthum)
t
Armoise (Artemisia vulgaris) t Estragon (Artemisia tige feuillée dracunculus
t
.BUSJDBJSF
Chamomilla recutita)…

4.3. COMPOSITION ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Après isolement (voir section 4.6, Facteurs affectant la composition et le rendement des huiles essentielles), on obtient des substances à forte odeur aromatique, généralement liquides,

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

143

faiblement colorées, de densité inférieure à celle de l’eau (à l’exception des essences de cannelle, de girofle et de sassafras). Les huiles essentielles se distinguent des huiles grasses qui sont fixes et tachent le papier d’une manière permanente, alors que pour les huiles essentielles leur tache sur le papier disparaît sous l’effet de la chaleur. D’un point de vue chimique, il s’agit de mélanges extrêmement complexes contenant pour la plupart plusieurs centaines de constituants, on les divise en : X huiles essentielles hydrocarburées : essence de térébenthine (oléorésine de divers pins), de citron… Ce sont les plus nombreuses ; X huiles essentielles oxygénées : essence de rose, de menthe… ; X huiles essentielles sulfurées : celles des Brassicacées, des Liliacées ; X huiles essentielles à carbures terpéniques et leurs dérivés oxygénés : Z monoterpénoïdes : limonène, pinène, camphène, cymène… sont, de loin, les constituants majoritaires, suivis des sesquiterpènes. Par exemple, la constitution de l’huile essentielle de cannabis fraiche est de 92 % de monoterpènes et 7 % de sesquiterpènes sur un total de 120 terpénoïdes différents identifiés. Bien que quantitativement moins importants que les monoterpénoïdes, certains sesquiterpènes ont un grand impact sur la flaveur générale, tel est le cas de l’oxyde de caryophyllène, un constituant du cannabis, perceptible par les chiens dépisteurs de drogues à une quantité de l’ordre de 1 μg, soit 106 fois moins que celle requise par l’homme. Z alcools : menthol, linalol, bornéol, géraniol… Z esters : acétate de linalyle, de bornyle, salicylate de méthyle… Z aldéhydes : essences d’amandes amères, aldéhydes benzoïques et cinnamiques, citral… Z cétones : menthone, carvone, thuyone… Z éther-oxydes : cinéole… X huiles essentielles à composés aromatiques : Z dérivés d’acides phénoliques simples (benzoïque, vanilline) ou du phénylpropane (cinnamique), Z phénols : anéthol, thymol, eugénol, carvacrol, apiol… Lorsque la molécule est optiquement active – ce qui est presque toujours le cas – la proportion des deux énantiomères varie considérablement selon l’espèce végétale considérée. L’un des deux peut être très largement majoritaire. Leurs caractéristiques odorantes sont souvent différentes. Le (+)-carvone, par exemple, donne son odeur au cumin, tandis que le (–)-carvone est responsable de la sensation de menthe poivrée. Les huiles essentielles sont solubles dans l’alcool et les solvants organiques habituels des huiles comme le chloroforme, le benzène ou l’éther, pratiquement très peu ou pas solubles dans l’eau. Elles sont liquides à la température ambiante. Leur point d’ébullition varie de 160 à 240 °C et leur densité de 0,759 à 1,096, généralement. Elles sont dextrogyres ou lévogyres, le plus souvent optiquement actives et possèdent un indice de réfraction caractéristique.

144

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Du fait de leur complexité et de l’adultération dont elles font l’objet, les huiles essentielles rendent difficiles leurs séparations chromatographiques, nécessitant une caractérisation sur colonne capillaire très fine.

4.4. PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES ET PHARMACOLOGIQUES Les huiles essentielles sont des substances douées d’activités pharmacologiques beaucoup plus importantes que les plantes fraîches ou que les drogues elles-mêmes. Elles possèdent de nombreuses propriétés qui peuvent être, selon les cas : antiinfectieuses (bactéricides, bactériostatiques, antibiotiques, antifongiques, antiparasitaires), expectorantes, diurétiques, antirhumatismales, circulatoires, hyper- ou hypotensives, tonifiantes, stomachiques, hypoglycémiantes, cicatrisantes, et, enfin spasmolytiques et sédatives. Elles sont employées quelquefois pures, mais le plus souvent en solution dans l’alcool. L’action cytotoxique des huiles essentielles sur les cellules bactériennes serait due à une désorganisation de la paroi et à sa perméabilisation. Chez les cellules des Eucaryotes, les huiles essentielles provoquent la dépolarisation des membranes mitochondriales par abaissement du potentiel de membrane, perturbent les canaux ioniques (notamment des ions Ca2+), réduisent le gradient de pH et affectent la pompe à protons. Elles changent la fluidité des membranes qui deviennent anormalement perméables. Certains constituants individuels de nombreuses huiles essentielles, notamment des monoterpènes comme le limonène, le citral, le carvone, le carvéol, le menthol et le géraniol ; des sesquiterpènes comme l’α-cadinol et l’α-humulène et des phénylpropanoïdes comme l’eugénol se sont révélés doués d’activités anticarcinogéniques sur des cellules cancéreuses animales et/ou humaines. Ces composés agissent à différents niveaux cellulaires et moléculaires. Par exemple, le géraniol inhibe la prolifération des cellules cancéreuses du colon en induisant une dépolarisation des membranes, en interférant avec les canaux ioniques et les voies de signalisation et en inhibant la synthèse de l’ADN. Les huiles essentielles sont également employées en thérapie soit pour leurs propriétés aromatisantes (essences d’anis, d’orange amère), soit en raison de vertus curatives propres : actions antiseptiques des voies respiratoires des essences d’eucalyptus ou de niaouli, rubéfiante de l’allyle sévénol contenu dans l’essence de moutarde (cataplasmes), vermifuge de l’essence de tanaisie ou de chénopode. Les essences d’absinthe, de sabine et de thuya, emménagogues mais abortives à fortes doses, sont soumises à une réglementation. L’essence de camomille jouit de propriétés antispasmodiques mais aussi antiinflammatoires, grâce à la présence d’azulènes. Les essences d’anis et de badiane, stimulantes pour le système nerveux, sont convulsivantes à fortes doses. D’autres essences, celles de thym et d’origan par exemple, entrent dans la composition de substances insectifuges. Qui dit pouvoir thérapeutique dit dangers potentiels. Plus que la phytothérapie, l’aromathérapie est susceptible, à certaines doses ou chez des sujets prédisposés, de provoquer des effets secondaires plus ou moins graves, des accidents nerveux (convulsions, crises épileptiques…), parfois le coma et la mort. C’est le cas, par exemple, des huiles essentielles de sauge, de romarin, d’hysope, d’eucalyptus et de marjolaine (et toutes celles

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

145

contenant des cétones qui sont neurotoxiques) qui peuvent, même à faibles doses, être toxiques. Certaines sont photosensibilisantes. Par exemple, l’huile essentielle du zeste de bergamote (Citrus bergamia) contient des psoralènes qui, sous l’effet des rayons UV-A, se lient à l’ADN et provoquent des mutations. Il convient alors de ne pas s’exposer au soleil après application sur la peau.

UTILISATIONS INDUSTRIELLES L’intérêt des huiles essentielles ou essences est reconnu depuis l’Antiquité. De nos jours, ces produits naturels sont considérés comme des produits à très haute valeur ajoutée destinés à différents secteurs industriels tels que l’industrie agro-alimentaire, l’industrie chimique et la parfumerie, la cosmétique, l’aromathérapie… hEn alimentation, elles donnent leur saveur aux condiments (poivre, gingembre…) et aux aromatisants (menthe, anis, oranger, citronnier, cumin, thym, laurier, romarin). Chacune de ces espèces doit en effet sa saveur à un ou plusieurs principes particuliers entrant dans sa composition : apiol de l’essence de persil, anéthol du fenouil ou de l’anis, phellandrène de l’essence d’angélique, limonène et anthranilate de méthyle de l’essence d’oranger, menthol des menthes. Aussi ces substances, isolées ou, parfois, obtenues par synthèse, peuvent-elles servir pour remplacer les essences ou pour aromatiser certains produits alimentaires : boissons gazeuses, aliments préparés… De plus, à faible dose, certaines substances ont un effet favorable sur la digestion, ce qui explique leur utilisation en liquoristerie (essences d’anis ou de badiane). 1 hL’industrie des parfums et des produits cosmétiques est le principal consommateur des plantes à huiles essentielles. Actuellement, près de 300 huiles essentielles ont une importance commerciale et sont utilisées en parfumerie ou dans les produits cosmétiques ou hygiéniques. Les plus connues d’entre elles sont celles des roses, du jasmin, de la lavande, de la violette, de la verveine, du citron… Les huiles essentielles sont rarement employées seules (irritantes, avec parfois une odeur désagréable, forte, acre). En général, on les dilue (souvent dans l’alcool) pour développer leur odeur. L’huile essentielle de bergamote est un des composants indispensables des eaux de Cologne et des parfums les plus luxueux. L’huile de bergamote est également utilisée depuis peu dans l’industrie cosmétique, mais sous forme débergapténisée (de laquelle on extrait le bergaptène, une furanocoumarine), pour l’élaboration de crèmes, de savons, de sels de bain, de dentifrice et d’autres produits. En effet, la débergapténisation permet de supprimer les propriétés photosensibilisantes de l’huile dont les effets peuvent être néfastes. hEn pharmacie, l’utilisation des huiles essentielles, en tant que telles, reste limitée à quelques applications comme des antiseptiques externes ou aromatisants pour certaines formes médicamenteuses destinées à la voie orale. Cependant, de nombreuses plantes à huiles essentielles sont utilisées sous forme de tisanes, de pommades florales, par exemple. hIndustrie chimique : certains constituants des huiles essentielles sont utilisés comme matières premières pour la biotransformation ou l’hémi-synthèse de divers principes actifs médicamenteux, odorants… C’est le cas du (R)-(+)-limonène (extrait de l’huile essentielle des zestes des agrumes) qui est transformé en α-terpinéol à l’aide de Penicillium digitatum (fig. 4.1), ou de l’eugénol (extrait de l’huile essentielle des feuilles de giroflier) qui est utilisé pour la synthèse de la vanilline ou de ses dérivés (fig. 4.2), à l’aide de diverses souches de micro-organismes. 1

pour des compléments d’information, voir Les parfums sur le site web dédié

146

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Penicillium digitatum

C

C

D-limonène

OH α-terpinéol

Figure 4.1 - Biotransformation du D-limonène en α-terpinéol OH H CH2

CH3

CH

CH

CH2

CH

H C

H

O

OCH3

C

OH alcool vanillylique OCH3

OH eugénol

OCH3 OH isoeugénol

OCH3

HO

O C

OH vanilline OCH3 OH acide vanillique

Figure 4.2 - Biotransformation de l’eugénol en vanilline et ses dérivés hEn

agriculture : face à l’inquiétude de plus en plus croissante des consommateurs vis-à-vis des pesticides synthétiques, surtout en Europe et en Amérique du Nord, l’alternative est de se tourner vers des pesticides naturels. Ainsi, des pesticides naturels basés sur des huiles essentielles ou sur certains de leurs constituants particuliers sont proposés. Ces huiles sont préparées à partir des feuilles de certaines plantes aromatiques (particulièrement des familles des Myrtacées et des Lamiacées, mais aussi d’autres familles de plantes). Certaines huiles essentielles et/ou leurs composants présentent un large spectre d’activité contre les insectes nuisibles, les champignons pathogènes et les nématodes. Les données actuelles montrent qu’elles sont sans danger pour l’utilisateur et l’environnement mais leur sélectivité visà-vis des invertébrés n’est pas bien connue. Certaines compagnies américaines commercialisent des pesticides à base d’huiles essentielles. Ainsi, Mycotech Corporation produit Cinnamite™, un aphidicide/miticide/fongicide pour serres et cultures horticoles, et Valero™, un miticide/fongicide pour vignes et agrumes. Les deux produits sont basés sur l’huile essentielle de cannelle de Ceylan, contenant du cinnamaldéhyde (30 % dans les formulations destinées aux pays de la CE) comme agent actif. Avec une douzaine de produits enregistrés à la fin de l’année 1999, EcoSMART Technologies devient le leader mondial pour les pesticides à base d’huiles essentielles. Ces produits comprennent des aérosols et des poudres contenant de l’eugénol et le 2-phénéthyl propionate, agissants contre les animaux nuisibles des habitations (cafards, fourmis, pucerons, insectes volants, guêpes…). D’autres insecticides et miticides

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

147

pour les cultures horticoles, les serres et les pépinières sont en cours de développement. Ainsi les pyréthrines qui sont des esters de monoterpènes extrait des fleurs du pyrèthre et d’espèces voisines sont utilisées comme insecticides. En raison de leur nature lipophile, les huiles essentielles traversent la cuticule cireuse et interfèrent avec le métabolisme, les fonctions biochimiques, physiologiques et comportementales de l’insecte. Elles agissent également au niveau des canaux à sodium des ailes des insectes et sont faiblement toxiques pour les mammifères et surtout biodégradables.

4.5. MODES D’OBTENTION DES HUILES ESSENTIELLES Les matières premières nécessaires à l’obtention des huiles essentielles sont d’origine végétale. Les huiles essentielles sont obtenues de diverses manières. Le choix de la technique dépend de la localisation histologique de l’huile dans le végétal et de son utilisation. L’enfleurage, technique extrêmement ancienne (antiquité égyptienne) et maintenant abandonnée, consiste à déposer des fleurs fraîches sur des châssis de verre recouverts d’une couche de corps gras (enfleurage à chaud ou à froid). L’essence contenue dans des organes fragiles (pétales de rose, de jasmin, par exemple) est alors absorbée par le corps gras qui est ensuite mélangé à de l’alcool (solvant) afin de récupérer les huiles essentielles après évaporation du solvant sous vide à 0 °C. Le résidu liquide contenant tous les composés volatils étant appelé une « absolue » (ex. absolue de rose). Ces procédés ont été pratiquement abandonnés. La distillation à la vapeur est la méthode la plus couramment utilisée actuellement par les industriels ; parmi les autres méthodes, on compte la distillation à l’eau (hydrodistillation), l’extraction par des solvants, l’expression du péricarpe de certains fruits (zestes de citron, d’orange) et l’extraction par des fluides supercritiques. La distillation peut se faire dans des installations industrielles ou dans des unités mobiles qui se déplacent sur les lieux de production. La récolte se fait au meilleur moment en fonction des substances que l’on veut extraire et des conditions climatiques (saisons) car la plante ne développe pas les mêmes composants selon la période de l’année. Le rendement est, généralement, très bas (il faut parfois plus de 200 à 10 000 kg de matériel végétal frais pour obtenir 1 kg d’huile essentielle) (tab. 4.2). Tableau 4.2 - Rendement de quelques plantes aromatiques en huiles essentielles Plante fraîche

Rendement [‰]

Plante fraîche

Rendement [‰]

roses (pétales)

0,25 à 1

sauge officinale

3 à 3,5

sauge sclarée

0,9 à 1,8

lavande officinale

5 à 8,5

thym vulgaire

1,5 à 2,5

lavandin

15 à 20

148

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

4.5.1. HUILES ESSENTIELLES OBTENUES PAR ENTRAÎNEMENT À LA VAPEUR D’EAU C’est le moyen le plus répandu pour extraire l’huile essentielle de nombreuses plantes. Dans ce système d’extraction, les organes végétaux (fleurs, feuilles, graines, fruits, tiges, racines, parties aériennes ou plantes entières) sont placés dans un alambic, qui possède à sa base une grille perforée au-dessous de laquelle on introduit de la vapeur d’eau fournie par une chaudière. La vapeur d’eau traverse le matériel végétal, éclate les cellules et entraîne les molécules volatiles. En traversant un tube réfrigérant, la vapeur d’eau saturée en composés volatils se condense en un mélange hétérogène, d’huiles essentielles et d’eau florale ou hydrolat (contenant encore des traces d’huiles essentielles), récupéré dans un vase de décantation (appelé séparateur ou essencier) par simple différence de densité. En fonction de la densité de l’huile extraite par rapport à l’eau florale, le mode opératoire sera différent : densité plus faible, c’est la partie surnageante qui est recueillie directement ; densité plus forte, l’huile est recueillie en présence de xylène qui la dissout et qui forme avec elle un mélange plus léger que l’eau. Les huiles essentielles peuvent ensuite être raffinées et les différentes molécules séparées par distillation sous vide. Les solutions obtenues sont alors pures ou pratiquement pures. Ce procédé, hérité du monde arabe et toujours utilisé, a subi de nombreux perfectionnements techniques au cours des dernières décennies, dont notamment une restriction dans le col de cygne, à la sortie immédiate de l’alambic ; cette restriction permet une augmentation de la pression et donc une élévation de la température d’ébullition de l’eau, ce qui facilite l’entraînement des composants peu volatils (essences de vétiver, d’iris…). Le perfectionnement du procédé a porté également sur son automatisation. L’absence de contact direct entre le matériel végétal et l’eau durant l’ébullition évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile. Cette méthode est pratiquée sur de nombreuses plantes (lavande, lavandin, sauge sclarée, hysope, romarin, menthe poivrée, basilic…) et également sur des résines et des gommes (encens, myrrhe, opoponax, styrax, costus, benjoin, ciste). Le rendement de ce procédé est très variable selon les plantes.

4.5.2. HYDRODISTILLATION Cette méthode consiste à immerger le matériel végétal dans un bain d’eau. L’ensemble est porté à ébullition. Elle est généralement conduite à pression atmosphérique. La chaleur permet l’éclatement et la libération des molécules volatiles contenues dans les cellules végétales. Le mélange volatil est ensuite refroidi, condensé puis séparé en une phase aqueuse et une phase organique qui constitue l’huile essentielle. La distillation peut s’effectuer avec ou sans recyclage de la phase aqueuse obtenue lors de la décantation. À l’échelle du laboratoire, le système basé sur ce principe qui est généralement utilisé pour l’extraction des huiles essentielles en accord avec la pharmacopée européenne est l’appareil de Clevenger.

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

149

4.5.3. HUILES ESSENTIELLES OBTENUES PAR EXPRESSION Alors que les huiles essentielles résultant de l’entraînement à la vapeur d’eau sont obtenues pratiquement à partir de toutes les parties de la plante, l’expression est réservée au péricarpe frais des fruits des agrumes. Cette opération consiste à faire éclater par différents procédés mécaniques (abrasion, compression, incision, perforation) les « poches » qui sont situées à la superficie de l’écorce de ces fruits et qui renferment l’huile essentielle (voir tab. 4.1). L’essence libérée est ensuite recueillie par un courant d’eau. L’essentiel de la production mondiale provient de la Calabre et la Sicile (bergamote, orange bigarade, citron, pamplemousse, mandarine). 7JFOOFOU
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quantités considérables d’huiles essentielles exprimées de Citrus (orange douce, pamplemousse, tangérine, limette, citron).

4.5.4. AUTRES MÉTHODES D’EXTRACTION On peut également extraire les principes aromatiques grâce à des solvants ou plus récemment avec du dioxyde de carbone supercritique (qui est dans un état intermédiaire entre un gaz et un liquide) mais les produits obtenus ne peuvent normalement pas s’appeler huiles essentielles. Ces modes d’obtention conduisent aux concrètes et absolues pour l’extraction par solvant, ou à des extraits au dioxyde de carbone (CO2).

4.5.4.1. EXTRACTION PAR SOLVANT Cette technique, largement utilisée actuellement, consiste à faire tremper les plantes dans un solvant organique volatil à chaud, soit pour obtenir des produits que l’on ne peut extraire par un autre procédé, soit en vue de rendements plus élevés. En fin d‘opération, le solvant est éliminé par distillation sous pression réduite. On obtient alors une substance appelée essence concrète (ou plus simplement une « concrète ») en raison de son aspect solide. Il s’agit d’un mélange, généralement homogène, de cires (inodores) et de constituants odorants. Des lavages répétés de ces concrètes avec l’alcool éthylique (seuls les constituants odorants sont solubles dans l’alcool) permettent d’éliminer les cires et les autres matières inertes. L’élimination de l’alcool par distillation conduit aux essences absolues. Ce sont ces dernières qui sont utilisées dans la parfumerie. Les concrètes et les absolues ne sont pas utilisées pour les huiles essentielles à destination thérapeutique. Les essences concrètes sont obtenues à partir des fleurs de certains plantes (jasmin, rose, oranger, narcisse, tubéreuse, jonquille, mimosa, genêt, réséda, chèvrefeuille…) ou des parties aériennes de la plante (lavande, lavandin, sauge sclarée, verveine). Dans le cas de certains produits végétaux secs comme les lichens, des gommes, des résines…, l’extraction est faite à l’aide de solvants volatils à froid. On obtient ainsi des produits appelés « résinoïdes ». Ces derniers, bien qu’intervenant dans la préparation de compositions pour extraits, sont surtout utilisés dans la réalisation de compositions destinées à parfumer les savons.

150

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Bien que, par rapport à la distillation, les rendements soient généralement plus importants, les solvants organiques utilisés posent des problèmes de sécurité et de toxicité, ainsi que des problèmes de règlementation liés à la protection de l’environnement qu’il convient de prendre en compte. Des analyses par les méthodes modernes ont révélé que les proportions de solvants résiduaires dans les concrètes se situent entre 2 et 4 % atteignant souvent 6 % voire plus. Les solvants les plus utilisés sont le cyclohexane (qui a remplacé le benzène), l’alcool éthylique, des carbures aliphatiques (butane, pentane), le propylène glycol et surtout l’hexane (dérivé du pétrole en C6). Au cours des dernières années, l’extraction assistée par ultrasons et par micro-ondes s’est développée. Toutefois, aucun développement industriel n’a encore vu le jour bien que ces techniques aient fait l’objet de plusieurs dépôts de brevets.

4.5.4.2. EXTRACTION PAR CO2 À L’ÉTAT SUPERCRITIQUE L’extraction par CO2 supercritique est une technologie alternative à l’extraction par solvant organique pour les composés naturels, notamment les plus fragiles. Elle nécessite d’utiliser des appareils résistants à des pressions pouvant aller jusqu’à 400 fois la pression atmosphérique. Cette technologie est basée sur le pouvoir solvant du CO2 qui est modulable à volonté, dans certaines limites, selon les conditions de pression et de température qu’on lui applique. À l’état supercritique (plus de 74 bars et de 31 °C) le CO2 possède des propriétés très particulières. Le fluide obtenu est caractérisé par une grande diffusivité (de l’ordre de celle des gaz), ce qui lui confère une bonne aptitude à la dissolution, et une densité élevée qui le dote d’une capacité de transport et d’extraction importante. L’utilisation du dioxyde de carbone supercritique présente plusieurs avantages : X le CO2 est un produit naturel, abondant dans la nature et peu coûteux ; X elle évite les problèmes associés aux solvants puisqu’il est inodore, sans goût, nontoxique et ininflammable. De plus, lors du retour à pression atmosphérique, il est automatiquement éliminé par vaporisation ; X son utilisation n’altère pas les produits, et ne génère pas de résidus polluants ; X les extraits obtenus présentent une grande stabilité et surtout ne contiennent pas de résidus toxiques. Les molécules solubles dans le CO2 supercritique, donc extractibles, sont les composés peu polaires de faible masse moléculaire, tels que les composés aromatiques, des alcools, des esters, de nombreux pigments, les stérols, les oligomères… Le coût élevé des appareillages lié à l’application de pressions de plusieurs centaines de bars demeure le principal frein au développement de cette technologie.

4.6. FACTEURS AFFECTANT LA COMPOSITION ET LE RENDEMENT DES HUILES ESSENTIELLES

Il est démontré que la provenance de la matière végétale a une influence marquée sur la qualité et le rendement en huiles essentielles. En effet, des facteurs tels que les conditions

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

151

de croissance (comme la lumière, la température, l’exposition aux vents, la disponibilité de l’eau et des éléments nutritifs), le stade de développement, la partie de la plante récoltée, la période de la journée où la plante est récoltée ainsi que le taux d’humidité des échantillons de plantes séchées interviennent dans la variabilité qualitative et quantitative des huiles essentielles extraites. La nature du sol (sols sableux, argileux…) a également une influence sur la qualité de l’huile essentielle. L’obtention d’une huile de bonne qualité exige donc des conditions climatiques et des conditions de culture bien précises. Dans la pratique, les fleurs sont cueillies lorsqu’elles sont entièrement épanouies, mais non-flétries, les feuilles et les tiges quand les fleurs sont sur le point de s’ouvrir, les fruits au moment de la maturité, les racines à la fin du printemps. La quantité d’huile essentielle produite par un plant peut également varier en fonction des stress que ce dernier a subis. Des plantes botaniquement identiques peuvent fournir des huiles essentielles de compositions plus ou moins différentes, on parle alors de chimiotypes. La variabilité chimique est d’origine intrinsèque (génétique) mais elle dépend aussi du biotope : composition physico-chimique du sol, conditions climatiques de développement des plantes. Elle dépend également de la période de récolte. Le chimiotype est le paramètre qui permet de distinguer des huiles essentielles extraites d’une même espèce botanique. Dans le cas du thym (Thymus vulgaris L.), par exemple, on distingue plusieurs chimiotypes, très distincts : chimiotype à 1,8-cinéole (80 à 90 % de cinéole) ; chimiotype à géraniol (80 à 90 % de géraniol libre estérifié) ; chimiotype à linalol (80 à 90 % de linalol libre estérifié) ; chimiotype à terpinéol (80 à 90 % de terpinéol libre estérifié) ; chimiotype à thuyanol (50 à 60 % de trans-4-thuyanol, 10 à 20 % de 4-terpinéol, 10 à 20 % de cis-8-myrcénol) ; chimiotype à thymol (70 % de thymol en été) ; chimiotype à carvacrol (80 % de carvacrol en été)… Le chimiotype d’une huile essentielle est donc une référence précise qui indique le composant biochimique majoritaire ou caractéristique, présent dans l’huile essentielle. Cette classification capitale permet de sélectionner les huiles essentielles pour une utilisation spécifique, plus sûre et plus efficace. Signalons enfin que le procédé d’extraction peut modifier la composition et le rendement en huile essentielle. Ainsi, les boutons floraux du giroflier (Eugenia caryophyllata), fournissent par hydrodistillation une huile essentielle renfermant 70 à 90 % d’eugénol, mais aussi 5 à 12 % de caryophyllène, substance qui est absente dans le produit d’extraction par le benzène. L’extraction par le dioxyde de carbone à l’état supercritique de graines de fenouil moulues, par exemple, donne un meilleur rendement (10 %) que la distillation par entraînement à la vapeur (3 %), presque la même quantité produite par extraction à l’hexane (10,6 %), et nettement moins que l’extraction à l’alcool (15,4 %). Ces différences peuvent s’expliquer par le fait que tous les composants ne sont pas extraits avec la même efficacité par chaque processus et que certaines substances peuvent individuellement subir des altérations pendant l’extraction.

152

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

4.7. GÉNIE MÉTABOLIQUE Bien qu’elles soient largement présentes chez les plantes, l’extraction des huiles essentielles est souvent fastidieuse et coûteuse en raison du faible rendement, leur disponibilité devient limitante avec l’augmentation de la demande et les ressources naturelles se raréfient de plus en plus. Dans cette optique, la création de plantes transgéniques à haute teneur en huiles essentielles ou en certains composés actifs, par génie métabolique, suscite de plus en plus l’intérêt des chercheurs et des producteurs. Les récentes découvertes des gènes codant pour les enzymes catalysant la synthèse des composés des huiles essentielles, parallèlement à une meilleure connaissance de leur régulation, offrent la possibilité d’améliorer les plantes productrices. Les stratégies mises en œuvre à cet effet incluent la modification des voies métaboliques à un ou plusieurs niveaux, le blocage des voies compétitives ou l’introduction d’une nouvelle étape qui dévie la voie métabolique vers la synthèse d’une molécule particulière.

4.8. CONTRÔLE DES HUILES ESSENTIELLES ET MÉTHODES D’ÉTUDE Comme tous les produits à forte valeur ajoutée, les huiles essentielles font l’objet de nombreuses adultérations (essences frelatées). La composition chimique confère à l’huile des propriétés spécifiques ou caractéristiques permettant d’authentifier son origine. Quel que soit le secteur d’utilisation, l’analyse physico-chimique préalable des huiles essentielles reste une étape importante. Les caractéristiques physiques le plus communément utilisées pour caractériser des huiles essentielles sont la densité relative, l’indice de réfraction, la couleur, la miscibilité (habituellement dans une solution hydro-alcoolique) et le pouvoir rotatoire. La détermination de la composition chimique des huiles essentielles a été grandement améliorée par le développement de nouvelles méthodes d’analyses, principalement les séparations chromatographiques qui permettent de distinguer plus facilement une huile essentielle naturelle pure d’une huile modifiée. Différentes techniques comme la chromatographie en phase gazeuse (CPG) couplée à un détecteur à ionisation de flamme ou, NJFVY
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méthode préparative pour une séparation ultérieure plus fine par CLHP. Les produits séparés peuvent être détectés sous rayonnement UV ou par pulvérisation de réactifs spécifiques sur la plaque de chromatographie. La CPG est la technique classiquement privilégiée dans l’analyse et l’isolement des comQPTÏT
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par exemple, permet d’obtenir, outre la séparation, des informations sur la structure des

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

153

molécules séparées en comparant les données spectrales avec celles de produits de référence contenus dans des bibliothèques de spectres. Les données spectrales sont systématiquement associées à l’utilisation des indices de rétention, qui sont calculés à partir des temps de rétention d’une gamme étalon d’alcanes ou plus rarement d’esters méthyliques
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température (indice de rétention). Dans des cas plus complexes, des colonnes capillaires à haute résolution sont utilisées. "JOTJ
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des huiles essentielles pour connaître la masse moléculaire et les informations structurales relatives à une molécule à partir de sa fragmentation. Dans la source d’ionisation, les molécules peuvent être bombardées à l’aide d’électrons générés par l’incandescence d’un filament de tungstène, conduisant ainsi à la formation des ions en phase gazeuse. Les ions sont ensuite dirigés vers la partie analytique de l’appareil dont il existe plusieurs types mais les plus utilisés dans le cas des huiles essentielles sont le « quadripôle » et le « piège à ions ». La CPG est très utilisée dans le domaine de l’identification et de la détection des adultérations des huiles essentielles. C’est ainsi que l’analyse de l’huile essentielle de la menthe des champs (Mentha arvensis, utilisée souvent pour frelater celle de la menthe poivrée Mentha piperata, beaucoup plus chère) révèle des concentrations élevées en deux constituants caractéristiques, l’isopulegol et le neoisopulegol. La présence de ces molécules dans l’huile de M. piperata est considérée comme preuve de son adultération par celle de M. arvensis. Les huiles de synthèse rencontrées dans le commerce ne sont fabriquées qu’à partir des constituants majoritaires présents dans les huiles naturelles. Elles sont, de ce fait, souvent déficientes en certains constituants mineurs qui peuvent avoir des propriétés particulières. C’est grâce à l’absence de ces constituants que l’on peut détecter, par spectrophotométrie, la présence d’huile de synthèse dans les produits élaborés. La faible diversité des constituants de cette huile de synthèse limite ses qualités organoleptiques et/ou ses propriétés. 6OF
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MBVthenticité des huiles essentielles. Il s’agit d’un domaine où cette technique est incontestablement la plus précise. La combinaison des données isotopiques (rapports des isotopes stables du carbone, de l’azote et de l’hydrogène) avec des données de la CPG pour les composés aromatiques caractéristiques tranche définitivement sur l’authenticité des huiles essentielles sans le recours à d’autres techniques. L’identification des constituants des huiles essentielles est également possible au moyen de la résonance magnétique nucléaire du 13$
3./13C), sans séparation préalable des constituants ou, si nécessaire, après une étape de purification limitée permettant l’obtention de résultats plus précis et plus fiables. Cette technique permet l’analyse de molécules quels que soient leur squelette et leur fonctionnalité, incluant les molécules thermosensibles et les stéréoisomères difficilement différentiables par les techniques conventionnelles. Cette technique est devenue une véritable méthode d’analyse, grâce notamment

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PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

à l’informatisation de la recherche des composés dans un mélange à partir de banques EF
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EF
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3./
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EF
techniques, avec la réalisation de spectres à deux dimensions, homo et hétéronucléaires c’est-à-dire les spectres de corrélations proton-proton (COSY et NOESY) et proton-carCPOF
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FU
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RVJ
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FO
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JOUFSBDUJPOT
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ou indirectes) entre les noyaux et fournissent donc des renseignements très précis sur la structure moléculaire. Afin d’identifier de manière certaine une huile essentielle, on utilise une nomenclature normalisée qui comprend : X la dénomination binomiale latine (avec descripteur) qui, seul, précise l’espèce botanique et évite les confusions. Le nom commun est donc insuffisant pour la reconnaître. En effet, il existe par exemple plusieurs sortes d’huiles essentielles d’Eucalyptus (genre qui comprend plus de 700 espèces) dont les propriétés vont varier d’une espèce à l‘autre. X le chimiotype (voir section 4.6, Facteurs affectant la composition et le rendement des huiles essentielles) qui permet d’identifier les composants biochimiques majoritaires d’une huile essentielle. X le procédé d’extraction : hormis chez certaines espèces végétales telles que les agrumes dont les essences sont extraites par expression à froid, la plupart des huiles essentielles sont extraites à la vapeur d’eau à faible pression (les eaux florales étant recueillies lors de la distillation). L’utilisation de solvants organiques, par contre, entraîne la destruction de certaines substances originellement présentes dans les végétaux. X la partie du végétal utilisée pour l’extraction : les huiles essentielles peuvent être extraites des différentes parties de la plante : la fleur, la feuille, la racine, la graine… Les propriétés de ces différentes huiles sont très différentes et elles n’ont pas le même usage. Ainsi, selon la partie traitée, trois produits très différents peuvent être obtenus à partir de l’oranger : une essence d’expression du zeste, une huile essentielle de petitgrain extraite des feuilles et une huile essentielle de néroli issue de la distillation des fleurs. X l’origine géographique et la méthode culturale : les produits doivent être issus soit de culture biologique, soit de cueillette sauvage provenant de régions éloignées des zones polluées. X l’année d’extraction. Si l’utilisation classique des huiles essentielles est bien la pharmacie et la parapharmacie, un regard sur les chiffres publiés concernant ce marché en plein essor, laisse entrevoir que d’autres secteurs sont destinataires d’une part de plus en plus importante de la production mondiale en huiles essentielles ou des plantes qui les fournissent. On assiste donc à une diversification des débouchés avec toujours une valeur ajoutée au produit final. Il va de soi que ces nouveaux secteurs utilisateurs des huiles essentielles imposent leur « cahier des charges » respectif quant à la qualité de l’huile essentielle. Cette qualité peut être garantie par les techniques d’analyse passées en revue dans ce paragraphe. Ajoutons simplement que la relative labilité des molécules constitutives des huiles essentielles et leur réactivité rend leur conservation difficile. Certains constituants des huiles essentielles, comme les monoterpènes se combinent facilement avec l’oxygène de l’air, surtout

4 - LES HUILES ESSENTIELLES

155

s’ils sont dans un environnement chaud ou en présence de lumière. Certains peuvent former des résines (polyterpènes). La position des doubles liaisons peut être modifiée, des chaines ouvertes peuvent se cycliser, la nature des groupements fonctionnels peut changer comme, par exemple, des alcools primaires en aldéhydes… Il est donc important de stocker les huiles essentielles dans des conditions qui minimisent leur contact avec l’air, avec la lumière (flacons en verre de couleur sombre) et avec la chaleur (réfrigération). Des règles d’emballage, de conditionnement et de conservation ont été établies par l’Agence Française de Normalisation (AFNOR) dans sa norme NF T75-001 (1996) ou par l’Organisation Internationale de Normalisation (ISO) dans sa norme ISO/TR 210:1999.

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5 - LES LIGNINES 5.1. GÉNÉRALITÉS Les lignines sont des polymères polyphénoliques, de masse moléculaire élevée, de composition très complexe, à structure réticulée, présents dans les parois cellulaires de certains tissus de plantes vasculaires ou trachéophytes (appelés communément plantes ligneuses). La majeure partie des lignines se trouve dans la paroi secondaire des cellules de soutien et de conduction (vaisseaux) conférant à celles-ci une résistance mécanique mais limitant leur élasticité. On les trouve également, en moindre quantité, dans la paroi primaire, de nature essentiellement pecto-cellulosique, et dans la lamelle moyenne. Etant très résistantes à la compression, les lignines confèrent aux cellules végétales leur solidité, ce qui permet à la plante entière de croître en hauteur et d’avoir un port dressé favorisant la captation de l’énergie lumineuse. Leur caractère hydrophobe rend les cellules imperméables. Ainsi, les parois des cellules de tissus de soutien (sclérenchyme et collenchyme) ou de transport de l’eau et des sels minéraux (xylème) sont très lignifiées. Peu sensibles à la dégradation biologique, les lignines créent une barrière physique qui s’oppose à la pénétration et à la progression des agents pathogènes et contribuent à la protection naturelle des végétaux contre certaines attaques parasitaires. La nature des lignines varie avec l’espèce botanique considérée, et pour une même espèce avec la nature (saine ou infectée) des tissus considérés, le type cellulaire, la zone pariétale considérée (parois primaire, secondaire), l’âge du végétal et le lieu où il s’est développé.

5.2. BIOSYNTHÈSE Les lignines sont formées fondamentalement par la copolymérisation oxydative de trois unités phénylpropanes (C6C3) appelées monolignols, différant par le degré de méthoxylation (aux carbones C-3 et C-5) du noyau phénolique et qui sont réunies par différentes liaisons chimiques sans aucun caractère ordonné ni répétitif. Ces unités constitutives sont les alcools coumarylique, coniférylique et sinapylique. Les noyaux aromatiques de ces alcools sont appelés p-hydroxyphényle (H), guaiacyle (G) et syringyle (S), respectivement. En s’entrecroisant, ces monomères construisent un réseau tridimensionnel amorphe interpénétrant la paroi cellulosique.

158

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La biosynthèse de ces unités s’effectue en une séquence d’étapes catalysées par différentes enzymes, à partir d’un acide aminé aromatique (fig. 5.1), la phénylalanine (Phe). glucose acide shikimique phénylalanine PAL NH3 acide t-cinnamique C4-H

tyrosine TAL NH3 acide p-coumarique COOH

acide caféique COOH

acide férulique COOH

acide sinapique COOH

CH

CH

CH

CH

CH

CH

CH

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OH alcool sinapylique

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guaiacyle

syringyle

polymérisation ×2 ×n lignanes

lignines

Figure 5.1 - Voie biosynthétique conduisant aux trois alcools phénylpropanes constitutifs des lignines et lignanes

5 - LES LIGNINES

159

La désamination oxydative de la phénylalanine en acide t-cinnamique est le point de départ de la biosynthèse de nombreux composés polyphénoliques complexes. Cette réaction est catalysée par la phénylalanine ammonia-lyase (PAL). Une autre voie parallèle, moins répandue (Poacées), a pour point de départ la désamination oxydative de la tyrosine en acide p-coumarique, catalysée par la tyrosine ammonia-lyase (TAL). En subissant des réactions d’hydroxylation du noyau phénolique en position 4 par l’action de la cinnamate-4-hydroxylase (C4-H), puis éventuellement de méthylation, en positions para et méta, par rapport à la chaîne latérale (hydroxylases, O-méthyl-transférases), l’acide cinnamique conduit aux divers acides phénoliques en C6C3. Les trois acides principaux formés (acides caféique, férulique et sinapique) sont ensuite estérifiés puis réduits en aldéhydes ou en alcools. La polymérisation oxygénasique de ces alcools dans la paroi intervient alors sous l’action de peroxydases pariétales. En dehors de leur implication directe dans la lignification, les peroxydases établissent des ponts de cinnamate et de férulate dans les parois cellulaires et catalysent la formation de complexes lignine-polysaccharides-protéines qui sont riches en hydroxyproline. Il est généralement admis que seules les peroxydases pariétales participent à la polymérisation des monomères de lignines. Cette fraction peroxydasique représente environ 15 % des peroxydases totales.

5.3. STRUCTURE Les polymères de lignines contiennent des unités de base p-hydroxyphényle, guaiacyle et syringyle (voir fig. 5.1), reliées entre elles par des enchaînements sans répétition régulière, mettant en jeu divers types de liaisons : carbone-oxygène, par exemple entre un carbone de la chaîne ou du noyau aromatique et l’oxygène phénolique ; carbone-carbone, entre carbone de la chaîne propanique et carbone du noyau aromatique d’une autre unité, ou entre carbones de noyaux aromatiques appartenant à deux unités monomères différentes. Des liaisons de type ester ou éther existeraient aussi entre les lignines et d’autres constituants de la paroi tels que les acides cinnamiques et les polysaccharides. Aussi les lignines ne peuvent-elles être dissociées des autres constituants des parois végétales qu’après des traitements physiques ou chimiques énergiques qui altèrent en partie leur intégrité structurale.

5.4. PROPRIÉTÉS Par la diversité de leurs unités de base, leurs types de liaisons (fig. 5.2) et leurs combinaisons, les nombreuses fonctions phénoliques, hydroxyles et éthers qu’elles contiennent, les lignines présentent une hétérogénéité de propriétés physico-chimiques et une grande réactivité. C’est ainsi que les lignines de la paille, par exemple, sont différentes, à ce point de vue, des lignines de bois tendres et de bois durs et sont donc très solubles dans les solutions alcalines. Cette propriété est exploitée pour délignifier la paille en vue de son utilisation dans la fabrication de papier. Les lignines de Poacées diffèrent des lignines de

160

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

bois de Feuillus (riches en unités guaiacyle et syringyle) et de Conifères (seulement riches en unités guaiacyle) par une proportion relativement plus élevée en liaisons alcalinolabiles entre les monomères des lignines (p-hydroxyphényle, guaiacyle et syringyle) ou entre la lignine et les polyosides. En raison de son intime association avec tous les constituants de la paroi cellulaire (tanins, acides phénoliques, cellulose, hémicelluloses) et de sa structure réticulée, la lignine ne peut pas être isolée dans son état natif inaltéré. Cette réactivité explique aussi que la lignine « native » est différente des nombreuses lignines industrielles, obtenues selon le procédé de pâte a papier choisi: X Les lignosulfonates issues du procédé de délignification au bisulfite en milieu acide par cuisson à 125-135 °C pendant 5 à 20 h. Ce sont des lignines rendues solubles dans l’eau par sulfonation et moins solubles dans les solvants organiques. Elles s’extraient surtout à partir de Résineux. X Les MJHOJOFT
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EÏHSBdées par des conditions technologiques drastiques (mélange de soude concentrée et de sulfate de sodium à 170 °C, sous une pression de 6 bars et pendant plusieurs heures), forment des pâtes très brunes. Ces lignines sont solubles en milieu alcalin (pH > 10,5), dans le dioxane, l’acétone et le diméthyl formamide et insolubles dans l’eau à pH neutre ou acide. Elles sont communément connues sous l’appellation d’Indulin AT. Ce procédé, plus récent (80 % des pâtes chimiques actuelles), préserve mieux l’intégrité de la cellulose tout en étant applicable à une plus grande variété de bois : bois durs des Feuillus, bois plus tendres des Résineux, plantes annuelles. X Les lignines organosolves obtenues par « digestion » des copeaux de bois à haute température en présence d’éthanol ou de méthanol aqueux. La liqueur noire obtenue est alors soumise à des extractions successives par précipitation, centrifugation ou filtration pour séparer les lignines des hémicelluloses. Les lignines organosolves se présentent ensuite sous forme d’une poudre brune. γ

liaison β-aryléther (β-O-4’) C

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C

Figure 5.2 - Liaisons intermonomériques les plus fréquentes illustrées sur un fragment de lignine

5 - LES LIGNINES

161

X Les

lignines Stake isolées par explosion à la vapeur d’eau des matériaux lignocellulosiques suivie d’une séparation des hémicelluloses et de la transformation de la cellulose par voie biochimique. Le résidu obtenu est alors constitué essentiellement par une lignine partiellement dépolymérisée, en fonction du temps de réaction et de la température de prétraitement.

5.5. IMPORTANCE ÉCONOMIQUE DES LIGNINES Les lignines sont, après la cellulose, les substances organiques les plus abondantes de la biosphère et une ressource naturelle renouvelable. Elles représentent suivant les espèces de 25 à 35, 20 à 28 et 10 à 30 % du poids sec du bois des Résineux, des Feuillus et des Graminées, respectivement. Certaines espèces végétales des forêts équatoriales et tropicales peuvent contenir jusqu’à 50 % de lignines. Il existe dans le monde une abondante production de certains produits agricoles dont on estime qu’une moitié, environ, reste inutilisée (pailles de Céréales, tiges de tournesol, tiges et rafles de maïs, feuilles de betterave sucrière, bagasses de canne à sucre, bois, liège…) ce qui représente une production potentielle annuelle de lignines estimée à 20 milliards de tonnes sur une production annuelle de biomasse estimée à 172 milliards de tonnes de matière sèche. Dans ce contexte, des approches biochimiques et biotechnologiques de la biodégradation des lignines pourraient ouvrir un nouveau domaine dans la conversion de la biomasse lignocellulosique et ainsi élargir les sources d’approvisionnement en produits carbonés. Des efforts importants ont été développés vers la mise au point de procédés économiquement rentables pour la valorisation de cette biomasse. Le procédé idéal est de séparer les trois principales composantes de la biomasse, cellulose, hémicelluloses et lignines et de les dégrader individuellement sans recours à des produits chimiques coûteux, polluants et à de grandes quantités d’énergie. Les matériaux ligneux, industriels ou résiduels, représentent une masse très importante de polyphénols, et donc une source intéressante de matières premières organiques après USBOTGPSNBUJPO
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BDUVFMMFment, les processus de dégradation sont encore mal maîtrisés. L’extraction des lignines peut être réalisée par hydrolyse acide, auto-hydrolyse éclair des bois, ou encore à l’aide de solvants organiques en présence de catalyseurs, ozonolyse ou par irradiation aux UV. Ces procédés sont souvent polluants ou difficiles à mettre en œuvre industriellement. La dégradation microbiologique qui se fait normalement dans le rumen pourrait servir de modèle à l’utilisation industrielle des lignocelluloses. Une meilleure connaissance de l’influence de la structure des parois cellulaires et les effets des prétraitements chimiques et mécaniques pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour une exploitation industrielle future. Ces nouvelles perspectives concernent essentiellement les pailles mais aussi divers autres déchets ou des lignocelluloses qui sont sous-utilisées tels que les tiges de maïs et de tournesol, les roseaux, les déchets de bois, le liège, les grignons d’olives, les résidus de raisins, le colza…

162

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Par ailleurs, les lignines provoquent une résistance à l’étirement de certaines fibres naturelles comme le lin, ce qui impose des traitements préliminaires tels que le rouissage pour les éliminer.

5.5.1. INDUSTRIE PAPETIÈRE Pendant longtemps, l’utilisation la plus importante concernant l’exploitation des matériaux lignocellulosiques était la préparation de la pâte à papier qui utilise uniquement la partie fibreuse. En effet, les lignines sont responsables de la coloration jaunâtre du papier après exposition au soleil. C’est pourquoi la fraction ligneuse (appelée aussi liqueur noire), dissoute après concentration, était simplement rejetée ou brûlée pour couvrir les besoins en énergie nécessaires au processus de transformation. Cette utilisation secondaire de la lignine fournit une valeur ajoutée limitée. Le traitement chimique classique des pâtes à papier fait appel à des agents très corrosifs (produits chlorés, soude…) pour l’extraction des lignines (délignification) qui rendent cette industrie particulièrement polluante. Par ailleurs, la délignification chimique consomme beaucoup d’énergie et de très grandes quantités d’eau (broyage, cuisson sous pression). La délignification du bois de Conifères exige des conditions plus drastiques que celle des bois de Feuillus mais la qualité de leurs fibres de cellulose est supérieure. Dans l’industrie papetière, les efforts de recherche actuels portent sur la mise au point de procédés propres et économiques parmi lesquels : l’optimisation des procédés de fabrication du papier, le blanchiment de la pâte, la modification des fibres et l’amélioration des essences forestières par les techniques du génie génétique en vue de réduire leur contenu et/ou d’en modifier leur composition en lignines, ce qui permet de limiter le recours aux prétraitements couteux et donc de réduire l’impact sur l’environnement des procédés industriels d’extraction.

5.5.1.1. AMÉLIORATION DES ESPÈCES FORESTIÈRES Dans ce domaine, les techniques de sélection génétique classique ont été utilisées dans le passé en vue de produire des espèces forestières plus intéressantes d’un point de vue économique et commercial. Ces recherches reposent sur l’existence d’une large variabilité naturelle de génotypes ; la sélection étant surtout dirigée vers l’obtention de caractéristiques spécifiques telles que la taille, la forme, la croissance rapide mais aussi la résistance aux maladies. Actuellement, d’autres critères ont été ajoutés comme la qualité du bois et sa densité. Les méthodes de multiplication clonale comme la culture in vitro et l’embryogenèse somatique peuvent être envisagées dans ce type de recherche. Néanmoins, les programmes de sélection des arbres sur la base de telles caractéristiques nécessitent plusieurs générations pour pouvoir observer les améliorations désirées. Récemment, des techniques d’ADN recombiné ont été développées. Ces techniques consistent à transférer des gènes spécifiques dans le génome de la plante hôte en vue de créer de nouveaux génotypes.

5 - LES LIGNINES

163

Pour appliquer ce type de technique il faut d’abord : 1. identifier, isoler et cloner le fragment d’ADN contenant le gène d’intérêt ; 2. transférer le fragment d’ADN dans la cellule réceptrice et l’incorporer dans son ADN ; 3. régénérer la plante transgénique entière à partir de la cellule transformée. L’étape [1] est actuellement bien acquise malgré son coût assez élevé. Les techniques pour accomplir l’étape [2] sont aussi bien maitrisées. On distingue plusieurs méthodes : X transformation des cellules végétales par utilisation d’un vecteur du plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes1 ; X micro-injection directe de protoplastes ; X électroporation de protoplastes ; X injection balistique de l’ADN fixé sur des particules d’or ou de tungstène à travers les parois cellulaires. De toutes ces méthodes, c’est la transformation par Agrobacterium tumefaciens qui est la plus utilisée pour transférer de l’ADN étranger dans le génome des plantes. L’étape [3] reste la plus difficile malgré quelques succès encourageants obtenus sur le peuplier (espèce très utilisée pour la production de pâte à papier) notamment.

5.5.1.2. TRAVAUX DE GÉNIE GÉNÉTIQUE L’autre approche qui retient de plus en plus l’attention des chercheurs est celui de la modification de la voie de biosynthèse des lignines dans le but de réduire ou de modifier qualitativement la composition du bois en lignines, afin de produire des lignines plus faciles à extraire. On sait que dans le processus de fabrication du papier, l’extractibilité chimique de la lignine dépend directement du rapport entre les unités syringyle (fortement méthylées) et les unités guaiacyle dans la lignine. Les précurseurs issus de noyaux syringyle produisent une lignine moins entrecroisée que celle issue de noyaux guaiacyle. Par conséquent, ils sont plus facilement extractibles lors de la fabrication de la pâte à papier. C’est ainsi que les Angiospermes (Feuillus et plantes annuelles) dont les lignines contiennent aussi bien des unités syringyle que des unités guaiacyle peuvent être traitées par tous les procédés connus à moindre coût et en moins de temps que les Gymnospermes (Résineux) dont les lignines sont constituées uniquement d’unités guaiacyle, plus faiblement méthoxylées que les lignines syringyles. Plus méthylées, la lignine des Feuillus se prête moins à des réactions de condensation entre monomères constitutifs et est, dès MPST
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pour des compléments d’information, voir Agrobacterium sur le site web dédié

164

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Plusieurs enzymes sont impliquées dans la voie de formation des monomères de la lignine (voir fig. 5.1 et 5.3). Selon les enzymes ciblées, les arbres transformés peuvent produire moins de lignines ou élaborer des lignines de qualité différente, plus facilement extractibles lors du processus industriel. Les deux résultats intéressent les fabricants de pâte à papier, mais la difficulté consiste à trouver le juste milieu : une suppression importante de lignines, entraine des problèmes de croissance des arbres et une altération de la circulation de leur sève. La première étape conduisant à la synthèse des monolignols est catalysée par la PAL, enzyme dont les gènes ont déjà été isolés et clonés chez un grand nombre d’espèces WÏHÏUBMFT
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PAL comme la C4-H (voir fig. 5.1) ne constituent pas de bonnes cibles pour la modification spécifique de la biosynthèse des monolignols puisque la voie des phénylpropanoïdes fournit aussi des précurseurs phénoliques pour d’autres composés importants tels que les flavonoïdes, les anthocyanines, les phytoalexines, les tanins, les stilbènes, les coumarines, les xanthones… La modulation de l’expression de ces enzymes risque de se répercuter négativement sur d’autres fonctions biologiques de la plante comme la croissance et la mise en place des mécanismes de défense. Le génie génétique a permis de créer des arbres qui répondent mieux aux exigences de l’industrie papetière. La technique la plus souvent adoptée est la stratégie de l’ARN antisens2. Les premiers peupliers transformés ont été plantés en France dès 1995. Les recherches en cours concernent surtout le peuplier (Feuillus) mais aussi le mélèze (Conifères) et il faudra attendre 2015-2020 pour statuer sur la rentabilité de cette voie dans le cadre d’une production industrielle mais aussi pour évaluer les répercussions de telles études aussi bien au niveau écologique que sur la stabilité de l’expression et sur le maintien des qualités recherchées. Parmi les résultats obtenus à l’heure actuelle, on peut citer, par exemple, la réduction de l’activité d’une des enzymes majeures impliquée dans la biosynthèse des lignines, la p-coumarate-coenzyme  A ligase (4CL) (fig. 5.3) chez le peuplier transgénique (Populus tremuloides) qui présente une baisse de 45 % des lignines et une augmentation de la teneur en cellulose de 15 %, doublant ainsi le rapport cellulose/lignines de la plante sans modifier la composition des lignines et sans effets apparents sur la croissance, le développement ou l’intégrité structurale de l’arbre. Une des enzymes la plus visée est l’alcool cinnamylique déshydrogénase (CAD) qui catalyse spécifiquement l’étape finale de formation des trois monomères précurseurs de la lignine (fig. 5.3). La réduction de l’activité de la CAD (de plus de 90 %) chez le tabac par manipulation génétique, en utilisant un ARN antisens2, conduit à la production d’un nouveau type de lignine plus accessible à l’extraction chimique. Cette réduction se fait sans interférences avec le développement et l’état de santé des plantes. Les plantes transgéniques incorporent moins de monomères d’alcools cinnamyliques et plus de monomères d’aldéhydes cinnamyliques dans leur lignine que les plantes témoins (rapport guaiacyl/ syringyl considérablement réduit). 2

pour des compléments d’information, voir La stratégie de l’ARN antisens sur le site web dédié

5 - LES LIGNINES

165

COOH

COCoAS

CH

CH

CH

CH + AMP + 2 Pi

R3

4CL

+ CoA + ATP R3

R2 R1 acide hydroxycinnamique

R2 R1 hydroxycinnamoyl - CoA

R1 = OH, R2 = R3 = H : acide p-coumarique R1 = R2 = OH, R3 = H : acide caféique R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = H : acide férulique R1 = R3 = OH, R2 = OCH3 : acide 5-hydroxyférulique R1 = OH, R2 = R3 = OCH3 : acide sinapique

R1 = OH, R2 = R3 = H : p-coumaroyle-CoA R1 = R2 = OH, R3 = H : caféoyl-CoA R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = H : féruloyl-CoA R1 = R3 = OH, R2 = OCH3 : 5-hydroxyféruloyl-CoA R1 = OH, R2 = R3 = OCH3 : sinapoyl-CoA

CH2OH

CHO

CH

CH

CH

CH

CCR

+ NADPH + H+

CAD R3

R2

R1 monolignols

CoASH + NADP+

R1 = OH, R2 = R3 = H : alcool coumarylique R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = H : alcool coniférylique R1 = R3 = OH, R2 = OCH3 : alcool 5-hydroxyconiférylique R1 = OH, R2 = R3 = OCH3 : alcool sinapylique

R3

R2

R1 cinnamaldéhyde

R1 = OH, R2 = R3 = H : p-coumaraldéhyde R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = H : coniféraldéhyde R1 = R3 = OH, R2 = OCH3 : 5-hydroxyconiféraldéhyde R1 = OH, R2 = R3 = OCH3 : sinapaldéhyde

Figure 5.3 - Quelques enzymes spécifiques de la voie de biosynthèse de la lignine, cibles des travaux de génie génétique 4CL : coumarate-CoA ligase, CCR : cinnamyl-CoA réductase, CAD : cinnamyl alcool déshydrogénase

166

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La diminution du niveau d’expression d’une des deux enzymes, l’O-méthyl transférase 0.5
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modifiés produisant moins de lignines (90 % et 70 à 80 % de réduction, respectivement). De plus, les lignines produites sont composées de chaînes plus courtes et s’éliminent plus facilement dans le processus de fabrication du papier. Ces résultats, obtenus sur des peupliers de six mois cultivés sous serre, ont été vérifiés sur des peupliers transgéniques produits en conditions de sylviculture naturelle. Une telle réduction du contenu en lignine permettrait de réduire la quantité d’énergie et de produits chimiques nécessaires aux traitements de blanchiment de la pâte à papier et diminuerait ainsi la quantité de déchets polluants. Une autre possibilité serait d’introduire dans les Gymnospermes qui en sont dépourvues les gènes codant des enzymes d’Angiospermes spécifiques de la méthylation des monolignols. Ces enzymes sont l’acide caféique-3-O-méthyltransférase, la férulate-5-hydroxylase (F5H) et la caféol-CoA-3-O-méthyltransférase ; elles sont impliquées dans la biogenèse de l’acide férulique par méthylation de l’acide caféique, et permettent aux Feuillus de produire des unités syringyles qui se polymérisent en une lignine moins condensée et plus apte à la délignification que celle des Gymnospermes. Une autre enzyme semble prometteuse : la cinnamoyl-CoA réductase (CCR) catalysant une des dernières étapes de la conversion des hydroxycinnamoyl-CoA en cinnamaldéhydes correspondant (voir fig. 5.3). La répression de l’expression de cette enzyme chez le tabac conduit à une réduction d’environ 50 % de la teneur en lignine, une augmentation du rapport S/G et une augmentation de la teneur en composés phénoliques estérifiés.

5.5.1.3. BLANCHIMENT CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE LA PÂTE À PAPIER Plus en aval du processus de fabrication de la pâte à papier, celle-ci doit subir un blanchiment qui consiste à éliminer les lignines résiduelles qui, par leurs groupements chromophores, sont responsables de la mauvaise qualité du papier (jaunissement par photooxydation et fragilisation mécanique du papier). Dans ce domaine, toute une panoplie d’agents chimiques a été testée en vue d’éliminer au maximum les lignines. Les produits utilisés (chlore, dioxyde de chlore, hypochlorite de sodium…) engendrent souvent des déchets qui ne sont pas sans nocivité. Le chlore moléculaire (Cl2) agit par substitution, addition ou oxydation formant des chlorolignines, solubles et extraites dans la soude. Le dioxyde de chlore (ClO2) est utilisé pour parachever l’oxydation de la lignine résiduelle pour les pâtes chimiques au sulfate. L’hypochlorite de sodium est utilisé en fin de traitement pour une élimination maximale des lignines. Ces produits chlorés génèrent des organochlorés difficilement éliminés par les procédés de dépollution classiques. Les orientations actuelles dans ce domaine, tentent d’une part, à utiliser d’autres agents de blanchiment moins coûteux, plus efficaces et moins polluants et d’autre part, à traiter les déchets. La première alternative répondant à ces critères fut l’utilisation, en Suède au début des années  1980, de mutants cellulase-moins de champignons de la pourriture blanche

5 - LES LIGNINES

167

(Basidiomycètes) pour la délignification du bois destiné à l’industrie papetière. Depuis, beaucoup de progrès ont été enregistrés dans l’utilisation de souches sélectionnées plus performantes et dans l’amélioration des conditions de traitement du bois. Dans beaucoup de cas, on note une diminution de l’énergie dépensée au cours du processus de fabrication et une amélioration de la résistance mécanique des feuilles produites. Il reste, cependant, beaucoup de problèmes à résoudre dans cette voie : sélection de souches à croissance plus rapide (les souches testées actuellement ont souvent une croissance lente), optimisation des conditions de fermentation aérobie, étude des mécanismes enzymatiques précis mis en jeu par les micro-organismes… Le blanchiment enzymatique offre une alternative intéressante à l’usage de produits chimiques particulièrement polluants. L’hydrolyse enzymatique partielle des hémicelluloses peut laisser s’échapper des fragments de lignine, et faciliter l’accès des produits chimiques à la lignine résiduelle. En effet, MF
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d’hémicellulases d’Aspergillus s’accompagne d’une réduction de leur contenu en lignine et en xylanes (hémicelluloses riches en xylanes). Les xylanases sont les principales responsables du blanchiment, en scindant les chaînes linéaires de xylanes, abondants à la surface des fibres. 3ÏDFNNFOU
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pâte à papier combinant enzyme et eau oxygénée. La méthode enzymatique, fondée sur les xylanases, est le résultat de recherches sur le blanchiment biologique. Le coût de fabrication des produits sans chlore est toutefois légèrement plus élevé que celui du blanchiment conventionnel. La difficulté principale est que les conditions de pH et de température, requises pour le traitement de la pâte à papier, sont difficilement compatibles avec l’activité des xylanases. Les recherches actuelles visent à trouver des micro-organismes capables de produire des xylanases résistantes aux pH élevés et aux fortes températures. L’enzyme la plus prometteuse provient d’un micro-organisme thermophile d’Islande. Elle supporte un pH d’environ 11 et une température supérieure à 85 °C. D’autres recherches s’efforcent d’optimiser l’activité de la lignine peroxydase, enzyme impliquée dans la dégradation de la lignine (oxydation des composés aromatiques OPOQIÏOPMJRVFT
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FYDMVTJvement les composés phénoliques de la lignine ou encore des laccases fongiques qui oxydent les groupements phénoliques en absence d’eau oxygénée.

5.5.2. ALIMENTATION ANIMALE Traditionnellement, la finalité de l’exploitation de la biomasse produite par le monde agricole est l’alimentation. Or, les végétaux utilisés dans l’alimentation humaine et animale ne représentent qu’une infime partie de la biomasse totale produite chaque année par l’Homme. Certains sous-produits générés par la production agricole sont utilisés comme aliments pour le bétail. Néanmoins, les sous-produits lignocellulosiques des cultures, difficilement digérés par les animaux et par les micro-organismes du fait de la présence de lignines constituent de fait un des principaux obstacles à la valorisation biologique de ces importants résidus de culture. Comme pour l’industrie papetière, cette valorisation à des

168

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

fins alimentaires ne pourra donc être effectuée qu’après délignification. De ce fait, plusieurs prétraitements de la matière lignocellulosique ont été envisagés afin de la rendre plus digeste. En technologie alimentaire, des prétraitements relativement simples (utilisant des solutions alcalines, le dioxyde de soufre, le peroxyde d’hydrogène, l’ozone, la vapeur, le broyage mécanique, les champignons) ont été adoptés en vue d’améliorer la digestibilité et la valeur nutritive des produits riches en lignine (la paille, par exemple) pour qu’ils puissent être consommés par les ruminants. La lignine constitue en effet une véritable barrière physique à l’attaque des micro-organismes empêchant la pénétration des enzymes de dégradation dans la paroi cellulaire. Ces types de prétraitements peuvent généralement être appliqués à petite échelle au niveau de l’exploitation agricole. Le procédé le plus largement employé utilise un traitement avec des solutions alcalines qui permet d’augmenter considérablement la biodégradabilité des parois cellulaires. L’hydroxyde de sodium est plus efficace que l’ammoniac dans l’amélioration de la biodégradabilité de la paille des Poacées mais ces produits ont aussi des conséquences négatives sur la santé et l’environnement. Deux procédés importants impliquent l’application d’ammoniac anhydre à la paille (3,5 parties de NH3 pour 100 parties de paille sèche) suivie, soit d’un chauffage à environ 90 °C dans un four, soit de la mise en tas pendant environ 6 semaines à température ambiante. Le premier procédé n’est pas sans danger, le traitement des déchets lignocellulosiques contenant des sucres solubles lorsqu’ils sont traités par l’ammoniac à température élevée engendre la formation du 4-méthyl-imidazole, un composé toxique pour les animaux. Ainsi, il a été montré que, pour une variété donnée de paille de Céréales ou de foin, la biodégradabilité des parois cellulaires est corrélée à la quantité d’acides phénoliques (dont les acides p-coumarique et férulique) libérés par le traitement alcalin, pour une variété donnée de paille de Céréales ou de foin. Cependant, les variations entre espèces sont grandes ce qui laisse à penser que d’autres facteurs interviennent de façon significative dans la diminution de la biodégradabilité. En effet, la structure de la cellulose elle-même est plus importante pour la digestibilité que la teneur en lignines par le fait qu’elle peut gêner l’accès des enzymes et des bactéries au niveau de la paroi cellulaire. Pour des raisons de sécurité, l’utilisation des agents oxydants tels que le dioxyde de soufre (SO2), les peroxydes (H2O2) et l’ozone (O3) ne peut pas être envisagée au niveau des exploitations agricoles. Pour les raisons évoquées ci-dessus, le biotraitement des matières lignocellulosiques par utilisation de champignons (en particulier les champignons dits « de la pourriture blanche du bois ») ou de bactéries, constitue une alternative intéressante. Ainsi, certaines souches de champignons (Phanerochaete chrysosporium) et de bactéries (Streptomyces viridosporus) induisent des réactions de décomposition des lignines, notamment par déméthylation (élimination de CH3), et coupures de liaisons dans ou hors des cycles aromatiques. Le mycélium du champignon pénétrerait donc en profondeur dans les composés lignocellulosiques, la dégradation s’effectuant grâce à des enzymes ou des complexes enzymatiques mettant en jeu des peroxydases en présence d’eau oxygénée. Les mécanismes sont

5 - LES LIGNINES

169

encore mal connus mais feraient intervenir l’oxygène moléculaire, des radicaux libres et EJòÏSFOUT
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5.5.3. AMENDEMENT DU SOL La lignine, notamment celle du bois raméal, a trouvé un débouché important comme améliorant de la teneur en matière organique du sol. Elle protège la racine des plantes contre la détérioration par des teneurs en sels trop élevées et réduit le lessivage des sels de potassium et d’ammonium apportés par les engrais. Cela s’explique par la proche parenté entre la lignine et l’humus, notamment quant à son pouvoir absorbant.

5.5.4. CULTURE DES CHAMPIGNONS COMESTIBLES Un des processus de bioconversion les plus économiques des résidus lignocellulosiques est la culture de champignons comestibles. Ce sont les champignons qui sont les plus aptes à dégrader la lignine. Cette dégradation de la lignine par les champignons filamenteux (notamment ceux de la pourriture blanche) est initiée par des peroxydases extracellulaires. Les recherches actuelles tendent à isoler et à sélectionner les souches de champignons capables de dégrader activement les déchets lignocellulosiques. À cet égard, la plupart des champignons comestibles se sont révélés pourvus de systèmes enzymatiques cellulolytique et hémicellulolytique et certains sont, en outre, hautement lignolytiques. L’identification et une meilleure connaissance de ces systèmes pourraient aussi aider à la sélection de souches de champignons ayant une grande aptitude à se développer sur différents substrats lignocellulosiques. Actuellement environ 10 espèces de Basidiomycètes saprophytiques ont été cultivées avec succès à une échelle qui peut être considérée comme commerciale.

5.5.5. SYNTHÈSE DE PRODUITS CHIMIQUES En raison de la grande variété de groupes fonctionnels qui pourraient être valorisés de plusieurs façons, des essais se déroulent, dans de nombreux laboratoires en vue de préparer, à partir de la lignine, toute une gamme de produits comme des arômes, des produits de chimie fine, des adhésifs, des fertilisants, des phénols, de l’acide acétique, de l’éthylène et bien d’autres produits. Ces dérivés se retrouvent dans les colles, les résines, les émulsifiants de peintures ou sous forme d’additifs renforçateurs lors de la production de caoutchoucs et de pneus. Ils peuvent également intervenir comme stabilisants antioxydants de polymères, comme agents d’enrobage de graines et de pesticides en agriculture. Ils peuvent entrer dans la composition de colorants et d’émulsifiants d’encre, et même de revêtement routier. Pour beaucoup de ces produits, les champignons de la pourriture blanche sont très étudiés en vue de leur utilisation potentielle dans la bioconversion et la production de molécules à haute valeur ajoutée d’intérêts agro-alimentaire et pharmaceutique à partir de matériaux lignocellulosiques.

170

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

La vanilline, substance aromatique à odeur agréable et saveur légèrement piquante, est traditionnellement extraite à partir des gousses de vanillier (Vanilla planifolia). Cette extraction ne représente que 0,2 % des besoins en ce produit ; le reste étant assuré par la synthèse chimique (environ 13 000 t annuellement) ou par la bioconversion de précurseurs à l’aide de micro-organismes. Cette dernière voie présente l’inconvénient de donner des rendements faibles. Actuellement, une des principales utilisations industrielles des lignines est la production de la vanilline (10 à 15 % de la vanilline synthétique), ce qui constitue une source d’approvisionnement plus en adéquation avec les nombreuses utilisations industrielles de ce composé aromatique. À cet effet, l’acide férulique (précurseur de la production de vanille par bioconversion), issu de la dégradation oxydative par les champignons (Aspergillus niger et Pycnoporus cinnabarinus, par exemple) des lignines, s’avère prometteur. L’acide férulique peut également être obtenu par hydrolyse alcaline ou enzymatique des lignines. Dans le premier cas, les matières premières de choix sont les déchets de Graminées (sons de blé et de maïs) dont les lignines sont riches en liaisons alcalinolabiles entre les acides hydroxycinnamiques et les hémicelluloses (arabinoxylanes). La méthode enzymatique utilise la féruloyl estérase qui agit par rupture des liaisons ester entre les glucides et les constituants des lignines, libérant l’acide férulique. Une autre possibilité consiste à utiliser les déchets sulfitiques obtenus lors de l’hydrolyse alcaline des lignines et qui sont riches en alcool coniférylique. Ce dernier est alors converti en vanilline par clivage oxydatif (fig. 5.4). CH2OH CHO oxydation

+

OCH3 OH alcool coniférylique

CH3CHO

OCH3 OH vanilline

acétaldéhyde

Figure 5.4 - Production de la vanilline à partir de l’alcool coniférylique La plus grande partie de la vanilline produite est utilisée dans l’industrie agro-alimentaire, confiserie et pâtisserie en particulier en tant qu’arôme. La vanilline est aussi un intermédiaire de synthèse important pour la chimie pharmaceutique et la phytochimie : synthèse de l’éthyle vanillate, de l’acide diéthylamide vanillique, de la L-dihydroxyphénylalamine.

5.5.6. AUTRES UTILISATIONS Des séparations plus complètes des matières lignocellulosiques utilisant des procédés technologiques plus compliqués peuvent produire des produits finaux de plus grande valeur et ayant un large spectre d’applications. De tels procédés connaissent un développement permanent par l’industrie.

5 - LES LIGNINES

171

5.6. MÉTHODES D’ÉTUDE 5.6.1. MÉTHODES HISTOCHIMIQUES Facile à mettre en évidence grâce à sa propriété de coloration spécifique, la lignine permet de distinguer les tissus conducteurs des tissus de soutien. Un grand nombre de colorants histochimiques sont disponibles pour visualiser les composés phénoliques dans les plantes, soit sur des coupes fines, soit sur des tissus entiers. Ci-après quelques exemples, parmi les plus courants : X La SÏBDUJPO
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syringyles. L’échantillon est plongé dans une solution fraîchement préparée de perNBOHBOBUF
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,.O04) aqueux 1 % (p/v) pendant au moins 30 min. Après lavage dans l’eau distillée pendant 2 min et élimination de tout le liquide, une solution d’HCl aqueux 15-20 % est appliquée puis éliminée et remplacée par une solution d’ammoniaque à 10 %. Les résidus syringyles apparaissent alors colorés en rouge. Leur absence se traduit par une coloration jaune. X La phloroglucine en milieu chlorhydrique (phloroglucinol 2 % dissoute dans un mélange 2 : 1 d’éthanol et d’HCl concentré) colore en rouge les tissus lignifiés riches en groupements cinnamaldéhydes comme le xylème. X Le TVMGBUF
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éthanolique, colore la lignine en jaune. X Le bromure d’éthidium est une substance fluorescente qui lorsqu’elle est appliquée en solution aqueuse à 0,1 % sur des coupes histologiques pendant 5-10 min, puis observée sous lumière UV, permet de visualiser les composés phénoliques qui apparaissent fluorescents en orange. X Le bleu de toluidine dissous dans un tampon à pH entre 4 et 8, ou dans l’éthanol à 70 % colore la lamelle moyenne en rouge, les parois non-lignifiées en rouge-violet ou bleu-violet, et les polyphénols polymérisés comme la lignine en vert ou bleu-vert. X Le DBSNJOP
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5.6.2. DOSAGE QUANTITATIF Deux méthodes sont couramment utilisées pour quantifier les lignines.

5.6.2.1. MÉTHODE DE KLASON Cette méthode consiste à hydrolyser les polysaccharides pariétaux (d’une matière végétale préalablement broyée) à l’aide d’acide sulfurique concentré (72 %, température ambiante) durant 2 h, tout en rendant le polymère de lignine insoluble. Cette première hydrolyse est suivie d’une post-hydrolyse par l’acide sulfurique dilué (3 %) porté à ébullition et à reflux pendant 3 h ; cette étape permettant de re-condenser une fraction des lignines afin de faciliter la filtration ultérieure. "QSÒT
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172

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

traces d’acide et les sucres hydrolysés, lavé avec de l’eau distillée jusqu’à ce que le pH devienne légèrement acide, séché dans une étuve à 105 °C et enfin pesé. Une partie des lignines, dites lignines acido-solubles, peut être solubilisée dans le surnageant sulfurique. Cette fraction est évaluée par mesure de son absorbance à 205 nm.

5.6.2.2. MÉTHODE AU BROMURE D’ACÉTYLE C’est une méthode spectrométrique basée sur la solubilisation à chaud du résidu pariétal dans un réactif très agressif (mélange de bromure d’acétyle et d’acide acétique glacial) placé dans des tubes en verre à vis bouchés. La réaction est ensuite réalisée dans un bain d’huile à 50 °C pendant 2 h 15 min, avec agitation périodique. Après refroidissement et EBOT
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dans l’acide acétique), les ions polybromures qui absorbent à 280 nm sont détruits par le DIMPSIZESBUF
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par l’acide acétique, mesurée à 280 nm, est convertie en quantité de lignines. L’avantage de cette technique est qu’elle est applicable à de petites prises d’essai d’une dizaine de milligrammes ou de quantités de lignines de quelques milligrammes, contrairement à la précédente qui nécessite des quantités plus importantes.

5.6.3. DÉTERMINATION STRUCTURALE Il n’existe pas de méthode unique pour caractériser complètement des polymères aussi complexes que les lignines. Cette caractérisation est obtenue par la collecte d’informations diverses à partir d’un ensemble de techniques d’analyse. La technique de thioacidolyse permet de caractériser, par chromatographie en phase HB[FVTF
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monomères libérés par la coupure sélective des liaisons intermonomériques non-condensées de type β-O-4. Cette méthode est spécifique des lignines et est très sensible. Elle permet de déterminer le rapport des unités S/G et la fréquence des liaisons non-condensées. Une analyse supplémenUBJSF
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les autres types de liaisons intermonomériques. La spectroscopie infrarouge (IR) ne permet pas de définir exactement la structure des molécules aussi complexes que les lignines mais permet la caractérisation des groupements fonctionnels et des composantes majeures de différents échantillons. Les fonctions caractéristiques des unités de base des lignines sont les fonctions aromatiques, carbonyles (C=O), les alcools et les éthers. La TQFDUSPTDPQJF
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la structure des lignines.

13

6 - LES LECTINES 6.1. DÉFINITION Les lectines (terme inventé par William Boyd en 1954) ou hémagglutinines (ou phytohémagglutinines pour celles d’origine végétale) sont des protéines globulaires ou des glycoprotéines caractérisées par l’existence d’au moins un domaine non-catalytique pouvant se fixer de manière spécifique et réversible à des résidus glucidiques (mono- ou oligosaccharides) de glycoconjugués des membranes cellulaires.

6.2. DISTRIBUTION ET LOCALISATION Les lectines ont été identifiées dans une grande variété d’organismes ou d’organes : virus, bactéries, champignons, lichens, éponges, mollusques, œufs de poissons, membranes des cellules de mammifères et de plantes. Ces dernières représentent la principale source de lectines utilisées actuellement dans la recherche. Les sources les plus riches sont les graines d’Euphorbiacées et des Fabacées où les lectines peuvent constituer jusqu’à 10 % des protéines totales (ex. graines et racines de haricot, lupin, soja…) mais on les trouve également chez les Poacées (blé, riz), fruits, tubercules et bulbes de diverses Solanacées (pomme de terre, tomate) et Liliacées, racines de Cucurbitacées, tiges et feuilles de Cactacées et d’Orchidacées. À cause de leur distribution très large dans le règne végétal, les lectines sont donc présentes dans la plupart des aliments à base de plantes. Elles présentent toutefois peu de similarités entre ces différentes origines. Les lectines des graines représentent généralement 0,1 à 5 % des protéines totales. Les plantes contiennent une quantité maximale de lectines durant la phase embryonnaire et la phase de maturation des graines (27 jours après l’anthèse chez Dolichos biflorus, par exemple), concentrées principalement dans les corps protéiques de l’albumen des cotylédons et disparaissant graduellement au cours de la germination, en même temps que sont mobilisées les réserves. Depuis l’isolement de la ricine (lectine du ricin) en 1889, d’autres lectines ont été identifiées dans plus de 1000 espèces de plantes et près de 1000 séquences ont été déterminées pour 241 espèces de plantes différentes. De plus, la plupart des lectines caractérisées proviennent d’une seule famille, les Fabacées qui compte environ 60 % des lectines connues.

174

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Les lectines sont localisées aussi bien dans le cytoplasme que dans les structures membranaires de la cellule : réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, plasmalemme, parois cellulaires, corps protéiques. L’agglutinine du tabac, par exemple, est synthétisée dans le cytoplasme et est partiellement transloquée dans le noyau. Au niveau extracellulaire, les lectines sont présentes dans les parois cellulaires de presque tous les tissus, et pourraient avoir un rôle fondamental dans l’assemblage des polysaccharides pariétaux.

6.3. STRUCTURE De poids moléculaire variable, les lectines peuvent avoir des structures quaternaires monomériques ou, le plus souvent, dimériques, tétramériques, ou encore octamériques. La structure multimérique augmente l’aptitude de la lectine à établir de multiples liaisons avec ses cibles glucidiques. Chaque protomère a une organisation polypeptidique tridimensionnelle avec une zone hydrophobe interne, siège des interactions spécifiques. La plupart sont liés par une liaison covalente à une partie glucidique. Cette dernière représente près de 50 % dans le cas de la lectine de pomme de terre, 2 % dans le cas de la lectine de Ficus cunia tandis que les lectines d’Urtica dioïca et de Canavalia ensiformis (concanavaline A ou ConA) sont uniquement protéiques. Les chaînons glycaniques des lectines contiennent du mannose, de la N-acétyl-glucosamine, du glucose, de l’arabinose, du xylose, du fucose, parfois du galactose. La plus petite lectine végétale connue est celle d’Urtica dioïca
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séquences des gènes codant pour des lectines d’espèces apparentées taxonomiquement présentent un degré d’homologie élevée comme il a été démontré chez les Céréales et les Légumineuses. Certaines lectines contiennent des cations divalents (calcium, magnésium, ou manganèse) dans leurs molécules. Ces ions sont nécessaires à la stabilité de l’édifice moléculaire comme à l’interaction de la protéine avec le sucre. D’autres lectines ne requièrent pas de cations divalents pour leur activité mais nécessitent la présence de groupements thiol ; tel est le cas de l’agglutinine du germe de blé. En général, les lectines interagissent avec les groupements glycosyl non-réducteurs des polysaccharides et des glycoprotéines, mais certaines peuvent se fixer à des résidus glucidiques internes ou aux extrémités réductrices des sucres.

6.4. PROPRIÉTÉS, RÔLES PHYSIOLOGIQUES ET TOXICITÉ Les caractéristiques structurales des lectines leur confèrent diverses propriétés biologiques détaillées ci-après.

6.4.1. AGGLUTINATION DES ÉRYTHROCYTES Les lectines peuvent agglutiner les érythrocytes en se fixant sur certains résidus glucidiques membranaires qu’elles reconnaissent spécifiquement. Les lectines possédant

6 - LES LECTINES

175

au moins deux sites de reconnaissance et de liaison avec les résidus glucidiques sont capables de produire une telle agglutination ; les lectines monovalentes à un seul site de reconnaissance ne provoquent pas l’agglutination. Une espèce de plante peut contenir plusieurs formes différentes de la même lectine mais cependant pourvues de la même spécificité de reconnaissance vis-à-vis d’un sucre. À l’inverse, une même espèce végétale peut contenir des lectines ayant des spécificités différentes. C’est le cas du gui (Viscum album) qui renferme 3 lectines ayant des spécificités pour le lactose, le galactose et la N-acétylgalactosamine, respectivement. Cette affinité spécifique des lectines pour certains résidus glucidiques constitue la base de leur identification et de certaines méthodes de séparation (voir section 6.5). Leur spécificité pour un glycane dépend de la conformation tridimensionnelle de ce dernier. Cette interaction sucre-lectine n’est pas enzymatique, en ce sens qu’elle n’induit aucune modification de la molécule glucidique mais elle provoque, en général, des changements dans la conformation de la lectine dans l’espace.

6.4.2. EFFET ANTINUTRITIONNEL ET TOXIQUE Les lectines ne sont pas toutes toxiques pour l’homme et l’animal mais certaines sont susceptibles d’avoir de graves incidences sur la santé. La sévérité de leur impact est également différente. Certaines (principalement celles présentes chez Phaseolus vulgaris) sont classées comme toxiques et d’autres comme non-toxiques (Pisum sativum, Lens culinaris, Vicia faba). L’effet des lectines ingérées sur le métabolisme humain ou animal varie selon le type de lectine, l’espèce qui ingère la protéine ainsi que l’âge, le statut nutritionnel et l’état de santé de l’organisme. Pour affecter le métabolisme humain, les lectines doivent d’abord se fixer à la surface des cellules épithéliales de l’intestin. Cette fixation nécessite la présence d’un résidu glucidique spécifique ; de plus, les lectines alimentaires résistent fortement à la dégradation protéolytique dans l’intestin. Elles exercent alors une action antinutritionnelle en s’opposant à la bonne absorption des nutriments et à leur passage dans le réseau sanguin. Les lectines alimentaires toxiques peuvent modifier l’équilibre hormonal ainsi que le métabolisme lipidique du muscle. Ces modifications épuisent les réserves de lipides, de glycogène et de protéines de l’organisme. Il s’en suit une perte de poids, une sensibilité plus grande à l’infection bactérienne, un retard de croissance et de développement et, dans certains cas, la mort de l’organisme pour les plus toxiques. Se fixant sur la muqueuse intestinale, les lectines empêchent le développement normal des microvillosités. Certaines lectines sont non-toxiques bien qu’elles se lient à l’épithélium de l’intestin, elles n’ont alors aucun effet négatif sur le métabolisme. Les effets nuisibles des lectines semblent par ailleurs être réversibles. Enfin, étant thermolabiles, les lectines alimentaires sont dénaturées par la cuisson.

176

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

6.4.3. ACTIVITÉ ENTOMOTOXIQUE De nombreuses lectines (comme les lectines des graines du haricot commun Phaseolus vulgaris) sont douées d’une activité entomotoxique lorsqu’elles sont présentes dans l’alimentation de divers Coléoptères, Diptères, Homoptères et Lépidoptères. Le tube digestif des insectes étant riche en récepteurs cellulaires potentiels des lectines, des effets néfastes (retard de croissance, anomalies de développement…) peuvent faire suite à l’ingestion de plantes contenant des lectines. Les lectines peuvent aussi se lier à des enzymes digestives glycosylées, inhibant ainsi leur activité. Des gènes codant pour des lectines entomotoxiques ont été introduits dans différentes plantes cultivées rendues ainsi moins sensibles aux attaques des insectes.

6.4.4. ACTION SUR LA SYNTHÈSE PROTÉIQUE La ricine et l’abrine sont des lectines hautement toxiques ; elles inhibent la synthèse protéique des cellules eucaryotes par inactivation de la sous-unité 60 S des ribosomes. Ces toxines hétérodimériques, se composent de deux sous-unités, l’une de 30 kDa à propriétés catalytiques (chaîne A) et l’autre de 35 kDa de type lectine (chaîne B), liées par des ponts disulfures ; elles sont appelées RIP2 ou RIP de type 2 (pour Ribosome Inactivating Protein à deux chaînes). En fait, la chaîne A, douée d’une activité N-glucosidase agit comme inactivateur des ribosomes, tandis que la chaîne B est responsable de la liaison avec les glucides. Le mécanisme d’action proposé est le suivant : X fixation de la chaîne B à la surface de la cellule grâce à un récepteur (glycoconjugué) ; X reconnaissance et pénétration de la chaîne A dans le cytoplasme ; X inactivation des ribosomes par clivage à l’extrémité N-glycosidique d’un résidu d’adénosine de l’ARNr, conduisant à l’inhibition de la synthèse protéique suivie de la mort cellulaire. La ricine est composée de deux hémagglutinines (RCL I et RCL II) et de deux toxines (RCL III et RCL IV). Les dernières sont des dimères constitués d’une chaîne A, ribosome-inactivating enzyme

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se lier aux résidus galactose des glycolipides ou des glycoprotéines de la surface cellulaire, facilite l’entrée, dans la cellule, de la chaîne A qui est douée d’activité toxique. Elle agit sur la sous-unité ribosomale 60 S et empêche la fixation du facteur-2 d’élongation. L’inhibition de la synthèse protéique conduit, là encore, à la mort cellulaire. La ricine est l’une des plus puissantes toxines naturelles connues.

6.4.5. LYMPHOSTIMULATION Une autre propriété importante de certaines lectines est leur aptitude à l’induction de la multiplication (lymphostimulation) des lymphocytes T humains qui sont une variété de globules blancs chargés de la destruction des cellules infectées par des pathogènes et qui interviennent dans le contrôle des processus immunitaires (tab. 6.1).

6 - LES LECTINES

177

Dans le monde végétal, cette action mitogène a été également observée sur les cellules de racines d’oignon sous l’action de la lectine du haricot. Tableau 6.1 - Propriétés de quelques lectines végétales Action mitogène Poids Ion sur les lympho- moléculaire métallique cytes humains approximatif requis

Source

Sucre(s) spécifique(s)

concanavaline A

Canavalia ensiformis

D-mannose D-glucose

oui (cellules T)

104 000 (tétramère)

abrine A

Abrus precatorius

D-galactose

oui

60 000 (dimère)

ricine

Ricinus communis

D-galactose

oui

60 000 (dimère)

Arachis hypogea

N-acétylD-galactosamine

oui (cellules T)

120 000 (tétramère)

Lectine

lectine d’arachide lectine de soja

Glycine max

N-acétylglobules rouges D-galactosamine du groupe D-galactose sanguin A D-mannose

110 000 (tétramère)

Ca2+
.O2+

Ca2+
.O2+

oui

49 000 (tétramère)

N-acétylD-glucosamine

oui

36 000 (dimère) 200 000 (octamère)

Vicia faba

mannose glucose N-acétylD-glucosamine

oui (tétramère)

50 000

lectine du haricot commun

Phaseolus vulgaris

oligosaccharide

oui

128 000 (tétramère)

lectine du haricot de Lima

Phaseolus lunatus

N-acétylD-galactosamine

globules rouges du groupe sanguin A

120 000 (dimère)

Ca2+
.O2+

oui

49 000 (dimère)

Ca2+
.O2+

lectine de petits-pois

Pisum sativum

D-mannose

lectine du germe de blé

Triticum vulgaris

lectine de fève (favine)

lectine de lentille

D-glucose D-mannose Lens culinaris N-acétylD-galactosamine

non-connu

6.4.6. INTERACTIONS PLANTES/MICRO-ORGANISMES ET DÉFENSE DES PLANTES Les lectines interviennent dans les interactions plantes/micro-organismes ainsi que dans les mécanismes de défense des plantes (ex. symbiose bactéries-Légumineuses, relations hôte-pathogène), par divers mécanismes. En inhibant la germination des conidies et la

178

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

croissance des hyphes, les lectines protègent les plantes contre les infections fongiques. La lectine du germe de blé, par exemple, possède une affinité pour l’acétylglucosamine ; en se liant aux parois du champignon, elle interfère avec la formation de la chitine et donc, avec la synthèse des parois. Par ailleurs, elles favorisent l’agglutination des bactéries du sol sur les racines des plantes. D’autres lectines possèdent une activité enzymatique. C’est le cas de la lectine de Vigna radiata et de Vicia faba qui présente une activité α-galactosidase.

6.5. PURIFICATION DES LECTINES ET UTILISATIONS Les lectines natives, dont beaucoup sont disponibles dans le commerce, sont utilisées essentiellement pour des applications basées sur les réactions de précipitation et d’agglutination ou de stimulation mitogénique des lymphocytes ; des dérivés de lectines (également disponibles commercialement) sont utilisés dans une variété d’autres applications. L’aptitude à la fixation réversible et spécifique sur des sucres fait des lectines des molécules utilisables pour l’isolement de ces sucres, à l’état libre ou à l’état de glycoconjugués (glycoprotéines ou glycolipides) ou, à l’inverse, pour la détection et la purification des lectines elles-mêmes. Dans le premier cas, l’extrait contenant les sucres ou les glycoconjugués est déposé sur une colonne de chromatographie d’affinité contenant, comme ligands, la lectine qu’ils reconnaissent, immobilisée sur un support insoluble (agarose, polyacrylamide, silice…). Tel est le cas de la concanavaline A qui est spécifique de l’α-D-mannopyranosyl et qui peut être fixée par covalence au Sepharose®. Les composés ne contenant pas ce résidu glucidique sont éliminés à l’aide d’un tampon approprié ; les sucres ou les glycoconjugués retenus étant ensuite désorbés par élution de la colonne avec une solution qui contient le même sucre en excès. Toutefois, leur comportement chromatographique et d’autres propriétés physiques ou chimiques peuvent dépendre des conditions d’essai, notamment de la présence de certains cations. De la même manière, elles sont aussi utilisées pour isoler les lectines d’extraits bruts de végétaux par la même technique. La découverte de nouvelles lectines dans les systèmes biologiques implique la maîtrise de techniques fiables d’isolement, de purification et de caractérisation. En raison de la nature complexe des interactions protéines-saccharides, aucune technique seule ne peut permettre la caractérisation de toutes les lectines. De nombreuses techniques analytiques sont souvent utilisées pour la caractérisation de nouvelles lectines, ou pour l’emploi des lectines existantes comme outils analytiques. La cristallographie aux rayons X de lectines purifiées fournit des données structurales de haute résolution et permet la visualisation EFT
JOUFSBDUJPOT
QSPUÏJOFTTBDDIBSJEFT
#JFO
RVF
MB
3./
EFT
DPNQMFYFT
MFDUJOFTBDDIBrides puisse la surpasser, cette technique s’est confirmée comme une alternative utile pour la détermination de leur structure à trois dimensions. La spectrométrie de masse à haute résolution est aussi une nouvelle technique qui fournit des informations très utiles dans ce domaine. Leur composition différente en acides aminés permet leur séparation par focalisation isoélectrique.

6 - LES LECTINES

179

APPLICATIONS En histochimie et cytochimie, l’utilisation des lectines marquées permet de localiser des glycoconjugués membranaires (récepteurs d’hormones, de vitamines, de neuromédiateurs et de toxines) porteurs de sucres particuliers, dans des coupes de tissus, des cellules, des organites… Cette technique est particulièrement intéressante, puisque des changements des propriétés fixatrices des lectines apparaissent lors de la différenciation embryonnaire et la croissance, lors des transformations malignes, et dans certaines conditions pathologiques. Elles peuvent être visualisées, soit par couplage direct de la lectine avec la fluorescéine isothiocyanate (FITC) (fig. 6.1), la ferritine, la peroxydase de radis (marquage froid) ou avec un marqueur radioactif, soit à l’aide d’anticorps dirigés contre les lectines (fig. 6.2) préalablement isolées et injectées à des lapins. Ces anticorps sont eux-mêmes rendus visibles en microscopie par couplage avec les réactifs utilisés dans la première méthode. marqueur (ex : FITC ou peroxydase) lectine résidu glucidique

Figure 6.1 - Marquage direct de la lectine à l’aide d’une sonde fluorescente marqueur (ex : FITC ou peroxydase)

anticorps anti-lectine

lectine résidu glucidique

Figure 6.2 - Marquage indirect de la lectine à l’aide d’un anticorps lui-même marqué à l’aide d’une sonde fluorescente Une des premières utilisations analytiques des lectines a été leur application en hématologie dans le groupage du sang. Grâce à ces substances, il est possible d’effectuer un test à la phytohémagglutinine par intradermoréaction. Ce test est positif quand l’immunité cellulaire est normale. Quand le test et négatif cela traduit une absence de transformation des lymphocytes. Les lectines de Lotus tetragonolobus et d’Ulex europaeus, toutes deux spécifiques du fucose, sont utilisées pour l’identification du groupe sanguin O. La lectine de Dolichos biflorus est utilisée pour distinguer entre les sousgroupes A1 et A2.

180

PARTIE I - SUBSTANCES D'ORIGINE VÉGÉTALE

Enfin des préparations à base d’extraits de gui contenant des lectines comme principes actifs ont été couramment utilisées dans certains pays pour traiter différents types de cancer. La plupart des données connues au niveau de la surface des cellules, aussi bien normales que pathologiques, proviennent de l’utilisation des lectines et le domaine de leurs utilisations comme réactifs spécifiques s’élargit de plus en plus.

PARTIE II

SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES 7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES 7.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2. Alginates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3. Agars. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4. Carraghénanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PAGES

183 183 186 188

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES 8.1. Généralités. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2. Pigments et colorants. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3. Acides gras polyinsaturés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4. Stérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5. Production de biocarburants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.6. Production de polysaccharides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.7. Isotopes biochimiques stables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.8. Toxines des microalgues et des Cyanobactéries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

193 194 198 201 202 211 211 212

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES 7.1. INTRODUCTION Les produits du métabolisme algal sont extrêmement diversifiés ; la richesse organique qualitative et quantitative de ces végétaux en fait une source potentielle de produits à haute valeur commerciale pour divers domaines d’utilisation : alimentation humaine et animale directe, industrie agro-alimentaire, industrie pharmaceutique, médecine, cosmétologie, dentisterie, agriculture, papeterie, industrie textile… Le principal intérêt économique des algues est leur richesse en polysaccharides pariétaux aux propriétés gélifiantes, émulsifiantes, stabilisatrices et épaississantes : alginates provenant d’algues brunes, carraghénanes et agar-agar extraits d’algues rouges, principalement destinés à l’industrie agro-alimentaire et à l’industrie pharmaceutique.

7.2. ALGINATES Les alginates, extraits sous forme de sels de l’acide alginique, sont les principaux constituants du mucilage des parois cellulaires des algues brunes ou Pheophycées. Ils se trouvent principalement dans la lamelle moyenne et la paroi primaire des cellules. En fonction des espèces, de la partie du thalle prélevée, des saisons et du cycle végétatif de l’algue, ils représentent 20 à 40 % de la matière sèche de l’algue. Les alginates sont extraits d’algues récoltées, principalement de laminaires (Laminaria digitata, L. hyperborea, L. japonica…), de Macrocystis pyrifera, d’Ascophyllum et de Fucus (F. serratus et F. vesiculosus). La majeure partie des alginates se présente dans les thalles sous forme de gel calcique peu soluble dans l’eau, une fraction alginates de sodium étant au contraire soluble à température ambiante.

7.2.1. STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Les alginates sont des polysaccharides formés de chaînes linéaires dont l’élément de base FTU
TPJU
MF
Ȼ%NBOOVSPOBUF
.


TPJU
MF
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FU
MB
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EF
DFT
BDJEFT
VSPniques diffèrent en fonction de l’espèce, de ses conditions de croissance, de son âge et des tissus considérés.

184

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

G

O

OH O OH COOH O

COOH OH O

OH M

Figure 7.1 - Structure de l’acide alginique en conformation « chaise » .

BDJEF
Ȼ%NBOOVSPOJRVF G : acide α-L-guluronique

Les monomères forment des chaînes (100 à 3000 unités liées par des liaisons de type (1J 4) dont la longueur est variable (masse moléculaire comprise entre 20 et 700 kDa GPSNBOU
EFT
CMPDT
EBDJEFT
BMHJOJRVFT

BDJEFT
QPMZ.
VOJT
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EFT
MJBJTPOT
Ȼ J 4)), poly-G (liaisons α-(1J 


TÏQBSÏT
QBS
EFT
SÏHJPOT
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(.(. 
-FT
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QIZTJco-chimiques des alginates sont fonction de la proportion respective de ces composants. En particulier les propriétés rhéologiques (viscosité
TPOU
EÏQFOEBOUFT
EV
SBQQPSU
.(
qui varie entre 0,25 et 2,25 selon les espèces utilisées lors de leur extraction mais aussi en GPODUJPO
EF
MÉHF
FU
EFT
SÏHJPOT
EV
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MF
SBQQPSU
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FTU
EF
 
DIF[
M. pyrifera et de 0,45 dans les stipes de L. hyperborea. Par rapport aux autres phycocolloïdes, les propriétés de viscosité et le pouvoir gélifiant des alginates s’expriment à température ambiante, dans la zone de pH allant de 4 à 10. Les sels solubles (alginates de cations monovalents et de magnésium) forment en présence d’eau une solution épaisse et visqueuse. Par exemple, à concentration égale de 1 %, la viscosité d’un alginate à 20 °C est de 1500 à 3000 centipoises, alors que la gomme arabique donne moins de 30 centipoises. La viscosité d’une solution d’alginate dépendant à la fois de sa concentration mais aussi de la longueur des molécules, c’est-à-dire du nombre de monomères composant la chaîne ; pour une même concentration, plus la chaîne est longue et plus la solution est visqueuse. Ce sont ces propriétés rhéologiques (la viscosité augmentant très vite avec la concentration) et la possibilité de produire des alginates de différentes qualités (donnant pour une même concentration des solutions de viscosité différentes) qui ont intéressé en premier les industriels. Une autre propriété des alginates est l’aptitude à former des gels aqueux non-thermoréversibles en présence de cations divalents (calcium) dont la structure stéréochimique de type « boîte à œufs » (fig. 7.2) est caractéristique. La liaison préférentielle du calcium au niveau de l’acide guluronique par des liaisons ioniques rapproche les groupements COO –uroniques contigus provoquant l’insolubilité, les segments guluroniques à conformation fortement plissée sont plus aptes à retenir les ions Ca2+ en coopération avec une chaîne parallèle (les groupes carboxyliques de l’acide mannuronique sont orientés à l’opposé). Les deux chaînes pouvant à leur tour en fixer d’autres suivant le même mécanisme (fig. 7.2). Ainsi en présence d’ions divalents les zones où l’acide guluronique est dominant vont former des structures rigides alors que les zones à acide mannuronique seront plus

7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES

185

lâches. La tendance d’un alginate à la gélification
TFSB
BVTTJ
GPODUJPO
EV
SBQQPSU
.(
Le gel d’alginate peut être redissous facilement en présence d’une concentration élevée d’ions sodium, potassium, ou magnésium ; on dit qu’il est ionoréversible.

+ Ca2+ ( )

Figure 7.2 - Représentation schématique du mécanisme de gélification des alginates en présence d’ions calcium (structure en « boîte à œufs »)

7.2.2. EXTRACTION Pour extraire les alginates, on utilise leurs propriétés d’insolubilité en milieu acide et en présence d’ions di- ou trivalents et de solubilité en présence d’ions monovalents comme le sodium. Pratiquement, après broyage des thalles dans de l’eau acidifiée, on élimine les contenus cellulaires et les produits indésirables (sels minéraux et sucres solubles) par filtration ou décantation. On dissous l’acide alginique en alcalinisant le milieu avec du carbonate de sodium (10 à 16 h à 50 °C, dans du Na2CO3 à 4 g/L) puis on le précipite en acidifiant le milieu avec de l’acide sulfurique et on récupère le « gâteau » d’alginate qui est ensuite abondamment rincé (pour éliminer l’acide), pressé et séché. Il peut alors être commercialisé sous cette forme ou transformé en différents sels : de sodium, potassium, ammonium ou calcium, sous la forme de poudres blanches à brunâtres pratiquement inodores et insipides.

IMPORTANCE ÉCONOMIQUE ET UTILISATION Les deux principales caractéristiques des alginates, viscosité et gélification s’expriment à température ambiante. Ainsi, les sels solubles (liés à des ions monovalents) forment en présence d’eau, des solutions épaisses et visqueuses qui ne coagulent pas à l’ébullition et restent onctueuses à la congélation. En présence de cations bi- ou trivalents, ils deviennent insolubles formant des gels durs alors qu’en milieu acide, ils forment des gels plus souples. Enfin, par évaporation, ils forment des films protecteurs solubles ou insolubles.

186

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Toutes ces propriétés font que les alginates présentent de multiples utilisations dans diverses applications alimentaires, pharmaceutiques et technologiques. hIndustrie alimentaire : du fait de leur innocuité, l’acide alginique et ses sels (de Na, K, NH4, Ca) sont abondamment (environ 30 % de la production) utilisés dans l’industrie agro-alimentaire1 comme additifs alimentaires en tant qu’épaississants, gélifiants, émulsifiants, stabilisants et rétenteurs d’eau en tant que liants en charcuterie, en tant qu’agents épaississants pour la stabilisation de desserts lactés et glacés, de mousses et d’émulsions, de boissons (jus de fruit et bière) et en tant que gélifiant pour les flans, desserts de fruits et crèmes glacées ou la biscuiterie, les confitures, les potages ou les desserts, les sauces (moutardes, mayonnaises…). Incorporé au beurre, l’acide alginique joue un rôle protecteur de la vitamine A. Il est aussi très utilisé dans la confection de produits reconstitués (fruits, légumes, poissons, viandes). hIndustrie pharmaceutique : on les retrouve en tant qu’excipients de nombreuses pommades, suppositoires, pilules, pastilles, sédatifs…, en tant qu’agent désintégrant dans les comprimés, pansements non-adhésifs, produits de régime restrictif (obésité), décontaminant, moulages dentaires, traitement des troubles liés à l’acidité gastrique pathogène (reflux gastro-œsophagien). Dans ce dernier cas, les alginates forment une mousse qui flotte au-dessus du contenu gastrique, et donc forme une barrière mécanique entre le liquide gastrique et l’œsophage. hIndustrie textile : au moins 30 000 t d’acide alginique sont produites au niveau mondial dont la moitié est utilisée par l’industrie textile pour la coloration des tissus (rôle d’épaississant pour la pâte contenant le colorant évitant les bavures et préservant la couleur) et leur imperméabilisation. hLa possibilité de fabriquer des billes d’alginates de calcium et d’y emprisonner des cellules vivantes (bactéries, levures, microalgues, cellules humaines…) ou des molécules (herbicides) ouvre la voie à de nombreuses applications en biotechnologie. hEnfin, les alginates sont également utilisés, mais en quantités moins importantes, dans d’autres domaines d’activité comme la fabrication du papier (apprêt de surface), l’enrobage des électrodes de soudure, le traitement des eaux, la fabrication de pellicules photographiques moins thermosensibles, les produits de beauté, les peintures et les encres d’imprimerie pour leurs propriétés épaississante, gélifiante, émulsifiante et stabilisante. Absorbant 200 à 300 fois son poids en eau, l’acide alginique trouve son application dans la fabrication des couches culottes.

7.3. AGARS Les agars sont des polysaccharides présents dans la matrice de la paroi cellulaire de certaines algues rouges, appartenant essentiellement à l’ordre des Gélidiales (Gelidium corneum, G. amansii) mais aussi des Gigartinales et des Céramiales.

7.3.1. STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Les agars sont des polymères linéaires du galactose cyclisé en forme pyrane qui se présente sous forme de β-D-galactopyranose simple, de galactopyranose-6-sulfate, de méthyl 3,6-galactopyranose ou de 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose. La répétition du 1

Voir Les additifs alimentaires cités dans le livre sur le site web dédié

7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES

187

même motif diosidique de base, l’agarobiose, forme une longue molécule se présentant sous forme d’une spirale lévogyre dont la masse molaire est d’environ 12 000 g/mole. Ces unités monomères sont liées alternativement par des liaisons β-(1J 4) et α-(1J 3). On distingue trois types d’agar : X le type « agarose » dont le dimère est essentiellement composé du β-D-galactopyranose

et du 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose (fig. 7.3) et d’un nombre peu élevé de groupements hydrophiles (OSO3– ). Ils formeront spontanément des gels de haute qualité ; X le type « agarose chargé » dont les molécules sont plus riches en OSO3– formant un gel souple mais de qualité moyenne ; X le type « galactane » dont les molécules possèdent beaucoup de groupements hydrophiles OSO3– qui formeront de ce fait un gel médiocre voire pas de gel du tout. OH OH O

O O

O

O OH

O OH

n

3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl-(1J3)-β-D-galactopyranane

Figure 7.3 - Structure de l’agarose L’agar extrait des différentes agarophytes contient ces trois fractions mais en proportions variables et ses capacités à gélifier des solutions aqueuses dépendent de leurs abondances respectives dans l’espèce utilisée mais aussi de la période et du lieu de la récolte. L’agar forme des gels translucides très résistants même à très faible concentration (de l’ordre de 0,04 %). Ils sont thermoréversibles et stables dans une large gamme de pH. À chaud l’agarose se présente sous forme de pelotes dispersées dans la solution ; lors du refroidissement les chaînes ont tendance à se regrouper en doubles spires de façon à ce que les groupements hydrophobes soient orientés vers l’intérieur en expulsant l’eau (phénomène de synérèse). Il se crée ensuite entre les chaînes des liaisons hydrogène qui consolident l’ensemble et immobilise les molécules d’eau sans ajout extérieur.

7.3.2. EXTRACTION Les agars sont extraits par congélation et décongélation successives après extraction à l’eau bouillante afin de scinder les molécules en fragments solubles. En solution aqueuse, ils forment alors spontanément des gels thermoréversibles, se liquéfiant à partir de 85 °C et se gélifiant à une température plus basse (entre 30 et 45 °C). Cette propriété (hystérésis), associée à une bonne résistance aux températures de stérilisation (120 °C), est exploitée depuis longtemps en microbiologie (solidification des milieux de culture) mais aussi dans l’industrie agro-alimentaire. L’agar est une poudre jaunâtre tirant vers le brun. Son odeur est pratiquement neutre, son goût rappelle en revanche légèrement celui des algues.

188

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

IMPORTANCE ÉCONOMIQUE ET UTILISATION La production et l’utilisation des agars dans le monde étaient supérieures à 10 000 t/an à la fin du XXe siècle. Le facteur limitant étant la disponibilité des agarophytes en milieu naturel. La culture de Gracilaria, en cours de développement, permet de résoudre en partie ce problème. hDans l’industrie agro-alimentaire, les agars sont abondamment utilisés (90 % de la production) comme gélifiants, émulsifiants et stabilisants (nappage des gâteaux, confiserie, confitures, gelées de fruits ou de légumes, viandes en gelée, sauces, produits de la pêche…). Peu métabolisé, sans goût et sans odeur, ils ne modifient pas l’apport calorique des aliments1. hDans l’industrie pharmaceutique, ils sont utilisés comme excipients et comme stabilisants dans de nombreuses préparations et comme gélifiants dans les pommades. Non-assimilables, infermentescibles et non-toxiques, ce sont aussi d’excellents laxatifs, favorisant mécaniquement l’évacuation intestinale (traitement de la constipation) et régularisant le transit. hEn biochimie et en biotechnologie : l’agar-agar ou gélose insoluble dans l’eau froide mais soluble dans l’eau bouillante, donne par refroidissement des gels consistants d’où son emploi pour la solidification des milieux de culture de micro-organismes : bactéries, champignons, microalgues, ou plantules. Les gels d’agarose (un des composants de l’agar obtenu par purification de ce dernier) sont abondamment utilisés comme support pour la séparation de macromolécules dans les techniques d’électrophorèse, de chromatographie comme phase stationnaire et en immunologie comme support de migration. Pour cette dernière application, les gels d’agarose sont souvent préférés à ceux constitués d’agar en raison de leur porosité plus uniforme. Le gel est élastique et thermiquement réversible (il se liquéfie en général vers 90-100 °C et se maintient en surfusion jusque vers 45-40 °C). hEnfin, dans d’autres domaines de l’industrie, l’agar intervient ponctuellement (fabrication de peintures, de colles, de pellicules photographiques, stabilisation de la nitroglycérine…). Il entre dans la composition de pâtes à empreintes dentaires en dentisterie.

7.4. CARRAGHÉNANES Comme les autres phycocolloïdes, les carraghénanes sont des constituants de la paroi cellulaire de diverses algues rouges ou Rhodophycées récoltées mais surtout cultivées, appartenant aux ordres des Gigartinales (Chondrus crispus, Gigartina mamillosa, G. stellata et Iridaea cordata) et des Cryptoméniales. Leur présence, à la fois qualitative et quantitative, dans le thalle, est fonction de la saison, de l’espèce, du lieu de récolte et de l’âge des plantes.

7.4.1. STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Les carraghénanes sont, comme les agars, des polymères linéaires du D-galactopyranose mais, par rapport à ces derniers, ils sont très riches en groupements sulfates OSO3– (20 à 25 %) partiellement salifiés qui leur confèrent une charge négative et un comportement de colloïde hydrophile anionique en solution. Leur poids moléculaire peut être supérieur à 106. La structure de tous les carraghénates est de type (AB)n où les liaisons sont alternées

7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES

189

en α-(1J 3) et β-(1J 4) où A et B sont des résidus galactopyranosyles, liés en α-(1J 3) et β-(1J 4), respectivement (fig. 7.4): OH OH O

β1J 4

α1J 3

1

O

O

OH O O

1

4

B

OH

HO A

OH

—3A1β—4B1α—3A1β—4B1α—3A1β—

Figure 7.4 - Structure générale des carraghénates Les unités A et B sont toujours sulfatées : en C-2 ou en C-4 pour l’unité A, en C-2 et/ou en C-6 pour l’unité B. Il existe, ainsi, plusieurs types de carraghénanes, désignés par des lettres grecques, en fonction du dimère (ou carrabiose) qui les constitue (fig. 7.5). La capacité à former des gels et les propriétés des gels obtenus dépendent de la structure du carraghénane. Ainsi, le kappa-carraghénane dont le dimère est constitué d’un β-D-galactopyranose 4-sulfate et d’un 3,6-anhydro-α-D-galactopyranose donne un gel dur et cassant. Le iota-carraghénane dont le dimère est voisin du précédent mais avec un radical supplémentaire OSO3– sur le deuxième carbone du 3,6-anhydro-α-D-galactopyranose. Du fait de la teneur plus élevée en groupements hydrophiles, il donne un gel plus souple que le précédent. Kappa- et iota-carraghénanes sont qualifiés de « gélifiants ». Le lambda-carraghénane encore plus riche en groupements hydrophiles dont le dimère est formé du β-D-galactopyranose 2-sulfate et du α-D-galactopyranose 2,6-disulfate. L’absence de ponts hydrophobes et la configuration spatiale de la molécule (pas de formation d’hélice) font que ce polymère ne forme jamais de gel dans l’eau mais élève sa viscosité et est donc utilisé comme épaississant. Chez les kappa- et iota-carraghénanes la gélification est dépendante de la présence dans la solution de cations (Li+, Ca2+
,+ ou Ba2+) qui permettent la formation de ponts entre les chaînes de polymères formant une structure de type « boîte à œufs » comme chez les alginates (voir fig. 7.2). Les gels de carraghénanes sont thermoréversibles (point de fusion entre 35°C et 55 °C). Grâce aux groupements OSO3–, ils se comportent comme des polyanions et réagissent facilement avec les protéines porteuses de charges positives (lorsque le pH est inférieur à leurs pHi), et augmentent par conséquent la viscosité des solutions protéiques.

190

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES résidu B – O SO 3

résidu A

CH2OH O

O

O

O O

OH

OH

κ-carraghénane – O SO 3

n

CH2OH O

O

O

O O

OH

OSO3–

ι-carraghénane HO

– O SO 3

CH2OH O

O

H 2C

O

O –O

3SO

carbone

O

HO λ-carraghénane

résidu

B 2

A 4

2

+

SO3–

n

dénomination 6

+

+

n

kappa (κ) + +

iota (ι) +

lambda (λ)

Figure 7.5 - Structure des principaux carraghénanes industriels et position des groupements sulfates

7.4.2. EXTRACTION Après broyage, les thalles sont placés dans une solution légèrement alcaline
/B0)

.
à 65 °C, les carraghénanes sont dissous sous forme de sel de sodium puis, après filtration, précipités dans des alcools (éthanol, méthanol ou iso-propanol). Le produit fibreux obtenu est transformé en poudre par broyage ou en granulés, contenant environ 60 % de carraghénanes, de couleur crème à légèrement brune. Pour conclure, le tableau 7.1 présente les principales différences et les principaux points communs entre les principaux polysaccharides extraits des algues et utilisés par l’homme.

7 - LES POLYSACCHARIDES DES PAROIS DES ALGUES

191

Tableau 7.1 - Caractéristiques des principaux phycocolloïdes (origine, extraction, gélification, nature chimique, utilisation, production) Phycocolloïdes Caractéristiques

Sources

Alignates Alginophytes, Pheophycées : essentiellement des Laminaires

polysaccharides linéaires composés Nature chimique soit d’acide guluronnique (G), soit d’acide NBOOVSPOJRVF
.




Carraghénanes

Agars

Carraghénophytes, Rhodophycées : Gigartinales, Cryptoméniales

Agarophytes, Rhodophycées : Gélidiales, Gigartinales, Céramiales

polymères du galactose (liés en 1-3 ou 1-4) très sulfatés, différents types : kappa, iota, béta, lambda…

polysaccharides dont le maillon de base est un disaccharide l’agarose : β-D-galactopyranose et 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose

dissolution à chaud, en présence de NaOH, sous forme de sel de sodium précipité ensuite dans l’alcool isopropylique

dissolution dans l’eau bouillante puis congélation et décongélation successives

Extraction

dissolution en présence de Na2CO3 puis précipitation avec de l’H2SO4

Gélification

non-thermodépendante, solution visqueuse en thermodépendante présence de cations moavec intervention novalents et formation de cations de gel dur en présence 2+ de cations divalents (Ca )

thermoréversible, phénomène d’hystérésis : températures différentes de liquéfaction 85 °C et de gélification 30 à 45 °C

Utilisation

t

JOEVTUSJF
UFYUJMF

ÏQBJT- t

BHSPBMJNFOUBJSF

agents gélifiants, sissant des colorants t

BHSPBMJNFOUBJSF
FU
QIBS- épaississants et stabimacie : gélifiant, épaissis- lisants (desserts, flans, sant, stabilisant (desserts produits carnés…) t

DPTNÏUPMPHJF

et produits laitiers) rétenteur d’eau, t

QBQFUFSJF

BQQSÐU
viscosifiant de surface

t

MBCPSBUPJSF

NJMJFV
EF
culture, électrophorèse t

QIBSNBDJF

FYDJQJFOU
et stabilisateur t

BHSPBMJNFOUBJSF

EFTserts lactés, confiserie t

JOEVTUSJF

TBWPO
DPMMFT
peintures

Production mondiale

30 000 t/an

30 000 t/an

10 000 t/an

Code

E401 à E405

E407

E406

IMPORTANCE ÉCONOMIQUE ET UTILISATION La production mondiale est d’environ 50 000 t et tend à augmenter au fur et à mesure que se développe la culture des carraghénophytes en Asie du Sud-Est et la diversification des applications de ces produits : hEn agro-alimentaire : les kappa-, iota- et lambda-carraghénanes natifs (non-hydrolysés) sont très utilisés à faible dose comme gélifiant, épaississant et stabilisant (interactions avec les protéines) dans l’industrie laitière et la production de dérivés du lait (laits gélifiés, laits aromatisés,

192

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

laits chocolatés, crèmes, glaces, flans, yaourts…) car ils forment avec ce dernier un gel onctueux extrêmement agréable aux papilles humaines, faisant intervenir la caséine et les ions calcium. On les trouve également dans les sauces, plats cuisinés, produits de la pâtisserie et produits carnés (viandes hachées). hNon-assimilables, ces produits sont également employés dans les produits diététiques. Les carraghénanes dégradés, obtenus par hydrolyse acide des produits natifs et dont le poids moléculaire est estimé entre 10 000 et 30 000, n’ont que des emplois en thérapeutique comme protecteurs de la muqueuse gastrique en cas d’ulcère. Ils sont aussi doués de propriétés anticoagulantes, hypocholestérolémiantes et antitumorales. Leurs propriétés gélifiantes sont également mises à profit pour la formulation de pâtes, de crèmes, d’émulsions… Ils sont aussi utilisés pour leurs propriétés laxative, émolliente et pectorale. Ils sont employés contre la constipation, la diarrhée, l’entérite, la dyspepsie, la pneumonie. L’hydrolyse des carraghénanes de type iota génère des oligosaccharides de galactanes sulfatés possédant 2 à 10 unités saccharidiques et présentant un taux de sulfatation moyen d’au moins 0,7 sulfate par unité. Ces unités sont identifiées comme étant actives vis-à-vis de l’élasticité et de la cicatrisation de la peau. hEn cosmétologie dans les gels désodorisants, crèmes de beauté, mais aussi dans la confection des croquettes pour l’alimentation animale et comme épaississant dans les dentifrices et les peintures en remplacement des alginates.

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES 8.1. GÉNÉRALITÉS Le terme générique « microalgues » est utilisé pour désigner des micro-organismes photosynthétiques, unicellulaires ou pluricellulaires, vivant dans les milieux aquatiques, marins, en eaux douces ou saumâtres (Diatomées, Chlorophycées…) mais aussi parfois en milieu aérien. Aussi les Cyanobactéries comme les Spirulines, beaucoup plus proches des bactéries par leur structure (Procaryotes) et leur organisation cellulaire sont parfois rattachées aux microalgues1. De nombreuses espèces de microalgues présentent une plasticité physiologique leur permettant de passer d’une croissance photoautotrophe (en utilisant la lumière qui fournit l’énergie pour convertir le CO2 en molécules carbonées) à une croissance hétérotrophe (sans lumière) utilisant le glucose ou d’autres substrats pour leurs métabolismes carboné et énergétique. Certaines espèces peuvent également se développer par mixotrophie en combinant les deux modes. Les microalgues, dont il existe environ 30 000 espèces connues, sont considérées depuis plusieurs décennies comme une source potentielle de produits à haute valeur ajoutée. Du fait de leur taux de croissance important, les microalgues donnent lieu à des pratiques culturales qui ont atteint, pour certaines espèces (Dunaliella spp.…), le stade de l’exploitation à grande échelle en vue d’utilisations alimentaires ou industrielles. Ainsi, une cinquantaine d’espèces de microalgues font actuellement l’objet de cultures intensives. En dehors de la production de biomasse protéique (traitée dans le chapitre 13, Protéines d’organismes unicellulaires) et de leur utilisation comme microalgues-fourrage en conchyliculture à la fois au niveau larvaire (écloserie-nurserie) mais aussi lors du pré-grossissement intensif des coquillages, elles sont de plus en plus cultivées afin de produire des molécules d’intérêts. Parmi celles-ci les lipides et les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont déjà exploités pour des applications alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. Elles sont également reconnues comme une source prometteuse pour la production de diverses substances à usages thérapeutiques. C’est le cas des deux espèces Dunaliella primolecta et Scytonema sp., qui produisent des composés à activité antibiotique. 1

pour des compléments d’information, voir Principales caractéristiques des grands groupes taxonomiques de microalgues et de Cyanobactéries sur le site web dédié.

194

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Diverses microalgues sont utilisées dans l’industrie pharmaceutique, soit pour leur richesse en oligo-éléments, soit pour les produits anthelminthiques et anticoagulants qu’elles renferment. Certaines pourraient être utilisées comme compléments alimentaires riches en vitamines (provitamine A, vitamine B12 et vitamine C) ; on en a également extrait industriellement du mannitol et de l’acide glutamique. Certains dispositifs de culture de microalgues à grande échelle (comme les bassins de type « race-way », photobioréacteurs…) sont performants, et permettent actuellement la production de pigments ou de glycérol. La maîtrise des cultures de microalgues est donc perçue comme un atout majeur dans la production prochaine de métabolites à haute valeur ajoutée commercialisables.

8.2. PIGMENTS ET COLORANTS En dehors de la chlorophylle (principal pigment photosynthétique), les microalgues contiennent une palette de pigments complémentaires associés au captage du rayonnement solaire. Les plus pertinents sont les caroténoïdes (qui protègent les algues contre la lumière incidente excessive et les effets connexes en stabilisent les photosystèmes) et les phycobiliprotéines (qui améliorent le rendement d’utilisation de l’énergie lumineuse) (tab. 8.1). Tableau 8.1- Principaux pigments de microalgues et Cyanobactéries Pigment

Source

Caroténoïdes β-carotène

Dunaliella salina, D. bardawil, Synechococcus spp., Nannochloropsis gaditan, Arthrospira spp. (Spiruline)

Astaxanthine

Haematococcus pluvialis, Chlorella vulgaris

Lutéine

Chlorella pyrenoidosa, Haematococcus pluvialis, et mutants de Dunaliella

Autres pigments Phycocyanine

Spiruline

Phycoérythrine

Porphyridium cruentum et autres microalgues rouges

Plus de 600 types de caroténoïdes ont été découverts à partir de sources naturelles et, fait intéressant, bon nombre d’entre eux exercent des effets bénéfiques potentiels sur la santé humaine au-delà de leur fonction bien connue comme précurseurs de molécules essentielles en nutrition humaine et animale. Ils sont divisés en deux classes : les xanthophylles (qui contiennent de l’oxygène) et les caroténoïdes (qui sont purement des hydrocarbures). Toutes les xanthophylles synthétisées par les plantes supérieures (ex. violaxanthine, anthéraxanthine, zéaxanthine, néoxanthine et lutéine) sont aussi synthétisées par les microalgues photosynthétiques ; cependant, ces dernières possèdent des xanthophylles supplémentaires, comme la loroxanthine, l’astaxanthine et la canthaxanthine, la diatoxanthine, la diadinoxanthine… Les caroténoïdes des algues sont présents dans les chloroplastes en mélange complexe caractéristique de chaque classe d’algues. Ainsi, les

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

195

Rhodophycées, algues rouges, sont pourvues de α- et de β-carotènes et de leurs dérivés hydroxylés. Les Chlorophycées se caractérisent par des caroténoïdes acétyléniques : alloxanthine, monadoxanthine et crocoxanthine. Bien que les caroténoïdes de synthèse soient beaucoup moins chers que leurs homologues naturels, les microalgues ont l’avantage de fournir des isomères naturels des caroténoïdes. Il est accepté aujourd’hui que l’isomère cis naturel du β-carotène (fig. 8.1) est biologiquement supérieur à la forme synthétique trans puisqu’il est mieux assimilé par l’organisme humain. La microalgue verte halophile Dunaliella salina est l’organisme le plus utilisé pour la production en grande quantité de β-carotène puisqu’elle peut en contenir jusqu’à 14 % de son poids de matière sèche, soit 100 fois plus que la teneur de la carotte. Elle est facilement cultivée de façon monospécifique dans des bassins ouverts car les conditions extrêmes de son développement (hypersalinité, faibles besoins en azote et hauts niveaux d’éclairement) limitent les contaminations, mais aussi en culture intensive en conditions contrôlées dans des photobioréacteurs. Une des méthodes utilisées pour induire l’accumulation massive de caroténoïdes par les microalgues en culture est la réduction du taux de croissance par carence de nutriments (azote, phosphore, soufre, principalement) ainsi que par un niveau d’éclairement élevé. Plus l’éclairement est puissant, plus forte est l’accumulation de β-carotène. L’intensité de l’éclairement affecte aussi les isomères du β-carotène ; un niveau faible favorise la synthèse de l’isomère cis-9, tandis qu’un niveau élevé favorise le β-carotène trans. La qualité de la lumière affecte également la teneur en β-carotène, qui est renforcée sous un éclairage en lumière bleue et en présence de radiations UV.

APPLICATIONS Le β-carotène est utilisé comme colorant jaune naturel d’aliments (margarine et beurre allégé, fromage, jus de fruits, produits laitiers, conserves…), comme provitamine A, en tant qu’additif aux produits cosmétiques produits de soins corporels et comme nutraceutique. Avec la demande très forte de molécules d’origine naturelle qui possèdent une image favorable auprès des consommateurs, et les prévisions de suppression de certains colorants de synthèse, le marché des caroténoïdes issus des microalgues offre des perspectives commerciales importantes. Les phycobiliprotéines sont des pigments photosynthétiques accessoires, regroupées dans la cellule sous forme de phycobilisomes, complexes antennaire fixés à la surface de la membrane des thylakoïdes des chloroplastes. La phycoérythrine, rouge, et la phycocyanine, bleue, sont solubles dans l’eau et peuvent servir de colorants naturels dans les aliments (produits laitiers, desserts à la gélatine…), les cosmétiques et les produits pharmaceutiques. Leur structure chimique est proche de celle des pigments biliaires. Ils sont constituées d’un chromophore, la phycocyanobiline qui est une chaîne tétrapyrrolique analogue à celle de la chlorophylle mais non-cyclisée et sans magnésium, liée de façon covalente par des liaisons thio-éther à une apoprotéine.

196

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Les principales espèces utilisées pour la production commerciale de phycobiliprotéines (phycoérythrine et phycocyanine) sont essentiellement les Spirulines (Spirulina maxima et Arthrospira platensis) cultivées dans des systèmes ouverts (« race-way ») et des Rhodophytes du genre Porphyridium cultivés cette fois dans des systèmes fermés (photobioréacteurs). L’extraction des phycobiliprotéines est effectuée par cassure cellulaire suivie d’une extraction par l’eau ou par une solution tampon et centrifugation. Le filtrat est ensuite partiellement purifié et stérilisé par microfiltration puis vaporisé à sec ou lyophilisé.

β-carotène

O OH

HO

astaxanthine O NH

CH

CO CH2 HOOC

COOH

S H

H

O O NH NH NH N phycocyanine attachée par une liaison thioéther à l’apoprotéine

Figure 8.1 - Structures chimiques de quelques pigments extraits des microalgues ou des Cyanobactéries La phycocyanine (fig. 8.1) est le principal pigment de la Spiruline puisqu’elle représente jusqu’à 10 à 15 % de son poids de matière sèche. Sa structure chimique est proche de celle des pigments biliaires. Elle est constituée d’une partie protéique reliée à un chromophore : molécule de phycocyanobiline constitué d’un groupement tétrapyrrolique analogue à celui de la chlorophylle mais non-cyclisé et sans magnésium central.

APPLICATIONS Ces dernières années, d’importants travaux de recherche ont mis en évidence les nombreuses et très diverses activités biologiques de la phycocyanine comme agent antioxydant et antiradicalaire, mais aussi antiinflammatoire et antitumorale, jouant un rôle dans la protection cellulaire contre les radiations, l’amélioration du système immunitaire, la stimulation de l’hématopoïèse, l’hépatoprotection et la détoxification. Elle est ainsi commercialisée (Spirulysat produite par Alpha Boitech) sous forme d’extrait liquide obtenu à partir de Spirulines fraîches. Toutefois, la première et la plus importante des applications de la phycocyanine est son utilisation comme colorant bleu alimentaire, en

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

197

remplacement des pigments synthétiques. Dainippon Ink & Chemicals (Sakura, Japon) a ainsi développé un produit commercialisé sous le nom de « Lina blue » qui est utilisé dans les chewing-gums, glaces, bombons, boissons sans alcool et produits laitiers. Les phycobiliprotéines sont aussi largement utilisées en industrie et en immunologie. Les propriétés colorantes et fluorescentes de la phycoérythrine (rouge) et de la phycocyanine (bleue) sont exploitées comme marqueurs pour le diagnostic en recherche médicale et en immunologie. En effet, leurs propriétés (forte absorption de la lumière, forte fluorescence, haute photostabilité) en font des réactifs fluorescents très puissants et très sensibles. L’astaxanthine (fig. 8.1) et la canthaxanthine sont des pigments rouges de la famille des caroténoïdes, communs à plusieurs organismes photosynthétiques aquatiques (microalgues, et macroalgues), mais aussi présents dans la carapace de l’écrevisse (l’astaxanthine doit son nom à l’écrevisse Astacus astacus), des crevettes, du homard et dans la chair des poissons comme le saumon et la truite. Les crustacés, incapables de synthétiser les caroténoïdes, doivent trouver l’astaxanthine (ou d’autres précurseurs) dans leur régime alimentaire pour acquérir la couleur adéquate appréciée par le consommateur. Une solution est la supplémentation du régime alimentaire des crustacées à l’aide de l’astaxanthine ou de ses précurseurs. Plusieurs sources naturelles de canthaxanthine et d’astaxanthine, comme la microalgue Dunaliella salina et la Cyanobactérie Spirulina maxima, ou synthétiques ont été utilisées dans ce but. D’autres sources naturelles d’astaxanthine sont exploitées en aquaculture, ainsi l’algue verte unicellulaire d’eau douce Haematococcus pluvialis est capable d’accumuler dans certaines conditions (stress lumineux et/ou nutritionnel) jusqu’à 40 g de ce pigment par kg de biomasse sèche. L’accumulation de l’astaxanthine peut être stimulée par tout facteur susceptible d’inhiber la division cellulaire. Chez H. pluvialis, elle est aussi favorisée lorsque les cellules sont exposées à une carence en éléments nutritifs, comme l’azote, le phosphore ou le soufre, ou à un stress salin ou thermique ou à un éclairement intense. Sous privation nutritive, H. pluvialis peut accumuler l’astaxanthine jusqu’à 4 % de son poids sec. Le niveau d’éclairement et la qualité de la lumière affectent également la synthèse de l’astaxanthine, bien que H. pluvialis puisse synthétiser l’astaxanthine à l’obscurité en culture hétérotrophe, utilisant des molécules organiques comme source de carbone et d’énergie. En augmentant le niveau d’éclairement, la formation de l’astaxanthine peut être multipliée par trois. La production de l’astaxanthine est stimulée plus efficacement sous lumière bleue à faible éclairement que sous lumière rouge, tandis que sous niveau d’éclairement élevé, les différentes longueurs d’onde lumineuses n’affectent pas la caroténogenèse. Pour la production commerciale de l’astaxanthine par H. pluvialis, une combinaison de plusieurs facteurs de stress est souvent utilisée pour améliorer l’accumulation du pigment. H.  pluvialis peut aussi croître en mode hétérotrophe. Elle est actuellement cultivée par plusieurs compagnies de biotechnologie en systèmes ouverts (type « race-way », $ZBOPUFDI
$PSQPSBUJPO
.FSB
1IBSNBDFVUJDBMTy
PV
FO
QIPUPCJPSÏBDUFVST
"MHBUFDIy 2. 2

pour des compléments d’information, voir La biotechnologie des microalgues et son développement sur le site web dédié

198

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

APPLICATIONS Une grande partie de l’astaxanthine produite est principalement consommée lors de la production aquacole du saumon d’élevage. C’est aussi un produit à haute valeur avec des applications dans les produits pharmaceutiques, nutraceutiques et l’alimentation animale (colorant apporté dans la ration alimentaire lors de l’élevage industriel des poulets et des poules pondeuses). C’est aussi un puissant antioxydant, aux effets reconnus sur les radicaux libres, avec notamment, un effet protecteur contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets. L’astaxanthine de Haematococcus est approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) américaine et par plusieurs pays européens en vue de sa commercialisation comme complément alimentaire pour la consommation humaine 3. Elle présente certains avantages sur les autres caroténoïdes : hune plus grande stabilité, hun potentiel antioxydant plus élevé (10 fois plus que le β-carotène et 500 fois plus que l’α-tocophérol), hune plus grande facilité à traverser la barrière hémato-encéphalique, hune haute capacité tinctoriale. La lutéine, pigment caroténoïde qui se rencontre en forte proportion chez certaines microalgues, suscite un intérêt accru en pharmacologie en raison de son rôle potentiel dans la prévention de l’apparition de la cataracte et de dégénérescence maculaire liée à l’âge ainsi que pour soigner l’artériosclérose. Les caroténoïdes issus des microalgues sont aussi abondamment utilisés comme compléments alimentaires, en tant que précurseurs de la vitamine A, avec un marché global estimé à 766 millions de dollars en 2007 dont 247 millions pour le seul β-carotène. La lutéine, la zéaxanthine et la canthaxanthine servent, elles aussi, à des fins pharmaceutiques, ou à la coloration de la peau des poulets. Pour le seul couple astaxanthine-canthaxanthine, le marché international a atteint en 2007, le montant remarquable de 330 millions de dollars, dû aux investissements croissants dans la pisciculture (pour renforcer la couleur rouge naturelle de la chair de certains poissons comme le saumon) et l’élevage des volailles (coloration du jaune d’œuf). L’astaxanthine de synthèse est également très utilisée dans ce domaine.

8.3. ACIDES GRAS POLYINSATURÉS Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont reconnus pour leurs effets protecteurs vis-àvis des maladies cardio-vasculaires, de l’obésité et de l’intégrité des tissus dans lesquels ils sont intégrés. Les AGPI (fig. 8.2) ne sont pas synthétisés par le corps humain et doivent donc être apportés dans l’alimentation. Leur consommation en quantité suffisante est très bénéfique pour la santé. Parmi les diverses sources d’AGPI, les poissons marins dits « gras », comme le hareng, le flétan, le maquereau, la sardine et le saumon, sont considérés comme les principales sources d’acides gras ω-3, en particulier l’acide éicosapentaénoïque (EPA, C20 : 5 ω-3) et l’acide docosahexaénoïque (DHA, C22 : 6 ω-3). 3

pour des compléments d’information, voir Les compléments alimentaires sur le site web dédié

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

199

Cependant, la demande croissante des acides gras ω-3 d’origine marine, en particulier du DHA, est devenue une menace pour ces espèces de poissons à cause de la pêche intensive ; il y a donc un besoin urgent de trouver des sources alternatives durables d’AGPI de haute qualité. Par ailleurs, les acides gras ω-3 issus des produits de la mer posent aussi quelques problèmes de qualité tels que la contamination par les métaux lourds et leurs odeur et goût désagréables, difficilement compatibles avec certains usages. A tout cela s’ajoutent d’autres difficultés comme le coût élevé d’extraction des acides gras à partir des chairs de poissons, l’irrégularité de la production fonction des saisons, la présence de fortes concentrations en cholestérol. Dans la recherche de nouvelles sources d’AGPI, les microalgues marines présentent un intérêt croissant car elles sont les producteurs primaires d’AGPI dans le milieu marin. Les poissons ne produisent pas les AGPI mais les accumulent en consommant des microalgues constituant le phytoplancton (ou d’autres organismes consommateurs d’algues, Rotifères, Artemia…). Un des autres avantages des microalgues est que leur composition en AG est souvent plus simple que celle des huiles de poisson, ce qui réduit les étapes de concentration des AG recherchés. En outre, les conditions de culture des microalgues influent considérablement sur la nature des lipides; il est donc possible d’orienter la production vers une composition particulière. Les huiles issues de microalgues présentent les mêmes avantages et les mêmes effets que celles de poisson avec la présence d’AGPI de la série ω-3 mais aussi de la série ω-6. L’autre avantage est qu’elles sont moins odorantes et dépourvues de cholestérol. De plus, la culture des microalgues permet de s’affranchir des problèmes d’approvisionnement que peuvent connaître les produits issus de la pêche tout en n’utilisant que des substrats peu coûteux ; seulement quelques espèces ont montré leur aptitude à une production industrielle, principalement dû au fait que la majorité de ces microalgues présente des taux de croissance faibles et des densités cellulaires trop basses sous les conditions photoautotrophiques conventionnelles. Ainsi, les espèces de microalgues comme Crypthecodinium cohnii, Nannochloropsis spp., Porphyridium cruentum, Phaeodactylum tricornutum, Odontella aurita et Chaetoceros calcitrans sont retenues comme les meilleures candidates pour la production de l’EPA, tandis que Isochrysis galbana et Crypthecodinium spp. sont plus appropriées pour l’extraction de DHA. Cependant, plusieurs espèces d’algues qui ont la capacité de produire une quantité élevée d’AGPI sont des photoautotrophes obligatoires et, dans bien des cas, l’utilisation de photobioréacteurs technologiquement avancés pour la culture de ces espèces rend plus difficile leur production commerciale. À cet égard, les espèces d’algues mixotrophes présentent un avantage supplémentaire puisqu’elles peuvent pousser dans des fermenteurs classiques pour fournir une biomasse élevée en l’absence de lumière avec un ou plusieurs substrats organiques comme seules sources de carbone et d’énergie. Ce mode de culture permet de s’affranchir de la contrainte de la lumière et, par conséquent, offre la possibilité d’augmenter considérablement la productivité et la densité cellulaire et d’être économiquement plus rentable à condition de faire abstraction de l’apport de nutriments organiques (le plus souvent des sucres) qu’il faut produire ailleurs. Si, par rapport à la croissance photoautotrophique, la productivité dans un même volume est meilleure, utiliser des sucres produits par l’agriculture traditionnelle pour faire pousser des microalgues qui pourraient les produire ellesmêmes est, d’un point de vue énergétique et écologique, totalement catastrophique.

200

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Certaines microalgues peuvent accumuler plus de 50 % de leur poids sec en lipides. Ces derniers sont principalement constitués de triglycérides, de phospholipides et de glycolipides. Ces lipides contiennent des AGPI comme les ω-3 : EPA, DHA, ou les ω-6 : ETA (fig. 8.2). Par exemple, la microalgue Odontella aurita est une source importante d’acides gras insaturés à longue chaîne : de 1,6 à 3,4 % d’acide gras EPA rapporté au poids sec. Par ailleurs, l’huile extraite de la microalgue Schizochytrium sp., autorisée en tant que nouvel ingrédient alimentaire, contient de 35 à 45 % de DHA. Par comparaison, les huiles traditionnelles les plus riches en ω-3 (huile de noix, huile de colza…) contiennent environ 10 % d’acide α-linolénique, précurseur de la famille des ω-3. L’utilisation de cette huile de microalgue peut donc être intéressante pour la supplémentation des aliments en DHA. C’est pourquoi les microalgues et les Cyanobactéries cultivées dans des bioréacteurs ou en système ouvert, sont utilisées pour produire après extraction les acides DHA et EPA. O 6

1 ω

HO acide eicosatétraénoïque (ETA = acide arachidonique) O 6

3

1 ω

HO acide eicosapentaénoïque (EPA) O 3

HO

1 ω

acide docosahexaénoïque (DHA)

Figure 8.2 - Structure chimique des principaux acides gras polyinsaturés de la famille ω-3 (EPA et DHA) et de la famille ω-6 (ETA), rencontrés chez les microalgues et les Cyanobactéries ω désigne le groupe méthyle.

Le DHA est un constituant structurel majeur du cerveau humain (15-20 % du cortex cérébral) et de la rétine (30-60 %) ainsi que du tissu cardiaque d’où son importance pour la santé cardio-vasculaire chez les adultes et le développement du cerveau et des yeux chez les nourrissons. L’EPA joue un rôle important chez l’homme en étant le précurseur d’un groupe d’eicosanoïdes, messagers intercellulaires semblables aux hormones comme les prostaglandines (dont certaines régulent différents systèmes cellulaires et échanges membranaires), des thromboxanes et des leucotriènes, qui sont cruciales dans la régulation du développement et le contrôle physiologique. Le rôle du DHA et de l’EPA dans la physiologie se manifeste dans le contrôle de la lipidémie (diminution des triglycérides et augmentation des HDL) et dans leurs effets antiinflammatoires et préventifs contre le cancer (voir chap. 3, sections 3.3.1.4. Acides gras essentiels, 3.6. Importance nutritionnelle et métabolique des lipides et 3.7. Importance médicale des lipides).

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

201

APPLICATIONS La Commission des Communautés Européennes, dans sa décision (2003/427/CE) autorise la commercialisation d’une l’huile à teneur élevée en DHA produite à partir de la microalgue Schizochytrium sp. pour les utilisations suivantes : produits laitiers (à l’exception des boissons à base de lait), matières grasses tartinables, sauces et assaisonnements, Céréales de petit déjeuner, compléments alimentaires, aliments diététiques destinés à des usages médicaux particuliers et denrées alimentaires utilisées dans les régimes hypocaloriques destinés à la perte de poids. Plus récemment, une huile dénommée DHAid™, issue de la microalgue Ulkenia sp. SAM179 cultivée en mode hétérotrophique, a été approuvée pour utilisation comme ingrédient alimentaire conformément à la réglementation alimentaire de l’UE, des Etats-Unis, de la Chine, de l’Australie et de la Nouvelle-Zélande. Des gélules contenant une Diatomée lyophilisée (Odontella aurita) riche en ω-3 produite par la société INNOVALG sont actuellement commercialisées, par ALGOSUD (France) et par d’autres sociétés, comme complément alimentaire en remplacement des huiles de poisson. L’acide γ-linolénique (C18 : 3 ω-6) trouve des applications dans les produits thérapeutiques et cosmétiques destinés à revitaliser la peau et, par conséquent, retarder le vieillissement. L’acide linoléique (C18 : 2 ω-6) est utilisé pour le traitement des hyperplasies de la peau, en application locale. Sur le marché, on trouve aussi, entre autres produits, des œufs de poulet enrichis en DHA et du lait de vache enrichi en acides gras ω-3 ayant pour origine différentes espèces de microalgues administrées aux animaux. Bien que faiblement synthétisé, le DHA est présent dans le lait maternel; par conséquent, les nouveaux-nés allaités artificiellement reçoivent un lait enrichi en DHA.

8.4. STÉROLS Les stérols sont des composants chimiques présents en quantité importante chez les microalgues et un composant essentiel du régime alimentaire de nombreux animaux marins élevés en aquaculture. La capacité des bivalves à synthétiser de novo ou de bioconvertir des stérols varie selon les espèces, mais reste généralement faible et quelquefois complètement absente. Cela implique qu’un apport en stérols est nécessaire pour la croissance des bivalves. Dans la plupart des écloseries, les larves de mollusques sont nourries avec plusieurs espèces de microalgues sélectionnées pour leur aptitude à stimuler la croissance larvaire et pour leur facilité de culture. Par conséquent, la variabilité qualitative et quantitative de la composition en stérols des microalgues-fourrage utilisées dans les écloseries a des implications directes sur la composition en phytostérols et en cholestérol des larves de bivalves et peut affecter ou stimuler leur croissance. Les phytostérols sont un groupe de composés en C28 ou en C29 dans lesquels un groupe méthyle ou éthyle est ajouté, respectivement, au carbone C-24 de la chaîne latérale du cholestane en C27 (voir fig. 3.21). Les propriétés biochimiques de phytostérol sont propres aux espèces, d’où leur utilisation comme biomarqueurs chimio-taxonomiques pour caractériser les différents taxa d’algues et comme critères de sélection de ces espèces pour l’alimentation de bivalves qui ont besoin d’une source extérieure de stérols. Des études

202

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

ont montré que les stérols ajoutés au milieu d’élevage influencent beaucoup plus la croissance des huîtres à l’état juvénile (35 %) que l’apport d’acides gras indispensables (28 %). Chaetoceros et Skeletonema, deux genres de Diatomées, peuvent accumuler, respectivement, jusqu’à 27,7 et 2,0 μg de stérols/g de poids sec. D’autres microalgues, comme Thalassiosira et Pavlova présentent également des teneurs élevées en stérols. Outre le cholestérol, P. lutheri contient d’autres stérols rares, comme le brassicastérol, le campestérol, le stigmastérol et le sitostérol. Les stérols de microalgues marines présentent l’avantage d’être hypocholestérolémiant, propriété démontrée pour tous les phytostérols.

8.5. PRODUCTION DE BIOCARBURANTS Le marché actuel de l’énergie est régi par des biocarburants dit de première génération résultants de la culture de tournesol, de colza, de soja, de palme ou de maïs (biodiesel) et de canne à sucre (bioéthanol). Dans le but de subvenir à leurs besoins et de réduire l’impact sur la hausse des prix des Céréales et des oléagineux ainsi que la concurrence avec les cultures vivrières et, par suite, la menace sur la biodiversité, de nombreux pays se sont tournés vers le développement de biocarburants de seconde et troisième génération. La seconde génération se base sur l’utilisation de la biomasse lignocellulosique non-utilisée pour l’agro-alimentation (feuilles, écorces, paille ou cultures dédiées comme Jatropha). La réelle avancée vient surtout de la troisième génération de biocarburant à base de microalgues, considérées comme la source de biomasse capable d’offrir les meilleurs rendements en condition autotrophe, étant donné leur contenu important en lipides qui peut atteindre 80 % en masse sèche dans des conditions de stress physiologique. Alors que leur processus de photosynthèse est semblable à celui des plantes terrestres, les microalgues convertissent généralement l’énergie solaire plus efficacement du fait de leur structure cellulaire simple. Comme les cellules croissent en milieu aqueux, elles ont un accès direct à l’eau et aux éléments indispensables à leur croissance (CO2, sels minéraux, nutriments). De plus, le rapport surface/volume important des microalgues facilite l’assimilation des nutriments. Leur culture ne requiert pas de terres arables qui pourront ainsi être épargnées pour l’agriculture ou l’élevage ; elle peut se faire en zone marginale (désert, terres arides ou semi-arides) et nécessite une faible surface comparativement aux plantes terrestres. Pour toutes ces raisons, les microalgues sont capables, sur l’année et pour une même surface utile, de produire beaucoup plus d’huile que les cultures oléagineuses terrestres (ex. tournesol ou colza). Leur multiplication rapide permet d’effectuer une récolte en continu, ce qui n’est pas le cas des cultures terrestres conventionnelles. Leur culture automatisée dans des bassins ou des bioréacteurs est, pour beaucoup d’espèces, bien maîtrisée.

8.5.1. AVANTAGES DE LA CULTURE DES MICROALGUES La culture des microalgues revêt des avantages très attractifs qui en ont fait un véritable « or vert » :

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

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X ce sont des micro-organismes photosynthétiques, de petite taille ayant peu de besoins

nutritionnels, donc faciles à cultiver ; X elles peuvent utiliser le CO2 d’origine industrielle, d’où un effet dépolluant ; X ce sont des organismes extrêmement productifs : les rendements en lipides à l’hectare seraient 30 fois supérieurs aux cultures oléagineuses comme le tournesol ou le colza, leur croissance est rapide (doublement de la biomasse en une journée pour certaines espèces) et elles sont riches en huile (capables d’accumuler des lipides jusqu’à 80 % de leur masse sèche selon les espèces et les conditions de culture) ; X l’existence d’une forte biodiversité constitue un réel potentiel pour la recherche sur les biocarburants et l’industrie ; X elles n’entrent pas en concurrence avec des cultures alimentaires pour les surfaces cultivables puisque ces organismes se développent dans l’eau ; X elles ne causent pas de pollution des nappes phréatiques ; X il est parfois possible de récupérer des sous-produits à haute valeur ajoutée ; X certaines espèces de microalgues ont la capacité de croître dans des conditions extrêmes (eaux très salées, pH élevé…) ce qui permet d’éviter une contamination par d’autres micro-organismes non-adaptés à ces milieux extrêmes ; X leur culture en photobioréacteurs n’a pas d’impact sur l’environnement (pas d’utilisation de pesticides) et permet de recycler les nutriments nécessaires à leur croissance (phosphore et azote).

8.5.2. MODES DE PRODUCTION Il y a principalement deux modes nutritionnels de production développés pour générer de la biomasse microalgale : en autotrophie et en hétérotrophie. X en autotrophie : c’est le mode le plus commun, basé sur des organismes qui ont la capacité de produire de la matière organique à partir de dioxyde de carbone et d’eau par photosynthèse. Il est le plus souvent mis en œuvre dans des bassins ouverts, mais aussi de façon plus efficace en système fermé dans des photobioréacteurs. X en hétérotrophie : ce mode est propre à certains genres (ex. Chlorella, Galderia, Crypthecodinium) qui peuvent se développer en l’absence de lumière en utilisant l’énergie chimique et le carbone issus d’autres substrats organiques placés dans le milieu. La culture est effectuée en système fermé dans des bioréacteurs, identiques aux fermenteurs utilisés pour les bactéries et les levures, permettant de contrôler tous les paramètres de culture. La densité cellulaire peut atteindre 20 à 100 g/L soit 10 à 20 fois plus élevée que celle obtenue en culture autotrophe mais avec un taux de croissance inférieur. Ce mode de culture permet donc d’atteindre de forte concentration mais moins rapidement. Ce système est utilisé pour la production de molécules organiques de haute valeur ajoutée, mais ne permet pas la production de pigments. Les niveaux élevés de productivité enregistrés sont prometteurs pour la production de biocarburants. Un troisième mode nutritionnel concerne certains organismes mixotrophes capables de se développer à la fois en autotrophie et en hétérotrophie.

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PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

8.5.3. PRINCIPALES VOIES DE PRODUCTION D’ENERGIE À PARTIR DE LA BIOMASSE MICROALGALE

La production de biocarburants à l’échelle industrielle à partir des microalgues peut se faire par trois moyens : X production du méthane par gazéification (méthanisation) biologique ou thermique, X production d’éthanol par distillation de solutions de biomasses traitées par fermentation, X production de biodiesel par extraction des huiles. Pour être économiquement rentable, la production de biocarburants à partir d’algues (ou à partir de n’importe quelle biomasse) nécessite l’utilisation de la totalité de la biomasse disponible aussi efficacement que possible. Pour y parvenir, les trois options précédemment retenues pour la production d’énergie peuvent être utilisées dans un certain nombre de combinaisons. Ces trois options de production peuvent être combinées à l’alimentation animale qui utilise les sous-produits générés. Quel que soit le type d’énergie produite, une grande part des efforts est consacrée à la recherche de souches à croissance rapide afin d’obtenir une biomasse suffisante tout en ayant une productivité élevée indispensable pour répondre aux contraintes économiques et techniques.

8.5.3.1. MÉTHANISATION La méthanisation produit du biogaz, un biocarburant proche du gaz naturel fossile. Les microalgues se révèlent particulièrement adaptées à cette application. La méthanisation est effectuée en milieu liquide dans des cuves spéciales (ou digesteurs) dont le volume varie de quelques centaines à plusieurs milliers de m3, en conditions anaérobies. Cette approche permet aussi d’éviter le séchage de la biomasse (coûteux en énergie) qui sert alors de base pour composer un substrat à fermenter. En général, il est plus simple et énergétiquement plus intéressant de traiter par fermentation les matières organiques très humides. Cette digestion est constituée de différentes étapes : 1. hydrolyse de la matière en sucres solubles et acidification ; 2. acétogénèse : la fermentation par des bactéries produit des sucres qui sont convertis en alcool, acide acétique, acides gras libres volatils et gaz riche en H2 et CO2 ; 3. méthanogenèse : après fermentation par les bactéries méthanogènes, il se produit : Z un biogaz : mélange gazeux saturé en eau et composé de 70 à 80 % de méthane, les autres gaz étant du CO2 et des traces de NH3, N2 et de H2S. Le CO2 peut être recyclé pour la production des microalgues ; Z un digestat : produit liquide ou pâteux riche en matières organiques et minérales (potassium, phosphates et éléments traces) qui peut être valorisé en tant que fertilisant biologique.

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

205

Avant de pouvoir être valorisé, le biogaz produit doit subir une concentration et purification afin d’éliminer les polluants nocifs au fonctionnement des installations en aval. Le niveau de traitement dépend du type de valorisation, il sera en général moins poussé (désulfurisation, déshydratation) pour la production de chaleur et/ou d’électricité. Cette filière est actuellement la voie de valorisation énergétique des microalgues la plus simple et la plus aboutie à court terme, tant sur le plan économique que technique. Elle peut être particulièrement efficace lorsqu’elle est associée à d’autres procédés. La croissance des microalgues par photosynthèse leur permet de combiner avantageusement la production de biogaz au traitement d’effluents liquides et de fumées industrielles (par exemple, centrale thermique) par biofixation du CO2, des nitrates et des phosphates… et utilisation de la chaleur produite pour leur croissance, ce qui rend l’ensemble du processus économiquement viable.

8.5.3.2. PRODUCTION DE BIODIESEL Actuellement, le biodiesel provient de la modification chimique des huiles issues de cultures oléagineuses, extraites de graines de colza (en Europe) et de soja (aux Etats-Unis). Les microalgues sont certainement les organismes les plus prometteurs pour les hydrocarbures de « troisième génération ». Certaines espèces d’algues ont une richesse en huile pouvant atteindre jusqu’à 70 % de leur masse, voire même plus selon les souches et les conditions de culture. Ainsi, les algues représentent une source alternative de biodiesel. Botryocooccus braunii, une algue verte unicellulaire dont les fossiles ont contribué à la constitution de gisements pétroliers, suscite actuellement un intérêt considérable comme organisme pouvant être cultivé pour la production de combustible à cause de sa particularité remarquable de produire des lipides dont le taux peut atteindre 70 % de son poids sec, voire même plus dans certaines conditions, ce qui représente une augmentation du rendement à l’hectare d’un facteur 30 par rapport à celui des espèces oléagineuses terrestres. La plupart de ces lipides sont sous forme d’hydrocarbures aliphatiques à longue chaîne (fig. 8.3) en C29 à C37 (alkadiènes, botryococcènes et lycopadiènes) et sous forme d’une variété d’isoprénoïdes insaturés. Les glycérolipides sont moins abondants que les hydrocarbures et sont composés principalement d’acides gras 16 : 0 et de divers acides gras en  C18. L’autre avantage de cette microalgue est que ses hydrocarbures sont facilement extractibles puisqu’ils s’accumulent à l’extérieur de la paroi cellulaire. L’inconvénient de cette espèce est que sa croissance est très lente (temps de doublement de 72 h), mais les recherches actuelles visent à optimiser sa productivité en culture à grande échelle.

botryococcène (C30)

Figure 8.3 - Structure d’un botryococcène dont il existe de nombreux types différant par la longueur de la chaîne hydrocarbonée, allant de 30 à 37 atomes de carbone

206

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

D’autres espèces d’algues prometteuses, accumulant des lipides, appartiennent aux groupes des Diatomées (genres Amphora, Cymbella, Nitzschia…) et des Chlorophycées du genre Chlorella en particulier. Les techniques de génie moléculaire devraient permettre d’optimiser leur production de lipides ainsi que leur rendement photosynthétique. Dans les cultures en bassin ou en bioréacteurs, étant donné la vitesse de croissance des algues, le CO2 devient très vite limitant ; aussi la croissance des algues est le plus souvent régulée par ajout de CO2 ou de bicarbonate.

Facteurs affectant la culture algale et élicitation de la production de lipides Chez les microalgues en phase exponentielle de croissance, la concentration en triglycérides reste faible, ils ne s’accumulent qu’en phase plateau. Toutefois, plusieurs paramètres physiques ou biologiques peuvent affecter la croissance et la production de lipides par les microalgues. La productivité des algues dépend du mode de culture (voir précédemment : autotrophie, hétérotrophie et mixotrophie), du type de culture (systèmes ouverts ou fermés), de la stratégie de production (culture en batch, culture semi-continue ou continue), de la présence de toxiques ou d’inhibiteurs, de l’agitation, de la concentration en nutriments et de la teneur en CO2, de la température et du pH, de l’éclairement et de la fréquence des récoltes. Afin d’améliorer la production d’huile chez les microalgues, les recherches se sont concentrées sur l’élicitation de la synthèse des triglycérides, constituants des huiles et molécules recherchées pour l’obtention des biocarburants. Il a été constaté que, sous certaines conditions de carence en un élément minéral essentiel (ex. phosphore, azote, soufre, voire silicium), certaines microalgues fabriquent un surplus de lipides avant d’arrêter de se diviser. Elles continuent en effet d’accumuler du CO2 pendant un certain temps et, ne pouvant plus l’intégrer dans les protéines (par exemple par manque d’azote), elles incorporent le CO2 dans des lipides. Une fois l’élément manquant à nouveau disponible, la synthèse protéique reprend et le stock lipidique est progressivement utilisé. Ces conditions de stress pour la cellule ne peuvent pas être maintenues pendant des longues durées : en effet, elles conduisent à une baisse de la croissance, voire à un arrêt total, et après un certain temps, à une consommation des lipides par la cellule elle-même, ce qui réduit fortement les rendements. Le contrôle de l’ensemble des paramètres physico-chimiques s’avère donc nécessaire pour accroître la productivité des microalgues. Un contrôle judicieux est, à son tour, tributaire d’une bonne compréhension des mécanismes physiologiques et biochimiques mis en œuvre par les microalgues dans les différentes situations. L’objectif est donc d’arriver à faire constituer à la microalgue des stocks de lipides aussi importants que possible en trouvant un compromis entre l’apport en éléments bénéfiques à la croissance de l’algue, et la carence nécessaire à la production d’huile. En plus de son effet sur la production globale des lipides, la carence trophique semble avoir d’autres effets sur les voies biosynthétiques des lipides. En effet, la carence en certains éléments nutritifs résulte en un changement dans la nature des lipides accumulés dans les cellules algales, particulièrement, une augmentation dans le ratio de lipides neutres (triglycérides de réserve importants dans la production de biodiesel) comparé aux lipides membranaires polaires.

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

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Pour une espèce donnée, la variation de la composition cellulaire peut être très différente selon les conditions de culture sous lesquelles elle croît. Par exemple, Chlorella spp., Botryococcus braunii et Dunaliella salina qui sont toutes des Chlorophycées, Volvocales, présentent une composition biochimique typique : 30 à 50 % de protéines, 20 à 40 % de glucides et 8 à 15 % de lipides sous des conditions de l’environnement favorables. En revanche, sous des conditions défavorables, ces trois espèces peuvent accumuler jusqu’à 80 % d’acides gras, 80 % d’hydrocarbures et 40 % de glycérine, par rapport à leur poids sec, respectivement. Il est clair donc que les facteurs de l’environnement, en particulier la lumière, la température, le statut nutritif et la salinité, affectent, non seulement la photosynthèse et la productivité en biomasse, mais aussi le métabolisme et donc la composition cellulaire. L’enzyme acétyl-coenzyme A carboxylase (ACCase) joue un rôle clé, notamment chez de nombreux organismes, dans la voie de synthèse des triglycérides via la transformation de l’acétyl-coenzyme A (CoA) en malonyl-CoA (fig. 8.4). Ainsi une carence en silice ou en azote induit chez ces microalgues une synthèse accrue en lipides, ceci en lien avec l’activité du gène de l’ACCase. Cette enzyme à été purifiée à partir de la Diatomée Cyclotella cryptica et son gène a été isolé et cloné en vue de chercher à augmenter son expression et donc la production d’huile. CO2 Cycle de Calvin

Acétyl-CoA

ACCase

Synthèse des acides gras

Malonyl-CoA

Lipides

Biodiésel

Figure 8.4 - Voie simplifiée du métabolisme lipidique D’autres approches possibles pour augmenter la teneur en lipides cellulaires consistent à bloquer les voies métaboliques qui conduisent à l’accumulation de composés riches en énergie, tels que l’amidon ou à réduire le catabolisme des lipides. En plus de l’ingénierie de microalgues pour l’augmentation de la production de lipides, il est également raisonnable de tenter d’améliorer la qualité des lipides comme source de biodiesel. Les recherches actuelles tentent de mieux comprendre les facteurs de l’environnement (température, éclairement…) et les facteurs génétiques qui affectent l’accumulation de lipides chez les microalgues, en vue de produire des souches ayant des caractéristiques désirées.

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PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Une production économiquement viable de lipides algaux pour la production de biocarburants nécessite l’optimisation de la productivité ainsi que la maîtrise de la cinétique d’accumulation des lipides pour récolter la biomasse algale au moment précis où la production de lipides est maximale.

Procédés de récolte La récupération de la biomasse algale est une des principales préoccupations technologiques et économiques du fait des coûts énergétiques prohibitifs des techniques usuelles de récupération (par exemple, la centrifugation) au regard de la valeur des produits finaux. La floculation et la sédimentation présentent l’avantage d’être moins coûteuses, efficaces, durables et fiables mais souvent lentes du fait de la petite taille des microalgues. Pour faciliter la décantation, on peut provoquer la floculation des microalgues c’est-àdire leur agrégation. Plusieurs techniques de floculation sont utilisées : X la floculation chimique : l’ajout d’additifs chimiques organiques ou inorganiques comme les sels métalliques multivalents (chlorure de fer, sulfate de fer, sulfate d’aluminium…) ou des polymères chargés (polyacrylamide, chitosane, amidon modifié…) provoque l’agrégation des cellules algales en modifiant leurs interactions physio-chimiques. La gomme de guar est un bon agent de floculation des algues de petite taille (Chlorella sp. CB4 et Chlamydomonas sp. CRP7) avec une surface chargée négativement ; X la biofloculation : un changement des conditions du milieu (oxygène dissous, pH, lumière, température, carence en nutriments…) peut déclencher un stress cellulaire générant la synthèse d’exsudats agrégeant ; X l’électrocoagulation et l’électrofloculation (ou floculation électrolytique) : elles ont l’avantage de ne pas faire usage d’additifs chimiques, mais elles sont coûteuses. Diverses techniques de filtration (frontale et tangentielle, notamment) sont également mises en œuvre dans certains cas, mais elles ne conviennent pas pour des cellules dont le diamètre est inférieur à 10 μm. Il semble n’exister aucune méthode unique ou combinaison de méthodes qui puisse convenir à la récolte de tous les types de microalgues. Les procédés naturels (sédimentation et floculation) pourraient être une alternative aux problèmes rencontrés par les techniques habituelles de récolte des microalgues. La concentration des microalgues atteinte par les différentes méthodes de récolte varie de 0,5 à 27 % en poids sec. Une étape de séchage peut être nécessaire avant l’extraction des biomolécules à partir de la biomasse algale. Elle est réalisée, selon les cas, par le soleil, sur cylindres tournants, par pulvérisation ou par lyophilisation. Le degré de concentration requis variera avec la méthode utilisée pour produire des molécules utilisables à partir des microalgues. Le second problème à résoudre est l’extraction des biomolécules produites. L’extraction à moindre coût des métabolites d’intérêt nutritionnel, nutraceutique, cosmétique ou pharmaceutique est un facteur de développement important de ce secteur d’activité. La ressource microalgale est particulière : elle est à la fois divisée (unicellulaire) et très diluée en phase aqueuse. Les fractions d’intérêt (lipides, mais aussi pigments, enzymes,

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

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amidon…) sont concentrées dans des compartiments cellulaires. Pour accéder au contenu intracellulaire, il faut donc s’affranchir de certaines barrières comme la paroi cellulaire ou la membrane plasmique par lyse, perméabilisation ou broyage. Les techniques couramment utilisées vont des cycles congélation-décongélation, broyage à billes, hautes pressions, ultrasons, jusqu’aux traitements électriques. Une idée récente est l’utilisation des champs électriques pulsés ou CEP, afin d’obtenir une électroporation réversible de la membrane cellulaire, permettant ainsi une exsudation ou l’extraction d’un des métabolites intracellulaires recherchés (protéine, enzyme, pigment…). Les micro-organismes ainsi traités devant rester viables afin d’être renvoyés dans le photobioréacteur pour une traite future (traite des microalgues par analogie à celle du monde animal mais aussi à la notion de traite des plantes terrestres déjà pratiquée).

Extraction et traitement des huiles Tout comme l’extraction des huiles des plantes supérieures, celle des algues peut être effectuée par trois procédés principaux : X par simple pressage à froid à l’aide d’une presse à huile et récupération de l’huile pure. Ce procédé simple ne dépasse pas un rendement de 70 à 75 % de l’huile. Il peut cependant être utilisé comme étape préliminaire suivie d’une extraction avec un solvant afin d’assurer une meilleure imprégnation du solvant ; X par extraction avec un solvant organique apolaire type hexane. Les lipides sont séparés du solvant par distillation. Le solvant récupéré peut être réutilisé pour d’autres extractions. Le rendement peut atteindre 95 à 99 % mais à un coût plus élevé ; X par extraction avec des fluides supercritiques. Sous certaines conditions de température et de pression, dites critiques (Tc = 31,1 °C et Pc = 73,9 bar), le CO2 acquiert des propriétés physiques intermédiaires entre celles d’un gaz et celles d’un liquide ce qui augmente sa capacité de solvatation des composés organiques. Le même principe peut être utilisé pour l’eau (Tc = 376 °C et Pc = 221 bar) comme agent extractant mais son application à grande échelle est délicate. Le rendement obtenu est proche de 100 %. Les triglycérides qui constituent les huiles algales ainsi extraites sont transformés en esters méthyliques ou en esters éthyliques et en glycérol par une réaction de transestérification avec des molécules de méthanol ou d’éthanol, respectivement. Le biodiesel ainsi obtenu présente les mêmes caractéristiques et les mêmes conditions d’utilisations que celles décrites pour les huiles végétales classiques (colza et soja). Il peut être utilisé pur ou comme additif au pétrodiesel dans des proportions de 5 à 30 % pour former un biodiesel composé plus fluide et mieux adapté aux zones tempérées ou froides.

8.5.3.3. PRODUCTION DE BIOÉTHANOL L’éthanol est généralement produit à partir de matières premières contenant des sucres fermentescibles ; certaines algues peuvent contenir plus de 50 % d’amidon et leurs parois cellulaires sont composées de polysaccharides. Le principe de la fermentation de la biomasse microalgale est le même que pour la fermentation des sucres issus des plantes sucrières. Les microalgues peuvent donc être utilisées comme matière première dans un processus similaire à la production d’éthanol cellulosique, avec l’avantage supplémentaire

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PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

que les algues ne contiennent pas de lignine et leurs polysaccharides sont généralement plus facilement décomposables que la biomasse ligneuse. La production de bioéthanol à partir de microalgues est multiparamétrique. L’accumulation de l’amidon dans la biomasse dépend, entre autres, de la photopériode, de la température, de l’éclairement, de la composition du milieu. La biomasse est récoltée (habituellement par filtration ou centrifugation), puis les cellules de microalgues sont soumises à des traitements mécaniques et/ou biochimiques (enzymes) afin de libérer l’amidon nécessaire pour la fermentation par les levures (Saccharomyces cerevisiae). Le bouillon fermenté est ensuite traité par distillation pour obtenir l’éthanol (fig. 8.5). Biomasse

Extraction des glucides

algale

Fermentation

Distillation

Bioéthanol CH3CH2OH

Figure 8.5 - Fermentation de la biomasse microalgale

8.5.4. DÉFIS À RELEVER .BMHSÏ
MFT
GPSUFT
BUUFOUFT
EFT
JOEVTUSJFMT
FU
EFT
ÏUBUT
DPODFSOBOU
MB
QSPEVDUJPO
EF
CJPcarburants à base de microalgues, un certain nombre de défis persistent et nécessitent encore des travaux de recherche et de développement importants dans les domaines techniques et économiques, notamment. En effet, si en laboratoire, les conditions de culture des microalgues sont bien maîtrisées, à l’échelle industrielle, la tâche est plus problématique. L’industrialisation de l’exploitation des microalgues à des fins énergétiques ne pourra se faire que si un certain nombre de barrières sont levées : X identification des microalgues les plus adaptées présentant le meilleur compromis entre croissance rapide, teneur en lipides, facilité de récolte et faible demande énergétique, et ce, parmi les quelques millions d’espèces existantes. X optimisation du rendement de production par régulation de l’apport en énergie lumineuse avec des systèmes automatisés (utilisation récente des LED, « Light-Emitting Diode ») ; X quantification des apports nécessaires en oligo-éléments et vitamines et recyclage de l’azote et du phosphore contenus dans la biomasse qui ont un impact direct sur le coût de production ; X amélioration du processus industriel de récolte des microalgues ; X optimisation de l’extraction des lipides ; X réduction du risque de contamination pour des cultures en milieu ouvert ;

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

211

X établissement

d’un écobilan complet des processus retenus mettant en balance la production d’huile avec les besoins en eau, en nutriments et les investissements nécessaires.

8.6. PRODUCTION DES POLYSACCHARIDES Les microalgues constituent d’excellents convertisseurs d’énergie solaire et de bons producteurs de polysaccharides extracellulaires. En terme de développement, les avantages des microalgues sont liés à leur court cycle de reproduction et surtout de mutiplication et à la possibilité de les cultiver dans des conditions précises afin d’en extraire les produits désirés. La culture de ces microalgues se fait dans des bioréacteurs tubulaires clos dans lesquels les microalgues circulent en continu entraînées par un courant généré par des pompes péristaltiques. La biomasse, contenant les cellules algales et le polysaccharide extracellulaire hydrosoluble, est recueillie en continu. La biomasse cellulaire est séparée par centrifugation ou filtration et le polysaccharide contenu dans le surnageant est isolé par précipitation à l’isopropanol. Les caractéristiques rhéologiques (viscosité) de ces polymères en solution leur confère également un large spectre d’applications comme agents de texture ou stabilisants dans l’industrie agro-alimentaire ou cosmétique. Les polysaccharides produits par les microalgues sont doués d’activités biologiques diverses. Les polysaccharides sulfatés sont des antiviraux puissants (notamment contre le virus de l’herpès). Elles produisent également des β-glucanes qui agissent en simulant la présence de pathogènes pour déclencher une réponse immunitaire. La production d’un polysaccharide, le paramylon à partir d’Euglena gracilis est très étudiée. Ce polysaccharide présente des effets antimicrobiens, antiviraux et immunostimulants. Il est utilisé en cosmétique et dans les techniques de chromatographie.

8.7. ISOTOPES BIOCHIMIQUES STABLES Les microalgues sont des sources idéales de composés marqués à l’aide d’isotopes stables. Leur capacité d’effectuer la photosynthèse leur permet d’incorporer des isotopes stables (13C, 15N et 2H) de molécules inorganiques simples relativement peu couteuses (13CO2, 15 NO3, 2H2O) dans des composés organiques plus complexes (par exemple, acides aminés, saccharides, lipides et acides nucléiques). C’est ainsi que, le 13C-glucose, par exemple, produit par voie biologique par culture de Chlorella, est commercialisé par une firme japonaise. Les isotopes biochimiques stables produits sont utilisés dans deux buts : X incorporation dans les protéines, les glucides et les acides nucléiques pour faciliter leur EÏUFSNJOBUJPO
TUSVDUVSBMF
BV
OJWFBV
BUPNJRVF
FO
QBSUJDVMJFS
QBS
3./
 X études métaboliques qui exploitent la discrimination isotopique4. 4

pour des compléments d’information voir Le marquage radioactif en biochimie et La discrimination isotopique sur le site web dédié

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PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

8.8. TOXINES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES Comme tout organisme vivant, les microalgues et les Cyanobactéries produisent une grande variété de métabolites appartenant à différentes classes chimiques (peptides, alcaloïdes, terpénoïdes, macrolides, glycosides, polysaccharides, lipopolysaccharides…). La plupart de ces métabolites sont accumulés dans la biomasse cellulaire, mais d’autres sont excrétés dans le milieu environnant et présents dans les poissons ou les mollusques consommés par l’homme. Ces métabolites sont dans la plupart des cas des substances douées d’activités biologiques aussi diverses que multiples : allélopathique, antifongique, antivirale, antibactérienne, cytotoxique, stimulatrice de la croissance cellulaire… d’où leur intérêt potentiel pour l’industrie pharmaceutique, l’agronomie ainsi que dans d’autres applications. Certaines de ces substances excrétées sont toxiques, ce qui pose de sérieux problèmes concernant la qualité de l’eau pour la pêche, l’aquaculture, l’agriculture de même que des risques sanitaires pour l’homme et les animaux. L’homme est exposé à ces toxines à travers différentes voies dont l’eau potable, le contact lors des loisirs aquatiques et lors de la consommation de produits alimentaires issus du milieu marin. Des recherches récentes suggèrent que la prolifération des Cyanobactéries dans les écosystèmes d’eau douce, estuariens et marins est souvent associée aux périodes d’eutrophisation qui favorise la lyse cellulaire ainsi qu’au réchauffement climatique. Les cyanotoxines sont essentiellement des endotoxines qui peuvent être libérées dans l’environnement suite à une lyse cellulaire ou après un traitement de l’eau avec des algicides. La présence des proliférations de Cyanobactéries est détectée et suivie par différents moyens. Une approche courante consiste à mesurer la teneur en chlorophylle a (Chl a), le pigment photosynthétique principal présent chez tous les micro-organismes photoautotrophes. La Chl a peut être mesurée soit in situ à l’aide de capteurs, soit sur des échantillons prélevés pour des analyses au laboratoire. Toutefois, les mesures de la Chl a ne permettent pas de discriminer les Cyanobactéries des autres microalgues, ce qui constitue une limitation sérieuse pour l’interprétation des résultats. La mesure des pigments cyanobactériens spécifiques comme la phycocyanine peut résoudre ce problème. Ainsi, l’analyse combinée de la Chl a et de la phycocyanine fournit des informations intéressantes en ce qui concerne la proportion de Cyanobactéries parmi les autres espèces de phytoplancton. Une technique récente, conduite conjointement par plusieurs laboratoires français et belges, consiste à utiliser des fluorimètres dont le principe est de déterminer la biomasse et/ou les paramètres physiologiques des microalgues par groupes fonctionnels en se basant sur les caractéristiques différentielles des spectres (sous excitation) par fluorescence, des pigments accessoires de plusieurs groupes de microalgues en même temps. L’utilisation de fluorimètre modulés adaptés comme le Phyto-Pam de chez Walz permet une détermination encore plus fine des groupes de microalgues. Une autre méthode commune de contrôle des proliférations cyanobactériennes est le dénombrement et l’identification des cellules par microscopie. Néanmoins, cette méthode est laborieuse et nécessite un niveau relativement élevé d’expertise taxonomique. Comme toute autre méthode, l’identification microscopique d’une espèce de Cyanobactéries ne veut pas dire que cette dernière est réellement productrice de toxine. Cependant, le dénombrement et

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

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l’identification des Cyanobactéries par microscopie combinées à l’identification chimique des toxines dans l’eau fournissent une bonne indication sur l’espèce incriminée. Par ailleurs, les espèces du genre Dinophysis
BCPOEBOUFT
TVS
MFT
DÙUFT
EF
MB
.BODIF
FU
de l’Atlantique et qui produisent des toxines diarrhéiques, rendent à certaines périodes de l’année les moules et autres mollusques bivalves filtrants impropres à la consommation. Certaines espèces de Dinoflagellés (ex. Alexandrium minutum, A. tamarense, Gonyaulax catanella, G. tamarensis, Pyrodinum phoneus) sécrètent des toxines paralysantes essentiellement des saxitoxines (fig. 8.6) dont il existe près de 20  types. Les saxitoxines sont également produites par certaines espèces de Cyanobactéries (tab. 8.2). La toxine s’accumule notamment dans le siphon, les branchies et les glandes digestives des mollusques. -FT
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de chair de moule. Cette toxine se caractérise par son effet paralysant neuromusculaire extrêmement puissant ; son intensité est 20 fois plus forte que celle du curare. D’autres toxines comme l’acide okadaïque et ses analogues, les dinophysistoxines (DTX1, DTX2 et DTX3), agissent en modifiant la perméabilité cellulaire et engendrent des diarrhées et des vomissements. Ces toxines sont produites par les Dinoflagellés, notamment du genre Dinophysis. L’acide okadaïque est un inhibiteur des protéines phosphatases de types 1 et 2A impliquées dans différents processus intracellulaires comme le métabolisme, la division cellulaire, la transduction du signal ou le fonctionnement des canaux ioniques. Une autre Dinophycée benthique Gambierdiscus toxicus est responsable de graves intoxications, dans le Pacifique Sud (Nouvelle Calédonie, Polynésie française, Australie…) mais aussi dans l’océan Indien, aux Antilles et en Floride. Cette intoxication est connue sous le nom de « ciguatera » ou « gratte » ou « ichthyosarcotoxisme ». Cette microalgue est ingérée par les poissons herbivores. Par bioaccumulation le long de la chaîne alimentaire, les ciguatoxines produites par la microalgue, vont se concentrer dans les poissons et atteindre des taux susceptibles d’intoxiquer les consommateurs. Ces neurotoxines s’accumulent plus dans les viscères (en particulier, le foie) que dans les muscles et sont insensibles à la cuisson. Les ciguatoxines se retrouvent dans de nombreuses espèces de poissons récifaux des Caraïbes, de l’Atlantique tropical et du Pacifique. Elles sont incolores, inodores et thermorésistantes, ce qui rend leur détection dans les poissons contaminés quasiment impossible. Des méthodes de détection de laboratoire existent néanmoins (chromatographie en phase gazeuse ou liquide couplée à la spectrométrie de masse) mais elles demeurent laborieuses et non-applicables à grande échelle. Récemment, une autre Dinophycée, Oestreopsis ovata, dont les habitats naturels sont les mers chaudes, s’est insUBMMÏF
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les ballasts des bateaux. Elle forme de temps en temps des efflorescences dans la partie nord-ouest générant des effets toxiques sur l’homme. Les symptômes sont des irritations de la peau, de la fièvre, de la toux, des troubles respiratoires…, mais la particularité de ce phénomène est que les personnes atteintes n’ont pas forcément été en contact direct avec l’eau de mer ; il leur a suffit d’inhaler les gouttelettes transportées par les embruns lors des efflorescences pour que les symptômes se manifestent. La toxine produite par O. ovata a été identifiée comme une palytoxine très dangereuse quand elle est ingérée et qui agit sur le potassium intracellulaire entraînant des problèmes gastro-intestinaux, cutanés, neurologiques et cardio-vasculaires.

214

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

Chez quelques Diatomées comme les Pseudo-nitzschia, des neurotoxines amnésiantes comme l’acide domoïque (fig. 8.6) s’accumulant dans les fruits de mer sont responsables d’intoxications alimentaires. L’acide domoïque appartient au groupe des neurotoxines de type acide kaïnique. En effet, il est structurellement proche de l’acide glutamique (neurotransmetteur) et de l’acide kaïnique (neuro-excitateur). Il se fixe sur un des récepteurs synaptiques de l’acide glutamique, connu sous le nom de récepteur de l’acide kaïnique. Il y a alors entrée des ions sodium dans la membrane post-synaptique induisant une dépolarisation et provoquant une augmentation de la perméabilité des ions calcium ce qui entraîne un dysfonctionnement des cellules, voire leur mort. O

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H CH3

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H

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O OH

Figure 8.6 - Saxitoxine (en haut à gauche), acide domoïque (en haut à droite) et acide okadaïque (en bas) Chez les Cyanobactéries, de nombreuses espèces sont considérées comme toxiques. Plus de 40 espèces représentant 20 genres de Cyanobactéries produisent des cyanotoxines. Ces toxines peuvent être séparées en quatre principales catégories selon leur mode d’action le plus significatif : celles attaquant le foie (hépatotoxines), celles attaquant le système nerveux (neurotoxines), celles agissant sur plusieurs organes (cytotoxines) et celles provoquant des irritations de la peau (dermotoxines) (tab. 8.2). Certaines, comme la cylindrospermopsine (voir fig. 8.8), produite par des Cyanobactéries filamenteuses, est qualifiée de cytotoxique générale car elle bloque la synthèse protéique et est susceptible d’affecter les reins, le thymus, la rate et le cœur, bien que ses principaux effets sont observés dans le foie. Une même espèce peut synthétiser plusieurs toxines simultanément. Ces toxines sont libérées dans l’eau à la mort des cellules et posent principalement des problèmes au niveau des plans d’eau destinés aux loisirs ou à la production d’eau potable.

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

215

Tableau 8.2 - Caractéristiques générales de quelques cyanotoxines Principal organe cible chez les Mammifères

Principaux genres de Cyanobactéries

.JDSPDZTUJOFT

Foie

Mycrocystis, Anabaena, Anabaenopsis, Gloeotrichia, Hapalosiphon, Nostoc, Oscillatoria, Planktothrix

Nodularines

Foie

Nodularia

Catégorie Peptides cycliques

Alcaloïdes

Anatoxine-a

Synapse

Anabaena, Aphanizomenon, Arthrospira, Cylindrospermum, Microcystis, Phormidium, Planktothrix, Raphidiopsis

Anatoxine-a(S)

Synapse

Anabaena

Aplyslatoxines

Peau

Lyngbya, Schizothrix, Planktothrix

Cylindrospermopsines

Foie

Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Lyngbya, Raphidiopsis, Umezakia

Lyngbyatoxine-a

Peau, tractus gastro-intestinal Lyngbya

Saxitoxines

Axones

Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Planktothrix

Lipopolysaccharides (LPS) Irritants potentiels pour tout tissu exposé

Nombreuses espèces

Les microcystines (nommées d’après le premier genre de Cyanobactéries associé à leur biosynthèse, Microcystis) et les nodularines (produites par le genre Nodularia) sont les toxines cyanobactériennes les plus abondantes et elles sont le plus souvent la cause d’intoxication chez les animaux et chez l’homme. À l’heure actuelle, on a dénombré plus de 90 sortes de microcystines et 9 nodularines. En France, l’AFSSA a établi pour la microcystine-LR un seuil de 1 μg/L de microcystine-LR (la plus fréquente parmi les microcystines cyanobactériennes) à ne pas dépasser dans les eaux de boisson. Les microcystines sont extrêmement stables dans l’eau grâce à leur structure chimique (fig. 8.7) qui leur permet de survivre dans les eaux tièdes et froides et de tolérer des variations importantes de la composition chimique de l’eau, en particulier du pH. Ce sont des structures heptapeptidiques formant un cycle et comprenant des acides aminés rares rencontrés uniquement dans ces molécules. Une fois absorbées par l’organisme, les microcystines se concentrent rapidement dans le foie et se lient aux phosphatases de types 1 et 2a. Selon la dose et le poids de l’individu affecté, l’inhibition de la phosphatase peut mener successivement à l’accumulation excessive de protéines phosphorylées dans le foie, la nécrose des cellules, l’hémorragie massive et la mort.

216

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES H3C

COOH

H

O

N NH

HN O

H 3C OCH3

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H NH H3C

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OCH3 NH

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O O HO

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NH2

Figure 8.7 - Structure commune des microcystines (en haut) et de la nodularine-R (en bas) X et Y sont des acides aminés variables.

Les nodularines dont la structure générale est très proche de celle des microcystines, sont pentapeptidiques cycliques. Elles en diffèrent principalement par leur plus petite structure cyclique. Par conséquent, elles pénètreraient dans les hépatocytes plus facilement que les microcystines, ce qui pourrait expliquer leurs plus fortes propriétés cancérogènes. En effet, elles induisent un stress oxydatif et produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dont les superoxydes, les radicaux hydroxyles et des radicaux de composés organiques cellulaires, causant des dommages comme la peroxydation des lipides, des protéines et de l’ADN. Les nodularines agissent également par l’intermédiaire de l’inhibition des phosphatases de types 1, 2a et 3. Les anatoxines sont un groupe d’alcaloïdes neurotoxiques produites par un certain nombre de genres de Cyanobactéries dont Anabaena, Oscillatoria et Aphanizomenon. La toxicité de ces composés (DL50) varie entre 20 μg/kg chez la souris (par voie I.P.) pour l’anatoxine-a(S) à 200-250 μg/kg pour l’anatoxine-a (fig. 8.8) et l’homoanatoxine-a, ce qui les rend beaucoup plus toxiques que les microcystines. L’anatoxine-a se lie au récepteur nicotinique de l’acétylcholine, où elle agit comme un analogue de l’acétylcholine sans

8 - LES MÉTABOLITES DES MICROALGUES ET DES CYANOBACTÉRIES

217

être dégradée par la cholinestérase, ce qui provoque une stimulation permanente des cellules musculaires conduisant à la paralysie et un arrêt respiratoire. H N

O

O

OH NH O

S

O H

H

H N

O CH3

O OH H

N

NH  NH

Figure 8.8 - Structures communes de la cylindrospermopsine (à gauche) et de l’anatoxine-a (à droite) Les dermatotoxines cyanobactériennes incluent l’aplysiatoxine et la lyngbyatoxine produites principalement par Lyngbya majuscula. Jusqu’ici, ces toxines ont été détectées seulement dans l’eau de mer. Après exposition, les symptômes caractéristiques d’empoisonnement chez l’homme sont principalement la dermatite ainsi qu’une inflammation buccale et gastro-intestinale entraînant une diarrhée. Deux méthodes sont généralement employées dans la détection et l’identification des toxines algales : les tests biologiques ou biochimiques et les méthodes physico-chimiques. Ces méthodes diffèrent par les principes de détection, les renseignements qu’ils fournissent et la simplicité/complexité de leur mise en œuvre. Le choix d’une technique dépend de la disponibilité des moyens matériels, des compétences requises ainsi que du type d’information recherchée. Cependant, la sélectivité et la sensibilité des techniques sont des critères importants déterminants dans le choix de la méthode convenable qui donnera des informations fiables requises. Parmi les méthodes biologiques/biochimiques actuellement disponibles pour la détermination des toxines algales figurent le test de la souris, les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et les essais sur la phosphatase protéique. La technique ELISA est couramment utilisée pour le dépistage systématique de la contamination de l’eau par des toxines algales. Le test de la souris consiste à administrer à des souris de laboratoire par injection intrapéritonéale, un lysat de cellules supposées toxiques ou un produit qui en est séparé. En fonction des symptômes observés, il permet de déterminer la classe de toxine (hépatotoxine, neurotoxine…) ainsi que la dose létale. Il est utile pour un dépistage de la contamination d’échantillons d’eau très concentrée (par exemple, les « fleurs d’eau ») mais ne convient pas pour la détermination des toxines en faible concentration dans l’eau. N’ayant pas une sensibilité suffisante, ces tests nécessitent une étape de pré-concentration. L’extraction en phase solide s’est avérée être très fiable pour le nettoyage des échantillons d’eau et leur pré-concentration en vue d’un dosage quantitatif des toxines.

218

PARTIE II - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES

La plupart des méthodes physiques incluent la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), l’électrophorèse capillaire (EC), la chromatographie liquide couplée Ë
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spectrométrie de masse en tandem
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ÏMFDUSPQVMWÏrisation (ElectroSpray Ionization, ESI) couplée à la chromatographie liquide présente une avancée dans le domaine de l’ionisation de substances non-volatiles, comme les cyanoUPYJOFT
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a permis d’atteindre une plus grande sensibilité et spécificité de détection des toxines algales. Enfin, on rencontre aussi des toxines dans les champignons (aflatoxine…) et plus QBSUJDVMJÒSFNFOU
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marines.

PARTIE III

SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE 9 - LES PRODUITS SANGUINS 9.1. Constituants du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2. Fonctions du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3. Composition du plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4. Valorisation des produits sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.5. L'hémoglobine en biochimie médicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PAGES

221 221 221 230 242

10 - LES PRODUITS LAITIERS 10.1. Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2. Obtention et traitement du lactosérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.3. Fractionnement et utilisation du lactosérum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4. Protéines du lait . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.5. Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

249 249 250 251 259

11 - LES OVOPRODUITS 11.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2. Structure et composition des œufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.3. Valeur nutritionnelle de l’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.4. Propriétés fonctionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.5. Utilisations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

261 262 266 267 269

12 - LA GÉLATINE 12.1. Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
.BUJÒSFT
QSFNJÒSFT
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QPVS
MB
QSPEVDUJPO
EF
MB
HÏMBUJOF . . . . . . . . . . . . 12.3. Procédés de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.4. Nature protéique de la gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.5. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.6. Propriétés fonctionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.7. Statut réglementaire et securité alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.8. Avenir de la gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.9. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9 - LES PRODUITS SANGUINS 9.1. CONSTITUANTS DU SANG Le sang total est un milieu biologique complexe composé d’une partie liquide jaune légèrement translucide, le plasma (600 g/kg, 60 %) et d’une partie solide en suspension (40 %) formée d’éléments figurés : les globules rouges (encore appelés hématies, ou érythrocytes), les globules blancs (ou leucocytes) et les plaquettes (ou thrombocytes). Le plasma peut être séparé des autres constituants par simple centrifugation du sang traité par un anticoagulant. Le sérum est le surnageant obtenu à partir d’un sang laissé coaguler (30 à 45 min) puis centrifugé. Il diffère du plasma par la perte de certaines protéines, fibrinogène en particulier, qui interviennent dans la coagulation.

9.2. FONCTIONS DU SANG Au sein de l’organisme, le sang véhicule de nombreuses substances comme : X l’oxygène (par les érythrocytes) ; X des molécules d’origine alimentaire (glucose, acides aminés, lipides, ions minéraux) vers les cellules ; X des produits de dégradation du métabolisme cellulaire (urée, acide urique, bilirubine) vers les émonctoires ; X des molécules jouant un rôle fondamental dans la défense de l’organisme contre les infections et agressions (anticorps) ; X des molécules messagères permettant la communication entre organes différents par voie sanguine (les hormones) ; X des globules blancs qui ont pour fonction de défendre l’organisme contre l’intrusion d’éléments étrangers. Le sang participe également au maintien de la température du corps à une valeur constante en assurant la distribution de la chaleur dans toutes ses parties.

9.3. COMPOSITION DU PLASMA Le plasma sanguin est essentiellement constitué d’eau (environ 90 %) dans laquelle est dissous un grand nombre d’ions et de sels minéraux, des glucides, des acides gras, des glycérides et d’autres lipides, des acides aminés et des protéines, des nucléotides (ATP,

222

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

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BJOTJ
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vitamines et des hormones. Les concentrations en ces différentes substances sont maintenues constantes par différents mécanismes. Les protéines plasmatiques représentent 1/3 des protéines totales du sang. Elles participent au maintien de la pression oncotique qui assure la constance du volume sanguin et contribuent à la coagulation sanguine et à la fibrinolyse. On dénombre plus de 300 protéines plasmatiques différentes, isolables par électrophorèse bidimensionnelle, mais leur nombre réel est largement supérieur à cette valeur. Plus d’une soixantaine de ces protéines sont douées d’activités enzymatiques diverses. Les protéines plasmatiques sont représentées essentiellement par trois fractions : l’albumine, les globulines et des facteurs de coagulation.

9.3.1. FACTEURS DE LA COAGULATION Les facteurs de la coagulation sont une famille de protéines qui ont des analogies de séquence et, dans une certaine mesure, de structure. Ils appartiennent à la famille des protéases à sérine, et on en compte environ 50. La majorité des facteurs de la coagulation se trouvent sous forme inactive (zymogène). Leur activation se fait en cascade, avec un effet amplificateur (fig. 9.1). activation par contact

voie intrinsèque

kallicréine

voie extrinsèque

prékallicréine FIIIa

FXII FXIIa FXI FXIa

FVIIa

FVII

FIX FIXa

FVIII FVIIIa

FX

FX

FXa FV prothrombine

voie commune

FVa thrombine

fibrinogène fibrine FXIII

FXIIIa réticulation de la fibrine

caillot

Figure 9.1 - Représentation schématique des réactions en cascade de la coagulation sanguine

9 - LES PRODUITS SANGUINS

223

Les facteurs sont désignés par la lettre « F » devant un chiffre romain, et un « a » est placé après le chiffre romain pour indiquer qu’il s’agit de sa forme active (les facteurs peuvent avoir aussi d’autres noms) (tab. 9.1). Dans la cascade des réactions de la coagulation, un facteur active souvent un autre, en causant aussi bien un changement de sa forme que de sa fonction. Cela s’accomplit à travers le clivage de liaisons peptidiques spécifiques. Tableau 9.1 - Classification fonctionnelle des facteurs de la coagulation et des protéines régulatrices Facteur*

Synonyme(s)

Fonction

Facteurs de la coagulation facteur I

fibrinogène

sous l’action de la thrombine, il se transforme en fibrine pour former le caillot sanguin

facteur II

prothrombine, thrombogène

sous l’action de la prothrombinase, il se transforme en thrombine (IIa) qui clive le fibrinogène en fibrine

facteur III

facteur tissulaire

active le facteur VII

facteur IV

Ions Ca2+

nécessaires à la fixation des facteurs de la coagulation aux phospholipides

facteur V

proaccélérine, facteur labile

activé par la thrombine, Va est un cofacteur dans l’activation de II en IIa par Xa

facteur VI

accélérine

formé à partir de la proaccélérine

facteur VII

proconvertine

active IX et X

facteur VIII

facteur antihémophilique A

activé par la thrombine, VIIIa joue le rôle de cofacteur dans l’activation de X par IXa

facteur IX

facteur antihémophilique B, facteur Christmas

active X

facteur X

facteur de Stuart-Prower, thrombokinase

active II, forme le complexe prothrombinase avec le facteur Va, Ca2+ et les phospholipides

facteur XI

facteur de Rosenthal

active IX et la prékallicréine

facteur XII

facteur de Hagemann

active XI et la prékallicréine, se lie au collagène au site de la lésion vasculaire

facteur XIII

transglutaminase

activé par la thrombine, il stabilise la fibrine par sa réticulation avec d’autres protéines

kallicréine

facteur de Fletcher, kininogénine

active XII

kininogène de haut poids moléculaire

facteur de Fitzgerald

aide à l’activation de XII, XI et prékallicréine en kallicréine

224 Facteur*

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE Synonyme(s)

Fonction

Protéines de régulation facteur de von Willebrand

stabilise VIII, facilite l’adhésion des plaquettes

fibronectine

facilite l’adhésion cellulaire

antithrombine

inhibe l’action de IXa, Xa, XIa, XIIa et de la kallicréine

protéine C

complexée avec la protéine S, elle inactive Va et VIIIa

protéine S

agit comme cofacteur de la protéine C

plasminogène

profibrinolysine

forme la plasmine qui lyse le caillot de fibrine et inhibe d’autres facteurs

antiplasmine

inhibe l’action de la plasmine

antitrypsine

inhibiteur faible de la thrombine et puissant inhibiteur de XIa

activateur du plasminogène tissulaire

active le plasminogène

inhibiteur I de l’activateur du plasminogène

inhibe l’activateur du plasminogène tissulaire

inhibiteur II de l’activateur du plasminogène

inhibe l’urokinase

urokinase

active le plasminogène

* Les facteurs de la coagulation du sang sont des protéines (à l’exception des ions Ca2+), présents dans le plasma sanguin sous forme inactive appelée zymogène.

Le facteur I, plus connu sous le nom de fibrinogène, est, quantitativement, le principal facteur de coagulation ; sa concentration dans le plasma humain est voisine de 2 à 3 g/L. En se transformant en fibrine, il permet la coagulation du sang. Après formation du caillot, le plasma défibriné est appelé sérum. En le chauffant à 50-60 °C en présence de calcium, il forme un gel translucide. Le fibrinogène est une glycoprotéine fibreuse synthétisée dans le foie, soluble en présence de sels et insoluble dans l’eau pure. De masse moléculaire 330 kDa, elle est formée de deux hétérotrimères polypeptidiques [(Aα)2(Bβ)2γ2] reliées par des ponts disulfures : 2 chaînes Aα (610 aa, 66 kDa) ; 2 chaînes Bβ (461 aa, 52 kDa) et 2 chaînes γ (411 aa, 47 kDa) (fig. 9.2). Sous l’action de la thrombine (fibrogénase), en présence de facteur XIIIa et d’ions calcium, il se forme des fibrino-peptides A (16 acides aminés, à partir des chaînes Aα) et B (14 acides aminés, à partir des chaînes Bβ) qui ont une forte tendance à polymériser pour former un réseau de fibrine soluble.

9 - LES PRODUITS SANGUINS

225

site d’action de la thrombine B

chaîne β

A

chaîne α chaîne γ chaîne γ

A

chaîne α

B

chaîne β fibrine fibrinogène

Figure 9.2 - Structure schématique du fibrinogène montrant sa nature dimérique avec 3 chaînes polypeptidiques Ce dernier est ensuite converti en un polymère de fibrine insoluble par action du facteur  XIIIa ou transglutaminase qui, en présence d’ions calcium, crée des liaisons covalentes entre les monomères par transamidation des résidus de glutamine avec les groupements aminés de la lysine des chaines adjacentes (fig. 9.3). Ce phénomène est à la base de la constitution du caillot sanguin. Lys CH2 Lys CH2 CH2

CH2

C +

CH2

CH2

CH2

CH2

Gln

NH2

CH2

NH2

O

CH2

XIIIa NH3

NH O

C CH2 CH2 Gln

Figure 9.3 - Réaction de transamidation, catalysée par le facteur XIIIa, entre les chaînes latérales de la lysine et de la glutamine, conduisant à la réticulation des monomères de fibrine lors de la formation du caillot sanguin

226

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Le facteur  II ou QSPUISPNCJOF
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polypeptidique unique, de masse moléculaire 72,5 kDa. Synthétisé dans le foie, il se trouve dans le plasma humain à la concentration d’environ 110 mg/L. Après l’initiation de la cascade de coagulation au site de la lésion, il se convertit en thrombine ou fibrinogénase par le facteur Xa à activité protéasique. Le facteur  III ou thromboplastine ou facteur de tissu (en abrégé FT) ajouté au plasma sanguin, accélère le temps de formation du caillot. C’est une glycoprotéine des cellules subendothéliales, qui initie la coagulation du sang en formant un complexe avec le facteur VII. Ce complexe active les facteurs IX ou X. Le facteur V ou proaccélérine est une glycoprotéine d’environ 330 kDa qui, après son activation en facteur Va (accélérine), agit avec le facteur Xa pour activer la prothrombine. Le facteur Va est inactivé par la protéine C. Le facteur VI ou accélérine est une protéine très proche de la précédente fabriquée par le foie et qui accélère la transformation de la prothrombine en thrombine. Le facteur  VII ou proconvertine se trouve à la concentration de 2 mg/L dans le plasma IVNBJO
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QPMZQFQUJdique de 50 kDa, produite par les cellules hépatiques. C’est le précurseur du facteur VIIa ou convertine, une protéase Ca2+-dépendante qui active le facteur X. C’est la première étape de la voie extrinsèque de la coagulation du sang. Le facteur VIII ou facteur antihémophilique A est une glycoprotéine de 265 kDa composée de deux chaînes polypeptidiques. Il est essentiellement synthétisé dans le foie et, à moindre degré, par la rate, le rein et les lymphocytes puis secrété dans le plasma où il s’associe au facteur vW qui le protège contre la protéolyse et l’inactivation. Il participe, conjointement avec le facteur IXa (à activité protéasique) à l’activation du facteur X dans la voie intrinsèque de la coagulation. Il active également le facteur IX en IXa. Le facteur von Willebrand (F  vWa) est une protéine impliquée dans la coagulation du sang. Synthétisé dans les cellules endothéliales et les mégacaryocytes, il se retrouve dans le sang sous forme de complexe avec F VIII. Il assure deux fonctions hémostatiques importantes : X il lie les récepteurs membranaires des plaquettes au collagène, et probablement d’autres constituants du tissu conjonctif subendothélial, facilitant ainsi l’adhésion des plaquettes au site lésé et, par suite, la formation du thrombus ; X il se lie au facteur VIII et le stabilise en ralentissant son inactivation par les enzymes protéolytiques. Le facteur  IX (appelé également facteur antihémophilique  B), présent dans le plasma humain à la concentration de 3 à 4 mg/L, de masse moléculaire 57 kDa, est une glycoprotéine à chaîne polypeptidique unique. Après activation protéolytique, il forme deux chaînes : le facteur IXa, une protéase à sérine de 27 kDa qui active le facteur X dans la voie intrinsèque de la coagulation et une chaîne légère de 16 kDa. Le facteur X se trouve dans le plasma humain à la concentration de 6 à 8 mg/L. C’est une HMZDPQSPUÏJOF
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9 - LES PRODUITS SANGUINS

227

chaîne de 40 kDa à activité protéasique et une chaîne de 15 kDa contenant des résidus carboxyglutamate. Sous forme activée (Xa), il convertit la prothrombine en thrombine par clivage sélectif de certaines liaisons. Cette activation se fait par complexation avec F Va, en présence d’ions Ca2+. Ses principaux inhibiteurs sont l’antithrombine III et l’α-antitrypsine. Le facteur XI est une glycoprotéine homodimérique de 158 kDa qui active le facteur IX en IXa. Son action est inhibée par l’α-antitrypsine et le complexe antithrombine-héparine. Le facteur XII est une glycoprotéine à chaîne polypeptidique unique de 80 kDa. Il initie la coagulation intrinsèque en activant F XI. Le facteur  XIII est une protéine qui se trouve sous forme tétramérique dans le plasma ..


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par la thrombine forme le facteur XIIIa qui est une transglutaminase qui relie de manière covalente les monomères de fibrine en polymère (voir fig. 9.3). Le facteur XIIIa est la seule enzyme, intervenant dans la cascade de la coagulation du sang, qui ne soit pas une protéase à sérine. La fibronectine est une glycoprotéine dimérique synthétisée dans les hépatocytes. Elle se fixe aux surfaces cellulaires et réagit avec la fibrine, le collagène et l’héparine. Les kinogènes sont des protéines multifonctionnelles (précurseurs de la bradykinine à propriété vasodilatatrice, cofacteurs dans l’activation du facteur XI par F XIIa et inhibiteurs de certaines protéases). Ils sont de deux types : les kinogènes à haut poids moléculaire (glycoprotéine à simple chaîne polypeptidique de 150 kDa) et les kinogènes à bas poids moléculaire, tous deux synthétisés dans le foie. La LBMMJDSÏJOF
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dans le sang. La kallikréine plasmatique est synthétisée dans le foie et dérive de la conversion de la prékallikréine par le facteur  XIIa. Elle agit sur le kininogène pour donner la bradykinine et active les facteurs de la coagulation XII et VII. Le plasminogène est une glycoprotéine à chaîne polypeptidique simple de 86 kDa, synthétisée dans le foie et dans les reins et qui, convertie en plasmine (ou fibrinolysine ou fibrinase), solubilise le caillot de fibrine. La conversion de la plasmine est catalysée par l’activateur du plasminogène, une protéase à sérine dont il existe de nombreux variants dans différents tissus. La plasmine est la protéase clé dans la lyse du caillot sanguin. La plasmine humaine est DPOTUJUVÏF
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site actif est localisé au niveau de la chaîne B. L’antithrombine (AT) est un puissant inhibiteur des sérines protéases de la coagulation agissant principalement sur la thrombine et le facteur X activés. Il en existe quatre formes dont la plus importante est l’antithrombine III, synthétisée dans le foie. Son activité est stimulée en présence d’héparine. La QSPUÏJOF̓ $
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HMZDPprotéique, synthétisée dans le foie et de masse moléculaire 62 kDa. Elle est constituée de deux chaînes liées par un pont disulfure : une chaîne légère L (155 aa, 21 kDa) et une

228

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

chaîne lourde H (262 aa, 41 kDa). Activée par la thrombine, elle participe à la régulation de la coagulation du sang en inactivant les facteurs Va et VIIIa, en présence d’ions Ca2+ et de phospholipides. Les protéines S et F V interviennent également dans ce processus de manière synergique. Son nom vient du fait qu’elle est la troisième protéine éluée d’une colonne échangeuse d’ions. La QSPUÏJOF̓ 4
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unique, de 69 kDa. Elle facilite la fixation de la protéine C aux plaquettes et fonctionne comme cofacteur de la protéine C impliquée dans la dégradation de F Va et F VIIIa. Son nom vient de Seattle où elle a été découverte.

9.3.2. AUTRES CONSTITUANTS L’albumine sérique ou sérumalbumine est la plus abondante protéine soluble (35 à 45 g/L) du plasma sanguin et, à ce titre, elle est le principal responsable de la pression oncotique puisqu’elle assure à elle seule environ 80 % du pouvoir oncotique plasmique. Cette propriété est due aussi à son fort pouvoir de rétention d’eau (15 à 20 mL d’eau/g d’albumine). On trouve l’albumine aussi, sous une forme extrêmement voisine, dans le lait et le lactosérum à côté de l’alpha et la béta lactalbumine. Protéine monocaténaire très riche en ponts disulfures, son poids moléculaire est d’environ 67 000. Synthétisée par le foie, elle a une fonction biologique très importante; c’est elle qui fixe et transporte, dans tout l’organisme, un grand nombre de substances nécessaires à son bon fonctionnement. Les substances transportées peuvent être : X d’origine endogène : Z ions organiques ou inorganiques (ex. calcium), Z bilirubine (protecteur de la sérumalbumine), Z acides gras libres (non-estérifiés), Z hormones thyroïdiennes et stéroïdes, Z glucose, X d’origine exogène : Z médicaments, Z vitamine C, iode. La fixation aux ligands est en général solide mais non-covalente. Ceci permet à la fixation d’être réversible. En biochimie analytique, la propriété de l’albumine de fixer le bleu de Coomassie est à l’origine de la méthode de dosage dite « de Bradford » pour doser les protéines. Les globulines sont séparées en différentes fractions selon leur mobilité électrophorétique. Elles sont principalement représentées par les gamma-globulines qui font partie des immunoglobulines (Ig), plus connues sous le nom d’anticorps, c’est-à-dire des substances réagissant spécifiquement à l’introduction d’un antigène dans la circulation générale. Les immunoglobulines sont produites par les lymphocytes B. Elles sont divisées en 

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9 - LES PRODUITS SANGUINS

229

sont les IgG qui ont la concentration plasmatique la plus élevée (7-14 g/L) et qui peuvent traverser le plus facilement la barrière placentaire (transfert de la mère à l’enfant). Les immunoglobulines sont constituées de deux chaînes protéiques lourdes (H, de l’anglais heavy) spécifiques pour chaque groupe et de deux chaînes protéiques légères (L,  de l’anglais light) qui sont reliées entre elles par des ponts disulfures et ayant une forme caractéristique en Y. Les deux chaînes H forment la partie allant de la base du Y jusqu’en haut des branches, les 2 chaînes  L sont limitées aux branches. Elles sont présentes dans le sang mais aussi dans le lait. Ce sont des macromolécules composées de plus de 1300 acides aminés ; l’ordre d’arrangement de ceux-ci et leur organisation dans l’espace leur confèrent leur spécificité d’action biologique vis-à-vis de telle ou telle substance étrangère s’introduisant dans un organisme vivant. La spécificité est le plus souvent absolue : chaque immunoglobuline est spécifique de l’antigène (Ag) qui a déclenché sa synthèse. Les diverses gamma-globulines jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement du système immunitaire. Les lipides plasmatiques sont représentés par les triglycérides, le cholestérol, des acides gras libres et des phospholipides. Les triglycérides sont des esters triples d’acides gras et de glycérol. Bien que présents dans le sang, ils constituent avant tout une réserve énergétique. À ce titre, ils sont très abondants dans le tissu adipeux. Leur concentration dans le sérum est de 125 à 180 mg/100 mL. Le cholestérol est un dérivé d’un noyau de base à 4 cycles, le stérane (voir fig. 3.21). Il est synthétisé en grande partie dans le foie et apporté en moindres quantités par une alimentation équilibrée. Il entre dans la composition des membranes cellulaires et sert de précurseur aux hormones stéroïdes. Sa concentration normale dans le sang est d’environ 200 mg/100 mL. Les acides gras libres proviennent de l’hydrolyse des triglycérides, de certaines lipoprotéines (les chylomicrons) et du tissu adipeux. Leur concentration est relativement basse par rapport aux autres lipides. Leur taux s’abaisse après un repas et s’élève en cas de jeûne. Insolubles dans le plasma, les lipides sanguins doivent être associés à des complexes protéiques, les apoprotéines, donnant ainsi naissance à des macromolécules de forme sphérique : les lipoprotéines. Celles-ci sont réparties en plusieurs catégories selon leur densité et leur mobilité électrophorétique. On distingue les chylomicrons, les VLDL (Very Low Density Lipoprotein), les LDL (Low Density Lipoprotein) et les HDL (High Density Lipoprotein). Du cholestérol en proportions variables entre dans leur constitution. Douées de propriétés amphiphiles (à la fois hydrophiles et hydrophobes), les lipoprotéines participent à la stabilité physique de nombreux systèmes biologiques (ex. sang, lait) comme à celle de certains systèmes alimentaires (ex. émulsions). Ce sont des agents tensioactifs. Le plasma contient également des ions tels que le sodium, le potassium, le magnésium, le chlore, le calcium et autres. Des échanges d’ions se produisent continuellement entre le plasma, le liquide interstitiel et le cytoplasme cellulaire.

230

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Les ions sont nécessaires au métabolisme en quantités très précises. Il est très important que soit maintenu, à un niveau constant, le taux d’ions du plasma, ainsi que du liquide interstitiel et du cytoplasme qui sont en relation avec lui. C’est le rein qui se charge de la régulation de cet équilibre ionique en éliminant, selon les besoins de l’organisme, plus ou moins d’électrolytes dans l’urine.

9.4. VALORISATION DES PRODUITS SANGUINS Le sang est l’une des plus anciennes sources de protéines pharmaceutiques humaines. On entend par produit sanguin tout constituant isolé du sang total tel que : X globules rouges, X concentré de plaquettes, X plasma, X albumine, X facteurs de la coagulation, X hémoglobine. La valorisation du sang repose aujourd’hui essentiellement sur celle du plasma riche en protéines présentes en quantités très différentes, de l’ordre du μg/L pour les facteurs de coagulation au g/L pour l’albumine ; chacune possédant une fonction physiologique particulière (tab. 9.2). Tableau 9.2 - Composition protéique du plasma [mg/L] [d’après Huart J.J. & Burnouf T. : Le fractionnement plasmatique, STP Pharma Pratiques 2, 17-24, 1992, avec permission]

Protéine

Concentration [mg/L]

Protéine

Concentration [mg/L]

albumine

35 000 - 50 000

antithrombine III

IgG

8 000 - 18 000

inhibiteur de C-1 estérase

20 - 70

fibrinogène

2000 - 4500

facteur de von Willebrand

4-6

alpha-1-antitrypsine

1300 - 3000

facteur IX

3-7

IgA

900 - 4500

protéine C

3-7

*H.

600 - 2500

facteur VIII

0,1 - 0,2

220 - 390

Le plasma est obtenu à partir de dons de sang total ou par aphérèse (fig. 9.4). Dans le premier cas, le plasma est séparé des éléments figurés par centrifugation. Le plasma d’aphérèse est obtenu des opérations de plasmaphérèse au cours desquelles seul le plasma du donneur est conservé tandis que les autres composants du sang lui sont réinjectés. Le fractionnement du plasma humain permet l’isolement et la purification de certains constituants pour les utiliser dans le domaine thérapeutique et clinique. On parle alors de « NÏEJDBNFOUT
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volume de plasma fractionné au monde et le marché mondial des produits plasmatiques à plus de 6 milliards d’euros.

9 - LES PRODUITS SANGUINS

231

dons de sang centrifugation

plasmaphérèse dérivés cellulaires : - concentrés de globules rouges - concentrés de plaquettes pool de plasma

fractionnement physico-chimique

élimination / inactivation virale

médicaments dérivés du sang : - albumine - immunoglobulines - facteurs de la coagulation (F I, F VII, F VIII, F IX, F vW) - inhibiteurs de la coagulation (antithrombine III) - colle de fibrine

Figure 9.4 - Stratégie d’obtention des médicaments dérivés du sang Dans le domaine médical, le plasma ou ses dérivés sont utilisés : X pour corriger les déficiences, héréditaires ou acquises, en facteurs de la coagulation ; X pour augmenter la volémie (volume sanguin) et pour traiter les pertes de plasma provenant de brûlures (agents cicatrisants) ou d’hémorragies graves ; X pour produire des immunoglobulines (protéines spéciales, appartenant à la classe des gammaglobulines, et qui sont responsables de l’activité anticorps) utilisées pour traiter des maladies infectieuses et des troubles immunitaires ; X pour l’exsanguino-transfusion chez les nouveau-nés. -PCUFOUJPO
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 X la décongélation du plasma (cryoprécipitation), X les étapes d’isolement et de purification, X les étapes d’élimination/inactivation virale.

9.4.1. FRACTIONNEMENT DU PLASMA Le fractionnement consiste en une séparation des protéines plasmatiques et contribue à MB
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Les technologies actuelles s’appuient encore largement sur un procédé connu sous le nom de fractionnement de Cohn, (développé dans les années 1940 aux Etats-Unis puis en Europe) et combinant deux types de procédé (fig. 9.5) :

232

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

X précipitations

séquentielles à l’éthanol dilué (10-40 %), avec control précis du pH, de la température et de la force ionique et l’addition de certains ions métalliques bivalents, notamment Zn2+. Cette étape aboutit notamment à la séparation de l’albumine et des immunoglobulines. La température de travail (– 3 à – 6 °C) permet de limiter les phénomènes de dénaturation protéique ou d’agrégation. Aux concentrations utilisées, l’éthanol assure un effet bactériostatique et participe à l’élimination virale par précipitation des virus et par inactivation des virus enveloppés ce qui renforce l’effet des étapes d’inactivation virale ultérieures ; X cryoprécipitation qui consiste en la congélation du plasma à – 70 °C suivie d’une étape de décongélation à une température comprise entre 0 et 4 °C, ce qui permet d’isoler un cryoprécipité blanc utilisé pour la production des concentrés de facteurs VIII, XIII, Willebrand et de fibrinogène. Chaque produit est ensuite recongelé et conservé séparément pour une utilisation ultérieure. La cryoprécipitation possède un faible degré de purification et l’absence d’inactivation virale. plasma humain congélation à – 70 °C décongélation entre 2 et 4 °C

cryoprécipité

cryosurnageant précipitation : - éthanol dilué - température basse

concentrés de facteurs de coagulation (F VIII, fibrinogène, F vW, F XIII) complexe prothrombique

CP

F IX

AT

PC

surnageant

F VII

F XI

albumine précipité IgG

Figure 9.5 - Protocole général simplifié du fractionnement des protéines plasmatiques CP : complexe prothrombinique, AT : antithrombine, PC : protéine C, IgG : immunoglobulines

Il existe de nombreuses variantes des procédés de fractionnement utilisant, en général, les mêmes techniques que dans la méthode de Cohn mais dans des combinaisons difGÏSFOUFT
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est couramment utilisée dans les procédés de fabrication en Europe. Les protéines sont séparées suivant leur différence de solubilité dans des solutions éthanoliques par la mise en jeu de cinq paramètres : concentration d’éthanol (de 8 à 40 %), pH (entre 4,8 et 7,2),

9 - LES PRODUITS SANGUINS

233

concentration protéique (5,1 % au début et 0,8 % aux dernières étapes), force ionique (0,14 à  
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centrifugation ou filtration puis remis en solution afin de poursuivre sa purification. Certains procédés comprennent, en particulier, l’utilisation du polyéthylène glycol à la place ou en plus de l’alcool, dans certaines étapes. plasma précipitation : - éthanol 19 % - pH 5,85 - T = – 5 °C

surnageant précipitation : - éthanol 40 % - pH 5,9 - T = – 8 °C surnageant précipitation : - éthanol 40 % - pH 4,8 - T = – 8 °C

précipité précipitation : - éthanol 13 % - pH 5,1 - T = – 5 °C surnageant précipitation : - éthanol 25 % - pH 7,2 - T = – 7 °C

surnageant contenant l’albumine

précipité riche en immunoglobulines

albumine purifiée

immunoglobulines G

Figure 9.6 - Schéma général du fractionnement des protéines plasmatiques à l’éthanol selon Cohn (modifié par Kistler-Nitschmann) Dans la pratique courante, ces méthodes utilisées à grande échelle, donnent des protéines de pureté intermédiaire mais elles ont l’avantage d’être bien au point et de limiter les risques de contamination bactérienne, en plus de leur relative facilité de mise en œuvre et de leur coût économique intéressant. Par ailleurs, la présence d’autres protéines plasmatiques dans ces cryoprécipités est susceptible d’être responsable de réactions secondaires d’hypersensibilité, d’hémolyse ou de thrombopénie que les améliorations dans ce domaine tendent à éliminer totalement. "DUVFMMFNFOU
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à plusieurs étapes de purification par chromatographie après solubilisation du cryoprécipité, adsorption ou précipitation de contaminants, et étape(s) d’inactivation virale. Les perfectionnements apportés aux procédés de fractionnement ont profondément marqué cette classe thérapeutique et ont conduit à l’obtention de concentrés protéiques spécifiques de plus en plus purs, présentant une meilleure tolérance.

234

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

9.4.2. MÉTHODES DE PURIFICATION 9.4.2.1. TECHNIQUES DE CHROMATOGRAPHIE Les innovations récentes dans le domaine de la purification des protéines ont permis l’intégration de procédés chromatographiques sur divers supports aboutissant à l’élaboration de nouveaux produits thérapeutiques de haute pureté à partir des fractions intermédiaires obtenues avec le procédé classique. Les techniques chromatographiques utilisées ne doivent pas dénaturer la structure des protéines, ce qui pourrait les rendre non-fonctionnelles et/ou plus immunogènes. La chromatographie d’exclusion stérique (filtration sur gel), d’échange d’ions (séparation des protéines en fonction de leur différence de charge), d’immuno-affinité (rétention des protéines suivant leur affinité pour un ligand spécifique) et d’adsorption sont les méthodes les plus importantes dans ce domaine (voir tab. 9.3). Les méthodes chromatographiques ont l’avantage de permettre la purification des protéines plasmatiques grâce à une séparation sélective obtenue par le choix du support chromatographique et des caractéristiques des tampons d’élution (pH, force ionique…). Le facteur antihémophilique purifié par immuno-affinité est, à ce titre, un très bon exemple : il est près de 100 fois plus pure que le cryoprécipité utilisé autrefois.

Filtration sur gel La chromatographie par filtration sur gel (ou d'exclusion sérique ou moléculaire) repose sur un tamisage moléculaire c’est-à-dire une séparation de substances selon leur différence de taille moléculaire en fonction du diamètre des pores de la phase stationnaire. Celle-ci est constituée de petites billes de taille bien calibrée, percées d’un grand nombre de trous eux-mêmes bien calibrés. Elle peut être soit un gel d’agarose, de dextrane ou un gel synthétique d’acrylamide, soit un gel mixte acrylamide-agarose ou acrylamide-dextrane. La technique de filtration sur gel ne s’utilise que pour des purifications particulières lorsque les protéines sont globulaires et que leurs tailles sont très différentes.

Échange d’ions La chromatographie d’échange d’ions est fondée sur l’échange réversible et stoechiométrique entre les molécules ionisées d’un échantillon (dissous dans une solution tampon) et ceux d’un support chromatographique constitué d’une matrice insoluble portant en surface des groupements ionisables (soit positivement, soit négativement) associés à des ions échangeables qui assurent la neutralité électrique du support. Selon le pH, les protéines sont ionisées et se fixent ou non à la matrice en fonction de leur charge. Dans une deuxième étape, la protéine fixée est éluée sélectivement, soit par un gradient de force ionique, soit par un gradient de pH. Les principaux supports sont des polymères cellulosiques, acryliques, polysaccharidiques, à groupements anioniques ou cationiques. Parmi les supports chromatographiques mis au point pour une utilisation à grande échelle, HyperD est un échangeur d’anions fabriqué par BioSepra Biosystems (France) ; cet échangeur est composé d’un matériau inorganique à haute résistance mécanique dont les pores sont remplis d’un gel organique à haute capacité d’échange ionique.

9 - LES PRODUITS SANGUINS

235

Affinité Le principe de la séparation par chromatographie d’affinité repose sur les propriétés biologiques fonctionnelles de la molécule (protéine plasmatique, dans notre cas), c'est-àdire sa capacité à former un complexe réversible très spécifique avec une autre molécule appelée ligand. Ce dernier est spécifique de la substance que l’on cherche à isoler. Généralement de faible poids moléculaire, il est lui même greffé par liaison covalente sur une phase stationnaire inerte, appelée matrice. Par exemple, l’héparine immobilisée est le ligand le plus utilisé pour l’isolement de l’antithrombine III et le facteur IX ; les anticorps monoclonaux de souris pour les facteurs VIII et IX. Les chromatographies d’échange d’ions et d’affinité permettent, par leur grande sélectivité, d’aboutir à un produit final de très haute pureté et de plus assurent une certaine réduction virale.

Adsorption Le principe de ce type de chromatographie est basé sur l’adsorption sélective plus ou moins forte sur la surface d’une phase stationnaire solide active, de substances dissoutes dans une phase mobile liquide. Cette fixation est de nature électrostatique de type liaison faible (forces de Van der Waals, liaisons hydrogène), entre les phases solide et liquide, et les substances dissoutes (solutés). Son intensité repose sur les polarités relatives des molécules à séparer, de la phase stationnaire et de la phase mobile. Les différentes phases mobiles sont donc caractérisées par leur capacité de désorber plus ou moins fortement les molécules fixées.

9.4.2.2. PRÉCIPITATION PAR LES POLYÉTHYLÈNES GLYCOLS Les polyéthylènes glycols (PEG) sont des polymères hydrosolubles capables de précipiter les protéines selon leur taille. Agents de précipitation non-dénaturants, ils sont mis en œuvre pour repurifier une fraction obtenue par précipitation éthanolique ou par cryoprécipitation. La précipitation par le PEG a été utilisée avec succès pour un grand nombre de protéines. L’inconvénient majeur de ce précipitant est qu’il est difficile à séparer ensuite des solutions protéiques.

9.4.2.3. ULTRAFILTRATION Les éluats chromatographiques sont habituellement soumis à une ultrafiltration afin d’éliminer les composants de faible poids moléculaire (sels, alcools) et de permettre ainsi la concentration des solutions de protéines.

9.4.2.4. AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS Le niveau de purification des concentrés de facteurs VIII et vW obtenus après chromatographie est environ 200 fois plus élevé que celui des produits obtenus avant 1988.

236

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Depuis cette date, la production de concentrés plasmatiques de plus haute pureté a joué un grand rôle dans l’amélioration de la qualité et de l’espérance de vie des malades transfusés. Néanmoins, ces produits issus du sang ont été pendant longtemps responsables de contaminations virales car ils étaient obtenus à partir de mélanges de plasmas ; la présence d’un seul plasma infecté par un virus étant suffisante pour contaminer la totalité du mélange. En outre, des risques liés à la présence d’une quantité résiduelle d’anticorps monoclonaux (généralement murins) ayant servi de support, dans le produit final peuvent exister pour les préparations obtenues par chromatographies d’immuno-affinité. Ces anticorps pourraient générer des réactions allergiques chez certains patients lors de l’injection répétée du produit. Ceci a conduit, d’une part, au développement et la généralisation de la sélection médicale des donneurs, de techniques de dépistage génomique viral au niveau de la collecte du sang et à la mise en œuvre, au cours de la fabrication des produits, d’étapes supplémentaires et plus efficaces pour inactiver ou éliminer les virus, et d’autre part, dès le début des années 1990, à la production de facteurs de coagulation issus de recombinaison génétique dont l’efficacité est similaire à celle des médicaments d’origine plasmatique (voir section 9.4.3).

9.4.3. PRODUCTION DES MÉDICAMENTS D’ORIGINE SANGUINE (MDS) RECOMBINÉS

9.4.3.1. PRINCIPE En utilisant la technologie de l’ADN recombiné, des cellules animales peuvent être génétiquement modifiées pour produire une protéine recherchée dans des conditions spécifiques. De petits morceaux circulaires d’ADN (plasmides), sont utilisés pour insérer des gènes codant pour la protéine recherchée dans le génome d’organismes qui possèdent un autre caractère souhaitable, comme la capacité de se développer sur des milieux bons marchés. La protéine sera alors exprimée par les cellules de ces organismes recombinés. Bayer Pharma fut l’un des pionniers de cette avancée biotechnologique, avec les premiers essais thérapeutiques, dès 1988, du facteur VIII obtenu par recombinaison génétique de cellules de rein de bébé hamster et commercialisé sous le nom de Kogenate-Bayer®. La production des protéines par recombinaison génétique est une technique qui est actuellement bien maîtrisée et comporte les étapes suivantes, résumées dans la figure  9.7 : X les gènes humains codant pour les protéines des facteurs de la coagulation sont isolés au moyen d’enzymes de restriction ; X l’ADN complémentaire (ADN sans les introns) de la protéine recherchée est ensuite inséré dans un vecteur d’ADN (ex. plasmide bactérien) ; X DF
WFDUFVS
FTU
FOTVJUF
USBOTGFDUÏ
EBOT
EFT
DFMMVMFT
EF
.BNNJGÒSFT
DVMUJWÏFT
in vitro et bien caractérisées, qui assurent les modifications post-traductionnelles nécessaires à l’activité coagulante des protéines. Les bactéries et les levures ne sont pas capables de synthétiser des protéines fortement glycosylées et de grande taille. Les lignées cellulaires habituellement utilisées sont : Z des cellules d’ovaires de hamster chinois (Chinese Hamster Ovary ou CHO), Z des cellules de reins de bébé hamster (Baby Hamster Kidney
PV
#), 

9 - LES PRODUITS SANGUINS

237

X la

protéine recherchée et sécrétée (dite « recombinée ») par les lignées cellulaires modifiées est par la suite recueillie, puis purifiée par chromatographie d’immuno-affinité sur des colonnes d’anticorps monoclonaux spécifiques de souris. ADN humain isolement du gène d’intérêt gène codant pour la protéine recherchée transfection (via un vecteur d’ADN) cellules hôtes (CHO ou BHK) transfectées culture production de la protéine recherchée purification et isolement de la protéine élimination / inactivation virale protéine pure, stabilisée dans son milieu de conservation

Figure 9.7 - Les différentes phases de production des protéines recombinées

9.4.3.2. AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES MDS RECOMBINÉS Les médicaments obtenus par la voie recombinante ont le même effet thérapeutique que les protéines d’origine plasmatique. Ils ne remplacent pas toutes les protéines plasmatiques mais comportent les avantages suivants : X leur disponibilité n’est pas limitée par l’approvisionnement en plasma humain, issu généralement des dons de sang, ce qui diminue le risque de pénurie et permet d’envisager une production industrielle régulière à moindre coût ; X il n'y a pas de risques de contamination par des agents infectieux d’origine humaine tels que le VIH, les virus de l’hépatite et les parvovirus et donc de leur transmission ; X le produit final d’une très haute pureté conserve toute son activité physiologique. L’inconvénient principal réside dans le risque allergique dû à la présence d’anticorps murins utilisés pour la purification, et de traces de protéines de hamster et d’ADN dans le produit fini. Il existe 6 concentrés de 3 facteurs antihémophiliques d’origine recombinante : VIII : Recombinate® (Baxter), préparé sur cellules CHO et en cours de remplacement par l’Advate (sans albumine) ; Refacto® (Wyeth), délété d’une portion jugée inutile du gène, avant de transfecter les cellules ; Kogenate-Bayer® (Bayer) et Helixate Nexgen® "WFOUJT#FISJOH


QSÏQBSÏT
TVS
DFMMVMFT
#),
 X facteur IX : Benefix® (Baxter, Wyeth Pharmaceutiques), préparé sur cellules CHO ; X facteur VII activé (rFVIIa) : Novoseven¥
/PWPOPSEJTL


QSÏQBSÏ
TVS
DFMMVMFT
#), X facteurs

238

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

9.4.4. OBTENTION DES MÉDICAMENTS DÉRIVÉS DU SANG ET LEUR UTILISATION EN THÉRAPEUTIQUE

La stratégie adoptée pour l’obtention des médicaments dérivés du sang varie d’un produit à un autre (tab. 9.3). Leurs indications thérapeutiques sont répertoriées dans le tableau 9.4. Tableau 9.3 - Principaux produits plasmatiques utilisés dans le traitement des maladies hémorragiques et thrombotiques en France [d’après Voyer A. et al. : Hématologie 11(3), 189-200, © 2005, John Libbey Eurotext Ltd, avec permission]

Produit commercial (Fabricant)

Procédés de purification

Procédés spécifiques d’élimination et/ou d’inactivation virale

Conservation

F VIII

Factane® (Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, LFBBiomedicaments)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

nanofiltration et traitement par solvant-détergent

2-8 °C 30 mois, < 25 °C 6 mois ; à l’abri de la lumière

F VIII

chromatographie d’affinité avec antitraitement Hémophil M® (Baxter) corps monoclonaux, par solvant-détergent chromatographie d’échange d’ions

F IX

Betafact® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

F IX

Mononine® (Aventis Behring)

chromatographie d’affinité avec anticorps monoclonaux

ultrafiltration

2-8° C < 25 °C 1 mois

Wilfactin® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

nanofiltration à 35 nm et chauffage à sec à 80 °C pendant 72 h et solvant-détergent

< 25 °C 3 ans ; à l’abri de la lumière

Facteur

F vW

F vW + F VIII

Wilstart® (LFB)

chromatographie d’affinité, chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d'adsorption

2-8 °C 2 ans

2-8 °C 30 mois nanofiltration < 25 °C 6 mois ; et traitement à l’abri de la par solvant-détergent lumière

t

QPVS
MF
'̓W8
OBOPfiltration à 35 nm et chauffage à sec à 2-8 °C 30 mois, 80 °C pendant 72 h et < 25 °C 6 mois ; solvant-détergent à l’abri de la t

QPVS
MF
'̓7***
lumière nanofiltration et traitement par solvant-détergent

9 - LES PRODUITS SANGUINS

239

Facteur

Produit commercial (Fabricant)

Procédés de purification

Procédés spécifiques d’élimination et/ou d’inactivation virale

Conservation

fibrinogène

Clottagen® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

traitement par solvant-détergent

< 25 °C 3 ans ; à l’abri de la lumière

F VII

F VII-LFB® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

traitement par solvant-détergent

2-8 °C 2 ans ; à l’abri de la lumière

F XI

Hemoleven® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions

nanofiltration et traitement par solvant-détergent

2-8 °C 2 ans ; à l’abri de la lumière

F XIII

Fibrogammin® (Aventis Behring)

précipitations répétées

pasteurisation de 10 h à 60 °C

2-8 °C

PPSB

Kaskadil® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

traitement par solvant-détergent

< 25 °C 3 ans ; à l’abri de la lumière

Feiba® (Baxter)

chromatographies d’échange d’ions, précipitation à l’éthanol

traitement par la vapeur en 2 étapes (10 h à 60 °C et 190 mbar, puis 1 h à 80 °C et 370 mbar)

2-8 °C, < 30 °C 6 mois

protéine C

Protexel® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

solvant-détergent

2-8 °C 2 ans ; à l’abri de la lumière

protéine C

Ceprotin® (Baxter)

chromatographie d’affinité, chromatographie d'échange d’ions

solvant-détergent et traitement par la vapeur

2-8 °C 2 ans ; à l’abri de la lumière

Aclotine® (LFB)

chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’adsorption

pasteurisation

< 25 °C 2 ans ; à l’abri de la lumière

CCPA

AT

Le fibrinogène, destiné à l’usage clinique, est extrait du plasma humain par fractionnement éthanolique, purifié par chromatographie d’échange d’ions ou d’adsorption sur gel d’oxyde d’aluminium et inactivé par un traitement solvant-détergent (SD : méthode chimique d’inactivation des virus consistant à incuber le produit en présence d’un solvant organique puis d’éliminer le solvant-détergent par extraction).

240

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE Tableau 9.4 - Indications thérapeutiques des principaux produits plasmatiques

Produit plasmatique Utilisation en thérapeutique

fibrinogène

traitement curatif des hémorragies et traitement préventif en situation chirurgicale ou obstétricale dans les cas d’hypo- ou d’afibrinogénémies constitutionnelles, et de certaines formes de dysfibrinogénémies ou d’hypofibrinogénémies sévères acquises

facteur VII

traitement et prévention des accidents hémorragiques liés à un déficit isolé en facteur VII

facteur VIII

arrêt ou prévention des manifestations hémorragiques de l’hémophilie A, maladie caractérisée par un déficit congénital en F VIII

facteur IX

arrêt ou prévention des hémorragies lors d’accidents hémorragiques ou d’interventions chirurgicales chez les hémophiles B (déficients en F IX)

facteur XI

traitement des déficits congénitaux en F XI

facteur XIII

traitement prophylactique et curatif des exceptionnels déficits en F XIII

facteur de von Willebrand

correction des troubles de l’hémostase chez les patients atteints de la maladie de Willebrand (maladie hémorragique constitutionnelle due à un déficit en F vW)

complexe prothrombique

EÏöDJUT
BDRVJT
FO
'̓**
FU
9
RVJ
TPOU
EFT
GBDUFVST
WJUBNJOF
,EÏQFOEBOUT

concentré d’AT

déficits congénitaux ou acquis en AT

protéine C

prévention et traitement des thromboses chez le déficitaire en protéine C, en particulier dans le contexte chirurgical et obstétrical

albumine

l’albumine à 4 % est utilisée principalement dans les cas d’hypovolémie de la femme enceinte et de l’enfant au cours des échanges plasmatiques ainsi que dans le traitement des brûlés graves. L’albumine à 20 % est indiquée dans le cas d’hypoalbuminémie.

immunoglobulines

traitement substitutif des déficits de l’immunité humorale

Le facteur VII est extrait à partir du surnageant du cryoprécipité formé par congélationdécongélation du plasma humain. L’inactivation de ce produit est assurée par un mélange solvant-détergent qui détruit les virus et il est purifié par chromatographie d’échange d’ions. Le facteur VIII est préparé à partir de larges pools de plasma et purifiés par chromatographie échangeuse d’ions, d’affinité ou d’immuno-affinité. Ce dernier procédé a été adopté par la firme Baxter qui commercialise l’Hemofil M® et la firme Rhône Poulenc-Armour qui commercialise le Monoclate P®. À ces produits d’origine plasmatique, s’ajoutent ceux d’origine recombinante. Le facteur  IX est obtenu à partir du surnageant, après séparation du cryoprécipité du plasma humain par chromatographie d’échange d’ions, d’affinité sur héparine ou d’immuno-affinité par des anticorps monoclonaux de souris. Il subit ensuite un traitement

9 - LES PRODUITS SANGUINS

241

solvant-détergent suivi d’une nanofiltration. Un facteur IX recombinant est également commercialisé. Le facteur  XI est obtenu par fractionnement du plasma humain par cryoprécipitation, purifié par ultrafiltration et chromatographie d’adsorption puis inactivé par traitement solvant-détergent et par nanofiltration. Le facteur XIII est extrait par fractionnement du plasma humain par la méthode de Cohn, purifié par précipitation en présence de citrate de sodium et inactivé par pasteurisation en présence de sorbitol. Il est disponible commercialement sous forme lyophilisée ou en solution. Le facteur de von Willebrand est obtenu à partir du cryoprécipité, inactivé par traitement solvant-détergent et d’autres procédés comme la chromatographie d’échange d’ions et d’affinité associée à la nanofiltration qui élimine les agents infectieux. Le complexe prothrombique, un mélange des facteurs II, VII, IX et X, est obtenu par chromatographie d’adsorption ou d’échange d’ions du surnageant du cryoprécipité de Cohn puis inactivé par solvant-détergent. Le concentré d’AT humaine est obtenu après précipitation du plasma frais congelé, isolé par chromatographie ayant subi une inactivation virale par pasteurisation. La grande affinité de cette molécule pour l’héparine facilite son extraction : l’héparine greffée sur un gel d’agarose fixe l’AT qui est ultérieurement éluée à l’aide d’un gradient de force ionique. L’albumine est extraite par fractionnement du plasma humain par l’éthanol et pasteurisation à 60 °C pendant 10 h. La solution d’albumine, conservée à l’abri de la lumière, est stable pendant 3 ans à une température ne dépassant pas 25 °C. Elle est commercialisée sous deux concentrations : 4 % (solution iso-oncotique) et 20 % (solution concentrée). Les immunoglobulines sont obtenues par fractionnement du plasma par précipitations séquentielles à l’éthanol puis traitées par la pepsine, ramenées à pH  4 puis chromatographiées sur différents supports. Le contact avec l’éthanol, l’inactivation par traitement solvant-détergent et l’incubation à pH 4 concourent à l’inactivation de certains virus. La pepsine, bien qu’utilisée à une concentration très faible, par son activité protéolytique, accélère le processus d’inactivation virale. Les immunoglobulines thérapeutiques sont classées en deux catégories principales : X les immunoglobulines polyvalentes, provenant de pools de plasmas de plusieurs milliers de donneurs sains, X les immunoglobulines spécifiques, provenant de pools de plasmas de donneurs immunisés contre un antigène déterminé. Si la valorisation des produits sanguins a posé des problèmes au niveau mondial il y a une dizaine d’année, actuellement les conditions de prélèvements totalement maîtrisées dans de nombreux pays, et le développement de méthodes de contrôle plus fines des produits sanguins présentées dans les paragraphes précédents permettent de proposer mainUFOBOU
BVY
NBMBEFT
EFT
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NBKFVS
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MB
QSPEVDUJPO
FO
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développement de médicaments recombinés permet aux fabricants de s’affranchir du problème majeur de l’approvisionnement.

242

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

9.5. L'HÉMOGLOBINE EN BIOCHIMIE MÉDICALE L’hémoglobine (Hb), constituant essentiel des globules rouges, est une chromoprotéine porphyrinique composée de 2 parties : X un groupe prosthétique constitué de 4 molécules d’hème par molécule d’Hb, comportant chacune un ion ferreux (Fe2+) au centre ; X une partie protéique, tétramère formée de 4 chaînes polypeptidiques de globines identiques 2 à 2 : α, β, γ, δ, ε ou ζ. Chaque chaîne de globine est liée à 1 molécule d’hème. La masse moléculaire de l’Hb est de 64,4 kDa (HbA). Le sang contient normalement 130 à 170 g/L d’hémoglobine chez l'homme adulte et 120 à 160 g/L chez la femme. Cette protéine a pour principale fonction de transporter l’oxygène et le dioxyde de carbone dans le sang. Chacun des ions ferreux fixe une molécule d’O2 de façon réversible. Chaque molécule d’hémoglobine peut donc s’associer à 4 molécules d’oxygène pour former l’oxyhémoglobine dans les poumons où l’oxygène est abondant ; l’oxygène est ensuite libéré dans les tissus où il fait défaut. L’hémoglobine chargée de CO2, appelée carboxyhémoglobine, emprunte alors le chemin inverse. Environ 15 % du CO2 est transporté par cette voie. Le terme hémoglobine regroupe un ensemble de sous fractions et de dérivés (tab. 9.5) dont certains résultent de modifications post-traductionnelles, tels HbA1a, HbA1b, Hb1c. Tableau 9.5 - Hétérogénéité de l’hémoglobine glyquée HbA

Tétramère constituée de 2 chaînes α et 2 chaînes β(α2β2), qui représente 97 à 99 % de l’hémoglobine totale chez la plupart des individus adultes

HbA0

Composant majeur de l’HbA ; comprend des formes non-glyquées et des formes glyquées ailleurs que sur l’extrémité N-terminale des chaînes β (sites ne modifiant pas son pHi).

HbA1

HbA glyquée sur l’extrémité N-terminale des chaînes β (sites modifiant son pHi) quel que soit l’ose. Elle est divisée en 3 fractions mineures dites rapides (migration plus rapide en chromatographie d’échange d’ions ou en électrophorèse), désignées par une lettre minuscule en fonction de la molécule greffée sur la chaine polypeptidique et de leur ordre d’élution.

HbA1a

La molécule fixée par l’Hb est le fructose 1-6 diphosphate (HbA1a1) ou le glucose 6 phosphate (HbA1a2). Ces deux formes représentent en moyenne environ 0,5 % de l’hémoglobine.

HbA1b

La molécule fixée par l’Hb est le pyruvate, sur l’extrémité N-terminale des chaînes β de globine.

HbA1c

Hémoglobine glyquée sur l’extrémité N-terminale d’au moins une chaîne β, molécule combinée de façon permanente au glucose présent dans le sang, représente 4 à 6 % de l’hémoglobine totale.

HbA2

Représente 2,5 % de l’hémoglobine totale (α2δ2).

HbF

Hémoglobine fœtale, représente moins de 1 % de l’Hb totale (α2γ2). Cette proportion peut augmenter en cas de grossesse, d’anémie, de drépanocytose, de bêta-thalassémie ou dans certains cas de leucémie et disparaît graduellement après la naissance.

9 - LES PRODUITS SANGUINS

243

9.5.1. HÉMOGLOBINE GLYQUÉE L'hémoglobine glyquée caractérise toute fixation non-enzymatique d’oses simples sur l'hémoglobine. Ce processus, appelé « glycation », se distingue de la glycosylation qui est un mécanisme enzymatique de la biosynthèse protéique. Une augmentation du taux sanguin de sucre entraînera une élévation de l'hémoglobine glyquée HbA1c. HbA1c est formée par la fixation irréversible de glucose (ose le plus abondant chez l’homme) sur les fonctions amines d’au moins une des valines N-terminales des chaînes β de l’hémoglobine A par une liaison céto-amine (fig. 9.8). L’existence d’une multitude de formes glyquées de l’hémoglobine est due au fait que plusieurs fonctions sont susceptibles de fixer un ose (valines N-terminales des chaînes α et β, lysines non-terminales des chaînes α et β) et que d’autres oses que le glucose peuvent s’y fixer. La glycation est un processus physiologique lent, en deux étapes. La première étape est rapide et réversible et donne l’HbA1c labile ou Hb pré-A1c par condensation d'une fonction aldéhyde ou cétonique d'un ose avec un groupement aminé de la protéine et formation d’une base de Schiff avec une fonction aldimine. Celle-ci se réarrange lentement au cours de la deuxième étape (réarrangement d’Amadori) pour donner l’HbA1c stable par formation d’une liaison céto-amine (ou fructosamine) (fig. 9.8). Protéine

Protéine O + NH2

H

H

Protéine

N

H

C

C

NH C

H H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

CH2OH glucose + protéine

H2O

H

C

OH

HO

C

H

H

C

H

C

C

O

HO

C

H

OH

H

C

OH

OH

H

C

OH

CH2OH base de Schiff (forme instable)

CH2OH produit d'Amadori (forme stable)

Figure 9.8 - Formation de l'hémoglobine glyquée HbA1c La glycation affecte l'ensemble des protéines de l'organisme, circulantes et tissulaires, et conduit à des remaniements moléculaires, des altérations structurales et fonctionnelles des protéines ainsi que des mécanismes de maturation/vieillissement impliqués dans certaines pathologies. L’intensité de la glycation dépend principalement de deux facteurs : X la glycémie, X la durée de vie de la protéine.

244

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Puisque la quantité du complexe HbA1c est proportionnelle à la glycémie et étant donné que le glucose reste irréversiblement attaché à l’HbA1c pendant toute la durée de vie du globule (environ  3 à  4  mois), un test sanguin pour mesurer l’HbA1c reflète la glycémie moyenne d’une personne pendant cette période et il peut donc être utilisé comme mesure du contrôle glycémique à long terme afin d’ajuster la thérapeutique antidiabétique. Cependant, il ne dispense pas de la détermination pluriquotidienne des glycémies, particulièrement dans le cas du diabète de type 1 traité par l'insuline, dans lequel les glycémies observées sont extrêmement variables. L’HbA1c est ainsi devenue un marqueur biologique indispensable pour le suivi du patient diabétique en raison de sa durée de vie importante et de ses faibles variations intra-individuelles. Elle représente un indice rétrospectif et cumulatif de la glycémie moyenne des quatre à six semaines (jusqu’à trois mois) alors que la glycémie à jeun ou après prise de glucose (test de tolérance au glucose – TTG) apporte une information à un instant donné. Le dosage sanguin de l'hémoglobine glyquée doit être effectué 3 à 4 fois par an environ. La teneur en HbA1c s’exprime habituellement en pourcentage de l’hémoglobine totale chez les sujets homozygotes pour l’hémoglobine A. Les valeurs normales s'échelonnent de 3,5 à 6,25 % d'hémoglobine totale. Au cours du traitement, sa valeur doit être maintenue à une valeur inférieure à 7 %, correspondant à une glycémie moyenne de 1,47 g/L selon la formule de Nathan : glycémie moyenne estimée = 0,33 × HbA1c – 0,86 g/L. Quelques repères donnant l’équivalence entre l’ HbA1c et la glycémie moyenne : HbA1c 6 % équivaut à 1,2 g HbA1c 7 % équivaut à 1,5 g HbA1c 8 % équivaut à 1,8 g HbA1c 9 % équivaut à 2,1 g Une augmentation de 1% équivaut à + 0,3 g/L L'hémoglobine glyquée permet d'évaluer également les risques de développer à long terme des complications aussi bien micro- que macro-angiopathiques du diabète comme la rétinopathie ou la néphropathie, principalement. Un changement d’à peine 0,5 % ou 1 % peut avoir un effet majeur sur leur santé. Ainsi, une baisse de 1 % du taux d'hémoglobine glyquée diminue les risques : X d'infarctus : de 14 % ; X de maladies cardio-vasculaires : de 37 % ; X d'amputations : de 43 %. Sur la base d’études épidémiologiques de grande envergure faisant le lien entre le taux de glycémie et les complications dégénératives liées au diabète, les seuils diagnostiques de diabète (taux d'hémoglobine glyquée) ont pu être établis à : X diabète de type 2 traité par antidiabétiques oraux : inférieur à 6,5 % (ou 7% selon le type de traitement) ; X diabète de type 2 traité par insuline : inférieur à 7 % ; X diabète de type 2 du sujet très âgé : inférieur à 8 % ; X diabète de type 1 : compris entre 7 et 7,5 %.

9 - LES PRODUITS SANGUINS

245

Ces chiffres varient en fonction du type de diabète, du traitement, de l'âge et des complications.

9.5.2. MÉTHODES DE DOSAGE DE L’HÉMOGLOBINE GLYQUÉE L'intérêt suscité par le dosage de l’hémoglobine glyquée est à l'origine d'une multiplication des techniques adoptées. Les techniques actuelles de dosage peuvent être classées en deux groupes : X celles qui dosent spécifiquement l'HbA1c (ou éventuellement l'HbA1 dans son ensemble), basées soit sur la modification de la charge de l’Hb (plus grande électronégativité des Hb glyquées sur l’extrémité N-terminale des chaînes), soit sur des caractéristiques immuno-chimiques, X celles qui mesurent la glycation totale de la molécule, donc tous les sites glyqués sur les deux types de chaînes. La glycation de la fraction A1c étant proportionnelle à celle de l'Hb totale, l'application d'un facteur de correction permet à ce type de technique de fournir des résultats équivalents à ceux obtenus avec une technique de mesure spécifique de l'A1c. Les techniques permettant un dosage spécifique de l'HbA1c et utilisées en pratique courante sont essentiellement celles de la chromatographie dont des systèmes automatisés ont été introduits sur le marché, des techniques immunologiques et de l’électrophorèse. La chromatographie d’échange ionique utilise généralement des échangeurs cationiques faibles et des tampons de force ionique et/ou de pH différents. Cela permet la séparation des fractions glyquées de l'hémoglobine (charge plus négative que celle de l'HbA0 à pH neutre). La chromatographie d’affinité exploite le fait que les Hb glyquées ont une affinité pour les dérivés des acides boroniques et phénylboroniques, qui forment des complexes avec les groupements 1,2-cis diol engendrés par la fixation de molécules d’hexoses sur l’Hb. La chromatographie liquide haute performance (CLHP) tire avantage de l’automatisation quasi-complète mais cette méthode nécessite un lourd investissement en matériel. Cependant, la CLHP, couplée à la spectrométrie de masse est généralement considérée comme la méthode la plus performante. Les échantillons peuvent être prélevés dans des tubes contenant de l’héparine, de l’EDTA, du fluorure ou de l'oxalate. La chromatographie liquide basse pression (CLBP) est plus facile à utiliser et moins coûteuse que les systèmes CLHP. Les techniques automatisées par CLHP ou CLBP fournissent un diagramme d’élution qui permet d’évaluer l’HbA1c de façon spécifique par rapport aux autres Hb rapides et à l’HbA0 : un rapport entre les différentes fractions peut être obtenu par calcul de l’aire des pics d’élution. Elles permettent également la mise en évidence d’une mauvaise séparation éventuelle ou la détection d’une hémoglobine anormale. L’électrophorèse sépare des fractions selon leur charge sur un gel d'agarose et leur quantification s'effectue par densitométrie. C’est une technique simple qui permet le dosage

246

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

simultané de plusieurs échantillons. La principale interférence est liée au fait que cette technique ne permet pas de détecter les hémoglobines modifiées (comme l’hémoglobine carbamylée formée lors d’insuffisance rénale). Les techniques immunogéniques sont basées sur les caractéristiques immunologiques de l’Hb. Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques utilisés dans ces méthodes reconnaissent le peptide N-terminal des chaînes β glyquées. La longueur du peptide est variable selon les fabricants. Ces techniques ont subi un développement considérable qui a aboutit à une amélioration de la sensibilité et une très bonne spécificité. Les principales limitations sont liées à la présence de variants de l’hémoglobine. En outre, dans le cas de la présence d'une HbF ou d'une Hb anormale, la glycation de ces formes n'est pas reconnue. A l’échelle mondiale, les moyens mis en œuvre ne sont pas équivalents et varient en fonction des laboratoires. En particulier, la diversité des techniques, aussi bien dans leurs principes que dans leurs résultats, est souvent responsable de la variabilité inter-laboratoire des résultats et, par suite, de leur difficulté d’interprétation. Récemment, dans plusieurs pays, un processus de standardisation basé sur la première méthode de référence à avoir été utilisée, celle du DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) et sur des programmes de standardisation analogues a été engagé, visant la réduction des discordances importantes entre les résultats de l’hémoglobine glyquée, provenant de laboratoires différents. L’HbA1c est désormais un outil de diagnostic pour le diabète validé par les sociétés d’experts en diabétologie comme l'American Diabetes Association (ADA), l’Organisation Mondiale de la Santé
0.4


MB
Société Suisse d’Endocrinologie (SSED), le National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) et, plus récemment, l'International Federation of Clinical Chemistry (IFCC)). Il est actuellement recommandé d'utiliser systématiquement la méthode de référence IFCC ou, à défaut, fournir la corrélation des résultats à cette méthode pour corriger les valeurs brutes. La méthode  IFCC est transposable en accord avec la méthode DCCT/NGSP, à l’aide de la formule suivante : DCCT/NGSP = (0,915 × IFCC) + 2,15. Par ailleurs, l’HbA1c possède de nombreux avantages et caractéristiques intéressants mais aussi quelques limitations dans son utilisation que le clinicien se doit de tenir en compte pour l’interprétation de la valeur obtenue (tab. 9.6).

9 - LES PRODUITS SANGUINS

247

Tableau 9.6 - Avantages et inconvénients de l'utilisation de la mesure de l'hémoglobine glyquée (HbA1c) pour diagnostiquer le diabète sucré Avantages

Limitations

Ne nécessite pas de mise à jeun des Pas de corrélation au contrôle glycémique présent du patients patient HbA1c est plus étroitement associée à des complications chroniques du Plus coûteuse qu’une glycémie à jeun diabète que la glycémie à jeun

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que la glycémie à jeun

Toute condition qui diminue la durée de vie des globules rouges telle que les anémies hémolytiques, les saignements aigus ou chroniques, la transfusion sanguine, l’hémodialyse, la grossesse (pendant le premier trimestre), la splénomégalie, les hémoglobinopathies et la prise de certains médicaments comme la Ribavirine et des antiviraux, entraîne un abaissement de l’HbA1c indépendamment des valeurs de glycémies.

Faible variabilité biologique intra-individuelle

Les atteintes structurelles de l’hémoglobine et les thalassémies (HbS et C) influencent également les valeurs d’HbA1c, soit en les élevant, soit en les abaissant faussement en fonction du processus pathologique impliqué et la méthode de dosage utilisée.

Tout état favorisant une augmentation de la durée de vie des érythrocytes tel qu’une splénectomie ou une anémie Absence d’influence de l’apport nuaplastique, la carence en fer, touchant plus de 20 % des tritionnel de la veille ou de l’activité femmes réglées, pourraient altérer la structure de l’hémophysique pratiquée globine en rendant plus facile sa glycation et ainsi surestimer les résultats de l’HbA1c.

Possibilité d’être dosée à n’importe quel moment de la journée

D’autres situations telles que l’insuffisance rénale chronique (Hb carbamylée), l’éthylisme chronique, l’hypertriglycéridémie, l’hyperbilirubinémie, la prise abusive de vitamines C et E, de salicylés (Aspirine à haute dose), d’opiacés et la présence d’hémoglobine fœtale (Hbf) semblent faussement augmenter les valeurs d’HbA1c.

1

Pour des compléments d’information, voir Le sang artificiel, Les anticoagulants du futur et Une hémoglobine extraite des vers marins sur le site web dédié

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10 - LES PRODUITS LAITIERS 10.1. INTRODUCTION Le lait est un milieu aqueux caractérisé par trois phases en équilibre instable : une émulsion de globules lipidiques dans un liquide qui est lui-même une suspension colloïdale de matières protéiques (sous forme de micelles) dans un sérum (solution vraie). Ce lactosérum est une solution neutre qui contient principalement du lactose et du sodium mais aussi des protéines et des vitamines hydrosolubles. Globalement, le constituant principal du lait est l’eau avec 902 g/L alors que la matière sèche ne représente que 130 g/L (fig. 10.1). protéines 2,5 - 3,5 % lipides 3,9 %

minéraux 0,9 %

glucides 4,6 %

eau 87 %

Figure 10.1 - Composition globale du lait La production laitière mondiale provient pour près de 88 % du lait de vache. Le reste provient d’autres mammifères dont les bufflonnes, les brebis et les chèvres. Le lait ou certains de ses composants constituent la matière première d’un grand nombre de produits obtenus à l’aide de procédés variés, essentiellement de nature physique et/ou biochimique. La Fédération Internationale de Laiterie (FIL) rapporte que la production laitière totale a atteint 519 millions de tonnes en 2004. Les pays en tête de la production laitière sont toujours les pays de l’Union Européenne suivis de l’Amérique du Nord et de l’Asie.

10.2. OBTENTION ET TRAITEMENT DU LACTOSÉRUM Les quantités de lactosérum disponibles dans le monde sont considérables puisqu’elles représentent au moins 85-90 % du lait transformé en fromage. La composition de ce dérivé de l’industrie laitière varie avec son origine et son lieu de fabrication.

250

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Deux catégories de lactosérum peuvent être distinguées, en fonction de son acidité qui peut être inférieure ou supérieure à 1,8 g d’acide lactique par litre : X le lactosérum doux issu de la fabrication de fromages à pâte pressée ou à pâte molle, cuite ou non-cuite, obtenus par coagulation à la présure (solution contenant un mélange de 2 enzymes protéolytiques : la chymosine (80 %) et la pepsine (20 %), prélevées de la paroi de la caillette des jeunes veaux non-sevrés), ex. camembert, brie, bleu, emmenthal, saint-paulin, cheddar, gruyères… À part l’eau, il a la même composition que le lactosérum liquide. Ces lactosérums présentent un pH d’environ 6 à 6,7. X le lactosérum acide issu des autres fromages à pâtes fraîches obtenues par coagulation lactique ou mixte (par action conjointe de la présure et de l’acide lactique issu de la fermentation microbienne), ex. fromages blancs, petit suisse… Ces lactosérums présentent un pH de l’ordre de 4,2 à 4,5. D’une façon générale, les sérums acides contiennent moins de lactose et davantage de minéraux, notamment de calcium et de phosphore, du fait de la déminéralisation des caséines. Les protéines sont constituées principalement de protéines solubles ; dans les procédés de fabrication utilisant des températures élevées de pasteurisation, leur teneur diminue. Il existe de nombreuses utilisations possibles du lactosérum dans l’alimentation humaine et animale, mais sa teneur en eau élevée (94 %), sa forte minéralisation (10 à 20 % de l’extrait sec) et son altérabilité (c’est un bon milieu de culture), rendent difficile sa valorisation sous sa forme liquide. Le lactosérum est généralement filtré et centrifugé afin de récupérer les particules de caillé et la matière grasse, puis concentré ou déshydraté. Sa conservation nécessite de le traiter sans délais en le refroidissant vers 5 à 8 °C après, si possible, pasteurisation. Les méthodes de traitement du lactosérum sont variées et permettent d’obtenir de nombreux produits. Tous les types de lactosérum, déminéralisés ou non, peuvent être concentrés puis éventuellement déshydratés, sur rouleaux ou, mieux, par pulvérisation (procédé spray). La concentration du sérum avant déshydratation permet la cristallisation du lactose sous forme alfamonohydratée et, ainsi, l’obtention d’une poudre non-hygroscopique et peu collante. Selon la qualité du sérum mis en œuvre, il existe différentes variétés de concentrés ou de poudres : produits de sérum doux, de sérum acide, de sérum déminéralisé et de sérum délactosé. D’une façon générale, les sérums doux sont plus faciles à sécher, de meilleure qualité et offrent plus de débouchés.

10.3. FRACTIONNEMENT ET UTILISATION DU LACTOSÉRUM De nos jours, le lactosérum n’est plus considéré comme un déchet de l’industrie fromagère, mais plutôt comme un sous-produit qui contient de nombreux éléments protéiques bioactifs et qui trouve de nombreuses applications. Il est commercialisé sous forme de concentrés liquides, de poudres de produit brut, ou est fractionné pour obtenir des protéines destinées à des applications particulières.

10 - LES PRODUITS LAITIERS

251

Les poudres sont principalement utilisées dans les aliments d’allaitement pour veaux, chevreaux, agneaux. Elles sont également employées, de même que les concentrés liquides, en mélange avec d’autres aliments (hachis de paille, mélasses, drêches de brasserie, farines de soja), pour divers animaux d’élevage (bovins, porcs, volailles). En alimentation humaine, les sérums concentrés et en poudre ont des applications dans les produits à base de Céréales, où ils agissent à la fois comme renforçateur des farines FU
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la remplacer, au moins, en partie. Les poudres de lactosérum déminéralisé et de lactosérum sans lactose sont utilisées dans les aliments pour bébés, les aliments diététiques et les aliments dont le profil et la concentration en minéraux sont des attributs importants. Les sérums concentrés et en poudre sont aussi utilisés en mélange avec de la crème ou de la matière grasse butyrique ou végétale, des protéines et additifs divers (stabilisants, sucre, sel, arômes…) pour préparer divers produits crémeux, pâteux ou à tartiner. La qualité nutritive du lactosérum tient à la fois à la présence du lactose et des protéines sériques. Les procédés de fractionnement permettent d’obtenir, à partir du lactosérum, des fractions protéiques enrichies en certaines protéines.

10.4. PROTÉINES DU LAIT Les matières azotées, protides ou protéines du lait de vache constituent un ensemble complexe dont la teneur totale varie de 25 à 35 g/L. Ce taux est élevé en comparaison des quantités présentes dans le lait de femme (environ 12 g/L). Ces protéines peuvent être réparties en deux grandes fractions suite à leur précipitation en milieu acide à pH  4,6 (20 °C). La fraction des caséines coagule dans ces conditions tandis que les autres protéines restent solubles (protéines sériques ou protéines du lactosérum).

10.4.1. PROTÉINES NON-SOLUBLES Cette fraction est représentée principalement par les caséines. Ce sont des phosphoglycoprotéines constituant environ 75-80 % des protéines totales du lait de vache (contre 30 % dans le lait humain) et se trouvant sous forme de micelles. Les micelles sont des microparticules solides de phosphocaséinate de calcium d’un diamètre de 0,1 μm en suspension colloïdale. Elles sont composées de 4 fractions protéiques de types différents et dont les poids moléculaires s’étalent entre 19 000 et 31 000 : les 2 α-caséines (α 1 et α 2), la β-caséine et la κ-caséine, dénommées ainsi selon leur mobilité électrophorétique décroissante. Elles sont bien équilibrées, notamment en lysine mais déficientes en acides aminés soufrés en raison du faible taux de cystéine (0,4 %). Elles possèdent par contre d’excellentes propriétés fonctionnelles (émulsification, épaississement). D’autres formes de caséines sont dérivées de modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation, la glycosylation ou l’hydrolyse partielle (voir aussi chap. 2 Protides, section 2.3.3. Modifications post-traductionnelles).

252

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Les caséines sont, avec la matière grasse, les constituants du lait qui intéressent le plus le fromager car elles sont retenues de façon sélective au cours de la fabrication du fromage. Leur taux influe directement sur le rendement. En effet, ces protéines sont sensibles aux acides (ex. acide lactique) et aux enzymes coagulantes (ex. présure). Cette sensibilité est mise à profit en fabrication fromagère (obtention du caillé, première étape de l’élaboration de tout fromage) et en fabrication caséinière (obtention de la caillebotte, première étape de la production de caséine acide ou de caséine présure). Le développement des techniques de microfiltration et d’ultrafiltration permet maintenant : X l’extraction directe des caséines sous forme native, le phosphocaséinate de calcium (molécule de caséine associée à du phosphore et du calcium), X l’extraction sélective de la β-caséine et de la κ-caséine. La maîtrise de ces technologies ouvre de nouveaux horizons pour la valorisation des caséines du lait en raison de leurs propriétés fonctionnelles et nutritionnelles particulières. Leur hydrolyse, à l’aide de trypsine, donne naissance à des oligopeptides solubles et facilement assimilables dont certains fragments de la β-caséine ou de la κ-caséine sont doués de propriétés biologiques tout à fait remarquables. De plus, l’allergénicité éventuelle de la caséine est réduite.

10.4.1.1. PHOSPHOCASÉINATE DE CALCIUM Le phosphocaséinate natif présente un large éventail de propriétés fonctionnelles (viscosité, pouvoirs liant, moussant, émulsifiant) ; ses propriétés nutritionnelles sont également des plus intéressantes (ex. moindres réactions allergènes).

10.4.1.2. β-CASÉINE C’est une des 4 fractions protéiques constitutives de la caséine aux côtés des 2 α-caséines et de la κ-caséine. Par hydrolyse enzymatique à l’aide de la trypsine, on obtient, à partir de cet isolat, divers fragments peptidiques. Chacun d’eux a des propriétés biologiques particulières : activité morphinomimétique de la β-caséinomorphine, activité hypotensive, aptitude à fixer et à transporter des oligo-éléments minéraux tels que le calcium, le fer, le cuivre, le zinc… Ils entrent dans la formulation de préparations pharmaceutiques utilisées dans le traitement de l’ostéoporose et/ou dans la lutte contre les carences minérales de l’organisme.

10.4.1.3. κ-CASÉINE Elle joue un rôle stabilisateur de la micelle de caséine. Sous l’action des enzymes coagulantes (ex. présure), c’est celle qui, en tout premier lieu, est hydrolysée en deux parties : la para-caséine κ, hydrophobe et le caséino-glycopeptide, hydrophile. Cette coupure provoque la destabilisation des micelles de caséine ; la para-caséine participe à la gélification EV
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10 - LES PRODUITS LAITIERS

253

Cette activité antithrombotique est à l’origine actuellement de nombreuses recherches en vue de l’extraire et de le purifier.

10.4.1.4. CASÉINE ACIDE Ce type de caséine est obtenu industriellement par précipitation de la caséine du lait à l’aide d’acides minéraux (ex. acide chlorhydrique). L’opération se déroule entre 30 et 40 °C et au pH isoélectrique de la caséine (pHi = 4,6), pendant 2 h. Ce précipité est égoutté, lavé à l’eau pure, essoré puis centrifugé ou séché à l’air chaud. La caséine acide contient au minimum 90 % de protéines dans sa matière sèche totale et elle est pauvre en éléments minéraux (environ 2,5 %). Etant insoluble dans l’eau, son utilisation principale est la fabrication de caséinates. Elle est toutefois employée en l’état dans la production de fromages fondus et dans la composition de préparations diététiques et d’aliments infantiles. Elle trouve aussi quelques utilisations non-alimentaires : colles, peintures, plaques photographiques…

10.4.1.5. CASÉINATES Ces isolats sont obtenus par séchage de la caséine acide préalablement solubilisée dans de l’eau à pH 6,5 à 7, additionnée d’éléments alcalins (ex. sodium, calcium, ammonium, potassium…). Quel que soit l’alcali utilisé, tous les caséinates contiennent au minimum 88 % de protéines dans leur matière sèche totale mais leurs propriétés fonctionnelles et leurs adaptations à des utilisations nutritionnelles dépendent largement de l’alcali choisi. Ainsi, les caséinates de potassium, d’ammonium et de calcium sont plutôt adaptés aux besoins des industries pharmaceutiques et diététiques alors que les caséinates de sodium douées de propriétés épaississantes, émulsifiantes et moussantes sont appréciées par les industries agro-alimentaires de la salaisonnerie, des plats cuisinés, des sauces, des crèmes fouettées…

10.4.1.6. CASÉINE LACTIQUE Cet isolat est obtenu par précipitation de la caséine après acidification du lait par des bactéries lactiques sélectionnées qui lui sont ajoutées à des températures comprises entre 25 et 40 °C. Comme la caséine acide, la caséine lactique se caractérise par une pauvreté en éléments minéraux (2 à 3 % en matière sèche), notamment en phosphate de calcium.

10.4.1.7. CASÉINE PRÉSURE C’est une forme de caséine industrielle obtenue par coagulation de la κ-caséine du lait par action de la présure (enzyme coagulante) à 35 °C. Après brassage et égouttage, le coagulum est lavé ou non à l’eau pure, essoré puis séché. La caséine présure est dépourvue de la fraction κ, solubilisée sous l’action hydrolytique de la présure mais contient au minimum 84 % de protéines dans sa matière sèche totale, et plus de 7,5 % de sels minéraux (éléments phosphocalciques du lait). Cette teneur élevée en minéraux la rend plus facilement humidifiable que la caséine acide. Elle a des propriétés plastiques et une aptitude au filage ; ces propriétés en font un ingrédient texturant de premier choix pour diverses industries agro-alimentaires (charcuteries, viandes) et elles permettent son extrusion.

254

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

10.4.2. PROTÉINES SOLUBLES Bien qu’en faible quantité dans le sérum, où elles ne représentent qu’environ 13 % de la matière sèche, l’extraction des protéines sériques présente un grand intérêt en raison de leur excellente valeur nutritionnelle (contenant des acides aminés essentiels tels que la lysine, la méthionine et le tryptophane). Notamment leur utilisation est possible dans les domaines diététiques et thérapeutiques pour leurs effets physiologiques spécifiques sur le corps humain : immunomodulateurs, antiinflammatoires, antimicrobiens, antioxydants, et anticancéreux. De plus, grâce à leurs excellentes propriétés techno-fonctionnelles, elles ont un grand nombre de rôles spécifiques dans la texture de préparations alimentaires. Les applications des protéines sériques sont résumées dans le tableau 10.1. Les propriétés nutritionnelles et fonctionnelles recherchées de ces protéines peuvent être : digestibilité, richesse en acides aminés essentiels, solubilité dans une grande gamme de pH (boissons au lait, limonaderie), capacité à absorber et à fixer l’eau (pour la préparation et la conservation de plats cuisinés), aptitude à la gélification, propriétés émulsifiantes et moussantes (confiserie, nougaterie). Les protéines sériques sont également employées dans d’autres opérations de l’industrie agro-alimentaire, telles que la fabrication des potages lyophilisés, des fromages fondus, des crèmes glacées, des mousses de foie et la panification. Enfin, les protéines sériques conviennent particulièrement bien au développement des levures. Tableau 10.1 - Applications des protéines sériques en industrie alimentaire Domaines d’applications et produits Propriétés recherchées biscuiterie

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10 - LES PRODUITS LAITIERS

255

Le lactosérum est constitué de protéines qui sont divisées en deux groupes ; d’une part, les globulines avec principalement la β-lactoglobuline (β-Lg) et les immunoglobulines et d’autre part, les albumines avec l’ α-lactalbumine (α-La) et l’albumine sérique. Sur le plan quantitatif, la β-lactoglobuline et l’ α-lactalbumine sont les protéines majeures du lactosérum ; les autres protéines sont dites mineures. Contrairement à l’albumine sérique et aux immunoglobulines qui proviennent du compartiment sanguin, ces deux protéines sont synthétisées par la glande mammaire de la vache.

10.4.2.1. β-LACTOGLOBULINE (β-Lg) Caractéristique du lait des ruminants dont elle est la principale protéine soluble (50-55 % de la totalité des protéines du lactosérum bovin), la β-Lg est absente du lait humain. Insensible à l’action des acides (jusqu’à pH 2) et de la présure, elle se retrouve dans le lactosérum. Elle présente, en revanche, une sensibilité très élevée à la chaleur (réaction de Maillard 1) par qui elle est facilement dénaturée (floculation et précipitation). De ce fait, lors du chauffage, elle réagit avec d’autres protéines du lactosérum par le groupe -SH libre du résidu cystéine. Il est généralement admis que le comportement fonctionnel de l’ensemble des protéines sériques est, en grande partie, influencé par la prédominance de la β-Lg. Diverses propriétés biologiques ont été attribuées à cette protéine ou à ses peptides : inhibition de l’ACE (Angiotensin Converting Enzyme), activité antimicrobienne, effet hypocholestérolémiant, activité opioïde… Elle présente aussi la capacité d’interagir avec diverses petites molécules hydrophobes ce qui lui confère une fonction potentielle de transporteur moléculaire. Elle est utilisée en industrie agro-alimentaire (charcuterie, biscuiterie…) pour ses propriétés gélifiantes et moussantes proches de celles du blanc d’œuf.

10.4.2.2. IMMUNOGLOBULINES (Ig) Les Ig sont des glycoprotéines naturellement présentes dans le lait et surtout dans le colostrum (première sécrétion de la mamelle au cours des 7 jours suivant le vêlage). Elles se retrouvent dans le lactosérum où elles représentent environ 10 % des protéines totales. -F
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plus forte proportion (80 % des Ig totales). Les Ig ont pour principal rôle d’assurer la transmission de l’immunité passive de la mère au nouveau-né. Elles peuvent être extraites du lactosérum et purifiées par chromatographie d’échange d’ions et être utilisées dans la formulation de laits destinés à la prévention des nourrissons contre d’éventuelles infections intestinales.

10.4.2.3. α-LACTALBUMINE (α-La) Deuxième protéine soluble du lait, par ordre d’importance quantitative, puisqu’elle constitue environ 20 à 25 % des protéines sériques du lait bovin et plus de 40 % des protéines 1

Pour des compléments d’information, voir Les réactions de Maillard sur le site web dédié

256

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

du lait humain. C’est pourquoi elle entre dans des formulations de diététique spécifiques comme les laits maternisés ou des formules pour les adultes et sportifs qui bénéficient de sa grande richesse en tryptophane (4 résidus par mole) et en acides aminés soufrés. Elle entre également dans des préparations spéciales régulatrices du sommeil et de l’appétit ainsi que dans les formulations destinées aux personnes allergiques à la β-Lg du lait de vache. L’α-La présente la capacité de fixer le calcium de façon particulière, mais aussi le zinc et d’autres ions métalliques. Insensible aux acides et aux enzymes coagulantes (ex. présure), elle se trouve systématiquement dans le lactosérum. Toutefois, elle peut être isolée par précipitation par la chaleur en présence d’acides et de calcium.

10.4.2.4. ALBUMINE SÉRIQUE L’albumine sérique représente près de 7 % des protéines du lactosérum. On en trouve aussi, sous une forme extrêmement voisine, dans le sérum sanguin. Très riche en ponts disulfures (17 par molécule) qui assurent la stabilité de la chaîne polypeptidique unique, son poids moléculaire est d’environ 66 300. Grâce à la présence de liaisons réversibles, elle joue un rôle de transporteur de diverses molécules et ions. Elle est douée également de propriétés antioxydantes et immunostimulantes du fait de sa richesse en groupes glutamylcystéines (rares dans les protéines alimentaires) ; ce qui lui confère un rôle important dans la synthèse et l’activation du glutathion. Ce dernier est un tripeptide sulfuré résultant de l’union de l’acide glutamique avec la cystéine et la glycine et joue un rôle primordial dans les phénomènes biologiques d’oxydoréductions intracellulaires (antioxydant).

10.4.2.5. LACTOFERRINE (Lf) Cette glycoprotéine soluble est présente dans le lait de vache (environ 0,3 g/L) et dans le lait de femme (2  à 4 g/L). De structure très proche de la transferrine du sang, elle a, comme celle-ci, la capacité de fixer le fer (2 atomes de fer par molécule). Cette propriété lui confère une activité bactériostatique car, en fixant le fer disponible dans les aliments, elle prive les bactéries pathogènes de cet élément indispensable à leur développement. De plus, elle a des propriétés immunostimulante, antithrombotique, antiinflammatoire, bifidogène, et joue un rôle contre l’oxydation. Certaines propriétés biologiques sont dues à la lactoferricine (Lfc), un peptide issu de l’hydrolyse naturelle de la Lf par la pepsine lors de la digestion gastrique. La Lf peut être extraite, à partir du lait et/ou du lactosérum, par chromatographie d’échange d’ions, par filtration sur gel (CM-Sephadex), par chromatographie d’affinité (Cibachron Blue-Sepharose, Heparin-Agarose ou DNA-Agarose). Elle est le plus souvent obtenue avec la lactopéroxydase qui est l’enzyme la plus abondante du lait. Ce couple lactoferrine-lactopéroxydase est utilisé dans des produits de soins bucco-dentaires (ex. dentifrices) comme agent de protection de la cavité buccale et prévention de la plaque dentaire et de la gingivite, de « laits » cosmétologiques antiacné… L’activité bactériostatique de la Lf est mise à profit pour la formulation de laits infantiles.

10 - LES PRODUITS LAITIERS

257

10.4.2.6. LIPOPROTÉINE Cette molécule résulte de l’association d’une protéine avec un ou plusieurs corps gras (lipides) : c’est une hétéroprotéine (par opposition aux holoprotéines constituées uniquement d’acides aminés). Douées de propriétés amphiphiles (à la fois hydrophiles et hydrophobes), les lipoprotéines participent à la stabilité physique de nombreux systèmes biologiques (ex. sang, lait) comme à celle de certains systèmes alimentaires (ex. émulsions). Ce sont des agents tensioactifs. Des lipoprotéines peuvent être extraites du lactosérum et/ou du babeurre ; elles sont employées en tant qu’ingrédients alimentaires, en particulier pour leurs propriétés émulsifiantes. Elles trouvent aussi des utilisations en cosmétique.

10.4.2.7. LYSOZYME Cette protéine est dotée d’une activité enzymatique très spécifique qui lui permet d’hydrolyser les polysaccharides des parois des bactéries réagissant positivement à la coloration de Gram comme Clostridium butyricum qui peut contaminer le lait. Son action est moins nette sur les bactéries réagissant négativement à la réaction de Gram. L’hydrolyse porte sur la partie glucidique des peptidoglycanes des parois de ces bactéries au niveau des liaisons β-(1J 4) entre la N-acétylglucosamine (NAG) et l’acide N-acétylmuSBNJRVF
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N-acetylmuramyl hydrolase), ce qui entraîne leur solubilisation partielle, provoquant l’éclatement (lyse) et la mort des bactéries. site d’action du lysozyme CH2OH

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Figure 10.2 - Site d’action du lysozyme sur un polysaccharide NAG-NAM alternant En raison de ses vertus bactéricides, le lysozyme est utilisé dans la formulation de laits maternisés ainsi que dans l’industrie pharmaceutique comme principe actif de traitements contre les infections de la cavité buccale et du système respiratoire, ou encore, comme conservateur naturel dans un grand nombre de préparations alimentaires. Le lysozyme est présent dans le lait de vache (plusieurs dixièmes de mg/L) et le lait de femme (quelques centaines de mg/L). Les méthodes les plus utilisées pour son extraction sont la cristallisation et précipitation à l’aide de chlorure de sodium, la filtration par membranes, la chromatographie d’affinité et la chromatographie d’échange d’ions. C’est la première enzyme et la seconde

258

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

protéine (après la myoglobine) dont on a établi la structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons X. Le lysozyme est thermosensible et est très endommagé au cours de la pasteurisation.

10.4.3. PRODUITS COMMERCIAUX À BASE DE PROTÉINES DU LACTOSÉRUM L’introduction des techniques de séparation par membrane (ultrafiltration et microfiltration) et par chromatographie d’échange d’ions et de filtration sur gel est à l’origine de l’apparition sur le marché de produits enrichis en protéines du lactosérum. Ainsi, les protéines sériques sont actuellement commercialisées sous forme de « concentrés protéiques de lactosérum » (CPL), d’« isolats protéiques de lactosérum » (IPL) ou d’ « hydrolysats protéiques du lactosérum » (HPL). Les CPL sont généralement obtenus par ultrafiltration combinée à une ou plusieurs étapes de diafiltration, après extraction de l’eau. Ces procédés mènent à une diminution des minéraux et du lactose présents dans le lactosérum. Leur teneur en protéines varie entre 35 % et 85 % de la matière sèche. Les CPL peuvent être utilisés sous forme liquide, concentrée ou sèche. Les propriétés fonctionnelles des CPL dépendent des proportions respectives de leurs divers constituants et de leur état plus ou moins natif ou dénaturé, mais également de la nature et de la quantité des autres constituants présents (lactose, lipides, sels…). Tous ces facteurs dépendent eux-mêmes des techniques et procédés utilisés pour leur préparation (précipitation, ultrafiltration, chromatographie) et tout particulièrement de l’intensité des traitements thermiques utilisés. Les IPL sont des poudres hautement concentrées en protéines. Ils sont obtenus par chromatographie d’échange d’ions, suivie d’une ultrafiltration. Ces procédés entrainent l’élimination de la quasi-totalité du lactose et des lipides (< 1 %) ainsi qu’une diminution importante de la teneur en minéraux (2 %). La teneur des IPL en protéines peut être supérieure à 90 %. En raison des différences dans les procédés technologiques utilisés pour leur élaboration, les CPL et les IPL présentent des compositions en protéines différentes. Les HPL sont des mélanges de molécules de taille plus ou moins importante (polypeptides, oligopeptides, acides aminés) résultant de l’hydrolyse des protéines complexes par actions de protéases. La spécificité de ces dernières est le critère principalement utilisé en fonction du profil des peptides désirés. Les endoprotéases d’origine animale (ex. pepsine, trypsine, chymotrypsine, pancréatine), végétale (papaïne, broméline) et bactérienne (alcalase, neutrase) sont les enzymes les plus employées à l’échelle industrielle pour l’élaboration des hydrolysats protéiques. Les propriétés physico-chimiques des molécules libérées dépendent alors de leurs séquences en acides aminés. Au plan nutritionnel, l’hydrolysat présente des avantages certains par rapport aux protéines macromoléculaires dont il est issu. Etant beaucoup moins allergène et plus facilement assimilable, il sert très souvent à l’élaboration de préparations alimentaires destinées aux nourrissons (formule lactée hypoallergénique) allergiques aux protéines du lait

10 - LES PRODUITS LAITIERS

259

de vache, à des malades souffrant de troubles digestifs ou lors de résections intestinales (formule entérale) ainsi qu’à des sportifs (formule enrichie en acides aminés branchés). En raison de la présence de peptides bioactifs (antihypertenseurs, anxiolytiques…), l’hydrolysat trouve aussi des applications dans le secteur des nutraceutiques. Au plan des propriétés fonctionnelles, les hydrolysats présentent une amélioration de la solubilité et de la stabilité thermique des protéines, de même que des pouvoirs émulsifiants et moussants accrus mais leurs capacités gélifiantes sont atténuées sinon détruites.

10.5. LACTOSE Le sucre principal du lait est le lactose, disaccharide constitué par l’association d’une molécule de glucose et d’une molécule de galactose, d’où son nom systématique β-D-galactopyranosyl-(1-4)-α-D-glucose. Sa teneur est très stable entre 48 et 50 g/L dans le lait de vache, alors qu’on ne relève que 70 mg/L de glucose et 20 mg/L de galactose ainsi que des traces d’autres glucides. Le lactose a un faible pouvoir sucrant (indice glycémique = 0,3) comparé à ceux du saccharose (indice = 1) et du glucose (indice = 0,5). Le lactose est un sucre fermentescible. Il est dégradé en acide lactique par des bactéries lactiques (lactobacilles et streptocoques) ce qui provoque un abaissement du pH du lait entraînant sa coagulation; celle-ci est indispensable pour la fabrication de fromages et de laits fermentés. L’obtention du lactose se fait par évaporation du lactosérum, après extraction éventuelle de la matière grasse, des protéines et des sels minéraux, puis par cristallisation du lactose, séparation et séchage des cristaux. Il existe deux qualités principales de lactose : lactose alimentaire à 99 % minimum de lactose, X le lactose pharmaceutique (Codex) à 99,8 % minimum de lactose. X le

Le lactose pharmaceutique est surtout employé comme diluant ou excipient ; il présente sur le saccharose l’avantage de ne pas être hygroscopique. On l’utilise, par exemple, dans la préparation des comprimés et des poudres antibiotiques destinées à être appliquées sur les plaies (grâce à sa dissolution dans les liquides de la plaie, il permet la diffusion rapide de l’antibiotique). La richesse du lactosérum en lactose en fait un auxiliaire actif dans de nombreux autres domaines : en diététique, en industrie alimentaire comme substrat de fermentation, en charcuterie ou comme substrat de culture pour les bactéries lactiques, en confiserie dans la fabrication des chips et pommes de terre frites pour favoriser les réactions de brunissement, appréciées également en boulangerie, biscuiterie et pâtisserie, ou encore comme glucide à faible caractère sucré (sept fois moins sucrant que le saccharose). Il est aussi utilisé comme fixateur d’arômes et pour son pouvoir émulsifiant. Le lactose présente une solubilité limitée par rapport aux autres glucides ce qui restreint ses utilisations en alimentation. Lorsqu’il est présent en concentrations importantes, il donne au produit un goût « métallique » qui n’est pas très apprécié.

260

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Le lactose hydrolysé (dédoublement en glucose et en galactose) est généralement obtenu par voie enzymatique à l’aide de lactases 2. L’hydrolyse se fait soit par l’enzyme libre, soit par l’enzyme immobilisée sur divers supports ; ce dernier procédé étant le plus économique. L’hydrolyse du lactose ouvre de nouveaux et intéressants débouchés au lactosérum déminéralisé, notamment dans les desserts, les fabrications sucrées à base de farine, la confiserie, les crèmes glacées, la biscotterie, la biscuiterie, ainsi que dans l’alimentation animale.

2

pour des compléments d’information, voir L’intolérance au lactose, Le lait maternel et Les exo-polysaccharides des bactéries lactiques sur le site web dédié

11 - LES OVOPRODUITS 11.1. GÉNÉRALITÉS De tout temps, dans l’alimentation humaine, l’œuf a occupé et occupe encore une place indéniable tant sur le plan nutritionnel qu’économique. Grâce aux nouvelles données biochimiques et aux technologies innovantes du froid, de la physique et de la mécanique, une nouvelle filière industrielle a vu le jour, la production des « ovoproduits ». Le terme d’ovoproduits fait souvent référence à des produits obtenus par transformation d’œufs débarrassés de leurs coquilles et de leurs membranes ou de leurs différents composants isolés ou en mélanges, traités en vue de la préparation d’une variété de produits pouvant répondre à différents types de besoins nutritionnels et fonctionnels du consommateur. Ils peuvent être partiellement complétés par d’autres denrées ou additifs alimentaires. Les ovoproduits ont été créés pour répondre à la fois à un impératif de sécurité alimentaire et aux contraintes techniques des professionnels (industries agro-alimentaires, boulangeries et restauration industrielles…). La préparation et le traitement de ces produits inclut le cassage des œufs, leur filtration, leur mélange, leur stabilisation ; puis des techniques de conservation : la pasteurisation, la réfrigération, la surgélation ou le séchage et enfin le conditionnement. Les ovoproduits sont issus presque exclusivement des poules (Gallus domesticus). Ils incluent les œufs entiers, les blancs et les jaunes d’œuf et plusieurs mélanges avec ou sans autres ingrédients qui sont traités et pasteurisés et peuvent être disponibles sous différentes formes (liquide, concentrée ou séchée, cristallisée, congelée, surgelée ou coagulée). Plus de 30 % de la production annuelle mondiale est consommée sous forme d’ovoproduits liquides, en gels ou séchés, principalement par l’industrie agro-alimentaire comme ingrédients d’autres aliments, comme la mayonnaise et les crèmes glacées. Avec une production annuelle moyenne de 16 milliards d’œufs, la France assure environ 20 % de la production communautaire. Une part croissante de la production annuelle d’œufs est transformée par l’industrie des ovoproduits, soit environ 250 000 t équivalent œufs coquille. Cette filière industrielle s’attelle à mettre au point, fabriquer et distribuer de nouvelles présentations de l’œuf et de nouveaux produits dérivés à valeur ajoutée plus importante que celle du banal œuf en coquille. En dehors de sa valeur biologique élevée (riche en vitamines, minéraux et oligo-éléments) et de son utilisation courante en cuisine, l’œuf recèle également une mine de molécules aux propriétés fonctionnelles, sensorielles, nutritionnelles et biologiques très

262

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

intéressantes. Certaines pourraient avoir des applications en santé humaine en raison de leurs actions antibactériennes, antivirales, antiinflammatoires, antihypertensives ou antioxydantes.

11.2. STRUCTURE ET COMPOSITION DES ŒUFS 11.2.1. ŒUFS ENTIERS Les principales parties de l’œuf sont, de l’intérieur vers l’extérieur : le jaune d’œuf ou vitellus, le blanc ou albumen, les membranes (interne et externe) de la coquille et la coquille. Les proportions relatives de chacun de ces composants peuvent varier considérablement. Les valeurs moyennes pour un œuf de poule sont : coquille 9,5 %, blanc 61,5 %, jaune 29,0 %. Un œuf entier contient approximativement 66 % d’eau, 11 % de substances minérales et 23 % de substances organiques (12 % de protéines et 11 % de lipides) (fig. 11.1). substances minérales

protéines 17 %

lipides 32 - 35 %

eau 48 %

eau 88 % protéines 11 %

Figure 11.1 - Composition d’un œuf En dehors des protéines majeures qui seront décrites dans les paragraphes suivants, l’œuf renferme d’innombrables autres protéines inconnues ou encore insuffisamment étudiées. On doit donc s’attendre à de nouvelles avancées grâce aux innovations technologiques récentes, notamment dans le domaine de l’analyse du protéome. Par exemple, l’approche protéomique utilisant la spectrométrie de masse en tandem
4.4.
B
QFSmis de révéler l’existence de 520 protéines uniquement dans la coquille. Beaucoup de ces protéines existent également dans les autres parties de l’œuf.

11.2.2. COMPOSITION DU BLANC D’ŒUF Le blanc est constitué presque complètement d’eau et de protéines (fig. 11.1), avec quelques minéraux qui sont très exceptionnels pour un produit d’origine animale (90 % de la matière sèche est constituée de protéines) et très peu de glucides (glucose). Une quarantaine de protéines globulaires et une glycoprotéine sulfatée sont les principaux

11 - LES OVOPRODUITS

263

constituants du blanc d’œuf (voir tab. 11.1). Nombreuses sont les protéines connues pour leurs propriétés spécifiques, fonctionnelles et nutritionnelles : X ovalbumine : c’est une phosphoglycoprotéine de masse moléculaire d’environ 45 kDa et de pHi 4,5. C’est la plus abondante dans le blanc d’œuf où elle représente environ 54 % en poids des protéines totales. Elle renferme 1 % de phosphore et 2 à 3 % de glucides (mannose) ; X ovotransferrine (aussi connue sous le nom de conalbumine) : synthétisée au niveau de l’oviducte, cette glycoprotéine est ensuite déposée dans le blanc d’œuf où elle représente 12 % de ses protéines totales. C’est une glycoprotéine qui a la capacité de se complexer à des cations métalliques bi- et trivalents. À son pHi, cette molécule peut se lier à deux cations en prenant une couleur rouge (Fe3+) ou jaune (Cu2+). Ces complexes métalliques sont plus thermostables que la protéine dans son état natif ; X ovomucoïde : présente en proportions presqu’égales à la précédente (11 %), cette glycoprotéine est formée de quatre sous-unités et est douée d’une activité antitrypsique ; X ovomucine : c’est une glycoprotéine oligomérique sulfatée de haut poids moléculaire, représentant 2 à 4 % des protéines du blanc d’œuf. Elle existe sous deux formes, soluble et insoluble, composée chacune de deux sous-unités : α-ovomucine et β-ovomucine. Ces dernières renferment une partie glucidique qui représente 15 à 50 % de la molécule et ont une masse moléculaire respective de  18 et 400 kDa. Le rapport des molécules  α/β dans les formes insoluble et soluble est de 84/20 et 40/3, respectivement. Cette protéine est insoluble dans l’eau et soluble dans les solutions salines dont le pH est supérieur ou égal à 7 ; X ovoglobulines : sous ce terme, on désigne les ovoglobulines G2 et G3, qui représente environ 8 % (4 % chacune) des protéines du blanc d’œuf ; X ovomacroglobuline (aussi connue sous le nom de ovostatine) : constituée de 4 sous-unités ayant chacune une masse moléculaire de 175 kDa, réunies deux à deux par des ponts disulfures ; X ovoflavoprotéine, aussi connue sous le nom de flavoprotéine ou riboflavin binding protein (RBP), est une phosphoglycoprotéine globulaire monomérique qui se lie en équimolarité à la riboflavine (vitamine B2). Elle est facile à identifier par électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes (en présence de SDS) ; X lysozyme : c’est une holoprotéine de masse moléculaire voisine de 14,3 kDa et de pHi très élevé (10,7). Elle est présente dans le sang, le lait de vache (plusieurs dixièmes de mg/L), le lait de femme (quelques centaines de mg/L) mais c’est surtout le blanc d’œuf qui en est la source principale (3,5 % de ses protéines totales) ; X avidine : glycoprotéine tétramérique fortement basique dont la partie glucidique représente près de 10 % de la masse moléculaire. Sa teneur est proche de 0,05 % des protéines du blanc d’œuf. Le blanc d’œuf contient également des vitamines hydrosolubles en quantités notables comme la biotine, la niacine et la riboflavine. Par contre, on n’y trouve pas de vitamine C ou de vitamines liposolubles.

264

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

11.2.3. COMPOSITION DU JAUNE D’ŒUF Le jaune d’œuf (fig. 11.1) est composé d’environ 17 % de protéines et de 31,8  à  35,5 % de lipides (rapportés au poids de matière fraiche) sous forme d’une dispersion de particules dans une phase aqueuse ou plasma (fig. 11.2). Ces lipides sont souvent associés à au moins deux protéines, la vitelline et la vitellenine. Les composants du jaune d’œuf peuvent être ainsi séparés par centrifugation en deux fractions : les particules et le plasma qui représente 77 à 81 % du poids de matière sèche.

culot

jaune d’œuf de poule centrifugation 10 000 g / 30 min surnageant

granules

HDL

phosvitine LDL granulaire

plasma

LDL

livetines

Figure 11.2 - Fractionnement du jaune d’œuf Les particules sont de trois types : X la fraction LDL (Low-Density Lipoprotein) granulaire, représentée par des lipovitellenines (lipoprotéines), constitue près des 2/3 de la matière sèche totale du jaune d’œuf ; X la fraction HDL (High-Density Lipoprotein) qui représente près de 17 % de la matière sèche totale du jaune d’œuf. Elle comprend les α- et β-lipovitellines qui différent par leur composition en acides aminés. À pH inférieur à 7, elles se retrouvent sous forme de dimères ; X la phosvitine est une glycoprotéine hautement phosphorylée (10 % de phosphore) de 160-190 kDa qui représente 5 à 6 % du poids sec du jaune d’œuf ; les résidus de sérine dont plus de 90 % sont estérifiés par l’acide phosphorique y constituent 30 à 50 % des acides aminés totaux (soit environ 110 résidus phosphosérine). Elle existe sous deux formes, α- et β-phosvitine. Outre le phosphore, la molécule de phosvitine renferme des hexoses (2,5 %), de l’hexosamine (1 %) et de l’acide sialique (2 %). En raison de son caractère polyanionique, cette protéine est capable de former des complexes hautement hydrosolubles avec les ions Fe3+ et constitue, de ce fait, une réserve en fer (6 mg/g de phosvitine). La phase plasmatique contient deux principaux types de protéines ainsi que des traces d’autres protéines sériques : X les livetines (près de 10-15 %) sont des protéines globulaires issues des protéines du plasma sanguin de la poule et qui peuvent être séparées en trois groupes de masses moléculaires différentes (α, β et γ), dans les proportions 2/5/3, respectivement ; X la fraction LDL (ou lipovitellenines) contient 85  à  90 % des lipides du jaune d’œuf, majoritairement des triglycérides (74 %) et des phospholipides (26 %) ; le reste étant constitué de protéines. Cette fraction représente 80 à 85 % du plasma et plus des 2/3 du poids de matière sèche du jaune d’œuf. Les lipovitellenines peuvent être séparées en deux fractions LDL1 et LDL2 avec des masses moléculaires de 104 et 3.103 kDa,

11 - LES OVOPRODUITS

265

respectivement. Dans ces lipoprotéines, les protéines et les phospholipides sont situées à la surface d’une structure sphérique dont le noyau est constitué essentiellement de triglycérides et d’esters de cholestérol ; X la vitellenine a une composition en acides amines équilibrée, proche de celle de la vitelline, mais elle contient très peu de cystéine. Les enzymes du jaune d’œuf sont représentées principalement par la cholinestérase. D’autres enzymes y sont présentes, parmi lesquelles, des phosphatases et des protéases acides, la phosphatase alcaline, l’amylase, la cathepsine D, l’α-mannosidase… Les lipides du jaune d’œuf sont représentés principalement par les triglycérides (65-70 %) et par les phospholipides (25-30 %) dont plus de 70 % de phosphatidylcholine et 16 à 20 % de phosphatidyléthanolamine (fig. 11.3), de 3 à 5 % de cholestérol, de près de 2 % de sphingomyélines et de moins de 1 % d’acides gras libres. Les mono- et diglycérides peuvent représenter 1,5 à 2,2 % de la fraction lipidique. La teneur en cholestérol est d’environ 1,6 % de la matière sèche ; celle des caroténoïdes, moins de 1 %. O

O R1

O

R2

O

O O

O

P

+N

O

O– phosphatidylcholine

R1

O

R2

O O

O O

P

+NH

O

3

O– phosphatidyléthanolamine

Figure 11.3 - Structures des principaux phospholipides du jaune d’œuf R1 et R2 : acides gras

Les phospholipides sont plus riches en acides gras insaturés que les triglycérides mais la composition en acides gras de ces lipides peut varier suivant l’âge et l’alimentation de la volaille. Ainsi, la composition en acides gras polyinsaturés ω-6 et ω-3 à longue chaîne (C20 et C22) est de 20 à 25 % plus élevée dans les lipides du jaune d’œuf des poules jeunes. Le ratio ω-6/ω-3, approximativement 9/1, peut être modifié via la maîtrise de l’alimentation des poules pondeuses. Pour augmenter la concentration d‘acides gras  ω-3 dans les œufs, deux stratégies d’alimentation des poules sont habituellement utilisées. L’une d’elles consiste à nourrir les poules à l’aide d’un taux approprié de graines de lin ou d’huile de ces graines, aliments eux-mêmes riches en acides gras ω-3. La seconde consiste à ajouter de l’huile de poisson (hareng ou thon) au régime. De cette façon, le rapport ω-6/ω-3 pourrait être diminué pour atteindre le rapport idéal recommandé pour la nutrition humaine (6,5/1), et pourrait donc avoir des effets bénéfiques pour la santé. Comme nous l’avons déjà précédemment noté, les acides docosahexaénoïque (DHA, C22 : 6 ω-3) et éicosapentaénoïque (EPA, C20 : 5 ω-3) sont les principaux acides gras polyinsaturés ω-3, reconnus pour leurs effets bénéfiques sur la santé humaine : réduction de la triglycéridémie, de la pression sanguine, de l’agrégation plaquettaire et de la croissance tumorale. Ils sont également particulièrement utiles à la femme enceinte et allaitante vis-à-vis de la croissance de son enfant.

266

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Enfin, la fraction vitaminique du jaune d’œuf comprend principalement les vitamines A, D, E, l’acide pantothénique et, en moindre quantité, B12 et la niacine.

11.3. VALEUR NUTRITIONNELLE DE L’ŒUF L’œuf constitue un véritable « cocktail » très complet de nutriments, présents en quantités parfaitement équilibrées et facilement biodisponibles. C’est aussi une source importante d’oligo-éléments (dont le phosphore et le fer) et de vitamines (vitamines du groupe B, "
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ÏHBMFment quelques micronutriments, comme les caroténoïdes. En revanche c’est un aliment qui manque de glucides, de calcium et de vitamine C. D’un point de vue énergétique, un œuf de 60 g fournit de 85 à 90 kcal (355 à 375 kJ) pour un apport protéique de 6 à  7 g ; cet aliment représente donc un rapport calories/protéines faible, ce qui est intéressant. De plus, ses protéines sont prises comme référence grâce à leur équilibre en acides aminés indispensables.

11.3.1. VALEUR BIOLOGIQUE DES PROTÉINES L’œuf est une source importante de protéines, localisées principalement dans le blanc. Les protéines de l’œuf sont bien connues pour leur très haute valeur biologique qui résulte de la complémentarité entre les protéines du blanc et celle du jaune d’œuf ainsi que de leur équilibre en acides aminés dont des acides aminés essentiels qui sont en proportions idéales dans l’œuf. C’est pourquoi les protéines de l’œuf servent de référence pour les nutritionnistes. L’œuf est l’aliment qui se rapproche le plus de l’apport protéique idéal. Le coefficient d’utilisation digestive (qui exprime la digestibilité d’une protéine donnée, consommée par un organisme déterminé) des protéines de l’œuf cuit atteint 93,7 %, ce qui indique leur excellente efficacité. Les valeurs comparables sont celles des protéines du lait (84,5 %), du poisson (76 %), du bœuf (74,3 %) et du soja (72,8 %). À l’état cru, seulement 50 % des protéines du blanc sont digestibles à cause de la présence de facteurs antitrypsiques (ovomucoide) et du fait que le blanc d’œuf cru est faiblement stimulateur des sécrétions gastrique et pancréatique. La cuisson, en coagulant les protéines, facilite l’action des enzymes digestives, et permet l’utilisation de presque toutes les protéines. En outre, la cuisson détruit la liaison biotine-avidine. Par contre, le jaune d’œuf est très facilement digéré même à l’état cru et toute cuisson excessive réduit son utilisation digestive. De plus, les albumines sont douées de propriétés antibactériennes directes ou indirectes (activités antiprotéases, complexation de vitamines ou de métaux) qui contribuent à la bonne conservation des œufs. D’un point de vue économique, les protéines de l’œuf présentent l’avantage d’être les moins onéreuses du marché. Cependant, dans la plupart des pays industrialisés, l’apport des protéines d’œufs ne joue pas un rôle important car la prise journalière moyenne de protéines (76 g/j pour un adulte mâle, par exemple) dépasse celle recommandée (55 g). Certaines protéines d’œufs se sont avérées adéquates pour une utilisation commerciale en raison de leurs propriétés bioactives. Par exemple, le lysozyme du blanc d’œuf, aux

11 - LES OVOPRODUITS

267

propriétés antibiotiques, peut être utilisé pour lutter contre les infections. Un autre groupe important de substances est représenté par les immunoglobulines de jaune d’œuf. Doués également de propriétés antibiotiques, ces anticorps sont capables d’assurer une immunité passive contre beaucoup de pathogènes intestinaux chez l’homme.

11.3.2. DIGESTIBILITÉ DES LIPIDES Les lipides du jaune d’œuf sont hautement digestibles par les humains (entre 94 et 96 %) du fait de leur état émulsifié. Bien que riche en cholestérol (200 à 300 mg/œuf), l’œuf contient très peu d’acides gras saturés (un gros œuf en contient seulement 8,5 g, soit 34 % des acides gras totaux) et est très peu calorique (seulement 75 calories par œuf). Le jaune d’œuf contient des acides gras insaturés (environ 2/3 des acides gras totaux) dont les acides  ω-6 (linoléique, arachidonique) et les acides ω-3 (α-linolénique, DHA et EPA). Des études cliniques ont montré que la consommation d’œuf a très peu d’incidence sur la lipidémie et n’augmente pas l’athérogénicité des particules de LDL.

11.3.3. MINÉRAUX ET VITAMINES Avec le lait, l’œuf est l’aliment le plus riche en phosphore assimilable alors qu’il ne fournit qu’une petite quantité de calcium par rapport aux besoins d’un être humain. Une autre caractéristique nutritionnelle intéressante du jaune d’œuf est sa haute teneur en fer, puisqu’un œuf peut satisfaire 30 % des besoins journaliers d’une personne en cet élément. Quand la ration alimentaire des poules est bien équilibrée, l’œuf est une source importante de vitamines. Un œuf couvre 10 et 15 % des besoins journaliers d’une personne en vitamines A et D (le jaune d’œuf est l’un des rares aliments contenant la vitamine  D à l’état naturel). Il fournit également environ 5 à 10 % des besoins en vitamine B1 et 20 % en vitamines B2 et B5 ainsi que la totalité des besoins en biotine (B8). La cuisson (plus de 5 min) peut provoquer une certaine perte en vitamine A (plus de 30 %), en vitamine B1 et d’avantage en acide folique (plus de 50 %).

11.4. PROPRIÉTÉS FONCTIONNELLES Les œufs et les ovoproduits ont été toujours utilisés en industrie alimentaire pour leur valeur nutritionnelle mais aussi pour leurs propriétés fonctionnelles (moussantes, émulsifiantes, coagulantes, gélifiantes…) qui en font des ingrédients indispensables dans de nombreux processus d’élaboration d’aliments.

11.4.1. PROPRIÉTÉS AROMATIQUES ET COLORANTES L’œuf entier et, particulièrement le jaune, possède une très forte flaveur caractéristique dont les constituants responsables sont liés aux lipides. La couleur du jaune d’œuf détermine l’attraction et l’appétence du consommateur pour ce produit. La couleur du vitellus est due à sa richesse en caroténoïdes liposolubles, principalement des xanthophylles (lutéine, zéaxanthine et β-cryptoxanthine, fig. 11.4) ainsi que des quantités

268

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

mineures de β-carotène. Ces caroténoïdes ne sont pas synthétisés par la poule mais proviennent de son alimentation. OH

lutéine

HO

OH

HO

zéaxanthine

HO

  β-cryptoxanthine

Figure 11.4 - Structures chimiques des xanthophylles du jaune d’œuf

11.4.2. COAGULATION ET GÉLIFICATION Les protéines de l’œuf sont responsables de la coagulation qui se produit sous l’action d’agents physiques (chaleur) ou chimiques. L’œuf se transforme d’un état fluide à un état solide appelé coagulum. La coagulation thermique se produit à partir de 62 °C dans le cas du blanc et à partir de 65 °C dans le cas du jaune d’œuf. Les principales protéines du blanc (ovalbumine et ovotransferrine) possèdent de bonnes propriétés gélifiantes. L’ovomucoïde seule ne coagule pas. Les protéines du jaune sont aussi sujettes à la coagulation thermique à l’exception des livetines et de la phosvitine. Le sel et le saccharose empêchent la dénaturation par la chaleur ce qui permet d’augmenter la température de pasteurisation de 6 et 3 °C respectivement. Cependant, ils augmentent aussi la résistance des micro-organismes. Cet effet protecteur peut être expliqué par la réduction de la teneur en eau libre, disponible dans la phase soluble. Le temps de gélification du blanc d’œuf est comparable quel que soit son état : frais, congelé ou en poudre. Cependant, les gels de blancs d’œuf obtenus à partir de poudres sont plus fermes que ceux obtenus avec les autres formes de blanc. Les propriétés gélifiantes du jaune sont associées aux lipoprotéines. Les LDLs sont dénaturées à partir de 60 °C, perdent leur fluidité à 65 °C et forment un gel à 85 °C. Le gel obtenu est plus stable que le gel de l’ovalbumine bovine ou de la sérumalbumine préparée dans les mêmes conditions. Contrairement à ces deux protéines, les lipovitellénines (LDL) produisent des gels qui sont stables entre pH 4 et pH 9. Les modifications de leurs propriétés fonctionnelles après congélation-décongélation sont minimes et sont principalement associées à une augmentation de la viscosité. Les premiers constituants du jaune d’œuf affectés par la congélation sont les LDLs et la gélification à froid du jaune est due aux interactions protéine-protéine suivant la rupture des lipoprotéines.

11 - LES OVOPRODUITS

269

11.4.3. PROPRIÉTÉS ÉMULSIFIANTES La viscosité élevée du jaune d’œuf génère des émulsions ayant une bonne stabilité. L’addition du blanc d’œuf au jaune réduit la stabilité de l’émulsion formée. Cet effet est lié essentiellement à une diminution de la viscosité. Cette observation est importante, puisque le jaune d’œuf industriel peut contenir parfois jusqu’à 20 % de blanc d’œuf. La pasteurisation, la congélation et la concentration n’affectent que très peu les propriétés émulsifiantes. La capacité émulsifiante des œufs entiers dépend de la nature du produit ; elle est considérablement plus élevée dans le cas de l’œuf frais que dans le cas d’un œuf en poudre. Les propriétés émulsifiantes des blancs d’œuf en poudre sont liées au pH du produit. Dans le cas des blancs d’œuf frais, elles sont beaucoup plus élevées que dans le cas des poudres. Notons aussi que la capacité émulsifiante des jaunes d’œuf en poudre est nettement inférieure à celle des jaunes d’œuf frais. En revanche, la stabilité des émulsions de jaune d’œuf, obtenues à partir de poudres est plus élevée que celle obtenue avec les œufs frais. Les propriétés hautement émulsifiantes du jaune d’œuf sont attribuées aux phospholipides et, en particulier, aux lécithines présentes sous forme de complexes de lipoprotéines. Les livetines et les lipovitellines agissent comme agents tensioactifs en facilitant la formation d’émulsions, tandis que les LDLs contribuent à leur stabilité. La dénaturation des LDLs par la chaleur réduit l’activité émulsifiante et la stabilité de l’émulsion.

11.4.4. PROPRIÉTÉS MOUSSANTES Une propriété intéressante du blanc d’œuf est sa capacité moussante. Celle-ci est nettement plus élevée dans le cas du blanc d’œuf en poudre que celle du blanc d’œuf frais ou congelé. L’ovomucine, les globulines et l’ovalbumine sont les principales protéines responsables de cette capacité moussante. Les protéines du blanc d’œuf présentent une capacité moussante maximale aussi bien à leur pH physiologique (pH 8 à 9) qu’à pH voisin de leur pHi (4 à 5). Les ions Ca2+ améliorent la stabilité par formation de ponts entre les groupements carboxyliques des protéines.

11.4.5. AUTRES PROPRIÉTÉS FONCTIONNELLES Le blanc d’œuf et, dans une certaine mesure, le jaune possèdent d’excellentes propriétés de liaison, de rétention d’eau et de lipides et des propriétés d’adhésion. La capacité remarquable des constituants du blanc d’œuf à fixer des minéraux peut être exploitée dans un but nutritionnel.

11.5. UTILISATIONS Les ovoproduits sont largement utilisés en industrie alimentaire pour leurs propriétés fonctionnelles exceptionnelles. Bien qu’il existe d’autres protéines liantes, parfois moins chères (lait, sang, soja, par exemple), les excellentes propriétés moussantes et coagulantes

270

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

du blanc et les propriétés émulsifiantes du jaune d’œuf leur confèrent des avantages dans de nombreuses préparations alimentaires, qu’elles soient familiales, artisanales ou industrielles.

11.5.1. UTILISATION DES OVOPRODUITS COMME INGRÉDIENTS ALIMENTAIRES Sous formes liquides, concentrées, déshydratées, congelés ou en poudre (lyophilisées), les ovoproduits trouvent leur utilisation dans l’élaboration de nombreux types de produits : X omelettes surgelées ou déshydratées, X œufs précuits pour salades aux œufs et apéritifs, X sauces aux œufs, X ketchup aux œufs, X boissons (jus d’orange mélangé à des œufs entiers liquides), X œufs ébouillantés recouverts de sauce de viande, X yoghurts aux blancs d’œufs…

11.5.2. MOLÉCULES BIOACTIVES D’INTÉRÊT TECHNOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE

Par des techniques de fractionnement, certaines protéines du blanc et du jaune d’œuf douées de propriétés biologiques peuvent être purifiées et utilisées dans diverses applications.

11.5.2.1. SÉPARATION ET FRACTIONNEMENT La qualité de la séparation du jaune d’œuf dépend beaucoup de l’état de fraîcheur et des conditions de conservation des œufs qui déterminent à leur tour les propriétés fonctionnelles des ovoproduits obtenus. Par exemple, la migration du jaune dans le blanc d’œuf affecte la capacité moussante de ce dernier. Les principales techniques utilisées pour l’extraction des protéines d’œuf pour des utilisations commerciales sont : X techniques chromatographiques : Z échange d’ions pour l’extraction de l’avidine, des flavoprotéines, des ovoglobulines et du lysozyme ; Z chromatographie d’affinité utilisée pour extraire les protéines qui présentent une activité biologique telle que l’avidine, la flavoprotéine et l’ovotransferrine ; Z filtration sur gel utilisée comme étape préparatoire dans la séparation de l’ovomucine. X techniques de précipitation par : Z réduction ou augmentation de la force ionique, par exemple, pour préparer l’ovomucine, ou pour précipiter le lysozyme à l’aide du NaCl ; Z sulphate d’ammonium, pour séparer les protéines telles que l’ovalbumine et l’ovomucoïde.

11 - LES OVOPRODUITS

271

11.5.2.2. EXTRAITS DU BLANC D’ŒUF C’est le blanc d’œuf qui concentre les principales protéines douées de propriétés bioactives (tab. 11.1). X L’ovalbumine : ses propriétés fonctionnelles élevées (pouvoirs gélifiant et moussant) en font un ingrédient alimentaire très recherché. Ces excellentes propriétés sont liées au fait que sa dénaturation se produit très facilement (par simple chauffage vers 60 °C ou un simple fouettage mécanique). Cette dénaturation modifie sa structure et accentue ses capacités d’absorption et d’adsorption. X Le lysozyme : déjà traité dans la Partie III, Chap. 10 Produits laitiers. X L’ovotransferrine : ses propriétés chélatantes lui permettent de transporter des ions ferriques (2 ions Fe3+ par molécule) au sein de l’organisme. Cette propriété lui confère une activité antimicrobienne vis-à-vis de différentes bactéries Gram+ et Gram– en les privant du fer nécessaire à leur croissance. Sous forme chélatée, elle résiste à la dénaturation par la chaleur. Sa purification repose essentiellement sur l’utilisation de la chromatographie d’échange d’ions. X L’ovomucine présente une activité antihémagglutinante prouvée contre de nombreux virus. Elle est facilement isolée par précipitation isoélectrique. Elle peut être également isolée par filtration sur gel, chromatographie d’affinité ou chromatographie d’échange d’ions. X La flavoprotéine véhicule la riboflavine, essentielle au développement embryonnaire. Cette capacité de fixation de la riboflavine disparaît à un pH inférieur à 4,2. X -BWJEJOF
TF
MJF
BWFD
VOF
USÒT
HSBOEF
BóOJUÏ
,d = 1,3.10 –15
.
Ë
Q)̓  
Ë
MB
CJPUJOF
FU
empêche son absorption au niveau de l’intestin. Elle fixe 4 molécules de biotine (une par sous-unités). Les résidus glucidiques ne sont pas nécessaires à cette liaison. La biotine est une vitamine essentielle dans le régime alimentaire. Elle se trouve dans beaucoup d’aliments et est synthétisée par la flore intestinale. La carence en biotine est rare, mais elle peut être causée quelquefois par une consommation excessive d’œufs crus. L’avidine libre, de même que le complexe avidine-biotine, résistent à la protéolyse. Il s’en suit que lors de la consommation d’œufs crus, la biotine ne peut pas être libérée de l’avidine dans le tractus gastro-intestinal. La forte interaction entre ces molécules ainsi que l’absence d’interaction entre, d’une part la chaîne latérale portant le groupement carboxylique de la biotine et, d’autre part l’avidine, est exploitée dans de nombreuses techniques de purification biochimiques (chromatographie d’affinité), de diagnostic médical très sensibles comme l’imagerie médicale appliquée aux cellules cancéreuses, les tests ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent assay) et des biocapteurs. Des protéines, des anticorps, des enzymes, des fluorophores ou des réactifs spécifiques à certains groupements susceptibles de se lier à la biotine peuvent être isolés par chromatographie d’affinité en utilisant un support (ex. agarose) auquel est greffé l’avidine. Ces molécules sont alors éluées de la colonne par apport de biotine libre en excès ou par abaissement du pH de la phase mobile afin de diminuer l’interaction de l’avidine pour la biotine.

272

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE Tableau 11.1 - Principales protéines du blanc d’oeuf et leurs propriétés biologiques et fonctionnelles

[Tableau composé d’après les données de : Li-Chan E.C.Y. et al., 1995 (masses moléculaires des oligomères) ; Réhault S. et al., 2007 ; This H., 2008 (pourcentage massique)]

Protéine

% de la MS Nature

MM [kDa]

PHi

Propriétés

ovalbumine

58

phosphoglycoprotéine (1 % de phosphore et 2-3 % de glucides)

45

4,5

t
HÏMJöBOUF
FU
NPVTTBOUF t
UIFSNPTFOTJCMF

ovotransferrine

13

glycoprotéine

76

6,6

t
DIÏMBUF
'F2+, Cu2+, Zn2+… t
BOUJNJDSPCJFOOF

ovomucoïde

11

glycoprotéine tétramère

28

4

ovoglobulines

8

glycoprotéines

lysozyme

3,5

hydrolase

ovomucine

1,5

glycoprotéine sulfatée dimérique

t

JOIJCF
MB
USZQTJOF
FU
MF
chymotrypsinogène

5,5-5,8 t
NPVTTBOUF 14,3

10,7

5500-8300

4,5

t

CBDUÏSJDJEF
CBDUÏSJFT
Gram+) t
UIFSNPTFOTJCMF t

SFTQPOTBCMF
EF la viscosité du blanc t

JOIJCF
MFT
IÏNBHMVUJ nations virales

t
ȺPWPNVDJOF

10 % de glucides

t
ȻPWPNVDJOF

50 % de glucides

ovomacroglobuline

globuline tétramère

769

4,5

t
BOUJIÏNBHMVUJOBOUF
t
BOUJDPMMBHÏOBTF
t
BOUJQSPÏPMZUJRVF

0,8

phosphoglycoprotéine

32

4,1

t
öYF
MB
SJCPøBWJOF

0,05

glycoprotéine tétramère (partie glucidique 10 %)

68,3

9,5

t

USÒT
HSBOEF
BóOJUÏ
QPVS
la biotine t
BOUJNJDSPCJFOOF
t
BTTF[
UIFSNPTUBCMF

holoprotéine

12,7

_
 

ovoflavoprotéine (RBP)

avidine

ovocystatine

t

JOIJCJUFVS
EF protéases à cystéine t
BOUJNJDSPCJFOOF

Du fait de sa nature glycoprotéique et de son état ionisé (pHi  =  10,5), l’avidine est susceptible de se lier à d’autres molécules chargées négativement, contrairement à une protéine analogue produite par Streptomyces avidinii, la streptavidine qui est une holoprotéine dont le pHi est égal à 6,0 et qui est donc plus spécifique avec une affinité similaire. De plus, la réactivité de certaines substances avec la biotine (biotinylation) est dépendante du pH qui peut ne pas être favorable à l’avidine, ce qui limite son utilisation dans ces conditions. Des avidines modifiées sont actuellement disponibles dans le commerce comme NeutraLite® (commercialisée par Belovo Chemicals, Belgique) qui

11 - LES OVOPRODUITS

273

est une avidine déglycosylée afin de réduire son pHi à une valeur neutre sans modifier ses propriétés de liaison et sans altérer les résidus lysines nécessaires aux réactions de dérivatisation. X Les antiprotéases : plusieurs antiprotéases ont été identifiées dans le blanc d’œuf dont l’ovomucoïde, l’ovoinhibiteur, l’ovostatine, l’ovocystatine et l’ovomacroglobline. De par leur activité inhibitrice des protéases microbiennes, les antiprotéases représentent une génération prometteuse de molécules antimicrobiennes : Z l’ovomucoïde est essentiellement utilisée pour ses propriétés antitrypsiques ; Z l’ovoinhibiteur inhibe un grand nombre de protéases ainsi que la réplication du rotavirus (agent causal de certaines gastro-entérites) ; Z l’ovocystatine est un inhibiteur spécifique des protéases à cystéines. Les recherches indiquent que l’ovocystatine joue plusieurs rôles dans l’organisme. Elle est efficace comme agent antimicrobien et agent antiviral, ainsi que dans la prévention des hémorragies et des métastases. Son spectre d’action bactéricide est d’autant plus large que sa concentration est plus élevée. Elle est particulièrement efficace contre les infections à rotavirus et pourrait limiter l’apparition des poliomyélites en inhibant la production de poliovirus par des cellules infectées ; Z l’ovostatine inactive diverses protéases bactériennes telles que des métalloprotéases et des protéases à cystéine impliquées dans diverses infections humaines. Elle inhibe également la dissémination de certains virus ; Z l’ovomacroglobuline présente un spectre d’activité antiprotéasique assez large ainsi qu’une activité anticollagénase.

11.5.2.3. EXTRAITS DU JAUNE D’ŒUF X La

lécithine du jaune d’œuf est une source importante de phosphatidylcholine (voir fig. 11.3), un des principaux phospholipides des membranes cellulaires. C’est également un précurseur de l’acétylcholine, un neurotransmetteur. Elle est utilisée dans les produits cosmétiques, pharmaceutiques et alimentaires. Les produits commerciaux sont composés essentiellement d’un mélange de phospholipides, de triglycérides et de cholestérol à divers taux pour répondre à des exigences particulières en fonction des domaines d’application. L’extraction industrielle des lécithines de jaune d’œuf est généralement basée sur l’utilisation de solvants organiques (acétone, éthanol). D’autres méthodes proposées récemment, combinent des traitements physiques tels que l’extraction à l’aide de résines d’alginates/carraghénates estérifiés, la concentration par osmose inverse, l’adsorption sélective sur gels de silice ou d’oxyde d’aluminium et la lyophilisation dans l’isopropanol ou dans l’éthanol. Bien que la lécithine utilisée comme additif alimentaire soit souvent d’origine végétale (soja), la lécithine de jaune d’œuf est plutôt recommandée pour des formulations infantiles à cause de sa haute teneur en acides arachidonique et docosahexaénoïque qui jouent un rôle important dans la nutrition du jeune enfant. X la phosvitine : cette protéine constitue une source de phosphore plus facilement assimilable que la caséine et est douée de propriétés antioxydantes puissantes grâce à sa capacité de chélater des métaux. Elle inhibe l’oxydation des phospholipides

274

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

catalysée par le cuivre, et encore plus par le fer. Cependant, la phosvitine perd son pouvoir antioxydant en présence de fer héminique, probablement en raison de l’ancrage de ce dernier dans la structure porphyrinique qui limiterait les interactions entre le fer et les résidus de phosphosérine. La capacité de fixation du fer et son activité antioxydante sont dépendantes du pH, susceptible d’induire des changements conformationnels de la protéine. La capacité de la phosvitine à fixer le fer, de même que ses propriétés antioxydantes ne sont pas affectées par la pasteurisation. Son chauffage à 110 °C pendant 20 à 40 min ne provoque pas la libération du fer préalablement fixé. X la lutéine et la zéaxanthine du jaune d’œuf réduisent le risque de dégénérescence maculaire et préviennent la formation de la cataracte, deux maladies des yeux liées au vieillissement. De plus, ces deux caroténoïdes sont mieux assimilés lorsqu’ils proviennent des œufs que des légumes à feuilles vertes (brocolis et épinards). Un jaune d’œuf contient, en moyenne, 30 μg/100g de lutéine et 25 μg/100g de zéaxanthine. Ces caroténoïdes sont également doués d’activités antioxydantes.

12 - LA GÉLATINE 12.1. INTRODUCTION Le tissu musculaire est constitué de tissu conjonctif de soutien formé essentiellement de cellules (fibroblastes) et de fibres de collagène, de petites quantités d’élastine dans les capillaires, tendons, nerfs et ligaments et de réticuline noyées dans une substance colloïdale (dite fondamentale). Le collagène, une glycoprotéine abondamment présente dans tout organisme animal, représente de 25 à 35 % des protéines totales. C’est la protéine la plus abondante dans les organismes vertébrés et le constituant majeur de la matrice extracellulaire du tissu conjonctif, assurant la cohésion des tissus, notamment des os et des cartilages, mais difficilement attaquée par les sucs digestifs. La teneur en collagène des muscles est très variable. Elle est plus élevée dans le muscle de la cuisse (17 mg/g de matière sèche) que dans le muscle pectoral (8 mg/g de matière sèche). Dans le muscle de la cuisse, la quantité de collagène augmente avec l’âge mais sa solubilité diminue. L’épaule de porc est, globalement plus riche en collagène que le jambon. Les tendons ont une teneur en collagène élevée leur permettant de transmettre les forces musculaires aux os. De structure fibreuse, le collagène est constitué de 3 chaînes peptidiques (monomères) enroulées les unes autour des autres et liés par des liaisons hydrogène et des liaisons covalentes en formant une triple hélice appelée tropocollagène, d’une masse moléculaire de 3 à 8.102 kDa, d’une longueur de 300 nm et d’un diamètre de 1 nm. Chaque chaîne est constituée d’environ 1000 acides aminés dominés par les formes acides, basiques et hydroxylées, conférant à la molécule un caractère hydrophile. Le groupement hydroxyle de l’hydroxyproline participe à la formation de liaisons hydrogène entre les chaînes et avec les molécules d’eau piégées dans la triple hélice. Cette structure trihélicoïdale est détruite par un traitement thermique ou par des acides qui détruisent les liaisons hydrogène aboutissant à une structure en pelote. En se polymérisant, le tropocollagène donne une fibrille de collagène. Plusieurs fibrilles de collagène constituent la fibre collagène. Le tissu conjonctif contient un très grand nombre de fibres de collagène stabilisées par des liaisons intra- et intermoléculaires. Les liaisons intermoléculaires sont formées par la condensation de groupes aldéhydes (formées par désamination oxydative de la lysine à l’extrémité des molécules peptidiques, catalysée par la lysyloxydase) avec les groupes aminés des résidus hydrolysyl des molécules voisines. Les liaisons intramoléculaires sont formées par la condensation aldol des

276

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

groupements aldéhydes de la lysine des chaînes adjacentes. La stabilité des liaisons intraet intermoléculaires augmente avec l’âge. Il existe plusieurs types (ou isoformes) de collagène, dont les 3 premiers représentent l’essentiel du groupe (90 %) : X le collagène de type I est le principal constituant de la peau, des tendons et des os. Il est constitué de triples hélices ayant deux chaînes polypeptidiques identiques α1 et une chaîne α2 de composition différente. X le collagène de type II, principal constituant du cartilage, est composé de trois chaînes identiques α. X le collagène de type III, présent dans les vaisseaux sanguins et les muscles squelettiques, est également composé de trois chaînes identiques α. Sa formation est liée à l’âge : une peau très dure peut en contenir jusqu’à 50 %. X les autres types de collagène sont présents en très faible quantité et spécifiques de certains organes. Chez l’homme, vingt deux types différents, numérotés à l’aide de chiffres romains, ont été identifiés. Ils différent essentiellement par leur association avec le milieu poly-glucosidique. Trois d’entre eux présentent une structure cristalline mise en évidence par les rayons X. En microscopie électronique, les fibrilles de collagène apparaissent striées. Ce profil est du aux écarts entre les triples hélices adjacentes. Les rayures sombres apparaissent au niveau des lacunes qui se remplissent d’acétate d’uranyle au cours de la préparation des coupes microscopiques. Les régions non-remplies d’acétate d’uranyle apparaissent claires. De façon générale, le degré de réticulation (on dit souvent de polymérisation) est lié à l’âge de l’animal et au sexe. Chez les animaux jeunes, le collagène est partiellement réticulé, flexible mais relativement inélastique, tandis que chez les sujets âgés, le degré de réticulation et sa résistance augmente alors que la flexibilité diminue. C’est ce qui rend la viande d’animaux âgés plus dure. Le collagène du mâle est très dense, celui de la femelle est plus souple. Par ailleurs, chez le mâle, la quantité de collagène augmente rapidement avec l’âge (taurillon très pourvu en collagène au-delà de 18 mois). Le collagène est une protéine ayant une très longue durée de vie, il est produit au cours de l’embryogénèse et reste en place durant toute la vie de l’organisme. Relativement difficile à digérer et très pauvre en acides aminés indispensables (tyrosine, tryptophane et acides aminés soufrés), le collagène n’a pas de valeur nutritionnelle propre au regard des autres protéines associées. Insoluble dans l’eau et les solutions salines, il se transforme en gélatine sous l’action de l’eau bouillante. En milieu industriel, c’est surtout la gélatine qui est utilisée du fait de ses nombreuses applications. A la cuisson à 65 °C, le collagène et l’élastine se rétrécissent, avec une certaine augmentation de rigidité et de dureté apparente. A 80 °C, le collagène commence à s’hydrolyser en gélatine. Le collagène peu réticulé, par exemple du poulet de chair ou de veau, se transforme facilement en une gelée gélatineuse tandis que le collagène fortement réticulé des animaux plus âgés est difficilement hydrolysable ; ces viandes exigent une cuisson humide prolongée pour obtenir un ramollissement appréciable.

12 - LA GÉLATINE

277

Le dosage de la teneur en collagène dans les viandes et les produits de charcuterie se fait indirectement par dosage de l’hydroxyproline, acide aminé caractéristique des tissus conjonctifs (12 à 14 %).

12.2. MATIÈRES PREMIÈRES UTILISÉES

POUR LA PRODUCTION DE LA GÉLATINE

La gélatine est une protéine animale hydrosoluble obtenue par hydrolyse partielle de matières premières riches en collagène : peaux, tissus conjonctifs blancs, os, tendons, et cartilages provenant exclusivement d’animaux. La gélatine est ensuite extraite à l’eau chaude à des températures croissantes. Viennent ensuite des opérations de raffinage incluant la filtration, la désionisation, la concentration, la stérilisation, la gélification, l’extrusion, le séchage, le broyage et le tamisage afin d’obtenir un produit final (la gélatine) commercialisable. Différents batchs sont ensuite mélangés pour obtenir le produit fini. Cette production s’effectue dans des usines ultramodernes à un niveau très élevé d’hygiène et de sécurité. Le collagène devient, en présence d’eau, de la gélatine suivant la réaction : collagène + eau $ gélatine (C102H149O38N)n + H2O $ (C102H151O39N31)y Les monomères sont liés entre eux et forment des chaînes polypeptidiques dont chacune contient aux environ de 1000 acides aminés. La structure de la gélatine est donc une molécule en forme de baguette (une protofibrille) composée des structures hélicoïdales primaires, secondaires et tertiaires. La gélatine (CAS#, 9000-70-8), n’existe pas à l’état libre dans la nature. Il n’en existe pas de source végétale et il n’y a pas d’apparenté entre la gélatine animale et les autres substances gélifiantes, de structure chimique totalement différente, parfois nommées incorrectement gélatines végétales comme les produits issus de certaines algues (agar-agar, carraghénanes, alginates) ou de plantes terrestres (pectines…). En milieu industriel, les trois principales matières premières utilisées pour l’obtention de la gélatine sont des sous-produits des abattoirs : X les couennes de porcs, traitées par hydrolyse acide conduisant à des gélatines de type A ; X les peaux de bovins, traitées par hydrolyse alcaline conduisant à des gélatines de type B ; X les os, conduisant à des gélatines qui peuvent être de type A ou B. Les couennes de porc sont une matière première importante pour la production de gélaUJOF
BMJNFOUBJSF
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FU
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EJTQPOJCJlité quantitative et donc d’approvisionnement, la filière de la gélatine utilise les couennes de porc (58 %), les os de bovins (28 %) ainsi que les peaux bovines (14 %) (fig. 12.1) ; les os de porc étant moins utilisés car largement vendus avec la viande. Les gélatines provenant de la peau et des os de porc ne sont pas autorisées dans certaines régions du monde pour des raisons religieuses.

278

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE Peaux de bovins 14 %

Couennes de porcs 58 %

Os de bovins 28 %

Figure 12.1 - Origine de la gélatine Compte tenu de la consommation grandissante de la volaille désossée, on peut s’attendre à l’avenir à l’arrivée sur le marché de gélatine issue de volailles. La gélatine de poisson, quant à elle, connaît des développements intéressants sur certains marchés. En effet, les abats de poissons, tels que les os, les écailles et les peaux sont très riches en collagène. La gélatine de poisson est extraite de la peau des poissons des eaux profondes comme le requin, la morue, l’aiglefin et la goberge.

12.3. PROCÉDÉS DE PRODUCTION 12.3.1. TRAITEMENTS PRÉLIMIAIRES Fournies fraîches ou congelées, les matières premières proviennent des abattoirs, des boucheries et des usines de transformation de la viande, garnies de graisse, de chair et de poils. Elles sont généralement traitées dans des installations spécialisées en fonction de leur nature (fig. 12.2). Les os frais sont préalablement traités dans des sites de dégraissage où sont enlevés les tissus mous et les graisses résiduelles grâce à plusieurs bains d’eau chaude. La séparation de la partie minérale (60 % de l’os) de la partie organique constituée par le collagène, s’effectue par un trempage de quelques semaines dans un bain d’acide chlorhydrique dilué (HCl 5 %) qui élimine les phosphates de calcium sans modifier la composition en acides aminés du collagène mais certaines liaisons peptidiques ou intermoléculaires peuvent être hydrolysées. Le matériau spongieux qui en résulte est constitué de l’osséine qui est le produit de base pour la fabrication de la gélatine. Les peaux sont généralement épilées chimiquement à l’aide d’une solution de soude caustique diluée à chaud ou de chaux/sulfure suivie d’un assouplissement mécanique. Dans les peaux de bovins, seule la partie supérieure (ou fleur) est utile pour la production du cuir. La fine couche située entre la peau et le tissu sous-cutané, largement constituée de collagène pur, représente une matière première prisée pour la fabrication de la gélatine. Les couennes de porc, quant à elles, proviennent des abattoirs, après réfrigération ou même congélation.

12 - LA GÉLATINE

279

Peaux de bovins

Os

Epilage

Dégraissage

Dégraissage

Déminéralisation

Couennes de porcs

Traitement alcalin

Traitement acide

Lavage à l'eau froide

Lavage

Lavage à l'eau chaude

Extraction à l'eau chaude (55 à 95 °C)

Filtration

Déminéralisation

Concentration

Stérilisation UHT

Gélification

Extrusion Séchage

Broyage, tamisage

Mélange

Mélange

Gélatine de type B pure

Gélatine de type A pure

Figure 12.2 - Schéma du processus de fabrication de la gélatine

280

PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

Elles sont débarrassées des graisses et des albuminoïdes par des méthodes physicochimiques pour donner du collagène pur. Elles peuvent être dégraissées par centrifugation dans un tambour rotatif chauffé à l’aide de vapeur d’eau à une température comprise entre 60 et 65 °C. Des enzymes protéolytiques peuvent également être utilisées dans le prétraitement des matières premières en vue de rompre des liaisons spécifiques et, donc, d’éliminer des substances organiques comme le sang, les mucines, les sucres et les protéoglycanes présents naturellement dans les matériaux bruts.

12.3.2. HYDROLYSE Le procédé de fabrication de la gélatine se base sur la solubilisation du collagène par hydrolyse. Industriellement, l’hydrolyse est généralement réalisée à chaud à l’aide d’acides minéraux forts (ex. acide chlorhydrique, sulfurique…) pour les os et les peaux de bovins et les couennes de porcs, ou d’alcalis (ex. lait de chaux), pour les os et les peaux de bovins. Dans le premier cas, on obtient une gélatine de type A, dans le deuxième, une gélatine de type B. Ces deux types de gélatine ont des propriétés sensiblement différentes et, donc, des applications distinctes. Il existe également des procédés d’hydrolyse enzymatique. Les procédés d’extraction sont étroitement contrôlés dans la fabrication de la gélatine de type A et de type B car ils influent sur la qualité du produit final et sur la quantité de produit obtenu. L’extraction s’effectue généralement dans les cuves en acier inoxydable équipées d’éléments de chauffage et de contrôle de la température.

12.3.2.1. HYDROLYSE ALCALINE Le procédé d’hydrolyse alcaline est principalement utilisé pour des collagènes complexes comme ceux des os et des peaux de bovins. Les peaux de bovins sont traitées dans un bain de chaux (ou de soude caustique) pendant 5 à 20 semaines, selon le traitement antérieur, la nature du matériau, la taille des pièces et la température de traitement. Selon les règles de l’Association des gélatiniers européens (Gelatine Manufacturers of Europe
(.&


MF
chaulage doit durer au moins 45 j à température ambiante. Les solutions sont renouvelées plusieurs fois afin d’éliminer les impuretés extraites comme la graisse, les composés organiques secondaires et afin de maintenir le degré d’alcalinité souhaité. Le degré d’alcalinité de la liqueur de chaux est contrôlé par titrage acide, ou en testant les extractions. La matière première est ensuite soigneusement lavée à l’eau froide pour enlever l’excès de chaux ; le pH est ajusté à l’aide d’acide et le produit final est extrait avec de l’eau chaude (entre 50 et 95 °C) pour récupérer, en fonction du temps et de la température, différentes fractions de gélatine de type B plus ou moins concentrées. Les os requièrent d’habitude plus de temps de chaulage que les peaux de bovins. Ils peuvent être broyés jusqu’à obtenir une granulométrie d’environ 1 à 2 cm. L’utilisation de tissus désintégrés facilite leur imprégnation par les réactifs et améliore l’extractabilité de la gélatine.

12 - LA GÉLATINE

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Durant le chaulage, une certaine désamination du collagène se produit, avec production d’ammoniac. L’hydrolyse alcaline agit sur les groupes amides de l’asparagine et de la glutamine qui se transforment après perte d’une fonction amine (–NH2) respectivement en aspartate et en glutamate. La gélatine qui en résulte est donc enrichie en groupements carboxyles, chargés négativement, ce qui diminue le pHi global de la molécule. L’hydrolyse alcaline n’est pas très utilisée dans la fabrication de la plupart des gélatines de poisson où l’on utilise plutôt l’hydrolyse acide. Lorsque c’est le cas, il semble que ce soit l’hydroxyde de sodium (NaOH) qui est l’alcali utilisé.

12.3.2.2. HYDROLYSE ACIDE L’hydrolyse acide convient mieux aux matières premières peu réticulées comme les os et cartilages de jeunes bovins et peaux de porc. Le traitement acide est moins agressif que le traitement alcalin et prend seulement 10 à 18 h, à température ambiante. Il en résulte que la composition en acides aminés de la gélatine n’est que peu modifiée par rapport au collagène dont elle dérive. Il donne des produits particulièrement adaptés aux applications photographiques et pharmaceutiques. La matière première est lavée et trempée dans les solutions d’acides diluées, dont la concentration n’excède pas 5 % et dont le pH se situe entre 3,5 et 4,5. Les acides minéraux utilisés peuvent être l’acide chlorhydrique, l’acide sulfurique ou l’acide phosphorique. Des extractions répétées sont effectuées jusqu’à ce que la matière première soit épuisée. Le nombre d’extractions varie, en général, de 3 à 6. L’extraction initiale s’effectue généralement entre 50 et 60 °C, les extractions ultérieures sont réalisées avec des augmentations successives de la température de 5 à 10 °C. L’extraction finale est réalisée à une température proche du point d’ébullition. L’hydrolyse est d’autant plus forte que la température est plus élevée ; par ailleurs, plus les chaînes obtenues sont courtes, plus la force du gel diminue, et il en résulte des applications différentes pour chaque fraction. La gélatine de qualité supérieure est obtenue lors des premières extractions. Elle a une masse moléculaire et une viscosité plus élevées ainsi qu’une plus grande résistance du gel obtenu qui est de couleur plus claire. Les extractions ultérieures donnent un produit ayant une masse moléculaire et une résistance de gel plus faibles liée à une couleur plus foncée. Différentes fractions sont ainsi isolées séparément car elles ont des caractéristiques texturantes propres. Elles peuvent être mélangées pour répondre aux spécifications exigées par des usages différents. Les solutions sont ensuite filtrées puis purifiées en éliminant les excès de sels, concentrées sous vide jusqu’à l’obtention d’une teneur de l’ordre de 30 à 40 % en gélatine. La solution est alors stérilisée par un procédé UHT à 140 °C puis refroidie rapidement pour obtenir une gelée. Le refroidissement rapide (crash cooling) minimise la dégradation de la gélatine. La gelée de gélatine concentrée est extrudée à l’aide d’extrudeuses semblables à celles utilisées dans la fabrication des « nouilles ». Le produit extrudé est ensuite séché avant son broyage, tamisé puis calibré afin d’obtenir différentes granulométries selon les

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spécifications requises. Un produit typique contient 14 % d’humidité, 84 % protéines et 2 % de cendres. Un bœuf ou un porc permettent de produire, en moyenne, 1 kg de gélatine. La gélatine de peaux de poissons est extraite avec de l’eau chaude et de l’acide acétique. L’extrait soluble est filtré, concentré par évaporation, séché et moulu en particules de taille standard (40 mesh), puis mélangé et emballé. Divers autres acides minéraux peuvent être utilisés, tel que les acides sulfurique et chlorhydrique. C’est une gélatine de type A et elle est généralement commercialisée sous forme de granulés secs.

12.3.2.3. HYDROLYSE ENZYMATIQUE Des hydrolases comme les protéases, qui catalysent le clivage hydrolytique des liaisons peptidiques dans les polypeptides et les protéines, ont été utilisées dans la fabrication de la gélatine. Il s’agit de la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la pronase et les collagénases. Plusieurs techniques ont été développées pour produire de la gélatine en utilisant des enzymes. En ce qui concerne la gélatine de type A, la pepsine et la pronase sont souvent employées en combinaison avec les méthodes chimiques pour accroître l’efficacité et réduire la durée des traitements. Une des approches consiste à utiliser des enzymes protéolytiques produites par des bactéries non-pathogènes. Contrairement aux procédés chimiques, les méthodes enzymatiques présentent les avantages suivants. Le rendement est presque de 100 %. Les propriétés physico-chimiques de la gélatine comme la force du gel, son point de fusion et sa viscosité sont améliorées contrairement à la méthode chimique où seulement environ 30 % du produit total extrait est de haute qualité. Les méthodes enzymatiques évoluent constamment et aboutissent à une gélatine de meilleure qualité et à un meilleur rendement. Quel que soit le processus utilisé dans la fabrication de la gélatine à partir de la matière première, le temps requis pour le traitement préalable à l’extraction et la minimisation des eaux usées générées sont des facteurs économiques importants. Comme la gélatine est hygroscopique, elle doit être stockée à l’abri de l’humidité de l’air. La croissance des moisissures commence à partir d’une teneur en eau de l’ordre de 16 %. En outre, les solutions de gélatine constituent un excellent milieu pour la croissance bactérienne. La gélatine est de ce fait un produit où la qualité microbiologique est essentielle. La performance de la gélatine est altérée si elle souffre de protéolyse bactérienne ; plus important encore, comme tout produit d’origine animale, il existe toujours un risque de contamination avec des bactéries pathogènes. La dégradation des solutions et des gels de gélatine par des bactéries, des levures et des moisissures peut être inhibée par l’utilisation de conservateurs. Le choix du conservateur variera selon l’utilisation de la gélatine. Parmi les conservateurs utilisés pour les gélatines, figurent le peroxyde d’hydrogène, le pentachlorophénol (pour les gélatines non-alimentaires), l’acide tartrique (pour l’ajustement du pH), le métabisulfite… En France, l’utilisation d’agents de conservation autres que le dioxyde de soufre et le peroxyde d’hydrogène est interdite pour la gélatine destinée à la consommation humaine. La gélatine peut aussi être irradiée.

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12.4. NATURE PROTÉIQUE DE LA GÉLATINE Chimiquement, la gélatine est semblable au collagène dont elle est issue. C’est un polypeptide contenant un total de 18 acides aminés à différentes concentrations dont 8 des 9 acides aminés essentiels. La variation plus ou moins importante de la composition en acides aminés des gélatines est fonction du prétraitement. En tant que substance protéique, la gélatine a une valeur nutritive limitée puisqu’elle ne contient pas de tryptophane et est déficiente en acides aminés soufrés (méthionine et cystéine/cystine). En dépit de quelques différences, la composition en acides aminés des gélatines issues de différentes sources est assez comparable. Il est bien connu que l’acide aminé dominant de la molécule de gélatine est la glycine (Gly), la forme la plus concentrée en contient 20,6 g pour 100 g de gélatine. Viennent ensuite, en termes d’abondance, les iminoacides (proline et hydoxyproline). La composition en acides aminés de la gélatine est caractérisée par une séquence à répétition de triplets Gly-X-Y, où X est le plus souvent la proline et Y est principalement l’hydroxyproline (fig. 12.3). À l’intérieur de la molécule de gélatine, la Gly constitue environ 27 % du pool des acides aminés totaux. La lysine (Lys), acide aminé essentiel, joue un rôle clef dans la préservation et la constitution de nouveaux tissus ainsi que dans la croissance des cellules et des os. Les autres acides aminés importants sont l’alanine (Ala) 8-11 % ; l’arginine (Arg) 8-9 % ; l’acide aspartique (Asp) 6-7 % et l’acide glutamique (Glu) 10-12 %. Gly—X—Y—Gly—X—Y—Gly—X—Y unité de base H

N

N H

N

O Gly

OH

O Pro X

O Hyp Y

Figure 12.3 - Structure primaire de la gélatine Généralement, les gélatines de peaux de poissons présentent une plus grande variété d’acides aminés que celles des mammifères. Elles contiennent plus de glycine et un peu plus d’arginine, de sérine et de thréonine que les gélatines de mammifères. La teneur totale des iminoacides est plus faible chez les poissons (16-20 %) que chez les mammifères (20-24 %).

12.5. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES La conversion hydrolytique du collagène en gélatine donne des molécules de masses différentes : chacune est un fragment de la chaîne de collagène d’où elle a été coupée.

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Par conséquent, la gélatine n’est pas une entité chimique unique, mais un mélange de fractions composées presque entièrement d’acides aminés. Elle est pratiquement le seul aliment de nature presque exclusivement protéique. Sa teneur en protéines atteint 85 à  90 %, selon qu’elle se présente en feuille ou en poudre. Elle contient aussi de l’eau (15 % maximum), et 1 à 2 % de sels minéraux. La composition élémentaire de la gélatine est : 50,5 % de carbone, 6,8 % d’hydrogène, 17 % d’azote et 25,2 % d’oxygène. La gélatine est presque insipide et inodore. C’est un solide vitreux, cassant faiblement jaunâtre. La gélatine de poisson a l’avantage d’être incolore une fois dissoute. Elle contient 8 à 13 % d’humidité et a une densité relative de 1,3 à 1,4.

12.5.1. SOLUBILITÉ Lorsque les granules de gélatine sont trempés dans l’eau froide, ils s’hydratent en particules discrètes. Réchauffées, ces particules gonflées se dissolvent pour former une solution. Cette méthode de préparation des solutions de gélatine est préférable, surtout lorsque des concentrations élevées sont souhaitées. Le comportement des solutions de gélatine est influencé par la température, le pH, la teneur en cendres, le procédé de fabrication et la concentration. La gélatine est soluble dans des solutions aqueuses de polyalcools tels que le glycérol et le propylène glycol. L’acide acétique, le trifluoroéthanol et le formamide sont des exemples de solvants organiques hautement polaires dans lesquels la gélatine se dissout facilement. La gélatine est insoluble dans les solvants organiques moins polaires comme le benzène, l’acétone, les alcools primaires et le diméthylformamide. La gélatine entreposée dans des contenants hermétiques à température ambiante reste inaltérable pendant de longues périodes. La gélatine sèche, chauffée au-dessus de 45 °C dans l’air à humidité relativement élevée (supérieure à 60 %), perd progressivement sa capacité à gonfler et se dissout. Les solutions stériles de gélatine stockée à froid sont stables indéfiniment ; mais à des températures élevées, elles sont sensibles à l’hydrolyse. Deux des propriétés les plus utiles de la gélatine, la force du gel et la viscosité, sont progressivement affaiblies lors d’un chauffage prolongé en solution au-dessus de 40 °C. La dégradation de la gélatine peut être aussi causée par des pH extrêmes et par des enzymes protéolytiques, y compris celles qui peuvent résulter de la présence de micro-organismes. La gélatine de poisson se distingue des autres gélatines par la diversité des températures de dissolution et de gélification tout en offrant une bonne viscosité et une bonne résistance. Une solution de gélatine de poisson dans l’eau est liquide à température ambiante, alors qu’une solution de gélatine animale est solide dans les mêmes conditions.

12.5.2. PROPRIÉTÉS AMPHOTÈRES Comme toutes les protéines, les gélatines sont caractérisées par leur point isoélectrique (pHi), c’est-à-dire par le pH pour lequel elles sont globalement neutres (autant de charges positives que négatives). La charge de la molécule de gélatine et son pH isoélectrique sont

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dus principalement aux groupes carboxyle, aminé et guanidino portés par les chaînes peptidiques. Les solutions de gélatine ont un pHi qui varie en fonction du traitement subi par les matières premières. Celles de type A ont un pHi de 6,3 à 9,5 ; celles de type B, ont un pHi de 4,5 à 5,4. La gélatine dans une solution ne contenant aucun des ions non-colloïdaux autres que H+ et OH– est qualifiée d’isoionique. Le pH de cette solution est appelé point isoionique (pI). Ces solutions peuvent être préparées en utilisant des résines échangeuses d’ions.

12.5.3. VISCOSITÉ L’autre caractéristique technologique importante de la gélatine est sa viscosité. La méthode établie pour la détermination de la viscosité consiste à mesurer le temps de l’écoulement de 100 ml d’une solution de test standard à 6,67 % de gélatine dans l’eau à 60 °C, à l’aide d’un viscosimètre à pipette calibrée (viscosimètre d’Ostwald). Dans certains cas, la viscosité est déterminée à des concentrations auxquelles la gélatine doit être utilisée. La distribution des masses moléculaires semble jouer un rôle plus important sur la viscosité que sur la force en gel. Certaines gélatines présentant une force en gel élevée peuvent avoir des viscosités plus faibles que les gélatines dont la force en gel est plus faible. Par ailleurs, la viscosité des solutions de gélatine est d’autant plus élevée que leur concentration augmente et que la température diminue et elle atteint son minimum au point isoionique. Enfin les viscosités des solutions varient suivant les méthodes d’extraction et l’origine de la gélatine.

12.5.4. FORCE DU GEL La formation de gels thermoréversibles dans l’eau est l’une des propriétés les plus importantes de la gélatine utilisée par l’industrie. Lorsqu’une solution aqueuse de gélatine à une concentration supérieure à environ 0,5 % est refroidie à environ 35-40 °C, sa viscosité augmente d’abord puis forme un gel. La rigidité ou la force du gel dépendent de la concentration en gélatine, de sa force intrinsèque, du pH, de la température et de la présence éventuelle d’additifs. La force intrinsèque de la gélatine est aussi fonction de sa structure et sa masse moléculaire. La première étape de la gélification est la formation de régions localement ordonnées, dues au retour aléatoire partiel (renaturation) de la gélatine à l’état d’hélices de type collagène. Ensuite, un réseau tridimensionnel continu de fibrilles forme des micelles dans tout le système sans doute en raison de la mise en place de liaisons non-spécifiques entre les segments plus ordonnés des chaînes. Les liaisons hydrophobes, hydrogène et électrostatiques peuvent être impliquées dans cette réticulation. La réversibilité du gel est due à la possibilité de rompre ces liaisons par chauffage. La réticulation est l’étape la plus lente du processus, de telle sorte que dans les conditions idéales, la force du gel augmente avec le temps au fur et à mesure que se forment les liaisons.

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La force du gel formé par la gélatine est exprimée en valeur « Bloom » (du nom de son inventeur). Elle correspond à la rigidité du gel obtenu dans des conditions standardisées. Elle permet la classification des gélatines. On la mesure selon une méthode précise (AOAC : Association of Official Analytical Chemists) : mesure de la force maximale qu’il faut imposer à un cylindre normalisé de 12,7 mm de diamètre pour qu’il pénètre de 4 mm et avec une vitesse de 1 mm/s dans un gel de gélatine à une concentration de 6,67 % (p/v), formé en 18 h dans un flacon spécifique et à une température de 10 °C. Cette mesure détermine une des principales caractéristiques de la gélatine, liée à sa valeur commerciale. Les méthodes standards de mesure de la valeur « Bloom and Viscosity » sont décrites par les normes internationales (« Standardised Methods for the Testing of Edible Gelatin » mises BV
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  Les gélatines commerciales peuvent avoir des degrés Bloom de 90 à 300 c’est-à-dire faible (< 150), moyen (150 - 220) ou élevé (> 220). Les gélatines de type A se distinguent du type B par : X leur pHi (toujours supérieur à 6,5 pour le type A et voisin de 5 pour le type B), X une viscosité plus faible pour un même degré Bloom. Pouvoir gélifiant et viscosité sont toujours mesurés et contrôlés. Des mélanges de fractions, dont la composition et les critères technologiques sont connus, peuvent être réalisés pour satisfaire les différentes exigences du marché.

12.5.5. DÉRIVÉS CHIMIQUES La gélatine peut-être être modifiée chimiquement pour lui conférer de nouvelles propriétés physiques et/ou chimiques. Ces changements sont le résultat de réactions chimiques et/ou de modifications structurelles. Les réactions typiques incluent l’acylation, l’estérification, l’amination, la désamination, la réticulation et la polymérisation, ainsi que des réactions simples avec les acides et les bases. Les dérivés aminés de gélatine, obtenus par introduction chimique de résidus comme l’éthylènediamine (Ed), la spermidine (Sd) et la spermine (Sm) sur les groupements carboxyles sont utilisés comme vecteurs de l’ADN plasmidique. Parmi ces dérivés, celui de la Sm est le vecteur de gène le plus efficace en raison d’un pouvoir tampon supérieur à celui des dérivés de l’Ed et de la Sd.

12.5.6. ACTION PROTECTIVE La gélatine est un colloïde hydrophile typique capable de stabiliser une variété de matériaux hydrophobes. L’efficacité de la gélatine comme colloïde protecteur est déterminée par son indice de Zsigmondy qui est le plus bas de tous les colloïdes. Cet indice est défini comme étant le nombre de milligrammes de substance colloïdale nécessaire pour empêcher la coagulation de 10 mL d’or colloïdal après ajout de 0,5 mL de chlorure de sodium à 10 %. Cette propriété est particulièrement intéressante pour l’industrie photographique et la galvanoplastie.

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12.5.7. COACERVATION La coacervation est un phénomène associé aux colloïdes dans lesquels les particules dispersées se séparent de la solution pour former une deuxième phase liquide, suite à l’addition de composés différents. Ce phénomène a été très étudié dans le cas de la gélatine. L’utilisation de mélanges d’hydrocolloïdes permet la production d’une gamme de textures. Par exemple, la gélatine et la gomme arabique donnent une texture compacte dure alors que le mélange de gélatine et de pectine donnera une texture cassante. La gélatine et l’amidon donnent une texture comprise entre ces deux extrêmes. Une application courante de coacervation est l’utilisation de la gélatine et de la gomme arabique pour produire des microcapsules contenant de l’huile pour la fabrication du papier autocopiant utilisé sur les photocopieurs et les imprimantes laser. La coacervation est également utile dans l’industrie photographique.

12.5.8. COULEUR La couleur de la gélatine dépend de la nature de la matière première utilisée et de l’origine de la gélatine (première extraction, deuxième ou d’une extraction ultérieure). Les gélatines issues de la peau de porc sont habituellement moins colorées que celles faites à partir d’os. En général, la couleur n’a pas d’influence sur les propriétés de la gélatine.

12.5.9. TURBIDITÉ La turbidité peut être due à la matière insoluble ou à des impuretés sous la forme d’émulsions ou de dispersions stabilisées en raison de l’action protectrice colloïdale de la gélatine. Elle est maximale au pHi isoélectrique dans des solutions à environ 2 % en gélatine. À des concentrations plus élevées ou à des pH différents, la turbidité est sensiblement inférieure.

12.5.10. CENDRES La teneur en cendres de la gélatine varie avec le type de matière première utilisée et de la méthode de traitement. Les gélatines de couennes de porc contiennent de petites quantités de chlorures ou de sulfates. Les gélatines d’os contiennent principalement des sels de calcium des acides qui ont été utilisés dans la neutralisation après le chaulage. Pour les secteurs pharmaceutiques et photographiques, par exemple, les gélatines doivent avoir une teneur en cendres très faible. Ces gélatines peuvent être déminéralisées à l’aide d’un traitement par échange d’ions.

12.6. PROPRIÉTÉS FONCTIONNELLES La gélatine est une protéine parfaitement digestible et assimilable mais elle ne peut être considérée comme un aliment protéique complet. De fait, elle est surtout recherchée pour ses propriétés fonctionnelles.

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12.6.1. GÉLIFICATION La gélification de la gélatine est évidemment l’une des principales propriétés exploitées par les utilisateurs et elle est normalement mesurée à l’aide d’un certain nombre de méthodes empiriques. Après dissolution dans l’eau chaude (30-35 °C) et refroidissement, la gélatine forme un gel absorbant 5 à 10 fois son poids d’eau. Le gel est thermoréversible et fond à un degré voisin de celui de la température du corps humain, sans modifier la qualité gustative du produit dans lequel elle entre. A noter que des gélatines solubles à froid sont proposées aujourd’hui sur le marché. La gélatine extraite de poisons se distingue de la gélatine de bœuf ou de porc par son point de gélification qui se situe entre 5 et 10 °C. La formation du gel dépend de plusieurs facteurs : X plus le degré Bloom de la gélatine est élevé, plus la gélification est importante. X le gel se forme immédiatement à 10 °C, mais la gélification maximale n’est atteinte qu’après environ 16 h. X la concentration critique de gélification ou concentration minimale en gélatine pour qu’il y ait gélification doit être de 0,5 %. X la gélatine forme un gel dans un intervalle de pH compris entre 4 et 8. Le pH des solutions aqueuses de gélatine de type A est de 4,5 à 6, celui des gélatines de type B est de 5 à 7. Par contre, une fois formé, le gel est peu sensible à l’acidité. X plus la température est élevée, plus faible est le gel formé. X le cisaillement avant gélification diminue la force de gel.

12.6.2. EMULSIFICATION ET FORMATION DE MOUSSE La gélatine a la propriété de s’adsorber à l’interface des gouttelettes d’huile et ainsi de stabiliser une émulsion de type « huile dans eau ». Cette stabilisation est accentuée par la propriété de la gélatine de gélifier en surface. Les propriétés émulsifiante et moussante de la gélatine sont dues à la présence de régions hydrophobes et de régions hydrophiles au niveau de ses chaînes peptidiques. Cependant, les propriétés émulsifiantes de la gélatine sont moindres que celles d’autres protéines globulaires comme les caséines ou la gomme arabique, par exemple. Par ailleurs, la gélatine présente des synergies avec les mono et diglycérides d’acide gras pour stabiliser les émulsions eau/huile.

12.6.3. POUVOIR FILMOGÈNE Le pouvoir filmogène et la non-solubilité de la gélatine dans les corps gras en font un agent biotechnologique recherché pour de nombreux enrobages protecteurs ou fixateurs (ex. capsules de produits pharmaceutiques, microencapsulation, poudres fixatrices d’arôme…).

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Les films de gélatine de poissons, présentent, cependant, une perméabilité à la vapeur d’eau plus faible que ceux de la gélatine bovine ou porcine. Ceci peut être expliqué par leur composition en acides aminés : les gélatines de poissons sont connues pour leur plus haute hydrophobie en raison de leur teneur plus faible en proline et hydroxyproline (le groupement hydroxyl de l’hydroxyproline forme normalement des liaisons hydrogène avec l’eau). Des différences de perméabilité à la vapeur d’eau existent également entre les films de gélatine de poissons des eaux froides et ceux de poissons des eaux chaudes. Les premiers ont une perméabilité significativement plus faible que les seconds, pour la même raison que précédemment. La gélatine est particulièrement remarquable du fait de ses nombreuses propriétés fonctionnelles exploitées dans les applications alimentaires. Quelques exemples en sont donnés dans le tableau suivant : Tableau 12.1 - Propriétés fonctionnelles de la gélatine dans les aliments Fonction

Application

Gélifiant

%FTTFSUT
FO
HFMT
t
DPOöTFSJFT

Agent d’enrobage

/PVHBUT
t
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NPVTTFT
t
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Colloïde protecteur

$SÒNFT
HMBDÏFT
t
EFTTFSUT
TVSHFMÏT

Liant

'SPNBHFT
t
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SÏHMJTTFT
t
QSPEVJUT
MBJUJFST

Clarifiant

#JÒSF
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WJOT
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Filmogène

1SPEVJUT
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t
NJDSPFODBQTVMBUJPO

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TPVQFT
t
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QSPEVJUT
MBJUJFST

Auxiliaire technologique

.JDSPFODBQTVMBUJPO
EF
DPMPSBOUT
EBSÙNFT
EIVJMFT
EF
WJUBNJOFT

Emulsifiant

4BVDFT
t
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NÉDIFS
t
DBSBNFM
t
QSPEVJUT
MBJUJFST

Stabilisateur

-BJU
DIPDPMBUÏ
t
ZBPVSU

Agent d’adhésion

12.7. STATUT RÉGLEMENTAIRE ET SÉCURITÉ ALIMENTAIRE En tant qu’aliment protéique, la gélatine est considérée comme ingrédient et non pas comme additif alimentaire contrairement à la majorité des autres texturants, aussi ne possède-t-elle pas de code de type Exxx. De par leur nature protéique, les fibres de collagène sont très recherchées par les organismes vivants. De plus ces chaînes sont linéaires, et donc très accessibles à tous les organismes microscopiques (bactéries, moisissures) qui sont capables de les dégrader. En matière de sécurité alimentaire, la gélatine doit correspondre à des critères très précis. Face aux inquiétudes dues à l’Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB), plus

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communément appelée maladie de la vache folle, la Communauté Européenne a mis en place un certain nombre de règlementations officielles strictes et notamment les décisions 2000/48/E et 1999/724/EC. Ces textes définissent les règles à respecter en matière de sélection de matières premières (issues uniquement d’animaux contrôlés et déclarés aptes à la consommation humaine par les services vétérinaires, élimination des parties à risque comme les têtes…) et du processus de fabrication pour l’obtention de gélatine de bœuf. La gélatine de porc (type  A), issue uniquement de couennes de porc, n’est donc pas concernée par ces règles sanitaires. Pour les gélatines de qualité pharmaceutique, des règles strictes spécifiques sont également appliquées. Un avantage majeur de la gélatine d’origine marine par rapport aux autres sources est qu’elle n’est pas associée au risque de l’ESB.

APPLICATIONS Technologie agro-alimentaire La gélatine est l’un des hydrocolloïdes dont les fonctions principales sont d’épaissir, de gélifier et de stabiliser. Elle est très facile d’emploi et très compatible avec le sucre et les sirops de glucose utilisés couramment par les confiseurs. C’est un bon support d’arômes et elle s’emploie à des doses relativement faibles. Les propriétés fonctionnelles d’épaississement ou de gélification des systèmes aqueux sont à la base de son utilisation dans l’industrie agro-alimentaire moderne. À ce jour, aucun autre hydrocolloïde n’offre la même combinaison de fonctionnalités, même si de nombreux mélanges de texturants tentent de l’imiter. Les applications de la gélatine sont essentielles dans différents secteurs alimentaires : les produits laitiers, les pâtes à tartiner allégées en matières grasses, la confiserie, l’industrie de la viande, des poissons et des crustacés, la diététique et la santé. Les récents développements comprennent des gélatines froides solubles instantanément qui peuvent être utilisées dans les desserts, les mousses, les crèmes fouettées stabilisées, la viande et les pâtisseries. Grâce à sa texture élastique et fondante particulière, la gélatine est tout à fait adaptée à la mastication. En outre, elle permet d’obtenir des textures très variées, avec une gamme de forces du gel très large. La formulation et la mise en solution de la gélatine sont très faciles puisque la gélification se fait par simple refroidissement. Grâce à son fort pouvoir de rétention, plongée dans l’eau froide, la gélatine gonfle en absorbant 5 à 10 fois son volume d’eau. Bien que la gélatine de poisson ne forme pas de gels particulièrement forts, elle est bien adaptée pour certaines applications industrielles : microencapsulation, revêtements de produits photosensibles… La gélatine de poissons génère des nouvelles applications comme ingrédient alimentaire parce qu’elle a des propriétés différentes de celle des mammifères. La gélatine de poissons, fabriquée uniquement à partir des peaux, satisfait à la norme casher stricte. Lorsqu’elle est utilisée non pas comme ingrédient mais comme additif alimentaire gélifiant, elle est codée E441.

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hConfiserie

La gélatine est l’un des ingrédients les plus polyvalents utilisés en confiserie qui est son domaine d’application privilégié. Ses qualités particulières sont recherchées par l’industrie de la confiserie pour donner des textures spécifiques très appréciées des consommateurs de certaines confiseries ainsi qu’une grande élasticité, une transparence du gel, une consistance optimale pour la mastication et une amélioration de leur durée de conservation. Dans les confiseries gélifiées qui représentent un marché en plein développement, la gélatine permet de donner des formes originales. Les gels obtenus sont limpides et transparents. La nature thermoréversible des gels de gélatine est utile à plusieurs égards. Ils fondent à une température comprise entre 27 et 35 °C selon les conditions et redeviennent fermes en refroidissant. Les aliments contenant de la gélatine fondent dans la bouche, produisant une sensation unique, très agréable et dégageant un arôme intense. t Les gommes Pour cette application, on choisira une gélatine acide, c’est-à-dire de type A pour deux raisons : – elle confère la brillance nécessaire à ces produits, – sa viscosité, plus faible que la gélatine de type B, est plus adaptée. Le degré Bloom est généralement de 220, et les doses de l’ordre de 6 %. Pour les gommes souples, la texture est modifiée par rapport aux gommes classiques (plus fermes) par des teneurs en eau et en acide plus élevées. t Les pâtes à mâcher et produits aérés (marshmallows) Dans les confiseries aérées et les pâtes à mâcher, la gélatine apporte ses qualités émulsifiantes et stabilisantes du réseau composé de bulles d’air. Selon la dose de gélatine employée, la gamme des produits aérés pouvant être fabriquée est large. La texture est souple et moelleuse, mais fond rapidement en bouche. La concentration et le type de gélatine déterminent la fermeté souhaitée de la pâte à mâcher. En plus de son pouvoir gélifiant, la gélatine joue ici deux autres rôles : elle stabilise et surtout elle foisonne (augmente le volume de la préparation). Pour ce faire, la gélatine doit avoir une force de gel élevée (220 degrés Bloom par exemple) et avec une viscosité assez importante (donc plutôt de type B). Les concentrations utilisées sont de l’ordre de 4 %. hProduits laitiers La diversification des ingrédients permet à l’industrie laitière d’élaborer des produits innovants d’une plus grande qualité sensorielle et de meilleur coût pour le consommateur. Dans ce contexte, la gélatine est souvent une matière de choix qui met en valeur la qualité de nombreux produits laitiers grâce à la combinaison de ses propriétés fonctionnelles. Dans les desserts lactés et les laits fermentés (type 0 % de matière grasse, aux fruits…), la gélatine donne un « fondant tendre » dans la bouche et laisse l’arôme se dégager d’une façon intense. Cette propriété permet aux industriels d’être innovants en créant des textures et des formes originales dans le secteur des produits laitiers. De plus, la gélatine immobilise l’eau, ce qui empêche le phénomène de synérèse difficilement évitable sans ajout de stabilisateur et augmente la durée de conservation des produits.

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PARTIE III - SUBSTANCES D'ORIGINE ANIMALE

D’autres hydrocolloïdes peuvent être utilisés pour obtenir les caractéristiques de desserts traditionnels. Toutefois, même combinés, ces produits ne permettent pas d’égaler complètement les propriétés particulières de la gélatine. t Pâtes à tartiner allégées en matière grasse On trouve la gélatine dans certains aliments allégés (ex. margarines, pâtes à tartiner) pour simuler l’effet de la graisse en bouche et créer du volume sans ajouter de calories. Dans ces produits, la phase aqueuse dispersée dans la phase grasse est augmentée au détriment de la phase grasse. La majorité de ces produits contient seulement 25 % de matières grasses. A titre indicatif, une margarine ordinaire en contient 80 à 82 %. Dans les produits laitiers, la gélatine possède des propriétés texturantes uniques qui donnent une texture en bouche fondante et onctueuse, imitant la consistance de la matière grasse en combinant moelleux et arôme. On l’utilise à des doses variant entre 5 et 12 % du produit final. t Yaourts Dans les yaourts allégés et autres desserts acidifiés, la gélatine (à faible dose : 0,3-0,5 %) donne une sensation crémeuse en bouche et empêche la synérèse. Pour ces applications, la gélatine présente de bonnes synergies avec l’amidon. A noter que le mélange gélatine/amidon est généralement ajouté avant pasteurisation. t Mousses La gélatine joue ici deux rôles : tout d’abord elle agit comme agent de foisonnement puis elle permet de stabiliser la texture foisonnée. Pour cette application, les gélatines utilisées sont la plupart du temps des gélatines solubles à froid, avec une force en gel élevée (220-400 degrés Bloom). Là encore, on les utilise en combinaison avec des amidons (également solubles à froid). A titre d’exemple, dans une mousse au chocolat industrielle, les dosages de gélatine sont de l’ordre de 1,5 %. t Desserts gélifiés Dans les desserts gélifiés tels que les bavarois, la texture est typiquement donnée par la gélatine. Comme pour les mousses, on choisit généralement des gélatines solubles à froid et avec une force en gel élevée (220-400 degrés Bloom). Ainsi, dans un bavarois, les doses d’emploi de la gélatine peuvent être de 2,5 g pour 100 g de crème fouettée. t Glaces La gélatine est généralement incorporée dans les préparations pour crèmes glacées (texturants et émulsifiants combinés) où elle remplit plusieurs fonctions : – elle améliore le foisonnement en facilitant l’incorporation d’air, – elle stabilise l’émulsion, – elle empêche la formation des cristaux de glace lors de la conservation. Au final, elle permet d’obtenir une glace de texture onctueuse sans fonte en bouche trop rapide. hProduits instantanés Dans les produits instantanés (desserts en poudre…), les gélatines utilisées doivent être solubles à froid dans différents liquides (lait, eau, jus de fruits…). A titre d’exemple, PB Gelatins (Tessenderlo Group) commercialise deux gammes de gélatine : t une gélatine pure à mélanger avec au minimum 5 parts d’autres ingrédients en poudre (gamme Cryogel®).

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t une gélatine prémélangée à du sirop de glucose qui permet une dissolution instantanée (gamme Instagel®). hIndustrie de la viande, poissons et crustacés En plus de sa valeur nutritionnelle et digestive, la gélatine incorporée dans les gelées de viande et aspics permet de présenter de manière attrayante les différents produits. Dans les conserves de viande (jambon, corned-beef), elle lie le jus de viande pendant la cuisson. hClarification des boissons Capable de floculer les polyphénols, les pectines décomposées et d’autres substances responsables de la turbidité, la gélatine est utilisée pour la clarification des jus de fruits (raisin, pommes…) ou du vin. Les gélatines utilisées sont de préférence de faible force de gel (100-200 degrés Bloom) et de type acide. La clarification de ces boissons nécessite seulement de 40 à 80 parties par million de gélatine, seule ou associée à la bentonite. En pratique, une solution de gélatine diluée (1-3 %) est introduite dans la partie supérieure de la citerne et ensuite laissée décanter avant la filtration. Industrie pharmaceutique et santé La gélatine extraite des os est utilisée principalement à des fins pharmaceutiques. C’est dans ce domaine que la gélatine connaît ses utilisations les plus diverses. hCapsules/gélules La force et la souplesse de la gélatine lui offrent des caractéristiques uniques qui permettent la fabrication de capsules de différentes tailles, de différentes couleurs et de formes variées assurant en même temps une bonne fermeture après remplissage. Ces capsules sont destinées à contenir des substances médicales actives liquides ou sèches qui seront libérées après ingestion par le patient. Les deux types de gélatine sont utilisés, soit en combinaison ou séparément, selon la nature du produit actif de remplissage. Des capsules dures sont produites aujourd’hui, avec une variété de systèmes de fermeture inviolable. La vitesse de libération des principes actifs dans le corps peut être rigoureusement déterminée à partir de l’épaisseur de l’enveloppe des capsules ce qui représente un élément important dans la thérapie moderne. Les capsules molles utilisent une solution de gélatine qui est plastifiée avec du propylène glycol, du sorbitol, de la glycérine ou divers mélanges autorisés. Ces capsules sont monobloc et hermétiquement scellées pour contenir des produits liquides ou semi-liquides (ex. huiles de foie de morue, vitamines…). L’enveloppe des capsules protège le produit contre l’humidité et les variations de température. Les capsules dures sont obtenues par l’utilisation d’agents de durcissement comme le formaldéhyde et le glutaraldéhyde qui sont, en fait, des agents de pontage chimique entre groupements aminés des chaînes de collagène. L’ensemble de ces qualités font de la gélatine un matériel de choix pour la production de médicaments en capsules en raison de ses excellentes propriétés filmogènes et de sa dissolution rapide dans le liquide gastrique ; des compagnies pharmaceutiques, cependant, ont été contraintes de développer des capsules préparées à partir d’autres sources pour de nombreuses raisons dont l’augmentation de la tendance au végétarisme, des objections religieuses aux produits d’origine

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animale et l’instabilité des médicaments hygroscopiques ou contenant des groupes aldéhydes réactifs. Plusieurs alternatives à la capsule de gélatine existent sur le marché comme les alginates. hComprimés La formulation des comprimés inclue un principe actif et plusieurs substances biologiquement inertes, connues sous le nom d’excipients. Par son effet liant, la gélatine permet la cohésion et la conservation des principes actifs. Le choix judicieux du type de gélatine et son dosage permettent de déterminer les vitesses de libération du principe actif. Par ailleurs, de nombreuses indications permettent aujourd’hui de conclure à un effet positif de l’ingestion régulière de gélatine lors des atteintes et complications articulaires. hSuppositoires La gélatine glycérinée est généralement utilisée comme véhicule de suppositoires devant être insérés dans le rectum, le vagin ou l’urètre. La fermeté du produit fini est ajustée en faisant varier la concentration de la gélatine dans la formulation. Les critères de toute formulation suppositoire sont que la base (gélatine) doit être non-toxique et non-irritante pour les muqueuses, compatible avec une variété de médicaments, fondre ou se dissoudre dans les fluides corporels et être stable pendant le stockage. Les suppositoires sont généralement moulés par compression ou par fusion. La gélatine offre toutes les caractéristiques souhaitées et requises par les deux méthodes. La gélatine de type A est généralement ajustée à un pH acide qui est au-dessous du point isoélectrique, alors que la gélatine de type B peut également être réglée à un pH acide, mais dans ce cas, le pH est au-dessus du point isoélectrique. Ainsi les caractéristiques cationiques, anioniques et non-ioniques peuvent être exploitées pour promouvoir la compatibilité avec le produit actif, avec les fluides environnants et les températures afin d’améliorer ou de contrôler la biodisponibilité. Les principales caractéristiques physiques et chimiques d’une solution de gélatine reposent largement sur le pH et la concentration ionique des milieux. Les conditions d’élaboration et de préparation de la gélatine peuvent en effet modifier le point isoélectrique modifiant voire améliorant les diverses caractéristiques physiques du produit. hMicroencapsulation La gélatine est utilisée pour produire des huiles microencapsulées pour diverses utilisations tant dans les applications alimentaires que pharmaceutiques. La méthode traditionnelle d’encapsulation est connue comme étant la coacervation où les huiles dispersées sont encapsulées par la gélatine à l’interface entre les phases aqueuse et non-aqueuse. Des suppléments de vitamines pour différents aliments sont produits selon le même procédé. Une gélatine teintée est utilisée pour protéger les substances médicales, comme les vitamines par exemple, contre les altérations de l’air et de la lumière. La taille et la formation de microcapsules sphériques peuvent être contrôlées par diverses méthodes. Les exemples courants de ces microcapsules varient de 5 à 500 μm. hSubstituts du sérum sanguin En raison de leur compatibilité parfaite avec le tissu humain, des solutions de gélatine modifiée (3,0-5,5 %) et de sels sont couramment utilisés comme substitut du plasma durant une intervention chirurgicale d’urgence pour rééquilibrer rapidement le volume sanguin des patients.

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hEponges hémostatiques

Exploitant les propriétés antithrombogènes et hémostatiques de la gélatine dans le sang, l’industrie pharmaceutique a développé des éponges hémostatiques absorbantes et implantables qui sont utilisées lors des opérations chirurgicales ou dans le traitement des plaies avec pertes de sang importantes, ce qui est particulièrement utile en cas d’accidents hémorragiques ou de brûlures. Ces éponges biocompatibles se résorbent au bout de 4 à 6 semaines. Industrie photographique L’utilisation de la gélatine dans les émulsions photographiques remonte aux environs de 1870. La gélatine est encore le meilleur moyen connu pour lier les sels d’argent hautement photosensibles entrant dans la constitution des émulsions photographiques. Les émulsions de gélatine ont, au fil du temps, été continuellement améliorées en qualité et en vitesse de réaction. Elles sont constituées de plusieurs couches contenant de la gélatine et coulées sur un film ou un papier. La gélatine pour usage photographique est principalement de type B, notamment pour la préparation des émulsions. Bien que les peaux de bovins aient été utilisées, la gélatine de type B photographique est généralement issue de l’osséine. La préparation et l’extraction des matières premières se font dans des conditions soigneusement contrôlées pour produire de la gélatine avec les propriétés photographiques souhaitées, telles que le degré de sensibilité ou d’inertie avec des propriétés de nébulisation minimales. La gélatine est dissoute dans l’eau puis ajoutée à une solution des sels d’halogénures requis. Ensuite, une solution de nitrate d’argent est soigneusement ajoutée à un débit donné et sous agitation constante. Le mélange est ensuite chauffé jusqu’à 50 °C pendant un temps déterminé. Les sels sont retirés par décantation et lavage après que la gélatine contenant l’halogénure d’argent ait précipitée par coagulation. Une quantité supplémentaire de gélatine et d’eau est ajoutée pour obtenir une consistance adéquate avant la sensibilisation chimique. La gélatine agit donc comme un colloïde protecteur durant la précipitation des halogénures d’argent ; c’est un facteur important dans le contrôle de la taille des grains d’halogénure d’argent ; elle protège les grains d’halogénure contre l’action réductrice du développeur, de sorte que la réduction de ces grains d’argent métallique soit proportionnée à leur exposition à la lumière. Une maturation finale et une sensibilisation s’opèrent en chauffant à 50 °C ou plus pour atteindre la sensibilité maximale ou désirée. Une émulsion d’ammoniaque est préparée de la même façon, mais avec l’ajout d’ammoniaque dans le mélange au début et une maturation à des températures plus basses. L’émulsion est alors prête à être enduite sur le film, le papier ou le métal. Le principal inconvénient et la sensibilité de la gélatine des pellicules à la chaleur qui oblige à les conserver au froid (dans un réfrigérateur à 4 °C) dans les pays chauds. La gélatine est présente aussi sur le papier photographique couleur qui offre des perspectives économiques prometteuses, dans le domaine de la radiographie médicale et industrielle où la complémentarité avec la photographie numérique est déjà réalisée, ainsi que dans celui du cinéma. Le papier de tirage revêtu de gélatine pour les imprimantes à jet d’encre garantit des couleurs brillantes et améliore la netteté des images. Autres applications On retrouve la gélatine également dans de nombreux autres produits comme : les têtes d’allumettes, certains papiers spéciaux pour imprimantes à jet d’encre et les billets de banque.

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La gélatine est utilisée dans des aérosols d’insecticides pour son pouvoir collant et comme agent moussant dans les extincteurs. hÉlectrolyse Ajoutée aux bains électrolytiques de raffinage, la gélatine permet de purifier le cuivre, le zinc et le cadmium en améliorant la séparation des impuretés. hPolymérisation des matières plastiques Utilisée en faibles doses, la gélatine permet de contrôler la taille des particules et d’empêcher leur coalescence durant la polymérisation du chlorure de polyvinyle (PVC). hConservation et restauration des livres et parchemins Les musées, archives et bibliothèques renferment des milliers de livres et documents anciens sur papier acide ou sur parchemin, écrits à l’encre au carbone (noir de carbone mêlé à de la gomme arabique ou à d’autres liants) ou à l’encre métallogallique (combinaison de sels métalliques et de tanins végétaux) qui se détériore sous l’effet de la lumière, de l’humidité, des insectes et des moisissures. L’aspersion de gélatine permet de stabiliser les papiers fragiles et chiffonnés avant que les pages ne soient détachées et traités dans des solutions aqueuses pour la conservation et la restauration finale. De nos jours, ce procédé est souvent remplacé par l’utilisation de résine. hÉlimination de l’amiante L’élimination de l’amiante des immeubles se fait par un procédé qui consiste à vaporiser une solution à base de gélatine sur les parties contaminées. Il se forme alors un réseau élastique mais solide dans lequel les fibres d’amiante restent emprisonnées lors de l’enlèvement. Grâce au pouvoir liant de la gélatine, la masse d’amiante ainsi figée peut ensuite être mélangée à du ciment par un autre procédé. Le bloc ainsi formé est tellement dur que les fibres d’amiante y restent enfermées de manière permanente. hSolidification d’huiles minérales La gélatine pourrait jouer un rôle très important en cas de déversement accidentel de grandes quantités de pétrole en mer. En ajoutant un émulsifiant comme le savon, on obtient une suspension huile dans l’eau et de petites gouttes se forment qui flottent dans l’eau. La phase aqueuse froide se gélifie en ajoutant de la gélatine. Cela entraîne la formation de blocs solides et indéformables, pouvant être stockés à long terme. Après avoir été enlevée, l’« huile-gélatine » peut de nouveau être décomposée en ses constituants. Lorsque la gelée est chauffée, l’émulsion se décompose, la phase aqueuse se sépare et le pétrole flotte vers la surface d’où on peut ensuite le pomper. Jusqu’à présent, le procédé n’a fait l’objet de recherches qu’en système clos. En haute mer, la formation d’un gel solide réversible est beaucoup plus difficile, mais des recherches qui vont dans ce sens sont entreprises.

12.8. AVENIR DE LA GÉLATINE La demande mondiale de gélatine ne cesse d’augmenter d’année en année. La production mondiale annuelle de gélatine est voisine de 350 000 tonnes, dont 46 % proviennent de peaux de porc, 29,5 % de peaux de bovins, 23 % d’os et 1,5 % de diverses autres sources.

12 - LA GÉLATINE

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Les marchés d’avenir de la gélatine sont très nombreux et offrent de grandes possibilités en termes de débouchés. Le développement de nouveaux marchés ainsi que le perfectionnement du produit sont au cœur des préoccupations des producteurs de gélatine qui cherchent, dans un processus continu, à élaborer des types de gélatine spécialement adaptés aux besoins des utilisateurs. Les usines modernes de production de gélatine, avec leur niveau technologique sophistiqué, cherchent à développer et à élargir la diversité des produits et des applications possibles. Cependant, bien que la gélatine trouve aujourd’hui une vaste gamme d’applications, une certaine controverse persiste chez les consommateurs en ce qui concerne son utilisation. C’est principalement en raison de convictions religieuses (le Judaïsme, l’Islam et certains groupes chrétiens interdisent la consommation de produits dérivés du porc, tandis que les hindous ne consomment pas de produits dérivés de la vache) ainsi que l’adhésion croissante et plus stricte de la population au végétarisme dans le monde entier 1.

12.9. CONCLUSION La gélatine est présente dans les produits élaborés très variés de notre environnement quotidien. En dehors de ses applications classiques – que ce soit à des fins alimentaires, pharmaceutiques ou encore photographiques – la gélatine, grâce à ses propriétés multifonctionnelles, trouve sa place dans les produits innovants, et ce, dans de nombreux domaines de l’industrie moderne y compris dans les soins médicaux (traitement avec des cellules souches) et dans des domaines techniques spécialisés. La plus grande part de la gélatine mise sur le marché est destinée à l’alimentation ou à la pharmacie. Avec la gélatine, l’industrie agro-alimentaire dispose d’un ingrédient naturel, nutritionnel car elle contient 8 des 10 acides aminés essentiels, multifonctionnel de par sa capacité de rétention d’eau (gélifiant, épaississant, moussant, viscosifiant, liant, émulsifiant, filmant), adaptable, car la gélatine peut être fabriquée sur mesure (granulométrie adaptée, solidité des gels, viscosité…), reconnu dans l’industrie agro-alimentaire car donnant au produit qui le contient une texture agréable.

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Pour des compléments d’information, voir L’histoire de la gélatine sur le site web dédié

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PARTIE IV

SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE 13 - LES PROTÉINES D'ORGANISMES UNICELLULAIRES (POU) 13.1. Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
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QSPEVDUFVST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.3. Substrats de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.4. Extraction et traitement des protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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14 - LES ANTIBIOTIQUES 14.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14.2. Classes d’antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
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QSPEVDUFVST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14.4. Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14.5. Applications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS 15.1. Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.2. Homopolysaccharides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.3. Hétéropolysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.4. Polyesters bactériens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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13 - LES PROTÉINES D'ORGANISMES UNICELLULAIRES (POU) 13.1. INTRODUCTION De nombreux micro-organismes sont susceptibles de se développer à partir des substrats d’origine végétale ou animale les plus divers. Ces produits sont convertis en biomasse microbienne contenant une part très importante de protéines d’excellente valeur nutritionnelle. Deux raisons principales justifient le développement de la production de ces protéines à partir des produits agro-industriels ; tout d’abord, il existe au niveau des productions agricoles et des industries agro-alimentaires de très importantes quantités de produits résiduels dont le rejet représente souvent une pollution insupportable et un énorme gaspillage de carbone organique qui peut être avantageusement valorisé. La seconde raison qui incite à la poursuite de telles recherches est que le déficit en protéines dans l’alimentation (aussi bien humaine qu’animale) de nombreux pays est un problème réel alors que toutes les régions du monde disposent de produits carbonés divers et non-exploités sous forme de cellulose ou d’amidon, par exemple. À l’échelle mondiale, l’apport des protéines animales est de l’ordre de 30 à 35 %. Le reste est fourni par les Céréales (représentant l’aliment de base de 94 % de la population mondiale) et les Légumineuses dont on connaît malheureusement le déficit en certains acides aminés indispensables et l’acceptabilité souvent médiocre. En dépit des efforts continus de sélection d’espèces de Céréales plus riches en protéines, et l’utilisation de plus en plus importante des protéagineux (colza, arachide, coton, soja) comme sources de protéines dites « semi-conventionnelles », et en dépit des progrès réalisés en matière d’élevage, de pêche et d’agriculture, le déficit protéique mondial actuel et des années à venir, ne peut être évité que par la recherche de nouvelles sources de protéines. Dans cette optique, les protéines d’organismes unicellulaires (POU) occupent une place de premier ordre comme source « non-conventionnelle » de protéines. La culture de micro-organismes pour l’obtention des protéines a beaucoup d’avantages par rapport aux sources de protéines conventionnelles : X contenu protéique élevé ; X temps du doublement (croissance) très court ;

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PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

X grande

flexibilité dans l’utilisation des substrats ; de cultures plus réduites d’où une plus grande productivité ; X leur obtention n’est pas tributaire de la qualité des sols et des aléas climatiques et des saisons (production en continu) ; X génome des souches utilisées en général bien connu, amélioration plus aisée et expression des gènes plus facilement contrôlable ; X processus moins polluant. X surfaces

13.2. MICRO-ORGANISMES PRODUCTEURS Parce que la majorité des micro-organismes utilisés pour l’obtention de ces protéines non-conventionnelles est unicellulaire, leur contenu protéique est appelé « protéines EPSHBOJTNFT
VOJDFMMVMBJSFT
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OVUSJtifs comme des vitamines, des glucides, des lipides, des minéraux… Ces organismes sont sélectionnés d’après certains critères tels que leur capacité à utiliser une large gamme de sources de carbone et d’azote, des conditions de croissance modérées, un taux de croissance acceptable, une bonne tolérance aux variations de pH, de température et de concentrations en sels, une récolte facile, une bonne résistance aux infections virales, une absence de toxicité et de pathogénicité, une valeur nutritive acceptable… Les micro-organismes potentiels sont : levures, X les champignons filamenteux, X les bactéries, X les Cyanobactéries. X les

De nombreuses souches de micro-organismes possèdent des activités amylolytiques ou cellulolytiques et sont susceptibles d’être utilisées pour la production de protéines. Ce sont notamment des levures et des champignons filamenteux. Les bactéries sont actuellement assez peu utilisées dans ce domaine bien qu’elles présentent des potentialités infiniment variées et encore peu explorées. La conversion des matières premières en biomasse protéique par les micro-organismes se fait avec un rendement très élevé, comparé à celui observé chez les animaux d’élevage. La valeur alimentaire des POU varie en fonction du type de micro-organismes, du substrat et des conditions de culture utilisées pour leur production (en particulier des rapports carbone/azote/phosphore). L’évaluation de la valeur alimentaire des POU repose sur des facteurs comme leur composition en nutriments (acides aminés, protéines, glucides, lipides, vitamines…) et en acides nucléiques. Leur palatabilité, leur pouvoir allergène et leurs effets gastro-intestinaux sont également pris en considération de même que des essais d’alimentation à long terme et des études sur leurs effets toxicologiques et cancérigènes potentiels sont évalués.

13 - LES PROTÉINES D'ORGANISMES UNICELLULAIRES (POU)

303

13.2.1. LEVURES Les levures de boulangerie sont depuis longtemps utilisées comme additifs dans l’alimentation humaine et animale pour leur bonne valeur protidique. Sous forme séchée, elles contiennent en moyenne 45 % de protéines. De plus, ces protéines de levure sont facilement digestibles comparées à celles des bactéries et constituent une source abondante d’acides aminés indispensables, en particulier la lysine dont la teneur est supérieure à celle du maïs, du blé, du soja et du poisson, mais elles sont pauvres en méthionine. Les levures contiennent également la thiamine, la biotine, la riboflavine, la niacine, l’acide folique, la choline, l’acide pantothénique, la pyridoxine, glutathion…, et leur carence en méthionine peut être corrigée par culture sur la mélasse. En raison du taux élevé d’acides nucléiques (8  à  12 %) et de la faible digestibilité des membranes de levures, il est recommandé de limiter la consommation à 20 g par personne et par jour et de préférer les protéines extraites de levures et non les levures elles-mêmes. Les amylases produites par les levures étant le plus souvent endocellulaires, l’utilisation de ces micro-organismes nécessite un amidon parfaitement solubilisé pour qu’il puisse être dégradé. Actuellement de nombreuses espèces de levures amylolytiques ont été isolées et étudiées parmi lesquelles on peut citer Candida tropicalis, Schwanniomyces spp., Endomycopsis filuliger qui fait l’objet d’un développement industriel… Récemment, la levure méthylotrophe (capable d’utiliser le méthanol comme source de carbone, en l’absence de glucose) Pichia pastoris a suscité également beaucoup d’intérêt comme micro-organisme producteur de POU et d’autres métabolites. Les protéines de levure sont utilisées d’une part, en alimentation animale où elles permettent d’obtenir des rations équilibrées en protéines, vitamines (thiamine, riboflavine, biotine, acide nicotinique, acide pantothénique, pyridoxine, choline, acide folique et acide p-amino-benzoïque…) et en facteurs de croissance ; d’autre part, en alimentation humaine où elles constituent un élément de supplémentation protidique et vitaminique remarquable et très bien toléré, soit à l’état pur sous forme de poudre, de pâtes ou de comprimés, soit directement incorporées dans des préparations alimentaires. Sur le plan pratique, l’utilisation de la levure comme source de protéines est très avantageuse à plus d’un titre : extrême rapidité de la croissance des cellules (temps de doublement de  2 à  4 h), abondance des matières carbonées (sous-produits d’autres industries, fractions pétrolières, en particulier les alcanes…) nécessaires à la culture des levures, culture facile…

13.2.2. CHAMPIGNONS FILAMENTEUX Différentes souches de champignons inférieurs amylolytiques ont été utilisées pour la production de biomasse sur substrats amylacés. Il s’agit en particulier des souches de Fusarium, de différentes espèces d’Aspergillus, de Rhizopus ou de Trichoderma. Les champignons filamenteux produisent généralement des enzymes du type amyloglucosidases et leur temps de doublement est de l’ordre de 3 à 6 h.

304

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La teneur en protéines totales des champignons filamenteux est inférieure à celle des levures et des bactéries, mais leur biomasse est plus riche en ARN et contient des quantités importantes de N-acétyl-glucosamine. Les champignons contiennent les vitamines du complexe B et leur composition en acides aminés est également élevée mais leur contenu lipidique est faible. Les moisissures elles-mêmes ont une teneur bien équilibrée en acides aminés, sans déficience en acides aminés soufrés. Elles sont traditionnellement utilisées dans l’alimentation humaine au Japon et en Indonésie. Les substrats utilisés sont très nombreux : mélasses, lactose du lactosérum, amidon de manioc ou de pomme de terre préalablement hydrolysé…

13.2.3. BACTÉRIES Plusieurs genres bactériens ont été utilisés pour la production des POU dont Lactobacillus, Cellulomonas, Alcaligenes, Pseudomonas, Aeromonas… mais, les résultats obtenus n’ont pas été très encourageants. Des cultures mixtes de souches bactériennes ont montré des résultats intéressants avec une meilleure stabilité et une plus grande résistance à la contamination. La plupart des bactéries amylolytiques appartiennent au groupe des Bacillus dont de nombreuses espèces sont pathogènes et leur culture peut être facilement infectée par des phages. En outre, leurs conditions de croissance nécessitent des contraintes strictes de stérilité dans un milieu où de nombreuses autres espèces peuvent se développer sur un substrat aussi peu sélectif que le glucose libéré par l’hydrolyse enzymatique. Bien que leur taux de croissance soit bon et leur teneur en protéines de l’ordre de 70 à 80 % du poids sec, leur taux en lysine est assez faible (environ 6 %). Leur biomasse est riche en acides nucléiques, notamment en ARN (7 à 6 % du poids sec). Or, il est admis qu’une consommation quotidienne de tels acides, supérieure à 2 g/j (limite maximale recommanEÏF
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une hyperuricémie (concentration excessive en acide urique dans le sang). L’acide urique étant le produit final du métabolisme des substances puriques ; en cas d’hyperuricémie, l’excrétion rénale d’acide urique ne peut compenser sa formation normale, ce qui conduit à sa précipitation dans les tissus et les articulations d’où l’apparition de la goutte et/ou de la lithiase urinaire. Signalons que les animaux d’élevage ne sont pas sujets à ce problème. &O
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l’uricase qui permet de transformer l’acide urique en allantoïne, un métabolite facilement éliminé. Certaines souches de bactéries peuvent non seulement être cultivées sur les hydrocarbures mais tolérer des températures beaucoup plus élevées que ne le feraient les levures. Elles sont thermophiles. Cette propriété remarquable permet de réduire le coût des opérations de refroidissement et de simplifier les problèmes posés par les stérilisations. Comme on opère à haute température, il y a déjà une pasteurisation des produits. Les genres Methanomonas, Methylophilus et Pseudomonas se développant sur le méthane ont un rendement de l’ordre de 75 g de cellules (matière sèche) pour 100 g de substrat métabolisé.

13 - LES PROTÉINES D'ORGANISMES UNICELLULAIRES (POU)

305

13.2.4. CYANOBACTÉRIES Les Spirulines (genre Arthrospira) sont des Cyanobactéries d’eau douce ou saumâtre, très riches en protéines (60 à 70 % de leur poids sec), qui représentent un complément alimentaire
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évaporateur solaire (Caracol), mais elles sont aussi cultivées en bassins dans des régions BVY
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aussi produites en milieu et en conditions entièrement artificielles en Europe (France, Italie) voire même dans les stations orbitales où elles jouent un triple rôle : apport nutritionnel pour les cosmonautes, renouvellement de l’atmosphère en fixant le dioxyde de carbone et en fournissant de l’oxygène et recyclage des déjections fécales. Dans le cas de Arthrospira maxima (= Spirulina maxima), les rendements de production peuvent atteindre VOF
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de protéine/ha/an) dans les conditions de température et d’ensoleillement favorables. Leur consommation comme complément alimentaire présente de nombreux avantages pour la santé : apport d’acides aminés indispensables, d’acides gras indispensables et de diverses vitamines. De plus, il a été montré que différents extraits présentent aussi des activités thérapeutiques (antivirale, antiinflammatoire, anticancéreuse…).

13.3. SUBSTRATS DE CULTURE En dehors des micro-organismes autotrophes (Cyanobactéries) qui n’exigent que de l’eau, des sels minéraux, du CO2 et de la lumière pour synthétiser leur propre matière organique lors de la photosynthèse, les autres micro-organismes, hétérotrophes, ont besoin de substrat organique pour se développer. Les principaux substrats utilisés pour la production des POU incluent des dérivés du pétrole (paraffines), du méthanol, du méthane des matières premières amylacées brutes (manioc, igname, patate douce, pomme de terre, Céréales), des matières premières lignocellulosiques (pailles, sciures, broussailles), des sous-produits ou des déchets issus des industries agricoles, agro-alimentaires (mélasses, des effluents des amidonneries, des sucreries et des usines de traitement des fruits, bagasses), du lactosérum, des effluents de papeterie (liqueurs sulfitiques) et des déchets urbains. Les déchets lignocellulosiques ont une composition variable en hémicelluloses, cellulose, et lignines. Selon le constituant dominant, des micro-organismes spécifiques sont utilisés pour la production de la biomasse protéique. Si la cellulose représente la source la plus importante de produits carbonés disponible, sa résistance à l’hydrolyse enzymatique et son association constante avec la lignine freinent considérablement ses possibilités d’utilisation comme substrat des POU En revanche, les substrats amylacés ne présentent pas de tels inconvénients et font l’objet de nombreuses utilisations industrielles.

306

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

En définitive, pour une bonne rentabilité et un rendement protéique satisfaisant, il faut : X d’une part, que le substrat de culture soit abondant, peu coûteux et non-polluant ; X et d’autre part, adapté à la souche de micro-organisme. La culture de ces micro-organismes se fait, généralement, sur milieu liquide dans des fermenteurs (fig. 13.1) mais peut également être conduite sur milieu solide.

Agitateur

Sonde de température Oxygénation Electrode de pH

Double paroi pour la circulation du liquide de refroidissement Cuve du fermenteur Pompe péristaltique

Figure 13.1 - Fermenteur de paillasse et ses modules de régulation

13.4. EXTRACTION ET TRAITEMENT DES PROTÉINES Après culture, les micro-organismes sont récupérés par filtration ou en les concentrant, généralement par centrifugation et puis ils sont séchés. Différents traitements sont alors exécutés pour les rendre plus digestes. Leurs parois sont dégradées par traitement à haute température, ce qui libère les protéines cytoplasmiques et facilite l’action des enzymes digestives. Si les produits cellulaires sont utilisés en alimentation humaine, il est impératif de réduire leur taux trop élevé en acides nucléiques. C’est le cas des bactéries et levures, notamment.

13 - LES PROTÉINES D'ORGANISMES UNICELLULAIRES (POU)

307

Cette réduction peut se faire par diverses techniques : X extraction des protéines par utilisation d’urée ou de soude concentrées pour hydrolyser les acides nucléiques ; X choc thermique (65 à 70 °C durant 80 s) utilisé avec succès pour réduire le taux d’ARN (de près de 70 %) chez certaines levures et bactéries. Un tel traitement inactive les protéases microbiennes et permet à la RNAase endogène d’hydrolyser l’ARN ; X combinaison de moyens physico-chimiques. L’ARN est hydrolysé par des solutions acides à des températures élevées. Cette hydrolyse est rapide et n’affecte pas les protéines ; X procédé enzymatique faisant intervenir la ribonucléase A pancréatique bovine ou des ribonucléases et des endonucléases microbiennes (Brevibacterium, Staphylococcus…) immobilisées ; X modification des conditions de culture (rapport C/N, teneur en phosphore et en zinc) qui affecte la synthèse de l’ARN chez les levures. La présence de mycotoxines dans certaines espèces fongiques est un handicap majeur pour leur utilisation. Les principales mycotoxines comprennent les aflatoxines, produites par Aspergillus flavus, A. parasiticus et A. oryzae ; la citrinine produite par Penicillium citrinum ; les ochratoxines produites par les espèces d’Aspergillus et de Penicillium ; les trichothecènes et la zéaralanone de différentes espèces de Fusarium et l’ergotamine de différentes espèces de Claviceps. Ces toxines sont susceptibles de produire, à de très faibles doses, des réactions allergiques, diverses maladies et des cancers du foie, aussi bien chez les êtres humains que chez les animaux. Leur élimination est une condition préalable à leur consommation. Parmi les nombreuses méthodes utilisées à cet effet, le traitement des champignons par l’ammoniaque est le plus efficace. En dehors des traitements chimiques et physiques utilisés pour la détoxification, des techniques de biologie moléculaire ont été également mises en œuvre pour bloquer les gènes responsables de la synthèse de ces mycotoxines. Certaines bactéries produisent aussi bien des endo- que des exotoxines. Ces dernières sont sécrétées notamment par les bactéries Gram+ dans le milieu de culture. Les endotoxines font partie intégrante des parois cellulaires des bactéries Gram– et ne sont libérées qu’après la lyse des cellules. Ce sont des lipopolysaccharides, la partie lipidique étant responsable de l’effet toxique. Les exotoxines peuvent être aisément éliminées du fait de leur solubilité dans le milieu de culture et de leur thermolabilité au-delà de 60 °C. L’alcool à 50 %, le formaldéhyde et les acides dilués peuvent aussi dénaturer les exotoxines ou de les transformer en toxoïdes non-toxiques.

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14 - LES ANTIBIOTIQUES 14.1. DÉFINITION Les antibiotiques sont des substances d’origine biologique (ou produites par synthèse chimique) de structure variable (sucre, protéine, aminoglycoside…) et de faible poids moléculaire, naturellement synthétisées et excrétées par différentes espèces de microorganismes et de végétaux. Ils agissent à très faible dose comme poison pour d’autres micro-organismes en inhibant une de leur fonction essentielle entraînant un blocage de leur croissance et éventuellement leur mort. Dans la nature, les antibiotiques représentent un avantage pour les bactéries et les moisissures qui les synthétisent. Ils leur permettent d’éliminer leurs compétiteurs pour mieux s’accaparer les substances nutritives disponibles dans leur environnement. Les phytoalexines, produites par diverses plantes en réponse à une infection par des agents pathogènes, peuvent aussi être considérées comme antibiotiques. Il en est de même des benzo-naphtoquinones et les para-naphtoquinones produites par certaines plantes.

14.2. CLASSES D’ANTIBIOTIQUES On définit plusieurs classes d’antibiotiques principalement en fonction de leur nature chimique, de leur origine (bactérie, champignon, synthèse, hémisynthèse), de leur mécanisme d’action, de l’étendue de leur spectre. Leurs mécanismes de résistance et leurs effets secondaires éventuels, sont parfois pris en compte. La nature chimique des antibiotiques est très variée et plus ou moins complexe. Les antibiotiques diffèrent en taille, on trouve des petites molécules comme la cyclosérine (102 Da) ou la fosfomycine (fig. 14.1) qui ne contient que trois atomes de carbone mais aussi des gros polypeptides comme la nisine qui contient 34 résidus d’acides aminés. O NH

H

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O

PO3H2 O

Figure 14.1 - Structures de la cyclosérine (à gauche) et de la fosfomycine (à droite)

310

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La structure de ces molécules cycliques peut comporter des groupements de nature diverse : carboxylique, aminée, osidique, protéique, lipidique… (ex. la polymyxine B est un polypeptide de 10 acides aminés) ; les antibiotiques polyéniques sont de nature lipidique ; l’érythromycine est un macrolide constitué d’un cycle d’origine lipidique où sont greffés des dérivés osidiques (voir fig. 14.3). L’action de l’antibiotique se traduit soit par l’arrêt de la multiplication des germes (elle est alors bactériostatique), soit par leur mort (elle est alors bactéricide). Les antibiotiques agissent souvent comme inhibiteurs des systèmes biochimiques indispensables à la vie et à la reproduction des cellules (voir section 14.5. Applications). Leur valeur thérapeutique dépend donc de leur activité nocive à l’égard des bactéries pathogènes et de l’absence d’effets secondaires sur l’organisme hôte. Les sites d’action sont caractéristiques de chaque famille d’antibiotiques. Bien que pas toujours connus avec certitude, les principaux sites d’action sur les cellules cibles sont les suivants : la paroi bactérienne, la membrane plasmique, le génome (perturbation de la réplication et de la transcription de l’ADN), la traduction de l’ARN messager (perturbation de la synthèse protéique), le métabolisme respiratoire, le métabolisme intermédiaire et le transport membranaire. L’étendue de l’activité antibactérienne d’un antibiotique définit son spectre. Plus un antibiotique agit sur des types de bactéries différentes, plus son spectre est large. Par exemple, la rifampicine (composé semi synthétique issu d’une rifamycine) et les tétracyclines sont actives à la fois contre les bactéries Gram+ et Gram–. La pénicilline qui agit uniquement contre les bactéries Gram+ et les antibiotiques antituberculeux qui sont actifs TVS
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14.3. MICRO-ORGANISMES PRODUCTEURS Certains des antibiotiques les plus couramment utilisés comme la pénicilline, la streptomycine, l’érythromycine, les tétracyclines et la vancomycine sont dérivés ou intégralement basés sur des molécules naturellement produites par des micro-organismes provenant de l’environnement. Ainsi, près de 80 % des antibiotiques produits industriellement proviennent des bactéries, le reste est fourni par les champignons. Les Actinobactéries sont les plus prolifiques de tous les micro-organismes en tant que producteurs d’antibiotiques (deux tiers des antibiotiques isolés jusqu’ici proviennent des Actinobactéries) et d’autres métabolites secondaires bioactifs. Parmi les espèces appartenant à ce groupe bactérien, le genre Streptomyces est le plus abondant et il détient actuellement la première place en tant que producteur d’antibiotiques et d’autres métabolites secondaires. On estime que 75 à 80 % des antibiotiques isolés des Actinobactéries sont produits par des Streptomycètes. Par exemple, les souches de Streptomyces griseus et de S. hygroscopicus produisent, respectivement, plus de 40 et 200 antibiotiques différents dont les plus connus sont la streptomycine, l’auréomycine, la terramycine et la néomycine.

14 - LES ANTIBIOTIQUES

311

Ce sont des bactéries rencontrées sur tous les substrats organiques mais on les trouve principalement dans les sols où elles jouent un rôle particulièrement important dans la transformation de composés organiques difficilement dégradables par les autres micro-organismes. Elles sont Gram+ et de morphologie très variable. Elles ont la capacité d’excréter de nombreux métabolites secondaires et des enzymes hydrolytiques (protéases, lipases, amylases, cellulases), ce qui leur permet de se développer sur des substrats complexes polymérisés. Leur classification est basée sur des critères morphologiques et biochimiques. Les souches productrices d’antibiotiques sont aérobies et de formes mycéliennes. Des bactéries du genre Bacillus, groupe ubiquitaire Gram+, produisent des antibiotiques de nature essentiellement peptidique (ex : bacitracine, gramicidine, subtilisine…). Signalons aussi que certaines espèces du genre Pseudomonas, bactéries aérobies strictes Gram–, produisent quelques antibiotiques. De nombreux champignons sont utilisés industriellement pour la production d’antibiotiques (pénicillines) dont plusieurs milliers ont été répertoriés, mais un nombre limité seulement est commercialisé. Parmi la dizaine d’organismes fongiques exploités industriellement, figurent les genres Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium, Helminthosporium, Fusidium.

14.4. PRODUCTION L’immense demande thérapeutique en antibiotiques a rapidement nécessité la mise au point de techniques industrielles de production ; de ce fait, la consommation mondiale à la fois médicale et vétérinaire d’antibiotiques s’évalue en milliers de tonnes. La production des antibiotiques naturels s’effectue actuellement à grande échelle dans des fermenteurs industriels dont le volume peut atteindre plusieurs centaines de litres (30 000 à 200 000 L) et dont la régulation est entièrement automatisée. Les souches de micro-organismes, sélectionnées avec soins à partir d’isolats de cultures pures, sont inoculées dans un milieu nutritif stérile contenu dans ces fermenteurs (voir fig. 13.1) et incubées pendant des périodes variables (habituellement 5  à  8 j), selon la souche utilisée et selon les conditions de culture. Un rendement de production intéressant est dépendant des conditions physico-chimiques, thermiques et biologiques extrêmement précises et stables. Ainsi, l’apport des substances nutritives, l‘introduction d’air stérile, la température, le pH sont régulés tout au long du processus fermentaire, de façon entièrement automatique. Dans certains cas, il est utile d’ajouter au milieu de fermentation un précurseur afin de stimuler ou de favoriser la production d’un composé spécifique comme, par exemple, l’acide phénylacetique pour l’obtention de la pénicilline G ou d’acides aminés spécifiques dans la production des actinomycines et des tyrocidines. Cette stratégie est connue sous le nom de biosynthèse directe.

312

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Plus de 13 000 antibiotiques ont été obtenus par voie fermentaire à ce jour, dont environ 80 % proviennent de bactéries et 20 % de moisissures
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DSJUÒSFT
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doit présenter un produit naturel antimicrobien pour acquérir une place importante en médecine humaine et vétérinaire : large spectre d’action, innocuité relative à l’égard de l’organisme hôte et prix de revient raisonnable, tous les antibiotiques connus ne sont pas exploités ; les effets toxiques de certains d’entre eux ou leur absence d’activité empêchant leur utilisation en thérapeutique. La pénicilline (voir fig. 14.3), la céphalosporine et leurs dérivés représentent à eux seuls 60 % du marché mondial des antibiotiques. Les biotransformations de précurseurs d’antibiotiques tiennent une place importante dans ce domaine, de même que le génie génétique qui est de plus en plus utilisé afin de produire de nouvelles souches microbiennes ayant des performances accrues dans la production d’antibiotiques.

14.4.1. EXTRACTION ET PURIFICATION À l’issue du cycle de fermentation, les antibiotiques sont souvent présents à des concentrations relativement faibles et sous forme de mélanges complexes de composés ayant des structures très proches mais souvent un ou deux sont majoritaires. L’antibiotique désiré doit alors être extrait du milieu de culture par des opérations souvent automatisées : filtration, extraction par adsorption sur des résines échangeuses d’ions, extraction par des solvants. Ces étapes représentent une part importante du coût global du procédé.

14.4.1.1. SÉPARATION SOLIDE-LIQUIDE Une étape de séparation des cellules, par décantation, filtration ou, le plus souvent, par centrifugation, n’est pratiquée que si on désire extraire les antibiotiques associés aux cellules, en plus de ceux contenus dans le milieu liquide de fermentation.

14.4.1.2. EXTRACTION À PARTIR DU MILIEU LIQUIDE Une extraction liquide-liquide à l’aide d’un solvant approprié est effectuée, après traiteNFOU
EF
MB
QIBTF
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QBS
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Q)

Q,a
EF
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PV
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CBTF
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Q,b), afin d’obtenir une forme ionisée de l’antibiotique. Le choix du solvant est déterminé par : X sa capacité à solubiliser l’antibiotique (bon coefficient de distribution entre l’eau et le solvant) ; X sa neutralité chimique vis-à-vis de l’antibiotique ; X un bon degré de sélectivité ; X un coût raisonnable ; X des propriétés physiques facilitant son élimination ou son recyclage. 1BS
FYFNQMF
MFT
DPFóDJFOUT
EF
EJTUSJCVUJPO
,D) de la pénicilline  G à pH  4 entre les solutions aqueuses et des extractants comme le méthyl cyclohexanone et le diméthyl cyclohexanone sont, respectivement, 180 et 160. Ces solvants sont donc beaucoup plus

14 - LES ANTIBIOTIQUES

313

FóDBDFT
RVF
MBNZM
BDÏUBUF
,D = 20) qui est l’un des extractants les plus utilisés pour les antibiotiques. Cependant, ces solvants sont plus coûteux, de même que l’extraction de l’antibiotique dans ces conditions est plus difficile.

14.4.1.3. PURIFICATION Cette opération qui fait appel à des techniques plus raffinées que pour l’extraction liquide-liquide est mise en œuvre lorsque cette dernière n’est pas suffisante pour atteindre un degré de pureté acceptable. Le degré de pureté recherché dépendra de l’application. La purification a donc pour but de débarrasser l’antibiotique désiré des impuretés susceptibles de lui être associées en jouant sur leurs propriétés différentes de celles de l’antibiotique. Les méthodes courantes de purification se basent souvent sur des procédés à membrane de type ultra- ou nanofiltration, ou encore de séparations chromatographiques comme la filtration sur gel et la chromatographie d’échanges d’ions. Ces procédés conduisent à des degrés de pureté compatibles avec la plupart des utilisations.

14.4.2. BIOTRANSFORMATIONS Un grand nombre d’antibiotiques peuvent être modifiés chimiquement ou biochimiquement par certains micro-organismes, conduisant à des antibiotiques dites semi-synthétiques. Ces transformations se font par divers types de réactions : hydrolyse ou désacylation, acylation, phosphorylation, nucléotidylation, oxydation, réduction, amination ou désamination, glycosylation, méthylation ou déméthylation, isomérisation, hydratation… Elles sont effectuées dans le but d’avoir une activité antimicrobienne ou des propriétés pharmacologiques améliorées. Par exemple, les pénicillines chimiquement modifiées, telle que la méthicilline, sont efficaces contre des bactéries résistantes au composé parent, la pénicilline G. De même, les autres pénicillines, telles que l’ampicilline, sont actives contre une variété plus large de micro-organismes que le composé parent. D’autres sont mieux absorbés par l’organisme ou ont une plus grande stabilité chimique, une biodisponibilité et une excrétion plus favorables ou une toxicité réduite. Les pénicillines qui représentent la classe la plus importante d’antibiotiques, sont constituées d’un noyau commun, l’acide 6-aminopenicillanique (6-APA), et d’une chaîne latérale variable (fig. 14.2). O

H N

H 2N

S + H2O

N

O

S

PGA O

N

COOH PenG

COOH

+ COOH 6-APA

acide phénylacétique

Figure 14.2 - Désacylation de la pénicilline G en acide 6-aminopenicillanique et acide phénylacétique

314

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Seulement deux exemples, la pénicilline G (PenG) ayant l’acide phénylacétique comme chaîne latérale, et la pénicilline  V (PenV) ayant l’acide phénoxyacétique comme chaîne latérale, sont obtenues par fermentation de Penicillium chrysogenum ; tous les autres dérivés (ex. amoxicilline et ampicilline) sont produits à partir du 6-APA qui provient presque exclusivement de l’hydrolyse enzymatique de PenG à l’aide de la pénicilline  G acylase (PGA) immobilisée.

14.5. APPLICATIONS Les antibiotiques naturels d’origine microbienne possèdent une vaste gamme d’activités thérapeutiques. Contrairement aux désinfectants usuels comme le peroxyde d’hydrogène ou la teinture d’iode, les antibiotiques exercent une action spécifique, c’est-à-dire qu’ils dérèglent le métabolisme de certains micro-organismes sans affecter les cellules humaines ou animales. La première de ces applications a été l’utilisation des antibiotiques en tant que NÏEJDBNFOUT
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sélectivité et la spécificité de leur action leur a permis d’acquérir également, en tant que réactifs, une place de choix dans les laboratoires de biochimie, de biotechnologie et de microbiologie, et tout particulièrement dans ceux orientés vers la biologie moléculaire et le génie génétique.

14.5.1. BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Les antibiotiques peuvent attaquer tout type d’activité biochimique microbienne, y compris la synthèse de l’ADN, de l’ARN et des protéines, les fonctions membranaires, le transport des électrons, la sporulation, la germination, et beaucoup d’autres fonctions. Le tableau 14.1 résume les sites d’action et les structures de quelques exemples importants d’antibiotiques. Tableau 14.1 - Sites d’action et structure de quelques antibiotiques Cible

Antibiotique

Structure

réplication de l’ADN

bléomycine

glycopeptide

transcription

BDUJOPNZDJOF
%
t
SJGBNZDJOF

QFQUJEF
t
BOTBNZDJOF

tétracyclines streptomycine chloramphénicol lincomycine érythromycine puromycine acide fusidique

polycétide aminoglycoside (aminocyclitol) phénylpropanoïde lincosamide (sucre-amide) macrolide nucléoside (purine) stéroïde

cycloheximide*

glutarimide

traduction t
SJCPTPNFT

4 t
SJCPTPNFT

4 t
SJCPTPNFT

FU

4 t
SJCPTPNFT

4

14 - LES ANTIBIOTIQUES

315

Cible

Antibiotique

Structure

synthèse de la paroi cellulaire des bactéries

cyclosérine bacitracine pénicilline vancomycine

acide aminé cyclique substitué polypeptide β-lactame glycopeptide

polymyxine amphotéricine nystatine gramicidine lasalocide

peptide polyène polyène peptide polyéther

inhibiteur de la β-lactamase

acide clavulanique

β-lactame

chélation du fer

desferrioxamine

peptide

biosynthèse de la chitine

nikkomycine

nucléoside

membranes cellulaires t
UFOTJPBDUJGT t
JPOPQIPSFT

* Cet antibiotique bloque la synthèse protéique uniquement chez les cellules des Eucaryotes.

Certains antibiotiques sont des inhibiteurs spécifiques pour des étapes bien précises de la biosynthèse des protéines in vivo ou dans des systèmes acellulaires. Les aminoglycosides, les tétracyclines et les spectinomycines se fixent à la sous-unité 30 S des ribosomes bactériens alors que le chloramphénicol, les macrolides et les kétolides se lient à la sousunité 50 S. L’acide fusidique (fig. 14.3) agit sur les bactéries Gram– en se fixant au facteur EF-G d’élongation au cours de la traduction, empêchant la fixation de l’ARNt aminoacylé. OMe N

HO

O O

H N

O N N H

S

N

S OAc

N

O O

O

COOH

NH2

pénicilline

céfotaxime

NMe2 HO O

OH O

O

HO HO

HO OH O

O

O O

érythromycine

O

O OH OMe

O acide fusidique

Figure 14.3 - Structures chimiques de quelques antibiotiques importants

316

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La sélectivité de ces inhibiteurs de la synthèse des protéines (qui sont le plus souvent bactériostatiques) est le résultat de certaines différences entre les ribosomes cytoplasmiques 70 S chez les Procaryotes et les ribosomes 80 S chez les Eucaryotes. Par contre, les ribosomes des mitochondries des Eucaryotes sont semblables à leurs équivalents chez les Procaryotes ; les antimétabolites peuvent être alors toxiques. La synthèse et le fonctionnement des acides nucléiques sont inhibés par certains antibiotiques : ex. la rifampicine bloque la transcription par inhibition de l’ARN polymérase et les quinolones (ex. acide nalidixique) bloquent la réplication de l’ADN par inhibition de la gyrase bactérienne. D’autres antibiotiques agissent comme antimétabolites. C’est le cas des inhibiteurs de la voie de synthèse de l’acide folique comme les sulfonamides ou sulfamides qui sont des analogues de l’acide p-aminobenzoïque, précurseur de l’acide folique, et inhibent la ptéridine synthétase (fig. 14.4). La relative insensibilité aux sulfonamides des cellules eucaryotes provient du fait que ces dernières assimilent directement l’acide folique apporté par l’alimentation alors que les bactéries doivent le synthétiser par cette voie métabolique. acide p-aminobenzoïque + ptéridine sulfonamides

ptéridine synthétase

acide dihydroptéroïque sulfadiazine

dihydrofolate synthétase

acide dihydrofolique triméthoprime

dihydrofolate réductase

acide tétrahydrofolique thymidine

méthionine purines

inhibition

Figure 14.4 - Voie de biosynthèse de l’acide folique et site d’action de ses inhibiteurs Diverses fonctions mitochondriales sont la cible d’antibiotiques inhibiteurs : phosphorylation oxydative (ex. oligomycine, rutamycine, aurovertine), chaîne respiratoire (ex. antimycine). Certains, comme la valinomycine, ne sont pas des antibiotiques majeurs quant à leurs applications thérapeutiques, mais ils fournissent des informations importantes sur le fonctionnement des biomembranes. Les antibiotiques polyéniques (ex. amphotéricine B, nystatine), en se fixant aux stérols membranaires, provoquent des modifications de la perméabilité des cellules eucaryotes. Très actifs contre les levures et moisissures, leur usage thérapeutique est cependant limité à cause de leur nocivité sur les cellules animales et humaines. D’autres, comme la daptomycine (lipopeptide), provoquent la formation de canaux ioniques chez les bactéries Gram+.

14 - LES ANTIBIOTIQUES

317

Les pénicillines et les céphalosporines, la vancomycine, la bacitracine et la cyclosérine exercent leurs effets bactéricides en bloquant certaines étapes spécifiques dans la biosynthèse des constituants majeurs des parois cellulaires bactériennes : inhibition des transpeptidases et inhibition de la synthèse des peptidoglycanes, respectivement. De même, les antibiotiques actifs contre les champignons sont soit fongistatiques (kétoconazole, fluconazole) ou fongicides (amphotéricine, nystatine). Leurs mécanismes d’action sont souvent similaires à ceux exercés sur les bactéries et comprennent : interaction avec les membranes cellulaires entraînant la libération de leurs contenus cytoplasmiques (amphotéricine, nystatine) ; interférence avec la synthèse des constituants membranaires (kétoconazole, fluconazole) ; interférence avec la synthèse des acides nucléiques (5-fluorocytosine) et perturbation de l’assemblage des microtubules (griseofulvine). Les antibiotiques sont aussi utilisés pour la sélection de souches bactériennes transformées, (techniques utilisant leur sensibilité aux antibiotiques), pour le blocage de la réplication de l’ADN par des antibiotiques intercalaires (daunomycine) et pour l’inhibition de la transcription ADN-ARN par les ansamycines et l’actinomycine D.

14.5.2. MÉDECINE Capables d’arrêter (bactériostatiques) ou de neutraliser (bactéricides) la croissance des bactéries, les antibiotiques permettent de lutter efficacement contre les maladies infectieuses en éliminant les bactéries pathogènes et sont souvent le seul moyen pour y parvenir. Cependant, suite à l’utilisation massive des antibiotiques en thérapeutique humaine et à leur utilisation comme facteurs préventifs et de croissance dans l’alimentation des animaux consommés par l’Homme, l’efficacité de ces agents antiinfectieux est désormais remise en cause par le phénomène de l’antibio-résistance1. Les antibiotiques sont aussi utilisés pour leurs propriétés antitumorales (actinomycine, adriamycine, rebeccamycine), et leurs diverses autres activités biologiques (immunosuppressives, immunostimulantes). L’actinomycine D (fig. 14.5), produite par le champignon Actinomyces antibioticus, est un antibiotique antitumoral efficace. C’est un dérivé phenoxazone ayant deux chaînes latérales constituées de cycles pentapeptidiques de part et d’autre d’un noyau hétérocycliRVF
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GPSNF
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pour des compléments d’information, voir La résistance aux antibiotiques sur le site web dédié

318

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La cyclosporine inhibe également la transcription de nombreux gènes, parmi lesquels ceux des interleukines (IL-2, IL-3) et d’autres cytokines produites par les cellules T activées. Il s’ensuit un arrêt de la croissance des lymphocytes T, d’où un effet immunosuppresseur marqué. O N

N

O

O

O N

MeLeu MeVal

N

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C

Abu MeGly

HN O

O

O

HN

MeLeu D Ala Ala MeLeu Val MeLeu O O N

H O N

O

NH

N

NH2

O O

O

O O

N N O

Figure 14.5 Structure de l’actinomycine D (à gauche) et de la cyclosporine (à droite)

14.5.3. AGRO-ALIMENTAIRE Des antibiotiques destinés uniquement à l’agriculture ont été développés. Ils sont exploités dans différents domaines : contrôle des maladies des végétaux (blasticidine), insecticides (nikkomycine), herbicides (phosphinothricine) et régulateurs du métabolisme végétal. Ces produits présentent l’avantage d’être actifs à très faible concentration (10 à 50 mg/kg) et rapidement biodégradables. Durant des décennies, l’industrie agro-alimentaire s’est mise à utiliser régulièrement des antibiotiques dans l’alimentation animale dans deux buts : X en tant qu’additif dans un aliment supplémenté, pour stimuler la croissance des animaux d’élevage ou en vue d’une prophylaxie anticoccidienne chez certains groupes d’animaux (volailles) ; X en tant que médicament vétérinaire dans un aliment médicamenteux, pour un traitement préventif (le plus fréquent) ou curatif. Susceptibles d’entraîner des phénomènes de résistance1 chez l’Homme mais aussi chez les animaux et les végétaux, plusieurs antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance ont été progressivement interdits dans l’alimentation animale par la Commission Européenne depuis 1997. La nisine fait partie des bactériocines, une famille qui regroupe de petites molécules aux propriétés antibiotiques naturellement produites par de nombreuses bactéries

14 - LES ANTIBIOTIQUES

319

lactiques lors de leur croissance. Elle possède un double mode d’action antimicrobienne : elle inhibe la synthèse de la paroi cellulaire et forme des pores au niveau de la membrane cytoplasmique permettant le passage des petites molécules. Elle est produite par les souches de Lactococcus lactis ssp. lactis, et manifeste une activité antimicrobienne vis-àvis de diverses bactéries Gram+ dont certaines bactéries lactiques, Bacillus, Clostridium, Listeria, ainsi que les bactéries du genre Streptococcus. De ce fait, l’industrie alimentaire l’utilise comme additif alimentaire pour la préservation des aliments contre l’infection microbienne, notamment de certains fromages affinés et fromages fondus, des légumes en conserves (ex. tomates), des poissons fumés et des sauces. La nisine ingérée est inactivée par la trypsine et la pancréatine et n’a aucun effet sur la flore intestinale. Elle est la seule bactériocine autorisée comme agent de conservation à travers le monde mais n’a actuellement aucune utilisation thérapeutique. Les quantités permises sont réglementées et varient selon le type de denrée alimentaire et selon le pays. Structuralement, il s’agit d’un polypeptide pentacyclique de 34 acides aminés, à caractères cationique et hydrophobe, de masse moléculaire 5,8 à 6,3 kDa, appartenant à la famille des lantibiotiques car contenant des groupes lanthionine et méthyllanthionine. La nisine existe sous deux formes ou variants (A et Z), qui diffèrent par un seul acide aminé substituant l’histidine en position 27 dans la nisine A et l’asparagine dans la nisine Z. La nisine A (fig. 14.6) est formée d’un seul résidu de lanthionine (Ala-S-Ala) et de quatre résidus de 3-méthyllanthionine (Abu-S-Ala). En outre, la nisine contient trois acides aminés insaturés, un 2,3-déhydroalanine (Dha) et deux 2,3-déhydrobutyrines (Dhb). Partant de l’extrémité N-terminale, les noyaux sont nommés de A à E. Les noyaux A, B, et C sont tous séparés tandis que les noyaux C et D forment un bicycle. Ala Ile Dhb S Ile

A

Ala Leu Gly

Dha Leu Ala Abu

Abu S B

Lys

Pro Gly

Ala

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Ser Abu Ala Ile C Gly Ala Ala His D His Ala S Abu S Val Asn Lys Dha Met Lys

Figure 14.6 - Structure de la nisine A Abu : acide 2-aminobutyrique

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS 15.1. INTRODUCTION Alors que les polysaccharides extraits des plantes terrestres et des algues (comme l’amidon, la cellulose, l’agar et l’alginate) sont exploités industriellement depuis de nombreuses années, les polysaccharides microbiens ne le sont que depuis quelques décennies. La diversité des structures polysaccharidiques est bien plus importante chez les micro-organismes que chez les plantes ; ainsi, une vingtaine de polysaccharides microbiens présentant un potentiel commercial ont été décrits dans la littérature. Cette diversité de structure est due, entre autres, à la variété des sucres rencontrés dans les polysaccharides microbiens beaucoup plus élevée que celle des polysaccharides d’origine végétale. De plus, les micro-organismes sont considérés comme une source riche et encore sousexploitée de polysaccharides. Certaines bactéries ont la capacité de produire naturellement une couche extérieure à leur paroi cellulaire, constituée principalement de polysaccharides, d’où le nom d’exopolysaccharides (EPS) donné à ces molécules. Si la couche reste étroitement attachée à la paroi, par le biais de lipopolysaccharides ou de phospholipides, elle est nommée « capsule ». Par contre, si elle est diffuse dans le milieu de culture et non-organisée, elle se nomme couche mucoïde. On appelle parfois ces sécrétions des «gommes». Les cellules produisant des EPS forment habituellement des colonies mucoïdes sur des milieux solides et des cultures en milieu liquide de ces cellules peuvent devenir très visqueuses. Cependant, les conditions de croissance peuvent influencer la composition, les propriétés physiques et l’organisation des EPS. Cette couche peut être observée en microscopie optique après coloration ou en microscopie électronique. Les EPS sont produits surtout par les bactéries saprophytes libres ou pathogènes pour l’homme, les animaux et les plantes. Ils sont également produits par la plupart des microalgues, mais aussi par certaines levures et quelques champignons. Les bactéries transforment efficacement leurs différentes sources de carbone en une gamme variée de polymères présentant des propriétés physiques et chimiques très variables. Bien que les bactéries ne synthétisent que quelques polymères intracellulaires, la gamme de polymères extracellulaires qu’elles peuvent synthétiser est beaucoup plus vaste. Certains de ces polymères sont aussi présents chez un large éventail de Procaryotes, tandis que d’autres polymères peuvent être spécifiques à certains taxons bactériens et ont des fonctions biologiques bien précises. Certaines espèces bactériennes sont capables de synthétiser plusieurs types de polymères.

322

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Les EPS remplissent plusieurs fonctions biologiques différentes dont les principales sont : l’agrégation des cellules bactériennes, l’adhérence sur des surfaces, la reconnaissance des cellules, la protection des cellules contre des éléments nuisibles et des fluctuations du milieu (composés toxiques, bactériocines, attaques phagiques…) en masquant les sites de reconnaissance, la rétention d’eau pour minimiser la dessiccation de la cellule. Parmi les fonctions les mieux décrites, il y a celle d’assurer la fixation irréversible des microorganismes sur les surfaces exposées en milieu naturel et de favoriser, en concentrant et en adsorbant des composés organiques exogènes et des oligo-éléments nécessaires à leur croissance, menant à la formation de biofilms. Cette biosynthèse des EPS joue un rôle pionnier car dans la grande majorité des cas, c’est la première étape d’une suite de séquences d’installation de micro-organismes qui vont conduire, en milieu marin, à la formation de macrosalissures ou « fouling ». Enfin, ils sont présents dans des environnements très divers et sont responsables, par exemple, du colmatage des holéoduques oléoducs et des échangeurs de chaleur ou à un tout autre niveau de la plaque dentaire. Les polymères microbiens trouvent de plus en plus d’applications dans de nombreux domaines. Ils présentent l’avantage sur les polymères végétaux d’être produits dans des conditions contrôlées permettant une maîtrise parfaite de leur qualité. Leurs propriétés spécifiques sont souvent liées à la régularité de leur structure chimique qui peut donner, en solution, une conformation de chaîne hélicoïdale, ce qui augmente la rigidité de la chaîne et permet dans certains cas la formation de gel. En conséquence, ces polymères sont généralement employés dans de nombreux domaines pour leurs propriétés visqueuses, viscoélastiques et gélifiantes dans les milieux aqueux. Comme polymères bactériens présentant un réel intérêt industriel et biotechnologique, il convient de citer en premier lieu les polysaccharides, en particulier les EPS et les PHA (polyhydroxyalcanoates), plus connus sur le nom de polyesters. L’application commerciale réussie des EPS microbiens repose sur l’exploitation de leurs propriétés physiques uniques. Ces propriétés concernent la rhéologie des EPS en solution et à leur capacité à former des gels à des concentrations relativement faibles. Les propriétés physiques des EPS découlent en grande partie de leur masse moléculaire élevée, de leur conformation moléculaire déterminée par leur structure primaire et de l’association de leurs molécules en solution. Les polyesters naturels sont issus de fermentation par de nombreuses bactéries appartenant aux genres Pseudomonas, Azotobacter, Hydrogenomonas, Chromatium, Halomonas… Ils présentent un intérêt croissant, ces dernières années, en raison de leurs nombreux atouts. Parmi ces polymères, les plus connus sont le PHB (polyhydroxybutyrate), le PHV (polyhydroxyvalérate) et le PHBV (3 polyhydroxybutyrate-3-hydroxyvalérate). Plusieurs polymères bactériens sont déjà produits dans le commerce par fermentation à moyenne ou à grande échelle comme, par exemple, des polyesters, le xanthane et le dextrane, entrant ainsi en compétition dans les applications avec d’autres polymères d’origine naturelle ou synthétique. Toutefois, les biopolymères provenant de ressources naturelles ont un avantage concurrentiel, en raison de leur production durable à partir de ressources renouvelables, leur biodégradabilité et, souvent, leur biocompatibilité. La

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

323

possibilité d’apporter des modifications chimiques à leur structure leur donne une valeur ajoutée supplémentaire. Lorsqu’ils sont exposés à la flore microbienne présente dans un environnement donné (par exemple, dans le sol ou dans l’eau) dans un environnement aérobie, les biopolymères sont entièrement dégradés et minéralisés en CO2 et H2O. Les hydrolases et les dépolymérases sécrétées par la microflore dégradent le biopolymère, conduisant à des produits de dégradation de faible masse moléculaire, qui peuvent ensuite être absorbés par les micro-organismes du sol pour être utilisés comme sources de carbone et d’énergie. En outre, les biopolymères sont composés d’éléments naturels non-toxiques et sont considérés comme intrinsèquement biocompatibles. Cette biocompatibilité a été mise à profit dans de nombreuses applications médicales dans lesquelles les biopolymères ont été utilisés comme matrices ou supports comme en génie tissulaire, en pansement et en administration de médicaments. Certains biopolymères sont progressivement dégradés in vivo ; cette aptitude les rend très intéressants pour une utilisation lors du remplacement de tissus humains et pour la libération contrôlée de médicaments.

15.2. HOMOPOLYSACCHARIDES 15.2.1. β-D-GLUCANES 15.2.1.1. CELLULOSE La cellulose est considérée comme la plus abondante macromolécule, produite par presque tous les groupes d’organismes vivants. Dans la nature, elle est produite en grande quantité par les plantes et certaines algues où elle constitue un élément essentiel des parois cellulaires. Chez la plupart des autres organismes, elle est sécrétée comme un produit extracellulaire et, donc, ne joue aucun rôle structurel et ne contribue à aucune fonction connue dans les cellules qui la produisent. Chez les bactéries, la cellulose est produite comme exopolysaccharide par Gluconacetobacter xylinus (précédemment nommée Acetobacter xylinum) et d’autres espèces principalement Gram– appartenant aux genres Aerobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium et Sarcinas. Chez ces bactéries, la cellulose est excrétée dans le milieu où elle s’agrège rapidement en microfibrilles.

Structure et composition chimique Les souches bactériennes d’Acetobacter xylinum et A. pasteurianus sont capables de produire une forme presque pure de la cellulose (homo-β-(1J4)-glucane). Sa structure chimique et physique est identique à celle de la cellulose végétale (voir fig. 1.15). Lors de sa production, cette dernière doit, toutefois, subir un traitement drastique chimique pour éliminer la lignine, les hémicelluloses et les pectines. Ce traitement altère gravement les caractéristiques physiques de la cellulose végétale : le degré de polymérisation diminue presque dix fois et les propriétés de cristallisation sont modifiées.

324

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La cellulose bactérienne, quant à elle, est traitée dans des conditions ambiantes. Elle est hautement cristalline ; 70 % est sous forme de cellulose I et le reste est amorphe. Cette composition se traduit par de remarquables propriétés physiques. Une cellule unique de G. xylinus peut polymériser jusqu’à 200 000 molécules de glucose en une chaîne linéaire de β-(1J 4) glucane excrété sous forme de fibrilles. Ces dernières sont assemblées en microfibrilles qui s’agrègent en rubans entrelacés en formant une pellicule gélatineuse vers l’extérieur de la cellule.

Propriétés physico-chimiques Typiquement, les réseaux de microfibrilles de cellulose bactérienne augmentent la surface de contact avec le milieu extérieur et retiennent une grande quantité d’eau tout en conservant un haut degré de cohérence structurelle. La forte densité des liaisons hydrogène inter- et intra-fibrillaires offre une grande résistance mécanique à cette couche cellulosique. Par rapport à la cellulose végétale, la cellulose bactérienne possède d’excellentes propriétés : pureté élevée, haut degré de polymérisation, haut degré de cristallisation, grande hydrophobie et haute résistance.

Production Diverses méthodes sont utilisées pour la production de la cellulose bactérienne comme la culture des bactéries en milieu non-renouvelé, la culture discontinue alimentée et la culture continue utilisant des bioréacteurs typiques ainsi que plusieurs dispositifs spécifiques. Le choix d’une technique de culture dépend de l’application de la cellulose, étant donné que sa structure supramoléculaire et ses propriétés physiques et mécaniques sont étroitement influencées par la méthode de production. Selon la méthode et les conditions de culture, la cellulose peut être produite sous différentes formes et tailles (ex. feuilles ou pellicules minces, sphères, agrégats fibreux, tubes ou masses irrégulières comme les pâtes). Jusqu’à présent, les matériaux plats de cellulose ont gagné en importance commerciale en raison de la facilité de mise en place de la technique de culture statique qui permet de les obtenir dans différents types de dispositifs. La cellulose en feuilles est habituellement produite par culture statique conventionnelle ou en culture sur couche mince sur les phases solides comme la gélose, la silicone ou sur des membranes poreuses. Sur ces supports, la cellulose peut être accumulée à l’interface air/milieu de culture. Les propriétés de la cellulose produite peuvent être contrôlées par différents paramètres du processus de culture (variation du volume du milieu de culture, rapport surface/volume du milieu, temps de la culture, type de bioréacteur…) et par l’utilisation de différentes souches. La culture agitée ainsi que les procédures de production qui en dérivent sont les plus fréquentes. Un fermenteur typique pour une culture en mode agité est constitué d’un récipient cylindrique, généralement en inox ou en verre, d’un dispositif d’agitation, d’entrées et de sorties régulées pour le milieu de culture frais, la récupération de la biomasse, l’air ou l’oxygène, d’une double paroi dans laquelle circule un liquide de refroidissement ou

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

325

de chauffage et des systèmes de contrôle des paramètres de culture comme la teneur en oxygène, la densité cellulaire, la température et le pH. La culture statique ne permet pas d’obtenir des rendements importants et, de plus, exige de grandes surfaces contrairement à la culture agitée en fermenteur qui donne, par ailleurs, une cellulose sous diverses formes se destinant à différentes applications : suspension
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souches de Gluconacetobacter comme la souche ATCC 53582, s’avèrent être s’adaptées à la culture agitée, probablement à cause des forces de cisaillement provoquant la cassure des cellules bactériennes qui se traduit par une réduction dans la biosynthèse de cellulose. En outre, la culture agitée favorise la formation spontanée de mutations des celMVMFT
CBDUÏSJFOOFT
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MFT
SFTUSJDUJPOT
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culture agitées présentent un potentiel unique pour une utilisation industrielle et ce dans divers domaines d’application. Les souches de G. xylinus ont la capacité d’utiliser une grande variété de substrats (mannitol, glycérol, saccharose et galactose, en plus du glucose et du fructose) et d’autres composés pour la synthèse de la cellulose. Dans les cultures en laboratoire de G. xylinus, le glucose est habituellement fourni au milieu. Quatre étapes enzymatiques ont été caractérisées dans la voie métabolique menant du glucose à la cellulose. Il s’agit de la phosphorylation du glucose par la glucokinase, de l’isomérisation du glucose-6-phosphate en glucose-1-phosphate par la phosphoglucomutase, de la synthèse de l’uridine diphosphate glucose (UDP-glucose) à partir de glucose-1-phosphate par la UDP-glucose pyrophosphorylase et enfin de l’assemblage des unités β-(1J 4)-glucosidiques en chaîne de cellulose par la cellulose synthase. Bien qu’une grande partie (près de 50 %) du glucose fourni soit transformée en cellulose, une fraction importante présente dans le milieu est convertie en acide gluconique dans les premiers stades de la culture des cellules G. xylinus
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stades de la culture, l’un des objectifs de la production commerciale de la cellulose est d’isoler les souches qui produisent moins d’acide gluconique et, donc, d’augmenter le rendement en cellulose. Un aspect beaucoup plus intrigant du métabolisme carboné est lié au mode de vie de G. xylinus et à son incapacité à métaboliser le glucose par voie anaérobie à cause de l’absence d’activité de la phosphofructokinase chez cette bactérie.

APPLICATIONS A ce jour, la cellulose bactérienne est plutôt moins exploitée que la cellulose issue du monde végétal, mais elle représente un biomatériau émergent à fort potentiel dans plusieurs applications. La performance de cellulose bactérienne découle de sa grande pureté, de sa structure en réseaux ultrafins et de ses excellentes propriétés mécaniques. Les propriétés physiques et mécaniques uniques de la cellulose bactérienne ainsi que sa pureté peuvent être exploitées dans des applications multiples telles que des membranes acoustiques de haute qualité, des membranes de séparation, du papier électronique et des matériaux biomédicaux. De plus, la cellulose bactérienne se prête bien à des modifications qui élargissent encore son potentiel et qui peuvent être, selon les applications envisagées, des modifications chimiques, l’incorporation de molécules bioactives ou la modification de la porosité et de la cristallinité.

326

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Bien que chimiquement identique à la cellulose végétale, la cellulose bactérienne possède une nanostructure fibrillaire qui détermine les propriétés physiques et mécaniques, qui sont nécessaires à la médecine moderne et à la recherche biomédicale. Dans ce domaine, la cellulose bactérienne peut être utilisée comme peau artificielle provisoire pour diminuer les pertes d’eau ou pour empêcher la déshydratation des tissus endommagés. De plus, sa haute capacité de rétention d’eau semble stimuler la cicatrisation tout en limitant les infections. Elle est également utilisée pour la fabrication de pansements, pour l’élaboration de microendoprothèses vasculaires ou de support pour cartilage. Le vieillissement s’accompagne d’une détérioration progressive du système squelettique, telles que l’ostéoporose et les problèmes dentaires. Il existe une demande croissante pour concevoir et fabriquer des matériaux biocompatibles à hautes performances qui imitent la qualité unique de l’os naturel. Le tissu osseux est constitué de cellules spécialisées dispersées dans une matrice organique riche en fibres de collagène et d’une phase minérale inorganique composée essentiellement de calcium et de phosphate. La fraction organique synthétisée par les ostéoblastes intervient dans la formation de cristaux d’apatite (minéraux calcium-phosphate) de microstructures distinctes pouvant résister aux forces mécaniques subies par le tissu osseux. La structure 3D ultrafine du réseau de cellulose bactérienne avec ses propriétés uniques natives est ainsi exploitée pour la synthèse de matériaux analogues aux tissus mous et durs, humains et animaux. En outre, l’évaluation in vivo de biocompatibilité de la cellulose bactérienne chez le rat a démontré qu’elle est bien intégrée dans les tissus de l’hôte et qu’elle ne provoque pas de réaction inflammatoire chronique, ce qui en fait un matériau de support potentiellement intéressant pour l’ingénierie tissulaire biomédicale.

15.2.1.2. CURDLANE Un certain nombre de souches bactériennes dont Alcaligenes faecalis et des espèces appartenant aux genres Agrobacterium et Rhizobium, produisent plusieurs EPS distincts dont le curdlane. Il est également produit exceptionnellement par la bactérie cellulolytique, à Gram+, Cellulomonas flavigena comme polymère de stockage extracellulaire, ce qui en fait l’unique EPS bactérien connu pour jouer ce rôle.

Structure et composition chimique Le curdlane est un β-D-glucane linéaire, neutre, constitué de motifs de D-glucose liés en β-(1J 3), d’une masse moléculaire d’environ 74 kDa.

Propriétés physico-chimiques Le curdlane est insoluble dans l’eau froide à pH neutre, mais se dissout dans les alcalis et MF
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%.40 
En suspension aqueuse, il forme un gel faible après un chauffage à plus de 54 °C par formation de zones de jonction localisées le long des chaînes du polymère. Un chauffage à plus haute température (ex. 100 à 120 °C) augmente la fermeté du gel en donnant des gels très structurés en triple hélice, fermes et thermostables. Quand la température est

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

327

inférieure à 54 °C, des gels mous et thermoréversibles se forment au refroidissement. Ces gels ont des propriétés se situant entre l’élasticité de la gélatine et la fragilité de l’agar et montrent une bonne capacité de rétention d’eau. La formation de gel de curdlane est indépendante des ions et les gels sont stables dans une large gamme de pH (3 à 9).

Production L’extrait de levure s’avère être la meilleure source d’azote pour la production de curdlane. C’est un mélange complexe d’acides aminés, de peptides et de protéines ainsi qu’une bonne source de vitamines du complexe B et de sels minéraux. La production est favorisée par un milieu minimal ayant un ratio C/N élevé. L’addition d’un tampon phosphate pour maintenir un pH approprié durant la culture, permet d’améliorer la productivité.

APPLICATIONS L’utilisation du curdlane en industrie alimentaire n’est pas autorisée en Europe. Au Japon, en Corée et à Taïwan, le curdlane est utilisé principalement dans l’industrie alimentaire pour améliorer et modifier la texture des aliments comme les préparations cuisinées à base de poisson ou de viande ou comme ingrédient essentiel dans les nouilles, le tofu, les pâtes de poisson et surtout dans les gels de fèves qu’il rend plus fermes et plus stables à la congélation/décongélation. Dans le domaine médical, il a été démontré que le curdlane sulfaté a des propriétés antivirales et antithrombiques (empêche la formation de caillots sanguins). Il est également utilisé comme tamis moléculaire et comme support d’enzymes immobilisées.

15.2.2. α-D-GLUCANES 15.2.2.1. PULLULANE Le pullulane est un EPS produit à partir de l’amidon par le champignon polymorphe Aureobasidium pullulans (anciennement Pullularia pullulans) et certains autres microorganismes avec une gamme variée de propriétés chimiques et physiques. Le pullulane est parfois synthétisé en même temps que d’autres EPS.

Structure et composition chimique Le pullulane est un α-D-glucane linéaire constitué d’un assemblage mixte linéaire d’unités de maltotriosyl répétitives, reliées entre elles par des liaisons α-(1J 4) pour former un polymère de masse moléculaire de 100 à 1000 kDa selon la souche et le milieu de culture utilisés. Chaque maltotriose (un triholoside de glucose), l’unité fondamentale du pullulane, contient deux liaisons  α-(1J 4) ; le troisième glucose du maltotriose est lié à une autre unité de maltotriose par une liaison α-(1J 6) (fig. 15.1). La formule développée du pullulane correspond à : [α-D-Glup-(1J 4)-α-D-Glup-(1J 4)-α-D-Glup-(1J 6)]n

328

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Toutefois, d’autres structures particulièrement le tétramère ou maltotétraose, [α-D-Glup-(1J 4)-α-D-Glup-(1J 4)-α-D-Glup-(1J 4)-α-D-Glup-(1J 6)]n peuvent être présentes dans la chaîne du pullulane jusqu’à concurrence de 7 %. La majorité des unités du tétrasaccharide se retrouve dans les parties intérieures (non-terminales) du polymère, avec une distribution aléatoire apparente tout au long de la molécule. L’alternance régulière des liaisons α-(1J 4) et α-(1J 6) engendre une flexibilité structurelle et améliore la solubilité. O HO HO

HO

O OH HO

O

HO

O OH HO

O OH

O O

HO HO

HO

O

O OH HO

HO

O OH HO

O OH n

maltotriose

maltotriose

Figure 15.1 - Fragment du polymère du pullulane

Propriétés physico-chimiques Le pullulane se présente sous forme d’une poudre blanche, inodore et fade ; il est non-hygroscopique, mais très soluble dans l’eau et insoluble dans les solvants organiques. Ses solutions aqueuses sont stables dans une large gamme de pH (pH 3 à 8) et montrent une viscosité relativement faible par rapport à d’autres polysaccharides et ne forme, donc, pas de gel. Il se décompose entre 250 et 280 °C. Il est malléable et forme des films transparents et hydrosolubles, imperméables à l’oxygène. Il peut être plastifié par estérification ou éthérification. La solubilité du pullulane peut être contrôlée ou modifiée à l’aide de groupements réactifs de dérivatisation chimique.

Production Commercialement, le pullulane provient du processus de fermentation par Aureobasidium pullulans (champignon ubiquiste) ou d’espèces voisines se développant sur des substrats glucidiques très variés comme des sucres (saccharose, glucose, fructose, maltose) mais aussi des sources carbonées plus complexes comme du lait de coco, du sirop de maïs, de la mélasse de betterave… Les cellules sont ensuite récoltées par microfiltration ou par centrifugation. Le filtrat ou le surnageant est stérilisé à la chaleur et les cellules brisées mécaniquement ou par traitement enzymatique. Le pullulane est alors extrait à l’eau ou par précipitation à l’aide d’un solvant organique. Les pigments et les autres impuretés sont éliminés par adsorption, par chromatographie d’échange d’ions ou par ultrafiltration. La masse moléculaire moyenne du pullulane commercial dépend des conditions de culture ; elle est généralement de l’ordre de 200 kDa. La nature du substrat, sa concentration

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en carbone et en azote, le pH, la concentration en oxygène et la température sont les principaux paramètres intervenant dans la synthèse du pullulane. Différents déchets agro-industriels ont été utilisés comme substrats pour la production du pullulane comme les déchets de fécule de pomme de terre, l’hydrolysat de tourbe, le lactosérum, la mélasse de betteraves, le jus concentré de canne à sucre, les gousses de caroube, le topinambour, les patates douces, les sous-produits de la noix de coco, les déchets de brasserie et les effluents résiduaires d’huile d’olive. Toutefois, dans certains cas, le rendement et, par suite, l’économie du processus ne sont pas toujours satisfaisants. Certains types de substrats comme les déchets amylacés nécessitent plusieurs étapes d’hydrolyse pour fournir une source de carbone utilisable, ce qui réduit son intérêt économique. L’avantage des résidus agro-industriels est leur disponibilité en grande quantité, leur faible coût et leur haute valeur nutritive. La source d’azote placée dans le milieu de culture, habituellement des ions ammonium (NH4+), joue un rôle important dans la production du pullulane. L’épuisement de l’azote est considéré comme un signal pour la formation des EPS par fermentation. Des sources alternatives d’azote comme l’urée, les sels d’ammonium… ont été utilisées avec un succès limité pour la production du pullulane. À l’heure actuelle, le processus de préparation du pullulane diffère selon l’application prévue. Pour une utilisation comme adhésifs industriels, dispersants et coagulants, le bouillon de fermentation est simplement concentré, séché et pulvérisé. Pour une utilisation alimentaire, la culture est décolorée à l’aide de charbon actif, concentrée, séchée et pulvérisée. En ce qui concerne les utilisations pharmaceutiques, le bouillon de fermentation est purifié par fractionnement alcoolique ou filtration membranaire, décoloré à l’aide de charbon actif, dessalé puis concentré, séché et pulvérisé.

APPLICATIONS Le pullulane a de nombreux usages potentiels en raison de sa capacité à former des films étanches à l’oxygène. C’est également le substrat de l’enzyme pullulanase (EC : 3.2.1.41, pullulane 6-glucanohydrolase) excrétée par les souches de Klebsiella aerogenes et par d’autres bactéries et donc une source utile de maltotriose. Les pullulanases sont très répandues chez les animaux, les plantes, les champignons et les bactéries. Les mécanismes enzymatiques de dégradation du substrat et les produits finis qui en résultent sont différents dans chaque cas. Le pullulane est utilisé dans l’industrie alimentaire, pharmaceutique, et pour diverses applications industrielles. Dans l’industrie pharmaceutique Le pullulane est maintenant largement étudié pour diverses applications dans l’industrie pharmaceutique. C’est principalement en raison de ses propriétés non-toxiques, non-immunogènes et biodégradables. En comparaison avec le dextrane, un polysaccharide semblable mais plus connu, la vitesse de dégradation du pullulane dans le sérum est plus rapide. Le pullulane et ses dérivés peuvent servir comme crème adhésive pour les prothèses dentaires. Les adhésifs ou les pâtes sont préparés par dissolution du pullulane estérifié ou éthérifié dans de l’eau ou dans un mélange d’eau et d’acétone.

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PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Le pullulane est un polysaccharide ayant une forte affinité avec le foie. Compte tenu de cette propriété, le complexe interféron - pullulane a été appliqué avec succès chez des souris pour le ciblage de l’interféron (IFN) vers le foie et a montré une efficacité accrue de son activité antivirale. Injecté par voie intraveineuse, le complexe IFN - pullulane améliore l’accumulation hépatique de l’IFN et sa période de rétention. Les autres applications du pullulane dans le domaine pharmaceutique sont : la fabrication de capsules solubles dans l’eau, l’enrobage de médicaments, l’élaboration de nanoparticules libératrices de molécules bioactives et comme agent de charge dans certaines formulations galéniques. Dans l’industrie agro-alimentaire Comme additif alimentaire, il est connu en Europe sous le numéro E1204. Ses bonnes propriétés filmogènes, sa très faible perméabilité à l’oxygène et sa biodégradabilité sont des atouts majeurs du pullulane dans le domaine alimentaire. Il est utilisé au Japon comme film d’emballage alimentaire. Une solution du polymère peut être appliquée directement sur l’aliment et former un revêtement sans odeur et sans goût. Il est, de plus, comestible. Les autres utilisations industrielles typiques du pullulane dans le domaine alimentaire sont : l’enrobage de produits alimentaires qui peuvent être lavés avant usage (pour dissoudre le film) ou consommés directement, comme ingrédient dans la fabrication d’aliments diététiques hypocaloriques, comme substitut de l’amidon et de la gélatine pour augmenter la consistance des aliments et comme épaississant dans les confitures, les sauces… Applications industrielles Comme colles et adhésifs sous forme de pâtes avec de l’eau. Dans la construction pour recouvrir des surfaces. Sous forme de fibres (après estérification) semblables à la soie et dont la résistance à l’élongation est comparable à celle des fibres de nylon. Comme plastique, comparable au polystyrène du point de vue de la transparence et de la résistance. Il est plus élastique que le polystyrène. Autres applications Le pullulane est également utilisé au laboratoire dans les colonnes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et en chromatographie d’exclusion moléculaire comme étalon.

15.2.2.2. DEXTRANE Le dextrane est un exopolysaccharide produit par Leuconostoc mesenteroides cultivé dans une solution de saccharose. Cet organisme Gram+ présente des cellules sphériques ou ovoïdes et est anaérobie facultatif. En dehors du dextrane et de l’acide lactique, il produit, entre autres, de l’acide acétique, de l’éthanol, du mannitol et du dioxyde de carbone. Le dextrane peut aussi être produit à l’aide d’un extrait enzymatique extracellulaire, la dextrane sucrase (EC : 2.4.1.24).

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

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Le dextrane est également synthétisé par des bactéries appartenant aux genres Lactobacillus et Streptococcus ; chaque polymère étant spécifique de la souche qui l’élabore.

Structure et composition chimique Le dextrane est un exopolysaccharide neutre constitué d’unités de α-D-glucopyranosyles liées par des liaisons de type α-(1J 6) (fig. 15.2) et portant des chaînes latérales très courtes (une ou deux molécules de glucose) attachées aux 3 positions restantes des unités glucosidiques de la chaîne principale par des liaisons (1J 2), (1J 3) ou (1J 4). Le degré de ramification (estimé entre 10 et 30 %) et la nature des liaisons dépendent de la souche bactérienne et des conditions de culture. HO

O O

O

OH O HO α-(1J4)

OH O HO HO

50-5000

α-(1J6)

Figure 15.2 - Fragment du polymère du dextrane

Propriétés physico-chimiques Le dextrane est soluble dans l’eau, le méthyl sulfoxyde, le formamide, l’éthylène glycol, le glycérol, le 4-méthylmorpholine-4-oxyde et l’hexaméthylphosphoramide (un cancérogène). Certaines fractions de dextrane peuvent présenter un certain degré de cristallinité et ne donner des solutions que sous l’effet d’un chauffage intense. La masse moléculaire du dextrane natif varie de 9103 à 500 103 kDa, selon les auteurs.

Production La plupart des grands systèmes de production de dextrane utilise un procédé basé sur la culture discontinue de souches sélectionnées de Leuconostoc mesenteroides (Lactobacillacées) sur un milieu riche en saccharose. Le produit obtenu comporte environ 95 % de liaisons (1J 6) et 5 % de liaisons (1J 3) et a une masse moléculaire d’environ 40.103 3 à 50.10 kDa. Pour de nombreuses utilisations, la masse moléculaire est réduite par hydrolyse acide douce. Le bouillon de culture visqueux est précipité dans l’éthanol ou le méthanol, après quoi le dextrane natif obtenu est hydrolysé partiellement par un acide dilué ou à l’aide d’enzymes fongiques ou d’ultrasons et le dextrane est ensuite isolé par fractionnement. Il existe actuellement des techniques alternatives, mais la technique décrite précédemment est la plus utilisée et ceci depuis plusieurs décennies. Bien que de nombreux sucres comme le sucre inverti et le maltose, puissent servir de sources d’énergie pour la croissance des bactéries, seul le saccharose permet d’induire la production de la dextrane sucrase, enzyme qui réalise la polymérisation des résidus α-glucopyranosyles en transférant le glucose à partir du saccharose. Ainsi, les milieux de culture contiennent nécessairement du saccharose additionné de différents nutriments.

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PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

La thiamine, l’acide nicotinique, l’acide pantothénique sont essentiels pour tous les Leuconostoc et la cystine, l’acide glutamique, l’isoleucine et la valine pour L. mesenteroides en particulier. Dans la pratique, ces exigences sont satisfaites par les extraits de levure, les extraits de liqueurs fermentées de maïs, la caséine acide hydrolysée ou l’extrait de malt (généralement additionné de bouillon de peptone ou de tryptone). Des sels de phosphate (ex. dihydrogénophosphate de sodium) à 0,5 % sont également ajoutés.

APPLICATIONS Des dérivés amphiphiles du dextrane sont utilisés comme tensioactifs et émulsifiants. Ces dérivés hydrophobes, biocompatibles et biodégradables, sont obtenus par réaction d’un époxyalcane sur les groupements hydroxyles des motifs de glucose. Le dextrane trouve également des applications dans la récupération assistée du pétrole, comme couche protectrice pour les graines de Céréales, comme agent défloculant pour l’industrie du papier et, dans le domaine alimentaire, pour la stabilisation et l’épaississement des sirops. Les dérivés officinaux sont obtenus par hydrolyse et fractionnement de dextranes produits par fermentation du saccharose au moyen de la souche Leuconostoc mesenteroides NRRL-B-512. Le Dextran 1 est un mélange d’isomalto-oligosaccharides, de masse moléculaire d’environ 1 kDa. Les Dextran 40, 60 et 70 désignent des polyosides de masses moléculaires respectives de 40, 60 et 70 kDa. En médecine, afin de limiter des réactions secondaires (réaction anaphylactoïde) induites par l’administration du dextrane, on a recours à l’administration préalable d’un petit volume d’un haptène monovalent (20 mL d’une solution à 15 %) obtenu à partir d’une fraction de dextrane, empêchant ainsi la formation de complexes immuns. Le Dextran 40 est hyperoncotique et agit en augmentant la volémie avant son élimination rapide par les reins. Son utilisation principale est d’améliorer le débit sanguin périphérique (dans la prophylaxie de la thrombose veineuse profonde). L’amélioration du débit sanguin se produit par réduction de la viscosité du plasma et, éventuellement, en réduisant l’interaction entre l’endothélium vasculaire et les composants cellulaires du sang. Les dextranes réduisent l’agrégation plaquettaire, favorisent la fibrinolyse et réduisent l’activité du facteur VIII. Des doses supérieures à 1,5 g/kg produisent une coagulopathie. L’effet antithrombotique des Dextran 40 et 70, démontré expérimentalement et cliniquement, fournit un traitement prophylactique de la thrombose veineuse et de l’embolie pulmonaire post-opératoire. Une dose ne dépassant pas 20 mL/kg de poids corporel de Dextran 40 (10 % dans un soluté physiologique) est recommandée pendant les 24 premières heures chez les patients devant subir une chirurgie à haut risque ou soufrant d’un traumatisme à haut risque. Le Dextran 70, généralement commercialisé sous forme d’une solution à 6 % dans un soluté physiologique est employé comme substitut du plasma sanguin dans les traitements et l’état de choc. Il est recommandé pour le traitement des hémorragies, des brûlures, des traumatismes ou des suites d’une intervention chirurgicale.

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Une solution de Dextran 70 à 32 % stabilisé dans du glucose à 10 %, plus connu sous son nom commercial Hyskon®, est utilisée en hystéroscopie comme aide à la distension de la cavité utérine pour faciliter son exploration et la visualisation de toutes les parties irriguées. L’un des avantages de la solution de Hyskon est son immiscibilité avec le sang, assurant une bonne visibilité au cours d’une hystéroscopie opératoire. Il a également été utilisé pour empêcher la formation d’adhérences tissulaires post-opératoire après chirurgie tubaire ou abdominale. Le Dextran 60 est utilisé comme substitut du plasma pour traiter l’hypovolémie (diminution du volume de plasma sanguin de la circulation) qui peut résulter d’hémorragies graves après la chirurgie, les blessures ou d’autres causes de saignement. Le dextrane ferrique est indiqué dans le traitement de l’anémie chez les porcelets nouveaux-nés. Le dextrane est d’abord chauffé avec un alcali puis neutralisé en présence d’une solution de chlorure ferrique. Une solution de ce complexe contenant 5 % de fer et 20 % de dextrane (Imferon™) est utilisée en injection intramusculaire et/ou intraveineuse pour traiter l’anémie ferriprive. La solution est mieux administrée conjointement avec des solutions de glucose. Le sulfate de dextrane a été testé comme remplacement potentiel pour l’héparine en traitement anticoagulant. Les dérivés de masse moléculaire plus faible affichent des propriétés anticoagulantes supérieures à celles des produits de plus grande masse moléculaire. Cependant, cette activité représente, au mieux, seulement 15 % de l’activité de l’héparine. Néanmoins, une fraction de masse moléculaire de 7 kDa est qualitativement similaire à l’héparine. Le sulfate de dextrane, immobilisé sur la cellulose a été utilisé pour éliminer le cholestérol LDL au cours de la plasmaphérèse. La réaction du chlorure de diéthylaminoéthyl avec le dextrane en présence d’alcalis conduit à un dérivé qui présente un large éventail de propriétés biologiques intéressantes. En particulier, les dextrane-DEAE semblent améliorer un certain nombre de processus cellulaires. Ces processus semblent fonctionner sans effets néfastes sur la viabilité des cellules. Ainsi, la production d’interféron est améliorée par des complexes de polyribonucléotides en présence de dextrane-DEAE. Une préparation de masse moléculaire d’environ 500 kDa, à une dose orale quotidienne de 2 à 3 g, s’est avérée capable de diminuer la cholestérolémie et la triglycéridémie de 8 et 15 %, respectivement. Le dextrane de faible masse moléculaire, à 5 à 10 %, est également utilisé comme solution de perfusion pour la préservation du rein, du foie et de la cornée. Le Debrisan™ est un agent de purification des plaies, préparé sous forme de perles obtenues par polymérisation du dextrane avec l’épichlorhydrine. Le produit qui est destiné à l’application cutanée (environ 4 mL/g), agit en absorbant l’exsudat de blessures infectées, ulcères et plaies cutanées, tout en favorisant leur cicatrisation. Dans un autre domaine, traité par de l’épichlorhydrine, le dextrane donne un réseau tridimensionnel traversé de mailles (ou pores) dont on peut contrôler la dimension. Ce gel réticulé est utilisé comme support en chromatographie d’exclusion stérique pour séparer des biomolécules en fonction de leur taille moléculaire, d’où le nom donné à cette technique. Ces gels (ex. Sephadex, commercialisé par Amersham Biosciences) sont couramment utilisés dans la purification de protéines et de produits pharmaceutiques et d’autres composés médicalement importants. Le Bleu Dextran, un polymère de masse moléculaire 2000 kDa, est couramment utilisé en chromatographie d’exclusion stérique comme indicateur de volume mort.

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PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

15.3. HÉTÉROPOLYSACCHARIDES 15.3.1. XANTHANE C’est, sans conteste, le plus connu des exopolysaccharides bactériens. C’est un hétéropolysaccharide excrété lors de la fermentation aérobie de sucres par une bactérie aérobie, Xanthomonas campestris.

15.3.1.1. STRUCTURE ET COMPOSITION CHIMIQUE De masse moléculaire estimée entre 1500 et 5000 kDa, le xanthane est constitué d’une chaîne principale dont la structure est analogue à celle de la cellulose : enchaînement de glucopyranoses reliés entre eux par des liaisons β-(1J 4) glucosidiques. Il est composé de D-glucose, de D-mannose et d’acide D-glucuronique en proportions 2 : 2 : 1 et partiellement acétylé (3 à 6 %) et pyruvylé (3 à 5 % de pyruvate). Un glucose sur deux de cette chaîne est greffé d’une chaîne latérale hydrophile tri-saccharidique constituée par 2 résidus de α-D-mannopyranoses encadrant 1 résidu d’acide β-D-glucuronique (fig. 15.3). Le premier mannose est lié à la chaîne principale par liaison osidique (1J 3), l’acide glucuronique est lié au premier mannose par liaison osidique (1J 2) et le mannose lié à l’acide glucuronique par liaison osidique  (1J 4). Certaines chaînes latérales peuvent porter un groupement acétyle (COCH3) sur l’hydroxyle en C-6 du mannose adjacent de la chaîne principale ou être pyruvylées, le pyruvate formant un acétal avec les hydroxyles en C-4 et C-6 du mannose terminal. Le degré de ramification et d’acylation peut différer selon la souche de micro-organisme producteur et donner au produit des caractéristiques différentes. Il dépend aussi des conditions et de l’état d’avancement de la fermentation et des conditions d’extraction (température, pH). OH OH O structure cellulosique COO

–

OH

O O

O

OH

O n OH OH mannose acétylé O

OH

O HO O O HO mannose pyruvylé

COO– O HO

OO O

OH acide glucuronique

O

Figure 15.3 - Structure primaire de l’unité pentasaccharidique de la gomme xanthane La molécule se présente donc sous forme d’une chaîne principale cellulosique en hélice, les ramifications tri-saccharidiques étant repliées le long de la chaîne, ce qui confère à la molécule une certaine rigidité. Le polymère possède toujours un caractère anionique marqué, en raison des groupements carboxyliques de l’acide guluronique et de l’acide pyruvique. Dans les produits

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

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destinés à l’alimentation, ces fonctions sont neutralisées par des cations dont les plus couramment rencontrés sont Na+
,+ et Ca2+.

15.3.1.2. PRODUCTION La production industrielle du xanthane est obtenue par fermentation aérobie de Xanthomonas campestris dans de grands fermenteurs où le milieu, contenant des sucres, de l’azote et des sels minéraux, est agité et dont le volume peut aller jusqu’à plusieurs centaines de mètres cubes. Le procédé de culture est le plus souvent discontinu (batch) pour des raisons de facilité de mise en œuvre et de maintien de la stérilité. La fermentation s’opère à une température de 28 °C. Dans ces conditions, le polymère est excrété hors des cellules. La production de xanthane s’arrête quand le pH est de l’ordre de 5,0. Elle est optimale quand la concentration en glucose atteint 1 à 5 %. Quand le glucose ou les autres saccharides du milieu de culture (saccharose, amidon, lactose) ont été totalement métabolisés, le milieu de fermentation (bactéries et exsudât) est pasteurisé et les polysaccharides sont récupérés par précipitation du filtrat de culture par un solvant polaire (éthanol, isopropanol). Le solvant est partiellement recyclé par distillation. Les fibres de xanthane sont débarrassées de toutes traces résiduelles d’eau et d’alcool par des opérations classiques de séparation solide/liquide. En fin de fermentation, la gomme de xanthane est fortement liée aux bactéries. Pour les grades commerciaux standard, il n’est pas nécessaire de séparer la biomasse de la gomme. Une stérilisation du moût précède les phases d’extraction. Elle a pour but de tuer les Xanthomonas et les éventuels contaminants et de dénaturer les enzymes exogènes qui peuvent gêner l’utilisation de la gomme dans certaines formulations (ex. la cellulase dans les mélanges carboxyméthyl-cellulose-xanthane). La température élevée utilisée lors de la stérilisation permet également d’améliorer la solubilité de la gomme de xanthane et de réduire la viscosité de la solution. La gomme est alors précipitée. Les fibres sèches sont broyées et tamisées à la granulométrie désirée pour répondre aux spécifications des clients. L’optimisation des opérations d’extraction vise l’efficacité (qualité du produit) et la diminution du prix de revient (productivité des étapes discontinues et continues, rendement de récupération de la gomme, coût en énergie et en solvant, équipement et maintenance des installations). Le bilan énergétique de l’extraction concerne principalement 3 niveaux : la stérilisation du moût, la distillation du solvant et le séchage des fibres. L’énergie nécessaire dépend des conditions de la stérilisation (volume à traiter, température, temps de séjour), du flux de solvant à distiller et de la pureté recherchée et, enfin, de la teneur en eau désirée. Les données sont propres à chaque industriel. La gomme xanthane est vendue dans le commerce sous forme de sels de sodium, de calcium ou de potassium, en poudre de couleur claire. Des procédés membranaires permettent d’obtenir des concentrats de gomme qu’il convient de stabiliser pour éviter la contamination. Des alternatives à ce schéma classique existent. Grâce à la grande souplesse du procédé (souches différentes, conditions spécifiques de fermentation, nombreuses opérations

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PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

unitaires d’extraction), on peut obtenir des changements de conformation (meilleure fluidité), une purification plus ou moins grande du polysaccharide (élimination des enzymes, des sels, de la biomasse…), une modification de la granulométrie (meilleure dispersabilité, absence de poussière), une modification des degrés d’acétylation et de pyruvylation (résistance à la température, synergie avec les galactomannanes). On peut aussi réaliser la préparation de mélanges intimes (avec des tensioactifs, des huiles…) pour améliorer l’hydratation, ou obtenir la compatibilité avec les sels di- ou trivalents, la préparation des systèmes fonctionnels (synergie avec des galactomannanes et autres), l’obtention d’une plus grande transparence et filtrabilité. L’utilisation de différents mutants de X. campestris et de différentes conditions de nutrition permet aussi d’obtenir une gamme de différents polysaccharides, conformes à la structure générale du xanthane, mais diffèrent par leurs chaînes latérales de glucides et de groupes acyle.

15.3.1.3. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Le xanthane est un épaississant. Sa configuration en double hélice, peu déformable, s’apparente à des bâtonnets rigides. Ses propriétés physico-chimiques principales sont liées aux interactions entre les macromolécules et l’eau.

Solubilité Le xanthane est hydrosoluble aussi bien à froid (dès 10 à 20 °C) qu’à chaud. Cette solubilité est due à la présence de groupements hydroxyles et de charges négatives qui facilitent l’interaction soluté - eau. De plus, les ramifications écartent les chaînes principales, ce qui facilite l’hydratation. On considère celle-ci achevée lorsque l’on a atteint une stabilisation de la viscosité. L’agitation, la température et la finesse des grains augmentent la vitesse d’hydratation tandis que la présence d’électrolytes, compétiteurs vis-à-vis du polysaccharide pour l’eau, provoque l’effet inverse. Le xanthane est insoluble dans la plupart des solvants organiques.

Viscosité Le xanthane donne des solutions visqueuses dès les basses concentrations (1 g/L). À concentration égale, les solutions de xanthane sont très visqueuses, comparées à d’autres solutions d’épaississants, comme l’alginate ou le guar. Les solutions de xanthane sont pseudogélifiées au repos. La viscosité augmente avec la teneur en xanthane et en électrolytes, mais ne dépend que peu de la température (excellente stabilité thermique, la température de transition gel-sol peut être supérieure à 100 °C) et du pH (gamme de 2 à 11). Elle dépend cependant de l’agitation du milieu. Le xanthane forme des solutions pseudoplastiques très visqueuses dans l’eau froide. Ce comportement est d’autant plus important que la concentration en xanthane augmente. Par contre, la pseudoplasticité ne dépend pas du taux des groupes acétyles et pyruvyles. Le xanthane est stable en milieu acide (un avantage sur l’amidon et ses dérivés), supporte les cycles de congélation-décongélation sans synérèse importante et possède, en outre, une excellente compatibilité avec de nombreux composés et la plupart des sels.

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Le xanthane possède enfin de bonnes propriétés émulsifiantes (une vinaigrette à 60 % d’huile est stabilisée pendant plus d’un an par l’adjonction de 0,3 % de xanthane).

Propriétés d’associations Le xanthane, sous sa forme hélicoïdale rigide, accepte bien les mélanges avec des sels et d’autres hydrocolloïdes ; il forme des gels mixtes, très stables, de consistance diverse avec les galactomannanes (guar, caroube). Ceux-ci sont constitués d’un enchaînement linéaire de β-D-mannose liés en (1J 4) et de branchements d’un α-D-galactose en (1J 6). Le xanthane et la gomme de caroube sont deux biopolymères épaississants qui gélifient lorsqu’ils sont mis en présence. Cette synergie de viscosité ne s’obtient qu’après un chauffage préalable pour dégager les zones non-substituées des galactomannanes et permettre ainsi le rapprochement des molécules de caroube. Il est possible de modifier leurs propriétés rhéologiques en jouant sur le ratio et sur la concentration totale. Il s’agit dans ce cas de gels thermoréversibles. Les mécanismes locaux mis en jeu font habituellement état d’interactions associatives entre hélices de la chaîne de xanthane et zones non-ramifiées de la caroube.

Dégradabilité Le xanthane est très peu digeste, alors que sa valeur énergétique potentielle est d’environ 4000 cal/g, soit 16 720 kJ/kg. Le polymère résiste à de nombreuses enzymes, dont les cellulases, car l’accessibilité aux liaisons β-(1J 4) est difficile dans la conformation ordonnée. La gomme est néanmoins biodégradable (en deux jours selon la norme DIN), grâce à l’action de différentes enzymes d’hydrolyse appelées xanthanases.

APPLICATIONS Le xanthane est produit depuis 1958 et commercialisé depuis 1964. Il a été autorisé comme additif alimentaire en 1969 aux USA, en 1971 au Canada et en 1974 dans l’Union Européenne (E415) pour ses propriétés épaississantes, gélifiantes, émulsifiantes et stabilisantes d’arôme pour les jus de fruits, les mayonnaises, les sauces instantanées et les desserts. Etant non-assimilable par l’homme, la gomme xanthane est classée comme agent de texture et placée dans la catégorie des additifs et non des ingrédients. Des spécifications bactériologiques et chimiques (absence de métaux, de solvants...) sont requises pour garantir l’innocuité de ce produit naturel. Selon les pays, la gomme xanthane est autorisée dans différentes applications à des doses allant généralement de 0,05 à 1 % (en masse). La gomme stabilise les suspensions, les émulsions et les mousses. Elle est efficace à 0,5 % contre au moins 1 % pour d’autres polysaccharides. Cette propriété est mise à profit dans de nombreuses applications : Dans l’industrie agro-alimentaire De par ses nombreuses propriétés fonctionnelles, le xanthane est très utilisé dans divers secteurs de l’industrie agro-alimentaire à cause de sa parfaite compatibilité avec la plupart des autres ingrédients alimentaires, comme les protéines, les lipides et les autres polysaccharides. De plus, il est stable dans des conditions acides, ce qui est important dans plusieurs produits comme les

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vinaigrettes ou le yoghourt. Le xanthane est rarement utilisé seul mais souvent en combinaison avec d’autres polysaccharides, comme la gomme de caroube, à cause de l’effet synergique entre ces polymères. Il est par ailleurs utilisé dans le secteur des sauces, pour ses propriétés d’accrochage (répartition homogène de la sauce sur les spaghettis), de stabilisation des sauces pour salade, des sauces cuisinées, des systèmes foisonnés (mousses, nappages), des soupes et en pâtisserie comme agent de stabilisation des fourrages de biscuits et des pâtes à tartiner aux fruits. Il sert aussi à stabiliser certains produits laitiers (aliments de remplacement pour les veaux renfermant des protéines de micro-organismes). Son pouvoir élevé de rétention d’eau le rend utile dans les produits de cuisson céréaliers (cakes), car il en améliore l’alvéolage, favorise le démoulage et permet une meilleure conservation. Soluble à froid, il est utilisé dans les préparations instantanées (desserts, sauces). Sa stabilité vis-à-vis des traitements thermiques permet de l’introduire dans les crèmes glacées et dans les plats cuisinés surgelés que l’on peut réchauffer au four à micro-ondes. La gomme xanthane est neutre en goût et non-digestible. Elle permet la substitution des graisses texturantes dans les aliments à basses calories. Dans l’industrie des détergents Dans l’industrie des détergents, la vaporisation des produits est possible grâce à la pseudoplasticité. Une fois pulvérisé, le produit (en suspension fine) adhère à la surface à nettoyer et s’écoule lentement pour une meilleure efficacité des agents lavants (lave-glace, gels WC…). Dans l’industrie des cosmétiques Ces mêmes propriétés sont appréciées, notamment pour les savons et les pâtes dentifrices. La gomme xanthane permet la coulabilité de la pâte lors de la pression sur le tube et confère de la viscosité au repos sur la brosse à dents. Le xanthane entre aussi dans la composition des produits cosmétique (crèmes, gels). Il est autorisé sans restriction dans les applications cosmétiques. Dans le domaine pétrolier Le xanthane est utilisé comme fluide de forage, soit sous forme de mélange avec de la bentonite (type d’argile) ou seul. Dans cette application, le xanthane agit comme lubrifiant et facilite l’élimination de la roche coupée. Utilisé en association avec des détergents, il sert d’agent de régulation de la fluidité lors de l’injection d’eau dans les puits. En augmentant la viscosité de l’eau de rinçage, il permet, par injection, de faire remonter le pétrole en le délogeant des roches. Sa biodégradabilité est un atout supplémentaire, cependant, son prix est souvent prohibitif, en particulier lorsque le cours du pétrole est bas. Autres Dans l’industrie du bâtiment et des travaux publics, le xanthane est utilisé comme agent viscosifiant pour la confection des ciments et des mortiers ; sa viscosité assure leur bonne tenue après projection et avant séchage. Les propriétés suspensoïdes du xanthane en font un ingrédient très employé dans les peintures, les vernis (dispersion aqueuse de cire), la teinture de textiles (suspension de colorants) et en agrochimie (herbicides, fertilisants).

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

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15.3.2. GELLANE ET POLYMÈRES APPARENTÉS La gomme gellane est produite par fermentation par la bactérie Sphingomonas elodea (anciennement appelée Pseudomonas elodea) et particulièrement la souche ATCC 31561.

15.3.2.1. STRUCTURE ET COMPOSITION CHIMIQUE La gomme gellane est un hétéropolysaccharide linéaire anionique de 400 à 500 kDa, basé sur des unités de tétrasaccharides. Le β-D-glucose, le α-L-rhamnose et l’acide β-D-glucuronique, en proportions 2 : 1 : 1, sont présents dans la gomme gellane sous forme d’éléments monomères (fig. 15.4). Sous sa forme native, un quart des unités porte un groupe O-acétyle lié au C-6 du β-D-glucose. D’autres polysaccharides (appelés « welane » et « rhamsane ») avec la même séquence de la chaîne principale sont produits par d’autres bactéries. Ils portent différentes chaînes latérales qui peuvent contenir un rhamnose ou un disaccharide contenant du glucose (gentibiosyl). Certains polymères de la série du gellane donnent des solutions aqueuses très visqueuses, dont certaines montrent un degré élevé de stabilité thermique. OH

O O HO

HO

HO

HO HO

O

OH

O O

O

OH

O CH3 n …3)-β-D-glucose-(1J4)-β-D-acide glucuronique-(1J4)-β-D-glucose-(1J4)-β-L-rhamnose-(1J… OH

–

OOC

O

HO

Figure 15.4 - Structure primaire du gellane

15.3.2.2. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES Comme son nom l’indique, le gellane est un gélifiant, par établissement de liaisons ioniques en présence d’ions divalents, comme Ca2+
FU
.H2+. La force des gels peut être importante à de très faibles concentrations (de l’ordre de 0,05 %). Contrairement à l’agar, les EPS de la famille des gellanes ne peuvent pas former un gel simplement par dissolution à chaud puis refroidissement de la solution. La présence d’un cation est nécessaire pour leur gélification. Ils forment des gels transparents en solutions aqueuses en présence de cations métalliques divalents. Ces derniers se lient aux groupes carboxyles des unités d’acide glucuronique et forment un complexe, conduisant à une liaison intermoléculaire stable ou une structure réticulée. Les caractéristiques gélifiantes dépendent de la nature et de la concentration des contre-ions. En outre, la gomme gellane peut fournir des gels avec une vaste gamme de textures par un contrôle minutieux des sels ajoutés. La gamme de propriétés physiques des gels de gellane peut être étendue également par un contrôle du degré de l’acylation. Dans sa forme native, le gellane forme des gels faibles, clairs, élastiques et thermoréversibles. Ces gels sont stables sur une vaste gamme de pH et

340

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

de température. En particulier, pour obtenir un gel résistant à la chaleur, l’ajout du cation divalent calcium est plus efficace qu’avec les cations monovalents, tels que le sodium, le potassium… Cependant, une trop forte concentration en ions calcium diminue la force du gel. En outre, la gélification du gellane est possible par diminution du pH de la solution. C’est l’une des caractéristiques du gellane mais le gel, ainsi obtenu, a tendance à avoir une clarté inférieure et une synérèse supérieure. Pour cette raison, la gélification du gellane par abaissement du pH n’est pas très pratiquée dans la fabrication d’aliments, par contre l’addition d’ions inorganiques est utilisée couramment. La température de fusion du gel augmente rapidement avec la concentration en calcium, ce qui indique que ce dernier est responsable de la résistance du gel à la chaleur. La gomme gellane contient divers types d’ions inorganiques, dont les cations divalents qui l’empêchent de se dissoudre. De ce fait, elle est insoluble dans l’eau froide et doit être chauffée à 90 °C ou plus pour la dissoudre. La température de dissolution est d’autant plus élevée que l’eau utilisée est dure (chargée en ions). Cependant, il est possible de dissoudre le gellane à température ambiante si les cations divalents sont séquestrés à l’aide d’un agent chélateur. Les composés suivants ont été utilisés comme chélateurs dans les aliments : hexamétaphosphate de sodium, pyrophosphate de tétrasodium, phosphate trisodique, polyphosphate de sodium, citrate trisodique… Dans certains cas, l’agent chélateur et le cation divalent forment un sel insoluble dans l’eau. Les sucres, contenus dans les aliments, augmentent l’élasticité des gels et la stabilité thermique des zones de jonction. Une autre propriété intéressante du gellane est sa capacité à libérer une bonne saveur, parce que l’eau intrinsèque est instantanément libérée lors de la mastication. Cette libération est plus importante que celle des autres EPS utilisés comme gels.

15.3.2.3. PRODUCTION La production industrielle du gellane est réalisée au moyen de certaines souches sélectionnées de Sphingomonas elodea. Son extraction se fait par précipitation dans l’alcool du filtrat de la culture. Bien que le glucose est habituellement utilisé comme source de carbone pour la production du gellane par Pseudomonas sp. ATCC 31561, d’autres sources de carbone alternatives existent. De même, la protéine de soja hydrolysée est une excellente source d’azote pour la synthèse du gellane. Le pH optimal de production du gellane par la souche ATCC 31561 est proche de la neutralité.

APPLICATIONS Le gellane est autorisé comme additif alimentaire texturant aux États Unis et en Europe (sous le code E418) et commercialisé sous le nom de Kelogen® et Gelrite®. Etant stable dans une large gamme de pH, ce polymère est utilisé comme gélifiant, mais aussi comme stabilisant ou agent de suspension. Utilisé à faible dose, il permet de préserver la saveur des aliments. En association avec d’autres agents de texture, on l’emploie en particulier en confiserie, où il permet d’obtenir une texture proche de celle de la gélatine, avec une gélification plus rapide.

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

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Il est également utilisé pour le transport de principes actifs dans la région oculaire. Les gellanes servent également à la libération progressive de médicaments. Le gellane est utilisé en microbiologie où il remplace l’agar dans les milieux de culture, dans les produits d’hygiène corporelle comme agent gélifiant (dentifrices, gels déodorants) et en papeterie, associé à l’amidon.

15.4. POLYESTERS BACTERIENS 15.4.1. INTRODUCTION Les plastiques synthétiques imposent des graves menaces qui pèsent sur notre environnement. Depuis leur introduction dans les années 1950, les plastiques sont devenus indispensables à notre qualité de vie. Cependant, ces plastiques ne sont pas dégradables, ils s’accumulent en particulier en milieu marin à raison de 25 millions de tonnes/an formant ce que l’on nomme le « septième continent » et sont donc devenus un des principaux risques environnementaux associés. Les scientifiques du monde entier recherchent des produits ayant moins d’impacts écologiques que les plastiques dérivés de la pétrochimie. Cette alternative consiste à produire des matières plastiques biodégradables. L’un de ces plastiques qui présente un intérêt considérable est la famille des polyhydroxyalcanoates ou PHA. Les PHA sont des polyesters linéaires d’acides 3, 4, 5 et 6-hydroxyalcanoiques (fig. 15.5) produits par de nombreux micro-organismes (bactéries Gram+, Gram– et Cyanobactéries) grâce à la fermentation aérobie des sucres, des lipides, des alcanes, des alcènes et des acides alcanoïques. Ce sont donc des biopolymères qui présentent des propriétés thermoplastiques et élastomères ressemblant étroitement aux plastiques synthétiques. En effet, les propriétés de ces polymères peuvent être adaptées en contrôlant le substrat carboné dont se nourrissent les micro-organismes. Ils sont recyclables et se dégradent en CO2 et en eau. En outre, ces polymères sont biocompatibles. C’est pour toutes ces raisons que les PHA sont de plus en plus retenus comme matériaux respectueux de l’environnement, avec de nombreuses applications industrielles, agricoles et médicales.

15.4.2. HISTORIQUE DES POLYHYDROXYALCANOATES Les PHA ont été découverts en 1923, par un microbiologiste de l’Institut Pasteur, le franÎBJT
.BVSJDF
-FNPJHOF

RVJ
B
EÏNPOUSÏ
RVF
MB
CBDUÏSJF
TQPSVMBOUF
BÏSPCJF
Bacillus megaterium accumule l’acide 3-hydroxybutyrique dans des conditions anaérobies
.BJT
BOUÏSJFVSFNFOU
MB
QSÏTFODF
EF
HSBOVMFT
EBOT
EFT
CBDUÏSJFT
BWBJU
ÏUÏ
SBQQPSUÏF
QBS
VO
NJDSPCJPMPHJTUF
IPMMBOEBJT
.BSUJOVT
8JMMFN
#FJKFSJODL
 
&O

.BDSBF
FU
8JMLJOTPO
POU
NJT
FO
ÏWJEFODF
MF
SÙMF
DMFG
EF
MB
MJNJUBUJPO
EFT
ÏMÏNFOUT
OVUSJUJGT
dans la production des PHA. Ils ont observé qu’une souche asporogène de B. megaterium accumule plus de PHA quand le ratio carbone/azote augmente. Leurs résultats suggèrent donc que l’accumulation des PHA se produit en réponse à un déséquilibre de croissance

342

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

provoqué par la limitation de certains éléments nutritifs. Le plus simple membre des polyhydroxyalcanoates est le poly-β-hydroxybutyrate (PHB) de formule semi-développée (O–CH(CH3)–CH2–C(O)–)n. Le PHB est un polyester thermoplastique naturel, qui possède des propriétés similaires aux plastiques à base de pétrole, mais du fait de son origine, il est totalement biodégradable. L’exploitation commerciale du P(3HB) commença dans les années 1960. On dénombre actuellement plus de 300 micro-organismes accumulant les PHA comme forme de stockage d’énergie et de carbone. Les producteurs connus de PHA incluent Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, des Pseudomonas, Rhodobacter sphaeroides et Escherichia coli recombinée. La composition chimique des PHA varie considérablement du fait de l’existence de plus de 150 monomères différents connus. Cette diversité de structure engendre une énorme diversité de propriétés des polymères produits. Les PHA présentent une cristallinité allant de 30 à 70 % et une température de fusion de 50 à 180 °C ; ces propriétés font que les PHA sont perçus comme des solutions alternatives aux matières plastiques d’origine pétrochimiques et sont commercialement pertinentes. Depuis les années 1990, les scientifiques travaillent sur l’utilisation des PHA pour diverses applications industrielles, agricoles et médicales tout en cherchant à rendre leur production plus rentable et écologique. Des déchets agricoles bons marchés et renouvelables sont à l’étude pour leur utilisation comme sources carbonées pour la production de PHA.

15.4.3. STRUCTURE ET COMPOSITION CHIMIQUE Les polyhydroxyalcanoates (PHA) sont des polyesters d’hydroxyalcanoates (HA) qui ont la structure générale illustrée à la figure 15.5. Dans ces polymères, le groupe carboxyle d’un monomère forme une liaison ester avec le groupe hydroxyle du monomère adjacent. R1

O

R2

O

H3C

CH3 O

x

O

x

O n

Figure 15.5 - Structure générale des polyhydroxyalcanoates R1/R2 = groupes alkyls C1-C13 ; x = 1 - 4 ; n =100 - 30 000 R désigne le type de chaîne latérale tandis que x désigne le nombre de groupes CH2. R et x déterminent tous deux le type d’unité HA constituant la chaîne de polymère.

Les PHA peuvent être classés en trois catégories basées sur le nombre d’atomes de carbone présents dans la chaîne latérale du monomère (tab. 15.1). On distingue ainsi les « short-chain-length PHA » (PHAscl) comportant  3 à  5 atomes de carbone (R = CH3 à C2H5), exemple poly(3-hydroxybutyrate) ou P(3HB), poly(4-hydroxybutyrate) ou P(4HB), les « medium-chain-length » (PHAmcl) comportant  6 à  10 carbones (R = C3H7 à C9H19), exemple poly(3-hydroxyhexanoate) ou P(3HHx) et poly(3-hydroxyoctanoate) ou P(3HO) et les « long-chain-length » (PHAlcl) ayant plus de 10 atomes de carbone.

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

343

Selon le type de monomère présent, les PHA peuvent être également des homopolymères ne contenant qu’un seul type d’hydroxyalcanoate comme unité monomère, par exemple P(3HB), P(3HHx) ou des hétéropolymères contenant plus d’une sorte d’hydroxyalcanoate comme unités monomères, par exemple poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), P(3HB-co-3HV) et poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate, P(3HB-co-3HHx). Dans la nature, les PHA à courtes chaînes contenant principalement des unités P(3HB) ou les PHA à chaînes moyennes contenant le 3-hydroxyoctanoate (3HO) et le 3-hydroxydécanoate (3HD) sont produites comme monomères prédominants par la plupart des bactéries. Tableau 15.1 - Structures générales des PHA R

O

O

x

n

Nombre d’unités répétitives, x Groupe alkyl, R Type de polymère

1

Hydrogène .ÏUIZM Ethyl Propyl Pentyl Nonyl

Poly(3-hydroxypropionique) Poly(3-hydroxybutyrate) Poly(3-hydroxyvalérate) Poly(3-hydroxyhexanoate) Poly(3-hydroxyoctanoate) Poly(3-hydroxydécanoate)

2

Hydrogène

Poly(4-hydroxybutyrate)

3

Hydrogène

Poly(5-hydroxyvalérate)

15.4.4. BIOSYNTHÈSE DES PHA Les PHA sont synthétisés par de nombreuses bactéries Gram+, des Cyanobactéries aérobies et des bactéries anaérobies photosynthétiques, des bactéries Gram– ainsi que certaines Archaebactéries. Ce sont des polymères de réserve que l’on retrouve chez ces organismes comme source de carbone et d’énergie intracellulaires. Ils constituent une forme de stockage de carbone et d’énergie idéale en raison de leur faible solubilité et de leur masse moléculaire élevée qui exerce une pression osmotique négligeable sur la cellule bactérienne. Ces polymères sont habituellement accumulés par certaines bactéries jusqu’à un maximum de 90 % de la masse sèche des cellules dans des conditions de laboratoire durant le stress en éléments nutritifs comme la limitation de l’azote, du phosphore, du magnésium, du soufre ou de l’oxygène, mais en présence d’une source de carbone en excès (par exemple sous forme d’acides gras). Dans des conditions qui ne sont pas favorables à la croissance, les cellules bactériennes assimilent l’excès de carbone à des fins de stockage. Les sources de carbone assimilées sont ensuite biochimiquement transformées en des molécules d’hydroxyacyl-CoA, unités monomères qui seront polymérisées en des molécules de PHA de masse moléculaire variant de 0,05 à 20.103 kDa selon le micro-organisme producteur, les conditions de croissance et la source de carbone (fig. 15.6).

344

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE O

OH

H3C

O

R

O

CH3 + O

CH3 R

n

SCoA

H3C

O n+1

Figure 15.6 - Réaction catalysée par la PHA synthase Ces polymères, insolubles dans l’eau, sont stockés sous forme d’inclusions ou de granules dans le cytoplasme des cellules microbiennes dont le nombre par cellule et la taille varient selon les espèces. La polymérisation est effectuée par l’enzyme PHA synthase qui est l’enzyme clé pour la biosynthèse des PHA. En fait, plus de 50 PHA synthases différentes ont été clonées et caractérisées à ce jour. Ces enzymes sont situées à la surface des granules de PHA. L’ensemble du processus, de la synthèse des monomères à leur polymérisation, se déroule dans la cellule bactérienne dans un environnement aqueux et à température ambiante. La synthèse de ces polymères peut également être réalisée dans les plantes grâce à une modification génétique. Le succès du clonage de gènes de biosynthèse de PHA ouvre de nouvelles perspectives pour créer des plantes transgéniques et des organismes recombinants pour la production de PHA. Plus de 150 types de monomères ont été identifiés comme substrats pour la PHA synthase. Cela montre que cette enzyme présente une large spécificité de substrat. Il s’en suit qu’en modifiant le substrat, différents copolymères peuvent être obtenus. Ainsi, Ralstonia metallidurans est capable de produire du P(3HB-co-3HV) en utilisant du glucose et de l’acide propionique comme sources de carbone. En utilisant l’acide butyrique et l’acide pentanoïque, la même espèce produit des copolymères P(3HB-co-3HV) contenant jusqu’à 85 % d’unités HV. De même, Pseudomonas oleovorans, cultivée sur l’octane, produit du poly(hydroxyoctanoate) et un certain nombre de PHA à chaînes moyennes ayant jusqu’à 12 atomes de carbone à l’aide de sels de sodium de différents acides n-alcanoïques comme substrats. La large spécificité de substrat des PHA synthases se reflète aussi dans le fait que ces enzymes peuvent catalyser aussi bien la polymérisation des PHA à courtes chaînes qu’à chaînes moyennes. Des copolymères de PHA des deux types de chaînes peuvent être également produits. Par ailleurs, la PHA synthase est hautement stéréospécifique puisqu’elle polymérise spécifiquement et seulement l’énantiomère (R) des monomères hydroxyalcanoates. Par conséquent, les PHA microbiens sont une source de composés énantiomériquement purs. Par hydrolyse de PHA de masse moléculaire élevée, il est possible d’obtenir les monomères qui peuvent être utilisés pour synthétiser des composés utiles. L’indice de réfraction élevé des granules de PHA leur permet d’être observées sous le microscope photonique à contraste de phase en tant qu’inclusions discrètes de 0,2 à 0,5 μm de diamètre.

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

345

15.4.5. PRODUCTION Des bioréacteurs de grande capacité sont nécessaires pour la culture de cellules bactériennes dans des conditions contrôlées pour produire des PHA à une échelle industrielle. Au laboratoire, pour produire des PHA, on cultive les bactéries dans un milieu contenant les nutriments appropriés afin qu’elles se multiplient rapidement; lorsque la population a atteint une densité suffisante, on modifie la composition du milieu nutritif afin de forcer le micro-organisme à synthétiser du PHA qui peut atteindre jusqu’à 80 % du poids de la matière sèche des bactéries. En général, le milieu favorisant la biosynthèse des PHA est préparé à partir d’un mélange de sels de phosphate et en limitant certains nutriments (l’azote, habituellement), mais en présence d’une source de carbone en excès. L’épuisement du nutriment sélectionné déclenche une réorientation métabolique chez les bactéries qui en l’absence de source azotée accumulent des PHA comme réserve de carbone et d’énergie. En milieu industriel, deux approches ont été développées lors des cultures en milieu non-renouvelé : la culture à une étape et la culture en deux étapes. Dans la première méthode, la croissance cellulaire et l’accumulation des PHA se produisent simultanément. Dans la culture en deux étapes, une première phase de croissance cellulaire s’effectue dans un milieu enrichi en nutriments ; puis les cellules sont ensuite transférées dans un milieu carencé en nutriments pour induire la phase d’accumulation des PHA. La méthode de culture diffère selon les souches bactériennes, mais la culture à une étape est généralement préférée pour la production de PHA à grande échelle. La durée de culture pour la biosynthèse de PHA est généralement de 24 à 96 h. Au cours de la période de culture dans l’approche à une étape, la production de PHA est initiée lors de la phase exponentielle de croissance cellulaire et se poursuit jusqu’à la fin de la phase stationnaire. Dans une culture discontinue alimentée, les cellules sont continuellement alimentées avec une source de carbone sélectionnée en fin de phase exponentielle. Les systèmes de production industrielle utilisent habituellement ce mode de culture. En général, la méthode de culture discontinue alimentée produit des densités cellulaires plus élevées et réduit, par conséquent, le coût global de production. D’autres modes de culture ont également été évalués, tels que : culture à pH stabilisé dans laquelle la source de carbone est fournie sur la base des fluctuations du pH et méthode du chimiostat dans laquelle le milieu de culture est continuellement échangé avec le milieu de croissance stérile. Le type de PHA synthétisé dépend des substrats carbonés, des voies fournissant les monomères et de la spécificité des PHA synthases. Les sucres comme le glucose et le saccharose sont les sources de carbone les plus fréquentes pour une production à grande échelle de PHA. Les huiles végétales et les acides gras dérivés ont également été utilisés pour la production de PHA. Par rapport aux sucres, ils sont moins chers, renouvelables et produisent des rendements supérieurs en polymère (deux fois plus qu’avec le glucose), principalement en raison du nombre plus élevé d’atomes de carbone par gramme d’huile que dans les sucres.

346

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

15.4.5.1. SUBSTRATS POUR LA PRODUCTION DES PHA Le choix d’une source de carbone convenable est l’un des facteurs clés qui permettent de réduire le coût de production des PHA. Des études estiment que la contribution du substrat au coût total du processus de production est d’environ 30 à 50 %. Ainsi, les matières premières carbonées pouvant convenir et relativement peu coûteuses sont recherchées afin d’optimiser le rendement de la production des PHA. De nouvelles approches dans l’utilisation de sous-produits et déchets comme matières premières pour la production rentable et durable de PHA ont été entreprises. Ces approches présentent l’avantage supplémentaire de résoudre le problème de la gestion de divers déchets agricoles et la production de produits à valeur ajoutée à partir de ces déchets. Les résidus de matières premières comme le malt provenant des brasseries, les déchets lignocellulosiques de soja, de tournesol, les mélasses de canne à sucre ou de betterave sucrière, le lactosérum provenant de l’industrie fromagère ont tous été utilisés pour la production des PHA, donnant des rendements plus ou moins importants mais souvent trop faibles. Les huiles végétales donnent des rendements supérieurs en comparaison avec d’autres substrats testés comme les sucres. Parmi les différentes huiles végétales, l’huile de palme est l’une des plus efficaces. Récemment, la production du poly-β-hydroxybutyrate (PHB) en utilisant les boues activées des stations d’épuration a suscité l’intérêt des chercheurs. Les boues activées peuvent, en effet, être utilisées comme substrats bon marché (comme les déchets organiques) et éviter la nécessité de la stérilisation. Ainsi, les coûts peuvent être sensiblement réduits.

15.4.5.2. EXTRACTION ET PURIFICATION Les PHA étant des produits intracellulaires, les méthodes employées pour les récupérer sont basées sur leur solubilisation ou sur celle de la matrice qui les contient. Après séchage des cellules, les inclusions sont extraites par dissolution avec des solvants organiques chlorés (comme le chloroforme) pour être ensuite précipitées à l’aide de méthanol ou d’éthanol. En général, cette méthode d’extraction par solvant a été adaptée pour la récupération des PHA à l’échelle du laboratoire parce qu’une grande quantité de solvant est normalement requise. L’extraction par le chloroforme donne un polymère à haut niveau de pureté, sans dégradation. Toutefois, l’utilisation de grandes quantités de solvants volatils est coûteuse et dangereuse pour l’environnement. Par conséquent, la solubilisation de la matrice non-PHA est la méthode préférée pour l’extraction des PHA à l’échelle industrielle. L’hypochlorite de sodium est un solubilisateur cellulaire bien connu qui a été utilisé pour l’extraction du poly(3-hydroxybutyrate) ou P(3HB). Les cellules sont traitées préalablement avec cette solution et les granules de PHA séparés par centrifugation. Bien que cette méthode soit simple et efficace, elle provoque la dégradation sévère du P(3HB), conduisant à une réduction de la masse moléculaire moyenne jusqu’à 50 % comparativement à celle du P(3HB) cellulaire intact, en raison des effets du fort pouvoir oxydant de l’hypochlorite de sodium. Une modification de cette méthode de récupération visant à limiter la dégradation consiste à utiliser une solution de dispersion contenant de l’hypochlorite de sodium et du chloroforme. Cette méthode permet de tirer profit de la digestion

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

347

différentielle de l’hypochlorite et du chloroforme, tout en conduisant à une réduction beaucoup moins importante (– 20 %) de la masse moléculaire moyenne du polymère récupéré. D’autres produits chimiques ont également été testés pour la solubilisation de la matrice non-PHA, y compris des acides forts (HCI et H2SO4), des alcalis
/B0)
,0)
/)4OH) et des agents tensioactifs (sodium sulfosuccinate de bis (2-éthylhexyle), bromure de cétyl triméthylammonium (CTAB), sodium dodécylsulfate (SDS), Triton X-100, Tween 20). Des produits très purs, pratiquement exempts d’endotoxines, peuvent être obtenus en extrayant les PHA avec des fluides supercritiques comme le dioxyde de carbone. Ce procédé élimine également les contaminants lipidiques. Une grande attention a également été portée à la récupération et purification enzymatiques des PHA. Ce processus de récupération implique généralement un traitement par choc thermique du bouillon de culture pendant une courte période de temps avant le traitement enzymatique. Le choc thermique rompt les cellules et dénature les protéines, ce qui empêche par la suite une augmentation préjudiciable de la viscosité du milieu. La lyse cellulaire peut aussi être obtenue par un mélange de bétaïne et d’EDTA. L’EDTA affaiblit la paroi des bactéries Gram– pour permettre le passage de la bétaïne qui attaquera la membrane cellulaire. Diverses enzymes capables de solubiliser la matrice non-PHA ont été évaluées pour une récupération efficace tout en maintenant un haut niveau de pureté. Des protéases, des cellulases et des lysozymes sont des exemples d’enzymes couramment utilisées. En général, la digestion enzymatique est employée avec des produits chimiques. Par exemple, l’utilisation de détergents anioniques, comme le SDS, facilite d’avantage la décomposition des protéines et des lipides tandis que l’utilisation de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA), pour l’extraction et la purification des PHA, facilite la dégradation de la couche de lipopolysaccharides de la paroi cellulaire enveloppant la membrane cytoplasmique. Il est également possible de récupérer et purifier les PHA par digestion enzymatique sans utiliser de produits chimiques. L’avantage d’utiliser des enzymes dépend de leur spécificité et des conditions de fonctionnement douces requises. Ces conditions opérationnelles doivent provoquer le moins de dommages possibles au produit et rendre sa récupération efficace.

15.4.5.3. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES En utilisant différents types de micro-organismes et de mélanges de substrats carbonés et en imposant des conditions de croissance optimales dans le bioréacteur, il est possible d’influencer la composition et la structure moléculaire des PHA et, par suite, les caractéristiques physiques du produit. La polyvalence des PHA peut être augmentée par différents types de modifications chimiques en raison de la possibilité d’introduire différentes fonctionnalités, tels que des groupes non-saturés ou des groupes bromo-, hydroxyl-, méthyl- et des unités aromatiques, dans la structure chimique du polymère en changeant la nature de la source de carbone et des micro-organismes utilisés pour leur production. Ces conditions déterminent

348

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

ainsi les caractéristiques du biopolymère obtenu qui pourra être hydrophobe, cassant, élastique ou encore collant. Les PHA à chaînes courtes, par exemple, sont très cristallins, plus fragiles et plus rigides. Le P(3HB) qui en fait partie et le plus commun des PHA, a une température de fusion (Tf ) de 180 °C et une température de transition vitreuse (Tv) de 4 °C. Ce sont des polymères typiquement thermoplastiques qui deviennent fluides et moulables au-dessus de leur Tf. La fragilité du P(3HB) est en grande partie due à la présence de vastes domaines cristallins qui se forment lors du refroidissement. Les propriétés mécaniques du P(3HB) sont comparables à celles du polystyrène (ou du polypropylène). Les PHA à chaînes moyennes ont des Tf basses allant de 40 à 60 °C et des valeurs de Tv allant de – 50 à – 25 °C. Ils ont aussi un taux de cristallinité relativement faible, peut-être en raison de la présence des groupes latéraux irréguliers qui empêchent la formation d’une structure tridimensionnelle régulière. Cette combinaison de valeurs de Tv sous la température ambiante et le faible taux de cristallinité confèrent au polymère un comportement élastomérique. Aux températures supérieures ou proches de sa Tf, le polymère est complètement amorphe et collant. Dans les PHA à chaînes moyennes, les parties cristallines servent à la réticulation physique et, donc, confèrent au polymère ses propriétés mécaniques comme la résistance à la traction et à la rupture par allongement qui sont très différentes de celles des PHA à courtes chaînes. Dans les PHA à chaînes moyennes, les masses moléculaires des polymères se situent dans la gamme de 60 à 412 kDa. Ces valeurs sont relativement faibles, par rapport à celles des PHA à courtes chaînes. Actuellement, les copolymères (ex. PHB/PHV), souvent plus souples, sont préférés pour des utilisations générales afin d’obtenir un meilleur équilibre entre les propriétés mécaniques. La teneur en PHV varie de 5 à 20 %. La faible perméabilité à la vapeur d’eau des PHA qui est proche de celle du polyéthylène à basse densité (PEBD) est une propriété très intéressante pour les applications d’emballage alimentaire. L’introduction d’un comonomère dans la chaîne principale du polymère, comme dans le cas des hétéropolymères, influe beaucoup sur les propriétés du polymère en augmentant sa flexibilité. Par exemple, un copolymère tel que le poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate), ou P(3HB-co-3HHx), a une Tf et une cristallinité inférieures et est plus malléable que le P(3HB). En fait, le P(3HB-co-3HHx) a des propriétés mécaniques similaires à l’un des polymères commerciaux représentatifs, le PEBD. Les propriétés des PHA varient considérablement en fonction de leur contenu en monomères et peuvent donc être adaptés en contrôlant leur composition. Les PHA sont également biocompatibles et manifestent une piézoélectricité qui stimule la croissance des os, aide à la cicatrisation des plaies et présentent une large gamme de propriétés physiques et mécaniques qui découlent de la diversité de leurs structures chimiques.

Biocompatibilité des PHA La biocompatibilité des PHA provient du fait que certains monomères constituant la chaîne du polymère se produisent naturellement dans le corps humain. Le monomère

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

349

(R)-acide 3-hydroxybutyrique est un métabolite normal trouvé dans le sang humain. Cet hydroxyacide est présent à des concentrations de 3 à 10 mg/100 mL de sang chez l’adulte sain. Par ailleurs, des PHA de faible masse moléculaire se trouvent complexés à d’autres macromolécules cellulaires, d’où leur appellation cPHA. Ainsi, des cPHAs ont été trouvés dans les tissus humains complexés aux lipoprotéines de basse densité (LDL), à l’albumine et aux canaux potassiques de Streptomyces lividans. La biocompatibilité des PHA, comme de n’importe quel autre biomatériau, dépend de facteurs tels que la forme, la porosité et l’hydrophilie de surface, de la tension de surface et de son produit de dégradation. En génie tissulaire, il est important de considérer le comportement cellulaire induit par les produits de dégradation pour une évaluation complète de la biocompatibilité des implants polymères.

Biodégradation des PHA Les PHA les plus courants dans la nature sont sujets à l’hydrolyse de leurs liaisons ester par des dépolymérases intracellulaires ou extracellulaires. Certaines bactéries productrices de PHA sont capables de les dégrader à l’intérieur de leurs cellules. Au cours de la dégraEBUJPO
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CO2. Les dépolymérases extracellulaires sont sécrétées par divers champignons et bactéries afin de dégrader les PHA en produits de faible masse moléculaire qui peuvent être assimilés et métabolisés par les micro-organismes. Les produits finaux de la dégradation des PHA dans des conditions aérobies sont le dioxyde de carbone et l’eau tandis que du méthane est produit dans des conditions anaérobies. Par conséquent, les PHA sont de bons candidats pour des applications comme les plastiques biodégradables en raison de leurs propriétés similaires à celles des plastiques conventionnels issus de l’industrie pétrolière. L’homopolymère commun, le P(3HB), peut être dégradé par hydrolyse en un constituant du sang présent normalement dans le corps humain, ce qui le destine potentiellement pour des applications comme biomatériau. Toutefois, en raison de son taux de cristallinité élevé et de l’absence de PHA dépolymérase chez l’homme, ce polymère se dégrade très lentement dans l’organisme. Un autre type de PHA, le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalérate) ou P(3HB-co-3HV) ayant un plus faible taux de cristallinité que le P(3HB) et une meilleure biodégradabilité est, pour l’instant, un des meilleurs matériaux pour l’ingénierie de tissus tels que le tissu osseux et le tissu épithélial. Il en est de même du PHA contenant du 4-hydroxybutyrate (4HB) comme monomère car il peut être hydrolysé par les lipases des Eucaryotes.

Facteurs affectant la biodégradation Les PHA sont biodégradables aussi bien en aérobie qu’en anaérobie. Ils peuvent également se dégrader par traitement thermique et par hydrolyse enzymatique. Dans les systèmes biologiques, les PHA peuvent être dégradés à l’aide de dépolymérases microbiennes ainsi que par hydrolyse enzymatique ou non-enzymatique dans les tissus animaux. De nombreux facteurs influent sur la biodégradabilité des PHA, tels que leur structure chimique (présence de groupes fonctionnels dans la chaîne du polymère, l’équilibre hydrophilie/ hydrophobie, la composition en monomères), la stéréorégularité (présence d’une structure ordonnée), la masse moléculaire et la cristallinité du polymère.

350

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

Habituellement, plus la structure est ordonnée, plus le taux de cristallinité est augmenté et plus la dégradation du polymère est difficile. Les structures cristallines ont aussi des Tf plus élevées. Ainsi, les PHA à chaînes moyennes, à faible cristallinité et faible Tf, sont plus dégradables que les PHA à courtes chaînes qui ont un taux de cristallinité et une Tf comparativement plus élevées. Dans la nature, la flore microbienne présente dans un environnement donné contribue également à la biodégradabilité du polymère. Ce sont essentiellement des micro-orgaOJTNFT
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5IFSNPNPnosporacées, Streptosporangiacées et Streptomycetacées qui dégradent le P(3HB) dans l’environnement.

APPLICATIONS Les PHA ont rapidement présenté un intérêt croissant tant dans la recherche que dans l’industrie en raison de leur polyvalence structurale et de leurs caractéristiques propres comme la biodégradabilité, l’insolubilité dans l’eau, la non-toxicité, la biocompatibilité, les propriétés piézoélectriques, la thermoplasticité et/ou les propriétés élastomères, qui favorisent leur utilisation dans les industries de l’emballage, en médecine et en pharmacie, dans l’agriculture et l’industrie agro-alimentaire, en remplacement des matériaux issus de la pétrochimie. Cette polyvalence est due en partie à la grande gamme de substrats des enzymes synthétisant des PHA et confère à ces derniers un spectre étendu de propriétés associées, les avantageant vis-à-vis d’autres bioplastiques. Toutefois, le coût de production élevé des PHA a contraint les industriels à rechercher et à utiliser des matières premières bon marché dont une grande variété de déchets et sous-produits comme sources de carbone pour leur production. Par ailleurs, plusieurs stratégies ont été développées en vue d’améliorer les conditions économiques de production des PHA en sélectionnant des espèces bactériennes différentes, des souches recombinantes, des plantes transgéniques pourvues des gènes de biosynthèse des PHA, des sources de carbone peu coûteuses permettant des taux de croissance élevés liés à une synthèse de polymères importante, des conditions de culture, des modes de fermentation et de récupération moins couteuses. Applications industrielles Le polymère P(3HB-3HHx) produit à l’aide d’Aeromonas hydrophila sert à fabriquer des emballages jetables, non-tissés, souples, des articles thermoformés, du papier synthétique et des dispositifs médicaux. La société allemande Biomer produit industriellement du P(3HB) à partir de Alcaligenes latus. Ce polymère est utilisé pour la fabrication de petits objets tels que des peignes, des stylos, et pour utilisation dans divers processus de transformation classique. La société Metabolix (USA) fabrique également du BIOPOL, un copolymère de 3HB à l’aide de la bactérie Alcaligenes eutrophus (Ralstonia metallidurans). Cet élastomère dont la rigidité et la résistance sont voisines de celles des polyamides 6(PA6) ou des polycarbonates (PC), sert à couvrir le papier et les cartons. Il a des propriétés antistatiques qui peuvent être exploitées pour l’emballage des pièces électriques et électroniques. Il est également utilisé pour la fabrication d’articles jetables comme les lingettes hygiéniques et les tampons applicateurs. Il peut également servir à fabriquer la tapisserie d’ameublement, les tapis, des emballages, des sacs compostables, des couvercles…

15 - LES POLYMÈRES MICROBIENS

351

Enfin, dans les années 2000, des PHA à chaînes moyennes ont été utilisés pour la formation de croûtes de fromage ou encore de caoutchoucs biodégradables. Applications médicales C’est dans le domaine médical que les premières applications des biopolymères ont vu le jour d’autant plus que leurs coûts élevés se justifiaient dans ces applications à haute valeur ajoutée. Leurs propriétés de biocompatibilité et de biorésorbabilité associées à leur résistance mécanique conviennent parfaitement pour assurer les fonctions attendues dans ce domaine. Les PHA à chaînes moyennes sont plus flexibles et moins cassants que les PHA à courtes chaînes et se prêtent très bien, du fait de leur biocompatibilité et de leur biodégradabilité, à des applications médicales telles que la fabrication de fils de suture, d’agrafes, de substituts de peau, d’implants vasculaires, de prothèses de cartilage, d’attaches et de broches chirurgicales ainsi qu’à la production d’artères, de veines et de valvules cardiaques artificielles et de vêtements et accessoires médicaux à usage unique. En génie tissulaire, les PHA ont été utilisés comme support pour tissus mous et tissus durs. L’encapsulation des médicaments pour l’administration et la libération contrôlée de substances actives à l’aide de PHA constituant la matrice a également été réalisée. Les PHA comme P(3HB), P(4HB), P(3HB-co-3HHx) ont également été utilisés pour la fabrication de greffes vasculaires pour réparer ou remplacer des vaisseaux sanguins défectueux dans les systèmes artériels ou veineux, en raison de dommage ou de maladie. Un greffon synthétique fait de P(3HB-co-4HB) a été utilisé comme revêtement de greffe chez des chiens. Les PHA ont également été utilisés pour le développement de valves cardiaques chez des animaux. En agriculture La biodégradabilité des biopolymères en fait des matériaux de choix pour diverses applications dans le secteur agricole. Dans ce domaine, les films de paillage à base de biopolymères s’imposent progressivement en remplacement des paillis en polymères conventionnels non-biodégradables. Leur fonction principale est de réduire l’évaporation de l’eau et d’accroître la température du sol pour favoriser la croissance des jeunes plantes au printemps. Par ailleurs, les paillis en biopolymères évitent les travaux de ramassage et de traitement des déchets et réduisent le coût de main d’œuvre puisqu’ils se dégradent in situ. Des gains économiques et environnementaux évidents sont ainsi obtenus. Outre le critère de biodégradabilité, le matériau doit avoir une durée de vie suffisante afin de remplir sa fonction. En effet, la dégradation trop rapide d’un film de paillage pourrait entraîner, par exemple, la croissance des adventices et des dégâts dans les cultures. Les biopolymères peuvent également servir à la confection de contenants pour les semis que l’on enfouit tels quels dans le sol. En emballage Le secteur de l’emballage est un autre créneau important pour le marché des biopolymères. Ces derniers apportent une solution aux problèmes de déchets, mais nécessitent toutefois la mise en place d’une filière de gestion de déchets adéquate à ce type de produits. Ainsi, l’organisation d’une filière de compostage est indispensable pour assurer une valorisation optimale de ces emballages biodégradables. En dehors de leur fonction première de protection des produits, les biopolymères

352

PARTIE IV - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE

confèrent aux emballages d’autres fonctions grâce à leurs propriétés intrinsèques comme leur imperméabilité à la vapeur d’eau qui est proche de celle du PEBD (polyéthylène basse densité), ce qui les destine particulièrement pour l’emballage des produits frais comme les fruits et les légumes.

15.5. CONCLUSION Les polysaccharides d’origine microbienne sont toujours en concurrence avec d’autres polymères d’origine naturelle ou synthétique qui sont souvent moins coûteux à produire bien que les propriétés physiques et surtout écologiques des EPS soient supérieures. Du fait de leur origine biologique, ces bioplastiques sont naturellement biodégradables ce qui est un avantage majeur dans la lutte contre la pollution. Enfin, les EPS doivent apporter un plus par rapport aux autres produits comme, par exemple, des effets bénéfiques pour la santé humaine et l’environnement ou présenter des caractéristiques physico-chimiques particulières. Ils ne correspondent encore qu’a un pourcentage très faible de la production mondiale de pétroplastiques voire même d’autres types de bioplastiques comme les PLA d’origine agricole. S’ils restent encore trop coûteux pour en faire un plastique de commodités, les PHA, du fait de leurs nombreuses et très diversifiées applications, devraient dans un avenir proche prendre une place de plus en plus importante lorsque leur coût de production égalera celui des autres bio et pétroplastiques.

PARTIE V

ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE 16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET EN MÉDECINE

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16.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 16.2. Obtention des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 16.3. Application des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS 17.1. Procédés d’immobilisation des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.2. Avantages des enzymes immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.3. Réacteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.4. Biocapteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

411 414 415 416

18 - LES EXTRÊMOZYMES 18.1. Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.2. Organismes thermophiles et hyperthermophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.3. Organismes psychrophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.4. Organismes piézophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.5. Organismes halophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.6. Organismes acidophiles/alcalophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.7. Organismes radiophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.8. Organismes métallophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.9. Organismes xérophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.10. Organismes oligophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18.11. Production des enzymes extrêmophiles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

423 425 426 427 428 429 430 431 432 432 432

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET EN MÉDECINE 16.1. GÉNÉRALITÉS .PMÏDVMFT
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enzymes ont un rôle comparable à celui des catalyseurs qui, en chimie, accélèrent les réactions. Sans l’action enzymatique, le métabolisme des cellules et donc les réactions biochimiques qui le constituent seraient trop lentes pour assurer efficacement le fonctionnement de la cellule et le renouvellement des structures cellulaires. À l’exception de quelques RNAses, Les enzymes sont des protéines globulaires qui présentent plusieurs degrés d’organisation : X une structure primaire définie par la séquence des acides aminés constitutifs ; X une structure secondaire liée à des conformations hélicoïdales ; X une structure tertiaire correspondant à l’organisation dans l’espace des chaînes ; X une structure quaternaire correspondant à l’association de plusieurs structures élémentaires, les monomères en un édifice complexe comportant au moins deux monomères. Très souvent, le fonctionnement de l’enzyme nécessite la présence de petites molécules qui peuvent être soit des cofacteurs lorsque ce sont des ions métalliques (Fe2+, Cu2+, .O2+…), soit des coenzymes lorsqu’ils sont de nature organique ou métallo-organique. La partie protéique de la molécule enzymatique qui porte le site de fixation du substrat et donc responsable de la spécificité de la réaction catalysée, s’appelle « apoenzyme ». Les isoenzymes correspondent à des cas particuliers d’organisation d’une même enzyme existant sous différentes formes ayant des activités catalytiques identiques et des différences de structure minimes comme c’est le cas des malate déshydrogénases cytoplasmique et mitochondriale. Lorsqu’elle fonctionne, l’enzyme procure à une réaction donnée un environnement spécifique qui lui permet de se dérouler rapidement ; du fait de sa structure tridimensionnelle, l’enzyme fournit au niveau d’un espace confiné appelé site actif, les conditions idéales de déroulement de la réaction : transformation du substrat en produit. La formation d’un complexe enzyme-substrat (ES) temporaire est la base du mécanisme des réactions enzymatiques et le point de départ d’une exploitation mathématique permettant de caractériser leur cinétique. L’activité enzymatique n’est maximale que dans un intervalle de pH et de températures donné. À des pH ou des températures extrêmes, la protéine enzymatique peut être dénaturée et perdre son activité.

356

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

L’activité catalytique d’une enzyme dépend aussi de la concentration en substrat au niveau du site catalytique et elle est maximale lorsque la concentration est saturante. *M
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vitesse observée à saturation (Vmax 
1MVT
MF
,m est faible, plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat est grande. L’activité, la présence et la quantité d’une enzyme peuvent être régulées de diverses manières. La production des enzymes est sous contrôle des gènes. Leur synthèse peut être réprimée par leurs propres métabolites en agissant soit au niveau du support de l’information génétique (répression), soit au niveau de la réaction enzymatique (rétro-inhibition). Beaucoup d’enzymes ne sont pas spontanément actives mais existent à l’état de précurseurs enzymatiques inactifs et ne sont activées qu’en cas de besoin. L’action de nombreuses enzymes peut être bloquée par des substances plus ou moins spécifiques appelées inhibiteurs. Cet effet peut être levé à l’aide de substances appropriées qui se lient à l’inhibiteur ou le modifient. On parle d’inhibiteur compétitif si la structure de l’inhibiteur est analogue à celle du substrat. Un inhibiteur non-compétitif se lie à l’enzyme par un site autre que le site actif en affectant la conformation de l’enzyme de sorte que la catalyse devient impossible. Ce type d’inhibition où la fixation du substrat au site actif n’est pas affectée, ne peut être donc levé par une addition de substrat. Les enzymes sont présentes dans toutes les cellules. Leur nombre et leur nature varient avec le type de cellule. Cependant, elles ne sont pas réparties au hasard dans les cellules, elles sont soit situées dans des organites intracellulaires particuliers, soit elles sont sous forme soluble dans le cytoplasme, soit encore intégrées à la structure de la membrane plasmique ou à celle de la paroi. Les relations entre les systèmes enzymatiques et la structure de l’organite qui les contient constituent une des bases de la physiologie cellulaire. Le nombre considérable et sans cesse croissant d’enzymes connues a rendu impératif le développement d’une classification et d’une nomenclature. Celles-ci ont été établies dès 1961 par la Commission des Enzymes de l’Union Internationale de Biochimie. Les enzymes sont classées en fonction de la nature des substrats qu’elles transforment et le type de réaction qu’elles catalysent, en général, en rajoutant le suffixe « -ase » au nom de leur substrat (ex. amylase, cellulase) ou à un mot ou une phrase faisant référence à leur activité (ex. oxydoréductase, oxoglutarate amino-transférase). Chaque enzyme possède un numéro de code recommandé par la Commission Internationale d’Enzymologie et constitué de l’acronyme E.C. (Enzyme Commission) suivi de quatre chiffres, séparés par des points. Le premier chiffre indique la classe (1 : oxydoréductases, 2 : transférases, 3 : hydrolases, 4 : lyases, 5 : isomérases, 6 : ligases) et les deux suivants des sous-classes et des soussous-classes et le quatrième un numéro d’ordre dans la sous-sous-classe (ex. l’α-amylase est codée E.C. 3.2.1.1). Ce code doit être mentionné dans les publications scientifiques1.

1

Voir Codes EC des enzymes citées dans le livre et, pour des compléments d’information, L'histoire des enzymes sur le site web dédié

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

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Les enzymes sont, en règle générale, pourvues d’une très grande spécificité de réaction (propriété fondamentale) mais parfois leur spécificité est plus faible et l’enzyme admet alors deux ou plusieurs substrats (enzyme non-spécifique comme la Rubisco ou la nitrogénase) ; d’autre part, elles opèrent dans des conditions douces de pH, de température (par exemple entre 20 et 37 °C) et de pression (pression atmosphérique) ce qui en fait des catalyseurs de choix pour des réactions biochimiques in vitro avec des molécules fragiles. Ainsi l’hydrolyse du maltose par la maltase se fait à 25 °C et à pH 7 ; la synthèse chimique de l’alcool éthylique nécessite une température supérieure à 250 °C et une pression d’environ 50 bars alors que la levure de bière (Saccharomyces cerevisiae) réalise la fermentation alcoolique à température (15-25 °C) et à pression ambiantes. D’autres enzymes, telles que les lipases et les protéases, par exemple, sont stables même dans des solvants organiques, ce qui autorise la catalyse de réactions qui ne sont pas possibles en milieux aqueux. Comparés aux procédés chimiques classiques, les procédés enzymatiques peuvent être utilisés pour la catalyse des réactions chimiques de façon très efficace et spécifique, tout en consommant moins d’énergie, en produisant moins de déchets. De plus, les conditions drastiques, nécessaires dans les procédés chimiques, augmentent considérablement le coût des investissements en équipements qui doivent être capables de supporter les hautes températures et/ou les hautes pressions, les produits corrosifs et être dotés de moyens de contrôle (refroidissement, par exemple) adaptés. Pour beaucoup de procédés, les enzymes sont rapidement passées de la recherche à la commercialisation (ex. par la société Novozymes). Elles sont, de ce fait, devenues aujourd’hui des auxiliaires technologiques importants utilisés dans une multitude de processus industriels. Des branches industrielles totalement innovantes sont ainsi nées et d’autres sont en train d’émerger grâce à la disponibilité sur le marché de nouvelles enzymes. Dans l’agro-alimentaire les enzymes interviennent dans de nombreux procédés de fabrication : produits laitiers, production d’alcool, d’amidon, élaboration des arômes, fabrication des jus de fruits et des boissons gazeuses, production du pain… Elles interviennent également dans de nombreux autres domaines tels que la chimie fine, l’industrie pharmaceutique, la fabrication des lessives ou l’alimentation animale. Elles participent à la synthèse de molécules biochimiques, ainsi qu’à l’élaboration de nouvelles techniques analytiques, à la fois sensibles, spécifiques et rapides. La demande en de nouvelles enzymes est en très forte croissance : entre 1995 et 2000, elle a été multipliée par 10. On évalue à au moins un milliard de dollars américains par an le marché mondial des enzymes industrielles extraites de micro-organismes. Il est clair que l’avenir de ces auxiliaires biochimiques sera tributaire du développement de technologies économiquement rentables pour leur production et leur l’utilisation à l’échelle industrielle. L’utilisation dans l’industrie d’enzymes purifiées ou de leurs organismes producteurs (micro-organismes comme les moisissures, levures, bactéries) devrait contribuer au développement durable en réduisant la consommation d’eau, d’énergie et de matières premières tout en préservant l’environnement. L’utilisation des enzymes est soumise à une réglementation stricte dans de nombreux pays industrialisés. Dans les applications relevant de l’industrie agro-alimentaire, l’enzyme doit être capable de produire les fonctionnalités désirées avec un coût minimal.

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Les fournisseurs de ce marché s’efforcent toujours de trouver les meilleures sources d’enzymes pour les différents processus industriels. Les techniques du génie génétique aidant, les propriétés des enzymes ont été sans cesse améliorées et adaptées à la production industrielle. Les principales caractéristiques qui définissent le profil d’une préparation enzymatique sont : 1. l’activité (par gramme d’enzyme), 2. le pH optimal, 3. la température optimale, 4. la stabilité dans les conditions d’utilisation, 5. la présence (ou l’absence) d’activités secondaires potentiellement nuisibles.

16.2. OBTENTION DES ENZYMES À des fins de production industrielle, les enzymes sont extraites des cellules végétales et animales ou produites par fermentation contrôlée, par des micro-organismes, généralement modifiés génétiquement. Les enzymes d’origine végétale sont surtout des protéases comme : la papaïne, extraite d’une plante équatoriale et tropicale, le papayer (Carica papaya, Caricacées) qui sert à attendrir la viande, la bromélaïne, extraite de l’ananas (Ananas comosus, Bromeliacées), la ficine tirée des figues (Ficus carica et F. glabrata
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l’actinidine extraite des fruits de kiwi (Actinidia deliciosa), la lipoxygénase issue de certaines Légumineuses (soja, fève, petits pois), la laccase hydrolase purifiée à partir de la sève et des tissus de diverses plantes. Les enzymes d’origine animale sont moins nombreuses : la chymosine extraite de la caillette de veau, la trypsine extraite du pancréas de porc ou de bœuf, la pepsine extraite de la muqueuse gastrique du porc ou d’autres animaux, la catalase extraite du foie de bovin ou de cheval, les lipases extraites de l’estomac de bovin, du pancréas de porc ou de bœuf, le lysozyme tiré du blanc d’œuf de poule. À côté de ces enzymes courantes, on peut ajouter les activateurs du plasminogène. Il s’agit d’un groupe d’enzymes protéolytiques qui agissent sur une molécule inactive du sang, appelé plasminogène, en la transformant en plasmine active. La plasmine détruit le réseau de fibrine d’un caillot de sang. L’urokinase humaine est le meilleur activateur du plasminogène connu, mais son prix de revient est excessif puisqu’un traitement nécessite une extraction à partir de 5000 L d’urine. Les activateurs du plasminogène produits par les tissus sont plus spécifiques dans leur action, et peuvent être obtenus à partir de cellules humaines en culture. La culture à grande échelle de cellules animales présente beaucoup plus de problèmes que celle des micro-organismes. Notons que les plantes comme les animaux sont des usines (bioréacteurs vivants) de production potentielle de protéines hétérologues, mais ce domaine est encore au stade embryonnaire.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

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Hormis ces quelques exemples, la grande majorité des enzymes utilisées dans l’industrie est issue de micro-organismes : 50 % proviennent des champignons et des levures, 35 % des bactéries, les 15 % restant ayant des origines diverses. Les micro-organismes offrent certains avantages par rapport aux plantes et aux animaux : croissance rapide et facilement optimisable, grande diversité d’activités, amélioration et sélection génétiques aisées, faible coût de production, utilisation réglementée des souches et des substrats. Grâce à une meilleure connaissance des mécanismes de fonctionnement et de régulation génétique de ces enzymes, leur disponibilité n’est plus un problème. Les développements de la biologie cellulaire, de la génétique moléculaire, du génie enzymatique et de la protéomique durant les dernières décennies ont bouleversé la production in vivo des enzymes. Il est devenu possible de cloner les gènes qui codent pour des enzymes particulières et de les exprimer dans des micro-organismes hôtes qui sont mieux adaptés aux conditions industrielles (pH variable, température élevée…) à grande échelle. La surexpression de certains gènes permet d’obtenir, avec des souches de micro-organismes cultivées dans des conditions appropriées, une production massive d’enzymes de grand intérêt à la fois biologique et industriel. En outre, les méthodes du génie génétique permettent l’introduction et l’expression dans ces micro-organismes de gènes étrangers (d’organismes supérieurs ou d’autres micro-organismes). Ce développement de la production d’enzymes pour des applications industrielles est lié également à une meilleure maîtrise de la fermentation, au choix judicieux des souches et de la matière première ainsi qu’aux techniques de purification qui sont en constante et rapide progression. Les techniques de séparation actuelles (chromatographie sur différents types de supports, procédés à membrane…) ouvrent des perspectives nouvelles pour l’amélioration des techniques rapides de purifications d’enzymes. Le protocole et les techniques utilisées pour extraire et purifier une enzyme sont présentés dans la figure 16.1. Des d’enzymes, en nombre de plus en plus important (amylases, amyloglucosidase, cellulases, glucose isomérase, invertase, catalase, lipases, pectinases, protéases…), sont ainsi disponibles sur le marché sous différentes formes (extrait liquide, extrait sec, encapsulée, lyophilisée ou immobilisée sur un support) correspondant aux besoins des différentes branches de l’industrie et de la médecine.

16.3. APPLICATIONS ET PERSPECTIVES Les enzymes sont utilisées dans une large gamme de processus technologiques comme la synthèse, la transformation de la matière première, le diagnostic, la dépollution… Les paragraphes qui suivent montrent, au travers de quelques exemples précis, que ce secteur est en pleine expansion.

16.3.1. SYNTHÈSE ORGANIQUE La synthèse chimique est un domaine où l’usage de la catalyse enzymatique a longtemps été perçu comme très porteur. Les transformations enzymatiques sont de plus en plus utilisées dans la synthèse ou l’hémisynthèse de molécules organiques, comme en témoigne

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

les nombreuses publications dans ce domaine. Bien que, jusqu’à une date récente, l'utilisation des enzymes dans la synthèse ait été restreinte à quelques domaines de la recherche, actuellement les processus basés sur les enzymes connaissent un essor considérable pour la production d’une diversité de nouveaux produits utilisés dans les industries de seconde transformation : alcools, acides aminés, acides organiques, composés responsables des arômes et du goût, édulcorants, corps gras aux qualités technologiques, organoleptiques et nutritionnelles déterminées… L’une des raisons à l’origine de cet intérêt provient du fait que les enzymes, qu’elles soient isolées ou en place dans la cellule, sont des catalyseurs d’une efficacité inégalée en conditions douces. De plus, elles peuvent produire des molécules optiquement actives à partir de substrats racémiques. Elles catalysent des transformations qui sont difficiles à réaliser à l’aide des catalyseurs chimiques conventionnels et elles sont écologiquement plus neutres. Les réactions chimiques qui peuvent être catalysées par les enzymes sont très diverses : hydrolyse, estérification, isomérisation, racémisation, épimérisation, transfert de groupement, addition et élimination, alkylation et désalkylation, halogénation et déshalogénation, oxydation et réduction. source cellulaire rupture des cellules

élimination des débris purification préliminaire

purification haute résolution

animal, plante, microorganisme - méthodes chimiques : détergents, alcalis - méthodes enzymatiques : lysozyme - altérations structurales : choc osmotique, congélation-décongélation - méthodes mécaniques : hautes pressions (55 MPa), broyage, sonication décantation, centrifugation, filtration - précipitation au pHi - ultrafiltration - traitement par la chaleur : précipitation - précipitation par les sels : sulfate d’ammonium 4 M - précipitation par solvants organiques : alcool, acétone - précipitation par des polymères : PEG - précipitation par l’acide trichloroacétique - filtration sur gel : séparation basée sur la taille moléculaire - chromatographie d’échange d’ions : séparation basée sur la charge - chromatographie d’affinité : séparation basée sur la reconnaissance biologique - électrophorèse : séparation basée sur la charge - cristallisation

enzyme purifiée

Figure 16.1 - Processus général d’isolement et de purification des enzymes

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

361

16.3.1.1. RÉSOLUTION DE MÉLANGES RACÉMIQUES ET SYNTHÈSE D’ÉNANTIOMÈRES Les intermédiaires clés utilisés dans la synthèse de nombreux médicaments, de substances agrochimiques et de parfums sont souvent des composés complexes et/ou chiraux, difficiles à obtenir avec les méthodes chimiques conventionnelles. En outre, seulement un des deux énantiomères du principe actif est biologiquement actif. Les intermédiaires chiraux et les produits de la chimie fine sont très demandés par les industries pharmaceutiques et agrochimiques pour la préparation de substances médicamenteuses et de produits phytosanitaires. La seule alternative est l’utilisation des enzymes. Il existe de nombreux exemples de réactions énantio-sélectives catalysées par les lipases pour la synthèse de produits pharmaceutiques. La lipase de Pseudomonas a été utilisée pour la synthèse de l’intermédiaire chiral dans la synthèse totale de l’agent antitumoral, l’épothilone A4. La lipase « OF-360 » commerciale de Candida rugosa catalyse la résolution enzymatique des composés antimicrobiaux (S)- et (R)-elvirol et leurs dérivés (S)- et (R)-curcuphénol. Ce dernier présente une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus et Vibrio anguillarum, alors que le (S)-énantiomère inhibe l’ATPase-H+,+ gastrique. Dans le domaine des substances agrochimiques, les lipases sont utilisées dans la production de l’énantiopure (S)-indanofan, un nouvel herbicide utilisé contre les mauvaises herbes dans les rizières. Seul le (S)-énantiomère présentant cette activité herbicide est actuellement synthétisé par des techniques combinées de résolution enzymatique catalysée par la lipase et l’inversion chimique.

16.3.1.2. SYNTHÈSE DE L’ACRYLAMIDE C’est l’une des premières applications d’enzymes à grande échelle dans l’industrie chimique. L’acrylamide est un produit chimique très employé dans les laboratoires des sciences de la vie pour préparer les gels de polyacrylamide utilisés pour séparer par électrophorèse les macromolécules protéiques et les acides nucléiques. Il est utilisé aussi dans différentes applications industrielles dont le traitement de l’eau potable (floculation des particules en suspension). Le procédé chimique classique de production de l’acrylamide à partir d’acrylonitrile se fait à haute température à l’aide d’un catalyseur à base de cuivre ou d’acide sulfurique. Cette NÏUIPEF
DIJNJRVF
FTU
NBJOUFOBOU
SFNQMBDÏF
QBS
VO
CJPQSPDÏEÏ
NJT
BV
QPJOU
QBS
.JUTVbishi Rayon Co. (Japon) et qui utilise une enzyme existant à l’état naturel, la nitrile hydratase, pour catalyser la conversion de l’acrylonitrile en acrylamide (fig. 16.2). L’acrylamide est ensuite soumis à une polymérisation pour obtenir le polyacrylamide classique. H2C

C

C

H acrylonitrile

N + H2O

nitrile hydratase

O H2C

C

C NH2

H acrylamide

Figure 16.2 - Synthèse enzymatique de l’acrylamide

362

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

La performance et le rendement de cette enzyme ont été optimisés par modification génétique du micro-organisme produisant naturellement l’enzyme. Le procédé enzymatique permet de réduire de 80 % la consommation d’énergie, d’abaisser les coûts et d’obtenir une acrylamide plus pure que celle obtenue avec le procédé chimique classique. La compagnie japonaise produit 30 000 t/an d’acrylamide (soit 12 % de la production mondiale). La voie enzymatique évite la formation de sous-produits (sulfates ou acide acrylique) et le retraitement du catalyseur au cuivre. De plus, l’impact financier résultant de la minimisation des déchets, des conditions opératoires et du meilleur rendement de cette opération est loin d’être négligeable (tab. 16.1). Tableau 16.1 - Comparaison entre les procédés catalytiques et enzymatiques de production de l’acrylamide [Source : OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique), 2001]

Conditions opératoires température [°C]

Procédé chimique enzymatique 70

4-15

pureté [%]

70-80

> 99

concentration d’acrylamide [%]

_


48-50

étape de concentration

oui

non

16.3.1.3. SYNTHÈSE DES COMPOSÉS RESPONSABLES DU GOÛT ET DES ARÔMES Les caractéristiques organoleptiques des aliments sont déterminées généralement par les structures moléculaires exactes des produits chimiques qui y sont présents. Par conséquent, des modifications mêmes minimes de la molécule tel qu’un groupe hydroxyle supplémentaire, une double liaison trans plutôt que cis, ou un isomère  R plutôt qu’un isomère  S, peuvent modifier ou faire disparaître complètement le goût ou les propriétés odorantes d’une molécule. Beaucoup de parfums et de produits aromatiques sont produits naturellement dans les aliments par l’action des enzymes endogènes et/ou par les micro-organismes qui s’y trouvent naturellement tels que ceux qui contribuent aux goûts et odeur du pain, du fromage, du vin, de la bière, et de beaucoup de produits orientaux tels que le soja. Le besoin de rendre aux aliments produits industriellement le goût et les caractéristiques organoleptiques qui évoquent les produits traditionnels nécessite d’élaborer des processus adaptés. C’est en particulier le cas pour beaucoup d’aliments qui perdent leurs produits aromatiques volatiles ou thermolabiles durant leur traitement. L’usage de méthodes enzymatiques est particulièrement avantageux pour la production industrielle de ces « saveurs naturelles », bien acceptées et mêmes recherchées des consommateurs. Les micro-organismes (bactéries et champignons) qui, par l’intermédiaire de leurs enzymes, produisent des métabolites (acides, alcools, lactones, esters, aldéhydes, cétones…) responsables majeurs de la flaveur, constituent une excellente source pour produire ce type de composés.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

363

La voie enzymatique directe pour la synthèse de certaines substances responsables d’une flaveur particulière est plus intéressante. Par rapport aux micro-organismes, les enzymes présentent l’avantage de ne pas produire de coproduits. Les enzymes les plus utilisées et étudiées sont les lipases et les oxydoréductases. Ainsi, la vanilline est un produit largement utilisé pour ses propriétés aromatisantes dans de nombreux domaines tels que les produits agro-alimentaires, les boissons non-alcoolisées, les glaces, les desserts glacés, la pâtisserie, la biscuiterie, la chocolaterie, la confiserie et les produits laitiers. C’est aussi un produit intermédiaire de synthèse de plusieurs dérivés pour la chimie pharmaceutique et la phytochimie : synthèse de l’éthyle vanillate, de l’acide diéthylamide vanillique, de la L-dihydroxyphénylalanine. La vanille naturelle, extraite des gousses du vanillier (Vanilla planifolia, Orchidacées), est un mélange de  150 à  200 composés différents. L’arôme spécifique de la vanille est la résultante de l’ensemble de ces composés dont le plus caractéristique est la vanilline (4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde), substance aromatique de base de la vanille, à odeur agréable et à saveur légèrement piquante. La teneur en vanilline (composé majoritaire) reste le critère le plus important dans la détermination de la qualité d’une gousse. La vanille est très chère à produire et à préparer, contrairement à la vanilline qui peut être fabriquée à faible coût par divers procédés chimiques. L’arôme de vanille artificielle est une solution de vanilline pure, généralement d’origine synthétique. De ce fait, la production industrielle de la vanilline et son utilisation dans les divers domaines d’applications sont devenues bien plus importantes que la production et l’usage de la vanille naturelle. Toutefois, la demande pour ce produit naturel excède toujours l’offre ; aussi le déficit est comblé par la synthèse chimique. La vanilline a été d’abord synthétisée et produite commercialement à partir de l’eugénol (constituant de l’huile de girofle), puis à partir de la liqueur sulfitique (provenant de la pulpe de bois) riche en lignine mais la majeure partie de vanilline est synthétisée actuellement par un processus à deux étapes, à partir de précurseurs pétrochimiques, le gaïacol et l’acide glyoxylique. Une des voies biotechnologiques pour la production de la vanilline, ayant de grandes possibilités industrielles, consiste à utiliser les déchets agro-industriels tels que la lignine. Rappelons que cette dernière est un sous-produit abondant de l’industrie du papier, également présent dans beaucoup de sous-produits agro-industriels. La vanilline est ainsi produite par bioconversion de l’acide férulique (fig. 16.3) à l’aide de divers champignons. COOH CHO

OCH3 OH acide férulique

OCH3 OH vanilline

Figure 16.3 - Conversion de l’acide férulique en vanilline

364

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

L’acide férulique (acide phénolique présent dans les parois cellulaires) est d’abord obtenu à partir de la biomasse ligneuse, à l’aide de diverses estérases fongiques, puis converti, soit directement en vanilline à l’aide d’une souche de basidiomycète tel que Pycnoporus cinnabarinus, soit par un processus à deux étapes sous l’action de divers micro-organismes (tels que Aspergillus niger, Xanthomonas campestris) qui transforment l’acide férulique en acide vanillique puis par Pycnoporus cinnabarinus pour produire la vanilline à partir de l’acide vanillique.

16.3.1.4. SYNTHÈSE DES EXHAUSTEURS DE GOÛT Sous ce nom on désigne des composés comme le glutamate monosodique et des monoOVDMÏPUJEFT
UFMT
RVF
MB
HVBOPTJOFNPOPQIPTQIBUF
(.1
FU
MJOPTJOFNPOPQIPTQIBUF
*.1


RVJ
BDDFOUVFOU
MF
HPßU
FU
MB
TBWFVS
EFT
QSÏQBSBUJPOT
BMJNFOUBJSFT
BVYRVFMMFT
ils sont ajoutés. Ils sont, de ce fait, utilisés comme potentialisateurs de la saveur dans les soupes, les sauces, le jus de viande, et beaucoup d’autres aliments. Ils sont actuellement produits sous forme purifiée, par fermentation microbienne de substrats organiques ou par synthèse enzymatique, combinée, pour certains, à des méthodes chimiques. Avec une production mondiale annuelle de près d’un million de tonnes, le glutamate monosodique est l’un des produits les plus importants, comparable, en tonnage, à la production de beaucoup de dérivés pétrochimiques. La presque totalité du glutamate est obtenue par fermentation de sucres, de molasse ou d’amidon à l’aide de souches sélectionnées de Corynebacterium glutamicum. Ces souches ont une faible activité déshydrogénasique sur l’α-cétoglutarate qui empêche la formation de succinate, et de ce fait, elles forment préférentiellement du glutamate par amidation réductive du cétoglutarate. De plus, la productivité des fermentations dépend de l’utilisation de milieux contenant très peu de biotine (moins de 5 μg/L), ce qui rend les parois cellulaires du micro-organisme suffisamment perméables permettant la sortie du glutamate hors de la cellule donc dans le milieu extérieur où il s’accumule. À l’issue de la fermentation, les cellules sont éliminées, et le glutamate est précipité sous forme de cristaux par addition d’HCl. L’autre avantage de la fermentation est que seul l’isomère L est produit.

16.3.1.5. SYNTHÈSE ENZYMATIQUE DES ACIDES ORGANIQUES ET DES ACIDES AMINÉS Acides organiques Les acides organiques trouvent de nombreuses applications dans différents secteurs d’activité, tout particulièrement dans l’industrie agro-alimentaire, dans l’industrie pharmaceutique, dans la fabrication de polymères biodégradables… Les industries agro-alimentaires utilisent des acides organiques tels que l’acide gluconique, certains acides aldoniques, l’acide  L-malique ou l’acide  L-tartrique, soit comme matière première pour les industries de seconde transformation, soit comme additifs alimentaires, conservateurs, régulateurs d’acidité et/ou complexants dans certains procédés de fabrication ou pour la production de certains aliments. La demande croissante d’acide lactique peut être actuellement attribuée à son utilisation en tant que monomère pour la production des polymères biodégradables (polylactates

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

365

ou polylactides), pouvant remplacer les polymères synthétiques, tel que le polyéthylène, le nylon, le polyester et le polystyrène, dans de nombreuses applications comme la production des sacs plastiques, les emballages, les films de paillage agricole, les gobelets, les vêtements, les implants osseux… Le procédé d’obtention de ces nouveaux matériaux est non seulement économe en énergie et en matières premières, mais utilise également comme matière de base des ressources agricoles renouvelables comme les sous-produits agro-industriels (fig. 16.4) riches en glucose, en saccharose, en lactose ou en amidon. Le polylactate est non seulement recyclable, mais il est aussi biodégradable et peut être composté. jus riche en saccharose provenant des industries sucrières fermentation microbienne (Bacillus thermoamylovorans) acide L(+) lactique polymérisation catalysée par l’acide sulfurique CH3 O

C H

C

O

H

O

C

C

O CH3 polylactate

Figure 16.4 - Production de polylactate à partir des sous-produits agro-industriels riches en glucides fermentescibles L’acide fumarique (C4H4O4) a une grande gamme d’applications. C’est un intermédiaire intéressant dans les synthèses chimiques qui impliquent des réactions d’estérification. Il est atoxique et non-hygroscopique d’où son utilisation comme acidulant dans les industries alimentaire et pharmaceutique. Il peut être obtenu par fermentation de divers résidus agro-industriels. C’est l’industrie japonaise qui détient la première place dans le domaine de la production des acides organiques : X la compagnie Hayashibara utilise un procédé enzymatique permettant, à partir de mono-, di- et tri-saccharides, de préparer les acides aldoniques (molécule issue de l’oxydation de la fonction aldéhyde d’un ose en fonction acide carboxylique) correspondants au moyen de systèmes oxydasiques issus de Pseudomonas fragi ; X la compagnie Tanabe Seiyaku Co., Ltd. synthétise, grâce à une fumarase immobilisée de Brevibacterium flavum, l’acide malique à partir de l’acide fumarique (fig. 16.5). Dans les deux cas, les cellules bactériennes sont fixées sur un gel de κ-carraghénane. OH COOH HOOC acide fumarique

fumarase + H 2O

COOH HOOC acide malique

Figure 16.5 - Synthèse de l’acide malique

366

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

L’acide malique est utilisé comme acidulant dans les jus de fruits, les boissons carbonatées, les confitures et dans les solutions d’infusions pour la nutrition parentérale dans le traitement des dysfonctionnements hépatiques.

Acides aminés Les L-aminoacides constituent un groupe de molécules utilisé en nutrition parentérale, comme additifs alimentaires, comme compléments dans les rations alimentaires de certains animaux d’élevage, en cosmétologie, comme pesticides et comme intermédiaires pour la synthèse de produits pharmaceutiques et la synthèse organique. Actuellement, il existe de nombreux procédés de production des acides aminés. Ces derniers peuvent être obtenus par extraction (à partir d’une matière première riche en l’acide aminé recherché), par synthèse chimique, par fermentation microbienne ou par synthèse enzymatique. Pratiquement, les 20 acides aminés présents dans les protéines sont actuellement produits par ces deux dernières voies. Par exemple, la L-alanine est produite industriellement par la firme japonaise Tanabe Seiyaku depuis 1965 à l’aide de la L-aspartate β-décarboxylase de Pseudomonas dacunhae (fig. 16.6). NH2

NH2 COOH HOOC acide aspartique

L-aspartate β-décarboxylase HOOC alanine

+ CO2

Figure 16.6 - Synthèse de l’alanine par décarboxylation de l’acide aspartique Afin d’améliorer le rendement de cette réaction, l’activité de la L-aspartate β-décarboxylase est stabilisée par l’addition de pyruvate et de pyridoxal phosphate. Cette réaction est souvent combinée à la synthèse de l’acide L-aspartique, catalysée par la L-aspartase ammonia-lyase à partir du fumarate, dans un processus à deux étapes (fig. 16.7). La principale raison de la séparation dans deux réacteurs est la différence de pH optimal pour les deux enzymes (aspartase de E. coli : pH 8,5, L-aspartate β-décarboxylase de Pseudomonas dacunhae : pH 6,0). À la fin du processus, les deux produits sont recueillis sous forme cristallisée. C’est le premier processus commercial d’une réaction enzymatique séquentielle utilisant deux types de cellules microbiennes immobilisées : NH2

NH2 COOH + NH 3 HOOC acide fumarique

E1

COOH HOOC acide aspartique

E2 HOOC alanine

+ CO2

Figure 16.7 - Synthèse de l’alanine par amination de l’acide fumarique suivie d’une décarboxylation de l’acide aspartique E1 = L-aspartase ammonia-lyase ; E2 = L-aspartate β-décarboxylase

Dans certains processus, le substrat de départ est l’acide maléique (isomère trans) qui est isomérisé par la maléate isomérase pour former l’acide fumarique (isomère cis) lequel sera ensuite converti en acide L-aspartique à l’aide d’une aspartase ammonia-lyase.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

367

16.3.1.6. ÉDULCORANTS Synthèse de l’aspartame L‘aspartame, α-L-aspartyl-L-phénylalanine méthylester, est un édulcorant de synthèse dont le pouvoir sucrant est près de 180 fois supérieur à celui du saccharose. C’est l’édulcorant intense le plus commun utilisé dans les boissons, les comprimés, les glaces, le chewing-gum, et de nombreux autres produits alimentaires dits allégés. Sa consommation mondiale est actuellement de près de 15 000 t/an. La molécule de l’aspartame est formée de 2 acides aminés : L-phénylalanine méthylène et acide L-aspartique (fig. 16.8). À l’heure actuelle, l’aspartame est produit essentiellement par 2 voies : la synthèse chimique VUJMJTÏF
QBS
/VUSBTXFFU
BVY
²UBUT6OJT
FU
"KJOPNPUP
BV
+BQPO
FU
MB
TZOUIÒTF
FO[ZNBUJRVF
VUJMJTÏF
QBS
)PMMBOE
4XFFUFOFS
$PNQBOZ
FU
%4.
FO
)PMMBOEF
5040)
BV
+BQPO  Plusieurs méthodes enzymatiques ont été décrites. L’une d’elles utilise une réaction de DPOEFOTBUJPO
FOUSF
MF
-BTQBSUBUF
-"TQ
FU
MB
-QIÏOZMBMBOJOF
NÏUIZMFTUFS
-1IF0.F
Ë
l’aide d’une métalloprotéase bactérienne, la thermolysine (fig. 16.8). COOH COOH + H2N

H2N

C OCH3 O D,L-PheOCH3

L-Asp

thermolysine

COOH H2 N

C

H N

COOCH3

+ H2N

L-AspPheOCH3

C O

OCH3

D-PheOCH3

Figure 16.8 - Synthèse de l’aspartame, catalysée par la thermolysine La thermolysine produite par Bacillus thermoproteolyticus Rokko est la protéase la plus thermostable actuellement produite pour usage industriel. L’avantage de la méthode enzymatique est qu’on peut utiliser un substrat racémique sans qu’il y ait production de β-aspartame (fig. 16.9) qui possède un goût amer. COOH H2N

C O

H N

COOMe O C N H H2N

α-aspartame

COOMe

COOH β-aspartame

Figure 16.9 - Structure de l’aspartame et de son régio-isomère

368

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

L’utilisation de phénylalanine racémique dans cette réaction est très avantageuse, parce que la L-phénylalanine est plus chère que la phénylalanine racémique. De plus, l’utilisation de la thermolysine fixée, en solvant organique, facilite la séparation des constituants, l’aspartame se dissolvant aisément dans un solvant organique tel que l’acétate d’éthyle par exemple.

Obtention du stévioside Le stévioside (glucoside d’un diterpène, le stéviol) (fig. 16.10) est un édulcorant naturel intense extrait des feuilles d’un arbuste sud-américain, Stevia rebaudiana Bertoni (Asteracées). Par action d’une α-glucosidase, sa solubilité est améliorée et son goût amer naturel est supprimé. Le pouvoir sucrant du produit obtenu est d’environ 250 à 300 fois plus élevé que celui du saccharose. Son principal avanOR1 tage, par rapport aux autres édulcorants comme l’aspartame, est qu’il peut être chauffé et qu’il supporte aisément des températures allant jusqu’à 200 °C. R1 = Glc (1J 2) Glc R2 = Glc

CO2R2

Figure 16.10 - Structure du stévioside

16.3.2. TRANSFORMATION DES PRODUITS AGRO-ALIMENTAIRES L’application d’enzymes exogènes dans la transformation des matières naturelles peut avoir plusieurs objectifs : X optimiser un procédé technologique et/ou réduire son coût, X améliorer le conditionnement, X améliorer la stabilité physique, la conservation et/ou les qualités organoleptiques ou nutritionnelles, X corriger des déficiences naturelles, X valoriser les sous-produits issus des activités agro-industrielles, X préserver l’environnement. Ces différents objectifs peuvent être envisagés ensemble (ce qui est l’idéal) ou individuellement dans le cadre d’un même traitement. Toutes les branches agro-alimentaires (boulangerie, jus de fruits, laits et dérivés, brasserie, vinification…) sont concernées par de telles applications. Le tableau 16.2 en donne un aperçu général. Tableau 16.2 - Quelques exemples d’applications actuelles des enzymes dans la transformation de produits agro-alimentaires Enzyme

Matière première Principales utilisations Substrat

aminopeptidase

protéines (soja, lait, poissons…)

t
QSPEVDUJPO
EIZESPMZTBUT
EF
QSPUÏJOFT

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

α-amylase

amidon

369 t

QSPEVDUJPO
EF
EFYUSJOFT
PV
EF
HMVDPTF
QPVS
MB
biscuiterie, pâtisserie, viennoiserie, jus de fruits et de légumes, sirops t
BNÏMJPSBUJPO
EF
MB
RVBMJUÏ
EV
QBJO
BOUJSBTTJTTBOU

t

EFTUSVDUJPO
EF
Mapprêt à base d’amidon des fils textiles t
GPSNVMBUJPO
EF
EÏUFSHFOUT

amyloglucosidase dextrines

t

QSPEVDUJPO
EF
HMVDPTF
QPVS
MB
CJTDVJUFSJF
QÉUJTTFSJF
viennoiserie, bières

asparaginase

féculents

t

USBOTGPSNBUJPO
EF
MBTQBSBHJOF
QSÏDVSTFVS
EF
l’acrylamide) en acide aspartique

cellulase

cellulose

t
QSPEVDUJPO
EF
HMVDPTF t

BNÏMJPSBUJPO
EV
SFOEFNFOU
FO
KVT
QBS
EFTUSVDUJPO
EFT
parois cellulaires t
GPSNVMBUJPO
EF
EÏUFSHFOUT

chymosine

caséines du lait

t
GPSNBUJPO
EV
DBJMMÏ

cyclodextrineamidon, cellulose glycosyltransférase

t
QSPEVDUJPO
EF
DZDMPEFYUSJOFT

β-galactosidase

t
QSPEVDUJPO
EF
MBJU
TBOT
MBDUPTF
IZESPMZTF
EV
MBDUPTF

lait, lactosérum

glucose isomérase glucose

t

JTPNÏSJTBUJPO
EV
HMVDPTF
FO
GSVDUPTF
QPVS
la production de sirops de maïs riches en fructose

invertase

saccharose

t
QSPEVDUJPO
EF
TVDSF
JOWFSUJ
QPVS
MB
DPOöTFSJF

lipase

huiles et graisses alimentaires

t

QSPEVDUJPO
EBDJEFT
HSBT
SFTQPOTBCMFT
EF
MB
øBWFVS
dans la fabrication du fromage (hydrolyse des lipides), et de glycérol t
EÏUFSHFOUT

papaïne

protéines

t

QSPEVDUJPO
EIZESPMZTBUT
EF
QSPUÏJOFT
VUJMJTÏT
comme matière de base, d’arômes ou de préparations aromatiques

pectinase

fruits

t

DMBSJöDBUJPO
EF
KVT
EF
GSVJUT
EFTUSVDUJPO
EFT
QFDUJOFT

phytase

acide phytique

t

MJCÏSBUJPO
EV
QIPTQIBUF
Ë
QBSUJS
EF
MBDJEF
QIZUJRVF
des aliments destinés aux animaux

protéase

t

QSPEVDUJPO
EF
QFQUJEFT
PV
EBDJEFT
BNJOÏT
IZESPMZTBUT

t
QSPUÏJOFT
EF
TPKB
t

QSPEVDUJPO
EF
QFQUJEFT
SFTQPOTBCMFT
EF
MB
øBWFVS
QFOt
MBJU dant l’affinage du fromage t
EÏUFSHFOUT

pullulanase

pullulane

t

GBDJMJUF
MB
GFSNFOUBUJPO
FU
MF
EÏWFMPQQFNFOU
EF
MB
QÉUF t
FOUSF
EBOT
MB
DPNQPTJUJPO
EF
EÏUFSHFOUT

xylanase

xylanes (hémicelluloses)

t

IZESPMZTF
EFT
YZMBOFT
QBSJÏUBVY
FO
amidonnerie, production de jus… t
JOEVTUSJF
EV
QBQJFS

370

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

16.3.2.1. UTILISATION DES ENZYMES DANS L’INDUSTRIE LAITIÈRE Fromagerie Les applications courantes des enzymes dans ce domaine incluent la formation du caillé, l’accélération de l’affinage, l’intensification de l’arôme des fromages et la lipolyse des graisses. En France, par exemple, près de 15 milliards de litres de lait sont transformés chaque année en fromages ou yaourts grâce à leur action (source : INRA). X Enzymes de la coagulation Diverses enzymes protéolytiques ont la propriété de coaguler le lait. Elles sont soit d’origine animale (présure, pepsine), soit d’origine végétale (bromélaïne, ficine), soit d’origine microbienne (enzymes de certaines moisissures ou de bactéries). La présure est, certainement, la préparation enzymatique traditionnelle la plus répandue. Elle est sécrétée dans la caillette des jeunes ruminants nourris au lait. Elle est constituée d’un mélange de deux enzymes qui ont la propriété de coaguler le lait, la chymosine (qui représente 80-95 % de l’activité coagulante totale, selon l’âge de l’animal) et la pepsine. La présence dominante de la chymosine par rapport à la pepsine dans la caillette des jeunes veaux s’explique par le fait que la chymosine n’hydrolyse pas les immunoglobulines (contrairement à la pepsine) présentes dans le colostrum et qui sont nécessaires à l’immunité. La coagulation se fait par hydrolyse des liaisons phénylalanine-méthionine des caséines kappa. La durée de la coagulation est inversement proportionnelle à la concentration de l’enzyme. L’activité optimale pour un lait brut est atteinte à 42,5 °C et pH 6,6 et pour un lait pasteurisé à 45 °C et pH 6,5. La chymosine est inactive aux températures supérieures à 55 °C et inférieures à 15 °C. En raison de la disponibilité limitée de la présure de veau, des substituts d’origine microbienne ont été élaborés, couvrant la presque totalité de la demande en enzymes de coagulation dans le monde. Ces coagulants microbiens, produits par fermentation, sont des enzymes extraites de Rhizomucor miehei, R. pussilus et Cryphonectria parasitica. D’autres préparations commerciales sont souvent des mélanges standardisés de chymosine et de pepsine bovine. Dans certains types de fromage, on utilise des protéases végétales de Solanum dubium et de cardon (Cynara cardunculus). Les fleurs de ce dernier sont utilisées traditionnellement dans certains pays méditerranéens (Algérie, Portugal, par exemple) pour faire du fromage doux de brebis, mais son activité protéolytique élevée n’est pas adéquate dans la fabrication de fromages comme l’Edam ou le Roquefort. Les enzymes impliquées sont des protéases aspartiques, les cardosines (A et B) et les cyprosines. Ces protéases sont souvent apportées sous forme de fleurs séchées. X Enzymes de l’affinage (ou maturation) L’affinage correspond à un ensemble de processus enzymatiques, simultanés ou successifs, au niveau du substrat (= le caillé) qui vont modifier sa composition, sa texture, sa valeur nutritive, sa digestibilité et ses caractéristiques organoleptiques (aspect, consistance, flaveur). La très grande variété de fromages disponibles dans le monde est essentiellement due à l’importante variabilité de ces différentes propriétés physico-chimiques. L’affinage constitue un phénomène très complexe en raison de la nature du substrat, de la diversité des agents responsables, de la variété des transformations et du nombre de produits formés. Les phénomènes biochimiques qui se déroulent durant ce processus

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

371

peuvent être reliés à quatre catégories d’activité enzymatique : la fermentation du lactose, la dégradation enzymatique des protéines, l’hydrolyse de la matière grasse et la dégradation du lactose. La protéolyse (des caséines, en particulier) aboutit à la libération d’éléments protidiques de plus en plus simples et à sapidité croissante : polypeptides, peptides, acides aminés, ammoniac. La lipolyse génère des acides gras et du glycérol, eux-mêmes pouvant être transformés en composés plus sapides et aromatiques (aldéhydes, cétones). Le dernier processus concerne la conversion enzymatique du lactose en acide lactique par les micro-organismes. En particulier, les acides formés lors de l’affinage contribuent considérablement au « caractère » du fromage. Il s’agit donc d’un processus lent et coûteux en immobilisation de capital (espace de stockage, contrôle de température…). Il dure de quelques semaines à plusieurs mois, voire même quelques années, selon le type de fromage. Les efforts de la recherche actuelle tendent à une meilleure optimisation des paramètres impliqués dans ce processus (amélioration de la qualité générale, réduction du temps et du coût…) par l’apport d’enzymes exogènes, protéases, lipases, estérases, décarboxylases. Une autre approche pour accélérer l’affinage du fromage consiste à modifier la culture microbienne de démarrage, soit génétiquement, soit au niveau de sa composition. L’addition de bactéries lactiques acides n’est pas toujours satisfaisante à cause de l’acidification incontrôlée du fromage se traduisant par des caractéristiques indésirables du produit final. Une manière efficace est d’ajouter ces bactéries sous forme atténuée, c’est-à-dire tuées par des chocs thermiques (chaud/froid) ou par l’exposition aux microondes, de façon à maintenir l’activité catalytique des enzymes. Le problème de l’acidification rapide du fromage est ainsi évité. Si la protéolyse agit surtout sur la texture, la lipolyse joue un rôle essentiel sur le goût, en particulier dans certains fromages bleus caractérisés par un goût piquant dû à la présence d’acides gras à chaînes courtes, générés par les lipases mélangées aux préparations de présure utilisées pour la fabrication de ce type de produit. Ainsi, l’addition de lipases à l’origine de la libération d’acides gras à chaînes courtes (principalement C4 et C6) provoque le développement d’un goût aigu, acidulé, tandis que les acides gras à chaîne moyenne (C12, C14) ont tendance à donner un goût savonneux aux produits. Les lipases utilisées sont extraites principalement de Mucor miehei, Aspergillus niger, A. oryzae et de certaines souches de Penicillium roqueforti. Le degré de l’activité lipasique sur la matière grasse du lait revêt une importance particulière dans la fabrication du fromage bleu. Outre leur contribution à la flaveur, les acides gras libérés participent également à des réactions chimiques simples et peuvent aussi être convertis par la flore microbienne du fromage. Il en résulte la synthèse des constituants tels que les aldéhydes substitués, l’acétate d’éthyle, les β-cétoacides, les méthyl-cétones, les esters et des lactones, supports du goût de certains fromages. À l’instar des protéases, l’utilisation de lipases exogènes réduit considérablement la durée de l’affinage. Les lipases jouent aussi un rôle crucial dans la préparation des fromages plus aromatisés appelés « Enzyme Modified Cheeses
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JODVbés, pendant une courte période, en présence d’enzymes et divers additifs, à température élevée et à haute teneur en eau, pour produire un arôme fort pour usage comme

372

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

ingrédient dans d’autres produits (fonds, sauces, assaisonnements, soupes…). Le type de fromage obtenu dépend de l’enzyme utilisée, et du profil des acides gras libérés. X Traitement enzymatique du lait Diverses enzymes sont utilisées à ce niveau, soit pour préserver le lait, soit pour la formulation de laits spéciaux, soit pour la valorisation des sous-produits issus de cette filière industrielle. X Préservation du lait Le lysozyme est présent dans le lait des bovins en quantité variable comprise entre 0,07 à 0,6 mg/L (voir chap. 10 Produits laitiers, section 10.4.2.7). Son activité est maintenue même dans des conditions de forte acidité et à une température élevée de l’ordre de 100 °C. Dans l’industrie fromagère, le lysozyme et les nitrates sont utilisés dans la prévention de certains accidents causés par des gaz (dioxyde de carbone et hydrogène) produits par le développement excessif de certaines bactéries formant des spores qui survivent à la pasteurisation, en particulier Clostridium tyrobutyricum qui forme de l’acide butyrique à partir de l’acide lactique, ce qui détruit complètement la texture du fromage (gonflement) et altère son goût et sa saveur. La lactopéroxidase est l’enzyme la plus abondante du lait. Chez les bovins, elle se trouve dans le lactosérum aux concentrations de 10 à 30 μg/mL de lait selon l’animal. Le colostrum bovin et le lait contiennent approximativement de 11 à 45 mg/L et de 10 à 30 mg/L de lactopéroxidase, respectivement. C’est une glycoprotéine de poids moléculaire d’environ 77 000 ayant un groupe héminique à fer ferrique (Fe3+). Son activité maximale se situe dans une gamme de pH comprise entre 4 et 7, ce qui correspond à celle du lait frais. La lactopéroxidase catalyse la réaction : H2O2 + SCN– $ OSCN– + H2O. L’inhibition microbienne par le système de la lactopéroxidase dérive de l’interaction de trois composants : la lactopéroxidase ; le thiocyanate (SCN–) qui dérive de l’hydrolyse de glucosides cyanogènes rencontrés dans certains aliments et le peroxyde d’hydrogène (H2O2), produit par le métabolisme de l’oxygène chez les bactéries lactiques acides. Le peroxyde d’hydrogène peut également être produit par les réactions d’oxydation de la xanthine oxydase et de l’acide ascorbique. Comme il n’est pas très stable, il peut être réduit par la catalase ou lié aux enzymes telles que la lactopéroxidase. L’hypothiocyanate (OSCN–) est produit lors de l’oxydation du thiocyanate, catalysée par la lactopéroxidase et la réduction simultanée du peroxyde d’hydrogène. La lactopéroxidase n’est inactivée que partiellement par la pasteurisation. Cependant, des températures de pasteurisation plus sévères (80 °C pendant 15 s) inhibent complètement l’enzyme. L’inhibition bactérienne par le système de la lactopéroxidase implique un changement dans la membrane cytoplasmique parce que l’hypothiocyanate se lie aux groupes –SH libres d’enzymes clés, en causant une diminution du gradient de pH et, par suite, une libération de potassium et d’acides aminés hors des cellules. Il en résulte un arrêt de l’absorption des glucides, des acides aminés, et d’autres éléments nutritifs par inhibition de leurs mécanismes du transport. Les autres activités vitales de la cellule telles que la synthèse des protéines, de l’ADN et de l’ARN sont également interrompues. Le système de la lactopéroxidase présente une activité contre une grande variété d’organismes saprophytes et pathogènes, les moisissures, les levures, les mycoplasmes et les protozoaires voire même contre les virus (VIH-1). Les bactéries Gram– sont plus sujettes

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

373

à la lyse par le système de la lactopéroxidase que les bactéries Gram+. Cela est dû aux différences de composition de la paroi cellulaire et de son épaisseur. Quelques Streptocoques positifs à la réaction de Gram sont résistants à l’hypothiocyanate. Lorsque la réfrigération n’est pas techniquement réalisable ni économiquement viable, le système de la lactopéroxidase doit être appliqué au lait cru pour stopper la prolifération des micro-organismes saprophytes et pathogènes (recommandations des experts EF
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TFOsiblement la détérioration du lait, préservant sa qualité initiale pendant 4 à 7 h (entre  30 et  35 °C et jusqu’à  24 à  26 h à 15 °C. Lorsqu’il est couplé à la réfrigération, la qualité initiale du lait peut être maintenue pendant 5 à 6 jours à 4 °C. Les ions thiocyanates, sous la forme de sels (de sodium ou de potassium) interviennent comme substrats pour le système lactoperoxydase et sont normalement ajoutés au lait à une concentration d’environ 14 mg/L, cependant des ajustements sont possibles en fonction de la variation du taux de ces ions dans le lait. Le peroxyde est ajouté ensuite sous forme, soit de peroxyde d’hydrogène, soit de percarbonate de sodium. Ce dernier est plutôt recommandé comme source d’ions peroxyde, car il conduit à une libération plus lente des agents actifs, alors que le peroxyde d’hydrogène est instable et réagit aussi avec les protéines. Pour éviter un surdosage dangereux, des kits d’activation prêts à l’emploi, sous forme de sachets de thiocyanate et de percarbonate, sont disponibles auprès de certaines sociétés. La glucose oxydase, en présence d’oxygène, oxyde le β-D-glucose en produisant de l’acide gluconique et du peroxyde d’hydrogène (fig. 16.11). Ce dernier a un effet bactéricide direct. La réaction est optimale entre 30 et 50 °C et à un pH compris entre 4,5 et 6,5. O

HO C CH2OH

O

CH2OH glucose oxydase

H 2O

O

CH OH HO

CH CH OH

O2 β-D-glucopyranose

H2O2

O gluconolactone

CH OH CH2OH acide gluconique

Figure 16.11 - Oxydation du glucose en acide gluconique sous l’action de la glucose oxydase X Modification enzymatique du lactose du lait et des sous-produits

L’emploi des enzymes est envisagé ici pour corriger certains problèmes liés à des aspects nutritionnel (intolérance au lactose chez certaines personnes), organoleptique (le lactose est moins sucrant que le glucose et le galactose) ou technologique (faible solubilité du lactose en milieu aqueux, tendance à la cristallisation et non-fermentescibilité). Le traitement consiste à hydrolyser le lactose à l’aide d’une β-galactosidase ou lactase (fig. 16.12). Cette réaction est inhibée par des ions comme Ca2+ et Na+
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,+, .H2+
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.O2+ l’activent. Les sources commerciales de β-galactosidases sont surtout les moisissures (principalement Aspergillus  spp.) dont les enzymes ont un pH optimal acide, et les levures

374

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

(Kluyveromyces spp.) qui produisent des enzymes à pH optimal neutre. Les domaines d’utilisation des β-galactosidases dans l’hydrolyse du lactose peuvent être : Z la production de lait et de produits dérivés délactosés, destinés aux individus intolérants au lactose2. Notons aussi que l’hydrolyse du lactose renforce le goût sucré de ce type de produits ; Z l’augmentation du pouvoir fermentaire et/ou la modification du pH lors de la fabrication de fromage et de yaourt ; Z la suppression de la perception sableuse due à la cristallisation du lactose dans les crèmes glacées et produits cuits ; Z la production de sirops et d’édulcorants pour l’industrie alimentaire. Les sirops de glucose-galactose sont près de trois fois plus sucrants que le lactose et, de ce fait, peuvent être utilisés dans la production de crèmes glacées, yaourt ou d’autres produits laitiers. De plus, le glucose, issu de l’hydrolyse du lactose, peut être isomérisé en fructose pour produire un sirop de galactose-glucose-fructose à pouvoir sucrant encore plus élevé. OH

OH O O

HO

OH

OH O OH lactose HO

OH OH

HO OH O

β-galactosidase

O OH +

HO

OH galactose

HO HO

OH OH glucose

Figure 16.12 - Hydrolyse du lactose catalysée par la β-galactosidase Une autre voie de transformation du lactose consiste à l’isomériser en lactulose (galactose-fructose) qui pourra être hydrolysé en galactose et fructose par certaines β-galactosidases. Bien que le lactulose soit plus sucrant que le lactose, il n’est pas métabolisé par les bactéries buccales et n’est donc pas cariogène. Il n’est pas non plus hydrolysé par la β-galactosidase intestinale et, de ce fait, il atteint le gros intestin où il peut être métabolisé par les bactéries lactiques acides, dont les Bifidobacterium. Pour ces raisons, l’utilisation de la voie du lactulose est considérée comme un bon moyen pour modifier la flore intestinale, réduire le pH intestinal et prévenir le développement des bactéries de putréfaction indésirables. Actuellement, il est couramment ajouté dans les laits infantiles pour stimuler les propriétés bifidogéniques. X Formulation de laits spéciaux Les protéases ont été depuis longtemps utilisées pour produire des laits infantiles à partir de lait de vache. Elles sont utilisées pour convertir les protéines du lait en peptides et acides aminés libres. La raison principale vient du fait que les protéines du lait de vache non-dégradées peuvent induire une sensibilisation chez certains enfants nourris avec 2

pour des compléments d’information, voir L'intolérance au lactose sur le site web dédié

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

375

ce lait. L’hydrolyse de ces protéines du lait minimise le risque d’induction d’une réaction allergique. On sait maintenant que seulement certaines parties des protéines intactes du lait présentent un risque potentiel pour les enfants. Ce sont les épitopes qui peuvent être éliminés en coupant une ou plusieurs de leurs liaisons peptidiques internes. Ainsi, les protéases fournissent le moyen d’élaborer un produit alimentaire satisfaisant qui peut être utilisé si la mère ne peut pas allaiter son enfant. De plus, la valeur alimentaire du lait est améliorée par l’hydrolyse de ses protéines en molécules plus petites (peptides).

16.3.2.2. RÉDUCTION DE L’ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PRÉPARÉS En 2002, des chercheurs de l’Agence Suédoise des Aliments (Swedish National Food Administration) ont relevé des niveaux élevés d´acrylamide dans des produits alimentaires, principalement ceux riches en amidon comme les frites, les chips, les gâteaux secs, les biscuits salés et les produits similaires. Cette molécule toxique est le produit d’une transformation complexe, par la chaleur, des sucres et de l’asparagine contenus dans ces aliments. L´étude suédoise a attiré l´attention des spécialistes concernés par l’alimentation et la santé du monde entier sur l´acrylamide. Considérée jusque-là comme non-naturelle, l’acrylamide peut se révéler toxique selon la dose absorbée. Des expositions, même faibles mais répétées et fréquentes, sont néfastes pour l’organisme. Le caractère neurotoxique de l’acrylamide est connu depuis plusieurs années ; son potentiel cancérogène est prédit par des expérimentations conduites sur des animaux de laboratoire. Il est établi que l’acrylamide se forme lorsque des aliments riches en sucres réducteurs et en asparagine sont préparés à haute température (cuisson, friture). Au delà de 120 °C, les sucres (glucose, fructose) réagissent avec l’asparagine au sein d’un ensemble de réactions complexe connu sous le nom de « réaction de Maillard ». La formation de l’acrylamide dépend également des différents traitements (micro-ondes, ébullition ou friture). La formation de l’acrylamide par micro-ondes ou par ébullition est particulièrement dépendante du pH des aliments. En règle générale, le taux d’acrylamide augmente avec la durée de la cuisson. &O

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des préparations enzymatiques, ont annoncé, chacune de leur côté, la découverte d’une enzyme capable de réduire la teneur en acrylamide de certains aliments. Il s’agit en fait d’une asparaginase destinée aux industriels dont le nom commercial est Acrylaway® (Novozymes) et PreventASe¥
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EAspergillus niger et A. oryzae, qui transforme l’asparagine en acide aspartique. Elle se présente sous forme de poudre ou de liquide. Ajoutée directement aux matières premières à des stades de fabrication différents selon le type de produit (essentiellement les chips, les biscuits salés, les frites…), l’enzyme permet de réduire le taux d’asparagine en l’hydrolysant en acide asparUJRVF
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EBDSZMBmide par Acrylaway® atteint 50 à 90 %, dans une large gamme d’aliments comme le pain grillé, les biscottes, les biscuits, les gâteaux sucrés et salés, sans pour autant, d’après ses concepteurs, modifier les attributs organoleptiques des aliments.

376

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Acrylaway® a été évalué positivement par des laboratoires indépendants (dont le français Eurofins), la FDA (Food and Drug Administration - USA), des instances mondiales comme l´Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) et l´Organisation Mondiale de la Santé
0.4
FO
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 Afin de réduire la formation de l’acrylamide, il est recommandé de limiter la température de cuisson autant que possible. Pour les frites, par exemple, elle ne devrait pas dépasser 175 °C.

16.3.3. PANIFICATION ET BISCUITERIE La panification est certainement l’exemple le plus caractéristique de l’intérêt des enzymes en technologie alimentaire. C’est au niveau de ce procédé qu’a été réalisée la première application des enzymes en ajoutant de l’α-amylase (présente dans le malt) pour corriger certaines déficiences de la matière première (grains et farines). Plus tard, le malt a été remplacé par des amylases microbiennes ayant une meilleure stabilité en panification. L’α-amylase est la première enzyme produite industriellement afin de compenser la variabilité de la farine naturelle. Aujourd’hui, une large gamme d’enzymes est disponible pour les utilisateurs de farine (tab. 16.3). Ces enzymes sont, dans la plupart des cas, utilisées comme aides biotechnologiques : X Soit pour corriger la concentration en α-amylase endogène dans la farine. En effet, les farines, en raison de la diversité de la composition des blés (résultant de différences entre les variétés cultivées d’une part et les conditions très variables de développement de la plante d’autre part) n’ont pas la même aptitude à la panification et certaines sont même impanifiables. Les minotiers adaptent alors les farines du commerce en leur ajoutant des amylases pour améliorer leur pouvoir fermentaire en augmentant la teneur du pain en glucose, sucre aisément digestible et aliment de base des levures. Les α-amylases fongiques hydrolysent l’amylose et l’amylopectine en un mélange de glucose et de dextrines solubles de tailles moyennes (DP2-DP12). Ces sucres fermentescibles assouplissent la pâte en augmentant son volume, favorisent la coloration de la croûte et améliorent le goût. Un dosage adéquat de l’enzyme est cependant nécessaire pour éviter des résultats indésirables, un léger excès conduisant à une pâte collante. Les α-amylases bactériennes donnent également les mêmes résultats tout en supportant de plus hautes températures. Elles sont souvent utilisées en biscotterie, viennoiserie et biscuiterie. X Soit pour adapter les propriétés de la pâte aux différents types de contraintes du pétrissage rapide ou aux caractéristiques technologiques ou organoleptiques souhaitées des produits élaborés. Par exemple, l‘hydrolyse modérée du gluten (molécule responsable de la viscoélasticité de la pâte) à l’aide de protéases (fongiques ou bactériennes), lui donne une meilleure extensibilité et augmente, de ce fait, son volume. La lipoxygénase extraite de la farine de certaines Légumineuses (graines de soja déshuilées, fève), permet de pallier à certains défauts qualitatifs des protéines du gluten, et d’améliorer le blanchiment de la farine. Pendant le pétrissage, la lipoxygénase catalyse

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

377

l’oxydation, par l’oxygène de l’air, des acides gras polyinsaturés, principalement les acides linoléique et linolénique. Les hydroperoxydes formés ainsi que les radicaux libres qui apparaissent transitoirement sont des composés très réactifs qui provoquent, en particulier, l’oxydation des thiols du gluten. Cette enzyme détruit également les pigments caroténoïdes par un processus d’oxydation couplée. Ce phénomène, se traduit par une décoloration des pâtes, ce qui permet d’obtenir des pains à mie blanche. Tableau 16.3 - Principales enzymes utilisées en panification et leurs effets Enzyme

Effet(s)

amylases

améliorent la fermentation, augmentent le volume de la mie et améliorent la durée de conservation du pain

glucose oxydase

oxyde les groupements sulfhydryls libres du gluten et le rend plus élastique

lipases

modifient l’arôme du pain par formation de composés volatiles à partir des acides gras issus de l’hydrolyse des triglycérides

lipoxygénase

blanchit la pâte

xylanase

améliore la manutention de la pâte et la structure de la mie

protéase

relâche le réseau du gluten (par son hydrolyse partielle) et donne les propriétés plastiques requises dans certains types de pâtes (ex. biscuits)

Ainsi, ces enzymes sont capables de produire une valeur ajoutée au produit final et par conséquent valoriser des farines de moindre qualité. Dans beaucoup de cas, les effets bénéfiques de l’utilisation des enzymes en panification sont obtenus par utilisation d’agents chimiques tels que le métabisulfite de sodium, la L-cystéine, l’azodicarbonamide (ADA), le bromate de potassium… Cependant, la tendance actuelle du marché des aliments vers les « produits naturels » va dans le sens d’une utilisation accrue des enzymes au détriment des agents chimiques.

16.3.4. PRÉPARATION DES SUCRES ALIMENTAIRES 16.3.4.1. GLUCOSERIE L’industrie de transformation de l’amidon en glucose est originale parmi les processus biotechnologiques industriels dans la mesure où elle est presque entièrement dépendante de l’usage d’enzymes pour la production à grande échelle. Ce secteur est dominé par les enzymes bactériennes : α-amylase, amyloglucosidase (ou glucoamylase) et glucose isomérase. L’amidon, obtenu après élimination des huiles et des protéines de la matière première, est hydrolysé lors d’un processus enzymatique qui s’effectue en deux étapes. La première étape, la liquéfaction, consiste à découper les longues chaînes de l’amidon en maltose et en dextrines, à l’aide de l’α-amylase. L’étape suivante, appelée saccharification, consiste à décomposer les molécules obtenues lors de la liquéfaction, en molécules de glucose. Les enzymes impliquées sont : l’α-amylase, la β-amylase, l’amyloglucosidase et la pullulanase.

378

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Le glucose obtenu peut être alors utilisé, soit directement comme matière première pour la synthèse chimique (ex.  sorbitol), soit comme substrat de fermentation pour la production d’autres composés (ex. acide citrique), ou utilisé pour la production des sirops de glucose et de fructose (HFCS: High Fructose Corn Syrup) (voir fig. 16.12). L’α-amylase est une endoamylase qui hydrolyse les liaisons glycosidiques α-(1J 4) de l’amylose et de l’amylopectine, les deux constituants de l’amidon mais sans action sur les liaisons (1J 6). Ainsi l’enzyme libère du maltose, des dextrines solubles et des oligosaccharides branchés et non-branchés. La stabilité des enzymes bactériennes aux hautes températures peut atteindre 105 à 110 °C. Elles sont obtenues industriellement à partir de bactéries du genre Bacillus. La β-amylase hydrolyse les liaisons α-(1J 4) à partir de l’extrémité non-réductrice, en libérant du maltose et des dextrines limites, jusqu'aux aux liaisons  (1J 6). Elle est extraite industriellement de l’orge malté. L’amyloglucosidase hydrolyse les liaisons  α-(1J 4) et α-(1J 6) des dextrines en éliminant graduellement les unités de glucose à partir de leurs extrémités non-réductrices. La vitesse de l’hydrolyse dépend du type de liaisons et de la longueur de la chaîne, les liaisons α-(1J 4) sont hydrolysées plus rapidement que les liaisons α-(1J 6). L’enzyme la plus utilisée industriellement est celle extraite de champignons comme Aspergillus niger et Rhizopus oryzae. La dégradation de l’amidon fait intervenir également d’autres enzymes dites déramifiantes, telle la pullulanase (connue aussi sous le nom de pullulane-6-glucanohydrolase), enzyme extracellulaire produite par certaines espèces de bactéries Gram– du genre Klebsiella. Leur utilisation est justifiée par le fait que les amidons destinés à la glucoserie contiennent une forte proportion d’amylopectine. Deux types de pullulanases peuvent être distingués. Les enzymes de type I, hydrolysant uniquement les liaisons α-(1J 6), sont utilisées comme enzymes déramifiantes dans la saccharification de l’amidon. Les amylopullulanases (ou pullulanases de type II) présentent une double spécificité pour les liaisons  α-(1J 4) et  α-(1J 6) de l’amidon. Pour cette raison, elles ne peuvent pas être utilisées comme enzymes déramifiantes dans la production des sirops de maltose et de glucose. Les xylanases sont très utiles dans le traitement de l’amidon de blé contrairement à l’amidon de maïs, à cause de sa teneur élevée en xylanes, surtout les arabinoxylanes. Ces xylanes solubles augmentent la viscosité de la pâte au point de gêner le bon déroulement du processus de séparation de l’amidon du gluten. Comme le blé est une des sources d’amidon les plus importantes, l’utilisation des xylanases comme auxiliaires technologiques devrait prendre de l’importance. Le glucose obtenu est ensuite, soit cristallisé ou transformé en sirop de glucose après sa concentration, soit transformé en fructose par la glucose isomérase. Cette enzyme, produite par plusieurs micro-organismes, est disponible sous différentes dénominations commerciales selon son origine et son fabricant (tab. 16.4).

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

379

Tableau 16.4 - Origine des différentes glucose isomérases commerciales Nom commercial

Micro-organisme

Compagnie (Pays)

Sweetzyme

Bacillus coagulans

Novo-Nordisk (Danemark)

Maxazyme

Actinoplanes missouriensis

Gist-Brocades (Pays-Bas)

Optisweet

Streptomyces rubiginosus

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Sweetase

Streptomyces phaechromogenes

Nagase (Japon)

La figure 16.13 résume l’ensemble du processus décrit. matière première amylacée liquéfaction • eau • α-amylase maltodextrines saccharification • amyloglucosidase • pullulanase sirop de glucose cristallisation glucose

isomérisation • glucose isomérase sirop enrichi en fructose enrichissement fructose

Figure 16.13 - Schéma général de l’hydrolyse de l’amidon et produits obtenus La réaction d’isomérisation (fig. 16.14) se déroule dans un réacteur en colonne contenant l’enzyme immobilisée. Le sirop de glucose circule de façon continue à travers la colonne où les paramètres de la réaction sont maintenus à leurs valeurs optimales (pH d’environ 7,5-7,8 ; température de 55-60 °C). Ces paramètres assurent une activité enzymatique élevée, un haut rendement en fructose et une grande stabilité de l’enzyme. Pour maintenir une concentration en fructose constante dans le sirop produit, la vitesse de passage du sirop de glucose introduite dans la colonne est ajustée d’après l’activité réelle de l’enzyme. L’enzyme immobilisée perd de son activité avec le temps. Typiquement, la recharge d’un réacteur en glucose isomérase est effectuée quand l’activité de l’enzyme tombe à 10-15 % de sa valeur initiale. À titre indicatif, sa durée de vie (qui dépend en réalité des conditions d’utilisation), varie de 200 jours à une année à l’échelle industrielle. En général, plusieurs réacteurs sont mis en œuvre, en parallèle ou en série. Dans ces conditions, 1 kg d’enzyme immobilisée peut convertir plus de 10 000 kg de sirop de fructose (en poids de matière sèche) par jour, en utilisant au moins 20 réacteurs. Etant une enzyme intracellulaire, son isolement est très coûteux. Des cellules bactériennes entières sont alors souvent utilisées,

380

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

immobilisées par différentes techniques selon la souche et le fournisseur. L’une des modalités du processus consiste à utiliser l’enzyme sous forme encapsulée dans des particules de 1-2 mm de diamètre, dans une colonne à lit fixe de 1,5 m de diamètre et 4 à 5 m de haut. CH2OH O

glucose isomérase

OH OH

CH2OH CH2OH O HO OH

OH OH

OH

Figure 16.14 - Isomérisation du glucose en fructose Dans les conditions industrielles, l’équilibre est atteint quand le niveau de fructose est d’environ 50 %. Or, la vitesse de réaction diminue considérablement lorsque l’on s’approche de cet équilibre, de sorte que, dans la pratique, la conversion est arrêtée quand la solution atteint 42 % de fructose. Bien que le HFCS à 42 % (dénommé HFCS-42) soit beaucoup utilisé, les HFCS à teneur plus élevée en fructose sont préférés dans certaines applications. Leur production se fait par passage du HFCS-42 à travers une colonne échangeuse de cations afin séparer le glucose du fructose. Le sirop résultant (90 % de fructose pour 10 % de glucose) est mélangé avec du HFCS-42 pour donner du HFCS-55. Celui-ci est purifié par élimination des contaminants (certains coproduits colorés) par adsorption sur une colonne de charbon activé et ensuite concentré jusqu’à environ 90 % par évaporation sous pression réduite. HFCS-55 est utilisé en remplacement du saccharose dans les boissons sans alcool ; le HFCS-90 est plutôt utilisé dans les aliments à basse valeur calorique. Cette enzyme catalyse également l’isomérisation du xylose (pour lequel elle présente une grande affinité) en xylulose, elle est, de ce fait, appelée xylose isomérase. Un grand nombre de secteurs d’activité des industries agro-alimentaires sont concernés par des applications des produits obtenus : fermentations, boissons, confiserie, crèmes glacées, entremets, confitures, aliments diététiques et infantiles…

16.3.4.2. RAFFINAGE ET TRANSFORMATION DU SACCHAROSE Dans le cas des plantes dites sucrières ou saccharifères (betteraves à sucre, canne à sucre), le saccharose est produit directement et dans ce cas, il est extrait par diffusion. Au fur et à mesure de cette extraction, le raffinose (un triose) se concentre dans la mélasse et ralentit la cristallisation du saccharose. Ce problème est résolu par l’utilisation d’une α-galactosidase fongique pour hydrolyser le raffinose. L’hydrolyse du saccharose, appelée « inversion » provoque sa transformation, totale ou partielle, en un mélange de sucres réducteurs le glucose et le fructose (fig. 16.15). Elle est le fait d’une invertase ou β-D-fructofuranosidase extraite de Saccharomyces cerevisiae ou S. carlsbergensis. La solution obtenue porte le nom de « sucre inverti » à cause du changement du signe du pouvoir rotatoire qui passe du positif ([α]D20 °C = + 66,59°, celui du

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

381

saccharose) vers le négatif ([α]D20 °C = – 21°, celui des produits d’hydrolyse). On en distingue deux types : l’inverti moyen qui contient un mélange ternaire, équimoléculaire de saccharose/glucose/fructose et l’inverti total qui contient un mélange équimolaire de fructose et de glucose.

HO HO

OH OH OH O

OH

OH OH OH O

O OH

invertase

O

HO HO

O + OH OH

OH

OH

OH

OH

saccharose

α-D-glucose

β-D-fructose

Figure 16.15 - Inversion du saccharose par l’invertase Les sucres invertis sont anticristallisants, stabilisants de l’humidité et améliorants de texture, utilisés en remplacement du saccharose dans la fabrication du pain et la biscuiterie industrielle, pâtisserie, viennoiserie, confiserie, glacerie et crème fouettée. En dépit de leurs multiples avantages, ces produits sont concurrencés par les sirops de glucose et d’isoglucose dans la majorité des branches agro-alimentaires.

16.3.5. PRÉPARATION DES BOISSONS L’utilisation des enzymes dans un grand nombre de procédés industriels de fabrication des boissons (jus de fruits, distillerie, brasserie) facilite, soit les techniques de préparation (extraction, clarification, filtration), soit la fermentation, soit la stabilisation des produits.

16.3.5.1. JUS DE FRUITS Les polysaccharides pariétaux des fruits sont principalement la cellulose, les hémicelluloses et les composés pectiques. Certains types de fruits (par exemple les pommes et les poires) exigent un traitement mécanique (broyage) couplé à un processus biochimique (utilisant des enzymes) pour briser les structures cellulaires et obtenir de meilleurs rendements en jus. Les pectinases, dont il existe plusieurs types (tab. 16.5), ont été les premières enzymes utilisées dans ce domaine. Leur emploi vise à hydrolyser les pectines présentes en abondance dans ces fruits. Comme les pectines se gélifient au cours de la concentration des extraits de fruits, il en résulte des difficultés lors du processus de filtration. L’addition de ces enzymes en cours de préparation détruit les pectines et permet le déroulement normal de la préparation des jus de fruits. Les modalités d’applications des enzymes pectiques varient d’un type de fruit à un autre, en raison des différences et des variations de composition chimique qui sont fonction du stade de maturité. Diverses enzymes pectiques d’origine microbienne sont utilisées à la fois pour le pressurage des baies et du raisin et pour la clarification des jus de fruits et des vins. Dans le cas du jus d’orange, la perte de stabilité de l’opacité du jus constitue un problème majeur. Le jus d’orange est produit normalement par pression du fruit. Les matériaux

382

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

insolubles en suspension dans le jus, quand celui-ci est pressé, contribuent aux caractéristiques organoleptiques (couleur, opacité et saveur). Contrairement aux pectines de la pomme qui sont hautement méthylées, les pectines de l’orange ne le sont que partiellement. Ceci est dû aux pectine-estérases naturellement présentes dans le jus d’orange et qui éliminent les groupes méthoxyles des molécules de pectine. L’acide pectique ionisé qui en résulte forme un complexe avec les ions calcium (Ca2+) normalement présents ce qui a pour résultat de former des pectates de calcium insolubles. Ce complexe précipite avec le temps en une couche qui laisse un jus clair surnageant. Une solution consiste en l’addition d’une polygalacturonase exogène, qui dépolymérise l’acide pectique avant la formation du complexe avec le calcium. Tableau 16.5 - Pectinases commerciales et fournisseurs Nom commercial

Fournisseur (pays)

Panzym

C.H. Boehringer Sohn (Allemagne)

Ultrazyme

Novozymes (Danemark)

Pectolase

Danisco (Danemark)

Sclase

,JLLPNBO
4IPZV
$P
+BQPO

Pectinex

Novozymes (Danemark)

Rapidase

Danisco (Danemark)

Klerzyme

Clarizyme Wallerstein Co. (Etats-Unis)

Pectinol, Rohament

Rohm, GmbH (Allemagne)

Pectinase

Novozymes (Danemark)

Bien que les pectinases soient les enzymes majoritairement utilisées dans le traitement des jus de fruits, elles peuvent être associées à d’autres pour améliorer le rendement et/ou faciliter le processus dans sa globalité. C’est le cas des cellulases, amylases, polyphénol oxydases… Les pommes non-mûres, par exemple, peuvent contenir jusqu’à 15 % d’amidon qui peut être dégradé par une amyloglucosidase active au pH du jus, ajoutée en même temps que les pectinases. Les enzymes pectiques sont inhibées par les polyphénols présents dans la pulpe de pomme ; l’addition de polyphénol oxydases microbiennes aux jus du fruit permet de corriger ce problème en éliminant les polyphénols, créant ainsi un environnement propice à l’action des enzymes pectiques. Durant la maturation des poires, les composés phénoliques sont oxydés et contribuent à la formation de composés lignocellulosiques insolubles, connus sous le nom de scléroïdes ou cellules pierreuses. La présence de ces cellules, constituées essentiellement de lignine (18 %) et de polysaccharides (82 %), rend difficile les opérations de filtration ou d’ultrafiltration. Les teneurs en arabanes, hémicelluloses et cellulose sont plus élevées que dans les pommes. C’est pourquoi il est utile dans le cas des poires, d’utiliser conjointement des pectinases avec des hémicellulases.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

383

16.3.5.2. BRASSERIE La source traditionnelle d’enzymes utilisées pour la conversion des Céréales en bière est le malt. Le maltage dépend d’un certain nombre de facteurs parmi lesquels la variété et la qualité de l’orge, les conditions opératoires et le savoir-faire du fabricant. La qualité du maltage dépend aussi des enzymes endogènes de l’orge et de leur stabilité. Durant le processus de maltage, certaines enzymes (β-amylase, exo-peptidase, carboxypeptidase) sont mobilisées par activation, d’autres sont néoformées (β-glucanase, endo-protéases, α-amylase et hémicellulases). Comme le brassage est un processus hautement optimisé, il se produit parfois des conséquences indésirables si l’activité enzymatique est réduite, comme une faible production d’alcool, une séparation du moût trop longue, une fermentation trop lente, une faible stabilité de la bière obtenue… Pour prévenir ces problèmes, des enzymes auxiliaires sont alors ajoutées pour corriger la déficience en enzymes endogènes des matières premières habituellement utilisées (maïs, blé, orge, riz, sorgho, seigle, avoine, millets…). En outre, les enzymes facilitent la mise en œuvre des techniques de filtration par une meilleure solubilisation ou stabilisation des produits. Ainsi l’utilisation de β-glucanases ou parfois de complexes enzymatiques (hémicellulases, pectinases…) d’origine fongique améliore considérablement les opérations d‘extraction et de filtration.

16.3.6. ENZYMES EN LIPOCHIMIE ET DÉTERGENCE 16.3.6.1. LIPOCHIMIE Raffinage des huiles brutes La plupart des huiles végétales (colza, coco, soja, arachide, germes de maïs, tournesol, olives…) sont produites classiquement par pression suivie par l’extraction avec des solvants organiques. Le solvant le plus communément utilisé dans ce processus est l’hexane qui est reconnu comme un polluant dangereux de l’air. Les enzymes capables de dégrader les parois cellulaires offrent une alternative écologiquement acceptable. Elles peuvent être utilisées pour extraire l’huile végétale en dégradant les composants structuraux des parois cellulaires. Cette technique a déjà été utilisée pour l’extraction de l’huile d’olive à l’aide d’une préparation enzymatique de polygalacturonase (Olivex® de Novozymes). La quantité d’huile produite et sa qualité ont ainsi été grandement améliorées. Les huiles végétales brutes subissent un raffinage, comprenant des étapes de démucilagination, décoloration, désodorisation, hydrogénation, inter- et transestérification. On dispose actuellement de procédés enzymatiques qui accélèrent le processus de démucilagination, améliorent la qualité de l’huile et réduisent les effets de l’élimination des effluents sur l’environnement. Les huiles végétales brutes contiennent jusqu’à 3 % de phospholipides, selon le type de graines utilisées et le procédé d’extraction. La première étape dans le raffinage, la démucilagination à l’eau élimine la majorité de ces phospholipides mais il en subsiste environ 0,6 % d'hydrophobes qu’il est possible d’éliminer par voie enzymatique.

384

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

On utilise à cet effet la phospholipase pour l’élimination des gommes et mucilages pendant le raffinage de l’huile et la lipoxygénase pour l’oxydation des acides gras polyinsaturés. Une méthode d’élimination enzymatique consiste à utiliser la phospholipase A2 qui catalyse l’hydrolyse des acides gras en position 2 et forme des lysophospholipides hydrosolubles pouvant être facilement éliminés par lavage. La démucilagination enzymatique a beaucoup d’avantages. Comparé au procédé classique qui utilise de l’acide sulfurique, de l’acide phosphorique, de la soude caustique et de grandes quantités d’eau, le traitement enzymatique permet d’éviter l’utilisation de bases et d’acides forts, de réduire considérablement la quantité d’eau utilisée et la production des boues résiduaires, et d’obtenir une réduction globale des coûts de 50 % tout en augmentant le rendement en huiles.

Modification enzymatique de lipides La modification des huiles et des graisses est actuellement un des principaux domaines d’activité de l’industrie alimentaire à la recherche de nouvelles technologies économiques et respectueuses de l’environnement. Les huiles végétales à composition et propriétés physico-chimiques modifiées feront l’objet d’une forte demande dans le futur. Ce secteur de la lipochimie est dominé par les lipases qui sont, de loin, les enzymes les plus largement utilisées dans la transformation des huiles. Ces enzymes font partie de la famille des hydrolases qui agissent sur les liaisons ester carboxyliques. Leur rôle physiologique est d’hydrolyser les triglycérides en diglycérides, monoglycérides, acides gras, et glycérol. De plus, elles peuvent catalyser des réactions d’estérification, d’interestérification et de transestérification, sur une grande variété de substrats. Elles sont souvent tolérantes à la présence de solvants organiques dans le milieu réactionnel. Cette polyvalence fait des lipases des enzymes de choix pour des applications potentielles dans le domaine de la lipochimie. Le tableau 16.6 résume les différentes réactions catalysées par les lipases. Tableau 16.6 - Polyvalence réactionnelle des lipases Type de réaction

Substrats

Produits

hydrolyse

ester + eau

acide + alcool

estérification

acide + alcool

ester + eau

transestérification par alcoolyse

ester 1 + alcool 1 ester 2 + alcool 2

transestérification par acidolyse

ester 1 + acide 1

ester 2 + acide 2

interestérification

ester 1 + ester 2

ester 3 + ester 4

aminolyse

ester + amine

amide + alcool

Ces réactions ont comme substrats les huiles (triglycérides), le glycérol, les acides gras libres, les esters et les alcools. Les lipases permettent ainsi de produire de nouveaux types de triglycérides, d’esters et d’acide gras, ou d’améliorer la qualité de produits existants. Parmi les produits nouveaux, on trouve : les huiles comestibles qui ont été équilibrées en acides gras saturés et insaturés, des allongeurs (substances destinées à augmenter le volume) du beurre de cacao, des esters pour les lubrifiants et les produits de beauté,

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

385

des monoglycérides utilisés comme émulsifiants et des agents tensioactifs. Les lipases microbiennes qui sont douées d’une grande spécificité présentent d’importantes potentialités d’utilisation pour la fabrication d’huiles végétales « sur mesure » à partir d’huiles de moindre qualité en les enrichissant en certains acides gras. À l’échelle mondiale, la production des graisses et des huiles avoisine les 110 millions de UPOOFT
QBS
BO
FU
VOF
QBSUJF
TVCTUBOUJFMMF
EF
DFMMFDJ
QMVT
EF

.UBO
FTU
VUJMJTÏF
EBOT
EFT
processus hautement consommateurs d’énergie tels que les hydrolyses, glycérolyses et alcoolyses. Les conditions opératoires dans ces processus impliquent des hautes températures (240-260 °C) et de hautes pressions (la méthanolyse est exécutée actuellement sous conditions légèrement plus douces). Les produits résultants sont souvent instables et nécessitent une redistillation pour éliminer les impuretés et produits de dégradation. De plus, les huiles très insaturées thermolabiles ne peuvent pas être utilisées dans ces processus sans hydrogénation antérieure. L’utilisation des lipases dans la lipochimie en remplacement des méthodes traditionnelles est donc essentielle. Ainsi l’estérification est une réaction au cours de laquelle un groupe alcool (–OH) est condensé à un groupe acide carboxylique (–COOH) avec élimination d’une molécule d’eau (H2O), ce qui forme une liaison ester (R1–COOC–R2) (fig. 16.16). O R1

O OH

+

HO

R2

estérification hydrolyse

R1

O

R2

+

H2O

Figure 16.16 - Réactions d’estérification et d’hydrolyse catalysée par les lipases L’estérification est utilisée pour obtenir des triglycérides à chaîne moyenne à partir de glycérol et d’acides gras en C8 et/ou en C10. L’estérification enzymatique pour la production de diglycérides est donc intéressante en raison de l’importance nutritionnelle des 1,3-diglycérides. En effet, l’utilisation de ces derniers dans la cuisson contribue à la réduction du taux de lipides sériques puisque la lipase pancréatique hydrolyse les 1,3-diglycérides en acides gras libres et glycérol sans former des 2-monoglycérides (éléments constitutifs des lipides sériques). La transestérification (décrite dans le chap. 3 Lipides, section 3.8.3.4) est catalysée par diverses lipases bactériennes (ex. Pseudomonas spp.) à 40 °C, sans perte d’activité. Il est maintenant bien admis que les acides gras polyinsaturés (AGPI) jouent un rôle essentiel en nutrition humaine en raison de leurs importantes propriétés biomédicales. Les lipases peuvent effectuer l’incorporation de ces AGPI dans des huiles riches en acides gras saturés tout en opérant en conditions douces, minimisant la dégradation et l’oxydation des acides gras. Ces réactions sont basées sur le fait que certaines lipases sont capables de discrimination entre différents acides gras et que d’autres lipases sont spécifiques de la position des acides gras sur le glycérol (fig. 16.17).

386

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE OOC-R1

H2O

HOOC-R1

OH

HOOC-X

H2O

OOC-X

OOC-R2

OOC-R2

OOC-R2

OOC-R3

OOC-R3

OOC-R3

TG DG TG = triglycéride initial R1, R2 et R3 = résidus d’acides gras DG = diglycéride (ou monoglycéride ou glycérol, selon la spécificité de la lipase) HOOC-R1 = acide gras libéré HOOC-X = acide gras à incorporer TG* = triglycéride avec le nouvel acide gras incorporé (OOC-X)

TG*

Figure 16.17 - Représentation schématique de la transestérification réalisée sur une huile riche en acides gras saturés et son enrichissement en acide gras polyinsaturés Cette réaction implique l’exécution séquentielle de réactions d’hydrolyse (désacylation) et de réestérification (acylation). L’acide gras incorporé peut être un acide gras poly-insaturé ω-2 ou ω-6 selon sa concentration dans le milieu de la réaction et la spécificité de la lipase.

Cette technique permet de préparer avec de l’huile de tournesol et de l’huile de palme totalement hydrogénée une margarine ne contenant pas d’acides gras trans. La transestérification catalysée par la lipase dans les solvants organiques est une application industrielle émergeante dans la production de nombreux produits à valeur ajoutée tels que le lait maternisé pour nourrissons, les AGPI pharmaceutiques et la production de biodiesel à partir d’huiles végétales. La lipase de Rhizomucor miehei catalyse la transestérification en remplaçant l’acide oléique par de l’acide stéarique pour produire des substituts de beurre de cacao (triglycéride stéarique-oléique-stéarique) (fig. 16.18). Ol

St

Ol + acide stéarique

Ol + acide oléique

Ol huile de tournesol riche en oléates St = acide stéarique ; Ol = acide oléique

St triglycéride St-Ol-St composant du substitut de beurre de cacao

Figure 16.18 - Réaction de transestérification catalysée par la lipase de Rhizomucor miehei L’interestérification et l’hydrogénation sont des techniques d’un grand intérêt dans la préparation de glycérides utilisés dans la fabrication de beurre et de margarine. La réaction d’interestérification consiste à faire un échange d’acides gras entre une huile riche en acides insaturés (mono- et polyinsaturés) et une huile riche en acides saturés. La réaction conventionnelle est conduite en présence d’un catalyseur tel que le sodium ou le méthylate de sodium, à haute température. Cependant, cette réaction n’est pas sélective et elle génère des coproduits colorés qu’il faut ensuite éliminer. En revanche, l’interestérification menée en présence de lipase comme catalyseur est plus intéressante puisqu’elle permet de maîtriser les caractéristiques physiques comme la température de

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

387

fusion des huiles et des graisses comestibles ; de plus elle se déroule à une température comprise entre 40 et 70 °C à laquelle il n’y a pas formation d’acides gras trans et de ce fait il n’y a plus de coproduit à éliminer. C’est donc une alternative, économiquement rentable, aussi bien à l’interestérification chimique qu’à l’hydrogénation. Le coût en termes d’investissement est encore réduit parce que le processus enzymatique exige seulement une colonne ou un réservoir simple comme matériel spécifique. Le profil précis de l’huile désirée est obtenu par simple passage de l’huile à travers la colonne renfermant l’enzyme. Celle-ci étant fixée dans la colonne elle n’est changée qu’après la production de plusieurs centaines de tonnes de matière grasse.

16.3.6.2. DÉTERGENCE Les enzymes sont à l’origine du développement et de l’amélioration des détergents modernes domestiques et industriels. Les principales classes d’enzymes détergentes sont les protéases, les amylases, les lipases et, plus récemment, les cellulases. Ces enzymes sont utilisées, soit seules, soit associées dans différentes combinaisons. Les protéases ont été les premières et les plus largement utilisées dans les détergents. Les taches protéiques (taches de lait, de jaune d’œuf, de sang…) sur le tissu ou sur des surfaces dures (comme la vaisselle, par exemple) sont dégradées en fragments (fig. 16.19) qui peuvent être supprimées ou dissous par d’autres composants du détergent. La majorité des protéases commerciales destinées aux détergents sont des subtilisines. Ce sont des endo-peptidases extracellulaires isolées à partir de l’espèce bactérienne Bacillus subtilis et d’autres espèces du même genre. Elles sont très similaires sur le plan structural et sont caractérisées par leur large spécificité de substrats et surtout par leurs conditions optimales de fonctionnement (température, pH) et leur exigence en calcium. Pour éviter le problème de l’autolyse dans les détergents liquides à base de protéases, des inhibiteurs réversibles (tels que l’acide borique ou des polyols) sont ajoutés dans la formulation. Lors du lavage, ces inhibiteurs sont dilués. H C R1

O C

R2 N

C H

R2

H protéase + H2O

C

COO – +

R1

+H N 3

C H

Figure 16.19 - Hydrolyse d’une liaison peptidique Les amylases commerciales sont représentées par les α-amylases extraites de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens et l’α-amylase thermostable de B. licheniformis et de diverses espèces d’Aspergillus. L’α-amylase catalyse l’hydrolyse des liaisons α-(1J 4) D-glycosidiques internes des polysaccharides (amidon, glycogène) et oligosaccharides. En raison de leur forte hydrophobie, les huiles et les corps gras (composés essentiellement de triglycérides) sont difficiles à éliminer à basse température. Les lipases (triacylglycérol acylhydrolases) hydrolysent les triglycérides en mono- et diglycérides (plus hydrophiles), en acides gras libres et en glycérol. Ces produits d’hydrolyse sont tous solubles dans les conditions alcalines du lavage.

388

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

L’application commerciale des cellulases a commencé en 1987 avec l’introduction de la cellulase alcaline de Bacillus. Depuis 1991, plusieurs détergents européens et américains ont incorporé des cellulases dans leurs formulations. En 1993, Procter & Gamble a introduit Carezyme® de Novo-Nordisk (leader européen), une enzyme qui permet de garder le coton (pur ou en mélange) dans un état neuf plus longtemps en éliminant les fils crépus qui apparaissent avec le temps sur les vêtements en coton ou suite à des lavages répétés. Les cellulases présentent plusieurs avantages dont le nettoyage (par enlèvement des souillures huileuses), l’amélioration de la douceur du tissu, la clarification de la couleur et l’élimination des microfibrilles de coton de la surface qui servent de points d’ancrage aux souillures. La douceur obtenue après utilisation des cellulases résulte de la capacité de ces enzymes à démêler les fibrilles de la surface, en les empêchant de s’entrelacer et former un réseau rigide au toucher. Ces avantages ont pour conséquence la réduction des cycles de lavages. Les cellulases détergentes courantes sont de sources fongiques, (Humicola insolens) ou de sources bactériennes (différentes espèces de Bacillus). Les enzymes fongiques sont typiquement un mélange d’exo- et d’endo-glucanases avec des pH optimaux dans la zone acide à neutre. Ce mélange d’activités facilite la dégradation de la cellulose. Des protéases, des lipases et des amylases sont souvent utilisées comme ingrédients fonctionnels dans des formulations détergentes pour nettoyer les membranes d’osmose inverse, de microfiltration et d’ultrafiltration en laiterie, dans le secteur des jus de fruits et dans diverses autres industries. Certaines marques de dentifrice et de bains de bouche incorporent la glucoamylase et la glucose oxydase. Ces enzymes ont un effet dans la prévention de la plaque dentaire. Les prothèses dentaires peuvent être nettoyées avec des produits qui contiennent une protéase en donnant un meilleur résultat dans un temps plus court. Les lentilles de contact sont également nettoyées par l’utilisation de solutions contenant des protéases ou des lipases ou des deux. Le peroxyde d’hydrogène résiduel après la désinfection est neutralisé à l’aide d’une catalase avant la mise en place des lentilles. En plus de leur efficacité de nettoyage, les enzymes présentent beaucoup d’avantages au niveau de l’environnement et de la consommation d’énergie en réduisant le temps de lavage, la température et la consommation d’eau. De plus, ces enzymes sont produites par des processus de fermentation qui utilisent des ressources renouvelables.

16.3.7. UTILISATION DES ENZYMES EN INDUSTRIE DU PAPIER L’industrie papetière traite d’énormes quantités de biomasse lignocellulosique. La préparation industrielle de papier exige la séparation et la dégradation de la lignine (la substance contenue dans la paroi des cellules végétales et qui jaunit le papier). Les technologies de fabrication de la pâte à papier sont très diverses. Les méthodes conventionnelles de délignification ou décoloration de la pâte à papier mettent en jeu des oxydants chimiques à base de chlore ou d’ozone (ex. ClO2 et O3). Bien qu’elles soient très efficaces, ces méthodes présentent de sérieux problèmes tels que le rejet des sous-produits chlorés et l’affaiblissement des fibres de cellulose. L’inquiétude grandissante au sujet de l’impact sur l’environnement des effluents organochlorés, très polluants, et notamment ceux

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

389

rejetés par les usines de blanchiment de la pâte à papier incite à rechercher d’autres solutions moins polluantes comparées aux procédés classiques de délignification/blanchiment. L’une des alternatives qui suscite beaucoup d’intérêt est l’utilisation des enzymes. Le prétraitement de la pulpe de bois avec les enzymes ligninolytiques peut fournir une stratégie alternative de délignification plus douce, plus propre et plus respectueuse de l’intégrité des fibres de cellulose. L’utilisation du chlore est ainsi réduite de près de 66 %. De plus, le processus se déroule à température ambiante et consomme beaucoup moins d’eau. Diverses enzymes interviennent dans cette opération, ce sont les peroxydases et les laccases. La fraction hémicellulosique de la matière première est éliminée principalement à l’aide de xylanases.

16.3.7.1. PEROXYDASES Ces enzymes à hème sont produites par quelques Actinomycètes mais surtout par des Basidiomycètes de la pourriture blanche (ex. Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pycnoporus cinnabarinus, Coriolus versicolor) qui présentent les meilleures caractéristiques lignolytiques. Ils sont dotés d’un complexe multienzymatique composé de : X lignine peroxydases (LiP), impliquées dans la dégradation de la lignine par oxydation des composés aromatiques non-phénoliques, c’est-à-dire sans –OH ; X QFSPYZEBTFT
.O ** EÏQFOEBOUFT
glycoprotéines) qui oxydent exclusivement les composés phénoliques de la lignine.

16.3.7.2. LACCASES Il est bien admis que la laccase, métalloenzyme à cuivre, participe à la délignification naturelle. Plusieurs laccases sont capables de dégrader aussi bien la lignine naturelle (ex. copeaux de bois) que synthétique. Les principales sources de laccase sont les champignons Basidiomycètes et Ascomycètes. Elle se trouve soit sous forme constitutive intracellulaire, soit sous forme inductible extracellulaire. Cette dernière forme est purifiée à partir du milieu de fermentation de souches sélectionnées. Elle est particulièrement abondante chez les champignons responsables de la biodégradation de la lignine (Pyricularia oryzae, Trametes consors, T. hirsutus, T. versicolor et Myceliophthora thermophila). La laccase pourrait être appliquée aux copeaux de bois avant leur broyage. Ce prétraitement pourrait dégrader partiellement la lignine et relâcher sa structure afin que son élimination puisse être faite plus efficacement, avec une économie notable en énergie. Son application à cette fin permettrait d’éviter l’utilisation massive des produits chimiques blanchissants très polluants. De plus, l’enzyme s’attaque spécifiquement à la lignine sans altérer la qualité des fibres de cellulose.

16.3.7.3. XYLANASES Les hémicellulases sont produites par de nombreuses espèces de bactéries et de moisissures, mais aussi par plusieurs plantes. Ces enzymes, particulièrement les xylanases, sont maintenant (depuis 1995) utilisées commercialement dans les broyeurs pour le traitement de la pâte à papier et incorporées dans les différentes étapes de blanchiment. Les

390

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

préparations d’hémicellulases commercialisées sont produites par des espèces du genre Trichoderma génétiquement modifiées ou par certaines souches d’Aspergillus. Certaines moisissures de la pourriture blanche sont capables de délignifier la pâte à papier et d’augmenter sa brillance. Les traitements fongiques sont certes trop lents mais les enzymes extraites sont plus faciles à optimiser et à utiliser. Les xylanases n’attaquent pas le chromophore des lignines mais plutôt les xylanes (constituants hémicellulosiques majoritaires dans les bois durs) qui établissent des liaisons piégeant des molécules de lignine résiduelles. Une hydrolyse du réseau de xylanes est souvent suffisante pour faciliter l’attaque chimique ultérieure de la lignine et, par suite, améliorer son extraction avec une quantité moindre de produits chimiques blanchissants. Un prétraitement aux xylanases au niveau du broyage assure une économie de 20 à 25 % de produits chimiques et donc une réduction simultanée d’émissions des polluants. Le bioblanchiment (nom donné au blanchiment enzymatique) est adopté par de nombreuses compagnies papetières comme Domtar (Canada), Oji Paper (Japon)… L’industrie canadienne (quatrième plus important producteur de pâtes et de papiers au monde), utilise cette méthode pour le blanchiment d’environ 10 % de la pâte à papier produite. Les xylanases devant être utilisées en industrie du papier doivent satisfaire un certain nombre de critères, parmi lesquels : X être exemptes d’activité cellulolytique pour éviter l’hydrolyse des fibres de cellulose ; X avoir une masse moléculaire faible pour faciliter leur diffusion dans les fibres de la pâte à papier ; X donner le rendement le plus élevé et au moindre coût possible. Or, les xylanases disponibles sur le marché ne peuvent satisfaire à ces exigences que partiellement, et la température optimale d’activité de la plupart des xylanases se situe entre  50 et 60 °C avec une demi-vie d’environ 1 h à 55 °C. Cependant, quelques xylanases, isolées à partir d’espèces microbiennes extrêmophiles, sont capables de supporter des températures de 80 à 100 °C, sans perte d’activité.

16.3.7.4. LIPASES Les lipases utilisées pour le désencrage du papier usagé sont susceptibles d’augmenter la productivité de la pâte à papier, la blancheur et de diminuer l’usage de produis chimiques, de prolonger la durée de vie des équipements, de réduire la pollution, le gaspillage de l’eau, d’économiser de l’énergie et de réduire le temps et le coût du traitement.

16.3.8. UTILISATION DES ENZYMES EN ALIMENTATION ANIMALE Dans sa forme basique, le phytate ou ester hexaphosphate du myo-inositol (voir chap. 1 Glucides, fig. 1.13), est la plus abondante des sources de phosphate chez les plantes, constituant 80 à  90 % du total du phosphore présent dans les Céréales et les légumes. Bien que cette molécule soit riche en phosphate, celui-ci n’est pas biodisponible pour l’animal. Un autre inconvénient de la présence de taux élevés en acide phytique dans la ration alimentaire animale est sa capacité à chélater le potassium, le calcium, le cuivre, le zinc, le fer et le magnésium, diminuant ainsi leur biodisponibilité. La présence de phytates dans

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

391

les aliments pour animaux a par ailleurs un impact négatif sur l’environnement, les phosphates non-digérés et éliminés dans les déjections des animaux contribuant à la pollution des eaux de surface. Ces conséquences négatives des phytates sur la nutrition animale et sur l’environnement peuvent être en partie palliées par l’addition de phytases à la ration alimentaire des animaux d’élevage. Une formulation de cette enzyme est déjà commercialisée par la société BASF Nutrition Animale (le numéro un mondial de la chimie), sous le nom de Natuphos®, en poudre ou en liquide. L’importance de ces enzymes, tant au niveau industriel qu’environnemental, provient du fait que les animaux monogastriques comme les cochons, les poissons, les volailles mais aussi l’homme, ne les possèdent pas alors qu’elles sont très répandues dans la nature, aussi bien dans les tissus végétaux que chez les micro-organismes (bactéries et champignons). Les phytases (connues aussi sous le nom de myo-inositol hexaphosphate phosphohydrolases, catalysent l’hydrolyse des phytates en inositol et phosphates. Elles sont de deux types ; les 3-phytases qui attaquent en premier le groupe phosphate en position 3 et les 6-phytases qui commencent l’hydrolyse par le groupement en position 6. Il s’en suit que l’action de ces enzymes est bénéfique sur le plan nutritionnel en améliorant sensiblement la biodisponibilité du phosphore des aliments tout en éliminant la nécessité d’ajouter du phosphore inorganique dans l’alimentation animale, mais également en réduisant la quantité de phosphore dans les déchets utilisés comme fertilisants, dont l’excès est responsable de la pollution des nappes d’eau et des rivières. Les avancées les plus récentes dans ce domaine portent sur l’amélioration dans les possibilités d’application et des performances des phytases dont de nouvelles formes fongiques ont été identifiées avec des activités spécifiques 4 à 50 fois plus élevées que celles connues antérieurement. L’une des approches pour le développement d’enzymes plus efficaces a été d’augmenter l’activité catalytique de phytases fongiques par mutagenèse dirigée du site actif comme cela a été le cas pour la phytase d’Aspergillus fumigatus, par exemple, dont l’activité spécifique a été multipliée par quatre. Dans les rations à base de blé, d’orge, de seigle ou de triticale, le principal facteur antinutritionnel est le taux élevé en fibres cellulosiques et en hémicelluloses. Dans le cas des volailles, déficientes en enzymes capables de dégrader ces fibres, une supplémentation de leur ration s’avère nécessaire. Les fibres présentes sont essentiellement des arabinoxylannes chez le blé et le seigle et des β-glucanes chez l’orge et l’avoine, à des teneurs variables en fonction de différents facteurs comme l’espèce, le biotope et la température. Ces polysaccharides augmentent la viscosité du digestat dans l’intestin grêle de l’animal et réduisent, par conséquent, son assimilation. Les enzymes utilisées dans ce contexte sont principalement des xylanases et des β-glucanases. Les premières (appelées également les endo-1,4-β-xylanases) ont pour substrat les xylanes des parois cellulaires. La société BASF Nutrition Animale commercialise également une formulation de cette enzyme, sous le nom de Natugrain® Wheat, utilisée notamment pour les mélanges alimentaires des volailles composés d’une grande quantité de blé et de ses dérivés comme le son afin d’en améliorer les performances grâce à une meilleure efficacité biologique. Le produit d’hydrolyse est constitué de courtes chaînes glucidiques. Les xylanases sont produites aussi bien par des bactéries que par des champignons, mais ce sont celles d’origine fongique (Trichoderma et Aspergillus) qui sont les plus utilisées. Les β-glucanases

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

agissent sur les β-glucanes (condensation de plusieurs unités de glucose liées par des liaisons β-(1J 3) et β-(1J 4)) en libérant du glucose et des oligosaccharides. À côté des Céréales utilisées en alimentation animale, le deuxième volet de ce secteur est la source de protéines qui peut être aussi bien végétale qu’animale, et de qualité variable. Un certain nombre de protéases ont été utilisées pour l’alimentation animale, toutes de la famille des peptidases, agissant sur des liaisons peptidiques spécifiques. La protéase la plus utilisée est la subtilisine, produite par des espèces de Bacillus, douée d’une large spécificité et hydrolysant les amides peptidiques. Généralement, les protéases sont ajoutées à la ration alimentaire, pré-mélangées avec d’autres enzymes (comme les α-amylases utilisées dans les rations à base de maïs, destinées à la volaille, pour accroître sa digestibilité très variable selon les variétés) afin de corriger les facteurs antinutritionnels associés aux protéines de l’aliment.

16.3.9. VALORISATION DES SOUS-PRODUITS AGRO-ALIMENTAIRES 16.3.9.1. CELLULOSE Les cellulases présentent un grand intérêt biotechnologique et industriel pour la valorisation des déchets végétaux. Ce sont des enzymes produites par divers micro-organismes permettant la dégradation de la cellulose (cellulolyse). On distingue trois types de cellulases : X les endo-1,4-β-glucanases ou endocellulases, qui coupent les liaisons β-(1J 4) intramoléculaires, de façon aléatoire, générant des extrémités non-réductrices. Elles hydrolysent également des celluloses substituées, comme la carboxyméthylcellulose ; X les exo-1,4-β-glucanases qui comprennent les 1,4-β-glucane glucanohydrolases ou cellodextrinases et les 1,4-β-glucane cellobiohydrolases ou cellobiohydrolases, et qui coupent, de façon processive, les extrémités accessibles de la molécule de cellulose, libérées par les endo-1,4-β-glucanases, en donnant du glucose pour les premières et du cellobiose pour les secondes ; X les exo-1,4-β-D-glucosidases ou cellobiases, qui hydrolysent les molécules de cellobiose et autres dextrines à degré de polymérisation (DP) jusqu’à 6 en donnant du glucose. Dans la nature, la cellulolyse est essentiellement le fait de micro-organismes (bactéries et champignons), aussi bien en aérobiose (par exemple à la surface du sol) qu’en anaérobiose (par exemple dans le rumen des animaux polygastriques). En réalité, les souches de micro-organismes cellulolytiques possèdent des systèmes multi-enzymatiques (appelé cellulosome) comprenant les trois types d’enzymes qui agissent en synergie et sont, de ce fait, capables de dégrader totalement la cellulose. La production industrielle de cellulases se fait par fermentation à partir d’organismes cellulolytiques, principalement des champignons et des bactéries (Cellulomonas). Actuellement, on utilise essentiellement des moisissures du genre Aspergillus et Trichoderma qui donnent les meilleurs rendements. Des mutants hyperproducteurs de cellulases ont pu être sélectionnés par mutagenèse chez Trichoderma reesei (les mutants actuels peuvent

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

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produire plus de 40 g/L de protéines solubles). Cette dernière espèce a probablement été la plus étudiée pour la production de cellulases. En effet, elle est capable de sécréter des concentrations importantes de cellulases très actives et elle a fait l’objet d’utilisation industrielle. T. reesei produit également des hémicellulases qui participent au processus d’hydrolyse des parois végétales. Dans les processus industriels courants, il n’existe pas de moyen rentable qui permette le recyclage de ces enzymes car celles-ci restent adsorbées en partie sur le résidu solide riche en lignine. Leur coût relativement élevé fait que cette étape est la plus onéreuse dans la production d’éthanol à partir des matériaux lignocellulosiques. Toute réduction de leur coût de production aura des répercussions positives sur les processus qui font appel à ces enzymes. Diverses stratégies de recherche visent à réduire le coût des opérations basées sur l’utilisation des cellulases, parmi lesquelles : X l’augmentation du rendement de production de l’enzyme ; X la production d’enzymes capables d’utiliser des substrats peu coûteux ; X la production d’extraits enzymatiques ayant une plus grande stabilité pour des processus spécifiques ; X la production de cellulases à plus haute activité spécifique sur des substrats solides.

16.3.9.2. PRODUCTION DE BIOCARBURANTS Les ressources limitées de combustibles fossiles, les prix de plus en plus croissants et les inquiétudes vis-à-vis de l’environnement comme la réduction des émissions de gaz à effet de serre et l’amélioration de l’innocuité ainsi que de la biodégradabilité des produits ont été les principales raisons qui ont incité à explorer l’usage des huiles végétales comme combustibles alternatifs. D’un autre côté, il y a une surabondance de matières premières lignocellulosiques ou amylacées et de coproduits, issus de cultures céréalières (maïs, blé) et oléagineuses (colza, soja, tournesol), du bois et de l’industrie agro-alimentaire (betterave à sucre, canne à sucre), susceptibles d’être utilisées comme substrats pour la production de biocarburants. Ces derniers sont répartis en deux principales filières : le bioéthanol et le biodiesel.

Bioéthanol L’éthanol est produit par fermentation industrielle (fig. 16.20) de la biomasse riche en glucides (betterave à sucre, canne à sucre, blé, maïs, pommes de terre, effluents et déchets organiques…). Cet éthanol produit par fermentation est généralement désigné par le terme de bioéthanol pour le distinguer de l’éthanol obtenu par synthèse chimique. C6H12O6 $ 2 C2H5OH + 2 CO2 La production par la voie biotechnologique l’emporte largement sur la voie pétrochimique qui ne représente qu’à peine 9 % de la production totale. Utilisé dans l’industrie chimique, dans la pharmacie, mais aussi, de plus en plus, comme biocarburant pour les moteurs à essence. Il peut être utilisé quasiment pur (composé à 85 % d’éthanol, cas de l’Allemagne) ou en mélange (5 à 30 %) avec l’essence (cas de la France). Son utilisation, selon cette seconde modalité, ne nécessite aucune adaptation des véhicules et des moteurs ou des pompes de distribution des carburants. Une troisième modalité

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

d’utilisation consiste à le transformer en ETBE (éthyl-tertio-butyl éther), par réaction avec l’isobutylène, une substance intermédiaire en pétrochimie. L’éthérification faisant appel à 53 % de produits pétroliers et à 47 % d’éthanol en volume. C2H5OH + H2C=C(CH3)2 $ CH3CH2OC(CH3)3 L’ETBE est destiné à être incorporé à l’essence à hauteur de 5 à 15 %. Dans ces conditions, aucune adaptation des moteurs n’est requise. Au Brésil, deuxième producteur mondial, juste après les Etats-Unis (18,5 et 23,4 millions de m3 en 2007), le bioéthanol représente 42 % des combustibles du marché. La production mondiale d’éthanol était de 65 millions de m3 en 2008. Ce chiffre ne cesse d’augmenter étant donné l’intérêt que suscite ce biocarburant renouvelable à travers le monde. Il faut noter que, comme pour la production d’alcool de distillerie, la fermentation directe ne peut être réalisée qu’à partir de substrats contenant une forte proportion de sucres libres, c’est-à-dire de sucres simples non-polymérisés. Tel est le cas des mélasses de l’industrie sucrière (canne à sucre au Brésil, betterave en France), certains déchets de fruits (effluents de conserveries) ou le lactosérum. Dans la plupart des cas, la prédominance de polysaccharides (amidon, cellulose, hémicelluloses) et de lignine contenus dans les sous-produits de la biomasse rend leur prétraitement nécessaire pour les transformer en sucres simples fermentescibles. Pour ce faire, les principales opérations sont résumées dans la figure 16.20. biomasse ligno-cellulosique

biomasse amylacée

prétraitement • broyage • délignification (thermohydrolyse), solubilisation alcaline, ozonolyse • décomposition de la cellulose par lignine thermolyse (T < 300° C) • solubilisation des hémicelluloses (à l’aide d’acides), ozonolyse hydrolyse • chimique (acides) • enzymatique (cellulases fongiques) glucose fermentation distillation rectification déshydratation bioéthanol

Figure 16.20 - Schéma général de production du bioéthanol à partir de la biomasse végétale

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

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L’hydrolyse peut être chimique (à l’aide d’acides) ou enzymatique. Cette dernière nécessite l’emploi simultané ou successif de plusieurs enzymes agissant en synergie : cellulases ou amylases en fonction du polymère à hydrolyser, hémicellulases et pectinases. L’hydrolyse de la cellulose par des enzymes est souvent la voie préférée pour l’obtention des sucres fermentescibles. En effet, les résultats de la plupart des évaluations économiques sont en faveur de l’hydrolyse enzymatique comparée à l’hydrolyse chimique, comme l’indique le tableau 16.7. Tableau 16.7 - Comparaison des procédés basés sur l’hydrolyse acide et l’hydrolyse enzymatique de la matière végétale lignocellulosique Acide

Enzyme

catalyseur non-spécifique : peut aussi bien délignifier le matériel végétal qu’hydrolyser la cellulose

catalyseur spécifique mais nécessite un prétraitement physique et chimique intense pour rendre la cellulose plus accessible à la dégradation

décomposition des hémicelluloses en composés inhibiteurs (ex. furfural)

production d’un sirop de sucres prêt à la fermentation anaérobie

génération d’effluents divers

génération de peu d’effluents à traiter

conditions d’action dures et, par conséquent, qui augmentent le coût du procédé : l’équipement doit être résistant à la corrosion et à la chaleur

conditions d’action modérées (50 °C, pression atmosphérique, pH 4,8) et donc pas de problèmes de corrosion

coût du catalyseur élevé

l’étape la plus coûteuse du procédé est celle de la production des cellulases

vitesse d’hydrolyse élevée

vitesse d’hydrolyse faible

rendement global en glucose faible en raison des dégradations

rendement global en glucose dépendant du prétraitement

perspectives d’amélioration faibles

perspectives d’amélioration importantes

Notons enfin que la fabrication de bioéthanol génère des coproduits valorisables. Si la matière première est constituée de Céréales, les coproduits de fermentation sont concentrés pour obtenir des « drèches », en granulés et qui, étant donné leur teneur en protéines, peuvent être utilisées en alimentation animale. Ainsi, dans le cas de l’utilisation de betteraves comme substrat de fermentation, le coproduit est la pulpe, également utilisée pour l’alimentation animale. Le tableau 16.8 donne un ordre de grandeur de la rentabilité de ce processus. Tableau 16.8 - Rendement de la fermentation éthylique selon le substrat Substrat de fermentation Production 1 ha de Céréales

2,16 t de bioéthanol + 3 t de drèches

1 ha de betteraves

6 t de bioéthanol + 3,75 t de pulpes sèches

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Biodiesel À partir des plantes oléagineuses (colza, soja, palmier à huile, tournesol…) ou de microalgues (essentiellement diatomées) dont certaines espèces ont une richesse en huile pouvant atteindre jusqu’à 50 % de leur masse, on extrait une huile naturelle visqueuse composée principalement de triglycérides. Par transestérification avec, soit du méthanol (fig. 16.21), soit de l’éthanol, cette huile est transformée en glycérol et en un mélange d’esters appelés esters méthyliques d’acides gras ou esters méthyliques d’huiles végétales &.)7
MPSTRVJMT
TPOU
PCUFOVT
BWFD
EV
NÏUIBOPM
PV
j
biodiesel ». Le catalyseur utilisé dans cette transformation peut être soit de nature chimique (acides PV
CBTFT
GPSUFT

/B0)
,0)
/B0$)3 ou H2SO4), soit enzymatique, à l’aide de la lipase (triacylglycérol ester hydrolases) qui catalyse l’hydrolyse des triacylglycérols, dans des conditions plus douces. OOC-R1 OOC-R2

OH +

3 CH3OH

OH

OOC-R3 triglycéride

OH

méthanol

R1COOCH3 + +

R2COOCH3 + R3COOCH3

glycérol esters méthyliques

R1, R2 et R3 = résidus d’acides gras

Figure 16.21 - Réaction de transestérification par le méthanol ou méthanolyse Afin de pouvoir récupérer et utiliser l’enzyme pour des applications industrielles, il est important de l’immobiliser. Parmi les techniques d’immobilisation de lipases les plus réussies, l’adsorption possède des potentialités commerciales intéressantes, étant la plus simple et la moins coûteuse, tout en permettant une haute activité catalytique. Les supports utilisés pour cela sont, par exemple, la kaolinite, la silice, les résines anioniques, la carboxyméthylcellulose… Les autres substrats potentiels comprennent le lard, le suif et les huiles végétales usagées (des restaurants, par exemple). Les huiles végétales rejetées des raffineries sont aussi un substrat adéquat pour la production du biodiesel. Comparé au pétrole ou à ses dérivés, le biodiesel issu d’huiles végétales ne produit pas d’oxyde de soufre et minimise les particules de suie. À cause de ce faible impact sur l’environnement, le biodiesel pourrait devenir dans un avenir proche une alternative au diesel conventionnel. La lipase immobilisée de Burkholderia cepacia a été utilisée pour la transestérification de l’huile de soja avec l’alcool méthylique et l’alcool éthylique. Les esters éthyliques d’acides gras ont aussi été préparés à partir d’huile de ricin en utilisant le n-hexane comme solvant et deux lipases immobilisées commerciales, Novozym 435 et Lipozyme
*.
DPNNF
DBUBMZTFVST
Novozym 435 a également été utilisée pour catalyser la transestérification des huiles brutes extraites des graines de soja pour la production de biodiesel dans un milieu sans solvant.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

397

Le biodiesel peut être utilisé de deux manières : soit incorporé au taux maximum de 5 % (7 % depuis mai 2007, en France), soit au taux optimum de 30 % dans le cas des flottes captives de véhicules diesel (transports publics, poids lourds…) appartenant à des collectivités territoriales ou à des entreprises disposant de leurs propres cuves de carburant. Comme pour le bioéthanol, les coproduits du biodiesel sont valorisables. Après extraction de l’huile des graines d’oléagineux, le résidu solide, appelé tourteau, est riche en protéines. Il est, de ce fait, utilisé en alimentation animale. La réaction de transestérification libère du glycérol (ou communément glycérine) qui peut être utilisé dans des produits de beauté, les dentifrices, en pharmacie galénique, dans des produits alimentaires ou bien comme adjuvant en peinture. À titre indicatif (source : http://www.prolea.com/) : ha de colza fournit 3,5 t de graines, X 1 t de graines de colza fournit 560 kg de tourteaux et 420 kg d’huile, X 1 t d’huile et 100 kg de méthanol fournissent 1 t de biodiesel et 100 kg de glycérine. X 1

Par ailleurs, le rendement des cultures de microalgues, du fait de leur croissance très rapide, est bien supérieur, permettant de produire sur une année 30 fois plus d’huile à l’hectare que les plantes oléagineuses. L’Union européenne (UE) est le leader mondial dans la production de biocarburants : 2 100 000 t sont produites et utilisées annuellement dans le secteur du transport. Les principaux producteurs dans l’UE sont l’Allemagne, l’Italie, l’Autriche et la France, suivies par l’Espagne et la Belgique. Les directives européennes souhaitent qu’un ajout de biocarburants dans l’essence sans plomb de 5,75 % soit réalisé d’ici à 2010 et qu’un cinquième du transport soit basé sur les biocarburants renouvelables à l’horizon 2020.

16.3.10. TRAITEMENT DE LA VIANDE ET DU POISSON Des protéases capables de digérer le tissu conjonctif et les protéines musculaires sont utilisées pour attendrir la viande. Les plus classiques d’entre elles sont représentées par la papaïne, la bromélaïne et la ficine. Ces enzymes sont soit répandues sur la surface (pour les petites pièces destinées à la cuisson immédiate), soit les pièces de viande sont plongées dans la solution enzymatique ou administrées en injection intraveineuse 2 à 10 min avant le sacrifice de l’animal. Les lipases jouent aussi un rôle important dans le processus fermentaire des saucisses. Dans le secteur des poissons, les lipases sont également utilisées dans la production d’une chair plus maigre. La graisse est éliminée pendant le traitement de la chair du poisson en ajoutant des lipases et cette procédure est appelée biolipolyse. Des enzymes protéolytiques sont utilisées pour le dépècement et l’attendrissement des poissons (comme le thon, le hareng, la raie, le calmar…), difficile manuellement ou par des moyens mécaniques. Le poisson est placé dans un bain contenant des enzymes protéolytiques en solution dans l’eau pendant 10 à 90 min. Après immersion, le reste de la peau est éliminé à l’aide de jets d’eau.

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

En Norvège, une méthode enzymatique d’enlèvement de la peau a été développée pour le hareng. Le hareng entier est placé dans un bain d’acide acétique à 5 % à une température de 10 °C, pour dénaturer le collagène de la peau, puis transféré immédiatement dans un bain contenant de la pepsine de poisson active au froid et de l’acide acétique dilué (0,5 %). Après 1 à 2 h à 20 °C, la peau est partiellement solubilisée et peut être enlevée par lavage.

16.3.11. INDUSTRIE DU TEXTILE ET DU CUIR Le désencollage des tissus en fibres de coton a été la première application des enzymes dans l’industrie textile. Avant leur tissage, les fils de coton subissent préalablement un apprêt ou encollage qui consiste à les enduire d’amidon afin de les renforcer et d’empêcher leur rupture. Après le tissage, cet apprêt est solubilisé (désapprêtage ou désencollage) par dégradation enzymatique avec l’α-amylase suivie d’un lavage des produits solubles par l’eau. L’usage de la laccase dans l’industrie textile ne cesse de prendre de l’ampleur. En plus de son utilisation pour blanchir les tissus, la laccase sert aussi à décolorer les effluents des usines de textiles. C’est la société Novozyme (Novo Nordisk, Danemark) qui a inauguré en 1996 la première utilisation industrielle d’une enzyme blanchissante à base de laccase, dénommée DeniLite¥
&O

MB
DPNQBHOJF
;ZUFY
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-UE
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EÏWFloppé une formulation basée sur la laccase (nom de marque Zylite®) et d’un médiateur, capable de dégrader l’indigo de manière très spécifique (fig. 16.22). Notons que l’indigo est l’une des teintures les plus difficiles à blanchir sans l’usage d’hypochlorite de sodium ou d’autres produits chimiques drastiques. L’enzyme est produite industriellement par fermentation ou par une souche d’Aspergillus génétiquement modifiée. H2O

enzyme (ox)

médiateur

O2

enzyme (red)

radical

isatine

oxyde du médiateur

indigo

acide isatique

acide anthranilique

Figure 16.22 - Dégradation de l’indigo par la laccase commerciale (Zylite®) En milieu aqueux, l’enzyme est oxydée et attaque le médiateur pour le convertir en radicaux libres. Ces radicaux libres attaquent alors l’indigo et le convertissent en isatine (= indole-2,3-dione) qui est à son tour décomposée en acide anthranilique (= acide 2-aminobenzoique) (voir fig. 16.22). Au fur et à mesure, des radicaux libres sont formés à partir du médiateur. Simultanément, les radicaux du médiateur sont convertis, par une réaction secondaire couplée, en formes oxydées qui n’interviennent plus dans la suite de la réaction.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

399

L’avantage de ce mécanisme est qu’avec un dosage défini de d’enzyme, on peut contrôler la diminution de l’intensité de la couleur. Dans le cas de l’hypochlorite, l’intensité de la couleur continue à diminuer avec le temps et rend difficile son maintien à un niveau homogène dans tous les lots traités. Les lipases représentent une méthode écologiquement saine pour éliminer la graisse. Pour les peaux de mouton qui contiennent jusqu’à 40 % de graisses, l’usage de solvants organiques, de la chaux, du sulfure de sodium et des détergents est très commun. Si les détergents sont très utilisés pour les peaux de mouton, ils ne sont pas aussi efficaces et peuvent engendrer des problèmes au niveau de l’environnement comme l’émission de composés organiques volatils. Ces méthodes conventionnelles tendent à être remplacées par des méthodes enzymatiques. Les lipases alcalines et acides peuvent ainsi être utilisées conjointement pour un meilleur résultat. Pour améliorer le processus, des protéases alcalines sont ajoutées pour aider à la dégradation des membranes cellulaires et des constituants des glandes sébacées. Les principaux avantages liés à l’utilisation des lipases sont l’homogénéité de la couleur, un meilleur aspect des peaux et une amélioration de l’imperméabilité du cuir. La kératinase de Bacillus subtilis est utilisée dans les tanneries pour l’épilation des peaux d’animaux destinées à l’industrie du cuir. L’épilation enzymatique représente une alternative aux produits chimiques dangereux, tels que le sulfure de sodium, utilisés dans la méthode conventionnelle et dont l’odeur nocive et la pollution posent un réel problème de santé. De plus, ces produits chimiques dissolvent complètement les poils et génèrent des effluents toxiques qu’il faut retraiter. L’épilation enzymatique évite ce problème et, par conséquent, il est possible d’éliminer les poils par simple filtration et, donc, réduire la demande en oxygène des effluents rejetés.

16.3.12. PRODUITS COSMÉTIQUES ET PARFUMS Les produits cosmétiques contenant des enzymes sont encore relativement rares mais leur nombre a augmenté au cours de la dernière décennie. Le nombre de brevets déposés dépasse celui de produits réellement sur le marché. L’utilisation des enzymes dans les dentifrices est déjà ancienne. Certains produits contiennent une combinaison d’enzymes oxydantes capable de neutraliser les bactéries pathogènes causant la plaque dentaire, les caries et la gingivite. D’autres utilisent des enzymes hydrolysant l’amidon ou les protéines pour éliminer les résidus des aliments et prévenir la coloration des dents. Un dentifrice dénommé Zendium® élaboré par Braun Oral-B, une filiale de la compagnie Gillette, utilise l’amyloglucosidase et la glucose oxydase. La première clive l’amidon en glucose qui est repris par la glucose oxydase avec production d’acide gluconique et libération d’H2O2. En plus de son effet bactéricide direct, le peroxyde d’hydrogène est utilisé par la peroxydase salivaire pour donner l’hypothiocyanite qui est également un puissant agent antibactérien. Ce mécanisme antibactérien par le biais de l’hypothiocyanite qui fait partie du système naturel de protection physiologique de la salive humaine se trouve renforcé par le système enzymatique de Zendium®.

400

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Unichem International (Espagne) a lancé la production du myristate de l’isopropyl, du palmitate de l’isopropyl et du 2-éthylhexylpalmitate pour être utilisés comme agents émollients dans les différentes crèmes pour la peau et dans les produits de bronzage. Ces produits sont préparés grâce à une lipase immobilisée extraite de Rhizomucor meihei, utilisée comme biocatalyseur. La compagnie espagnole prétend que l’usage de l’enzyme au lieu du catalyseur acide conventionnel donne des produits de plus haute qualité, ne nécessitant qu’un minimum de raffinage en aval. Des esters de cires (esters d’acides gras et alcools gras) ayant des applications similaires dans les produits de soins corporels sont aussi fabriqués enzymatiquement (Croda Universal Ltd.). La compagnie Uniche International utilise la lipase de C. cylindracea dans un bioréacteur en batch. Le coût total de la production total est légèrement plus élevé que par la méthode conventionnelle, mais il est justifié par l’amélioration de la qualité du produit final. Les rétinoïdes (vitamine A et dérivés) ont de grandes potentialités commerciales en cosmétologie et en produits pharmaceutiques comme les produits de soins pour la peau. Des dérivés du rétinol solubles dans l’eau ont été préparés par réaction catalytique à l’aide de lipase immobilisée.

16.3.13. APPLICATIONS MÉDICALES Il y a trois domaines où les enzymes sont employées avec succès en thérapie : X pour remplacer les enzymes perdues ou inopérantes à cause d’une maladie génétique héréditaire ; X pour pallier aux déficiences en enzymes dues à des maladies acquises dans l’organe où elles sont normalement synthétisées ; X pour fournir un effet biologique spécifique et dépendant de l’activité catalytique de l’enzyme. En outre, certaines enzymes sont utilisées d’une manière efficace en combinaison avec d’autres thérapies, ou pour la suppression de substances toxiques ou de substances indésirables du sang ou d’un tissu du corps humain. Le tableau 16.9 donne un aperçu général des principales enzymes utilisées en thérapie. Les enzymes utilisées en thérapie proviennent de différentes sources : bactéries (E. coli, Streptococcus), champignons (Aspergillus  spp., Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma viride), animaux (foie, estomac et pancréas du porc, grenouille, testicules et pancréas de bovins), plantes (papayer, ananas) ou venins de serpents. Des enzymes humaines ont également été obtenues à partir du sang (superoxyde dismutase, thrombine, divers facteurs de coagulation), de l’urine (urokinase), du placenta (glucosylcéramidase, glucocérébrosidase) ou des cellules en culture (urokinase). Actuellement, ces enzymes sont préférentiellement obtenues par la technologie de l’ADN recombinant et des protéines recombinantes (pour le principe général, voir chap. 9 Produits sanguins, section 9.4.3). C’est le cas de l’urokinase (issue d’E. coli recombinée) qui est utilisée dans l’infarctus du myocarde. Son action repose sur l’activation du plasminogène ce qui permet d’éliminer les caillots de fibrine. Il en est de même de la superoxyde dismutase issue d’E. coli ou d’une levure

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

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recombinées et qui est utilisée dans la prévention de la dysplasie broncho-pulmonaire chez les nouveau-nés prématurés. La L-asparaginase, issue d’E. coli ou d’Erwinia carotovora, est utilisée en chimiothérapie du cancer, particulièrement dans les leucémies lymphocytiques aigues, pour l’élimination de la L-asparagine, puisée dans le sang et indispensable au développement des tumeurs. En catalysant l’hydrolyse de l’asparagine en acide aspartique et ammoniaque, l’asparaginase entraîne la disparition des cellules incapables de synthétiser elles-mêmes l’asparagine (cellules leucémiques). Généralement, la concentration plasmatique en asparagine FTU
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,m bas). Bien que la thérapie par l’asparaginase ait prouvé son efficacité, plusieurs effets secondaires (nausée sévère, vomissement et diarrhée) lui ont été associés. Ces effets sont expliqués par un manque transitoire de l’asparaginase dans certains tissus. Les lipases isolées de la fausse teigne de la cire (Galleria mellonella, Lepidoptera) se sont révélées douées d’une action bactéricide sur Mycobacterium tuberculosis
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)3W
-B
lipase de Rhizopus arrhizus de même que la pepsine porcine (dégradation des protéines alimentaires), l’α-amylase (digestion de l’amidon), la lactase (hydrolyse du lactose) et la pancréatine (dégradation des lipides, glucides et protéines) sont utilisées comme aides digestives. Dans la « pancréatine » commercialisée, la substance active contenue dans le médicament contient, sous forme concentrée, les enzymes nécessaires à la digestion des aliments (lipases, amylases et protéases). Elle est utilisée pour traiter les troubles digestifs (tels que les lourdeurs d’estomac, les renvois et les gaz) résultant de l’insuffisance de sécrétions pancréatiques chez les patients atteints de mucoviscidose, de pancréatite chronique, ou dont le pancréas a été ôté (partiellement ou entièrement). Les lipases sont également des activateurs du facteur de la nécrose tumorale et par conséquent peuvent être utilisés dans le traitement de tumeurs malignes. L’utilisation des enzymes à des fins thérapeutiques est parfois problématique en raison de leur immunogénicité. Ceci est particulièrement vrai pour celles d’origine non-humaine. Dans certains cas, l’immunogénicité des enzymes non-humaines produites par la technologie de l’ADN recombinant est plus faible que celle des enzymes naturelles, voire même nulle. Ce constat peut être expliqué par le haut degré de pureté des enzymes recombinantes mais leur immunogénicité n’est pas totalement exclue. Parmi les stratégies adoptées afin de réduire ou de supprimer l’immunogénicité des enzymes thérapeutiques, la modification chimique est la plus facile et la plus utilisée. Par exemple, Oncaspar® (développée par Enzon Inc.) est une L-asparaginase PEGylée (L-Asp issue d’E. coli, modifiée par conjugaison avec le polyéthylène glycol), qui est utilisée pour le traitement des leucémies lymphoblastiques aiguës chez les enfants. Cette forme de L-Asp PEGmodifiée possède une durée de vie plus longue dans le sérum et une immunogénicité réduite comparée à la forme naturelle non-modifiée de L-asparaginase.

402

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE Tableau 16.9 - Enzymes utilisées en thérapeutique [données compilées à partir du site : http://www.biam2.org/]

Enzyme

Effet(s)

Application(s)

activateur du plasminogène

t

DPOWFSTJPO
EV
QMBTNJOPHÒOF
plasmine

t

USBJUFNFOU
EF
MJOGBSDUVT
EV
myocarde (phase aiguë)

alpha amylase

t

IZESPMZTF
MFT
MJBJTPOT glucosidiques α-(1J 4) des polysaccharides t

QPTTÒEF
VOF
BDUJWJUÏ
antioedémateuse t

JOIJCJUJPO
EF
MBVHNFOUBUJPO
de la perméabilité capillaire t

BHFOU
EF
EÏöCSJOBUJPO
(activité thrombinique)

t
”EÒNF
JOøBNNBUPJSF t

MZNQI”EÒNF
”EÒNF
EV
CSBT
après mastectomie)

batroxobine (obtenue à partir du venin du serpent Bothrops atrox)

t

USBJUFNFOU
EF
MFNCPMJF
pulmonaire et de la thrombose veineuse

bromélaines

t
QSPUÏPMZUJRVF t
BOUJJOøBNNBUPJSF

t

USBJUFNFOU
TZNQUPNBUJRVF
EFT
états inflammatoires modérés de la pathologie stomatologique, chirurgicale, gynécologique et post traumatique t

USBJUFNFOU
EFT
”EÒNFT
QPTU traumatique et inflammatoire

catalase

t
FVUSPQIJRVF
DBSUJMBHJOFVY

t
USBJUFNFOU
EF
MBSUISPTF

entérokinase

t

FVQFQUJRVF
USBOTGPSNF
MF
USZQTJ- t
EZTQFQTJF nogène inactif en pepsine active)

fibrinolysine (humaine)

t
QSPUÏPMZTF


t

USBJUFNFOU
EF
MVMDÒSF
WBSJRVFVY
des escarres et des plaies atones

glucosylcéramidase (partie protéique réduite d’isoenzyme de placenta humain)

t
MJQPMZUJRVF

t

USBJUFNFOU
TVCTUJUVUJG
EF
MB
NBMBEJF
de Gaucher de type I

hémocoagulase EF
,MPCVTJU[LZ

t
IÏNPTUBUJRVF

hyaluronidase

t

EJNJOVUJPO
EF
MB
WJTDPTJUÏ
EV
tissu interstitiel par hydrolyse de l’acide hyaluronique, favorisant la diffusion des produits injectés

t
USPVCMF
EF
MIÏNPTUBTF
QSJNBJSF t

allergie médicamenteuse hémorragipare t

UFNQT
EF
TBJHOFNFOU
BMMPOHFment) maladie thromboembolique fragilité capillaire t
PFEÒNF
QPTUUSBVNBUJRVF t
ÏQBODIFNFOU
USBVNBUJRVF

L-asparaginase

t
BOUJOÏPQMBTJRVF

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

403

Enzyme

Effet(s)

Application(s)

lipase

t
MJQPMZUJRVF

t
JOTVóTBODF
IÏQBUJRVF t
JOTVóTBODF
QBODSÏBUJRVF
FYUFSOF t
QBODSÏBUJUF
DISPOJRVF

lysozyme

t
BOUJCBDUÏSJFO
t
BOUJWJSBM

t
JOøBNNBUJPO
03-

papaïne

t
QSPUÏPMZUJRVF


t
EZTQFQTJF t
JOGFDUJPO
JOUFTUJOBMF

pepsine

t
QSPUÏPMZUJRVF


t
EZTQFQTJF t
HBTUSJUF
BUSPQIJRVF

ribonucléase

t
BOUJ
JOøBNNBUPJSF

t
EPVMFVS
JOøBNNBUPJSF t
IÏNBUPNF t
FOUPSTF t
PFEÒNF
JOøBNNBUPJSF t

JOøBNNBUJPO
FO
03-
stomatologie et phlébologie t
JOøBNNBUJPO

t
BOUBMHJRVF

serrapeptase (enzyme t
QSPUÏPMZUJRVF provenant d’une souche de Serratia sp.) thrombine

t
IÏNPTUBUJRVF t
DPBHVMBOU

t
IÏNPSSBHJF
FYUFSOF t
IÏNPSSBHJF
TVQFSöDJFMMF

trypsine

t
QSPUÏPMZTF
MPDBMF


t
QMBJF
VUJMJTÏF
QPVS
MB
EÏUFSTJPO t
FTDBSSF
VUJMJTÏF
QPVS
MB
EÏUFSTJPO t
VMDÒSF
DVUBOÏ

urate oxydase (extrait des cultures d’Aspergillus flavus)

t

VSJDPMZTF
USBOTGPSNBUJPO
EF
l’acide urique principalement en allantoïne, composé plus hydrosoluble éliminé par voie rénale)

t
HPVUUF
USBJUFNFOU
EF
GPOE

t
IZQFSVSJDÏNJF

urokinase

t
öCSJOPMZUJRVF


t
FNCPMJF
QVMNPOBJSF t
FNCPMJF
BSUÏSJFMMF t
UISPNCPTF
BSUÏSJFMMF
BJHVF t
UISPNCPTF
WFJOFVTF t

JOGBSDUVT
EV
NZPDBSEF
QIBTF
BJHVÑ

t

UISPNCPTF
EFT
QSPUIÒTFT
valvulaires

16.3.14. LES ENZYMES COMME OUTILS ANALYTIQUES Dans le secteur médical, de nombreuses enzymes sont utilisées pour le dépistage et le diagnostic de maladies afin de mieux adapter les traitements ou de suivre l’évolution de la maladie et apprécier les effets thérapeutiques de la médication. C’est le cas des lipases, par exemple, qui peuvent être utilisées comme outils de diagnostic ; ainsi leur présence ou les fluctuations de leur taux sont indicatrices de certaine infections ou maladies telles que la pancréatite aiguë qui se produit habituellement par suite d’abus de l’alcool ou obstruction du canal biliaire. Les lipases sont utilisées dans la détermination enzymatique

404

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

des triglycérides sériques produisant du glycérol lequel est ensuite dosé par colorimétrie. Le dosage des transaminases et des phosphatases alcalines fait partie intégrante du bilan hépatique. Le taux des transaminases est augmenté notamment en cas de destruction des cellules du foie (cancer du foie, hépatite, cirrhose…) et de certaines cellules cardiaques (infarctus du myocarde). De même, les phosphatases alcalines voient leur taux augmenter lors du cancer du foie. Un nombre beaucoup plus important d’enzymes est utilisé pour le dosage de substances biologiques telles que le glucose (glucose oxydase), l’urée (uréase), des hormones et des anticorps (peroxydase), des corps cétoniques… Ce marché moins dépendant du prix de revient que d’autres applications des enzymes est en expansion.

Détermination du glucose Dans la première réaction, le glucose est oxydé à l’aide de la glucose oxydase et du peroxyde d’hydrogène est formé : glucose + O2 + H20

$ gluconactone + H2O2

Dans la seconde réaction, le peroxyde d’hydrogène est utilisé pour oxyder un chromogène afin de former un produit coloré à l’aide d’une peroxydase (extraite du raifort). H2O2 + chromogène réduit incolore

$ chromogène oxydé rouge + H2O

La quantité de chromogène oxydé formée est proportionnelle à la quantité de glucose oxydé. Le chromogène utilisé peut être le PAP (phénol-4-amino-phénazone) qui se colore en rouge ou le 2,2’-azino-bis (3-éthyl-2,3-dihydrobenzothiazolsulfonate) qui se colore en violet.

Détermination de l’urée L’urée est hydrolysée à l’aide de l’uréase et l’ammoniaque formé réagit ensuite avec l’α-cétoglutarate et le NADH en présence de la glutamate déshydrogénase (GDH) avec formation de glutamate et de NAD+ :

$ 2 NH3 + CO2 + 2 NADH $ 2 L-glutamate + 2 NAD+ + 2 H2O

urée + H2O 2-cétoglutarate + 2 NH4

+

La diminution de l’absorption du NADH dans l’UV est suivie au spectrophotomètre.

Dosage immuno-enzymatique (ELISA) C'est une épreuve sérologique généralement effectuée sur des plaques à microtitration, et dans laquelle un anticorps couplé à une enzyme se lie à un anticorps spécifique d’une molécule cible, provoquant un changement de couleur. Par exemple, la cible peut être le β-glucane immobilisé sur la plaque par un anticorps polyclonal de lapin. Un anticorps monoclonal spécifique permet de détecter la cible, et un anticorps couplé à un marqueur antiphosphatase alcaline de souris permet de visualiser la réaction. La production d’une coloration jaune constitue une réaction positive détectable par spectrophotométrie à 405 nm.

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

405

Biologie moléculaire En biologie moléculaire, l’amplification d’une séquence nucléotidique par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction) utilise la réaction catalysée par les ADN polymérases en présence de plusieurs facteurs : ADN (matrice), une concentration suffisante en ions magnésium, les 4 dNTP (dATP, dGTP, dCTP et dTTP) en excès dans le milieu réactionOFM

Ʌ.


MFT
amorces (3’OH) oligonucléotidiques (18-28 nucléotides) homologues et de séquences connues. Pour éviter l’introduction de l’ADN-polymérase à chaque cycle, on utilise une enzyme résistante à des températures proches de 100 °C : la Taq polymérase extraite d’une Archaebactérie (Thermus aquaticus) dont la vitesse d’extension, dans les conditions optimales, est de 60 nucléotides/s (durée = quelques minutes). Cette bactérie vit dans des sources chaudes et la Taq polymérase est l’une des rares enzymes, utilisées en sciences expérimentales, capables de fonctionner à de très hautes températures. Notons enfin que les activités enzymatiques ont été largement utilisées comme un indicateur de qualité dans beaucoup de produits comme le poisson et la viande. La plupart des indicateurs enzymatiques sont endogènes (c’est-à-dire, présents naturellement dans le produit). Les changements post mortem et les méthodes de traitement, en particulier, la réfrigération, la congélation et la décongélation, peuvent entraîner des dommages aux tissus et la rupture des organites cellulaires comme les mitochondries et les lysosomes, libérant ainsi leurs enzymes au sein du milieu cellulaire. La mesure de l’ampleur de ces changements est faite habituellement par l’estimation du (des) produit(s) des réactions enzymatiques impliquées. Parmi les enzymes les plus étudiées figurent : l’ATPase, la pyrophosphohydrolase de l’ATP et la lactate déshydrogénase.

16.3.15. ISOLEMENT DES PROTOPLASTES Dans les programmes de sélection végétale, beaucoup de combinaisons de caractères désirables ne peuvent pas être transmises par les méthodes conventionnelles de manipulation génétique. Un processus autre que la voie sexuelle peut être réalisé pour les plantes supérieures et peut mener à la recombinaison génétique. Cette procédure non-conventionnelle, implique la fusion in vitro entre les protoplastes somatiques isolés (cellules débarrassées de leurs parois) et le développement subséquent de leur produit (hétérokaryon) en une plante hybride. Les méthodes d’isolement des protoplastes de plantes supérieures sont de deux types : X enzymatique séquentielle ; X enzymatique mixte (simultanée). Les processus enzymatiques séquentiels utilisent des préparations commerciales d’enzymes (tab. 16.10) et consistent à faire macérer le tissu végétal en présence d’une pectinase qui va permettre la séparation des cellules. Les protoplastes sont ensuite libérés après un traitement à l’aide d’une cellulase et, éventuellement, d’une hémicellulase qui détruit les parois. Les protoplastes peuvent être obtenus également par l’action conjuguée et simultanée de cellulases et de pectinases qui désagrègent les parois pecto-cellulosiques et libèrent des cellules sphériques dénudées, dans de très strictes conditions de

406

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

durée, de température et d’iso-osmoticité. Chez la luzerne, par exemple, on peut obtenir ainsi environ 12 .106 protoplastes par gramme de feuille traitée. Chez les algues, compte tenu de la nature particulière des parois cellulaires, pour obtenir des protoplastes, on utilise d’autres systèmes enzymatiques : alginate-lyase, mannuronate ou guluronate-lyase extraits de l’hépatopancréas de mollusques marins brouteurs comme les Abalones mais aussi de bactéries marines pour préparer des protoplastes de Pheophycées ; chez les Rhodophycées, dont la nature chimique des parois est différente, on utilise des agarases ou des carraghénases. Tableau 16.10 - Fournisseurs et origine des enzymes les plus utilisées pour l’isolement de protoplastes Enzyme Noms commerciaux Cellulase t
Driselase t
Onozuka RS, Onozuka t
Cellulysin t
Cellulase t
Meicelase CESB t
Cellulase

Organisme

Fournisseurs

Basidiomycètes Trichoderma viride Trichoderma viride Aspergillus niger Trichoderma viride Trichoderma viride Trichoderma reesei Humicola insolens

,ZPXB
)BLLP
,PHZP
$P
-UE
+BQPO

Yakult Honsha Co., Ltd (Japon) Calbiochem (USA) Fluka (USA), Sigma Chemical Co. (USA) .FJKJ
4FJLB
,BJTIB
-UE
+BQPO

Fluka (USA)

Hémicellulase t
Rhozyme HP-150 t
Hemicellulase

Aspergillus niger Aspergillus niger

Rohm and Hass Co., Ltd (Japon) Sigma Chemical Co. (USA)

Pectinase t
Macerozyme R-10 t
Macerozyme R-200 t
Macerase t
Pectolyase Y-23 t
Pectinol AC t
Pectinase

Rhizopus spp. Rhizopus spp. Rhizopus spp. Aspergillus japonicus Aspergillus niger Aspergillus niger

Yakult Honsha Co., Ltd (Japon) Fluka (USA) Fluka (USA) Calbiochem (USA) Seishim Pharmaceutical Co., Ltd (Japon) Corning Glass (USA), Sigma Chemical Co. (USA), Fluka (USA)

Alginate-lyase t
Abalone acetone powder

Ormeau (Haliotis sp.)

Sigma Chemical Co. (USA)

Agarase

Pseudomonas atlantica

Sigma Chemical Co. (USA)

16.3.16. DÉPOLLUTION ET TRAITEMENT DES EAUX USÉES Les potentialités technologiques offertes par les champignons filamenteux ligninolytiques ouvrent de nouvelles perspectives en matière de dépollution et plus particulièrement pour la réhabilitation des sols contaminés. En effet, il a été montré récemment que les champignons filamenteux sont capables de biodégrader des polluants persistants

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

407

dans les sols, tels que certains hydrocarbures et que la laccase joue un rôle crucial dans ces processus de dégradation. Les phénols sont fréquemment trouvés dans les effluents des usines (transformation agro-alimentaire, papier, textile, cuir, raffineries…). Etant des polluants dangereux, beaucoup de phénols et de composés phénoliques doivent être neutralisés au niveau des eaux usées. Pour ce faire, de nombreuses approches, physiques, chimiques et biologiques, ont été adoptées. Un processus enzymatique basé sur l’utilisation de la peroxydase permet la formation d’agrégats de polymères phénoliques insolubles en solutions aqueuses. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et d’autres xénobiotiques sont une source majeure de contamination des sols. De ce fait, leur dégradation est d’une grande importance pour l’environnement. Les propriétés catalytiques des laccases peuvent être utilisées pour dégrader de tels composés. De plus, les HAP qui proviennent des rejets et de l’utilisation des combustibles fossiles sont aussi dégradés par les laccases. Les lipases sont utilisées dans le traitement biologique des eaux usées (et autres processus de traitement aérobies des déchets) où les couches minces de graisses doivent être éliminées en continu de la surface des bassins de décantation pour permettre la diffusion de l’oxygène (condition nécessaire au développement et au bon fonctionnement des micro-organismes). Cette couche riche en matières grasses est dégradée à l’aide de lipases comme celles extraites de Candida rugosa. Par exemple, des lipases d’origine végétale, bactérienne ou animale (pancréatique) ont montré une grande efficacité à hydrolyser et/ou réduire la dimension des particules grasses dans les eaux usées rejetées par les abattoirs par exemple.

16.3.17. ENZYMES ET RÉGLEMENTATION (Le texte qui suit s’inspire des arrêtés parus dans le Journal Officiel de la République Française et le Journal Officiel des Communautés Européennes.) Au même titre que les additifs et auxiliaires technologiques, l’emploi des préparations enzymatiques dans les différentes filières de l’industrie alimentaire est soumis à une réglementation stricte. Ne peuvent donc être utilisées que les préparations enzymatiques qui auront été expertisées et expressément autorisées par des instances compétentes, propres à chaque pays (par exemple, en France, c’est l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments ou AFSSA ; aux Etats-Unis, c’est la Food Drug Administration ou FDA) ou communautaires (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments ou EFSA pour l’Union Européenne). L’autorisation d’utilisation d’une préparation enzymatique est délivrée, non seulement pour une enzyme mais aussi pour l’organisme producteur, modifié génétiquement ou non, un mode d’obtention, un domaine d’application et les conditions d’emploi (concentration, par exemple). Les autorisations définissent donc les règles générales permettant de garantir l’innocuité des préparations en précisant les conditions d’obtention, les critères de pureté chimique et microbiologique, les normes d’étiquetage des emballages et les conditions d’emploi.

408

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Les enzymes alimentaires ne peuvent être autorisées et utilisées que si elles remplissent les trois critères suivants concernant l’organisme producteur, la préparation enzymatique elle-même et les produits de la réaction enzymatique.

L‘organisme producteur Les tissus animaux ou végétaux d’où sont extraites les enzymes ne doivent pas présenter de risques toxicologiques. Les tissus animaux servant à la production des enzymes doivent provenir d’animaux en bon état sanitaire au moment de l’abattage et aptes à la consommation humaine. Les tissus animaux utilisés doivent être parfaitement sains et en excellent état de conservation. Le matériel végétal utilisé pour la fabrication des enzymes doit être issu des parties normalement comestibles des plantes saines et ne doit laisser aucun résidu nocif dans le produit traité mis en vente. Quant aux micro-organismes utilisés dans les bioprocédés industriels ou pour la production d’enzymes industrielles, ils EPJWFOU
ÐUSF
FYFNQUT
EF
QBUIPHÏOJDJUÏ
QPVS
MIPNNF
MFT
BOJNBVY
FU
MFT
WÏHÏUBVY
.BJT
la pathogénicité des micro-organismes, qui dépend de l’espèce voire de la souche, doit également tenir compte des conditions d’environnement. Aussi, la non-pathogénicité et l’absence de production de toxines doivent être considérées comme propres à la souche utilisée dans des conditions précises de production, de conservation et d’emploi. Ces organismes font l’objet de réglementations strictes relatives à l’hygiène du travail et aussi aux conditions de leur manipulation sur le lieu de travail et de leur élimination après utilisation (inactivation par stérilisation ou incinération). Les matières organiques obtenues sont généralement compostées et peuvent être utilisées comme engrais.

L‘enzyme et les substances qui l’accompagnent Les préparations enzymatiques sont souvent composées d’un mélange d’enzymes avec certains résidus des organismes d’origine (autres protéines, résidus de fermentation…) et avec des agents de conservation ainsi que des agents diluants. Le mode d’obtention de l’enzyme ne doit donc pas laisser des résidus ou des métabolites susceptibles de présenter un danger du point de vue toxicologique dans le produit alimentaire fini ou apporter à ce dernier des substances dont la présence n’est pas admise par la règlementation. Ne peuvent être utilisés que les agents de conservation et les diluants autorisés avec leurs doses maximales admises dans les aliments et les boissons traités.

Les produits de la réaction L’étude toxicologique doit également tenir compte de l’action des enzymes sur les substrats envisagés et, en particulier, des produits d’hydrolyse et/ou de métabolisation néoformés. Dans le cas des enzymes issues d’organismes génétiquement modifiés, chaque produit est examiné au cas par cas en tenant compte de l’origine des gènes, des séquences insérées, du vecteur et de l’organisme-hôte, ainsi que des différentes interactions qui pourraient en résulter (stabilité de la construction, taux de mutation, recombinaisons inter- ou intramoléculaires). L’étiquetage des préparations enzymatiques obéit également à des normes précises. Lorsqu’il est destiné aux utilisateurs professionnels, il doit donner des informations précises

16 - LES ENZYMES EN INDUSTRIE ET MÉDECINE

409

concernant la nature et l’activité de l’enzyme. Il est aussi important que les fabricants de produits alimentaires connaissent la durabilité des enzymes alimentaires afin de garantir l’innocuité de leurs produits. Les conditions de transport des enzymes concernées, qui sont sensibles aux changements de température, à l’humidité…, peuvent avoir une incidence sur la qualité des produits finaux. Des informations sur les effets potentiels d’une consommation excessive des enzymes peuvent contribuer à protéger les consommateurs contre des maladies facilement évitables. Leur usage excessif n’est pas sans conséquence pour la santé humaine (ex. cas de l’asparaginase, section 16.3.13). Notons, enfin, que les enzymes alimentaires doivent faire l’objet d’une observation permanente et être réévaluées chaque fois que c’est nécessaire, compte tenu des modifications de leurs conditions d’emploi et de l’acquisition de nouvelles données scientifiques.

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS Dans la pratique, les applications industrielles des enzymes en solution se trouvent parfois considérablement limitées par leur prix de revient et leur relative instabilité du fait de leur nature protéique (sensibles à la température, au pH, aux ions…). En solution, même si l’activité de l’enzyme est suffisante, sa récupération après utilisation nécessite un processus long et coûteux de purification. Par conséquent, ces enzymes sont perdues une fois la réaction effectuée : elles ne sont pas utilisables pour d’autres cycles de production. L’immobilisation des enzymes sur des supports solides, en augmentant leur stabilité opérationnelle et en permettant l’utilisation de réacteurs en flux continu permet de contourner cette difficulté.

17.1. PROCÉDÉS D’IMMOBILISATION DES ENZYMES L’immobilisation des enzymes sur des supports solides est rendue possible grâce à la présence de certains groupements chimiques réactifs dans la structure primaire de l’enzyme, accessibles à la surface de la molécule : –NH2 (Lys), –SH (Cys), –OH (Ser, Thr, Tyr), –COOH (Asp, Glu)… (fig. 17.1). L’enzyme peut être retenue sur un support solide par différents procédés résumés dans la figure 17.2. X Adsorption (fig. 17.2a) : certaines enzymes peuvent se fixer de façon assez stable, sans aucune modification chimique particulière, à la surface de certains supports solides, par adsorption. Celle-ci est obtenue par la mise en contact du support et des enzymes actives pendant une période définie. Cette technique est simple, peu coûteuse et réversible, mais la fixation n’est pas spécifique et les risques de désorption sont importants. Un choix judicieux de support ne nécessitant pas d’agent chimique pour l’adsorption permet une immobilisation dans des conditions douces résultant en une stabilité élevée des enzymes retenues. Les supports les plus utilisés sont les suivants : alumine (Al2O3), argiles (bentonite, montmorillonite), charbon actif, gel de silice, titane, verre poreux, résines échangeuses d’ions
%&"&DFMMVMPTF
$.
DFMMVMPTF
BHBSPTF
Amberlite®…). Cette technique a été la première application commerciale d’une enzyme immobilisée (L-aminoacylase) (voir fig. 17.6) permettant l’isolement de la L-méthionine à partir d’un mélange racémique, (technique mise au point par la compagnie Tanabe Seiyaku, au Japon, en 1969).

412

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE (Lys, ++) NH2

(Arg, –) NH H

NH2 N (N-terminal, +) NH2

OH OH

(Cys, –) HS (glucide, ±) (Met, –)

E

S

O

(Asp, +) OH

(Ser, ±) O (Glu, +) OH

O

(Tyr, –) HO

OH (C-terminal, +) NH (Trp, –)

Figure 17.1 - Groupements chimiques réactifs : + fréquemment utilisés pour l’immobilisation ; – non-utilisés ; ± utilisés parfois ; ++ très utilisés

[D’après Linqiu Cao : Carrier-bound immobilized Enzymes. Principles, applications and design, 563 p. © 2005, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA., avec permission]

E

E

E

E

E

E E

E

E

E

E

E E

E E a

E

E

b

E E c

d

Figure 17.2 - Procédés d’immobilisation d’enzymes (E) a : adsorption ; b : fixation covalente ; c : inclusion ; d : réticulation X Fixation

covalente (fig. 17.2b) : comme il s’agit de protéines, les groupements réactifs disponibles sont de deux types principaux : des groupements acides carboxyliques et des groupements aminés primaires. D’autres groupements existent (R –SH, R –OH), mais

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS

413

leur utilisation est plus délicate car leur modification se traduit en général par la perte de l’activité enzymatique. L’immobilisation des enzymes nécessite donc une « greffe » dans des conditions douces, entre R–COOH ou R–NH2 de la protéine et certains groupements réactifs du support solide. Parfois, il est nécessaire d’introduire, sur le support solide, d’autres groupements activés par l’utilisation de réactifs tels que le bromure de cyanogène, le glutaraldéhyde, la carbodiimide… Ces réactifs relient à la fois les enzymes et le support (fig. 17.3 et 17.4). O OH

O

+ BrCN

C

OH

NH

+ NH2

E

O

O

C

NH

E

OH

Figure 17.3 - Fixation d’une enzyme sur un support activé par le bromure de cyanogène O

NR

O

C

OH + C + 2 H+

C

NR’

NHR O

CH

+ NH2

E

O C NH

NHR E

+ O

NHR’

C NHR’

Figure 17.4 - Fixation d’une enzyme sur un support activé par un carbodiimide Les supports usuels sont : Z des supports minéraux : silice, verre poreux, oxydes métalliques, Z des supports organiques : dextrane, agarose, cellulose et dérivés, polystyrène, polyamide, nylon… Ce procédé d’immobilisation offre l’avantage de pouvoir être utilisé dans une large gamme de pH et de force ionique. X Inclusion ou encapsulation (fig. 17.2c) dans les mailles d’un gel de polymères naturels ou synthétiques. Les supports utilisés sont très variés : cellulose ou ses dérivés, dextranes (Sephadex®), amidons, alginates, carraghénanes, polyacrylamide, fibres de polyester, mousse de polyuréthane, nylon. Le gel polymérise autour de l’enzyme et l’inclut, tout en permettant, dans une certaine mesure, la circulation des substrats et produits. Cette technique est peu coûteuse, mais les problèmes de diffusion constituent un facteur limitant. La figure 17.5 illustre l’immobilisation de l’acétylcholinestérase par inclusion dans un gel mixte d’alginate/ carraghénanes (Sahin et al., 2005). X Réticulation (fig. 17.2d) : les enzymes sont immobilisées par l’établissement de liaisons intermoléculaires entre les enzymes au moyen de réactifs bi- ou multifonctionnels, formant des agrégats insolubles. Le glutaraldéhyde, par exemple, est utilisé comme agent de réticulation qui réagit avec les fonctions amines (–NH2) des protéines grâce à ses deux fonctions aldéhydes. Les supports inorganiques utilisés pour l’immobilisation des enzymes doivent présenter de bonnes propriétés mécaniques et thermiques, être stables dans une large gamme de pH et avoir une bonne capacité de résistance aux attaques microbiennes et aux solvants organiques.

414

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE Na - alginate (0,25 g) + enzyme en solution (3 mL) versé goutte à goutte dans une solution de CaCl2 (0,3 M) OH

HO

OH

HO

E

E E

HO

E

OH

E

E

OH OH

OH

κ-carraghénane (0,25 g) + alginate de sodium (0,25 g) + enzyme en solution (3 mL) versé goutte à goutte dans une solution de CaCl2 (0,3 M) OH

HO

OH

HO E HO

E

E E

E

OH

E OH OH

OH

carraghénane alginate

Figure 17.5 - Immobilisation de l’acétylcholinestérase par utilisation de perles gélifiées d’alginates (en haut) et le polymère mixte d’alginate/κ-carraghénane (en bas) [d’après Sahin F., Demirel G. & Tümtürk H. : International Journal of Biological Macromolecules 37, a novel matrix for the immobilization of acetylcholinesterase, 148-153, © 2005, avec la permission d’Elsevier]

17.2. AVANTAGES DES ENZYMES IMMOBILISÉES Comparativement aux systèmes à enzymes libres, la technologie des enzymes immobilisées présente les avantages suivants : X Augmentation de la stabilité face à la dénaturation thermique ou aux pH extrêmes. Par conséquent la durée de vie de ces enzymes immobilisées est accrue ce qui permet leur utilisation pendant de longues durées. À titre comparatif, chez une enzyme immobilisée, sa stabilité en fonctionnement à 30 °C est de l’ordre d’une semaine à quelques mois alors que celle de l’enzyme en solution est souvent inférieure à 24 h. Sa conservation est améliorée, la stabilité de l’enzyme immobilisée peut atteindre plus de 6 mois à 4 °C. L’utilisation de températures plus élevées (50 °C et plus) lors des réactions est également possible à cause du renforcement de l’architecture tridimensionnelle par l’immobilisation qui empêche le déploiement des chaînes polypeptidiques de l’enzyme. Dans ces conditions de température, le développement des bactéries est également stoppé.

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS

415

X Contrairement

aux enzymes solubles, l’utilisation de solutions alcooliques est rendue possible par l’immobilisation des enzymes. Cette propriété est particulièrement utile lorsque l’on travaille avec des substrats insolubles en phase aqueuse et solubles en phase organiques (ex. stéroïdes).

Entre autres avantages : mécanisme réactionnel de l’enzyme immobilisée n’est en général pas modifié, X le contrôle du pH d’action optimal est plus aisé, X les produits obtenus sont d’une plus grande pureté et leur récupération est plus facile, X les processus d’inhibition des enzymes sont réduits voire complètement éliminés, X la productivité est fortement augmentée grâce aux opérations en mode continu et à la possibilité de réutiliser les enzymes. X le

17.3. RÉACTEURS ENZYMATIQUES Un réacteur enzymatique est défini comme un dispositif dans lequel une réaction de conversion chimique est catalysée par une enzyme. L’immobilisation des enzymes est un procédé permettant leur utilisation industrielle dans des réacteurs en continu permettant les bioconversions, la synthèse ou l’hémisynthèse de composés de haute valeur ajoutée. Plusieurs types de réacteurs enzymatiques ont été mis au point. Ils ont pour fonction la production, en continu, du ou des produits de conversion du substrat. Le principe de ces réacteurs repose sur le passage lent du substrat (vitesse déterminée par l’expérience) au travers d’une colonne d’enzyme immobilisée. Le choix du réacteur dépend du type de réaction, du support et de l’utilisation désirée.

17.3.1. RÉACTEUR À ACIDES AMINÉS C’est l’un des premiers réacteurs industriels réalisé pour la fabrication de L-aminoacides (fig. 17.6). Les acides aminés synthétisés chimiquement à des fins alimentaires sont un mélange racémique de composés D- et L-. Seul le composé L- est utilisable en nutrition humaine et animale. Le dédoublement du racémique, difficile par voie chimique, est facilité par l’utilisation d’une aminoacylase fixée. Le mélange racémique est alors acylé, puis passé sur une colonne contenant l’enzyme immobilisée qui est le plus souvent d’origine fongique (Aspergillus oryzae). Le L-aminoacide libéré est aisément séparé du D-acylaminoacide. Ce dernier est chimiquement racémisé, avant de passer à nouveau sur la colonne. Cette synthèse dite combinée (association de méthodes chimiques et enzymatiques) est très avantageuse pour un grand nombre d’acides aminés. Ce type de bioréacteur permet de produire des quantités importantes (une dizaine de tonnes) de L-aminoacides par mois (ex. L-alanine, L-glutamate, L-méthionine, L-phénylalanine, L-tryptophane, L-valine).

416

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE synthèse chimique de DL-aminoacides (mélange racémique) H R’ COOH N O

R acétylation

DL-acylaminoacides racémisation + H2O + L-aminoacylase fongique immobilisée

H N

R’

COOH

O R D-acylaminoacide

R’

OH O acétate

H2N

COOH

R L-aminoacide

Figure 17.6 - Obtention des L-aminoacides à l’aide d’un réacteur Les DL-acylaminoacides sont traités par la L-aminoacylase fongique, ils donnent les L-aminoacides. Les D-acylaminoacides sont racémisés.

17.3.2. RÉACTEUR À LACTOSE Ce type de réacteur est utilisé pour fabriquer du lait sans lactose. L’hydrolyse de ce dernier en glucose et galactose est catalysée par la β-galactosidase. Cette enzyme peut être copolymérisée avec la sérum-albumine bovine qui sert alors de protéine support, grâce au glutaraldéhyde (agent pontant). Le lait est déposé en continu sur la colonne remplie de l’enzyme immobilisée, le lactose est alors hydrolysé en glucose et galactose. Ainsi, le lait se trouve débarrassé du lactose sans avoir perdu ses propriétés nutritives et en préservant l’ensemble de ses constituants.

17.4. BIOCAPTEURS ENZYMATIQUES La catalyse enzymatique est étudiée traditionnellement en milieu aqueux. La grande variété et la spécificité des enzymes ont été très tôt exploitées dans le secteur de l’analyse et du contrôle, particulièrement lorsque l’hétérogénéité du milieu se prête mal à une mesure spécifique par voie chimique ou lorsque le milieu réactionnel est constitué

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS

417

d’une phase non-aqueuse. En effet, le développement de biocapteurs à enzymes permet aujourd’hui de travailler en phases organiques, rendant possible la détermination de composés qui sont peu ou pas solubles dans l’eau mais solubles dans des solvants organiques, ce qui a élargit le champ des applications analytiques des biocapteurs enzymatiques aux substrats et échantillons hydrophobes. Le composant clé du biocapteur enzymatique est l’enzyme qui est responsable de la reconnaissance spécifique de l’analyte. Lorsqu’on travaille dans des solvants non-aqueux, la simple adsorption de l’enzyme sur un support solide au niveau de l’électrode est souvent une bonne méthode d’immobilisation en raison de l’insolubilité des enzymes dans les solvants organiques. Néanmoins, une grande variété de méthodes d’immobilisation des enzymes est actuellement disponible, permettant une meilleure stabilisation de l’activité catalytique. Les durées de vies de ces électrodes enzymatiques sont alors de quelques jours à plusieurs semaines selon la nature de l’enzyme et son mode d’immobilisation.

17.4.1. DÉFINITION D’une manière générale, les biocapteurs associent un dispositif de reconnaissance biologiquement sélectif appelé biorécepteur à un semi-conducteur le transducteur (fig. 17.7). Le biorécepteur représente le premier maillon du biocapteur, sa spécificité permet d’identifier la nature du produit recherché. Le transducteur constitue l’autre partie du biocapteur. La grandeur à mesurer, en agissant sur le biorécepteur, génère une énergie (thermique, électronique, rayonnante…) proportionnelle à l’intensité de la réaction. Cette énergie est convertie par le biorécepteur en un signal électrique aisément mesurable. Plusieurs types de biorécepteurs et de transducteurs existent à l’heure actuelle ; différentes combinaisons sont alors possibles. production du signal électrique

reconnaissance moléculaire

glucose O CO2 NO3 ... O

O

particules à détecter

anticorps cellule organite enzyme récepteur ADN / ARN ...

ampéromètre calorimètre photomètre potentiomètre ...

biorécepteur

transducteur

biocapteur

acquisition des données

amplificateur

signal électrique

Figure 17.7 - Principe de fonctionnement d’un biocapteur

1 2 0 électronique

information

418

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

17.4.2. BIORÉCEPTEURS Ce sont les enzymes purifiées couramment commercialisées qui sont les plus utilisées. L’utilisation de ces enzymes présente de nombreux avantages comme leur grande spécificité par rapport au(x) substrat(s), la reproductibilité des analyses, des caractéristiques et des durées de vie connues, une disponibilité rapide. Le développement d’électrodes biologiques, dites « électrodes à enzymes » est certainement une des plus importantes innovations dans le domaine des applications industrielles des enzymes. Ces électrodes sont recouvertes d’une couche constituée d’une enzyme immobilisée sur un support et couplée à un transducteur (généralement ampérométrique) qui traduit sous forme de signal électrique l’activité de cette enzyme. L’enzyme peut être fixée directement à la surface de l’électrode ou incluse dans un gel polymérique et retenue par une membrane perméable au substrat à doser. Si celui-ci est présent dans l’échantillon, il diffuse à travers la membrane et la réaction catalytique est déclenchée. Le produit qui peut être un ion ou un gaz induit une différence de potentiel mesurée par l’électrode de platine et proportionnelle à la concentration du produit de la réaction. Ainsi, dans le cas d’une électrode à urée, l’uréase adsorbée sur un gel convertit l’urée en ions ammonium et en HCO3– et l’électrode sensible aux ions NH4+ permet la mesure directe de la quantité d’urée présente dans l’échantillon. De telles électrodes permettent la mesure instantanée d’un certain nombre de substances dans des systèmes biologiques complexes (le sang, par exemple), du fait de la spécificité des enzymes utilisées. De plus, ces électrodes peuvent être adaptées à des mesures en continu, ce qui facilite grandement le suivi de l’évolution de tel ou tel produit au cours d’une réaction. Dans le domaine de la détermination des pesticides, un biocapteur basé sur l’acétylcholinestérase (AChE), obtenue par manipulation génétique chez Drosophila melanogaster, montre une constante d’inhibition pour le methamidophos (insecticide) avec un ordre de grandeur trois fois plus élevé qu’avec les préparations commerciales d’AChE d’Electrophorus electricus (anguille électrique). Ce même biocapteur est sensible à un autre insecticide, l’omethoate, avec une limite de détection de 10–17
. Des avancées importantes dans le développement des biocapteurs portent sur l’immobilisation de l’élément de reconnaissance biologique à la surface de la sonde. Ces approches incluent l’usage de nouveaux matériaux et l’incorporation de médiateurs d’oxydoréduction dans le processus de l’immobilisation. Plusieurs enzymes sont inhibées par des métaux toxiques qui contaminent l’environnement. Pour détecter ces métaux, les enzymes les plus utilisées sont l’uréase et l’AChE. La transduction du signal est souvent obtenue en suivant par potentiométrie le changement du pH causé par la présence de métaux toxiques tels que Hg (II), Cu (II), Cd (II), ou Zn (II). L’activité de la chromate reductase du cytochrome C3 de bactéries réductrices du sulfate a été utilisée pour construire un biocapteur sélectif du Cr (VI). Cette électrode enzymaUJRVF
FTU
TFOTJCMF
Ë
$S
7*
Ë
EFT
DPODFOUSBUJPOT
DPNQSJTFT
FOUSF̓ 
FU̓
˜.
FU
OFTU
QBT
affectée par des interférants potentiels tels que As (V), As (III) ou Fe (III).

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS

419

L’analyse de certaines substances telles que la lécithine exige le couplage de deux enzymes. Une électrode bi-enzymatique qui utilise la phospholiphase D (PLD) et la choline oxydase (ChOx) immobilisées sur un gel de κ-carraghénane avec une électrode à oxygène comme transducteur a été utilisée pour l’analyse de la lécithine (phosphatidylcholine). Le biocapteur, fonctionnant sur le principe de deux réactions enzymatiques couplées, établit une corrélation entre la concentration en substrat et l’oxygène consommé par la réaction catalysée par la choline oxydase et la diminution de l’intensité du courant mesuré par la sonde oxymétrique de l’appareil. PLD

lécithine

$ choline + acide phosphatidique ChOx

choline + 2 O2 + H2O

$ bétaine + 2 H2O2

Les limites de détection obtenues à l’aide des biocapteurs mono- ou bi-enzymatiques sont relativement plus élevées que celles obtenues par les méthodes immunologiques ou chromatographiques qui restent des méthodes de référence.

17.4.3. TRANSDUCTEURS Le transducteur représente l’élément permettant de mettre en évidence la réaction assurée par le biorécepteur auquel il est intimement connecté ou de doser directement et rapidement un composé chimique ou biologique dans un milieu complexe en transformant le signal biologique ou biochimique (modification de charges, de pH, de température, de fluorescence…) en un signal électrique enregistrable. Le choix du transducteur dépendra donc du type de réaction et des substances libérées ou consommées. Il peut s’agir d’une cellule électrochimique, d’une thermistance, d’un photomètre…

17.4.3.1. TRANSDUCTEURS ÉLECTROCHIMIQUES Dans le cas d’une détection chimique, il existe un grand nombre d’électrodes sensibles au pH, aux cations et aux anions. Ces transducteurs sont de plusieurs types, suivant la nature du signal enregistré : X conductométriques qui permettent de suivre les modifications de conductivité d’une solution lorsque, au cours d’une réaction, des espèces ioniques sont générées ; X potentiométriques qui mesurent la différence de potentiel (ddp) entre l’électrode de mesure et l’électrode de référence. Selon la loi de Nernst, la ddp est proportionnelle au logarithme de la concentration de l’élément chimique à doser ; X ampérométriques qui mesurent l’intensité du courant qui traverse une cellule électrochimique. Cette intensité dépend de la concentration des espèces chimiques pouvant être oxydées ou réduites.

17.4.3.2. TRANSDUCTEURS THERMIQUES OU CALORIMÉTRIQUES Certains transducteurs sont sensibles à la température. Ils sont basés sur la mesure de la chaleur générée par la catalyse enzymatique. Cette approche a été utilisée pour la détermination de l’activité de la lipase.

420

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

17.4.3.3. TRANSDUCTEURS OPTIQUES Il peut s’agir aussi d’une détection à l’aide de fibres optiques d’un changement des conditions optiques du milieu : émission de lumière, de fluorescence, absorption de la lumière, phosphorescence, luminescence.

17.4.4. CARACTÉRISTIQUES DES BIOCAPTEURS Un biocapteur va pouvoir être caractérisé en fonction de plusieurs critères : X sa spécificité qui correspond à sa capacité à détecter un composé parmi d’autres. Elle dépend de la nature du biorécepteur. Par exemple, un biocapteur basé sur le suivi de la conductimétrie sera sensible à toutes les espèces d’électrolytes qui pourraient être présentes dans un milieu. Par contre, les électrodes spécifiques d’un ionomètre ne sont sensibles qu’à des ions particuliers ; X sa sensibilité correspondant à la plus petite concentration d’un polluant donné générant un signal. Elle dépend du biorécepteur, du transducteur et de l’interaction entre ceux-ci. Le signal émis par le biorécepteur lors de la reconnaissance moléculaire doit être dans les limites de détection du transducteur. Or, plus le signal est important, meilleure est la détection, compte tenu du rapport signal/bruit de fond. Il faut donc choisir d’étudier une fonction qui soit fortement perturbée par le(s) toxique(s) à détecter et à quantifier ; X sa capacité à donner une réponse en temps réel. Chaque essai doit être reproductible et facile à calibrer ; X un biocapteur doit être robuste et résister aux changements de température, de pH, de force ionique. De plus, son utilisation doit être simple, requérant un minimum d’entretien de technicité. Il devra donc être un outil compact, peu onéreux, fiable, facilement miniaturisable et automatisable (dans la majorité des cas) ; X la stabilité du biorécepteur dans les conditions de l’analyse est une caractéristique d’une importance primordiale ; X le choix du transducteur va aussi dépendre des possibles interférences qui peuvent perturber la détection (ex. milieux troubles dans le cas d’une détection optique) et de l’application du biocapteur. Utilisé en milieu biologique, il doit répondre à des critères de biocompatibilité : dépôt à sa surface de protéines, de lipides ou de cellules. Utilisée in vivo, sa dimension doit être réduite et sa forme adaptée pour éviter un endommagement important du matériel biologique. Pour une utilisation de longue durée, il faut tenir compte du relargage éventuel de composants toxiques, métalliques ou polymériques du transducteur.

17.4.5. IMMOBILISATION DE L’ENZYME L’un des principes fondamentaux des biocapteurs est la proximité du biorécepteur et du transducteur. Ce dernier doit être à même de capter et transmettre rapidement les changements biologiques ou biochimiques existant. De ce fait, la technique d’immobilisation du biorécepteur, directement sur le transducteur ou à proximité, constitue un des points critiques de l’élaboration et du bon fonctionnement des biocapteurs.

17 - LES ENZYMES IMMOBILISÉES ET LEURS INTÉRÊTS

421

Dans les biocapteurs à enzymes, les méthodes d’immobilisation sont variées : X immobilisation sur des billes de verre poreuses, X liaisons covalentes sur membranes de dialyse, X réticulation avec du glutaraldéhyde, X immobilisation sur gel d’agarose.

17.4.6. DOMAINES D’APPLICATION DES BIOCAPTEURS ENZYMATIQUES De nombreux exemples d’applications des enzymes en général et des enzymes immobilisées, en particulier sont décrits dans le chapitre 16 Enzymes en industrie et en médecine. Les applications potentielles des biocapteurs enzymatiques concernent la mesure de substances antigéniques, de nombreux paramètres chimiques (glucose, urée) ou la détection de corps toxiques (dioxyde de carbone, métaux lourds, pesticides…). Ces mesures relèvent des domaines d’applications suivants : analyses médicales, industrie agro-alimentaire, environnement… Les premiers biocapteurs ont été développés à des fins médicales. Puis l’industrie agro-alimentaire s’est intéressée aux biocapteurs comme outils analytiques rapides. Enfin, depuis quelques années, les biocapteurs trouvent des applications dans le domaine de la surveillance de l’environnement. Très récemment, d’autres dispositifs, les puces à ADN 1 sont de plus en plus développés et utilisés dans des buts similaires, en complément ou en concurrence avec les biocapteurs.

17.4.6.1. DOMAINE DE LA SANTÉ Le premier biocapteur développé en 1967 permettait la détection du glucose dans le sang. En 1972, un biocapteur enzymatique sensible à l’urée a été mis au point. Une suspension d’uréase est maintenue à la surface d’une électrode munie d’une toile en nylon ; l’ensemble est recouvert avec une membrane de dialyse. Ce biocapteur permet de détecter l’urée à des concentrations variant de 1,1.10 –7
.
Ë
  –2
. D’autres biocapteurs ont été développés pour les besoins de l’industrie pharmaceutique et le domaine médical, principalement pour la recherche de stéroïdes tels que le cholestérol, l’androstendione, la testostérone, des antibiotiques tels que la nystatine et d’autres composés comme des hormones, l’acide urique, la créatinine et le fer (II et III). Les biocapteurs les plus utilisés sur le marché sont les biocapteurs à glucose, constitués de la glucose oxydase comme biorécepteur et d’un transducteur électrochimique, pour leur utilisation dans le diagnostic du diabète.

17.4.6.2. INDUSTRIE AGRO-ALIMENTAIRE C’est notamment dans les procédés de fermentation où les applications sont les plus utilisées pour le suivi, en continu, de la concentration de sucres grâce à des biocapteurs à enzymes ou à micro-organismes immobilisés.

1

pour des compléments d’information, voir Les puces à ADN sur le site web dédié

422

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Un biocapteur à base de tyrosinase est utilisé pour la détermination de polyphénols dans les huiles et aliments.

17.4.6.3. ENVIRONNEMENT Contrôler les contaminants dans l’air, l’eau et le sol est incontournable lors de la prévention des risques pour la santé humaine et l’environnement. Compte tenu du temps consacré et du coût des techniques analytiques traditionnelles, il y a un besoin accru de méthodes plus simples, plus rapides, moins couteuses et directement applicables sur le terrain. L’utilisation des biocapteurs dans le domaine de l’environnement est récente. Ils permettent la détection rapide de polluants dans les écosystèmes et donc d’intervenir plus rapidement pour y remédier. La détection peut se faire directement dans des systèmes complexes (eau douce, eau de mer, sol…) prélevés dans le milieu naturel. Un grand nombre de biocapteurs destinés à la détection des pesticides organophosphorés et des carbamates utilisent des capteurs électrochimiques comme transducteurs et des biorécepteurs à base d’enzymes purifiées et immobilisées (estérases, acétyle choline estérase). Des biocapteurs basés sur l’utilisation de la tyrosinase ont été développés pour la détection des phénols, molécules polluantes dont l’usage est très répandu (pesticides, plastiques, surfactants…).

18 - LES EXTRÊMOZYMES 18.1. INTRODUCTION La terre présente une diversité d’environnements qui, du point de vue anthropocentrique, pourraient être qualifiés d’extrêmes. Les micro-organismes, comme tous les êtres vivants, s’adaptent à l’environnement dans lequel ils doivent vivre ou au moins survivre. La découverte de formes de vie particulières dans des environnements apparemment inhospitaliers continue à défier les connaissances classiques des conditions limitant la croissance de nombreux organismes. Des adaptations morphologiques, physiologiques, biochimiques et génétiques aux environnements extrêmes de ces micro-organismes extrêmophiles ont suscité un immense intérêt chez les astrobiologistes qui croient de plus en plus dans l’existence d’une vie extraterrestre. Au cours des dernières décennies, des études ont démontré que des champignons, des microalgues, des Eubactéries et des Archaebactéries extrêmophiles ont colonisé des environnements que l’on croyait incompatibles avec la vie, voire même létales. Ces organismes, non seulement, tolèrent des conditions extrêmes particulières, mais les exigent souvent pour leur survie et leur croissance. Bien que les stratégies moléculaires utilisées pour survivre dans des environnements extrêmes ne soient pas toujours entièrement élucidées, on sait que ces organismes sont dotés de biomolécules possédant des caractéristiques particulières qui présentent de ce fait un grand intérêt pour des applications biotechnologiques. Leur stabilité et leur activité dans des conditions extrêmes en font des alternatives particulièrement intéressantes par rapport aux molécules labiles des organismes mésophiles qui ne sont actives que dans des gammes de température ou de pH très réduites et sont inactives en présence de solvants, ou de concentrations salines excessives. Cela vaut particulièrement pour leurs enzymes, qui restent catalytiquement actives sous des conditions extrêmes de température, de salinité, de pH et en présence de solvants ou encore d’agents chaotropiques. Souvent plus stables, plus faciles à utiliser, les extrêmozymes permettent, d’une part, de réduire le nombre d’étapes dans certains procédés industriels, d’augmenter la productivité et, d’autre part, d’accéder à des domaines d’applications nouveaux. Fait intéressant, certaines de ces enzymes présentent une polyextrêmophilicité (stabilité et activité dans plus d’une condition extrême) qui permet leur utilisation en biotechnologie industrielle, par exemple, acidothermophilie (Sulfolobus solfataricus), alcalithermophilie (Bacillus alcalophilus). De nombreuses sources chaudes sont à la fois acides ou alcalines et, généralement, riches en métaux ; les profondeurs de l’océan sont généralement froides, oligotrophes (très

424

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

pauvres en éléments nutritifs) et exposées à de hautes pressions ; certains lacs hypersalins sont très alcalins… Le genre bactérien Thermus se caractérise par sa capacité à vivre à des températures élevées dans un milieu pauvre en oxygène et acide (acide sulfurique) ou basique (carbonate/ bicarbonate, silice). Diverses espèces de Thermus peuvent exprimer des phénotypes très différents en fonction du contexte environnemental de leur habitat. Thermus thermophilus, par exemple, présente une physiologie adaptative spécifique, lui permettant de survivre sous une grande variété de conditions environnementales, basée sur des protéines, des organites et de l’ADN qui sont plus résistants que ceux des organismes vivant sous des températures plus clémentes. Les enzymes issues de ces micro-organismes ont été appelées extrêmozymes en raison des conditions extrêmes dans lesquelles elles fonctionnent. Cette définition s’applique également aux enzymes modifiées par génie génétique et pouvant agir dans des conditions extra-physiologiques. Ces conditions incluent : X les températures de 60 à 80 °C (organismes thermophiles) ou supérieures à 80 °C ou plus des sources chaudes (organismes hyperthermophiles) ; X les températures inférieures à 0 °C (organismes psychrophiles) ; X une pression hydrostatique élevée  : certaines enzymes fonctionnent sous des pressions très importantes sur les grands fonds océaniques (organismes piézophiles) ; X des milieux acides ou alcalins : en effet certaines enzymes ne sont pas affectées par les conditions extrêmes de pH, inférieures à 3-4 (organismes acidophiles) ou supérieures à 10 (organismes alcalinophiles) ; X EFT
DPODFOUSBUJPOT
FYDFTTJWFT
EF
TFMT
FO
TPMVUJPO
TVQÏSJFVSFT
Ë

.
PSHBOJTNFT
halophiles) ; X des niveaux élevés de rayonnements ionisants et ultraviolets (organismes radiophiles) ; X des niveaux élevés en métaux (organismes métallophiles) ; X des milieux très pauvres en eau (organismes xérophiles) ; X des milieux très pauvres en nutriments, donc oligotrophes (organismes oligophiles). Les extrêmozymes sont particulièrement utiles car de nombreux « process » industriels utilisent des procédés qui exigent des conditions difficiles. L’industrie des détergents, les industries alimentaires, pharmaceutique et papetière, entre autres, tirent profit de ces enzymes pour améliorer leurs méthodes de production. Un des objectifs de la recherche actuelle consiste à développer des techniques utilisant la catalyse d’enzymes d’extrêmophiles dans les processus industriels nécessitant des conditions opératoires extrêmes. Il s’agit d’une thématique de recherche relativement récente en plein développement et où beaucoup reste à faire et qui devrait être très productive à plus ou moins long terme. L’utilisation de ces extrêmozymes se développe rapidement et offre des perspectives prometteuses en raison de l’existence d’une multitude de micro-organismes présents et encore inconnus dans des environnements extrêmes. Ainsi, l’étude des extrêmophiles a évolué rapidement passant d’une science académique vers une technologie industriellement viable.

18 - LES EXTRÊMOZYMES

425

18.2. ORGANISMES THERMOPHILES ET HYPERTHERMOPHILES Ce sont les organismes thermophiles et hyperthermophiles qui ont attiré le plus rapidement l’attention des chercheurs et qui sont parmi les extrêmophiles les plus étudiés. Les organismes thermophiles ont été isolés de tous les types d’environnements chauds terrestres et marins, naturels et artificiels (centrales nucléaires, sortie de centrales géothermiques et des stations d’épuration au niveau des boues). Ces organismes se développent de façon optimale entre 50 et 80 °C. Leurs enzymes montrent une stabilité thermique qui est comprise entre celle des enzymes hyperthermophiles et celle des mésophiles. Les enzymes thermophiles et hyperthermophiles ne sont généralement pas très actives à des températures inférieures à 40 °C. De ce fait, elles sont parfois appelées thermozymes. La grande diversité des Archaebactéries et des Eubactéries hyperthermophiles, soit près d’une centaine d’espèces actuellement bien connues (ex. Sulfolobus solfataricus, Thermoproteus sp., Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus…), constitue une source importante d’enzymes pour développer de nouvelles applications biotechnologiques. Les Eubactéries thermophiles extrêmes sont représentées par les genres Bacillus, Thermus, Clostridium. Les enzymes de ces organismes hyperthermophiles présentent des relations structure-activité de haute stabilité thermique uniques et une activité optimale à des températures supérieures à 70 °C. Certaines de ces enzymes sont actives à une température très élevée, 110 °C, voire même plus. Le premier organisme hyperthermophile isolé (1977) fut Pyrolobus fumarii, Archaebactérie qui se développe à des températures allant de 90 à 113 °C avec un optimum à 106 °C. La souche Methanopyrus kandleri 118 (Archaebactérie) pousse à 122 °C (la plus haute température enregistrée). La température maximale pour laquelle la vie est possible est encore inconnue, mais elle n’est probablement pas beaucoup au-dessus de cette limite. Au-delà de cette température, des molécules comme les acides aminés et d’autres métabolites deviennent très instables (l’ATP est spontanément hydrolysée en solution aqueuse à des températures proches de 140 °C) et les interactions hydrophobes diminuent considérablement. Thermus aquaticus, l’espèce type du genre, a été la première bactérie extrêmement thermophile décrite et s’est avérée capable de croître à une température maximale de 79 °C. Quelques années plus tard, ont été isolées les souches HB8T et HB27 de Thermophilus pouvant croître à des températures maximales plus élevées (85 °C). Stables et actives à des températures élevées, les enzymes thermophiles et hyperthermophiles offrent des avantages biotechnologiques majeurs sur les enzymes de mésophiles (enzymes ayant une activité optimale à 25-50 °C) ou des enzymes de psychrophiles (activité optimale à 5-25 °C) : X lorsqu’elles sont exprimées dans des hôtes mésophiles, les enzymes thermophiles et hyperthermophiles sont plus faciles à purifier par traitement thermique ; X leur thermostabilité est associée à une résistance plus élevée aux dénaturants chimiques (par exemple un solvant ou le chlorhydrate de guanidinium) ;

426

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

X la réalisation de réactions enzymatiques à haute température est possible à des concen-

trations plus élevées en substrat, à basse viscosité, avec moins de risques de contaminations microbiennes et présentent souvent des taux de réaction plus élevés. De plus, les températures élevées influent notablement sur la biodisponibilité, la solubilité des composés organiques et leur diffusion qui se trouvent ainsi améliorées.

APPLICATIONS La stabilité des enzymes et leur activité à haute température sont des propriétés importantes et recherchées dans de nombreuses applications. Un parfait exemple en est l’utilisation actuelle de l’ADN polymérase thermostable issue de Thermus aquaticus (Taq polymérase) et celle issue de Thermus thermophilus (Tth polymérase) dans la technique de réplication de l’ADN appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR, acronyme anglais), très utile voire indispensable dans les laboratoires de biologie moléculaire, mais aussi dans le diagnostic et dans l’analyse génétique en médecine légale. Dans cette technique, l’ADN polymérase subit un chauffage à des températures allant généralement de 50 à 92 °C pour séparer les deux brins d’ADN, suivi de la liaison d’amorces à 50 °C et la synthèse de l’ADN à 72 °C. On peut également citer une autre enzyme thermostable, l’ADN ligase, qui est utilisée dans la technique de LCR (Ligase Chain Reaction) permettant de détecter certaines maladies génétiques. Les enzymes thermophiles et hyperthermophiles peuvent servir de systèmes modèles pour l’étude de la stabilité enzymatique et de la biocatalyse dans des conditions extrêmes ainsi que pour l’étude de la relation structure-activité, paramètres essentiels pour l’élaboration de stratégies d’ingénierie des protéines. Ces applications ont été rendues possibles par les progrès de la biologie moléculaire et de la biochimie (purification et caractérisation des protéines) en permettant le clonage et l’expression des gènes d’hyperthermophiles chez des hôtes mésophiles. Le nombre sans cesse croissant d’enzymes caractérisées à partir d’organismes thermophiles et hyperthermophiles et les développements récents d’outils puissants de génie protéique laissent espérer que ces enzymes trouveront, dans un avenir proche, de plus en plus d’applications.

18.3. ORGANISMES PSYCHROPHILES Certains biotopes sur terre sont exposés en permanence à des températures basses, comme le continent Antarctique, la banquise arctique, le pergélisol, les régions de haute montagne et les glaciers et les eaux profondes en haute mer. Un psychrophile est défini comme étant un organisme vivant en permanence à des températures proches du point de congélation de l’eau, en équilibre thermique avec le milieu. Cette définition englobe un large éventail d’espèces d’Eubactéries, d’Archaebactéries et d’Eucaryotes. Cela souligne que les psychrophiles sont nombreux et diversifiés sur le plan taxonomique et largement distribués au niveau du globe terrestre. Chez ces organismes, les basses températures sont indispensables au maintien du métabolisme cellulaire. Ainsi, certaines bactéries psychrophiles cultivées à 4 °C ont un temps de doublement proche de celui d’Escherichia coli cultivée à 37 °C. Une telle adaptation nécessite une vaste gamme d’ajustements

18 - LES EXTRÊMOZYMES

427

métaboliques et structurels à presque tous les niveaux d’organisation de la cellule que l’on commence à comprendre, grâce à des approches protéomiques, notamment. La plupart des réactions biologiques présentent une baisse d’activité suite à une réduction de température de 37 à 0 °C. Les mécanismes d’adaptation au froid incluent une intensification de la production d’enzymes, voire d’isoenzymes spécifiques adaptées à des températures basses. L’intérêt des enzymes actives à froid réside évidemment dans le fait qu’elles peuvent catalyser de nombreuses réactions à températures faibles ou modérées (< 40 °C) plus efficacement et avec moins de réactions chimiques indésirables qui peuvent se produire à des températures plus élevées; par ailleurs ces conditions thermiques (basses températures) réduisent les dépenses d’énergie et les coûts de traitement associés aux étapes de chauffage. La forte activité intrinsèque des protéines de psychrophiles fournit des potentialités d’exploitation biotechnologique qui demeurent encore insuffisamment explorées.

APPLICATIONS Les enzymes psychrophiles ou psychrozymes sont utilisées notamment pour la transformation des aliments (produits laitiers, produits carnés, produits de la mer…) en raison de leur activité catalytique élevée à basse température, ce qui réduit au minimum la détérioration et les altérations du goût et de la valeur nutritionnelle de ces produits.

18.4. ORGANISMES PIÉZOPHILES La pression provoque des changements de volume des organismes vivants, diminuant la fluidité des membranes cellulaires par compression. Des changements brusques de pression peuvent être létaux. La pression hydrostatique est élevée dans les lacs profonds et l’est encore plus dans les zones profondes des mers et des océans (fosses océaniques) où elle augmente à raison de 10,5 kPa par mètre alors que la pression lithostatique augmente encore plus de 22,6 kPa par mètre de profondeur. Les organismes piézophiles ou barophiles peuvent prospérer dans des eaux profondes à EFT
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barotolérants. Des enzymes piézophiles, stables à haute pression, ont été isolées d’une grande variété de micro-organismes, dont la plupart sont thermophiles ou psychrophiles et présentent des conditions optimales de croissance au-dessus de la pression atmosphérique normale (1013 hPa).

APPLICATIONS Bien qu’il existe de nombreuses applications biotechnologiques possibles des enzymes piézophiles, peu d’entre elles sont en fait connues. Cela est dû aux difficultés de cultiver en grande quantité des piézophiles dans des conditions de haute pression. Par conséquent, les propriétés de ces enzymes et d’autres métabolites cellulaires n’ont pas encore été entièrement élucidées.

428

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Les protéines résistantes à la pression pourraient être utiles, en particulier, pour la production alimentaire où la haute pression est appliquée lors de leur traitement et lors de la stérilisation des matières alimentaires.

18.5. ORGANISMES HALOPHILES Les micro-organismes halophiles appartenant aux Archaebactéries sont la principale source d’enzymes halophiles extrêmes ou halozymes. Ces micro-organismes abondent dans les environnements hypersalins, comme la mer morte, les marais salants, les lacs salés (sebkhas)… Les extrêmozymes produites par des micro-organismes halophiles peuvent fonctionner en présence de concentrations élevées de sel ou dans des conditions fortement alcalines (alcalozymes). Les nombreuses enzymes isolées d’organismes halo-alcalinophiles présentent la capacité de fonctionner à des pH élevés. Les micro-organismes halophiles répondent aux augmentations de la pression osmotique de leur milieu naturel de manières différentes. Certaines bactéries halophiles FYUSÐNFT
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,+, Na+…) tandis que d’autres synthétisent et accumulent des solutés compatibles et osmotiquement actifs (par exemple la proline, la glycine-bétaïne, les sucres, les polyols, les acides aminés…), qui les aident à maintenir un potentiel osmotique interne compatible avec le milieu environnant. Ces substances aident aussi à protéger les cellules contre les contraintes abiotiques du milieu comme les températures élevées, la dessiccation et la congélation. A fortes concentrations en sels, les enzymes halophiles peuvent être purifiées ou stérilisées sans crainte de la contamination de protéines ou d’autres molécules biologiques qui ne fonctionnent pas dans ces conditions.

APPLICATIONS Etant résistantes aux fortes concentrations en sels, les protéines et les enzymes halophiles peuvent trouver des applications commerciales dans les réactions qui requièrent de fortes concentrations salines. Diverses enzymes halophiles sont utilisées dans des domaines industriels tels que les détergents, les produits alimentaires, la production animale, le traitement des cuirs et des textiles, la production pharmaceutique, le diagnostic et la gestion des déchets. Le plus grand marché mondial des enzymes industrielles reste celui des détergents avec environ 30 à 40 % de la production totale d’enzymes dans le monde à l’exception des enzymes diagnostiques et des enzymes thérapeutiques. Les enzymes alcalines, telles que l’α-amylase, les protéases, la cellulose (endo-1,4-β-glucanase), la mannanase et des lipases, sont incorporées dans la lessive en blanchisserie industrielle et dans les détergents pour lave-vaisselles. La plupart des enzymes utilisées dans les détergents alcalins ont été découvertes entre les années 1960 à 1980. Les détergents contenant des enzymes alcalines ont été développés dans le monde entier ; certaines d’entre elles constituent le principal ingrédient biologique dans les détergents.

18 - LES EXTRÊMOZYMES

429

La fabrication de produits chimiques comme des pesticides, des herbicides, des explosifs et des colorants génère habituellement des effluents contenant des mélanges complexes de composés xénobiotiques, des solvants organiques et des sels. Les extrêmozymes halophiles encapsulées peuvent servir dans la bioremédiation (c’est-à-dire la réduction ou l’élimination des produits chimiques toxiques et autres déchets dangereux pour l’environnement).

18.6. ORGANISMES ACIDOPHILES/ALCALINOPHILES Les acidophiles sont définis comme étant des organismes pouvant croître jusqu’à pH 1,0 et avec une croissance active à pH < 4,0. Certains nécessitent des pH acides pour un fonctionnement optimal. Peu d’Eucaryotes unicellulaires vivent en dessous de pH 1,0 comme l’algue rouge Cyanidium caldarium qui, dans son milieu naturel, peut vivre à un pH de 0,5, mais en culture, son optimum de croissance se situe à pH 2-3 ; l’algue verte Dunaliella acidophila survit à un pH de 0 et a un taux de croissance maximal à pH 1,0 ; des champignons, comme Acontium velutium, Cephalosporium sp. et Ferroplasma acidarmanus, ont été trouvés à un pH de 0. Le genre Picrophilus comprend les organismes acidophiles les mieux connus (ex. P. torridus), capables de se développer à un pH de 0,06. Une des propriétés les plus frappantes des micro-organismes acidophiles et alcalinophiles est leur utilisation de pompes à protons pour maintenir leur pH interne proche de la neutralité ce qui évite aux enzymes intracellulaires de ces micro-organismes d’être en contact direct avec ces conditions extrêmes. Le mouvement des protons vers la cellule est minimisé par une charge intracellulaire nettement positive ; les cellules ont un potentiel de membrane intérieure positif dû aux chaînes latérales d’acides aminés protéiques et aux groupes phosphorylés des acides nucléiques et des intermédiaires métaboliques. Ainsi, le faible pH intracellulaire provoque la protonation des groupes titrables et produit une charge positive nette intracellulaire. Chez Dunaliella acidophila, la charge de surface et le potentiel intérieur de membrane sont positifs, ce qui doit réduire l’afflux des protons dans les cellules. Ce mécanisme serait renforcé par l’existence d’une ATPase-, H+ au niveau de la membrane cytoplasmique pour faciliter la sortie des protons de la cellule. Cependant, les enzymes extracellulaires des acidophiles doivent fonctionner à pH bas, tandis que celles des alcalinophiles fonctionnent à pH alcalin. Les mécanismes d’adaptation de ces enzymes extracellulaires aux pH élevé ou faible ne sont pas encore entièrement élucidés. Les alcalinophiles maintiennent un cytoplasme neutre ou légèrement alcalin. La régulation du pH intracellulaire est dépendante de la présence de sodium qui est échangé contre des protons grâce à des antiports H+/Na+. L’alcalinophile le plus extrême connu est Alkaliphilus transvaalensis qui vit à pH 12,5.

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PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

Les études d’alcalinophiles ont abouti à la découverte de nombreux types d’enzymes qui présentent des propriétés intéressantes. Le premier rapport concernant une enzyme alcaline, publié en 1971, décrivait une protéase alcaline produite par Bacillus clausii. Depuis cette époque, des centaines de nouvelles enzymes ont été isolées dans de nombreux laboratoires. Certaines d’entre elles ont été produites à l’échelle industrielle et commercialisées.

APPLICATIONS Les enzymes de micro-organismes qui peuvent survivre dans des pH extrêmes pourraient être particulièrement utiles dans des conditions réactionnelles très acides ou très alcalines, par exemple lors de la production de détergents. Genencor International (Rochester, USA) a commercialisé une des premières extrêmozymes industrielles utilisée dans les détergents de textiles; c’est une cellulase provenant d’une bactérie alcalinophile d’un lac d’Afrique de l’Est.

18.7. ORGANISMES RADIOPHILES Divers micro-organismes se sont montrés très résistants à des niveaux élevés de rayonnement ionisant ou ultraviolet. Deinococcus radiodurans est une bactérie remarquable par sa résistance aux produits chimiques mutagènes, aux dommages oxydatifs, aux niveaux élevés de rayonnement 
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ÏHBlement multigénomique (2 - 10 copies de chromosomes, selon le taux de croissance). Elle contient une batterie de gènes qui codent pour les multiples activités intervenant dans la réparation des dommages de l’ADN. Une microalgue autotrophe extrêmophile, Coccomyxa actinabiotis nov. sp. a été récemment isolée à partir d’une installation nucléaire et résiste à d’énormes doses de rayonnements ionisants, jusqu’à 20 000 Gy. Cet Eucaryote est donc au moins aussi hyperradiorésistant que la Procaryote Deinococcus radiodurans. Dans la mesure où elle accumule divers radionucléides dont le 14C, elle pourrait être utilisée comme agent de biodécontamination dans l’industrie nucléaire.

APPLICATIONS La présence de produits chimiques toxiques, de métaux lourds, de solvants halogénés et de radionucléides dans les déchets nucléaires pose un problème difficile pour la séparation des différentes espèces et l’élimination des contaminants individuels. Les souches de Deinococcus radiodurans et autres micro-organismes détoxifiants comme Coccomyxa actinabiotis peuvent être utilisés pour éliminer une grande partie de ces contaminants. Ce dernier micro-organisme présente l’avantage de l’autotrophie, n’ayant besoin pour se développer que de lumière, d’eau, de CO2 et de quelques minéraux en solution grâce à sa photosynthèse.

18 - LES EXTRÊMOZYMES

431

D’un autre coté, plusieurs groupes de recherche utilisent des techniques de génie génétique pour développer des souches de bactéries résistantes capables de réaliser une telle tâche. La résistance aux radiations peut se faire par des moyens de prévention ou de réparation efficace des dommages, développés par l’organisme exposé. Chez Deinococcus radiodurans, l’exposition à une irradiation γ, provoque l’altération de son ADN dont les fragments touchés sont remplacés par l’ADN chromosomique intact, sans que cela affecte la viabilité des cellules. La capacité de Deinococcus radiodurans d’utiliser la multiplicité de son génome pour réparer les dommages de l’ADN semble être la stratégie la plus fondamentale de la radiorésistance extraordinaire de cette espèce. Certains hyperthermophiles d’Archaebactéries comme Thermococcus litoralis et Pyrococcus furiosus sont également connus pour survivre à des niveaux élevés d’irradiation γ.

18.8. ORGANISMES METALLOPHILES Ces organismes métallophiles, dont plusieurs membres du genre Ralstonia colonisent les sédiments industriels, les sols ou les déchets contenant des teneurs élevées en métaux lourds, sont bien adaptés aux environnements difficiles générés par les activités anthropiques extrêmement polluantes. Ralstonia metallidurans, bacille à Gram négatif, non-sporulant, se développe dans des concentrations millimolaires de métaux lourds toxiques. Une des caractéristiques de ces Ralstonia réside en la présence d’un ou deux mégaplasmides contenant des gènes de résistances multiples aux métaux lourds. Ces plasmides leur confèrent une résistance au Co, Cd, Zn, Pb, Cu, Hg, Ni et Cr.

APPLICATIONS Dans la mesure où la pollution par les métaux lourds constitue une menace pour la santé publique, le milieu aquatique et marin, la pêche et la faune, il est indispensable de développer des systèmes capables de supprimer ou de neutraliser leurs effets toxiques dans les sols, les sédiments et les eaux usées. Beaucoup de micro-organismes, y compris Ralstonia, pourraient être utilisés dans la bioremédiation des zones contaminées par des métaux lourds. En plus de leur utilisation comme biosorbants, les bactéries peuvent être utilisées pour immobiliser certains métaux lourds efficacement en réduisant leur état d’oxydoréduction, produisant ainsi des espèces métalliques à activité biologique réduite. Ces bactéries sont dotées d’un certain nombre d’activités enzymatiques qui transforment certaines espèces métalliques par oxydation, réduction, méthylation et alkylation. Mis à part les transformations enzymatiques qui mènent à des précipitations métalliques et immobilisations, d’autres réactions biologiques qui génèrent des métaux sous des formes moins toxiques ont été exploitées à des fins de bioremédiation.

432

PARTIE V - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE

18.9. ORGANISMES XÉROPHILES Les régions les plus sèches du monde peuvent supporter la vie. Cependant, seuls des organismes spécialisés appartenant au règne des champignons (ex. Xeromyces bisporus) et certains lichens ont la capacité de croître dans des milieux extrêmement secs. De tels organismes sont qualifiés de xérophiles ou xérophytes. Vivant dans des milieux très secs, les xérophiles sont confrontés à deux problèmes, se reproduire et élaborer des enzymes capables d’hydrolyser les substrats dans des milieux extrêmement pauvres en eau. Comme très peu d’études ont été mené sur les xérophiles, le potentiel biocatalytique de ces organismes et leurs enzymes ne sont pas encore suffisamment connus pour être exploitées industriellement.

18.10. ORGANISMES OLIGOPHILES Les organismes oligophiles sont des organismes en général hétérotrophes (bactéries, champignons filamenteux…) capables de vivre dans un milieu pauvre en nutriments organiques. Dans les écosystèmes naturels, les oligotrophes et les eutrophes coexistent et leurs proportions respectives sont dépendantes de la capacité de chaque catégorie à dominer l’autre dans un environnement particulier. Une des caractéristiques principales des micro-organismes oligotrophes est leur système d’absorption des éléments nutritifs du milieu. Ainsi, les oligotrophes auraient idéalement un rapport surface/volume important, des systèmes d’absorption de grande efficacité avec des spécificités de substrat larges et une résistance aux stress environnementaux. De nombreux micro-organismes adaptés à des environnements pauvres en nutriments produisent des appendices permettant d’augmenter leurs surfaces en contact avec le milieu environnant, et appartenant aux genres Caulobacter, Hyphomicrobium, Prosthecomicrobium, Ancalomicrobium, Labrys et Stella.

18.11. PRODUCTION DES ENZYMES EXTRÊMOPHILES L’inconvénient majeur des enzymes extrêmophiles est la difficulté de les produire au laboratoire comme dans des environnements industriels. Les conditions requises pour la croissance des extrêmophiles incluent souvent des températures extrêmes, dans un environnement anaérobie et des milieux à pH extrêmes (pour les acidophiles et les alcalinophiles) ou contenant jusqu’à 5 moles de NaCl par litre (pour les halophiles). Ces conditions sont incompatibles avec la fermentation industrielle standard et les équipements pour le traitement en aval. La fermentation à température élevée sur des milieux corrosifs nécessite l’utilisation de matériel spécialement conçu. L’instabilité des substrats et des réactifs du fait de l’augmentation de température sont d’autres facteurs de complication. Des recherches sont en cours en vue de développer des méthodes permettant de cultiver des thermophiles et des hyperthermophiles pour leur biomasse, leurs enzymes et leurs biomolécules. Pour ce faire, différents groupes de recherche ont développés

18 - LES EXTRÊMOZYMES

433

plusieurs approches comme l’optimisation de la composition du milieu, l’utilisation de fermenteurs spéciaux (fermenteurs à air forcé, bioréacteurs à membrane…) et l’utilisation des différents modes de fermentation (culture discontinue alimentée, recyclage cellulaire ou culture continue). En raison des difficultés liées à la culture à grande échelle des extrêmophiles et à leurs traitements en aval, les gènes correspondants des extrêmophiles ont été exprimés avec succès chez des hôtes mésophiles comme Escherichia coli et des levures, même si des difficultés surgissent lorsque l’enzyme exprimée nécessite des cofacteurs spécifiques ou des ions métalliques que l’hôte n’utilise pas. La plupart des extrêmozymes qui ont trouvé leur place dans les applications industrielles sont actuellement produites à l’aide de systèmes d’expression placés dans E. coli.

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PARTIE VI

CULTURES CELLULAIRES 19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES 19.1. Définition, généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.2. Culture de cellules végétales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.3. Culture de cellules animales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.4. Amélioration de la production de métabolites secondaires chez les plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.5. Applications et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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437 437 440 448 452

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19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES 19.1. DÉFINITION, GÉNÉRALITÉS Les organismes vivants sont des structures très complexes et très intégrées. L’existence de nombreuses interactions et la multiplicité des processus de régulation rendent difficile l’étude d’un phénomène sans que le reste ne vienne perturber les résultats. Les cultures cellulaires offrent la possibilité d’isoler les phénomènes observés en simplifiant le modèle. Ainsi l’organisme se réduit à un organe, un tissu, voire une cellule, selon les besoins. Les techniques de cultures cellulaires permettent le maintien en vie et la prolifération des cellules d’un tissu en dehors de l’organisme voire même, dans le monde végétal, la régénération d’organismes entiers, in vitro dans des conditions aseptiques et contrôlées, à partir d’un fragment de tissu initial ou explant, prélevé sur l’organisme qu’on souhaite multiplier. Actuellement, il n’est pas encore possible de cultiver tous les types de cellules. Il n’en reste pas moins que les cultures de cellules constituent le matériel de base par excellence pour les études sur le métabolisme des produits naturels. Fondamentalement, le principe des cultures est très simple : on prend des cellules, des tissus ou des fragments d’organes sur un être vivant (animal ou végétal) ou des cellules naturellement isolées dans la nature telles que les bactéries ou les microalgues et on les place dans un milieu in vitro qui reproduit, aussi fidèlement que possible, les conditions existantes in vivo. La détermination des exigences pour la mise au point de milieux favorables à la survie des cultures cellulaires suppose une bonne connaissance des conditions qui prévalent dans le milieu naturel. L’intérêt que connaît la culture de cellules depuis ces dernières décennies est suscité par la capacité de certaines cellules à produire des molécules à haute valeur ajoutée, pouvant être utilisées dans les domaines pharmaceutiques et agro-alimentaires.

19.2. CULTURES DE CELLULES VÉGÉTALES 19.2.1. GÉNÉRALITÉS La culture in vitro des cellules végétales peut être réalisée à partir des embryons (embryogenèse), des bourgeons ou des méristèmes, des microspores ou des grains de pollen (androgenèse), des ovaires, des ovules ou des sacs embryonnaires non-fécondés

438

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

(gynogenèse) ou encore à partir d’explants divers (cotylédons, tiges, racines, feuilles, fleurs). Elle est également possible à partir de protoplastes. L’explant est placé, dans des conditions d’asepsie stricte, sur un support solide (gélose, microporteur ou membrane) ou en suspension en milieu liquide contenant des sels minéraux essentiels, des nutriments glucidiques et azotés et des substances de croissance. Ce processus exploite la capacité inhérente des cellules végétales à régénérer et, finalement, à produire des plantes entières in vitro sans subir le processus de recombinaison sexuelle. Ce phénomène est appelé totipotence des cellules végétales. Les suspensions de cellules indifférenciées peuvent être cultivées dans des enceintes de grand volume pour leur multiplication rapide. La régénération des explants cultivés peut se faire selon deux modalités de développement, l’organogenèse et l’embryogenèse somatique. L’organogenèse désigne le processus de formation de la racine ou de la tige feuillée par l’explant végétal en réponse aux substances de croissance appropriées. La supplémentation du milieu par un taux élevé en auxines (hormone de croissance végétale) est une méthode courante pour induire la rhizogenèse (croissance des racines) sur les explants alors que des taux élevés en cytokinines sont utilisés pour l’induction de la callogenèse (formation des tiges). L’embryogenèse somatique est la capacité de cellules végétales à former des embryons sans recombinaison sexuelle et, ainsi, de régénérer un organisme entier par un processus qui ressemble à l’embryogenèse zygotique. La culture est menée dans des conditions contrôlées de température, de lumière et d’hygrométrie optimales.

19.2.2. CONDUITE D’UNE CULTURE DE TISSUS VÉGÉTAUX La croissance des tissus végétaux est dépendante de l’optimisation de plusieurs facteurs, dont : X la sélection d’un explant approprié, X la préparation de l’explant, X la supplémentation du milieu de culture avec une combinaison optimale en substances de croissance (hormones et nutriments), X l’optimisation des conditions de l’environnement pour le développement des plantules régénérées, X le repiquage des plantules régénérées sur un milieu optimisé pour leur croissance et leur développement ultérieurs. Pour se développer in vitro, les tissus végétaux ont besoin de cinq catégories de produits : des sels minéraux, des glucides, des vitamines, un ou plusieurs acides aminés et des hormones. Les sels minéraux sont divisés en deux catégories : les macro-éléments qui comprennent le potassium, le calcium, le magnésium, l’azote, le soufre et le phosphore qui sont apportés sous forme de nitrates, de phosphates et de sulfates à des concentrations de l’ordre de quelques fractions de g/L et les microéléments qui sont l’aluminium, le cuivre, le cobalt, l’iode, le manganèse… apportés sous forme de sels (sulfates, chlorures) à des concentrations de l’ordre de quelques fractions de mg/L de milieu de culture.

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

439

Le fer présente un cas particulier car il est apporté sous une forme chélatée pour éviter sa précipitation dans le milieu. Lors de la croissance et de la multiplication des cellules, ces éléments minéraux seront intégrés dans la nouvelle matière vivante (protéines, lipides, acides nucléiques…) et seront utilisés pour la régulation d’enzymes intervenant dans le métabolisme. À titre indicatif, la composition d’un milieu de culture type est donnée dans le tableau 19.1 ci-après. Tableau 19.1 - Composition du milieu de culture de Murashige et Skoog (MS)* Ingrédient saccharose

Quantité [mg/l] Ingrédient 20 000

Quantité [mg/l]

,*

0,83

,/03

1900

CoCl2, 6H2O

0,025

(NH4)NO3

1650

Na2.P04, 2H2O

0,25

CaCl2, 2H2O

440

CuSO4, 5H2O

0,025

.H404, 7H2O

370

myo-inositol

100

,)2PO4

170

acide nicotinique

0,5

Na2EDTA

37,3

kinétine (une cytokinine)

FeSO4, 7H2O

27,8

glycine

.O404, 4H2O

22,3

acide indole acétique

ZnSO4, 7H2O

8,6

thiamine/HCl

0,1

H3BO3

6,2

pyridoxine/HCl

0,5

0,04-10,0 2,0 1,0-30,0

* Pour un milieu solide, il faut ajouter de l’agar à 10 g/L.

Les sucres (glucose, saccharose, le plus souvent), incorporés dans le milieu, sont indispensables à la croissance des tissus car la photosynthèse est fortement réduite dans l’atmosphère confinée des flacons de culture. Les vitamines hydrosolubles (groupe B) ont une action importante sur le développement des tissus. Quant aux hormones ou substances de croissance, elles agissent soit pour stimuler les divisions cellulaires et provoquer la formation de nouveaux bourgeons au sein de nouveaux tissus, soit pour assurer le développement des nouveaux bourgeons formés. Les tissus tumoraux sont facilement cultivables et ne nécessitent pas d’hormones pour leur croissance. Ces milieux de culture se présentent sous deux formes : par addition de gélose (agar), X liquides, pour la culture des cellules en suspension. X semi-solides,

Ces milieux de culture sont répartis dans divers types de contenants en verre ou en plastique : tubes, fioles diverses, boîtes de Pétri…, après avoir été stérilisés à l’autoclave (120 °C, 20 min). L’explant est prélevé sur la plante mère. Son asepsie peut être assurée par prélèvement sur des plantules issues de germinations en conditions stériles, ou par désinfection (à l’aide

440

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

d’hypochlorite de calcium) des organes végétaux prélevés sur une plante cultivée dans des conditions habituelles d’environnement ou par prélèvement des méristèmes lorsque les plantes sont contaminées par des virus. Outre l’explant et le milieu de culture, l’asepsie concerne également la verrerie, les instruments et l’environnement (hotte à flux laminaire ou zone stérile d’un bec Bunzen) utilisés lors des manipulations. Après leur ensemencement, les milieux de culture sont disposés dans des locaux climatisés (entre 20 et 30 °C) et le plus souvent éclairés en continu ou sous une photopériode moyenne (12 h de jour/12 h de nuit) à l’aide de tubes fluorescents. À l’échelle industrielle, la culture des cellules végétales requiert des bioréacteurs spécialement adaptés (agitation douce) en raison de la grande sensibilité de ces cellules au cisaillement.

19.3. CULTURES DE CELLULES ANIMALES 19.3.1. CONDUITE D’UNE CULTURE DE CELLULES ANIMALES La culture des cellules animales peut être conduite en boîtes de Pétri en plastique, en flacons ou en bioréacteurs, dans des milieux liquides ou solides, de composition adaptée. La culture en milieu liquide est la technique la plus simple à mettre en œuvre. Les cellules en suspension (cellules non-adhérentes) dans un milieu liquide peuvent croître librement jusqu’à épuisement des éléments nutritifs. La poursuite de la culture se fait par récupération des cellules par une centrifugation modérée et leur repiquage dans un milieu neuf. La culture de cellules sur milieu solide est obtenue en plaçant des suspensions cellulaires ou des petits fragments de tissu dans une boite de Pétri, contenant un milieu nutritif. Pour la plupart des cellules normales, le milieu nutritif doit comporter du sérum (en général à des doses de 5 à 15 %). Ce dernier fournit divers facteurs de croissance, des lipides, des facteurs d’adhésion et des éléments minéraux. Les cellules envahissent progressivement la surface de la boite jusqu’à confluence. À ce moment, elles arrêtent de se diviser (phénomène d’inhibition de contact). Les cellules de la culture primaire sont alors détachées du fond plastique par action de la trypsine (ou d’autres enzymes protéolytiques) puis remises en culture dans d’autres boîtes, à une concentration plus faible : c’est la culture secondaire.

19.3.1.1. MILIEUX DE CULTURE Un milieu de culture pour cellules animales doit apporter in vitro aussi fidèlement que possible la totalité des composants de l’environnement qu’elles trouvaient en conditions naturelles. Pour cela le milieu doit apporter l’ensemble des nutriments en maintenant des conditions physiques compatibles avec la vie et le développement cellulaire comme par exemple le pH, la température ou l’osmolarité.

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

441

Milieu de base Le milieu synthétique de base a une composition plus ou moins complexe suivant les auteurs mais il ne permet que la survie in vitro des cellules ; pour assurer la prolifération et le maintien des fonctions cellulaires il est nécessaire d’y adjoindre un sérum comme le sérum de veau fœtal (5 à 20 % du milieu) qui apporte, entre autres, des facteurs de croissance cellulaire, des protéines de transport et de la fibrinolectine qui permet l’ancrage des cellules aux parois du flacon de culture. -FT
NJMJFVY
EF
CBTF
TPOU
TPVWFOU
EÏTJHOÏT
QBS
MBDSPOZNF
.&.
.JMJFV
&TTFOUJFM
.JOJmum). Comme le montre le tableau 19.2, ils contiennent : X sept ions indispensables : Na+
,+, PO4 –
.H2+, Ca2+, Cl–, HCO32– accompagnés souvent d’oligo-éléments sous forme de métaux à l’état de traces comme le fer, le cuivre, le zinc ou le cobalt. Leurs rôles sont multiples : cofacteurs dans les réactions enzymatiques, intervention dans le maintien de la pression osmotique et dans la régulation du pH, en intervenant dans le potentiel membranaire… ; X des acides aminés essentiels au nombre de huit chez l’homme (isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, trypsine, valine) auxquels s’ajoutent des acides aminés que les cellules ne sont pas capables de synthétiser in vitro comme la glutamine, la tyrosine, la cystéine, l’arginine et l’histidine mais indispensables à la synthèse protéique ; X des vitamines dont huit sont indispensables comme la choline, l’acide folique, l’inositol, la thiamine l’acide nicotinique, l’acide panthoténique, le pyridoxal et la riboflavine; elles jouent le rôle de précurseurs lors de la synthèse de certaines molécules ; X des sucres comme le glucose mais parfois comme le galactose, le mannose ou le fructose; ils sont à la fois sources de carbone pour les synthèses et d’énergie lorsqu’ils sont dégradés (catabolisme) ; X des antibiotiques en concentration adéquate ; X un indicateur coloré de pH comme le rouge de phénol afin de visualiser ses éventuelles variations lors des cultures dans la mesure où sa zone de virage est voisine de 7 ; X un système tampon (bicarbonate de sodium et dioxyde de carbone apporté sous forme de gaz dans l’étuve ou utilisation d’un tampon organique comme l’HEPES) qui va permettre de réguler le pH.

Le sérum Dans les milieux synthétiques de base décrits précédemment, la plupart des cellules ne peuvent que survivre. Pour déclencher la division cellulaire, il faut fournir un sérum contenant des facteurs mitogènes. Pour cela, on utilise des sérums d’origine humaine ou animale, en général, prélevés sur des individus jeunes. Le plus fréquemment utilisé est le sérum de veau fœtal (SVF). La quantité de sérum additionné au milieu de base varie, selon le type cellulaire, il est compris entre 2 et 20 %, mais le plus souvent il est de l’ordre de 5 à 10 %. Ce sérum apporte des facteurs de croissance et des hormones, des facteurs d’attachement afin de favoriser l’adhérence des cellules

442

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

essentielle au démarrage de la culture car indispensable à la division cellulaire. Il présente des propriétés nutritives en apportant de nombreux métabolites en particulier des lipides et des oligo-éléments. Son pouvoir tampon complète celui du milieu de base. Toutefois il présente certains inconvénients car sa composition n’est pas définie et varie suivant les lots. Il peut être contaminé par des virus, des toxines ou des prions ; enfin il favorise souvent le de développement préférentiel des fibroblastes. Tableau 19.2 - Composition de certains milieux de culture couramment utilisés pour les cellules animales Composants [mg/L]

Eagle

Ham F12

Dulbecco

RPMI 1640

L-arginine HCl

126

211

84

200

L-cystéine

24

35,12

Acides aminés 50

L-glutamine

292

145

584

L-histidine HCl, H2O

42,0

20,96

42

15

L-isoleucine

52,0

3,94

105

50

L-leucine

52,0

13,10

105

50

L-lysine HCl

73,1

36,5

146

20

L-méthionine

15,0

4,48

30

15

L-phénylalanine

33,0

4,96

66

15

L-thréonine

48,0

11,9

95

20

L-tryptophane

10,0

2,04

16

5

L-tyrosine

36,0

5,4

103

20

L-valine

47,0

11,7

94

20

L-alanine

—

8,9

—

L-asparagine

—

15,01

50 20

L-acide aspartique

—

13,3

L-acide glutamique

—

14,7

L-glycocolle

—

7,5

30

10

L-proline

—

34,5

20

L-sérine

—

10,5

—

L-cystine 2HCl

—

—

62,6

—

Hydroxyproline

—

—

—

20

1,00

0,48

4,00

0,25

Vitamines D-panthoténate de Ca Chlorure de choline

1,00

13,96

4

3,00

Acide folique

1,00

1,3

4

1,00

Inositol

1,00

18

7

35,00

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES Composants [mg/L] Nicotinamide

443

Eagle

Ham F12

Dulbecco

RPMI 1640

1,00

0,04

—

3,00

Niacinamide

—

—

—

4,00

Pyridoxal HCl

1,00

0,062

4

1,00

Riboflavine

2,00

0,038

0,4

0,20

Thiamine HCl

1,00

0,34

4

1,00

Biotine

—

0,0073

—

0,20

Cobalamine

—

1,36

—

—

Pyridoxine HCl

—

0,062

—

—

Acide para amino-benzoïque

—

—

—

1,00

Vitamine B12

—

—

—

0,005

Minéraux CaCl2

200

44

200

200

,$M

400

223

400

400

Ca(NO3)2

—

—

—

100

.H404,7 H2O

200

268

150

100

NaCl

6800

7599

6400

6000

NaHCO3

2200

1176

—

2000

NaH2PO4, H2O

140

0268

150

800

.H$M2, 6H2O

—

122

—

—

CuSO4, 5H2O

—

0,0024

—

—

FeSO4, 7H2O

—

0,834

—

—

ZnSO4, 7H2O

—

0,863

—

—

Fe(NO3)3, 9H2O

—

—

0,1

—

1000

1802

1000

2000

Acide lipoïque

—

0,21

—

—

Autres composants D-glucose Pyruvate de Na

—

110

110

—

Glutathione

—

—

—

1

Hypoxanthine

—

4,1

—

—

Thymidine

—

0,084

—

—

Putrescine HCl

—

0,161

—

—

Acide linoléique

—

0,73

—

—

Rouge de phénol

0,01

15

5

CO2, gazeux

5%

10 %

pH

7,4

444

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

Milieux définis sans sérum Ce sont des milieux dans lesquels le sérum est remplacé par des facteurs de croissance dont l’apport est contrôlé. Au milieu de base on peut ainsi ajouter : X des hormones comme de l’insuline (entre  5 et  10 μg/mL), de l’hydrocortisone, de la progestérone… ; X des facteurs de croissance qui vont jouer le rôle de médiateurs chimiques locaux. Leur action sur les cellules correspond à la formation d’un complexe spécifique avec un récepteur qui aboutit soit à une augmentation de la taille de la cellule, soit à une augmentation de la population cellulaire, soit à une induction ou un blocage d’une des étapes de différenciation. Les facteurs de croissance sont des polypeptides actuellement produits par recombinaison comme l’EGF (acronyme de Epidermal Growth Factor = facteur de croissance épidermique), FGF (Fibroblast Growth Factor = facteur de croissance des fibroplastes), NGF (Nerve Growth Factor = facteur de croissance des nerfs), PDGF (Plateled-Derivated Growth Factor = facteurs de croissance des cellules endothéliales d’origine plaquettaire), TGF (Transforming Growth Factor = facteur de croissance de transformation)… ; X des facteurs d’attachement (ou facteurs d’adhérence) qui favorisent l’adhésion et l’étalement des cellules sur le support, qu’il s’agisse de verre, de plastique ou de microporteurs (microbilles en plastique recouvertes ou non de support physiologique comme le collagène). La majorité des cellules adhérentes ne se fixent pas directement sur leur support mais sur des protéines elles-mêmes adsorbées sur celui-ci. Ces protéines sont sécrétées par les cellules ou apportées par le sérum. En complément, des facteurs d’attachement peuvent être dissous dans le milieu de culture comme la poly-lysine qui amplifie l’interaction électrostatique entre les ions négatifs de la membrane cellulaire et les ions positifs de la surface cellulaire ; le collagène, une glycoprotéine fibreuse structurale très abondante qui lie les cellules de notre corps (comme une sorte de colle) et qui est sécrétée par les cellules des tissus conjonctifs. La fibronectine glycoprotéine qui contribue à l’organisation de la matrice extracellulaire et à l’adhésion cellulaire; Les laminines correspondant à une famille de glycoprotéines secrétées par les cellules épithéliales et qui forment le constituant majeur de la lame basale, (un assemblage de protéines et glycoprotéines extracellulaires sur lequel reposent les cellules épithéliales). La gélatine (voir chap. 12 Gélatine), enfin, que l’on obtient par ébullition prolongée de la peau des animaux, de leurs os et des tissus conjonctifs ; utilisée comme agent collant, elle est constituée à 99 % de protéines ; X des protéines de transport comme l’albumine sérique bovine (ASB ou SAB, acronyme anglais) apportée à une concentration maximale de 5 g/L, mais souvent de l’ordre de 0,1 à 1 g/L. En plus d’être le transporteur de substances lipophiles (acides gras, éléments de trace, hormones et vitamines liposolubles), elle intervient aussi dans la détoxification du milieu (transport de H2O2, fixation de toxines). La SAB peut être remplacée par le PEG-20000, ou le TWEEN 85. La transferrine est utilisée en concentration de  1 à  100 mg/L. Son principal rôle est le transport du fer (d’où son nom), mais elle peut également jouer un rôle de détoxifiant pour d’autres métaux. Enfin, la transferrine peut être remplacée par du fer (Fe2+ ou Fe3+), complexé par le citrate, la glycylglycine ou d’autres acides organiques ;

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

445

X des

antioxydants dont le rôle est essentiel lors de cultures menées en milieu sans sérum car ils inactivent les peroxydes générés lors de la croissance cellulaire. Pour cela, PO
VUJMJTF
EV
NFSDBQUPÏUIBOPM
FOWJSPO

Ʌ.


EV
/B2SeO3

Ë

O.
MF
TÏMÏOJVN
FTU
essentiel à l’activité de la glutathion peroxydase), du glutathion, des vitamines E et C, du pyruvate… ; X des substances lipidiques qui sont essentielles pour les cellules car elles contiennent les précurseurs de la synthèse des prostaglandines et sont incorporées après d’éventuelles NPEJöDBUJPOT
EBOT
MFT
NFNCSBOFT
DFMMVMBJSFT
-ÏUIBOPMBNJOF

Ë

Ʌ.
FTU
QSÏTFOUF
dans la formulation de la plupart des milieux. Il existe une longue liste d’acides gras, plus ou moins saturés, qui sont indispensables au développement de certaines lignées cellulaires comme l’acide lipoïque, l’acide linoléique… ; X des facteurs divers comme des métaux à l’état de trace, exemple le sélénium, composant de l’enzyme glutathion peroxydase qui intervient dans la dégradation des peroxydes toxiques métabolisés par la cellule au cours de la culture. La putrescine qui est le produit de la décarboxylation de l’ornithine par l’ornithine décarboxylase. C’est une diamine. Les polyamines ajoutées aux cellules en culture induisent la synthèse d’une protéine qui inhibe l’ornithine décarboxylase. L’acide ascorbique ou vitamine C qui joue un rôle important dans le maintien du potentiel d’oxydoréduction. Des précurseurs des acides nucléiques comme la thymine, l’uridine, adénosine. La réelle utilité de ces molécules reste douteuse car les cellules sont en général capables de synthétiser ces précurseurs d’acides nucléiques à partir de vitamines comme l’acide folique. X des substances mal définies comme les peptones…, sont utilisées pour améliorer les milieux car elles apportent des acides aminés, des acides gras, des sels, des oligopeptides… L’avantage est qu’un milieu sans sérum contenant ces substances peut être plus efficace qu’un milieu sans ces ajouts. L’inconvénient est qu’un milieu amélioré par ces substances n’est plus un milieu défini. Si les avantages d’un milieu défini sans ajout de sérum sont évidents (qualité constante, reproductibilité garantie, environnement cellulaire parfaitement défini…) ; il est par contre nécessaire de définir un milieu spécifique pour chaque type cellulaire mis en culture et pour chaque application.

19.3.1.2. CONDITIONS DE CULTURE Le maintien d’un environnement physiologique satisfaisant suppose également la détermination d’une température d’incubation correcte (37 °C), d’une concentration équilibrée d’ions inorganiques, d’un pH et d’une osmolarité adaptés, l’utilisation d’un système tampon adéquat et d’une atmosphère humide où les pressions partielles en oxygène et en dioxyde de carbone sont maintenues à des valeurs optimisées et non-toxiques. Dans la mesure où les cellules animales en culture sont aérobies il est nécessaire de leur apporter de l’oxygène. Ainsi dans les bioréacteurs il est indispensable d’injecter en permanence de l’air comprimé dans l’enceinte; dans les flacons on doit légèrement dévisser les bouchons afin d’éviter l’anoxie et éviter une trop grande épaisseur de milieu au-dessus du tapis cellulaire car l’oxygène diffuse faiblement dans le milieu. De la même façon on doit réguler la température et la maintenir à une valeur correspondant aux conditions

446

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

optimales du système cellulaire cultivé. Dans les cytoculteurs on maintient automatiquement une densité cellulaire adaptée, un environnement gazeux constant ainsi qu’un apport continu de milieux frais en remplacement du milieu usagé. Le pH doit être régulé soit en plaçant un système tampon dans le milieu, soit en apportant du CO2 dans l’atmosphère de l’étuve (étuve à CO2) ou par injection dans le bioréacteur. Cet apport de CO2 maintient l’efficacité du système tampon bicarbonate de sodium/dioxyde de carbone gazeux en le régénérant. On peut aussi placer dans le milieu de l’HEPES, molécule organique dont le groupement fonctionnel est capable de capter ou de libérer des QSPUPOT
FO
NBJOUFOBOU
MF
Q)
BVUPVS
EF
TPO
Q,B
  
&O
DPNQMÏNFOU
MB
QSÏTFODF
EBOT
MF
milieu d’un indicateur coloré de pH, le rouge de phénol permet de suivre grossièrement MFT
WBSJBUJPOT
EF
Q)
EF
MB
DVMUVSF
BWFD
VO
Q,B
WPJTJO
EF

JM
FTU
KBVOF
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MF
NJMJFV
FTU
acide et violet lorsque le milieu est alcalin ; à pH 7 il donne une coloration rouge-orangée au milieu qui doit se maintenir tout au long de la culture.

19.3.2. SYSTÈMES DE CULTURE CELLULAIRE INDUSTRIELLE À l’échelle du laboratoire, la plupart des études sur la culture des cellules de mammifères sont réalisées dans de petits systèmes, boîtes de Pétri, plaques multi-puits, flacons agités… de 1 à 100 mL, avec ou sans contrôle des paramètres de culture. À l’échelle industrielle, la plupart des protéines biopharmaceutiques dérivées de culture de cellules sont produites dans les bioréacteurs à cuves agitées opérant selon trois principaux modes : discontinu non-alimenté (batch), discontinu alimenté (fed-batch) ou continu (fig. 19.1). Les paramètres stabilisés peuvent être, selon le procédé, la densité cellulaire, le pH, la température, la pression partielle d’oxygène et la composition du milieu. X Culture discontinue non-alimentée : dans ce procédé, la culture de cellules se déroule en milieu fermé, jusqu’à l’épuisement d’un des substrats (par exemple carboné). Ce procédé est relativement simple à mettre en œuvre, mais exige de grands volumes de culture (10-20 m3) afin de compenser les densités cellulaires relativement basses qui sont atteintes. Habituellement, la densité des cellules en suspension dans la culture se stabilise entre 106 et 107 cellules/mL. Lorsque le taux de croissance diminue, on relance après lavage de l’enceinte un nouveau cycle de culture. Dans ce genre de culture, l’agitation ou le brassage du réacteur est capitale afin d’assurer une bonne homogénéisation et une aération suffisante et ainsi de permettre une meilleure croissance. X Culture discontinue alimentée : il s’agit d’une variante de culture discontinue où l'on alimente le réacteur à l’aide d’un petit volume d’une solution contenant certains nutriments limitants, à un stade précis du cycle cellulaire, de manière à augmenter la production de biomasse et à supprimer les effets de répression par le substrat. L’approvisionnement en nutriments est défini pour assurer un taux de croissance satisfaisant tout en maintenant un volume de culture constant. X Culture continue ou en perfusion : ce procédé s’applique aux cultures de cellules en suspension. L’alimentation en milieu nutritif neuf et le soutirage des produits du bioréacteur se font continuellement à débit régulier de manière à conserver un volume constant et à maintenir un taux de croissance optimal des cellules permettant une

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

447

production maximale de métabolites. Après récupération des métabolites, les cellules soutirées sont réintroduites dans le réacteur. Des densités cellulaires très élevées (c’est-à-dire 107 à 108 cellules/mL) peuvent être atteintes dans les cultures en perfusion. Par conséquent, la productivité des systèmes de cultures en continu peut être plus de 10 fois plus importante que la productivité d’un bioréacteur comparable fonctionnant en mode discontinu alimenté. En d’autres termes, une culture en perfusion de 2 m3 serait équivalente à une culture en mode discontinu alimenté de 20 m3. L’inconvénient d’un tel système est sa complexité et la difficulté de sa mise en œuvre. agitation

alimentation en milieu nutritif

cuve du bioréacteur

aération

a

b récupération des cellules

milieu frais

séparation des cellules

milieu clarifié + produit milieu de culture avec cellules et produits c

Figure 19.1 - Représentation schématique des différents types de bioréacteurs agités classiques pour la culture de cellules animales en suspension a : culture en mode discontinu non-alimenté. Aucune addition de solution nutritive au milieu durant le cycle de culture ; b : culture en mode discontinu alimenté. Un milieu nutritif concentré est fourni au système sans aucun prélèvement du milieu de culture ; c : culture en mode continu. Au fur et à mesure du soutirage, du milieu nutritif frais est fourni au bioréacteur avec le même débit.

448

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

19.3.3. IMMORTALISATION DES CELLULES Les cellules animales sont sujettes à un processus naturel de vieillissement inhérent à la cellule et ne sont capables de se multiplier in vitro que pendant un nombre défini de divisions cellulaires. Cette forme d’arrêt irréversible de la croissance cellulaire est connue sous le nom de sénescence cellulaire. Le nombre de doublements de population que peut effectuer une culture de cellules humaines avant d’entrer dans la phase de sénescence dépend de l’âge du donneur et de la durée de vie maximale des cellules du tissu utilisé. Par exemple, les fibroblastes embryonnaires diploïdes humains normaux se développent en culture et doublent leur nombre approximativement 50 fois (± 10) puis meurent. Les cellules de personnes plus âgées de même que celles d’animaux à durée de vie courte comme les souris subissent un plus petit nombre de doublement avant leur mort (14 à 28). Expérimentalement, il est possible de faire acquérir à ces cellules la capacité de proliférer indéfiniment in vitro tout en conservant en culture la plupart des caractères génotypiques et phénotypiques des cellules initiales. Ce processus, proche de la tumorigenèse que l’on retrouve pour certains cancers, est connu sous le nom d’immortalisation des cellules. Elle est réalisée, le plus souvent, par transformation d’une culture primaire, soit à l’aide d’un virus (EBV, rougeole, SV40, rétrovirus, adénovirus, virus du sarcome de Rous, virus d’Epstein-Barr), soit par des oncogènes (ras essentiellement) ou encore par un produit chimique, tel un agent mutagène (nitrosoguanidine, méthanesulfonate d’éthyl…). Dans les cancers, cette immortalisation est secondaire à une activité anormalement élevée d’une enzyme, la télomérase, qui bloque le vieillissement et la mort programmée des cellules.

19.4. AMÉLIORATION DE LA PRODUCTION

DE MÉTABOLITES SECONDAIRES CHEZ LES PLANTES

Généralement, la difficulté majeure dans l’utilisation des cultures cellulaires pour la production de métabolites secondaires est le manque de connaissances fondamentales sur leurs voies de biosynthèse et sur les mécanismes régulant leur accumulation. Diverses techniques sont néanmoins utilisées pour augmenter les quantités de métabolites secondaires produites par les cultures cellulaires.

19.4.1. CRIBLAGE ET SÉLECTION DE LIGNÉES CELLULAIRES HAUTEMENT PRODUCTRICES

La sélection d’une lignée cellulaire commence par le choix d’une plante mère caractérisée par une haute teneur en métabolite désiré, en vue de produire des cals de cellules hautement productrices. Un criblage ultérieur de la population hétérogène des clones cellulaires obtenus permet de sélectionner les meilleurs. Les techniques de mutation sont parfois utilisées pour obtenir des lignées hyperproductrices.

19.4.2. OPTIMISATION DE LA CROISSANCE L’optimisation de la croissance par modification de la composition du milieu et/ou des conditions de culture (température, lumière, pH, agitation et aération) est la démarche

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

449

la plus classique. Les éléments du milieu les plus étudiés sont les glucides (source de carbone), les nitrates et/ou l’ammoniaque (sources d’azote), les phosphates, les régulateurs de croissance… Il semble maintenant bien établi que le statut nutritionnel des cellules est le facteur déterminant de leur capacité à produire des métabolites secondaires. Par ailleurs, les cellules végétales peuvent accumuler des quantités plus ou moins importantes de nutriments (nitrate, phosphate, carbone…) dans leurs vacuoles. Ces stocks cellulaires sont susceptibles de tamponner voire de contrer l’effet d’une modification du milieu de culture sur la biosynthèse de métabolites secondaires. Le contrôle des concentrations intracellulaires en nutriments pourrait donc être la clé conduisant à une meilleure gestion des cultures de cellules. La modulation du statut nutritionnel des cellules peut se faire, par exemple, par une limitation de l’apport en nutriments en vue de ralentir la division cellulaire tout en faisant des ajouts ciblés pour « ravitailler » les réserves cellulaires. Cependant, cet aspect est souvent difficile à maîtriser car les métabolismes primaire et secondaire se partagent les mêmes ressources carbonées.

19.4.3. UTILISATION DE PRÉCURSEURS L’approvisionnement des cultures cellulaires en précurseurs est une approche couramment utilisée pour augmenter la production de métabolites secondaires dans les cultures de cellules végétales. Ce concept est basé sur l’idée que l’addition de tout composé, qui est un intermédiaire, dans ou au début d’une voie biosynthétique de métabolites secondaires, est susceptible d’augmenter le rendement en produits finis. Cette stratégie a souvent aboutit aux résultats attendus. Par exemple, l’addition de phénylalanine (précurseur des composés aromatiques) conduit à l’amélioration du rendement en acide rosmarinique chez les cultures de cellules de Coleus blumei et de Salvia officinalis. Dans ce dernier cas, elle diminue également le temps de production. La phénylalanine est également le précurseur de la chaîne latérale de N-benzoylphénylisosérine du taxol, et la supplémentation des cultures de cellules de Taxus cuspidata avec cet acide aminé conduit à un plus grand rendement en taxol. L’ajout de l’acide férulique aux cultures cellulaires de Vanilla planifolia se traduit par une augmentation de l’accumulation de vanilline. De même, la synthèse des anthocyanines par des cultures de cellules de carotte est améliorée par l’addition de dihydroquercétine. L’addition de la leucine augmente la production des monoterpènes volatils α- et β-pinène dans les cultures cellulaires de Perilla frutescens, tandis que l’addition du géraniol aux cultures de cellules de rosier conduit à l’accumulation du nérol et du citronellol.

19.4.4. ÉLICITATION Parmi les techniques utilisées pour améliorer la productivité de métabolites secondaires par des cultures de cellules végétales, l’élicitation est très probablement celle qui est la plus efficace. Elle consiste à induire la production des métabolites par des molécules ou des traitements appelés éliciteurs. La plupart des métabolites secondaires sont associés à des mécanismes de défense contre les agents pathogènes ou à la réponse de la plante aux blessures. Bien que, nos connaissances actuelles sur le mode de l’action des éliciteurs soient liées presque exclusivement au métabolisme secondaire, il a été démontré que le

450

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

métabolisme primaire peut également être affecté par l’élicitation. L’usage d’eliciteurs en culture traditionnelle vise généralement à imiter la réponse des plantes aux agressions. Les éliciteurs appartiennent à différentes classes de familles chimiques, n’ayant généralement aucune parenté structurale commune et sans effet spécifique comparable vis-àvis de plantes différentes. Les composés qui peuvent avoir un effet positif sur certaines plantes peuvent ne pas être actifs sur d’autres bien que différentes espèces végétales peuvent être sensibles au même éliciteur. Ces faits suggèrent que les cellules végétales ont la capacité de reconnaître les signaux d’un certain nombre de molécules structurellement distinctes ce qui pourrait s’expliquer par l’existence de récepteurs spécifiques pour chaque classe d’éliciteur. Les éliciteurs peuvent être : X biotiques (glycoprotéines, polysaccharides, acides organiques de faible poids moléculaires, extraits cellulaires fongiques, bactériens, de levures ou d’algues…), X abiotiques (irradiation UV, froid, choc osmotique, sels de métaux lourds, produits chimiques…). Les éliciteurs peuvent affecter le métabolisme secondaire des cellules végétales en modulant les taux de biosynthèse, de l’accumulation vacuolaire et de la dégradation. L’intensité de la réponse, variable selon les espèces, est fortement dépendante de la concentration de l’éliciteur. Un éliciteur donné peut exercer un effet stimulateur sur certaines espèces et être exempt d’activité sur d’autres, ce qui reflète l’existence de différentes susceptibilités au niveau des composants moléculaires impliqués dans l’élicitation. L’élicitation peut ainsi induire ou augmenter les activités des enzymes essentielles de la voie de biosynthèse visée. La production du métabolite recherché peut-être alors fortement augmentée (d’un facteur 10 à plus de 100 dans certains cas). Ainsi, l’exposition des cultures cellulaires de Catharanthus roseus (pervenche de Madagascar) à l’acide jasmonique active, au niveau transcriptionnel, la synthèse de plusieurs alcaloïdes. L’acide jasmonique est connu pour son rôle central dans l’expression de gènes de défense chez les plantes supérieures en induisant des défenses, locales et à distance, comme la transcription de plusieurs ARNm spécifiques et de JIPs (Jasmonate Induced Proteins) incluant des inhibiteurs de protéases antinutritionnelles, des enzymes oxydatives ou diverses toxines. L’addition d’acide (pH de 5,5 à 3,5) augmente la production de certains alcaloïdes dans les cultures de cellules de lupin. De même, la qualité spectrale de l’éclairement, son intensité et sa photopériode peuvent affecter significativement les cultures cellulaires. Plusieurs travaux ont démontré les effets stimulateurs de l’éclairement sur la formation de composés comme les anthocyanines, la vindoline, la catharanthine, la caféine… dans des cultures cellulaires en milieu liquide.

19.4.5. IMMOBILISATION DE CELLULES L’immobilisation des cellules par leur encapsulation dans une matrice de polymère comme le gel d’alginate de calcium est communément employé dans ce cas, en raison de sa simplicité d’utilisation et de son innocuité. Les autres gels utilisés sont l’agarose, la

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

451

gélatine, les carraghénanes, la mousse de polyuréthane et le polyacrylamide. L’encapsulation ne doit pas empêcher la libération du produit dans le milieu.

19.4.6. PERMÉABILISATION DES MEMBRANES La perméabilisation des membranes cellulaires facilite la sortie des métabolites secondaires. Souvent, les produits formés s’accumulent dans les vacuoles. Pour les libérer, deux barrières membranaires doivent être rompues, le tonoplaste et la membrane plasmique. Les techniques utilisées peuvent être : solvants organiques (isopropanol, diméthylsulfoxide), polysaccharides (chitosanes), X physiques : traitement aux ultrasons, électroporation… X chimiques :

19.4.7. STRESS OSMOTIQUE Sous l’effet de la pression osmotique, la physiologie de la plante est profondément modifiée. L’une des manifestations les plus frappantes de cet effet est l’induction du métabolisme secondaire afin de produire des molécules osmotiquement actives dans les cellules. Dans la pratique, cet effet est obtenu par l’addition, dans le milieu de culture d’agents osmotiques, comme des substances glucidiques (saccharose, mannitol ou sorbitol) ou non-glucidiques (polyéthylène glycol).

19.4.8. GÉNIE MÉTABOLIQUE Le génie métabolique peut être défini comme la réorientation ou la modulation d’une voie métabolique afin d’augmenter la concentration d’un composé préexistant naturellement ou d’induire l’accumulation d’un nouveau produit. L’objectif visé est de produire des composés valorisables à une échelle économiquement intéressante. Par exemple, dans le cas de l’augmentation de l’accumulation du métabolite D, illustré par la figure 19.2, plusieurs possibilités peuvent être envisagées : X augmentation de la production des précurseurs de métabolites (ex. A ou B ou C), X augmentation de l’activité des enzymes clés qui catalysent des étapes limitantes dans une voie métabolique (ex. E1), X induction de l’expression de gènes liés aux métabolites, X blocage des voies compétitives (qui utilisent les mêmes produits intermédiaires) (ex. C à F), X blocage du catabolisme du métabolite désiré pour permettre son accumulation (ex. D à E). métabolite recherché D A

E1

B

E

C F

Figure 19.2 - Stratégie de surproduction d’un métabolite par génie métabolique

452

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

Ces deux dernières méthodes utilisent notamment la technique de l’ARN antisens. Il s’agit d’un ARN complémentaire d’une portion d’un autre ARN et inhibant son expression c'està-dire sa traduction en une protéine. Cette technique affecte seulement le caractère ciblé, alors que les techniques de sélections classiques sont souvent accompagnées d’autres effets indésirables.

19.5. APPLICATIONS ET PERSPECTIVES À l’origine, la culture in vitro de cellules animales a été utilisée pour évaluer la toxicité de certains médicaments. Les améliorations apportées à la technique, aux milieux et aux équipements ont été telles que la culture in vitro est devenue une technique de routine pour produire des systèmes cellulaires modèles utilisés par des biologistes de toutes disciplines : biologie cellulaire, biochimie, enzymologie et physiologie.

19.5.1. BIOLOGIE CELLULAIRE ET BIOCHIMIE C’est ainsi que la culture in vitro a permis de déterminer les besoins spécifiques des différents types de cellules en acides aminés ou en vitamines ainsi que pour élucider la nature des composés nécessaires à la multiplication cellulaire. La culture in vitro constitue donc un outil efficace pour l’étude fondamentale des mécanismes de biosynthèse. Elle est aussi d’une grande utilité pour la compréhension des interactions entre cellules et agents pathogènes. Elle offre un outil de choix pour la recherche précoce de marqueurs spécifiques utilisables dans les programmes de sélection à condition que le caractère sélectionné à l’origine du marqueur soit bien fixé dans la descendance.

19.5.2. CRIBLAGE PHARMACEUTIQUE Les cellules de mammifères font actuellement l’objet d’un intérêt croissant notamment dans le domaine du criblage pharmaceutique. Parmi les nombreuses lignées cellulaires, les cellules souches constituent pour la recherche fondamentale un outil précieux dans la compréhension des mécanismes de base comme la division, la différentiation et la physiologie de ces cellules particulières. Les cellules souches embryonnaires sont considérées comme un modèle de référence. Ces cellules ont deux caractéristiques : X la capacité d’auto-renouvellement illimité, c’est-à-dire de se reproduire longtemps sans se différencier ; X la capacité de donner naissance à des cellules progénitrices de transition, cellules dont proviennent des populations de cellules hautement différenciées (nerveuses, musculaires, hématiques…).

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

453

19.5.3. PRODUCTION DE MOLÉCULES PHARMACEUTIQUES 19.5.3.1. CELLULES ANIMALES La culture des cellules animales représente la source la plus importante pour un grand nombre de produits biopharmaceutiques. En effet, les cellules de mammifères sont le système d’expression préféré pour l’obtention de protéines recombinées à usage thérapeutique ; ceci étant du à leur capacité d’exprimer une grande variété de protéines ayant un profil de glycosylation qui ressemble à celui des protéines humaines normales. Plusieurs types de ces cellules de mammifères, comme les cellules de rein de bébé hamster (Baby Hamster Kidney
PV
#),


MFT
DFMMVMFT
EPWBJSFT
EF
IBNTUFS
DIJOPJT
Chinese Hamster Ovary ou CHO) et les cellules embryonnaires de rein humain (Human Embryonic Kidney PV
)&,
4
TF
NVMUJQMJFOU
OBUVSFMMFNFOU
MPSTRVFMMFT
TPOU
DVMUJWÏFT
FO
suspension dans un milieu approprié. En raison de ces avantages, la recherche s’oriente vers le développement de cellules animales en tant que moyen de production commerciale. La demande en protéines thérapeutiques dérivées de la culture de cellules de mammifères ne cesse de croître, car, de plus en plus, de nouveaux produits sont approuvés. Certains de ces nouveaux produits comme des anticorps monoclonaux et des récepteurs de protéines doivent être administrés à des doses élevées; ceci nécessite une forte augmentation de leur production. L’avènement de technologies basées sur ces approches a permis, à ce jour, la production à une échelle industrielle et à partir de cellules de mammifères, de plus de 30 nouveaux produits biopharmaceutiques autorisés à la mise sur le marché. Ainsi, les cellules animales sont couramment employées pour produire diverses molécules thérapeutiques : vaccins (antiviraux inactivés, atténués, sub-unitaires, recombinants), facteurs de croissance, hormones, interférons, insuline, activateurs du plasminogène, anticorps… C’est également le cas de la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphénylalanine) qui est un précurseur des catécholamines chez les animaux et qui est utilisé comme traitement de la maladie de Parkinson. Le tableau 19.3 donne quelques exemples de ces molécules. Tableau 19.3 - Exemples de produits biopharmaceutiques obtenus par culture de cellules de mammifères [d’après Langdon S.P. : Molecular Biomethods Handbook., J.M. Walker & R. Rapley eds, tableau 49.2 p. 870, 2e éd. 2008, 1124 p., Humana Press, Totowa, NJ, avec la permission de Springer Science + Business Media]

Catégorie de produit

Nom commercial

Type de culture cellulaire Application

hormone

Follistim

CHO

stérilité

hotmone lutéinisante

Luveris

CHO

stérilité

thyrotrophine-α

Thyrogen

CHO

cancer de la thyroïde

érythropoietine

Aranesp

CHO

anémie

interféron-β

Rebif

CHO

sclérose multiple

antiIgE

Xolair

CHO

asthme

α-galactosidase

Fabrazyme

CHO

maladie de Fabry

454

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

Anticorps polyclonaux et anticorps monoclonaux Un anticorps polyclonal est obtenu à partir d’un animal immunisé, habituellement d’une espèce différente de celle de la source de l’antigène. Ainsi, l’organisme humain produit des anticorps si on lui injecte l’insuline d’un animal dès lors que cette dernière possède un épitope (déterminant antigénique) dont la séquence est différente de celle de l’insuline humaine. Un anticorps polyclonal contient un mélange d’anticorps réagissant contre un antigène spécifique ; chaque anticorps identifiant un épitope ou une région différente de l’antigène. En raison des interactions multiples des anticorps polyclonaux, leur liaison à l’antigène est forte et se traduit habituellement par un précipité (in vitro). Un anticorps monoclonal est un anticorps produit artificiellement à partir d’un seul et unique clone de lymphocytes B et, donc, spécifique d’un seul épitope (déterminant antigénique) de l’antigène. X Technologie des hybridomes

Un animal peut produire plusieurs millions d’anticorps différents. Dans le corps, les lymphocytes peuvent produire beaucoup de types d’anticorps (polyclonaux) contre des antigènes. En raison de cette hétérogénéité, l’isolement d’une seule lignée unicellulaire qui produit seulement un anticorps à partir du mélange de cellules polyclonales est une tâche très délicate. La technologie d’hybridome se base sur une méthode plus simple pour produire une lignée unicellulaire de cellules polyclonales et met en œuvre la fusion de deux types de cellules génétiquement différentes : les cellules myélomateuses immortalisées (cellules tumorales du myélome) et les lymphocytes B produits par les cellules de la rate (qui ne sont pas cultivables). La fusion génère des cellules hybrides, appelées hybridomes, produisant l’anticorps monoclonal qui a été à l’origine produit par le lymphocyte B et qui est spécifique de l’antigène ayant servi à immuniser la souris. La fabrication d’hybridomes est un bon exemple d’utilisation de la culture des cellules animales en milieu liquide. Le succès clinique et commercial des anticorps monoclonaux justifie la nécessité d’une production à très grande échelle par culture de cellules de mammifères. Cela a conduit à l’expansion rapide des capacités industrielles globales, une augmentation du volume des réacteurs (jusqu’à 20 000 L) et un effort soutenu en vue d’améliorer l’efficacité du processus avec réduction concomitante des coûts de production. Actuellement, une vingtaine d’anticorps monoclonaux sont approuvés pour usage thérapeutique. La majorité de ces anticorps est produite par la technologie de l’ADN recombinant (pour le principe, voir chap. 9 Produits sanguins, section 9.4.3.1) alors que trois seulement sont des anticorps murins produits par des hybridomes. Les anticorps recombinants sont produits par des systèmes d’expression de cellules mammaliennes qui utilisent soit l’ovaire du hamster chinois (CHO), soit des lignées de cellules lymphoïdes murines. La plupart des produits utilisés dans les essais cliniques sont des anticorps entiers produits dans des systèmes de cellules mammaliennes mais quelques-uns sont des fragments d’anticorps qui peuvent être produits par des micro-organismes comme E. coli.

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

455

La productivité des cellules de mammifères a été radicalement améliorée ces dernières années de sorte que les cultures cellulaires peuvent produire des concentrations d’anticorps dépassant 5 g/L ; ce résultat provient des améliorations de la technologie de l’expression et de l’optimisation du processus, en particulier en amont, au stade de la culture cellulaire. Pour obtenir un anticorps monoclonal, on a recours aux étapes suivantes : 1. Immunisation d’une souris par injections répétées (3 à 5) d’un antigène. 2. Prélèvement de la rate de la souris après quelques semaines. Au cours de cette période, des cellules produisant des anticorps contre l’antigène sont formées en quantité suffisante dans la rate. 3. Isolement des lymphocytes B de la rate par broyage suivi d’une centrifugation sur gradient de densité. 4. Fusion des lymphocytes B avec des cellules myélomateuses en présence d’un agent fusiogène, le polyéthylène glycol (PEG) ou, mieux, à l’aide d’un champ électrique (électrofusion). Les cellules myélomateuses sont déficientes en hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT –
PV
FO
UZNJEJOF
LJOBTF
5, –) et par conséquent, incapables de synthétiser leurs nucléotides ni par la voie endogène, ni à partir des précurseurs fournis par le milieu HAT qui contient l’aminoptérine, un inhibiteur de la voie de biosynthèse des bases puriques et pyrimidiques (fig. 19.3). Les cellules myélomateuses sont employées pour la fusion parce que les lymphocytes obtenus après immunisation sont incapables de croître continuellement en culture. Par conséquent, la fusion des lymphocytes avec des cellules myélomateuses mène à l’immortalisation (durée infinie) des cellules. 5. Développement des cellules fusionnées ou hybridomes en suspension dans un milieu sélectif HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymine). Dans ce milieu, seuls les hybrides lymphocytes (HGPRT +/cellules myélomateuses HGPRT –) survivent, tandis que les cellules myélomateuses non-fusionnées meurent et les lymphocytes non-fusionnés disparaissent après quelques divisions, 6. Sélection des hybridomes sécrétant des anticorps spécifiques d’un déterminant antigénique particulier, à l’aide de techniques immuno-enzymatiques (ELISA), radio-immunologiques (RIA), immunofluorescentes… 7. Les hybridomes peuvent être : Z soit cultivées sur milieu gélosé, la production d’anticorps est alors modeste (1 g/mL), Z soit injectées dans la cavité péritoniale de souris (de lignée définie) dont le système immunitaire est rendu non-fonctionnel par injection d’un inhibiteur. La souris développe alors une tumeur d’où l’on peut prélever par ponction le liquide d’ascite (épanchement péritonéal) qui contient 2 à 10 mg/mL (soit 1000 fois plus) d’anticorps monoclonal du type dicté par les lymphocytes-B. L’avantage des ascites est qu’elles sont alimentées en permanence par l’organisme de la souris ce qui permet de prolonger la production de la culture pendant plusieurs semaines, alors que dans les milieux de culture ex vivo l’épuisement des ressources oblige à faire des repiquages fréquents.

456

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES L’avantage des ascites est qu’elles sont alimentées en permanence par l’organisme de la souris ce qui permet de prolonger la production de la culture pendant plusieurs semaines, alors que dans les milieux de culture ex vivo l’épuisement des ressources oblige à faire des repiquages fréquents. La production d’anticorps monoclonaux est aussi possible avec d’autres animaux comme le rat, le lapin, le cobaye, la chèvre, la poule… nucléotides puriques PRPP aminoptérine

×

AMP

IMP

ATP

GMP

GTP

HGPRT adénine

hypoxanthine

guanine

PRPP = α-5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate ATP = adénosine triphosphate AMP = adénosine monophosphate IMP = inosine monophosphate GMP = guanosine monophosphate GTP = guanosine triphosphate HGPRT = hypoxanthine-guanidine - phosphoribosyl transférase nucléotides pyrimidiques CAP aminoptérine TTP

TMP

×

UMP

UTP

CTP

TK thymidine

uridine

CAP = carbamyl phosphate TTP = thymidine triphosphate TMP = thymidine monophosphate UMP = uridine monophosphate UTP = uridine triphosphate CTP = cytidine triphosphate CMP = cytidine monophosphate TK = thymidine kinase

CMP

cytidine

Figure 19.3 - Voies de biosynthèse des nucléotides X Importances médicale et biologique Z Les anticorps monoclonaux sont employés pour identifier des quantités infimes d’an-

tigène dans le corps grâce à leur haut degré de spécificité. Z élimination de certaines toxines de la circulation sanguine en employant des anticorps monoclonaux.

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

457

Z Dans la thérapie du cancer, des anticorps

monoclonaux sont utilisés pour transporter une substance cytotoxique destinée à neutraliser des cellules cancéreuses, sans nuire aux autres cellules saines du corps. Z En imagerie médicale, des anticorps monoclonaux marqués à l’aide de molécules fluorescentes, sont aussi utilisés pour localiser des cellules cancéreuses. Z Des anticorps monoclonaux sont employés pour purifier des enzymes. Z Ils sont employés dans l’isolement d’antigènes spécifiques à partir d’un mélange de protéines. Z Ils sont utilisés dans le diagnostic immunologique de la présence d’agents infectieux dans le corps humain. Z Enfin, ils peuvent être employés en hématologie pour la détermination de groupes sanguins particuliers.

19.5.3.2. CELLULES VÉGÉTALES Les plantes produisent une grande diversité de métabolites secondaires pour leur défense et leur survie. Le nombre de ces métabolites dépasse actuellement 30 000 substances identifiées. À l’échelle mondiale, plus de 120 médicaments prescrits actuellement sont des dérivés de plantes. Beaucoup de ces substances sont difficiles, sinon impossibles à synthétiser chimiquement, ou difficiles à produire. Il est aussi souvent difficile d’augmenter les quantités produites par les micro-organismes par les techniques de génie génétique. Les cellules végétales sont biosynthétiquement totipotentes ce qui signifie que chaque cellule est capable d’exprimer l’information génétique qu’elle contient, ce qui lui permet théoriquement de produire toute la gamme de produits rencontrés chez la plante mère. Elles peuvent donc, dans certaines conditions de culture in vitro, synthétiser des métabolites secondaires et constituer alors une alternative à la synthèse chimique ou à l’extraction à partir de la plante entière de certains produits. Les avantages de cette biotechnologie par rapport à la production agricole conventionnelle sont les suivants : X la culture in vitro de cellules végétales n’est pas dépendante des conditions de l’environnement et des variations saisonnières naturelles ; X les cellules peuvent proliférer à des vitesses de croissance plus grandes que les plantes entières en culture ; X la possibilité de produire des composés nouveaux qui n’existent pas normalement chez la plante mère ; X la cellule végétale peut exécuter des biotransformations stéréo- et régio-spécifiques pour la production de composés nouveaux à partir de précurseurs abondants et bon marché. Parmi les produits les plus prescrits figurent des molécules complexes dont des stéroïdes, des analgésiques, des molécules cardiotoniques, des produits antiinfectieux et anticancéreux… Les tableaux 19.3 et 19.4 donnent quelques exemples de substances produites par cette voie, avec des rendements souvent plus intéressants que ceux obtenus par la culture conventionnelle.

458

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES Tableau 19.4 - Produits obtenus par culture de cellules végétales pour des applications industrielles ou pharmaceutiques

Produit

Utilisation

Espèce végétale

acide rosmarinique

BOUJPYZEBOU
t
ÏQJDF

Digitalis lanata
t
Coleus blumei
t
Anchusa officinalis
t
Lithospermum erythrorhizon

anthocyanines

WFJOPUPOJRVFT
t
BOUJPYZEBOUT
Vitis vinifera t
Daucus carota colorants

atropine

parasympatholytique

Atropa belladonna

berbérine

antiseptique intestinal

Coptis japonica

bétacyanines

colorants (pharmacotechnie Chenopodium rubrum et industrie agro-alimentaire)

bétalaïnes

colorants alimentaires

Beta vulgari
t
Chenopodium rubrum

camptothécine

antitumoral

Camptotheca acuminata

capsaïcine

additif alimentaire piquant

Capsicum frutescens
t
Capsicum annuum

cardénolide

glycosides cardiotoniques

Digitalis spp.

caroténoïdes

colorants

Lycopersicon esculentum

codéine

analgésique

Papaver somniferum

crocine

colorant

Crocus sativus

digitoxine

cardiotonique

Digitalis purpurea

digoxine

cardiotonique

Coleus blumei

diosgénine

synthèse d’hormones

Discorea deltoides

L-DOPA (= L-3,4-di-hydroxyphénylalanine)

traitement de la maladie de Parkinson

Stizolobiumhassjoo
t
Mucuna pruriens

géraniol

QBSGVN
t
SÏQVMTJG
EJOTFDUF

Geranium spp.

glycyrrhizine

édulcorant

Glycyrrhiza glabra

jatrorrhizine

antimicrobien

Berberiswilsoniae

morphine

analgésique

Papaver somniferum

nicotine

insecticide

Nicotiana tabacum

péroxydase

décompose les peroxydes

Raphanus spp.

podophyllotoxine

antitumorale (antimitotique) Podophyllum peltatum

quinine

BOUJNBMBSJBM
t
BOUJQZSÏUJRVF

Cinchona ledgeriana

réserpine

cardiotonique

Rauwolfia serpentina

scopolamine

parasympatholytique

Atropa belladonna

serpentine

antihypertensive

Catharanthus roseus

shikonine

colorant

Lithospermum erythrorhizon

stévioside

édulcorant

Stevia rebaudiana

taxol et produits dérivés (taxoïdes)

antitumoraux (antimitotiques)

Taxus brevifolia
t
Taxus chinensis

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

459

Produit

Utilisation

Espèce végétale

thaumatine

édulcorant

Thaumatococcus danielli

vincristine et vinblastine antitumoraux

Catharanthus roseus

thébaine (convertie en codéine)

Papaver bracteatum

analgésique et antitussif

Les métabolites secondaires sont recherchés pour leurs activités biologiques très diverses. Ces activités comprennent des activités antibactériennes, anticancéreuses, antifongiques, antioxydantes… utilisées dans les secteurs industriels de l’agriculture, de l’alimentation et de la pharmacie. À cause de ces nombreuses utilisations, le marché global annuel des extraits végétaux et des métabolites secondaires isolés dépasse les 10 milliards de dollars américains. La valeur pharmacologique des métabolites secondaires végétaux augmente en raison des découvertes récentes et continues sur leurs rôles thérapeutiques potentiels et comme précurseurs pour le développement de nouveaux médicaments. Les métabolites secondaires, généralement de 1 à 3 % du poids sec, sont synthétisés dans des cellules spécialisées à des stades de développement distincts et ont des structures très complexes, ce qui rend leur extraction et leur purification difficiles. Le contenu en biomasse des métabolites secondaires peut maintenant être augmenté par des techniques de culture de cellules en bioréacteurs afin de faciliter une production continue à grande échelle. Les bioréacteurs sont de grandes enceintes destinées à la culture de cellules sur des milieux appropriés sous des conditions d’environnement stériles. Ils offrent également la possibilité de suivre et de contrôler les paramètres internes tels que la circulation de l’air, la lumière, la température, le pH, la teneur en oxygène dissous, la disponibilité des substances de croissance… Beaucoup de progrès ont été accomplis sur l’optimisation de ces systèmes pour la production de métabolites précieux extraits traditionnellement de plantes médicinales tels que les ginsenosides, la shikonine (fig. 19.4) et diverses substances anticancéreuses. Conduites en bioréacteur, les cultures optimisées de cellules de plantes médicinales pourraient permettre finalement à la production en masse de métabolites phytopharmaceutiques à haute valeur ajoutée. La principale difficulté dans l’obtention du paclitaxel (fig. 19.4), molécule à propriétés anticancéreuses très intéressantes, est l’approvisionnement en matières première étant donné la très faible teneur des écorces des ifs en ce principe (environ 0,01 % du poids de matière sèche) et la croissance très lente de cet arbre. L’extraction conventionnelle du paclitaxel (Taxol®) exigeait la récolte des écorces d’un arbre centenaire, l’if (Taxus brevifolia), pour obtenir 1 kg de composé actif. L’efficacité du taxol a entraîné une demande importante qui pouvait conduire à la destruction massive de cette espèce. Il existe quatre alternatives pour l’obtention du paclitaxel : l’hémisynthèse de son précurseur naturel (10-deacétylbaccatine III), la synthèse totale, la production par les moisissures ou les bactéries (Brevets américains 5561055, 1996 et 6329193, 2001) et la culture cellulaire. C’est la culture cellulaire de Taxus spp., qui est actuellement considérée comme l’alternative prometteuse et stable à long terme pour la production des taxoïdes.

460

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

O

NH

O

O

O H O OH O O

OH

O

H

OH O

OH

O O

OH paclitaxel (taxol) C(CH3)2 shikonine

OH

O

Figure 19.4 - Structures du paclitaxel et de la shikonine Le taxol est connu comme étant un « poison » du fuseau achromatique. Il se lie aux microtubules qui deviennent alors extrêmement stables et statiques, de sorte que la division cellulaire est bloquée. Il favorise la polymérisation de la tubuline en microtubules mais inhibe leur dépolymérisation. Plusieurs centaines (plus de 400) de structures différentes de taxoïdes sont connues et dont plusieurs ont montré une activité semblable ou même supérieure au paclitaxel ; d’autres peuvent s’avérer utiles comme précurseurs pour la production de paclitaxel. Certains taxanes, autres que le paclitaxel, sont à divers stades des essais cliniques. Ces dernières années ont vu de grands progrès dans la production de taxoïdes par cultures de cellules. Ainsi, la production de paclitaxel a été améliorée plus de cent fois par comparaison à ce qui avait été rapporté dans le premier brevet (U.S. patent 5019504, 1991) déposé, c’est-à-dire, d’environ 1 mg/L à plus de 100 mg/L. La possibilité de cultiver des suspensions cellulaires ou des tissus de plantes, à l’image des micro-organismes, offre de nouvelles perspectives dans la production de métabolites biologiquement intéressants spécifiques des végétaux (alcaloïdes, insecticides, enzymes, pigments, bioconversion de certains composés…). Ces applications sont actuellement largement exploitées dans les domaines agro-alimentaire ou pharmaceutique.

19.5.4. BIOTRANSFORMATIONS Un substrat exogène (d’origine naturelle ou xénobiotique) peut être biotransformé par une souche cellulaire sans qu’il y ait de relation théorique entre l’espèce végétale ayant fourni la souche et le métabolite ajouté comme substrat. Il convient donc d’effectuer un criblage préalable afin de tester, parmi les souches disponibles, la plus apte à effectuer une bioconversion.

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

461

De plus, il est possible d’orienter le métabolisme cellulaire vers la biosynthèse d’un métabolite secondaire intéressant, ou de sélectionner, parmi d’autres, les cellules capables d’effectuer cette biosynthèse efficacement. Le tableau 19.5 donne quelques exemples de produits obtenus par biotransformations de substrats naturels. Les composés synthétisés in vitro peuvent être absents de la plante entière, voire même inconnus dans le monde végétal. L’intérêt des bioconversions est qu’elles sont très spécifiques puisqu’elles concernent un composé de structure définie (stéréospécificité) et une réaction déterminée qui ne peut pas être facilement effectuée par synthèse chimique ou par tout autre moyen. Elles peuvent être de différents types : réduction, oxydation, isomérisation, hydrolyse, hydroxylation, méthylation, déméthylation, acétylation, estérification, époxydation, saponification… Tableau 19.5 - Exemples de métabolites secondaires obtenus par culture de tissus végétaux avec des rendements plus élevés que ceux obtenus avec la plante entière Rendement [g/L]

Rapport culture in vitro/plante

Coleus blumei

5,6

5-9

anthraquinones

Galium aparine Morinda citrifolia

0,43 2,5

20 8

berbérine

Coptis japonica Thalictrumminus

1,7 0,8

2,6-3,3 1000

caféine

Coffea arabica

–

92

nicotine

Nicotiana tabacum

–

2

saponines

Panax ginseng

–

6,7

shikonine

Lithospermum erythrorhizon

1,5-4

14

tripdiolide

Tryterigium wilfordii

0,004

36

ubiquinone

Nicotiana tabacum

–

173

vomilenine

Rauwolfia serpentina

0,057

51

Métabolites

Espèce végétale

acide rosmarinique

Cependant, pour qu’un processus de biotransformation soit réussi et viable, les conditions suivantes doivent être satisfaites : X la culture cellulaire doit posséder les enzymes nécessaires, X le substrat ou le précurseur ne doivent pas être toxiques pour la culture, X le substrat doit atteindre le compartiment cellulaire, siège de la réaction, X la vitesse de la formation du produit recherché doit être plus rapide que celle de sa métabolisation ultérieure. Les glycosylations, autre exemple difficilement réalisable par d’autres procédés, sont rendues possibles à l’aide de cellules végétales maintenues en culture. Par exemple, des

462

PARTIE VI - CULTURES CELLULAIRES

cellules de Stevia rebaudiana (Asteracées) réalisent la transformation du stéviol (sans goût particulier) en un glycoside, le stéviobioside dont la saveur sucrée, 300 fois supérieure à celle du saccharose, lui permet d’être utilisé comme édulcorant. De même, l’acide salicylique est glycosylé par des cultures cellulaires de Mallotus japonica (Euphorbiacées). Le nouveau composé présente une activité analgésique plus rapide que celle de l’aspirine et est mieux toléré par l’estomac. En suspension cellulaire, les précurseurs sont ajoutés directement. Les cellules végétales sont capables de réaliser des bioconversions de composés naturels ou artificiels introduits dans leur milieu de culture. Ainsi, les suspensions cellulaires de la digitale laineuse (Digitalis lanata, Scrophulariacées), immobilisées dans l’alginate, sont capables de transformer, avec un rendement élevé, la β-méthyldigitoxine (un sous-produit d’extraction) en β-méthyldigoxine (molécule douée de propriétés thérapeutiques). Ces transformations se révèlent très difficiles et onéreuses et elles sont souvent impossibles par voie chimique ou microbiologique. La digoxine est un alcaloïde très précieux dont la teneur dans les feuilles est 10 fois plus faible que celle de la digitoxine moins utile. La β-méthydigitoxine est transformée par ces cellules avec un rendement qui peut atteindre 93,5 % et la β-méthydigoxine est aussi efficace que la digoxine elle-même. Développées depuis plus de 100 ans, les cultures de cellules qu’elles soient animales ou végétales sont présentes dans de nombreux domaines d’activité dépendants de la biochimie de par les molécules à haute valeur ajoutée qu’elles permettent de produire dans des conditions de plus en plus contrôlées et de mieux en mieux maîtrisées. Différentes industries et plus particulièrement les industries pharmaceutiques et agro-alimentaires ont mis en place des dispositifs intensifs de production, essentiellement des fermenteurs permettant de cultiver des cellules en hétérotrophie. Pour les cellules autotrophes issues du monde végétal, le développement de photobioréacteurs de plus en plus performants devraient permettre prochainement le transfert au monde industriel. Dans le même temps s’est constitué au niveau d’organismes nationaux (laboratoire Origine, Structure et Evolution de la Biodiversité
EV
.VTFVN
/BUJPOBM
E)JTUPJSF
/BUVSFMMF
ou internationaux (European Collection of Cell Cultures, ECACC, affiliée à Health Protection Agency Culture Collection, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures…), des collections de lignées de cellules vivantes de toutes catégories en général cryopréservées. .JTFT
Ë
EJTQPTJUJPO
EFT
MBCPSBUPJSFT
DFT
DPMMFDUJPOT
RVJ
OF
DFTTFOU
EBVHNFOUFS
TPOU
VO
matériel de choix incontournable lors de nombreuses expérimentations et de tests in vitro. En outre, les cultures in vitro constituent un matériel de choix dans l’application de méthodes analytiques émergentes comme la métabolomique, pour l’étude du profil chimique des cellules, tissus ou organes, avec en aval, l’énorme potentiel de découverte de nouvelles molécules thérapeutiques. L’avènement de la génomique et des technologies connexes a créé un changement radical dans la conception des protocoles de recherche sur les systèmes biologiques. Les approches traditionnelles de la biochimie et de la biologie moléculaire, où les processus cellulaires étaient étudiés individuellement et souvent indépendamment les uns des autres, ont cédés la place à un concept plus global d’analyse de la composition cellulaire dans son intégralité, afin d’obtenir l’image la

19 - LES CELLULES VÉGÉTALES ET LES CELLULES ANIMALES

463

plus complète possible du métabolisme de la cellule et de ses variations spatio-temporelles. En effet, l’évolution des techniques analytiques progressent rapidement permettant des mesures simultanées, comme le criblage à haut débit de plusieurs substances, au niveau de la transcription (transcriptomique), des protéines (protéomique) et des métabolites (métabolomique). Ces développements sont nés principalement des exigences du secteur de la santé étant donné que les approches « -omiques » présentent d’énormes potentialités pour les industries pharmaceutiques mais aussi pour les industries agro-alimentaires et l’agrochimie.

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

BIBLIOGRAPHIE SOMMAIRE OUVRAGES GÉNÉRAUX Z ALAIS

C. & LINDEN G., 1997. Abrégé de biochimie alimentaire
.BTTPO
1BSJT

Q ALAIS C., LINDEN G. & MICLO L., 2004. Abrégé de biochimie alimentaire, 5e éd., Dunod, Paris, 260 p.

Z BELITZ

H.D., GROSCH W. & SCHIEBERLE P., 2009. Food chemistry, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, 1114 p.

J.L. & STRYER L., 2008. Biochemistry, 5th ed., W.H. Freeman, New York, 1050 p.

Z BERG
+.
5YMOCZKO

J., 1999. Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales, 3e éd., Tec & Doc, Paris, 1120 p.

Z BRUNETON

J.H. & DESWARTE F. Eds, 2008. Introduction to chemicals from biomass, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 184 p.

Z CLARK

V. & CHOI E., 2008. Essential guide to food additives, 3rd ed., Leatherhead Food International Ltd, Surrey, 336 p.

Z EMERTON

Z GUIGNARD Z GUIRAUD

J.L., 2006. Biochimie végétale, Dunod, Paris, 274 p.

J.P., 2003. Microbiologie alimentaire, Dunod, Paris, 696 p.

Z HELDT

H.W., 2005. Plant biochemistry, Elsevier Inc., Amsterdam, 630 p. HELDT H-W & PIECHULLA B., 2011. Plant biochemistry, 5th ed., Elsevier Inc., San Diego, 622 p.

Z LARPENT-GOURGAUD
.

4ANGLIER

J.J., 1992. Biotechnologies. Principes et méthodes,

Doin, Paris, 668 p. Z LINDEN

G. & LORIENT D., 1999. New ingredients in food processing. Biochemistry and agriculture, Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC, Boca Raton, 366 p.

Z MAROUF

A. & TREMBLIN G.

.ÏNFOUP
UFDIOJRVF
Ë
MhVTBHF
EFT
CJPMPHJTUFT
et des biochimistes, EDP Sciences, collection Grenoble Sciences, Les Ulis, 845 p.

Z .OLL
.

.OLL

N., 1998. Additifs alimentaires et auxiliaires technologiques, Dunod, Paris, 350 p.

Z NOGRADY

T. & WEAVER D.F., 2005. Medicinal chemistry-A molecular and biochemical approach, 3rd ed., Oxford University Press Inc., New York, 649 p.

Z PELMONT

J., 2008. Glossaire de biochimie environnementale, EDP Sciences, collection Grenoble Sciences, Les Ulis, 1026 p.

466

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

Z.E. Ed., 2007. Chemical and functional properties of food components, 3rd ed., Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 532 p.

Z SIKORSKI Z TSAI

C.S., 2007. Biomacromolecules, John Wiley & Sons Inc., Hoboken, 740 p.

Z VOET

D. & VOET J.G., 2011. Biochemistry, John Wiley & Sons Inc., Chichester, 1520 p.

CHAPITRE 1 - GLUCIDES Z ASADI
.

Beet-sugar handbook,

John Wiley & Sons Inc., Hoboken, 866 p.

G., FLITSCH S., ITO
:
,ONDO H., NISHIMURA S.I. & YU B. Eds, 2008. Glycoscience-chemistry and chemical biology, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2874 p.

Z COTÉ

A.C., LARSSON
,
"NDERSSON S., HYDE S.T., NESPER R. & VON SCHNERING H.G., 1987. On the structure on native starch. An analogue to the quartz structure, Starch/Stärke 39(5), 147-152.

Z ELIASSON

Z ERNST

B., HART G.W. & SINAY P. Eds, 2000. Carbohydrates in chemistry and biology, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2183 p.

Z GABIUS

H-J. Ed., 2009. The Sugar Code. Fundamentals of Glycosciences, 8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

Z HALLEY

P.J. & AVÉROUS L.R., 2014. Starch polymers. From Genetic Engineering to Green Applications, Elsevier, San Diego, 461 p. R.S., SAXENA S. & GUPTA
3

.JDSPCJBM
QFDUJOPMZUJD
FO[ZNFT
B
SFWJFX
Process Biochemistry 40, 2931-2944.

Z JAYANI Z LI

J. Ed., 2010. Functional Glycomics, Methods in Molecular Biology 600, )VNBOB
1SFTT
B
QBSU
PG
4QSJOHFS
4DJFODF #VTJOFTT
.FEJB
--$

Q

Z LOFTSSON

T. & DUCHÊNE D., 2007. Cyclodextrins and their pharmaceutical applications, International Journal of Pharmaceutics 329, 1-11.

DEL VALLE
&.

$ZDMPEFYUSJOT
BOE
UIFJS
VTFT
B
SFWJFX
Process Biochemistry 39, 1033-1046.

Z .ARTIN

Z .ERCIER

C. & COLONNA P., 1988. Starch and enzymes: innovations in the products, processes and uses, Biofutur 73, 55-58.

Z .OSHER

G. & THOMPSON D.O., 2002. Complexation and cyclodextrins, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 2nd
FE
.BSDFM
%FLLFS
*OD
/FX
:PSL


Z SZEJTLI

J. & SZENTE L., 2005. Elimination of bitter, disgusting tastes of drugs and foods by cyclodextrins, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 61, 115-125.

CHAPITRE 2 - PROTIDES Z GARY

W., 2014. Proteins: biochemistry and biotechnology, +PIO
8JMFZ

4POT
-UE
8FTU
4VTTFY
6,

Q

J., SANCHEZ-VIOQUE
3

.ALABAT C., 1999. Les protéines végétales : un réservoir de macromolécules multi-fonctionnelles, Oléagineux, Corps Gras, Lipides 6(6), 498-504.

Z GUÉGUEN

BIBLIOGRPAHIE SOMMAIRE Z REHM

467

H., 2006. Protein biochemistry and proteomics, Elsevier Inc., New York, 236 p.

Z WESTERMEIER

R., NAVEN T. & HÖPKER H.R., 2008. Proteomics in practice. A guide to successful experimental design, 2nd
FE
8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

Z WHITFORD

D., 2005. Proteins-structure and function, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 528 p.

CHAPITRE 3 - LIPIDES Z AKOH

C.C. Ed., 2006. Handbook of functional lipids, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 525 p.

D. & ALAZARD-TOUX N., 2006. Les biocarburants : état des lieux, perspectives et enjeux du développement, Editions Technip, Paris, 352 p.

Z BALLERINI

Z DEMIRBAS

A., 2009. Biofuels. Securing the planet’s future energy needs, Springer-Verlag London Ltd, London, 336 p.

Z GUNSTONE

F.D., HARWOOD J.L. & DIJKSTRA A.J., 2007. The lipid handbook, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 791 p. L.C., VIDYA SAGAR D. & NAIK S.N., 2006. Technical aspects of biodiesel production by transesterification-a review, Renewable and Sustainable Energy Reviews 10, 248-268.

Z .EHER

Z O’BRIEN

R.D., 2009. Fats and oils formulating and processing for applications, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, 744 p.

Z VANCE

D.E. & VANCE J.E., 2008. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes, 5th ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 596 p.

CHAPITRE 4 - HUILES ESSENTIELLES J., 1999. Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales, 3e éd., Tec & Doc, Paris, 1120 p.

Z BRUNETON

Z K ALOUSTIAN

J. & HADJI-MINAGLOU F., 2012. La connaissance des huiles essentielles : Qualitologie et aromathérapie, Springer-Verlag, France, Paris, 210 p.

CHAPITRE 5 - LIGNINES Z ANTEROLA
".

-EWIS

N.G., 2002. Trends in lignin modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic manipulations/mutations on lignification and vascular integrity, Phytochemistry 61(3), 221-294.

Z TSAO

G.T., 1999. Recent progress in bioconversion of lignocellulosics (Advances in biochemical engineering biotechnology), Springer-Verlag Telos, Santa Clara, 292 p.

Z VERMERRIS

W. & NICHOLSON R., 2006. Phenolic compound biochemistry, Springer, Dordrecht, 276 p.

468

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

CHAPITRE 6 - LECTINES Z NILSSON

C.L. Ed., 2007. Lectins-analytical technologies, Elsevier B.V., Amsterdam, 442 p.

Z PUSZTAI

A. & BARDOCZ S. Eds, 2005. Lectins biomedical perspectives, Taylor & Francis Ltd, London, 278 p.

DAMME
&+.
-ANNOO N. & PEUMANS W.J., 2008. Plant lectins, Advances in Botanical Research 48, 107-209.

Z VAN

CHAPITRES 7 ET 8 - SUBSTANCES ISSUES DES ALGUES Z BARSANTI

L. & GUALTIERI P., 2006. Algae: anatomy, biochemistry, and biotechnology, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 301 p. BARSANTI L. & GUALTIERI P., 2014. Algae : anatomy, biochemistry, and biotechnology, 2nd ed., Taylor & Francis Group, LLC, 326 p.

Z BOTANA

L.M. & ALFONSO A. Eds, 2015. Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry, John Wiley & Sons, Ltd., 523 p.

Z CARDOZO
,).
(UARATINI

T., BARROS
.1
'ALCÃO V.R., TONON A.P., LOPES N.P., CAMPOS S., TORRES
."
4OUZA A.O., COLEPICOLO P. & PINTO
&

.FUBCPMJUFT
GSPN
BMHBF
XJUI
economical impact, Comparative Biochemistry and Physiology 146, 60-78.

Z MOHEIMANI

N.R., MCHENRY K ARNE DE BOER M.P. & BAHRI P.A. Eds, 2015. Biomass and Biofuels from Microalgae. Advances in Engineering and Biology, Springer International Publishing Switzerland, 373 p.

Z PEREZ

R. & OLIVIER B., 1997. Ces algues qui nous entourent, conception actuelle, rôle dans la biosphère, utilisations, culture
*'3&.&3
ÏEJUJPOT
2VBF
1MPV[BOÏ

Q

Z SE-KWON

K. & K ATARZYNA C. Eds, 2015. Marine Algae Extracts. Processes, Products, and Applications
8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
#PTDITUS
8FJOIFJN
(FSNBOZ
Vol. 1 and 2, 722 p.

Z WYATT

M., 2015. Whey proteins. Functional properties, production and health benefits, Nova Science Publishers, Inc., 191 p.

CHAPITRE 9 - PRODUITS SANGUINS Z HUART

J.J. & BURNOUF T., 1992. Le fractionnement plasmatique, STP Pharma Pratiques 2, 17-24.

J., GERBER
4
,ÄMPFER U., LEJON S. & TRACHSEL C., 2008. Human blood plasma proteins-structure and function, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 526 p.

Z SCHALLER

A., ROUSSEL
#
.ACHU-PRESTAUX N., DIEVAL J., GUILLAUME N. & LEFRÈRE J.J., 2005. Le point sur les médicaments d’origine plasmatique dans le traitement des maladies hémorragiques et des maladies thrombotiques, Hématologie 11(3), 189-200.

Z VOYER

BIBLIOGRPAHIE SOMMAIRE

469

CHAPITRE 10 - PRODUITS LAITIERS Z FOX

P.F. & MCSWEENEY P.L.H., 2009. Advanced dairy chemistry, Vol. 3, 3rd ed., 4QSJOHFS
4DJFODF
#VTJOFTT
.FEJB
--$
/FX
:PSL

Q

Z HUI
:,
&E

Dairy science and technology handbook,

Vol. 1, 2 and 3, Principles and properties, Wiley-VCH Inc., New York, 1304 p. Z THOMPSON

A., BOLAND
.

4INGH H. Eds, 2009. Milk proteins: from expression to food, Academic Press, Elsevier Inc., Oxford, 535 p.

CHAPITRE 11 - OVOPRODUITS Z HUOPALAHTI

R., LÓPEZ-FANDIÑO R., ANTON
.

4CHADE R. Eds, 2007. Bioactive egg compounds, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 298 p.

Z LI-CHAN

E.C.Y., POWRIE W.D. & NAKAI S., 1995. The chemistry of eggs and egg products, In STADELMAN W.J. & COTTERILL O.J. Eds, Egg science and technology, 4th ed., Food Products Press, New York, 105-175.

Z MINE

Y. Ed., 2008. Egg bioscience and biotechnology, John Wiley & Sons Inc., Hoboken, 362 p.

Z RÉHAULT

S., ANTON
.
/AU F., GAUTRON J. & NYS Y., 2007. Les activités biologiques de l’œuf, INRA Prod. Anim. 20(4), 337-348.

Z SIM

J.S., NAKAI S. & GUENTER W. Eds, 2000. Egg nutrition and biotechnology, CABI Publishing, New York, 495 p.

Z THIS

H., 2008. L’œuf dur : un festin de réactions chimiques, L’Act. Chim. 316, 5.

CHAPITRE 12 - GÉLATINE Z EUN

J.B., SHON J., EO J.H. & JO S.H., 2011. Utilization of Gelatin and Collagen Extracted from Skate (Raja Kenojei) Skin, Nova Science Publishers Inc., 70 p.

Z FRATZL

P. Ed., 2008. Collagen. Structure and Mechanics, 4QSJOHFS
4DJFODF #VTJOFTT
.FEJB
--$

Q

Z SCHRIEBER

R. & GAREIS H., 2007. Gelatine Handbook Theory and Industrial Practice, 8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

CHAPITRES 13, 14 ET 15 - SUBSTANCES D'ORIGINE MICROBIENNE Z ANUPAMA

A. & RAVINDRA P., 2000. Value-added food: single cell protein, Biotechnology Advances 18, 459-479.

Z AVÉROUS

L., 2008. Polylactic Acid: Synthesis, Properties and Applications, In BELGACEM M.N. & GANDINI A., Monomers, Polymers and Composites from Renewable Resources, Oxford, Elsevier, 433-451.

470

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

Z BHUBALAN

K., LEE W. H. & SUDESH K., 2011. Polyhydroxyalkanoate, In DOMB A., KUMAR N. & EZRA A., Biodegradable Polymers in Clinical Use and Clinical Development Hoboken, John Wiley & Sons, 249-317.

Z CHEN

H., 2014. Biotechnology of Lignocellulose. Theory and Practice, 4QSJOHFS
4DJFODF #VTJOFTT
.FEJB
%PSESFDIU

Q

Z COURVALIN

P., 2008. La résistance des bactéries aux antibiotiques: combinaisons de mécanismes biochimiques et génétiques, Bull. Acad. Vét. France, tome 161(1), 7-12.

Z DUBLANCHET

A., 2009. Des virus pour combattre les infections. La phagothérapie : renouveau d’un traitement au secours des antibiotiques, Favre SA Editions, Lausanne, 237 p.

Z GAMA

M., GATENHOLM P. & KLEMM D., 2014. Bacterial NanoCellulose. A Sophisticated Multifunctional Material, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 263 p.

Z MCCARTHY

S.P., 2003. Biodegradable Polymers, In ANDRADY, A.L., Plastics and the Environment, John Wiley & Sons,Hoboken, 359-378.

Z RABETAFIKA

H.N., PAQUOT M. & DUBOIS P., 2006. Les polymères issus du végétal : matériaux à propriétés spécifiques pour des applications ciblées en industrie plastique, Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 10(3), 185-196.

Z REHM

B.H.A., 2010. Bacterial polymers. Biosynthesis, modifications and applications, Nature Reviews Microbiology 8, 578-592.

Z SIN

L.T., RAHMAT A.R. & RAHMAN W.A., 2012. Polylactic Acid: PLA Biopolymer Technology and Applications, Oxford, Elsevier Science & Technology, 352 p.

Z SMITH

R., 2005. Biodegradable polymers for industrial applications, Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 516 p.

CHAPITRES 16, 17 ET 18 - ENZYMOLOGIE APPLIQUÉE Z AEHLE

W. Ed., 2004. Enzymes in industry. Production and applications, 8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

Z GARY

W., 2014. Proteins: biochemistry and biotechnology, +PIO
8JMFZ

4POT
-UE
8FTU
4VTTFY
6,

Q

Z HORIKOSHI

K. Ed., 2011. Extremophiles Handbook, Springer, Tokyo Dordrecht Heidelberg London New York, 1247 p.

Z LINQIU

C., 2005. Carrier-bound immobilized enzymes. Principles, applications and design, 8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

Z .CGRATH
#.

8ALSH

G. Eds, 2006. Directory of therapeutic enzymes, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 290 p.

Z MANDAL

S., & RATH J., 2015. Extremophilic cyanobacteria for novel drug development, Springer International Publishing Switzerland, 92 p.

Z OCDE

(Organisation de Coopération et de Développement Economique), 2001. The application of biotechnology to industrial sustainability, Service des publications de l’OCDE, Paris, 152 p.

BIBLIOGRPAHIE SOMMAIRE

471

Z PELMONT

J., 1996. Enzymes : catalyseurs du monde vivant, EDP Sciences, collection Grenoble Sciences, les Ulis, 1040 p.

Z POLAINA
+

.ACCABE

A.P. Eds, 2007. Industrial enzymes-structure, function and applications, Springer, Dordrecht, 641 p.

Z QUÉRELLOU

J. & GUÉZENNEC J., 2010. Biotechnologie des extrêmophiles, Ed. Techniques Ingénieur, Bio580, 2-13.

Z SAHIN

F., DEMIREL G. & TUMTURK H., 2005. A novel matrix for the immobilization of acetylcholinesterase, International Journal of Biological Macromolecules 37(3), 148-153.

Z SANCHEZ-PANIAGUA LOPEZ
.
-OPEZ-CABARCOS

E. & LOPEZ-RUIZ B., 2006. Organic phase enzyme electrodes, Biomolecular Engineering 23, 135-147.

Z WHITEHURST

R.J. & LAW B.A. Eds, 2002. Enzymes in food technology, Sheffield Academic Press, Sheffield, 255 p.

CHAPITRE 19 - CULTURES CELLULAIRES Z CASTILHO
-3
.ORAES
¬.
"UGUSTO

E.F.P. & BUTLER
.

Animal cell technology: from biopharmaceuticals to gene therapy, Taylor & Francis Group, New York, 518 p.

Z HUANG
5,

.CDONALD
,"

#JPSFBDUPS
FOHJOFFSJOH
GPS
SFDPNCJOBOU
QSPUFJO


production in plant cell suspension cultures, Biochem. Eng. J. 45(3), 168-184. Z K AYSER

O. & QUAX W.J. Eds, 2007. Medicinal plant biotechnology, 8JMFZ7$)
7FSMBH
(NC)

$P
,(B"
8FJOIFJN

Q

Z ,INTZIOS

S., 2008. Secondary metabolite production from plant cell cultures: the success stories of rosmarinic acid and taxol, In RAMAWAT
,(

.ÉRILLON +.
&ET
Bioactive molecules and medicinal plants, Chap. 4, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 85-100.

Z LANGDON
41

.BNNBMJBO
$FMM
$VMUVSF
In

WALKER
+.

3APLEY R. Eds, Molecular biomethods handbook, 2nd ed., Humana Press Inc., Totowa, NJ, 861-873.

Z LOYOLA-VARGAS
7.

7ÁZQUEZ-FLOTA

F., 2006. Plant cell culture protocols, 2nd ed., Humana Press Inc., Totowa, NJ, 393 p.

Z .ISAWA
.

1MBOU
UJTTVF
DVMUVSF
BO
BMUFSOBUJWF
GPS
QSPEVDUJPO
PG
VTFGVM
NFUBCPMJUF


FAO Agricultural Services Bulletin 108, 65-78. Z OKSMAH-CALDENTEY
,.

#ARZ

W.H., 2002. Plant biotechnology and transgenic plants, .BSDFM
%FLLFS
*OD
/FX
:PSL

Q

Z RAMASHANDRA RAO

S. & RAVYCHANKAR G.A., 2002. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites, Biotechnology Advances 20(2), 101-153.

Z RYAN

J.A., 2008. Introduction to animal cell culture, Technical bulletin, Corning Incorporated, USA, 8 p.

Z ZHAO

J., DAVIS L.C. & VERPOORTE R., 2005. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites, Biotechnology Advances 23(4), 283-333.

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

GLOSSAIRE Les mots en italique suivis de * sont définis à leur place dans le glossaire.

A Abiotique : se dit d’un facteur écologique, d’un phénomène ou d’un processus de nature et d’origine strictement physico-chimique, donc indépendant des êtres vivants mais intervenant dans le développement des organismes. Tel est par exemple le cas de la salinité, la température ou de l’hygrométrie. Absolue : matière aromatique* très concentrée et visqueuse obtenue par traitement de l’essence concrète* au moyen d’alcool suivi de l’élimination de ce solvant. Acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) : c'est un agent de chélation couramment utilisé pour former des complexes stables avec des ions métalliques divalents, notamNFOU
EF
.H2+
.O2+, Ca2+… Il s’agit d’un acide aminé* ayant 4 groupements carboxyliques agissant comme sites de fixation* (voir figure ci-dessous). OOCH2C

CH2COO

4–

N–CH2–CH2–N

Structure de l’EDTA OOCH2C

CH2COO

Son affinité pour les ions métalliques diminue avec le pH*. Son sel disodique n’est TPMVCMF
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  Il présente un fort pouvoir chélatant grâce auquel il forme des complexes métalliques très stables ; aussi est-il utilisé dans de nombreuses applications industrielles mais aussi en chimie (analyse quantitative), en biologie (milieux de culture*), en biochimie* (solutions tampons*), en médecine, en agronomie… Acides aminés : molécules organiques renfermant au moins une fonction amine primaire (–NH2) et un groupe carboxylique (–COOH) d’où leur nom. Ce sont les unités élémentaires constitutives des protéines, reliées entre elles par des liaisons peptidiques. Il en existe plus d’une centaine mais seulement 22 sont codés par le génome* des organismes vivants. Acides aminés indispensables : acides aminés* qui doivent être fournis par l’alimentation, soit parce que les animaux et l’homme sont incapables de les synthétiser, soit parce qu’ils ne peuvent les synthétiser en quantité suffisante pour répondre à leurs besoins. Pour l’Homme, les acides aminés indispensables sont au nombre de huit : isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane et valine. Si l’apport est insuffisant, une carence* se manifeste. L’histidine est dite semi-indispensable mais

474

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

elle est d’autant plus indispensable que la croissance est plus rapide, comme chez le jeune enfant ou durant une grossesse, devenant un acide aminé banal chez l’adulte. Acides gras : les acides gras sont les constituants élémentaires des lipides. Ce sont des hydrocarbures monoacides acycliques comportant un nombre généralement pair d’atomes de carbone, compris le plus souvent entre 4 et 20. Rarement présents sous forme libre, leur association avec un alcool, le glycérol, forme les glycérides. Acides gras indispensables : catégorie d’acides gras polyinsaturés* qui doivent être apportés par l’alimentation, soit parce que les animaux et l’homme sont incapables de les synthétiser, soit parce qu’ils ne peuvent les synthétiser en quantité suffisante pour répondre à leurs besoins : ce sont les acides linoléique, linolénique et arachidonique. *MT
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QIZTJPMPHJRVF
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.BNmifères puisqu’ils entrent dans la composition des phospholipides* membranaires, mais interviennent aussi à tous les niveaux de protection et de contrôle de l’organisme. L’acide arachidonique n’est synthétisé en quantité suffisante que par l’organisme jeune et bien portant. Acides gras polyinsaturés : constituants des lipides, ce sont des acides gras qui possèdent plus d’une double liaison dans leur chaîne aliphatique*. Il en existe quatre familles : les oméga-3, 6, 7 et 9 en fonction de la position de la première double liaison en comptant à partir de l’extrémité méthyle. Les principales sources alimentaires d’acides gras insaturés sont les huiles végétales, la viande, les poissons gras. Acides nucléiques : classe de macromolécules (polynucléotides) caractéristiques des cellules vivantes, constituées d’un enchaînement linéaire non-ramifié de nucléotides (monomères*). Chaque nucléotide contient une molécule de base purique ou pyrimidique, un groupement phosphate et une unité pentose. On distingue deux types d’acides nucléiques suivant la nature du sucre qui les compose : l’ADN ou Acide DésoxyriboNucléique et l’ARN ou Acide RiboNucléique. Dans l’ARN, la base pyrimidique correspondant à la thymine de l’ADN est l’uracile. Dans une chaîne d’acide nucléique, l’acide phosphorique est estérifié en formant un pont entre le C-5 du sucre de l’un des nucléosides et le C-3 du sucre d’un autre nucléotide. Les enchaînements sucre-phosphate forment un squelette très long qui porte les bases puriques et pyrimidiques à intervalles réguliers. La molécule d’ADN est constituée de deux brins complémentaires enroulés autour d’un axe commun, pour former deux hélices de polarités* opposées. Chaque unité adénine d’une chaîne est liée d’une manière spécifique, par deux liaisons hydrogène*, à une thymine de l’autre chaîne ; de même chaque guanine de l’une des chaînes est liée à une unité cytosine par trois liaisons hydrogène. L’ADN est le constituant essentiel des chromosomes, support matériel de l’information génétique, transmissible d’une génération à l’autre. Chez les Eucaryotes*, la majeure partie de l’ADN est contenu dans le noyau où il forme, avec des protéines (les histones) les chromosomes. Les mitochondries et les chloroplastes contiennent également de petites molécules d’ADN. La transcription de l’ADN en ARN est la première étape de l’expression d’un gène*. Aujourd’hui, les molécules d’ADN peuvent être coupées (brin d’ADN) et ressoudées

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in vitro puis introduites dans des cellules dont le clonage* permet la production de copies multiples de l’ADN incorporé. L’ADN régit l’ensemble des activités cellulaires grâce à une double propriété : d’une part, il renferme l’information génétique nécessaire à la formation des protéines et des enzymes* qui catalysent les réactions biochimiques ; d’autre part, il est capable de se copier lui-même : lorsque la cellule se divise, chacune des deux cellules filles reçoit une copie exacte et complète de l’ADN initial. Acidifiant : substance qui augmente l’acidité d’une préparation alimentaire et/ou lui donne un goût acide. Acidophile : 1. Qualifie chez un organisme une aptitude à pouvoir se développer dans des milieux acides. Ainsi l’usage de la terre de bruyère en horticulture est rendu indispensable à cause de l’acidophilie de nombreuses plantes ornementales. 2. Se dit d’une cellule ou d’une zone cellulaire présentant une affinité particulière pour un colorant* acide (c’est-à-dire anionique). Parmi les colorants acides, l’éosine, l’orange G, le bleu d’aniline sont les plus courants. Acidulé : légèrement acide. Acylation : elle correspond à la réaction d’un ou de plusieurs radicaux acyles (R–C=O) sur des molécules en remplacement d’un ou de plusieurs atomes d’hydrogène actifs : –OH (alcools, phénols, sucres, stéroïdes), –SH (thiols), –NH (amines, nitrosamines), en les transformant en esters, thioesters ou amides, respectivement. O ll ROH + (CF3–CO)2O  CF3–C–OR + CF3–COOH O ll RNH2 + (CF3–CO)2O  CF3–C–NHR + CF3–COOH

Le radical acyl dérive souvent d’un acide organique par enlèvement d’un hydroxyle* de tous les groupes acides. Il porte alors le nom de l’acide dont il dérive. Ex. acétyl (acide acétique), benzoyl (acide benzoïque)… Additif alimentaire : se dit de toute substance qui n’existe pas normalement dans les aliments mais qui y est ajoutée en faible quantité pour maintenir ou modifier certaines de leurs propriétés nutritionnelles, organoleptiques* ou technologiques. Les additifs alimentaires peuvent être naturels ou synthétiques, beaucoup sont d’origine végétale. Leur présence doit être signalée sur l’emballage, dans la liste des ingrédients* souvent sous forme d’un code (ex. E407 = carraghénanes). Les principales catégories d’additifs alimentaires sont : Z les colorants* (E100 à E180) : chlorophylles, caroténoïdes, rouge de betterave, safran… Z les conservateurs* (E200 à E297), destinés à contrôler ou à empêcher le développement de certains micro-organismes ; Z les antioxygènes* ou s (E300 à E321) : vitamine* C et ses sels de sodium, de calcium et de potassium, vitamine E ; Z les émulsifiants*-stabilisants (E322 à E495)  : lécithine (E322), mono et diglycérides, acide alginique, agar-agar, carraghénates, sorbitol, pectines…

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Z les acidulants

: acide citrique, acide fumarique ; épaississants* : gomme arabique*, agar-agar, carboxyméthylcellulose ; Z les réhausseurs de goût (E620 à E637) : glutamate monosodique (E621) ; Z les levains : phosphate de calcium ; Z les édulcorants* : xylitol, sorbitol, mannitol… Les additifs alimentaires sont sujets à une réglementation de plus en plus sévère, notamment les additifs synthétiques dont certains sont soupçonnés d’être cancérigènes. Z les

Adjuvant : substance dépourvue d’activité biologique mais qui, ajoutée à une préparation, est capable d’améliorer ses qualités physico-chimiques ou biologiques et, donc, de moduler l’action de celle-ci. ADN : voir acides nucléiques ADN plasmidique : petite molécule d’ADN* bicaténaire, le plus souvent circulaire, distincte du chromosome bactérien et capable de se répliquer dans la cellule d’origine et dans une cellule-hôte indépendamment du génome* principal, il peut donc être transmis de cellule à cellule par conjugaison ou transduction et s’insérer éventuellement dans le chromosome bactérien. Il existe aussi des plasmides* linéaires non-refermés sur eux-mêmes. La taille des plasmides varie de quelques milliers de paires de bases (pb) à plus de 100 000 (mégaplasmides). L’ADN plasmidique est utilisé comme vecteur* de clonage* permettant de transporter 10 000 paires de bases environ (10 kb) d’ADN. Présent aussi dans certaines cellules eucaryotes*, comme les levures*. Le nombre d’exemplaires du plasmide par cellule est variable et régulé. Les plasmides ne sont pas indispensables au métabolisme* normal de la cellule-hôte mais véhiculent souvent des gènes* porteurs de potentialités nouvelles, comme la résistance à certains antibiotiques, à des métaux lourds ou aux bactériophages*. Les plasmides permettent ainsi aux bactéries* de s’adapter à un environnement hostile. Adsorption : fixation d’un produit à la surface d’un solide au moyen de charges électrostatiques. Aérobie : 1. Caractérise un processus se déroulant en présence de dioxygène. 2. Désigne un organisme qui utilise le dioxygène pour la respiration cellulaire. Aérosol : produit en suspension* sous forme de très fines gouttelettes dans une phase gazeuse. Affinage : étape de maturation* d’un fromage pendant laquelle il est entreposé dans un local adapté (température, humidité, aération, plus ou moins constantes) pendant une durée déterminée, variable selon le type de fromage (quelques jours à plusieurs mois). Durant cette opération, il y a production de molécules sapides et aromatiques*, générée par l’activité de diverses enzymes* de la flore microbienne* qui dégradent le lactose*, les matières grasses et les protéines du caillé* en lui donnant sa texture* et son aspect final, propres à chaque sorte de fromage. Agent antimoussant : substance qui empêche ou réduit la formation de mousse*. Les agents antimoussants, sont utilisés, par exemple, dans les cultures en fermenteur* pour

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limiter la production de mousse qui risque de déborder de la cuve et de contaminer l’environnement. Agent d’enrobage : substance qui, appliquée à la surface d’une denrée alimentaire, lui confère un aspect brillant ou constitue une couche protectrice. Agent de charge : en pharmaceutique, excipient* qui permet d’accroitre le volume d’une substance active afin de faciliter son utilisation. Agent défloculant : dans une suspension* aqueuse c’est une substance qui va empêcher par sa présence la formation de liaison et donc empêcher la floculation : les ions monovalents sont des agents défloculants. Agent de texture : substance chimique ou naturelle qui améliore la consistance des préparations alimentaires en permettant ou facilitant la stabilisation des phases physiques hétérogènes par ses propriétés émulsifiantes*, épaississantes* ou gélifiantes*. Ex. carraghénane. Agent tensioactif : composé qui modifie la tension superficielle entre deux surfaces. Les composés tensioactifs sont des molécules amphiphiles*, c’est-à-dire présentant deux parties de polarité* différente, l’une lipophile* et apolaire*, l’autre hydrophile* et polaire*. Agro-alimentaire : 1. Secteur industriel situé en aval de la production agricole ayant pour objet l’élaboration, la transformation et l’exploitation des produits agricoles et leur conditionnement en denrées alimentaires, destinées à l’alimentation humaine ou animale. 2. Relatif à l’élaboration, à la transformation et au conditionnement des produits d’origine agricole, destinés à la consommation humaine et animale. Alcalinité : capacité de l’eau à neutraliser des acides, c’est-à-dire à fixer des ions H+. Cette propriété dépend, entre autres, de la concentration en carbonate (Na2CO3) et en hydrogénocarbonate (NaHCO3 ou bicarbonate) de l’eau. L’alcalinité ou pouvoir tampon* de l’eau se mesure en milligramme par litre d’équivalent carbonate de calcium (CaCO3). Alcalinophile : qualifie un organisme dont l’optimum de croissance se situe au-dessus d’un pH* de 8,5 et jusqu’à 10,5. Alcalis : substances basiques. Ex. l’hydroxyde de sodium (NaOH), l’hydroxyde de potasTJVN
,0) y Alcaloïdes : nom générique donné à des substances organiques azotées à propriétés basiques, présentes dans de nombreux végétaux et, de manière spécifique, chez certaines familles ou genres appartenant majoritairement aux Dicotylédones (ApocynaDÏFT
'BCBDÏFT
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.POPDPUZMÏdones, on les trouve principalement chez les Liliacées et les Amaryllidacées. Parmi les Chlamydospermes et les Gymnospermes, on les trouve chez les genres Ephedra (Gnétacées) et Taxus (Taxacées), respectivement, et, parmi les Cryptogames vasculaires, chez les Prêles (Equisétacées) et certaines Lycopodiacées. Leurs propriétés alcalines, plus ou moins marquées, sont dues au fait que leur cycle contient de l’azote qui peut fixer des ions H+. Les alcaloïdes se conservent très bien dans les plantes séchées. En solution aqueuse et au pH* physiologique du cytoplasme (pH 7

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approximativement) ou de la vacuole (pH 5-6), ils tendent à être protonés, sauf dans le cas où l’azote est voisin d’un groupe accepteur d’électrons (ex. ricinine, colchicine) et sont de ce fait, généralement, hydrosolubles. En général, les alcaloïdes sont insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques. Les alcaloïdes porteurs d’un atome d’azote quaternaire sont, par contre, très solubles dans l’eau et n’existent que sous la forme de sels. Les alcaloïdes sont doués d’une activité physiologique généralement prononcée à très faibles doses. À plus fortes doses, ils sont responsables d’effets toxiques sur l’homme et les animaux. De ce fait, chez les plantes, ils ont un rôle de défense contre les prédateurs. Ils sont à la base de nombreuses molécules thérapeutiques. Alcool primaire : alcool dans lequel le carbone portant le groupe OH est attaché à un autre atome de carbone (C–OH lié à un carbone). Les alcools primaires se distinguent des alcools secondaires (C–OH lié à deux carbones) et tertiaires (C–OH lié à trois carbones). Aldéhyde : composé organique contenant un groupement carbonyle : –CO–H. La formule générale est R–COH ou R–CHO pouvant donner par oxydation* un acide organique (R–COOH) ou par réduction* un alcool primaire* (R–CH2OH). On les distingue des cétones qui présentent deux groupements alkyles* de part et d’autre du carbonyle. L’aldéhyde le plus simple est le formaldéhyde ou hydroxyméthylène (HCOH). Les aldéhydes sont soit aromatiques* (aldéhyde cinnamique de l’essence de cannelle), soit phénoliques (aldéhyde anisique constituant des essences d’aubépine, d’anis vert et de badiane), soit éthylénique (citral de l’essence de citronnelle). Ils sont surtout antiseptiques, aromatisants (vanille), ocytociques (aldéhyde cinnamique) ou cholérétiques. Aldimine : analogue structurel à un aldéhyde*, de structure générale R–CH=N–R’. Algicide : se dit d’une substance ou préparation ayant la propriété de tuer les algues. Ex. le sulfate de cuivre (CuSO4), l’irgarol (C11H19N5S), plus toxique, surtout utilisé comme antifouling (dispositif permettant d’éviter la fixation des organismes marins sur la coque des navires), plus spécifiquement l’oxyde de germanium (Ge2O) bloque le développement des diatomées. Aliment diététique : désigne un produit qui, bien que non-médicamenteux, permet la satisfaction des besoins nutritionnels de certaines catégories de consommateurs « bien-portants » (sportifs, travailleurs de force, femmes enceintes). Il s’agit d’un aliment naturel de base auquel on a ajouté ou non d’autres éléments naturels pour en augmenter la valeur biologique. À ne pas confondre avec un produit de régime auquel on a retranché les éléments incompatibles avec l’hygiène alimentaire imposée par certaines affections de l’organisme (aliments hypoglucidiques pour les diabétiques, hyposodés pour l’albuminurie et les maladies cardio-vasculaires). Aliment fonctionnel : aliment dont il a été démontré qu’il procure, en plus de ses fonctions nutritionnelles de base, des bienfaits physiologiques et qu’il réduit le risque de maladies chroniques. Aliment infantile : aliment destiné aux jeunes enfants, à partir de 3 mois, pour remplacer ou compléter l’alimentation lactée.

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Aliphatique : qualifie les composés à chaîne carbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou non (ex. acides gras et dérivés), acyclique (ex. hexane) ou cyclique (ex. cyclohexane), par opposition à ceux contenant des cycles aromatiques*. Alkylation : réaction chimique correspondant à un transfert d’un radical alkyle* d’une molécule organique à une autre. Alkyle ou alcoyle : radical monovalent de formule générale CnH2n+1 résultant de l’arrachement d’un atome d’hydrogène à un alcane. Ex méthyle, éthyle… Allélopathique : 1. Se dit d’une plante capable d’interagir chimiquement à distance sur d’autres espèces par l’intermédiaire de substances, généralement toxiques (antibiotiques, toxines, inhibiteurs de germination ou de croissance) excrétées par ses racines ou par ses feuilles dans le milieu environnant (air, eau, sol). 2. Qualifie aussi une substance impliquée dans ce phénomène. Allergie : réaction exagérée de l’organisme à l’égard de certaines substances étrangères (bactérie*, pollen, poussière, substance chimique…) qui ne présentent, habituellement, pas de danger pour la plupart des individus. Elle se manifeste surtout par des réactions cutanées ou des tissus conjonctifs (ex. urticaire, eczéma, œdème), parfois par des crises d’asthme, des vomissements… Elle peut être causée à la suite du second contact (sensibilisation) avec l’allergène en cause ou à la première rencontre (hypersensibilité). Elle implique souvent des anticorps* IgE. Amidon natif : amidon dans sa forme naturelle non-modifiée, par exemple, tel qu’il est extrait des tubercules de pomme de terre ou des grains de maïs. Amidonnerie : secteur de l’industrie concerné par la transformation du grain en amidon*. Amination : réaction de chimie organique au cours de laquelle un groupement aminé est inséré dans une molécule organique. Amorce : courte chaîne simple d’ADN* dotée d’une extrémité 3’ libre qui, en s’hybridant avec un brin matrice* d’ADN, permet à une enzyme* (polymérase) d’initier la synthèse d’un nouveau brin d’ADN complémentaire. Les amorces sont utilisées en particulier dans des réactions d’amplification en chaîne par polymérase ou PCR (Polymerase Chain Reaction). Amphiphile : se dit d’une molécule possédant à la fois un caractère hydrophile* et hydrophobe*. La partie hydrophobe est souvent une chaîne aliphatique*, elle est alors lipophile*. La partie hydrophile peut être ionique ou non. Cette caractéristique est à la base de propriétés telles que la solubilité*, le pouvoir émulsifiant*, le pouvoir hydrophobe hydrophile moussant* et le pouvoir tensioactif*, et la capacité de amphiphile s’assembler sous forme de micelles*. Les molécules amphiphiles peuvent être : Z anioniques comme l’acide caprylique, les phospholipides* (molécules biologiques), le SDS (sodium dodécyl sulfate); Z cationiques comme le CTAB (cétyl triméthyl ammonium bromide) ;

480 Z non-ioniques

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE comme le Triton X100, la digitonine (molécule biologique) ; comme la lécithine (molécule biologique).

Z zwittérioniques

Amphotère : qualifie un composé qui, selon les conditions de pH* dans lesquelles il se trouve placé, se comporte soit comme une base, soit comme un acide. Les protéines, par exemple, présentent cette particularité ; elle est à l’origine de leur plus ou moins grande stabilité ou solubilité* dans les milieux naturels où elles se trouvent. Amylacé : se dit d’une plante ou d’une substance riche en amidon*. Ex. Céréales*, pomme de terre. Anaérobie : 1. Caractérise un environnement dépourvu d’O2. 2. Désigne un organisme capable de se développer dans un tel milieu. Anaérobie facultatif : organisme capable de fabriquer de l’ATP par respiration cellulaire aérobie* quand l’O2 est disponible, mais qui fait appel à la respiration anaérobie* ou à la fermentation* si cette molécule est absente. Anhydroglucose : unité de glucose dans la molécule d’amylose ou d’amylopectine, diminuée d’une molécule d’eau. Anthelminthique : les anthelminthiques désignent une classe de médicaments utilisés dans le traitement des maladies d’origine parasitaire provoquées par des vers (les helminthes). Anticoagulant : substance qui empêche la coagulation* du sang. Anticorps : protéine de défense spécifique appartenant à la classe des immunoglobulines du sérum produite par les lymphocytes* B de l’organisme vertébré en réponse à l’introduction d’un corps étranger et provoquant sa précipitation* dans un test in vitro. Ces corps étrangers, appelés antigènes*, sont le plus souvent des bactéries* ou des virus, mais ils peuvent également n’être que de simples protéines constitutives de certains aliments. Chaque anticorps reconnaît un seul déterminant antigénique d’un antigène auquel il se lie spécifiquement et ainsi le neutralise. Ceux de la classe IgG sont présents dans le sang et utilisés dans les dosages immunologiques. Anticorps monoclonal : anticorps* purifié dérivé d’une seule lignée de cellules* (lymphocytes* B) génétiquement identiques (clone) et qui sont donc homogènes, c’est-à-dire qu’ils ont tous la même spécificité* (ne reconnaissant qu’un antigène*) et la même sensibilité*. Les anticorps monoclonaux sont produits en grand nombre grâce aux hybridomes*. Ils sont utilisés pour le diagnostic* en immunologie et hématologie. Ils peuvent, par exemple, servir à des purifications et à des caractérisations de substances antigéniques par chromatographie d’affinité* grâce à leur haut degré de spécificité*. Antigène : substance ou structure cellulaire étrangère à l’organisme vivant, susceptible de déclencher la formation d’un anticorps* spécifique visant à l’éliminer. La réaction antigène/anticorps est une réaction de défense de l’organisme immunisé. Certains antigènes peuvent provoquer les manifestations allergiques lors de leur pénétration dans

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l’organisme : ils sont appelés allergènes (pollens de Graminées, poussières de maisons, poils et plumes d’animaux domestiques, substances chimiques…). Antioxydant : 1. Substance capable de neutraliser ou de réduire les dommages causés par l’oxygène ou les radicaux libres* dans l’organisme. Les principaux antioxydants naturels sont les vitamines* C et E, les caroténoïdes et le sélénium. Ces substances agissent, soit en bloquant les radicaux peroxydes, premier stade d’oxydation* des acides gras insaturés, soit en chélatant les catalyseurs d’oxydation comme les métaux lourds, soit en réduisant le taux d’oxygène disponible ou en inhibant les lipoxydases. Ex. l’hydroquinone agit par transfert d’hydrogène vis-à-vis de radicaux oxygénés ; la vitamine E agit par fixation du radical. 2. Dans les industries agro-alimentaires*, il s’agit d’une substance qui protège les denrées alimentaires des altérations provoquées par l’oxydation par l’oxygène moléculaire, telles que le rancissement* des matières grasses ou comme des modifications de coloration et des qualités organoleptiques*. Ex. acide ascorbique (E300), acide citrique (E330). Antioxygène : substance qui bloque la réaction en chaîne d’auto-oxydation due à l’oxygène moléculaire. Antithrombogène : qui empêche la coagulation* du sang. Antitrypsique : qualité de certaines substances présentes dans les Légumineuses* crues (soja, lentilles, haricots et autres) et qui inhibent l’action de la trypsine* et par conséquent conduisent à des difficultés digestives. La cuisson les détruit. Aphérèse : récupération d’une fraction spécifique du sang ; le reste étant remis au corps du donneur. La récupération du plasma est appelée plasmaphérèse*. Apolaire : se dit d’un solvant ou d’une molécule qui n’est pas polaire*, c’est-à-dire qui ne comporte pas de liaisons polarisées ou dont les charges partielles positives et négatives ont le même barycentre. Apoprotéine : partie protéique d’une molécule qui comporte une partie non-protéique. Ainsi chez l’hémoglobine, la globine est l’apoprotéine dont le groupe prosthétique* est un hème*. Apprêt : traitement réalisé sur le papier séché ou sur les textiles en vue de rendre leur surface plus lisse. Aquaculture : culture ou élevage d’organismes aquatiques en eau douce ou en milieu marin comme les poissons, les mollusques*, les crustacés, les algues (dans ce cas on parle de phycoculture). Archaebactéries : ancien embranchement de Procaryotes* appartenant au groupe phylogénétique des Archaea distinct de celui des Eubactéries* (Bacteria ou bactéries* vraies) et qui est actuellement érigé en un règne distinct. Les Archaebacteria se distinguent des Bacteria par un certain nombre de critères biochimiques, en particulier la structure de leur ARN* ribosomal et celle de leurs constituants lipidiques. Ce règne, qui correspond aux êtres vivants à la fois les plus primitifs et

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les plus anciennement apparus au cours de l’évolution biologique, montre une grande diversité d’adaptations à des milieux extrêmes. Il comprend en particulier diverses bactéries* halophiles*, des thermophiles*, des thermoacidophiles, des sulfobactéries et des méthanogènes ainsi que diverses autres familles de bactéries chimioautotrophes ou photoautotrophes*. ARN : voir acides nucléiques ARN antisens : ARN* complémentaire d’une portion, plus ou moins étendue, d’un autre ARN et inhibant son expression comme modèle de la traduction. Les ARN antisens peuvent être des éléments naturels de régulation ou être obtenus par génie génétique*. Aromatique : caractère d’une molécule organique comportant un cycle insaturé, à liaisons conjuguées (ex. benzène, toluène). Les composés aromatiques* ont souvent une odeur caractéristique. Arôme : ensemble des composés volatils d’un aliment perçus par la partie rétro-nasale. Chimiquement, les arômes sont plus légers que les molécules de l’air. Les composés volatils d’un aliment sont perceptibles de deux manières : par voie nasale directe (ce qui correspond à l’odeur) ou par voie rétro-nasale lorsque l’aliment est placé dans la bouche, ce qui donne naissance à l’arôme. Artériosclérose : dégénérescence des artères qui se traduit par le durcissement* (sclérose) et l’épaississement des parois dû au vieillissement. Aryle : radical carboné monovalent résultant de l’arrachement d’un atome d’hydrogène à un arène (hydrocarbure aromatique*). Asepsie : ensemble des conditions propres à empêcher toute contamination d’un milieu donné par les micro-organismes. Asporogène : se dit d’un organisme qui ne produit pas de spores. Assimilation : utilisation, par un organisme, de molécules simples prélevées directement dans le milieu ou correspondant aux aliments simplifiés par digestion, pour la synthèse de molécules complexes constitutives de la matière vivante. L’assimilation est indispensable pour la croissance mais aussi pour l’entretien de tout être vivant. Selon leur système d’assimilation, on distingue les autotrophes* (essentiellement les plantes vertes) et les hétérotrophes* (animaux, champignons*). Par photosynthèse*, les végétaux verts fabriquent, à partir des sels minéraux et du dioxyde de carbone prélevé dans le milieu, leurs substances organiques : on parle d’assimilation chlorophyllienne. Les hétérotrophes, ne possédant pas cette propriété, utilisent pour leur synthèse des constituants organiques semi-élaborés. Pour les autres éléments nutritifs (azote, phosphore…), les plantes ne sont capables d’utiliser directement que certaines formes minérales, appelées formes assimilables (nitrates NO3–, ammonium NH4+, phosphate PO43–, QPUBTTJVN
,+, sulfates SO3–
NBHOÏTJVN
.H2+, calcium Ca2+…). Chez les animaux, les aliments complexes sont dégradés en composés plus simples lors de la digestion pour permettre la synthèse de la matière vivante. La fraction assimilable d’un aliment est celle qui est effectivement utilisée pour couvrir les besoins (synthèse, énergie…) de l’organisme. L’énergie assimilable d’un aliment est appelée énergie nette.

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Astringence : perception d’âpreté (resserrement des muqueuses buccales) en bouche due à des substances particulières comme les tanins* et leurs dérivés. L’artichaut cru, les coings… sont astrigents. Athérogène : se dit d’une substance qui favorise la déposition de plaques lipidiques (cholestérol*) ou plaques d’athérome au niveau de la tunique interne des vaisseaux sanguins (principalement les artères), conduisant progressivement à leur oblitération. Autotrophie : mode de nutrition propre aux organismes capables de subvenir à leurs besoins métaboliques en utilisant comme seule source de carbone le CO2 présent dans l’air ou dissous dans l’eau et des matières nutritives exclusivement minérales, et en employant comme source d’énergie celle du rayonnement solaire (photosynthèse*), ou chez certaines bactéries* celle produite par des réactions d’oxydation* de substances inorganiques (soufre par exemple) pour synthétiser leurs molécules organiques (chimiosynthèse). Les organismes autotrophes sont des producteurs primaires* importants; les produits de leur activité fournissent l’énergie et le carbone aux organismes hétérotrophes*.

B Babeurre ou petit lait : liquide au goût aigrelet qui reste après la fabrication du beurre. Bactéricide : se dit d’une substance capable de tuer les bactéries*. Bactérie : micro-organisme unicellulaire, appartenant au règne des Protistes, de formes diverses, généralement à chromosome unique circulaire, ne comportant pas de véritable noyau et se multipliant le plus souvent par division cellulaire (asexualité). Sa membrane plasmique est doublée par une paroi rigide de nature polysaccharidique, protéique, et lipidique. Certaines bactéries ont des effets bénéfiques, d’autres sont pathogènes et provoquent des maladies infectieuses. Les bactéries se rencontrent partout et dans tous les milieux. Elles sont particulièrement abondantes dans les eaux et les sols où elles jouent un rôle primordial dans les transformations multiples et complexes des constituants organiques et minéraux comme les grands cycles biologiques des éléments fondamentaux (cycle de l’azote, du carbone, du soufre, du phosphore, du fer). Certaines bactéries du sol sont capables de fixer l’azote atmosphérique, sous une forme directement assimilable par les plantes, jouant un rôle capital dans la vie des végétaux (ex. Rhizobium, Clostridium, Azotobacter). Plusieurs sont connues par leurs propriétés de fermentation*. Certaines sont productrices d’antibiotiques. L’étude des bactéries relève du domaine de la microbiologie et plus précisément de la bactériologie. La relative simplicité de leur reproduction et de leur structure a fait des bactéries des outils de choix pour de nombreuses disciplines (biochimie*, biologie moléculaire*, génie génétique*…). Parmi les bactéries les plus étudiées figurent Escherichia coli, Bacillus subtilis, B. licheniformis. Bactériophage : virus susceptible de parasiter des bactéries*.

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Bactériostatique : propriété d’un produit, et en particulier d’un antibiotique, qui bloque la croissance, et donc la multiplication, bactérienne en inhibant une réaction du métabolisme*, sans détruire les cellules. Bagasse : sous-produit* fibreux obtenu après l’extraction* du jus sucré (ou vesou*) par broyage et pressage de la canne à sucre, constitué par ses parties ligneuses, dures (écorce, fibres). La bagasse est composée essentiellement de cellulose (40 %), d’hémicelluloses (34 %) et de lignine* (11 %). Ayant un pouvoir calorifique très élevé, la bagasse sert de combustible pour les chaudières de sucrerie et pourrait être également utilisée pour produire du bioéthanol*. Barophile ou piézophile : qualifie les espèces marines vivant à des pressions hydrostatiques* très élevées comme dans les grandes profondeurs océaniques. Barotolérant : organisme capable de survivre à des fortes pressions mais se développant mieux à des pressions plus basses. Barrière hémato-encéphalique : barrière anatomique semi-perméable constituée de cellules épithéliales recouvrant les capillaires sanguins du système nerveux et qui filtre et contrôle le passage des substances sanguines en les empêchant de passer librement du sang au liquide céphalo-rachidien. Elle isole ainsi le système nerveux central du reste de l’organisme et lui permet d’avoir un milieu stable, spécifique, différent du milieu intérieur du reste de l’organisme. Base de Schiff : composé comportant une double liaison C=N avec l’atome d’azote lié à un groupe aryle* ou alkyle*, et pas un hydrogène : ce sont donc les imines secondaires. Les bases de Schiff résultent de la condensation des aldéhydes* et des cétones avec des amines primaires. Elles sont stables lorsqu’elles contiennent au moins un groupe aryle sur leur atome d’azote ou de carbone. Dans les tissus, les sucres réducteurs* réagissent avec les protéines en formant des bases de Schiff instables. Les bases de Schiff au sens large ont une formule générale de type R1R2C=NR3, où R est une chaîne organique. Bentonite : roche constituée principalement d’un complexe de silice colloïdale (silicate d’aluminium hydraté ou montmorillonite), à propriétés adsorbantes marquées, résultant de l’altération de cendres volcaniques. La bentonite est utilisée comme inhibiteur des nucléases, ainsi que dans l’essai de « floculation de la bentonite », un test d’agglutination dans lequel des particules de bentonite ayant des propriétés antigènes* permettent de détecter les anticorps* spécifiques. Bilirubine : produit de la dégradation de l’hémoglobine (principalement dans les macrophages) et un des constituants essentiels de la bile. Bioactif : qui possède des propriétés biologiques actives. Des molécules bioactives sont isolées dans un but curatif ou préventif. Biocarburants : produits gazeux, liquides ou solides, qui dérivent de sources biologiques et qui remplacent les carburants à base de pétrole pour le transport routier : le bioéthanol* est obtenu par fermentation* à partir de plantes sucrières (betterave, canne à sucre, topinambour), de Céréales* (blé, maïs) et d’autres plantes amylacées* ; il est utilisé

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comme additif à l’essence. Le biodiésel*, issu principalement d’huiles végétales (colza, tournesol, soja…), mais aussi d’huiles usagées ou de graisses animales, peut être utilisé comme carburant en mélange avec du gazole à base de pétrole ou en remplacement de celui-ci. Biocatalyse : accélération d'une réaction biochimique par une substance, un biocatalyseur. Celui-ci est désigné souvent comme étant l’enzyme* elle-même ou, par extension, le micro-organisme* qui la produit. Biochimie : science qui étudie les substances qui constituent les organismes vivants, leur rôle biologique et les processus chimiques complexes qui aboutissent à leur transformation, auxquels on donne le nom de métabolisme*. La biochimie est née du rapprochement de deux sciences anciennes : la physiologie et la chimie organique. Biocompatibilité : capacité d’un matériau à être utilisé chez un hôte dans une application spécifique sans engendrer de réactions négatives (pas de réaction inflammatoire, pas de toxicité…). Bioconversion : terme général s’appliquant à la transformation d’une substance en un ou plusieurs autres produits bien définis, réalisée par biocatalyse* lors de culture cellulaire (cellules microbiennes, champignons*…). Ex. transformation du (R)-(+)-limonène (extrait de l’huile essentielle des zestes des agrumes) en α-terpinéol à l’aide de Penicillium digitatum. De même, l’acide salicylique est glycosylé par des cultures cellulaires de Mallotus japonica (Euphorbiacées) en un nouveau composé qui présente une activité analgésique plus rapide que celle de l’aspirine et qui est mieux toléré par l’estomac. Ce terme englobe aussi la transformation de l’énergie solaire directe ou indirecte par les êtres vivants : la photosynthèse*. Biodégradation : décomposition d’un corps, par action de micro-organismes vivants (bactéries*, champignons*), voire d’enzymes* isolées, en ses éléments de base (minéraux ou organiques) recyclables, c’est-à-dire directement assimilables par le milieu naturel ou par d’autres organismes. Cette notion a acquis de nos jours une grande importance avec l’aggravation de la pollution* industrielle. Parmi les produits fabriqués par l’homme, ceux dont la composition est à base de substances naturelles se dégradent très bien (papiers, tissus…) ; ils sont dits biodégradable. Par contre, beaucoup de produits de synthèse (pesticides*, herbicides*, matières plastiques…) résistent à la destruction en milieu naturel et sont donc des polluants dont la présence ne cesse d’augmenter. Biodiesel : combustible obtenu par transestérification* d’huiles par du méthanol en un mélange d’esters appelés esters méthyliques* d’acides gras ou esters méthyliques d’huiles végétales (EMHV). Biodisponibilité : 1. En pharmacologie, fraction de la dose administrée d’un médicament qui est effectivement mise à disposition des organes cibles. Par exemple, les médicaments qui sont injectés par voie intraveineuse aux mammifères ont une biodisponibilité de 1 parce qu’ils arrivent tous dans le plasma qui les distribue à d’autres parties du corps. Dans le cas de l’utilisation d’autres voies pour administrer le médicament, telles que la voie

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orale, la biodisponibilité sera déterminée par sa vitesse et son degré d’absorption au niveau des intestins. 2. En physiologie, fraction d’un nutriment*, présent dans un aliment, utilisée par l’organisme. La présence conjointe d’un nutriment avec une autre substance particulière peut augmenter la biodisponibilité de ce nutriment et, donc, son assimilation* par l’organisme ou, au contraire, la diminuer. Ex. le lactose* augmente la biodisponibilité du calcium présent dans le lait. Certaines plantes, bien que riches en protéines, contiennent des facteurs antinutritionnels*, comme les tanins*, qui se complexent aux protéines, les rendant non-disponibles à l’assimilation. Biodiversité : variété de la vie sous toutes ses formes et à tous les niveaux d’organisation, dans un milieu donné : variété des espèces vivantes (diversité des espèces) dans un habitat donné et variété entre les individus d’une même espèce (diversité intraspécifique ou génétique). Ces différents concepts sont les sujets directs des disciplines scientifiques comme l’écologie, la taxonomie et la génétique. Le maintien d’un niveau élevé de biodiversité est important pour la stabilité des écosystèmes. Certains habitats, notamment les forêts tropicales, possèdent une très riche diversité, aussi bien animale que végétale, qui est menacée par la déforestation. La biodiversité des habitats naturels représente également un gisement important d’espèces et de matériel génétique potentiellement utiles pour les sociétés humaines. Par exemple, les plantes sauvages continuent d’être utilisées comme source de nouveaux médicaments et autres produits et le développement de nouvelles souches et variétés de plantes cultivées avec une résistance accrue aux maladies puise du matériel génétique chez les plantes sauvages. Bioéthanol : éthanol obtenu par fermentation* à partir de matériel biologique (plantes cultivées essentiellement) et pouvant se substituer aux combustibles fossiles comme le pétrole et le charbon pour alimenter les voitures dites « FlexFuel ». On utilise égaleNFOU
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Bioinformatique : au carrefour des mathématiques, de l’informatique, de la biologie et de la physique, la bioinformatique développe et utilise les bases de données pour stocker, analyser et traiter les données biologiques complexes (en biologie moléculaire*, génomique*, protéomique*, séquençage d’ADN*…). On parle de biologie in silico. Cette discipline utilise tous les concepts de l’informatique : l’acquisition (séquençage à haut débit), l’organisation de l’information (classement des gènes* en fonction des homologies de leurs séquences), l’analyse (des séquences d’ADN), la visualisation (recherche dans des bases de données), la modélisation (prédiction des séquences protéiques) pour les appliquer à la génomique. Biologie moléculaire : discipline visant à étudier les molécules, leurs structures, leurs synthèses, leurs altérations (mutations) et les phénomènes biologiques au niveau moléculaire (ex. caractérisation des molécules impliquées dans l’expression du génome*). La biologie moléculaire tente de montrer que la structure des molécules composant l’organisme conditionne son fonctionnement et assure une compréhension plus rigoureuse des processus vitaux. La biologie moléculaire a grandement bénéficié des développements de la physico-chimie des macromolécules et de la biochimie*, notamment avec la découverte des endonucléases de restriction et l’automatisation du séquençage à haut débit. Le développement des techniques de biologie moléculaire aide à l’amélioration génétique et la sélection de variétés de plantes plus performantes par le génie génétique*. Biomasse : ensemble des organismes vivants et de leurs produits et dérivés (bois, déchets végétaux, déchets animaux…) dans un milieu. En milieu marin, la biomasse est souvent exprimée en poids de matière fraîche ou sèche par unité de volume, en milieu terrestre par unité de surface. Biomatériau : substance ou matériau d’origine biologique pure (ex. cellulose, chitine, fucanes, dextranes*, collagène…) mais pouvant aussi être combiné à une petite fraction de matériaux non-organiques ; il peut donc être biodégradable totalement ou partiellement, selon sa composition. Les biomatériaux sont généralement destinés à l’implantation dans un corps vivant pour remplacer un organe déficient ou un tissu. Les prothèses, de la plus simple (implant* dentaire) à la plus complexe (valve cardiaque) sont élaborées à partir de biomatériaux. Biomolécules : composés biologiques provenant d’un organisme vivant comme des polysaccharides, des protéines, des lipides ou des acides nucléiques*. Biopolymère : terme employé pour désigner des macromolécules biologiques, à motif de base répétitif ou monomère* (molécule simple), enchaînés les uns aux autres comme les peptides, les polynucléotides, les polysaccharides. Les biopolymères sont dits apériodiques si le monomère varie (ex. polypeptides faits d’acides aminés* différents) ou périodiques si le monomère est unique (ex. cellulose formée de glucose). Bioréacteur : dispositif de laboratoire ou de milieu industriel où sont mises en œuvre des cultures en conditions contrôlées de cellules ou des bioconversions* grâce à des microorganismes hétérotrophes* (fermenteur*), des cellules isolées animales ou végétales

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(cytoculteur*), des extraits cellulaires ou des enzymes* fixées ou libres (réacteur enzymatique). Le bioréacteur comprend différents systèmes (souvent automatisés) permettant un meilleur contact entre les phases biotique et abiotique*, le brassage du contenu de façon à éviter la sédimentation* ou, au contraire, favorisant la flottaison ou la floculation, assurant l’alimentation en nutriments* et en gaz, l’évacuation des déchets, le transfert de chaleur… Bioremédiation : technique de restauration des écosystèmes pollués et dégradés, qui repose sur l’utilisation d’organismes vivants pour la réduction ou l’élimination des composés toxiques et xénobiotiques* accumulés dans le sol ou dans l’eau. Biorésorbabilité : disparition progressive d’un biomatériau* dans le corps du récepteur. Ex. fils de suture chirurgicaux. Biosorbant : désigne un produit ou un organisme capable de récupérer des molécules ou des métaux dissous en piégeant les cations métalliques tels que le Cd, l’Ag, le Cr, le Ni, le Pb, le Zn, l’Ur. Biotechnologie : application intégrée des connaissances et des techniques de la biochimie*, de la microbiologie, de la physiologie, de la génétique et du génie chimique, au traitement des matières par des agents biologiques (micro-organismes, enzymes* isolées). Les biotechnologies consistent, aussi, à tirer profit des micro-organismes et de cellules animales et végétales en orientant leur métabolisme* et leur capacité de biosynthèse vers la production de substances spécifiques utiles et valorisables. L’application des techniques biotechnologiques à l’échelle industrielle a donné naissance à la bioindustrie*. Biotinylation : processus qui consiste à fixer par une liaison covalente* de la biotine à une autre molécule ou à une surface quelconque. La biotine se fixe avec une très grande affinité à une protéine du blanc d’œuf (l’avidine) et à une protéine bactérienne (la streptavidine). Cette propriété est utilisée dans un grand nombre d’applications pratiques en biologie moléculaire* notamment. Biotransformation : transformation biologique, plus ou moins dirigée et améliorée, s’effectuant sur des matières brutes ou des déchets (mélasses*, déchets papetiers, résidus forestiers ou agricoles) à l’aide d’agents biologiques (enzymes*, bactéries*, champignons*…) libres ou fixés. A l’échelle industrielle, les sous-produits et les déchets des industries agricoles et alimentaires sont soumis à l’action de divers micro-organismes dans le but de produire des produits à haute valeur ajoutée* (acides aminés*, vitamines*, protéines, médicaments, biogaz*, méthane, alcools…). Bivalves : mollusques* d’eau douce ou marine dont certains sont comestibles comme les palourdes, les huîtres, les moules… Ils sont cultivés et leur coquille comporte en général deux valves. Blanchiment : élimination ou modification des impuretés colorées des composants d’une pâte ou d’une huile en vue d’augmenter la blancheur de celle-ci.

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Bois raméal : bois issu des branches d’arbres, plus riche en matières organiques (cellulose hémicelluloses, lignines*, acides aminés* et protéines) que le bois caulinaire (du tronc). Boue activée : culture de micro-organismes floculant, brassée et oxygénée formée en bassin d’épuration des eaux usées, qui se rassemble en petits agrégats de matière organique en suspension* comme dans une boue. Les espèces bactériennes des boues sont principalement des hétérotrophes* mais aussi quelques autotrophes* (Nitrosomonas, Nitrobacter), des champignons* et d’autres organismes. Brasserie : lieu ou est brassée la bière.

C Caillage : coagulation* des caséines du lait soit par acidification (action des ferments lactiques), soit par action des enzymes* spécifiques (chymosine* de la présure). Base de toutes les fabrications fromagères, le caillage est un phénomène non-réversible qui aboutit à la formation d’un coagulum appelé aussi caillebotte. Caillé : partie solide issue de la coagulation* du lait. Caillette : quatrième partie de l’estomac d’un ruminant*, qui sécrète le suc gastrique, responsable de la dégradation enzymatique des aliments. C’est de la caillette du veau que l’on prélève la présure. Cal : amas de cellules végétales indifférenciées (sans organisation définie), naturel (ex. cal cicatriciel) ou obtenu par culture in vitro. Ces cellules peuvent être cultivées indéfiniment par repiquages successifs, sur des milieux neufs. À partir de cals, on peut régénérer des organes, des plantes entières. Cancérogène : se dit de tout facteur, physique ou chimique, qui peut provoquer le développement d’un cancer. Carence : situation d’absence ou d’insuffisance d’un élément ou d’un nutriment* (dans un milieu donné) essentiel pour le métabolisme* et le développement de l’organisme et caractérisée par l’apparition de symptômes physiologiques (perturbations du métabolisme), voire pathologiques (maladie). Par exemple, la carence en vitamine* A peut entraîner la cécité, celle en iode le goitre et le crétinisme, et un apport insuffisant en fer est à l’origine de l’anémie. On distingue les carences vraies ou primaires et les carences induites ou secondaires. La carence vraie est le résultat d’un manque d’un ou de plusieurs élément (dans le sol ou dans l’air, pour une plante et dans la ration* alimentaire pour un animal). La carence induite survient lorsque, bien que l’élément soit présent en quantité suffisante, l’organisme se trouve dans l’impossibilité de l’assimiler. Les causes peuvent être dues à des conditions physico-chimiques défavorables. Ce sont principalement : Z la chélation, entraînant une immobilisation*, Z le pH* excessif, Z un antagonisme ou une compétition entre éléments.

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Carie : infection liée à des bactéries* qui colonisent la surface dentaire et utilisent les glucides comme substrats* pour synthétiser des acides (acide lactique en particulier) capables de dissoudre l’émail dentaire (déminéralisation). Cariogénicité : capacité à provoquer des caries* dentaires. Caroténogenèse : synthèse des caroténoïdes. Caséines : principales protéines du lait dont elles représentent la fraction la plus abondante : 75-80 % des protéines totales du lait de vache ; 30 % de celles du lait humain, se trouvant sous forme de micelles* de phosphocaséinate de calcium en suspension* colloïdale. Ce sont des phosphoglycoprotéines qui coagulent dans des conditions acides tandis que les autres protéines restent solubles (protéines sériques ou protéines du lactosérum*). Elles sont, de ce fait, avec la matière grasse, les constituants du lait qui intéressent le plus le fromager car elles sont retenues de façon sélective au cours de la fabrication du fromage. Catalyseur : substance qui, en petite quantité, accélère la vitesse d’une réaction chimique sans être, en aucun cas, transformée au cours de la réaction. Un catalyseur diminue l’énergie d’activation d’une réaction. De nombreux types de catalyseurs incluant des métaux purs (palladium, platine, nickel…) et des substances chimiques sont employés à l’échelle industrielle. Les enzymes* sont considérées comme catalyseurs biologiques ou biocatalyseurs très puissants qui peuvent transformer jusqu’à un million de molécules de réactifs par minute et par molécule d’enzyme. Elles sont, de plus, douées d’une spécificité* rigoureuse. Cataracte : trouble de la vision qui survient lorsque le cristallin perd de sa transparence. Il peut évoluer jusqu’à la cécité. Cellulase : enzyme* produite par divers micro-organismes permettant la dégradation de la cellulose (cellulolyse). Ces micro-organismes sont présents naturellement dans le rumen* des polygastriques (ruminants*) et surtout chez l’escargot et participent à l’hydrolyse* de nombreux polysaccharides. Les cellulases présentent un grand intérêt biotechnologique* et industriel pour la valorisation des déchets végétaux. Cellulolytique : qualifie une substance ou un organisme capable de dégrader la cellulose. Ex. certaines bactéries* et champignons* du sol, pourvus de cellulase*. Centrifugation : technique de séparation et de fractionnement* des particules (cellules, organites, macromolécules) d’un échantillon par sédimentation* utilisant l’accélération centrifuge développée par le rotor d’une centrifugeuse tournant à grande vitesse. Céréales : important groupe de végétaux alimentaires, constituant le régime de base de la majorité de l’humanité. Ils se répartissent de façon distincte selon les continents : blé (et orge) pour les pays occidentaux et maghrébins, riz pour l’Asie, mil et sorgho pour l’Afrique, maïs pour les Amériques et les Antilles. Cétose : glucide possédant un groupement cétone (>C=O). Le plus important est le D-fructose (cétohexose).

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Chaîne alimentaire : séquence des transferts de nature alimentaire unissant les organismes (y compris les micro-organismes) d’une communauté. Les animaux herbivores (consommateurs primaires), incapables de synthétiser la matière organique dont ils ont besoin pour leur croissance, doivent la puiser chez les organismes photosynthétiques (producteurs) autotrophes dont ils se nourrissent. Les consommateurs primaires servent à leur tour de nourriture aux carnivores (consommateurs secondaires, tertiaires et quaternaires). À leur mort, les végétaux comme les animaux, sont décomposés par des micro-organismes (décomposeurs) et minéralisés pour servir de base nutritive aux plantes vertes et un nouveau cycle recommence. Champignons : appelés maintenant mycètes, organismes eucaryotes*, hétérotrophes*, dont l’appareil végétatif est constitué, le plus souvent, d’un mycélium filamenteux, cloisonné ou non, limité par une paroi riche en chitine, et se multipliant végétativement par libération d’une multitude de spores. Certains groupes (levures*) possèdent une structure unicellulaire. D’autres, possèdent une organisation plus complexe avec des différences considérables de taille, d’aspect, de structure, d’activités métaboliques… Chaotropique : molécule qui détruit la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques (protéines, acides nucléiques*…) et les dénature en interférant avec les interactions intramoléculaires faibles (non-covalentes), comme les liaisons hydrogène* et les forces de Van der Waals. Ex. perchlorate et bromure de lithium, thiocyanate de sodium, iodure de sodium, hypochlorite de sodium, chlorhydrate de guanidinium et urée. Charbon actif : charbon ayant été traité par pyrolyse (calcination prolongée à une température élevée, 800 à 1000 °C) afin d’augmenter ses capacités d’absorption. Le charbon activé est utilisé comme agent filtrant dans les industries chimiques et les laboratoires de chimie, dans les masques respiratoires et les filtres de purification des hottes contre les produits volatils dangereux. Il se présente sous la forme d’une poudre noire, légère, inodore et insoluble. Il est aussi utilisé pour décolorer certaines préparations industrielles. Dans le domaine médical, il est utilisé pour la préparation d’adsorbants. Ceux-ci sont obtenus en mélangeant le charbon activé avec des solutions médicamenteuses. Le charbon fixe les substances mises en sa présence et les libère ultérieurement à l’intérieur de l’organisme. Il est également utilisé pour adsorber certaines substances toxiques ce qui empêche ou (limite) leur absorption lors de la digestion. Charcuterie : transformation des viandes (essentiellement de porc) et des abats en produits variés : pâtés*, saucisses, jambons, rillettes… Chaulage : une des étapes de purification du jus sucré extrait de la canne à sucre ou de la betterave à sucre lors du processus d’obtention du sucre alimentaire. Elle implique l’ajout d’une certaine forme de chaux, par exemple, l’oxyde de calcium [Ca(OH)2], le lait de chaux ou le saccharate de calcium, au jus de sucre, suivie d’un chauffage. La chaux neutralise les acides organiques présents et forme des sels de chaux insolubles avec les impuretés qui seront éliminés par filtration*. Chélateur ou séquestrant : molécule dont la configuration* spatiale en pince ou en crochets permet de complexer (ou piéger) des cations métalliques (calcium, fer, cuivre,

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magnésium, plomb…) à l’intérieur de son édifice moléculaire, par des liaisons de coordinance, où les atomes donneurs de doublets électroniques sur le chélateur, disposés selon une géométrie stricte, sont le plus souvent O et N, parfois S. Le complexe formé s’appelle chélate. Chirale : se dit d’une molécule qui ne peut se superposer avec son image (appelée énantiomère*) dans un miroir, c’est-à-dire non-symétrique par rapport à un plan, un axe ou un point. Cette propriété structurale est à l’origine de l’activité optique (pouvoir rotatoire), notamment dans les composés renfermant des carbones asymétriques (liés à quatre constituants différents). Cholestérol : stérol caractéristique des animaux mais rencontré également chez certaines algues et dans les huiles végétales alimentaires à très faible dose. Composant fondamental des membranes des cellules, il est aussi le précurseur* des hormones* stéroïdiennes (progestérone, testostérone, cortisol, cortisone, œstrogènes), de la vitamine* D synthétisée au niveau de la peau sous l’effet du soleil et des sels et acides biliaires comme l’acide cholique. Ce dernier, sous forme de sels, facilite la digestion et l’absorption des lipides, en les émulsifiant. Le cholestérol est présent également dans tous les tissus, soit à l’état libre (calculs biliaires, tissu cérébral et tissu nerveux), soit sous forme d’esters (palmitate, stéarate, oléate). Il provient à 75 % de la synthèse par l’organisme (par tous les tissus et plus particulièrement par le foie, l’intestin, les glandes corticosurrénales, et la peau) et pour 25 % des aliments que nous consommons. L’absorption intestinale du cholestérol alimentaire varie selon les individus. Le cholestérol est donc indispensable au bon fonctionnement de l’organisme, mais il est également impliqué dans certaines pathologies. Un taux de cholestérol élevé peut entraîner des calculs biliaires ou constituer des dépôts dans les artères et leur durcissement* (artériosclérose*) ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires. Un régime alimentaire approprié s’impose dans ces conditions afin de rétablir le taux de cholestérol. Il peut se présenter sous deux formes les lipoprotéines* LDL (lipoprotéines de petite densité) et HDL (lipoprotéines de haute densité). Le LDL-cholestérol est souvent considéré comme le « mauvais » cholestérol, le HDL-cholestérol représentant le « bon ». Cholestérolémie : taux de cholestérol total dans le sang. Ce taux est considéré comme normal lorsqu’il est inférieur à 2,5 g/L. L’hypercholestérolémie correspond à un taux anormalement élevé de cholestérol. Il existerait un lien entre un taux élevé de cholestérols et le risque de maladies cardiovasculaires et certaines pathologies comme les néphrites et le diabète*. Chromatographie : ensemble de techniques physico-chimiques permettant la séparation, plus ou moins sélective, des constituants d’un mélange (qu’ils soient colorés ou non) et leur obtention à l’état pur, en utilisant certaines de leurs propriétés physiques et/ou chimiques. Il en existe plusieurs variantes, toutes basées sur la répartition différentielle des molécules dans un mélange entre deux phases, la phase stationnaire* et la phase mobile*. Ces différents systèmes diffèrent par la nature des phases utilisées et par la nature du facteur déterminant la séparation.

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Chromatographie d’affinité : technique chromatographique dont le principe repose sur les propriétés biologiques fonctionnelles de la molécule, c’est-à-dire sa capacité à former un complexe réversible très spécifique avec une autre molécule appelée ligand*. Ce dernier, généralement de faible poids moléculaire, est lui-même greffé par liaison covalente* sur une phase stationnaire* inerte, appelée matrice*. Un exemple classique est représenté par l’affinité d’un anticorps* pour son antigène*. On dit que l’anticorps a une affinité pour un effecteur, l’antigène. De même, si l’on veut purifier des enzymes*, on utilisera comme effecteur des substrats*, des analogues de substrat*, des inhibiteurs compétitifs, des effecteurs allostériques, des coenzymes*… Chromatographie d’échange d’ions : chromatographie sur colonne en phase liquide permettant d’isoler une substance chargée électriquement dans un mélange de molécules chargées. Pour cela, on fait passer le mélange (phase mobile*) sur une phase stationnaire* (solide) chargée, les substances ayant une charge nette opposée à celle de la phase stationnaire sont retenues alors que celles ayant une charge identique ou sans charge ne sont pas retenues. On récupère ensuite les substances retenues par désorption en modifiant le pH* par exemple. Chromatographie d’exclusion stérique (SEC) ou moléculaire ou par filtration sur gel : La chromatographie d’exclusion stérique est une méthode de chromatographie sur colonne en phase liquide basée sur la taille des macromolécules (volume hydrodynamique). Les molécules les plus petites sont retenues alors que les plus grosses sont éluées plus rapidement. Elle permet ainsi la détermination des masses molaires des polymères*. Chromatographie d’immuno-affinité : technique de purification dans laquelle un anticorps* est lié à une matrice*, souvent utilisée pour isoler une protéine d’un mélange complexe. Chromatographie liquide basse pression (CLBP) : chromatographie très lente qui utilise des colonnes ouvertes plus ou moins longues où la phase mobile est un liquide qui se déplace par gravité sous une pression souvent voisine de 1 atm. Chromatographie liquide haute performance (CLHP)  : chromatographie dont le principe est basé sur l’utilisation d’une phase stationnaire* de granulométrie* très fine et d’une extrême homogénéité, ce qui nécessite l’utilisation de pressions élevées (produites par une pompe) pour pousser la phase mobile* au travers de la phase stationnaire de la colonne. La microparticulation de la phase stationnaire offre une surface d’échange importante tout en résistant aux pressions importantes employées et, par conséquent, augmente l’efficacité de la séparation. Les diamètres les plus couramment utilisés se situent entre 3 et 10 μm. Les systèmes actuels permettent fréquemment d’obUFOJS
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Chromophore : molécule ou groupe fonctionnel ou liaison moléculaire responsable de l’absorption de la lumière à certaines longueurs d’onde. Par exemple, le groupe carbonyle >C=O, absorbe dans l’infrarouge à des longueurs d’ondes comprises entre 1650 et 1 760 nm selon qu’il est engagé dans une structure amide, ester, cétone, lactone, anhydride… Si les longueurs d’onde correspondent au domaine du visible, la molécule porteuse de ce groupement apparaît colorée. Chromoprotéine porphyrinique : protéine renfermant un groupe prosthétique* (chromophore*) formé de quatre noyaux pyrroliques autour d’une partie minérale centrale, conférant une coloration à l’ensemble de la molécule. Ainsi, dans la molécule d’hémoglobine, la partie protéique est constituée de 4 globines identiques deux à deux, le chromophore étant constitué d’un hème*. La partie protéique est appelée apoprotéine*. Les chlorophylles, et les caroténoïdes présents dans les chloroplastes, le phytochrome, les flavoprotéines sont des chromoprotéines. Chylomicrons : petites gouttelettes de lipoprotéines* sécrétées en grande quantité par les entérocytes* (cellules de l’intestin) en période postprandiale (après un repas copieux par exemple) ; leur rôle essentiel est le transport des triglycérides* d’origine alimentaire vers le plasma sanguin. Chymosine : enzyme* protéolytique* qui est secrétée dans l’estomac du jeune veau (abomasum) et qui provoque le caillage* du lait. Cette enzyme peut être récoltée ou synthétisée artificiellement et utilisée dans la fabrication du fromage. La présure contient environ 80 % de chymosine et 20 % de pepsine*. Chymotrypsine : enzyme* protéolytique* appartenant au vaste groupe des protéases à sérine (EC 3.4.21.1), hydrolysant préférentiellement les liaisons amides adjacentes aux résidus d’acides aminés* aromatiques* (trp, tyr, phe). C’est donc une endopeptidase, formée à partir du proenzyme, le chymotrypsinogène par action de la trypsine*. Chez les vertébrés, la chymotrypsine est contenue dans le suc pancréatique et hydrolyse les protéines dans l’intestin grêle. Cidre : boisson obtenue par fermentation* du jus de pommes. Cires : macromolécules hydrophobes* constituées d’un mélange d’esters d’acides gras saturés et insaturés à longues chaînes (14 à 36 atomes de carbone) non-ramifiées et d’alcools gras à longues chaînes aliphatiques* (16 à 36 atomes de carbone) ou parfois cycliques. Les cires sont présentes naturellement dans les huiles de tournesol, de carthame, de coton, de maïs, de grignons* d’olive. Elles revêtent la membrane externe des cellules épidermiques des feuilles, des fruits et de la tige de certaines plantes, notamment chez les xérophytes limitant leur transpiration. La cire recouvrant les feuilles du tabac se compose presque exclusivement de paraffines* C25 à C33, tandis que la cire des feuilles de choux est constituée à 95 % par la paraffine C29H60. Cisaillement : terme employé en rhéologie* pour désigner des contraintes parallèles aux interfaces à l’intérieur d’un bioréacteur* ou d’un fermenteur* muni d’une agitation mécanique. S’exerçant sur les enveloppes cellulaires, elles risquent de déchirer celles-ci. Les

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protozoaires, les microalgues, les cellules animales et végétales sont généralement très sensibles au cisaillement et nécessitent des agitations douces. Clairance rénale : mesure de la capacité du rein à se débarrasser d’une substance (ou quantité de substance éliminée par unité de temps). Clonage : 1. Technique consistant à insérer, à l’aide d’un vecteur*, dans le génome* d’une cellule hôte un ou plusieurs gènes* qui seront ensuite transmis dans la lignée cellulaire* issue des divisions de cette cellule transformée. La culture de cette cellule et la purification ultérieure du vecteur permettent de produire des quantités quasiment illimitées de copies du gène cloné que l’on désire étudier. 
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in vitro aboutissant à la formation de copies multiples, génétiquement identiques ou clones. En conditions naturelles, cette multiplication végétative est une voie normale pour un certain nombre d’espèces avec différents dispositifs (ex. tubercules, stolons, rejets, bulbilles, œilletons) ou horticoles (greffe, bouturage). Coacervation : séparation d’un système colloïdal en deux phases liquides. La phase la plus concentrée en colloïdes* est la phase coacervée, l’autre phase contenant principalement du solvant est appelée solution d’équilibre. Coagulation : 1. Dans le cas des protéines, formation d’un gel irréversible, soit par action enzymatique, soit par traitement thermique. La coagulation des protéines s’effectue à une température de l’ordre de 50 à 80 °C suivant leur nature. 2. Dans le cas du sang, formation d’un caillot permettant d’interrompre le saignement pour éviter l’hémorragie. Coagulopathie : anomalie de la coagulation* du sang, pouvant être due, par exemple, à la carence* en facteur de coagulation. Coenzyme : complexe organique ou organo-métallique qui associé à la partie protéique (apoenzyme) constitue l’hétéroenzyme ou enzyme* complète (holoenzyme). Les coenzymes sont souvent indispensables et en général favorisent le fonctionnement de l’enzyme. Les coenzymes interviennent dans les réactions de transfert de radicaux, les réactions d’isomérisation*, les oxydoréductions*, les réactions formant les liaisons covalentes*. Pour ce faire, elles doivent exister sous deux formes inter-convertibles (oxydée et réduite) durant la réaction catalysée. Le nombre de coenzymes connues à l’heure actuelle est sensiblement inférieur à celui des enzymes : une même coenzyme peut être combinée à différentes protéines pour former des enzymes différentes. Plusieurs coenzymes sont dérivées de vitamines* hydrosolubles. Par exemple, la biotine, le NADH et le FAD+ sont des coenzymes. Les coenzymes se trouvent à la même concentration que MFO[ZNF
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MPSganisme et doivent alors être apportées dans l’alimentation. Cofacteur : substance non-protéique, de faible poids moléculaire, thermostable ou ion métallique dont la présence est indispensable lors d’une réaction enzymatique.

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Les cofacteurs peuvent être : Z de nature organique : nucléotides transporteurs d’hydrogène, (NAD, NADP, FAD, ubiquinone), transporteurs d’autres groupements (ATP, GTP, UTP, CTP, coenzyme A, biotine…) ou cofacteurs vitaminiques (pyrophosphate de thiamine, phosphate de pyridoxal). Ces cofacteurs sont encore appelés coenzymes* ; Z de nature inorganique. Dans ce cas, il peut s’agir d’un ion métallique qui peut être intimement lié à l’enzyme*, qualifiée alors de métallo-enzyme. Dans les autres cas, l’en[ZNF
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.P2+, Zn2+). Le complexe enzyme-cofacteur est appelé holoenzyme; l’enzyme sans cofacteur et par conséquent inactive est une apoenzyme. Collagénase : enzyme* protéolytique* assurant la dégradation du collagène. Les collagénases de mammifères sont des métallo-enzymes et sont spécifiques des différents types de collagène. Des collagénases de micro-organismes sont très utilisées expérimentalement pour libérer et récupérer différents types de cellules à partir de tissus animaux, comme les adipocytes et les hépatocytes. Colloïde : dispersion ou mélange constitué par un liquide dans lequel le soluté, généralement solide, est dispersé de façon homogène en particules dont la dimension est supérieure à celle des molécules du solvant, mais trop petites pour être visibles au microscope photonique*. Les dispersions colloïdales ont la propriété de diffuser la lumière. Les colloïdes font donc la transition entre les solutions et les suspensions* de particules solides dans un liquide. Colonne échangeuse d’ions : colonne de chromatographie* composée d’un réseau de polymères* sur lequel sont fixés des groupements fonctionnels chargés positivement (colonne échangeuse d’anions) ou négativement (colonne échangeuse de cations). Colorant : 1. Substance chimique, naturelle ou synthétique, capable d’absorber les rayonnements lumineux dans la partie visible du spectre et qui apparaît ainsi colorée. Contrairement au pigment*, un colorant est soluble dans son milieu d’utilisation. 2. En technologie alimentaire, se dit de toute substance ajoutée dans les préparations alimentaires pour en améliorer l’apparence (couleur). Compléments alimentaires : denrées alimentaires dont le but est de compléter un régime alimentaire normal et qui constituent une source concentrée de nutriments* ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique. Ils sont conditionnés en doses, sous forme de comprimés, de gélules ou d’ampoules. Ils peuvent contenir des vitamines*, des sels minéraux, des oligo-éléments*, des plantes ou extraits de plantes, des acides aminés*, des protéines, des acides gras, des enzymes* ou des hormones*. Complémentation ou supplémentation : opération ayant pour but d’améliorer les qualités nutritionnelles de certaines protéines déficientes en acides aminés indispensables* (méthionine, lysine, thréonine et tryptophane, notamment) en ajoutant dans une ration* alimentaire, d’autres protéines non-déficientes. Les protéines de Céréales*, par exemple, pauvres en lysine, sont généralement complémentées en leur associant de

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petites quantités de lait ou de soja. La complémentation peut aussi porter sur d’autres types de nutriments* : énergétiques, minéraux ou vitaminiques. Les principales raisons qui conduisent à complémenter un aliment peuvent être : Z une perte de valeur nutritionnelle* au cours de traitement et de conservation ; Z une fabrication d’aliments nutritionnellement équilibrés ou répondant à des objectifs particuliers (aliments diététiques* ou de régimes) ; Z une lutte contre des maladies de carence*. Complexe immun : complexe se formant entre l’antigène* et l’anticorps* correspondant. Il peut être soluble, surtout en cas d’excès d’antigène ou insoluble (précipité) lorsque l’antigène et l’anticorps sont présents dans des proportions équivalentes. Compostage : processus par lequel les déchets organiques se décomposent naturellement en donnant un produit (compost) riche en matières organiques, utilisé ensuite en agriculture biologique. Concentrat : produit protéique issu de sources diverses (ex. concentrats de soja, de pois, de lait…) et dont la teneur moyenne en protéines varie de 45 à 85 % maximum, selon son origine. Son enrichissement en protéines est obtenu par l’élimination des composants non-protéiques de la matière première (ex. élimination des lipides, des sucres, des matières minérales) et non par extraction* sélective directe comme pour les isolats*. Conchyliculture : élevage des coquillages (mollusques*) à des fins alimentaires. Concrète ou essence concrète : résidu, solide ou semi-solide, obtenu par évaporation d’un solvant apolaire* volatil dans lequel on a fait au préalable macérer un végétal aromatique*. Les solvants les plus couramment utilisés sont l’alcool, le benzène, l’éther de pétrole, l’hexane, le cyclohexane… Configuration : arrangement des atomes d’une molécule dans l’espace. Les différentes configurations d’une même molécule donnent naissance à des stéréoisomères. Ex. disposition relative de deux substituants sur une ou plusieurs doubles liaisons ou sur des cycles (isomérie cis-trans). Configuration anomérique : un anomère est une configuration* particulière que l’on retrouve dans la chimie des aldoses ou des hexoses ou de leurs dérivés (formes cycliques de sucres, diastéréoisomères d’hétéroside*), des hémiacétals cycliques ou bien dans des familles de molécules apparentées qui ne diffèrent que par la configuration de carbone. L’anomère ayant la même configuration, dans la projection de Fischer, à l’atome de carbone asymétrique de référence est désigné par α ; l’autre l’anomère est désigné par β. Pour une utilisation correcte concernant les glucides, les descripteurs anomérique et configurationnelle doivent toujours être reliés entre eux ; par exemple α-D-glucopyranose, et non α-glucose. Confiserie : 1. Produit alimentaire à base de sucre tels que les fruits confits, bonbons, pates de fruits, pastilles, caramels, chewing-gums, dragées… 2. Secteur d’activité qui repose sur la maîtrise de la cuisson du sucre.

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Conformation : arrangement spatial des atomes d’une molécule de configuration* définie, à l’origine de l’existence de plusieurs stéréoisomères qui peuvent être interconvertis par rotations autour d’une ou de plusieurs liaisons simples. L’interconversion des molécules de conformations* différentes n’implique pas la rupture et l’établissement de liaisons chimiques (excepté des liaisons hydrogène* et, dans les protéines, les ponts disulfures) ou des changements de chiralité*. Dans le cas des protéines, la conformation est souvent critique pour l’activité biologique. Des termes spéciaux et des symboles distinguent les différentes conformations possibles de diverses classes ou parties de molécules. Conservateur : en technologie alimentaire, se dit de toute substance qui, ajoutée aux préparations alimentaires, prolonge leur durée de conservation en les protégeant entre autres des altérations dues aux micro-organismes. Ex. l’acide sorbique (E200) est utilisé contre les champignons* et les bactéries*. Conversion hydrolytique : transformation d’un produit par hydrolyse*. Copolymère : polymère* mixte constitué de plus d’un type de polymère. Ex. copolymères d’acide lactique et d’acide glycolique. Coprah : pulpe séchée de la noix de coco (Cocos nucifera, Arecacées), très riche en lipides (60-70 %). Corps gras : nom générique englobant aussi bien les huiles végétales (graines oléagineuses*, pulpes de certains fruits oléagineux*) que les huiles d’origine animale, les suifs, le beurre, les huiles de poissons (foie de poissons) ou les huiles de vertébrés aquatiques (huile de baleine). Ces substances de consistance variable, liquides ou fondant à une température peu élevée, insolubles dans l’eau, sont généralement peu solubles dans l’alcool, très solubles dans le chloroforme, saponifiables par les alcalis*. Cossettes : lors de l’extraction* du sucre, la betterave est découpée en « tranches » appelées cossettes. Cristallisation : arrangement en réseau cristallin d’atomes ou de molécules de manière régulière dans les trois dimensions de l’espace. Cela aboutit, si la préparation est très pure, à la formation de cristaux dont il est possible déterminer la structure par diffraction des rayons X*. Cryoprécipité : précipité obtenu par décongélation contrôlée d’une substance préalablement congelée. Culture discontinue alimentée : variante de la culture discontinue, le milieu est confiné mais on y apporte régulièrement des nutriments* de manière à augmenter la production de biomasse* et à supprimer les effets de répression par le substrat*. L’alimentation en nutriments est programmée dans le temps et peut être réglée pour assurer un taux de croissance donné. Culture discontinue non-alimentée (en batch) : procédé de culture de micro-organismes en milieu confiné jusqu’à épuisement des nutriments*. Toutes les cellules sont récoltées en même temps.

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Cytoculteur : enceinte stérilisable, à fond rond dans laquelle sont conduites des cultures de cellules sensibles au cisaillement*, de faible volume (< 5 m3), équipée d’une hélice. Ce dispositif permet de maintenir en continu une densité cellulaire* et un environnement gazeux constant ainsi qu’un apport de milieux frais et de récupérer les cellules produites.

D Décantation : opération consistant à éliminer les matières solides suspendues dans un liquide. Défécation : précipitation* d’éléments en suspension* dans une phase liquide, par action d’agents physiques ou chimiques. Ex. précipitation des protéines en solution par ajustement du pH* au pHi*. Dégénérescence maculaire : détérioration de la macula, petite zone de la rétine située au fond de l’œil, près du nerf optique. La dégénérescence maculaire entraîne une perte progressive et parfois importante de la vision centrale, qui devient de plus en plus floue. Comme elle touche surtout les personnes âgées, on la désigne le plus souvent par l’exQSFTTJPO
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Densitométrie : évaluation quantitative des spots sur les chromatogrammes sur couches minces, des gels d’électrophorèse* et caractérisation des substances séparées par enregistrement de leur absorbance ou de leur fluorescence. Dérivatisation : transformation chimique effectuée sur un produit ne pouvant être directement analysés par chromatographie en phase gazeuse* en vue d’améliorer sa stabilité, sa séparation chromatographique, sa volatilité, son isolement sélectif ou la sensibilité* de sa détection. Désamination : élimination d’un groupement aminé (–NH2) d’une molécule, par hydrolyse*. Désionisation : procédé utilisant des résines échangeuses d’ions* en vue d’éliminer les sels ionisés de l’eau. Le dispositif utilise des perles de résine qui contiennent des anions insolubles électriquement neutralisés par des cations sodium. Ce système adoucit l’eau dure par captage des ions calcium et magnésium de l’eau en les remplaçant par des ions de sodium. Désodorisation : élimination des impuretés (notamment des substances volatiles) odoriférantes par évaporation à basse pression, haute température (220-265 °C) et avec balayage d’un gaz inerte. Dessiccation : mode de conservation des produits par élimination de l’eau initialement contenue dans les tissus d’un organe végétal, par l’action combinée du vent et de la chaleur, soit en conditions naturelles (soleil), soit dans des séchoirs dans lesquels circule un courant d’air à 60-80 °C. La dessiccation est également réalisée par lyophilisation*. Les germes ne peuvent proliférer que dans un milieu suffisamment pourvu d’eau. Détergent : produit nettoyant possédant des propriétés de dissolution des graisses (savon, soude…). Détoxification : élimination des propriétés toxiques d’une substance dans un produit alimentaire par voie chimique (dissolution par des solvants), enzymatique ou microbiologique. Dextrane : polymère* composé de molécules de dextrose, utilisé entre autres pour diminuer la viscosité* du sang afin d’éviter la thrombose*. Il est aussi utilisé dans les techniques de chromatographie* d’exclusion (Sephadex). Dextrines : oligosides issus de l’hydrolyse* partielle de l’amidon* par l’α-amylase. Contrairement à l’amidon, les dextrines, sont caractérisées par une bonne solubilité* dans les solutions aqueuses. Une hydrolyse plus poussée donne du maltose et du D-glucose. Dextrogyre : se dit d’une molécule possédant un carbone asymétrique, qui en solution dévie vers la droite le plan de la lumière polarisée (dans le sens des aiguilles d’une montre). Cette propriété est indiquée par le signe (+) ou D, placé devant le nom de la substance chimique. C’est le cas des oses et des acides aminés* présentant la même structure que le D-glycéraldéhyde, sucre à 3 atomes CHO CHO ı ı de carbone, le plus petit des sucres possédant ı ı H C OH OH C H un carbone asymétrique pris comme référence. ı ı ı ı L’hydroxyle* porté par le carbone asymétrique CH2OH CH2OH se trouve à droite. D-glycéraldéhyde L-glycéraldéhyde

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Diabète : altération du métabolisme* glucidique liée soit à un déficit de production d’insuline* par le pancréas, soit à une résistance à son action. Elle se caractérise donc par un excès permanent de sucre dans le sang (hyperglycémie), ce qui a de multiples conséquences néfastes. On distingue le diabète de type 1 ou insulino-dépendant et le diabète de type 2 non-insulino-dépendant. Le diabète de type 1 peut se déclarer dès l’enfance. Il provoque la destruction des cellules β des îlots de Langerhans du pancréas productrices de l’insuline d’origine auto-immune ou inconnue (diabète idiopathique). Le diabète de type 2, le plus courant parmi les personnes qui souffrent de diabète, est défini par la présence d’une insulino-résistance (c’est-à-dire une moindre sensibilité* à l’insuline des cellules cibles de l’organisme : tissu adipeux, foie et muscles) et éventuellement d’une insulinopénie relative (c’est-à-dire une moindre sécrétion d’hormone* en réponse au glucose), associées de façon variable. Cette insulinorésistance touche essentiellement les adultes en surpoids. Leur organisme ne réussit plus à réguler correctement le métabolisme du sucre. Diafiltration : méthode qui consiste, au cours d’une séparation par ultrafiltration* ou par microfiltration*, à ajouter de l’eau ou une solution appropriée au rétentat, qui est ensuite retraité afin de mieux éliminer les petites molécules résiduelles. Diagnostic : dans un sens général, acquisition d’une connaissance à partir de signe et d’un raisonnement permettant d’identifier l’origine ou la cause d’un problème (défaillance d’un appareil ou d’un dispositif…). Z En biologie, détermination d’une espèce à partir de ses caractères morphologiques ou autres. Z En biologie moléculaire*, mise en évidence de la présence d’une séquence d’acide nucléique* particulière par hybridation avec des sondes moléculaires spécifiques. Cette méthode, appelée également diagnostic génétique, est utilisée par exemple pour le diagnostic prénatal de certaines maladies héréditaires ou pour la détermination parentale. Z En biochimie*, recherche et mise en évidence d’un produit donné, par une méthode physico-chimique, immunologique, enzymatique ou autre. Z En médecine, identification d’une maladie à partir de ses symptômes (in vivo) ou à partir d’analyses de prélèvements (in vitro). Dialyse : méthode de purification permettant de séparer des molécules selon leur taille par diffusion* à travers une membrane dialysante. La dialyse permet soit de concentrer une solution biologique (élimination de solvant), soit de dessaler (élimination d’ions d’une solution protéique). Diffusion : tendance qu’ont les substances (ions ou molécules) à se déplacer d’une zone où leur concentration est plus élevée vers celle où leur concentration est moins élevée, afin de se répartir uniformément. Elle est dite « facilitée » lorsque le passage de molécules ou d’ions à travers une membrane biologique suit un gradient électrochimique, facilité par un transporteur protéique transmembranaire ou un canal ionique spécifique, sans dépense d’énergie.

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Digestibilité : mesure de l’aptitude d’un aliment à être digéré. C’est l’une des conditions pour qu’un produit offre un intérêt nutritionnel. Elle varie beaucoup avec la nature des nutriments*. La moindre digestibilité et, donc, la moindre valeur nutritionnelle* des protéines végétales par rapport aux protéines animales sont souvent dues à leur association à des facteurs antinutritionnels*. La digestibilité d’un nutriment est mesurée par différence entre la quantité ingérée et la quantité excrétée dans les fèces, exprimée habituellement en pourcentage de la quantité ingérée : 100 × (ingestion – excrétion) / ingestion Dispersant : substance capable de provoquer et de maintenir une suspension* de particules solides au sein d’une phase liquide. Distillation : processus qui utilise la chaleur pour vaporiser des molécules volatiles contenues dans une matrice* liquide ou solide pour les condenser ensuite en produit pur. Diurétique : qui augmente l’excrétion de l’urine. Durcissement : dans le cas des huiles, synonyme d’hydrogénation*. Dysfibrinogénémie : affection altérant la qualité du fibrinogène*.

E Echange d’ions : procédé dans lequel les ions d’une certaine charge contenus dans une solution (par exemple des cations) sont échangés contre d’autres ions de même polarité* préalablement fixés sur une résine dite « échangeuse d’ions* ». Ce procédé est utilisé, par exemple, pour adoucir l’eau. Ecloserie : en aquaculture*, on désigne par écloseries les lieux où se pratiquent la reproduction artificielle, l’éclosion et l’élevage des premiers stades de développement des mollusques*, des poissons et des crustacés. EDTA : voir acide éthylène diamine tétra-acétique Edulcorant : produit qui, ajouté à une denrée alimentaire, lui donne une saveur* sucrée sans pour autant augmenter sa valeur énergétique. Il est issu de plantes saccharifères, de Céréales*, de fruits ou du lait (glucose, fructose) ou produits par synthèse ou hémisynthèse* (aspartame, cyclamates, saccharine…). En fonction de leur pouvoir sucrant, on en distingue deux catégories : les édulcorants « massiques » – ou polyols – au pouvoir sucrant du même ordre que le saccharose (pris comme référence) et les édulcorants « intenses », au pouvoir sucrant 100 à 1000 fois plus intense que le saccharose. Les édulcorants sont considérés comme des additifs alimentaires* au sens de la réglementation. Leur présence doit donc être mentionnée dans la dénomination de vente du produit de même que le nom de l’édulcorant, ou son code européen, doit figurer sur la liste des ingrédients* (par exemple : « aspartame » ou « E951 »). Ils sont autorisés à des doses d’emploi spécifiques pour chaque catégorie d’aliments et sont interdits dans l’alimentation infantile*.

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Effluents : ensemble des eaux usées rejetées par une usine (laiterie, huilerie, amidonnerie*…). Ces polluants constitués de molécules organiques (phénols, polyphénols*, sucres, acides, alcools…), souvent difficilement dégradables, risquent d’occasionner des dommages aux cours d’eau (eutrophisation*). Eicosanoïdes : composés dérivant des phospholipides*, doués d’activités similaires à celles des hormones*, utilisés par l’organisme pour la synthèse des prostaglandines*, thromboxanes*, leucotriènes*, lipoxines et cannabinoïdes. Elastine : glycoprotéine* responsable de l’élasticité des tissus des vertébrés. C’est un polymère* amorphe et hydrophobe* qui est totalement insoluble dans l’eau et dans les solvants organiques, de 50 à 70 kDa, riche en glycine (1/3 des acides aminés* constitutifs) et en proline et de structure hélicoïdale. L’association latérale des hélices donne des fibres élastiques localisées dans les tissus conjonctifs qui subissent de fortes déformations, comme les parois des vaisseaux, les ligaments, les alvéoles pulmonaires, la peau. C’est l’élastine qui confère aux fibres élastiques du derme leur élasticité et leur résilience et permet à la peau de reprendre sa position d’origine quand elle est pincée ou étirée. Elastomère : macromolécule résultant de la polymérisation de monomères* naturels ou synthétiques, mais se distinguant des plastiques par une propriété physique essentielle qui est de se déformer à la moindre sollicitation mécanique à température ambiante. Les silicones, les caoutchoucs, naturels produits par l’Hevea brasilensis, ou artificiels à partir de la pétrochimie*, en sont des exemples. Electrolyte : molécule se dissociant en phase aqueuse en ions comme le NaCl qui donne des anions Cl– et des cations Na+. Les électrolytes sont responsables entre autres de la conduction du courant électrique dans une solution. Électrophorèse : technique permettant la séparation de molécules chargées électriquement en fonction de leur mobilité relative sur un support (gel d’agarose, gel de polyacrylamide…) imprégné d’une solution électrolytique et parcouru par un champ électrique. Le champ électrique est produit dans la solution entre deux électrodes par l’application d’une différence de potentiel à l’aide d’un générateur de courant continu. La mobilité relative est fonction de leur charge nette (elle-même dépendante du pH* du milieu utilisé), de leur taille, du support de migration (viscosité* notamment) et de l’intensité du champ électrique appliqué. L’électrophorèse est avant tout une méthode analytique employée pour identifier et doser les protéines présentes dans un milieu complexe. C’est également l’une des étapes de l’analyse des empreintes génétiques. Electrophorèse capillaire (EC) : méthode analytique de haute résolution utilisée pour séparer les molécules ionisées selon leur charge, les forces de friction et leur rayon hydrodynamique, sous l’effet d’un champ électrique (typiquement 10-30 kV). Cette technique utilise des capillaires très étroits (25-100 mm d.i.) remplis de silice et dont la surface interne est tapissée d’une phase stationnaire*. Le suivi de la migration des molécules se fait habituellement à l’aide d’un détecteur à fluorescence ou à l’aide d’un spectromètre de masse couplé.

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Electroporation : technique d’introduction d’ADN* recombiné dans les cellules consistant à soumettre une suspension* de protoplastes* à de brèves impulsions électriques. Le courant électrique crée dans la membrane plasmique des trous temporaires par polarisation des phospholipides* la constituant. Les protoplastes sont ensuite mis en culture. Si le choc électrique n’a pas été trop violent, le phénomène est réversible et la membrane reprend ensuite son état initial, laissant le protoplaste parfaitement viable. Elicitation : déclenchement d’un phénomène biologique ou biochimique, comme l’accélération d’un métabolisme*, la synthèse d’antibiotique lors d’attaques de plantes par des bactéries* ou des champignons…, sous l’effet d’une substance (éliciteur), endogène ou exogène. L’éliciteur peut être biotique (polysaccharide, protéine, substance de croissance…) ou abiotique* (métal, proton, lumière…). Les éliciteurs sont exploités en culture in vitro pour induire la production des substances désirées. Ainsi, l’addition d’acide (pH* de 5,5 à 3,5) peut augmenter la production de certains alcaloïdes* dans les cultures de lupin. ELISA (test –) : test immuno-enzymatique sur plaque de microtitration où la réaction antigène*/anticorps* est révélée par l’action d’une enzyme* (couplée à l’anticorps ou l’antigène) sur un substrat* chromogène et dont le résultat est suivi par spectrophotométrie. Il permet de détecter et de doser une protéine dans un liquide biologique. Il est aussi utilisé pour le diagnostic* et le dosage des virus. Le test ELISA a trouvé de nombreuses applications par suite de sa qualité, de sa simplicité et de sa reproductibilité. Il présente une haute spécificité*, grâce à l’emploi d’anticorps monoclonaux produits in vitro, et sa sensibilité* est 1000 fois plus élevée que celle des méthodes sérologiques classiques. Ces qualités lui ont permis d’être adopté comme technique de contrôle de routine par de nombreux laboratoires. Des coffrets de diagnostic sont commercialisés à cet effet. Embolie pulmonaire : une embolie pulmonaire est l’obstruction brutale d’une artère pulmonaire par un caillot de sang. Embryogenèse : ensemble des transformations qui se déroulent au niveau d’un œuf fécondé et ceci jusqu’au développement total de l’embryon. Emulsifiant : substance permettant de réaliser et de stabiliser une émulsion*. Les émulsifiants sont des molécules qui présentent à la fois un pôle hydrophile* et un pôle hydrophobe* ou lipophile* ce qui leur permet, en se plaçant à l’interface huile-eau, de stabiliser les émulsions thermodynamiquement instables. Les phosphoglycérides sont d’excellents émulsifiants (lécithines de soja ou de jaune d’œuf) ainsi que les monoglycérides ou diglycérides, la gomme arabique* et certaines protéines du lait. Emulsion : milieu hétérogène constitué de deux phases liquides non-miscibles dont l’une est dispersée à l’état de particules très fines dans l’autre (phase dispersante). C’est le plus souvent le mélange résultant d’une phase aqueuse (lait écrémé, vinaigre…) et d’une phase grasse (crème du lait, huile…). On distingue : Z les émulsions huile/eau : la phase grasse est dispersée dans la phase aqueuse. C’est le cas de la vinaigrette, de la crème du lait, des pâtés*, mousses* de foie…

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Z les émulsions eau/huile : la phase aqueuse est dispersée sous forme de fines gouttelettes

de quelques microns de diamètre dans la phase grasse. C’est le cas du beurre et de la margarine*. Enantiomères : désigne chacune des deux configurations*, images l’une de l’autre dans un miroir plan d’une même molécule (comme la main droite et la main gauche). Ces deux énantiomères ont même composition chimique et possèdent un atome asymétrique. On dit aussi qu’ils sont chiraux (du grec kheri, main) car ils sont symétriques l’un de l’autre comme les deux mains, donc non-superposables. Encapsulation : procédé d’immobilisation* d’une molécule bioactive* (ex. enzyme*), de cellules ou de micro-organismes emprisonnés à l’intérieur d’un espace délimité, totalement ou partiellement, par une membrane semi-perméable, qui permet leur diffusion*. L’encapsulation des cellules les protège et leur confère une plus grande viabilité. Cette stabilité est importante pour la conservation des souches, mais aussi pour la mise en œuvre de procédés continus de bioconversion*. La matrice* d’immobilisation est généralement constituée de polymères* comme les alginates ou les carraghénanes. Endotoxine : lipopolysaccharide toxique situé dans la surface externe de la paroi de certaines bactéries* à Gram* négatif et qui est libéré lors de la rupture de la paroi, consécutive à la mort de la bactérie. Les endotoxines sont responsables de divers symptômes tels que la fièvre, la diarrhée, une inflammation, un état de faiblesse ou de choc… Ensilage : technique de conservation humide de végétaux coupés verts et non-séchés de différentes espèces (ex. graminées avec leurs feuilles et tiges) par fermentation* lactique anaérobie* ; l’acidification qui en résulte empêche la multiplication d’autres bactéries* indésirables qui feraient pourrir les plantes. L’ensilage sert pour l’alimentation des bovins en complément et en dehors de la saison des pâturages. Entérocyte : cellules les plus internes de l’intestin grêle. Enzyme : substance protéique élaborée par des cellules qui catalyse ou accélère une transformation biochimique, caractérisée par une grande efficacité catalytique et une haute spécificité* (par rapport à la réaction et au substrat*) ; elle agit en infime quantité et ne se retrouve pas modifiée à la fin de la réaction. L’organisme renferme un grand nombre d’enzymes qui jouent toutes un rôle physiologique spécifique : inhibition, déclenchement ou accélération d’une réaction, hydrolyse* ou liaison de molécules particulières… Ex. l’amylase permet de transformer l’amidon* en maltose et glucose. Enzyme immobilisée : enzyme* fixée sur une matrice* solide ou semi-solide. Cette fixation peut se faire par différents mécanismes : adsorption*, liaison covalente*, encapsulation* ou réticulation*. Les enzymes immobilisées sont utilisées dans diverses applications commerciales comme les lipases immobilisées permettant d’hydrolyser les graisses. Epaississant : substance ayant l’aptitude d’accroître la viscosité* d’un liquide dans lequel elle est incorporée. Souvent à dose élevée, ils ont un pouvoir gélifiant*. Espèces réactives de l’oxygène (ROS) : groupe de composés contenant des atomes d’oxygène partiellement réduits et ayant une réactivité chimique importante. Ces composés

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produisent des radicaux libres* et provoquent un stress oxydatif*. Les radicaux libres réagissent notamment sur les acides gras insaturés, les protéines et les acides nucléiques*. Esters éthyliques : composants des biocarburants*, obtenus par une opération de transestérification* avec de l’éthanol des huiles végétales. Esters méthyliques : composants des biocarburants*, obtenus par une opération de transestérification* avec du méthanol des huiles végétales. Estérification : réaction chimique qui combine un acide, par exemples des acides gras naturels, avec un alcool (méthanol, butanol, alcool gras…) ou polyol (glycérol, polyéthylène glycol…), pour former un ester. L’enzyme* impliquée est appelée une estérase. Etalon : composé pur et stable ou échantillon contenant une quantité connue d’un composé utilisé pour calibrer une méthode de dosage (courbe étalon*) ou un appareil (ex. un pHmètre). Etudes épidémiologiques : études analytiques basées sur des observations cliniques ou des études de répartition d’une maladie (par exemple un cancer) au sein d’une population dans une région donnée et aboutissant à la formulation d’hypothèses de relation entre cette maladie et un ou divers facteurs susceptibles d’exercer une influence sur la fréquence et l’évolution de la maladie. Ces études se font souvent à très long terme. Eubactéries : ensemble des Procaryotes* dont on a séparé les Archaebacteria, aujourd’hui classées dans un règne à part en raison de certaines particularités comme la structure et la composition de leurs parois cellulaires*, la structure de leurs membranes (fluidité des lipides membranaires), leur métabolisme*, leurs ARN* 16S. Les Eubactéries représentent la plupart des bactéries* connues (plus de 9000 espèces), vivant dans les sols, les eaux et les êtres vivants. Eucaryote : organisme à noyau individualisé (existence d’une enveloppe nucléaire). Parmi les Eucaryotes, on range les champignons, les végétaux et les animaux. Ils peuvent être unicellulaires (levures*, protozoaires) mais plus souvent pluricellulaires. Eutrophe : qualifie l’état d’un milieu aquatique où existe une concentration élevée de ressources alimentaires ce qui entraîne la prolifération d’algues et d’autres autotrophes invasifs et de bactéries* qui les dégradent, en consommant l’oxygène, ce qui provoque l’asphyxie des autres formes de vie aquatique, en particulier la mort partielle ou totale de la vie animale. Eutrophisation : prolifération d’organismes dans un milieu aquatique naturel, faisant souvent suite à une pollution* organique ou minérale excessive, notamment par les nitrates et les phosphates d’origine agricole ou industrielle. L’eutrophisation conduit à une modification de l’équilibre biologique. Ainsi, la prolifération des végétaux aquatiques et surtout des bactéries* qui les dégradent et qui sont de gros consommateurs d’oxygène ; le développement de l’anaérobiose* provoque l’asphyxie des autres formes de vie aquatique, en particulier la mort partielle ou totale de la vie animale… Excipient : substance biologiquement neutre dans laquelle on incorpore des principes actifs* pour les rendre plus facilement absorbables.

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Exhausteur de goût ou agent de sapidité : substance qui ne possède pas de goût propre mais qui renforce l’effet des autres ingrédients* présents dans une denrée alimentaire. C’est le cas du glutamate de sodium que l’on trouve dans les conserves de légumes, par exemple. Exopolysaccharide (EPS) : polysaccharide de haut poids moléculaire, produit par un micro-organisme, soit sous forme de capsules insolubles ou de mucus solubles en contact avec le milieu extérieur. Ils servent de protection et éventuellement aussi à la reconnaissance par des organismes hôtes. Ex. cellulose bactérienne, curdlane (tous deux étant des glucanes). Expression : méthode mécanique utilisée pour obtenir les huiles essentielles du péricarpe des fruits d’agrumes (orange, pamplemousse, mandarine…), en le soumettant à une forte pression à l’aide d’une presse hydraulique. Extraction : opération technologique ayant pour but d’isoler une substance donnée du milieu complexe dans lequel elle se trouve, à côté d’autres substances, souvent au moyen d’un solvant. Il existe trois principaux modes d’extraction liquide-solide, liquide-liquide, solide-fluide supercritique*. Elle peut se faire de différentes manières : Z par broyage de la matière organique suivi d’une décantation* ou d’une centrifugation*, c’est le cas pour les substances solubles notamment; Z par pression, procédé utilisé pour les produits huileux; Z par des solvants (hexane, trichloroéthylène…) dans le cas des matières grasses. Les graines des oléagineux* sont d’abord broyées et chauffées pour faciliter l’extraction de l’huile. Le solvant utilisé doit être aussi spécifique que possible de la nature de l’huile désirée. Il est ensuite éliminé par distillation* ou par entraînement à la vapeur. Extraction supercritique : procédé d’extraction* à l’aide d’un fluide à l’état supercritique* (fluide dont la pression et la température sont supérieures à leurs valeurs critiques). Par exemple, le dioxyde de carbone atteint l’état supercritique à 73 bars à la température de 31 °C. Ses propriétés physiques dans ces conditions sont proches de celles des solvants organiques d’extraction traditionnelle mais son état supercritique assure une efficacité d’extraction et une facilité de traitement considérable. Ce procédé est utilisé, entre autres, pour l’extraction des huiles essentielles, pour la fabrication des aliments fonctionnels* parce qu’elle ne nécessite pas de solvants. Extrêmophile : qualifie un organisme capable de vivre dans des milieux où les conditions s’écartent fortement de celles que la plupart des autres espèces vivantes sont capables de supporter. Comprenant les halophiles extrêmes et les thermophiles* extrêmes, on distingue notamment des : Z psychrophiles* : froid permanent (< 5 °C) ; Z hyperthermophiles* : température élevée ; Z acidophiles* : milieu acide des sources volcaniques sulfureuses, lacs volcaniques ; Z halophiles* : haute concentration en sel ; Z alcalinophiles* : eaux très alcalines (pH* > 10) ; Z barophiles* : hautes pressions dans les grands fonds marins.

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Extrusion : procédé qui consiste à soumettre une matière première ou un mélange hydraté à l’action conjuguée ou non de la pression et de la température pendant une courte période de temps afin de les mettre en forme par passage forcé à travers une grille comportant des orifices de faible diamètre. Le produit extrudé pouvant être ensuite découpé, éventuellement séché avant conditionnement.

F Facteurs antinutritionnels : substances chimiques, de natures variées, présentes à dose variable, notamment dans les graines de protéagineux* et d’oléagineux* diminuant soit directement la qualité nutritionnelle des aliments ingérés, soit indirectement par leurs produits de dégradation. En font partie aussi les substances qui peuvent avoir des effets sur la prise des aliments. Les troubles qu’ils provoquent vont de la simple astringence* et la flatulence* (ex. glycosides, sucres fermentescibles*) jusqu’à de possibles hypertrophies du pancréas ou de la glande thyroïde en passant par de fréquentes inhibitions de certaines enzymes* digestives (ex. facteur antitrypsique*) ou la perturbation des capacités d’absorption des cellules intestinales (ex. lectines*). Facteur antitrypsique : protéine se liant spécifiquement et de manière stable aux protéases à sérine comme la trypsine* et la chymotrypsine* et inhibant leur activité. Lors de la digestion ces enzymes* ne peuvent plus alors jouer leur rôle normal d’enzymes digestives. Divers facteurs antitrypsiques se retrouvent en particulier dans les graines de la plupart des Légumineuses* (pois, soja), des Céréales* et les tourteaux* de diverses graines oléagineuses* (soja par exemple). Facteurs d’attachement  : substances qui vont favoriser l’adhésion et l’étalement des cellules sur le support (verre ou plastique) et qui sont soit synthétisées par les cellules (protéines membranaires appelées intégrines), soit apportées par le milieu de culture comme des glycosaminoglycanes (acide hyaluronique), des protéoglycanes (aggrégane, perlécane, syndécane…) ou des protéines (collagène, fibronectine*, laminine, ténascine, vitronectine…) Elles dépendent également de la nature du support utilisé, en général en plastique : polystyrène traité physiquement pour exposer des charges négatives. Facteur de croissance : substance chimique, de nature polypeptidique, ayant divers rôles importants dans la stimulation de la croissance et de la différenciation des cellules et dans leur maintien en vie. Elle se fixe à la surface cellulaire sur des récepteurs spécifiques. Font partie de cette famille : l’insuline*, la somatotropine (ou hormone* de croissance), la prolactine, certaines cytokines… Féculents : aliments riches en amidon* : pomme de terre, blé, maïs, riz, manioc… Femtomole : unité de mesure de quantité de matière du Système International (SI), valant 10−15 mole, et dont le symbole est fmol.

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Fermentation : 1. Transformation d’un substrat* organique, utilisant des micro-organismes, en présence d’oxygène (fermentation aérobie*) ou en son absence (fermentation anaérobie*). 2. Ensemble des processus de transformation de composés organiques par des cellules pour produire de l’énergie chimique sous forme d’ATP en conditions anaérobies. Dans les cellules anaérobies, c’est le seul processus produisant de l’énergie. 3. D’un point de vue technologique, la fermentation se définit comme l’ensemble des opérations qui permettent de cultiver des micro-organismes et de contrôler leurs activités biosynthétiques : production d’enzymes*, de molécules à haute valeur ajoutée*… dont l’homme a besoin pour son alimentation ou son industrie. Fermentescible : se dit d'un sucre qui favorise la croissance des micro-organismes par fermentation*. Certains sucres fermentent directement, tels que le glucose ou le lévulose ; d’autres ne peuvent fermenter qu’après hydrolyse*  ; ce sont, par exemple, le saccharose qui est transformé en sucre inverti* par l’invertase de la levure de bière, le maltose. Par contre, l’amidon ne peut être utilisé par les levures* que s’il a été préalablement hydrolysé en maltose. Fermenteur : enceinte généralement en verre ou en inox, stérilisable, dans laquelle se déroulent les fermentations* microbiennes et, d’une façon plus générale, la culture de micro-organismes ou de cellules en vue de la production industrielle de métabolites* divers (acides aminés*, acides organiques, antibiotiques, alcaloïdes*, alcools, enzymes*, hormones*, vitamines*…). Il permet aussi des essais au laboratoire en conditions contrôlées comme le traitement des eaux usées, la biotransformation* et la biodégradation* de déchets agricoles… Le fermenteur permet de mettre en jeu tous les systèmes de brassage, d’aération et de contrôle du milieu. Feuillus : groupe d’arbres dont les feuilles, généralement à limbe large, tombent à l’automne; ils font partie des Angiospermes. Fibres alimentaires : nom générique désignant l’ensemble des substances d’origine végétale et qui, bien que comestibles, ne sont pas digérées dans l’intestin grêle ayant une capacité plus ou moins grande à fixer l’eau et ainsi à augmenter le volume des selles. Les fibres subissent, toutefois, l’action fermentaire de la flore colique anaérobie* qui aboutit à leur dégradation, plus ou moins importante avec production de gaz. On distingue les fibres insolubles (cellulose, lignine*, certaines hémicelluloses…) et les fibres solubles (certaines hémicelluloses, pectines, gommes, inuline…). Fibrinogène : protéine plasmatique soluble dans le sang circulant et devenant insoluble lorsqu’elle se transforme en fibrine sous l’influence de la thrombine lors de la coagulation*. L’absence ou le déficit en fibrinogène entraîne des syndromes hémorragiques graves. Chauffé à 50-60 °C en présence de calcium, il forme un gel translucide. Ses propriétés liantes sont utilisées en charcuterie*. Fibrinolyse : processus de destruction physiologique qui rentre dans le système de coagulation* et consiste en la dissolution des caillots sanguins (constitués de fibrine) sous l’action protéolytique* de la plasmine ou d’autres enzymes* comme la streptokinase ou les protéases extraites des venins de serpents.

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Fibronectine : c’est une glycoprotéine* de 440 à 450 kDa, composée de deux sous-unités de 220 à 250 kDa liées du côté C-terminal par une paire de ponts disulfures que l’on rencontre dans la matrice* extracellulaire et qui permet l’ancrage des cellules sur les parois des récipients de culture. Filtration : procédé de séparation des constituants solides d’une phase fluide selon leur taille, par passage à travers un support poreux, appelé filtre. Les filtres utilisés sont de natures différentes (ex. papier, acétate de cellulose, nylon, fibres de verre…). Flatulence : troubles gastro-intestinaux dues à l’accumulation de produits gazeux divers dans l’appareil digestif créant un ballonnement. Ces troubles peuvent être provoqués par la présence, dans la ration* alimentaire, de sucres (α-galactosides) comme le raffinose et le stachyose ou le verbascose. Ces sucres sont difficilement hydrolysés par les enzymes* digestives mais sont, en revanche, consommés par la flore intestinale* en donnant des catabolites gazeux (hydrogène, dioxyde de carbone, méthane, azote, amines volatiles…). De tels sucres sont fréquemment associés aux protéines végétales (ex. protéines de Légumineuses*); on les en débarrasse par solubilisation dans l’eau par exemple, suivie d’une cuisson avant d’envisager leur utilisation dans l’alimentation humaine. Flaveur : ensemble des caractéristiques organoleptiques* des aliments perçues par les systèmes sensoriels olfactifs et gustatifs qui sont donc des chimiorécepteurs. Floculation : phénomène d’agglomération (insolubilisation) de particules en suspension* colloïdale dispersée en agrégats de grandes tailles, sous l’effet de facteurs physiques (ex. chaleur) ou chimiques (ex. acide), provoquant leur précipitation* et clarification du milieu dans lequel elles se trouvent. Elle est facilitée par l'ajout de floculants. Flore intestinale ou micobienne : ensemble des nombreuses bactéries* qui vivent naturellement dans les intestins. Ces bactéries ne présentent aucun danger et elles sont même bénéfiques puisqu’elles finalisent la digestion et synthétisent certaines vitamines*. De plus, elles neutralisent certaines toxines et les bactéries pathogènes. Fluide supercritique : fluide dont la pression et la température sont supérieures à leurs valeurs critiques. Par exemple, le dioxyde de carbone, fluide le plus utilisé, atteint l’état supercritique à 73 bars à la température de 31 °C. Comparées à celles des solvants organiques d’extraction* conventionnelle, les propriétés physiques des fluides à l’état supercritique sont meilleures  : leur diffusion* plus rapide, leur viscosité* et leur tension de surface* plus faibles assurent une facilité de traitement tout en ayant une efficacité d’extraction considérable. De plus, leur pouvoir de solubilisation peut être ajusté en changeant la pression ou la température de travail ou en leur ajoutant des modifiants. Par exemple, le dioxyde de carbone supercritique, ayant une polarité* similaire à celle de l’hexane, peut être additionné de modifiants organiques comme l’eau, le méthanol ou l’acétonitrile (habituellement de 1 à 10 %) pour augmenter sa polarité et extraire des analytes plus polaires*. Fluorimètre : appareil permettant de mesurer la fluorescence d’une molécule présente dans un échantillon. Le fluorimètre modulé permet lui de déterminer un certain nombre de paramètres de la photosynthèse* de façon non-intrusive.

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Foin : herbe des prairies qui a été fauchée, séchée par le soleil pour servir de nourriture au bétail durant l’hiver. Fonctionnelles (propriétés –) : ensemble des propriétés d’une substance, autres que nutritionnelles, permettant son utilisation dans la formulation et/ou la fabrication de produits alimentaires, diététiques, pharmaceutiques, cosmétiques… Les propriétés fonctionnelles des protéines peuvent être classées en trois groupes principaux : Z celles liées à leur comportement vis-à-vis de l’eau (absorption, rétention, viscosité*…), Z celles dépendantes de leur comportement les unes vis-à-vis des autres (floculation, précipitation*, gélification*…), Z celles résultant de leur comportement lorsqu’elles se trouvent à la frontière de deux phases différentes (pouvoir émulsifiant*, pouvoir moussant*). Fongicide : produit utilisé dans la lutte contre les maladies cryptogamiques. Force du gel : pour la gélatine, la force du gel est la force, exprimée en grammes, nécessaire pour enfoncer de 4 mm un piston standard dans le gel à l’aide d’un instrument de mesure de force. Force ionique : expression de la concentration ionique définie par l’équation I = ½Σ[i]Zi2 dans laquelle [i] et Zi représentent la concentration et la charge nette de l’espèce ionique i. Le signe Σ exprime l’addition de tous les ions présents dans la solution. La force ionique d’un tampon* constitué par des ions monovalents est équivalente à la molarité de la solution. Fourrage : ensemble des plantes cultivées ou qui poussent naturellement dans les prés (plantes fourragères) servant d’aliment au bétail et consommées fraiches, sèches ou après ensilage*. Le fourrage est en général composé des feuilles et des tiges des plantes. La population microbienne du rumen* permet aux ruminants* de digérer les fibres contenues dans les fourrages. Pour les bovins, par exemple, les plantes fourragères couramment cultivées sont : le trèfle, le sainfoin, la luzerne, le ray-grass, les betteraves fourragères, le maïs, l’orge, le sorgho fourrager, le soja, le lupin, le pois, les féveroles… Fractionnement : opération technologique ayant pour objet de séparer puis de récupérer individuellement les composants d’un mélange en différentes fractions en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques (densité, pHi*…). Parmi les techniques mises en œuvre figurent, par exemple, des techniques chromatographiques comme la chromatographie d’échange d’ions*, la chromatographie d’exclusion moléculaire*, ou des techniques de partage liquide-liquide. Friture : mode de cuisson d’un aliment qui consiste à le plonger dans de la matière grasse chauffée. Fromage à pâte fraîche : fromage n’ayant subi que la fermentation* lactique mais pas d’affinage*. Ex. petits suisses. Fromage à pâte molle : fromage qui ne subit au moment de sa fabrication ni cuisson, ni pressage. La pâte est alors onctueuse voire coulante. Ex. camembert, brie.

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Fromage à pâte pressée : fromage dont le caillé* subit un ou plusieurs pressages au moment du moulage afin d’éliminer le maximum de lactosérum*, puis laissé à l’affinage*. Ex. gruyère, emmental. Furanose : monosaccharide simple constitué d’un cycle à 5 sommets, le furane : 4 atomes de carbone et 1 atome d’oxygène.

G Galénique : la pharmacie galénique ou galénique, est la branche de la pharmacie qui concerne la mise en forme des produits pharmaceutiques ; formes galéniques d’un médicament : sirop, capsules, comprimés, gélules, suppositoires… Pour un produit cosmétique : émulsion*, crème, lait, gel, stick, baume, spray… Galvanoplastie : dépôt d’une couche de métal par électrolyse sur un objet dans un but de protection ou d’embellissement. Gazéification : processus de transformation d’un solide en gaz. Cette gazéification est utilisée pour convertir des matières carbonées (biomasse*) en un gaz par pyrolyse à haute température suivie d’une oxydation* partielle en présence d’air, de vapeur d’eau ou d’oxygène pur. Gel : système biphasique constitué par un réseau macromoléculaire formant une maille qui englobe une phase liquide. Le gel est dans un état ordonné par rapport à la solution qui est un système non-ordonné. La formation d’un gel dépend d’une association d’interactions, le gel pourra être modifié par les conditions physico-chimiques du milieu (phénomène de réversibilité). Gel-filtration : voir chromatographie d'exclusion stérique Gélifiant : substance qui transforme une denrée alimentaire (solution ou suspension* aqueuse) en gel. On utilise des polysaccharides (galactanes essentiellement) comme les carraghénanes, l’agar-agar, les pectines, les alginates, la gomme arabique* et des protéines comme le collagène (gélatine) mais aussi des protéines qui forment un gel irréversible à la chaleur (caséines, albumines du lait, blanc d’œuf, plasma sanguin…). Gélification : la gélification est un procédé par lequel un liquide va se transformer en gel* (état de la matière intermédiaire entre l’état liquide et l’état solide). Ce changement d’état est dû à l’établissement de liaisons intermoléculaires sous l’action d’un facteur physique, comme la température, ou chimique, comme la présence d’un catalyseur*. Gène : unité d’information génétique située à un endroit bien précis (locus) sur l’ADN* chromosomique et constituée d’une séquence spécifique de nucléotides dans l’ADN ou dans l’ARN* (chez certains virus) et transmise de génération en génération par les gamètes. Chaque région de l’ADN qui produit une molécule d’ARN fonctionnelle est un gène, responsable d’une fonction spécifique, correspondant le plus souvent à la synthèse d’une protéine contrôlant un caractère particulier. Outre la séquence codant pour cette protéine, le gène comprend des séquences qui en permettent et régulent

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l’expression. L’organisme entier peut donc être considéré comme la résultante de l’expression de l’ensemble de ses gènes ou génome*. Génie génétique ou moléculaire : ensemble de méthodes et techniques portant sur la manipulation des gènes* in vitro à des fins pratiques. Ces manipulations peuvent porter sur l’activation ou l’inactivation des gènes, de leur isolement et de leur introduction dans un autre organisme qui ne les possède pas dans son patrimoine génétique. Suite à ces modifications génétiques, l’organisme concerné présente de nouvelles caractéristiques qui apparaitront également dans le patrimoine génétique des cellules des descendants. Ces techniques permettent de s’affranchir de la barrière de l’espèce et abouUJTTFOU
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0(.  Génie tissulaire ou ingénierie de tissus : application de principes et de méthodes scientifiques pour le design, la construction, la modification, le développement de substituts tissulaires et la restauration et l’amélioration de la fonctionnalité de tissus vivants, normaux ou pathologiques. Génome : ensemble du matériel génétique présent dans chaque cellule d’un individu, d’une espèce, d’un organite ou d’un virus, ainsi que ses séquences d’acides nucléiques* non-codantes. Il est constitué de molécules d’acides nucléiques (ADN* ou ARN*). Les parties d’ADN porteuses d’une information génétique ou gènes*, ne constituent qu’une partie du génome. Chez les animaux, le génome comprend l’ADN nucléaire qui concentre la majorité de l’information génétique et l’ADN mitochondrial. Chez les végétaux, il comprend en outre l’ADN chloroplastique qui est aussi porteur d’une information héréditaire. Le génome nucléaire a une hérédité biparentale via la méiose et la fécondation. Pour une espèce donnée, le génome est globalement semblable pour tous les individus. Il existe, cependant, des variations de séquences d’ADN entre les individus d’une population : c’est l’origine du polymorphisme. Chez les virus, le génome viral est contenu dans une molécule d’ADN simple ou double brin ou une molécule d’ARN. Génomique : discipline scientifique récente, la génomique s’attache à l’étude exhaustive des gènes* d’un organisme vivant. Elle se compose de deux volets complémentaires : Z La génomique structurale étudie la cartographie du génome* et le séquençage des molécules d’ADN*. Z La génomique fonctionnelle s’intéresse à la fonction des gènes, à leur expression et leurs interactions et/ou aux protéines résultant de l’expression des gènes. La génomique a pris un essor considérable grâce au perfectionnement des méthodes et des outils d’analyse de la biologie moléculaire*, en particulier le séquençage à haut débit, et aux capacités accrues de la bioinformatique*. Gluten : complexe protéique insoluble dans l’eau, extrait des grains des Céréales*. Le gluten de maïs est utilisé en alimentation animale alors que le gluten de blé est utilisé en panification* puisqu’il forme une masse cohérente et visco-élastique lorsqu’il est hydraté. Glycane : polymère* formé de monosaccharides liés par des liaisons glycosidiques formant des oligo- ou des polysaccharides. Les glycanes peuvent être liés aux protéines (glycoprotéines*) ou aux lipides (glycolipides*) par leurs extrémités réductrices.

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Glycation : réaction non-enzymatique, lente et irréversible des monosaccharides réducteurs* avec les groupements aminés libres des protéines. Toutes les protéines de l’organisme subissent un glycation. L’intensité de la fixation du glucose, l’ose le plus abondant chez l’homme, dépend de la glycémie et de la durée d’exposition de la protéine au glucose qui est à l’origine de la majorité des réactions de glycation. Glycémie : concentration du glucose dans le sang. À jeun, une glycémie normale se situe entre 0,6 g/L et 1 g/L. Après un repas, la glycémie augmente pendant 1 ou 2 h sans dépasser 1,6 g/L, puis revient aux valeurs de base dans les 2 h qui suivent. On parle d’hyperglycémie lorsque ce taux s’élève et d’hypoglycémie* lorsqu’il s’abaisse en dessous de la valeur normale (inférieure à 1,4 g/L à jeun chez un sujet sain). Au-delà du maximum, le glucose peut passer dans les urines (glycosurie). Glycérolipides : esters d’acides gras et de glycérol faisant partie des lipides et abondant dans les membranes cellulaires et dans le tissu adipeux. Glycolipides : association d’un oligosaccharide et d’un lipide. Ils sont très présents dans les membranes cellulaires. Le lipide est habituellement un mono- ou diglycérol et le sucre est souvent du glucose ou du galactose. Glycoprotéine : molécule protéique de taille plus ou moins importante à laquelle sont liées par covalence, des chaînes oligosaccharidiques latérales de nature variée (D-galactose*, D-glucose, D-mannose, hexosamine, xylose, fucose, arabinose, acide N-acétyl muranique, acides uroniques, N-acétyl-D-glucosamine et acide sialique). Ces protéines font partie des hétéroprotéines* (par opposition aux holoprotéines constituées uniquement d’acides aminés*). Glycosylation : la glycosylation est une réaction enzymatique (à l’aide glycosyl-transférases) qui se déroule dans l’appareil de Golgi et qui correspond à un ajout d’oligosaccharides (polymères* constitués d’un petit nombre de glucides simples ou oses) au cours de la biosynthèse de certaines protéines membranaires qui deviennent alors des glycoprotéines*. On distingue la N-glycosylation et la O-glycosylation suivant les acides aminés* qui vont porter ces glucides. La N- glycosylation est l’ajout d’un oligosaccharide sur l’azote de la fonction amide de l’asparagine. La O-glycosylation correspond également à l’ajout d’un oligosaccharide sur une protéine, mais via l’établissement d’une liaison entre un N-acétylgalactosamine et le groupement hydroxyle* (–OH) de la chaîne latérale d’un acide aminé comme la sérine ou la thréonine. Gomme arabique : polysaccharide complexe de type arabinogalactane. Elle est exsudée par des arbres du genre Acacia, principalement localisés dans les pays des régions de la bande du Soudan au Sénégal. Deux espèces d’Acacia seulement produisent la gomme d’acacia officiellement reconnue comme telle, l’Acacia senegal et l’Acacia seyal. Gram (coloration de –) : coloration par le violet cristal suivie d’une contre-coloration permettant de distinguer deux grands groupes de bactéries* en fonction de la structure de leur paroi : les bactéries positives à la réaction de Gram (Gram+) sont colorées en violet et présentent une paroi épaisse très résistante et riche en peptidoglycanes ; les bactéries négatives à la réaction de Gram (Gram–) sont colorées en rose et ont une paroi constituée de lipoprotides et de lipoglucides.

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Granulométrie : répartition des particules élémentaires de nature diverses (comme des farines, des poudres, des sables, des particules minérales…) par catégorie de grosseur (diamètre) après tamisage. Grignons (– d’olives) : résidu solide obtenu lors de l’extraction* de l’huile d’olive par broyage. Les grignons se composent essentiellement des noyaux et de la peau des olives. Ils contiennent également un peu d’huile que l’on peut extraire par solvant (hexane) et peuvent être utilisés comme aliments de bétail. Groupe prosthétique : groupement organique non-protéique ou ion métallique associé spécifiquement à une protéine, dans les proportions stœchiométriques et essentiel à son activité. Par exemple, de nombreuses enzymes* contiennent des ions métalliques, comme dans la carboxypeptidase qui contient du zinc ; l’hémoglobine contient un hème* avec un atome de fer central.

H Halogéné : se dit des éléments chimiques du groupe VII de la classification périodique, dont les molécules contiennent au moins un atome d’halogène (fluor, chlore, brome, iode ou astate). Halophile : qualifie une espèce adaptée à des milieux à forte salinité. On distingue les halophiles modérés, croissant en présence de concentration en NaCl comprise entre 3 et 15 %, les halophiles intermédiaires entre 9 et 24 % de NaCl et les halophiles extrêmes entre 18 à 35 % de NaCl. Ces derniers sont essentiellement des Archaebactéries*, sauf à de rares exceptions comme la microalgue Dunaniella salina. Haptène : petite molécule, de faible poids moléculaire, incapable d’induire par elle-même une réponse antigène*/anticorps* mais qui peut aussi être reconnue par un anticorps et donc se lier à son site de reconnaissance spécifique. On peut fixer expérimentalement un haptène (ex. dinitrophényle ou DNP) sur une molécule protéique (dite molécule porteuse) pour provoquer le formation d’un antigène artificiel. Hème : groupement constitué de 4 cycles pyrroliques reliés entre eux par des liaisons méthyliniques et dont les atomes d’azote, placés au centre de la molécule, fixent un JPO
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liaisons hydrophobes*. L’hème peut être libre ou constituant le groupe prosthétique* de plusieurs hémoprotéines, par exemple l’hémoglobine, la myoglobine, les cytochromes, la catalase et la peroxydase. Le nom d’un hème dérive de celui de la porphyrine correspondante ; par exemple, cytohème, de la cytoporphyrine et ferroprotohème, de la protoporphyrine. Hémisynthèse : préparation d’une molécule à partir d’une autre molécule déjà très élaborée, de structure chimique assez proche (naturelle ou synthétique) qui comporte une grande partie de la structure de la cible. Ex. le taxol à partir du taxotère extrait des aiguilles de certains ifs (Taxus sp.). Dans le domaine pharmacologique, par exemple, il s’agit le plus souvent d’une opération ou d’une suite d’opérations chimiques

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permettant la modification de la structure naturelle inactive (ou sans utilisation thérapeutique) en molécule active. L’hémisynthèse peut être envisagée dans d’autres cas : Z Amélioration des propriétés pharmacologiques par : – la diminution de la toxicité ; – le renforcement de l’activité thérapeutique aux dépens des effets secondaires indésirables, la dissociation de propriétés thérapeutiques intéressantes dans le cas de composés aux effets polymorphes (ex. effet hypotenseur et action neurodépressive de la réserpine) ; – l’amélioration de l’absorption, de la biodisponibilité* ou de l’élimination en vue d’obtenir des effets thérapeutiques plus rapides ou plus durables ; Z Facilitation de l’administration par une mise en forme galénique* plus favorable ou mieux tolérée. Hémostatique : se dit d’une substance qui favorise la coagulation* du sang. Héparine : molécule de glycosaminoglycane (GAG), hautement sulfatée, produite dans le foie et présente dans les tissus des vertébrés, notamment dans les poumons et les vaisseaux sanguins. C’est la molécule biologique qui présente la plus grande densité de charges négatives. Elle est douée d’une forte activité anticoagulante* et est, de ce fait, utilisée en clinique et en chirurgie. Herbicide : substance détruisant les plantes indésirables (plantes adventices). Les herbicides peuvent être plus ou moins spécifiques. Par exemple, le 2,4-D détruit uniquement les dicotylédones. Une plante utile peut être rendue, par génie génétique*, tolérante à un herbicide donné. Hétéropolymère : polymère* formé de molécules (élément de base) différentes. Ex. les hémicelluloses. Hétéroside : union d’une molécule glucidique (ose ou oligoside) avec une molécule non-glucidique (aglycone ou génine) dont la nature peut être très variée mais qui renferme toujours une fonction alcool ou phénol (–OH) : alcool, phénol, stérol, amine (–NH2, –NH–) ou thiol (–SH). Lorsque la partie glucidique est constituée uniquement de glucose, on parle de glucoside. Hétérotrophe : dans une chaîne alimentaire* d’un écosystème, organisme qui se nourrit directement ou indirectement des produits photosynthétiques des producteurs primaires*. Tous les animaux, les mycètes, certains végétaux non-chlorophylliens de même que la plupart des bactéries* sont hétérotrophes. Homéostasie : état d’un système biologique (cellules, organe, organisme) fonctionnant normalement et efficacement, en dépit des variations de l’environnement. L’homéostasie désigne l’état d’autorégulation assurant la stabilité du milieu intérieur, c’est-à-dire l’ensemble des liquides extracellulaires (sang, lymphe et liquide interstitiel) et en particulier la constance de ses caractéristiques physico-chimiques. Homopolymère : polymère* formé de molécules (éléments de base ou monomères*) identiques. Ex. la cellulose.

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Homozygote : se dit d’une cellule ou d’un individu qui possède une paire d’allèles identiques sur le même locus (emplacement occupé par un gène*) des chromosomes homologues, pour un caractère donné : il est dit homozygote pour un tel gène. Un individu peut être homozygote pour un gène, et en même temps hétérozygote pour un autre. Par convention (symbolisme mendélien), l’allèle est représenté par deux lettres semblables, exemple AA dans le cas d’un individu diploïde. Le croisement entre deux individus homozygotes (AA) donne, à la première génération (F1), 100 % de descendants ayant le génotype AA. Hormone : molécule, très active et très spécifique, produite dans le monde animal par une glande ou dans le monde végétal par un tissu puis transportée ou diffusée vers un organe ou un tissu ciblé au niveau duquel elle va intervenir de façon positive (promotion) ou négative (inhibition) en agissant, en général à très faible concentration, sur un processus biologique précis en général après fixation sur récepteur. Deux exemples : Z Dans le monde animal, l’insuline* est secrétée au niveau du pancréas par les ilots de Langherans, et a pour fonction de faire baisser la glycémie* en se fixant à des récepteurs placés sur les membranes des cellules du foie, des muscles et des tissus graisseux afin de faire rentrer le sucre dans ces cellules et de faire ainsi baisser sa concentration dans le sang. Z Dans le monde végétal, l’auxine est une phytohormone synthétisée principalement dans les parties terminales des tiges, les jeunes feuilles et dans les bourgeons, elle joue un rôle majeur dans le contrôle de l’élongation cellulaire mais elle intervient aussi à différents niveaux du développement des plantes (phototropisme, dominance apicale, rhizogenèse, développement des fruits, perception de la gravité…). HPLC : acronyme anglo-saxon se traduisant en français par Chromatographie Liquide Haute Performance* (CLHP). Huile brute : huile non-raffinée et, par conséquent, contenant des impuretés comme des lécithines, des protéines, des glucides, des substances colorées et des composés volatiles odoriférants. Hybridome : cellule hybride synthétique, dérivée de la fusion d’un lymphocyte* B avec une cellule tumorale produisant un anticorps* unique, lui conférant la propriété de croître indéfiniment en culture in vitro. Hydrocarbure : composé binaire de carbone et d’hydrogène. Le pétrole est un mélange d’hydrocarbures. Hydrocarbures aliphatiques : composés organiques constitués de molécules acycliques à chaîne ouverte, pouvant présenter une ou plusieurs ramifications avec des chaînes latérales, saturée ou insaturée. Hydrocolloïde : substance permettant de stabiliser une phase solide dans un milieu aqueux. En agro-alimentaire*, il s’agit souvent de polysaccharides de haut poids moléculaire, comportant des zones hydrophobes* et hydrophiles*, qui leur assurent des propriétés d’émulsifiants* et d’épaississants* pour les éléments suspendus dans la phase aqueuse du produit.

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Hydrogénation : fixation d’hydrogène sur les doubles liaisons des acides gras insaturés. Cette réaction se fait à chaud en présence d’un catalyseur*, le nickel, pour produire des huiles concrètes (dont la température de fusion* s’élève et qui seront solides à température ambiante et plus résistantes aux oxydations*). Cette réaction est très utilisée pour produire la margarine*. Hydrolase : enzyme* catalysant une hydrolyse*, commandée par le caractère nucléophile de l’ion hydroxyle* OH–, et conduisant à la rupture d’une liaison au sein d’une molécule organique avec fixation ou élimination de molécule(s) d’eau : R–R’ + HOH m R–H + R’–OH Les hydrolases scindent les liaisons peptidique, glycosidique, ester, éther, carbonée, halogénée… Ex. cellulases, phosphatases*, protéases, lipases, nucléases… Ce groupe porte le numéro 3 (E.C : 3.) dans la classification des enzymes. Hydrolysat protéique : produit obtenu par hydrolyse* enzymatique d’une protéine et qui se compose d’un mélange de peptides et d’acides aminés* libres. Hydrolyse : rupture d’une liaison chimique (parfois spontanée) avec fixation des éléments d’une molécule d’eau. Dans les cellules, les réactions d’hydrolyse sont catalysées par des enzymes* appelées hydrolases*. Hydrophile : qualifie un groupement, une molécule ou une substance qui a de l’affinité pour l’eau. La solubilité* dans l’eau d’une protéine est donc liée à son hydrophilie*. Hydrophilie : état d’une substance ayant une affinité pour l’eau. Les groupements polaires* sont hydrophiles*. Ex. les sucres. Hydrophobe : qualifie un groupement, une molécule ou une substance qui présente une répulsion pour les molécules d’eau. Un groupement hydrophobe est souvent lipophile* (se liant facilement aux corps gras*). Hydrophobie : état d’une substance qui ne se dissout pas dans l’eau et n’a aucune affinité pour elle (ex. les lipides). Hydroxyle : fonction hydroxyle portée par les alcools et les phénols (–OH). Les groupements hydroxyles des sucres leur confèrent leur nature hydrophile*. Hygroscopique : qui a tendance à absorber facilement l’humidité de l’air. Hyperplasie : augmentation anormale du volume et de la masse d’un tissu ou d’un organe due à l’accélération de la division cellulaire. Hyperoncotique : qualifie une solution ayant une forte pression oncotique*. Hyperthermophile : qualifie un organisme dont la température optimale de croissance est au-dessus de 80 °C. Les bactéries hyperthermophiles sont généralement des Archaebactéries* appartenant à 3 groupes, les méthanogènes (Methanopyrus, Methanococcus, Methanothermus), des sulfato-réducteurs comme Archaeglobus, des soufre-dépendants ou sulfothermophiles (Pyrodictium, Thermococcus, Pyrococcus). Hypocholestérolémiant : qui diminue le taux de cholestérol* dans le sang.

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Hypoglycémie : diminution de la teneur de glucose dans le plasma sanguin. Hypofibrinogénémie : déficience de fibrinogène* dans le sang. Hypovolémie : diminution du volume total du sang circulant. Hystéroscopie : intervention endoscopique utilisée en vue d’examiner l’intérieur de l’utérus. Elle consiste en l’insertion d’un mince instrument équipé d’une caméra (appelé « hystéroscope ») dans le vagin et au travers du col de l’utérus pour aider le médecin à déterminer la cause d’un problème possible, pour le dépistage du cancer de l’endomètre (muqueuse de l’utérus) ou pour procéder à une opération.

I Iminoacides : acides aminés* renfermant à la fois un groupement imino (>C=NH) et carboxyle (–COOH). Ex. proline et hydoxyproline. Immobilisé : se dit d’enzyme*, de cellule ou de micro-organisme fixé sur un support par adsorption*, inclusion, liaison covalente* ou par réticulation* afin de mieux en utiliser les propriétés biologiques. Le maintien de l’activité cellulaire sur des périodes très longues est exploité dans la production de métabolites* et dans les procédés continus de bioconversion*, de synthèse ou d’hémisynthèse*. Immortalisation cellulaire : transformation génétique d’un type de cellules d’Eucaryotes*, le plus souvent par un agent oncogène*, en une lignée cellulaire* pouvant se multiplier indéfiniment in vitro. Immunité : aptitude d’un organisme à résister à des maladies ou à se défendre contre l’attaque d’agents infectieux (virus, bactéries*) ou de substances toxiques (venins, poisons). L’immunité peut être naturelle (barrières anatomiques, physiologiques, phagocytose…) ou acquise lorsqu’elle apparaît au cours de la vie. Implant : prothèse fixée sur le corps, visant à remplacer un organe déficient. Un implant doit être biotolérant ou biocompatible et biofonctionnel. Indice (ou index) glycémique (IG) : mesure le pouvoir glycémiant d’un glucide, c’est-àdire sa capacité à libérer plus ou moins rapidement une certaine quantité de glucose après la digestion. Les aliments ayant un IG bas font monter la glycémie plus lentement que les aliments à IG élevé. Cependant, un même aliment aura un IG différent selon la manière dont il est cuisiné, son mode de consommation ou encore les aliments auquel il est associé. Par exemple, une pomme de terre au four a un IG plus élevé qu’une pomme de terre à l’eau. L’IG est déterminé comme étant le rapport entre l’aire sous la courbe de glycémie obtenue 2 h après la consommation d’un aliment à tester contenant 50 g de glucides et celle obtenue avec 50 g de glucose. Le glucose est considéré comme la référence : son IG est de 100. Indice de réfraction : constante physique toujours supérieure à 1 définie comme le rapport entre la vitesse de propagation de la lumière dans le vide et sa vitesse dans le milieu étudié.

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Ingénierie des protéines : ensemble des techniques d’expression et de modifications de la structure tridimensionnelle des protéines recombinantes (protéines exprimées à partir d’un ADN* modifié). Cette modification est faite par voie chimique, enzymatique ou par mutagenèse dirigée sur le gène* codant pour cette protéine. Le but recherché est d’obtenir de façon rationnelle, des protéines aux propriétés physico-chimiques et catalytiques nouvelles intéressantes. Par exemple, l’expression d’un l’ADN modifié dans une bactérie* comme Escherichia coli permet de synthétiser une protéine dont la structure primaire* est désirée. Le « protein design » est l’une des branches de l’ingénierie des protéines. Ingénierie de tissus : synonyme de génie tissulaire. Ingrédient : toute substance utilisée dans la fabrication ou la préparation d’une denrée alimentaire et présente dans le produit fini. Insecticide : produit servant à détruire les insectes. Insuline : hormone* pancréatique produite par les îlots de Langerhans du pancréas qui abaisse le taux de la glycémie*, favorise la pénétration du glucose dans les cellules et freine la libération du glycogène du foie. Sa sécrétion augmente lorsque le taux de glucose s’accroît dans le sang. En cas d’absence ou de défaut de sécrétion (diabète* de type 1), l’insuline peut être fournie à l’organisme par injection intraveineuse. Interestérification : traitement d’un corps gras* visant à modifier la structure des triglycérides* par réarrangement des acides gras sur le glycérol. Interféron : nom générique donné à de petites molécules (15 à 30 kDa) glycoprotéiques aux fonctions antivirales ou immunitaires régulatrices. Les interférons sont produits et libérés par les cellules humaines et animales à la suite de leur exposition à divers agents inducteurs, principalement des virus mais aussi des endotoxines* bactériennes, des phytohémagglutinines* ou d’autres substances. Plus de 14 interférons humains génétiquement différents ont été identifiés. Ils exercent leurs activités cellulaires en se fixant à des récepteurs spécifiques de la membrane cellulaire. L’interféron alpha (des globules blancs) et l’interféron-β (des fibroblastes des tissus conjonctifs), que sécrètent des cellules infectées par des virus, aident les cellules adjacentes à résister aux attaques virales ; l’interféron-γ, sécrété par les lymphocytes* T, stimule les macrophages. Ils sont produits commercialement, pour diverses applications thérapeutiques, grâce à la technologue de l’ADN* recombinant*. Intolérance au lactose : impossibilité de digérer le lactose* en raison de l’absence dans l’organisme d’une des enzymes* (lactase*) indispensables à sa digestion, ce qui provoque ballonnements et inconfort gastrique. L’intolérance au lactose se distingue de l’allergie*, mécanisme dans lequel des réactions immunitaires sont mises en jeu. Intrapéritonéal : relatif à l’intérieur du péritoine (membrane entourant la cavité abdominale). Ionisation de flamme : dispositif de détection non-spécifique très classique mais assez sensible (0,01-10 ng), équipant certains chromatographes en phase gazeuse. Les molécules hydrocarbonées éluées de la colonne sont ionisées dans une flamme générée par

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un mélange hydrogène/air. Les ions négatifs et les électrons qui en résultent sont collectés sur une anode collectrice (+ 250 volts) située au-dessus du brûleur. Le courant très faible (quelques picoampères) ainsi créé est ensuite converti en une tension qui est proportionnelle à la quantité du composé élué et brûlé dans la flamme, dans une certaine gamme de concentration. Le signal est ensuite amplifié et apparaît finalement sur l’enregistreur sous forme de pic. Irradiation : exposition d’un corps ou d’un produit alimentaire à des radiations, sous conditions contrôlées. Celles-ci peuvent être infrarouges, lumineuses, ultraviolettes*, ou encore, de nature radioactive (ex. radiations gamma). Isoenzymes ou isozymes : formes multiples d’une même enzyme* caractérisées par de légères différences génétiques au niveau de la structure primaire*, assurant des fonctions comparables. Les isoenzymes peuvent résulter de l’expression d’un gène* unique donnant une protéine soumise à des modifications secondaires variables (attachement de glucides, coupures hydrolytiques…). Dans d’autres cas, il s’agit de gènes distincts de séquences généralement très voisines. Les isoenzymes sont mises en évidence, à la suite d’une chromatographie*, d’une électrophorèse* ou d’une focalisation isoélectrique sur un extrait cellulaire, par la présence de fractions protéiques multiples douées d’une même activité catalytique. Elles sont désignées par un numéro, dans l’ordre de leur mobilité électrophorétique décroissante : le numéro 1 est donc attribué à l’isoenzyme migrant le plus rapidement en l’électrophorèse. Isolat protéique : produit protéique issu de sources diverses (ex. soja, pois, lait…) et dont la teneur en protéines est élevée (de 80 à 95 %). Sa richesse en protéines est obtenue par extraction* sélective de celles-ci à partir du milieu plus ou moins complexe dans lequel elles se trouvent. Isomères : molécules ayant une même formule brute, mais se différenciant par un arrangement différent de leurs atomes constitutifs dans l’espace et présentant de ce fait des propriétés chimiques différentes. Les principaux isomères découlent de la présence de carbones asymétriques ou de doubles liaisons dans une molécule. Isomérase : enzyme* catalysant un réarrangement intramoléculaire entraînant la transformation d’isomères*. Les isomérases sont soit des racémases modifiant les acides aminés* L en forme D, des épimérases réalisant l’interconversion de sucres ou des mutases réalisant le transfert d’un radical. Ce groupe d’enzymes constitue la classe 5 (E.C: 5.) dans la classification des enzymes. Ex. glucose-6-phosphate isomérase, triose phosphate isomérase. Isomérisation : transformation d’un corps chimique en un isomère*, c’est-à-dire ayant la même formule brute mais un arrangement différent des atomes dans l’espace ce qui induit des propriétés chimiques différentes. Isoprénoïdes : classe de composés dérivant d’un précurseur* commun, l’isoprène (2-méthyl-1,3-butadiène), une molécule à 5 atomes de carbone. Sous forme active, l’isopentenyl diphosphate est utilisé par les plantes et les animaux pour la synthèse d’oligomères linéaires et cycliques et de polymères*.

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Isotopes : atomes dont les valeurs de  A (nombre de masse) et de  N (nombre de neutrons) sont différentes mais dont les valeurs de Z (nombre d’électrons périphériques) sont identiques. Il s’en suit que les isotopes ont un comportement chimique similaire. Les isotopes peuvent être naturels ou artificiels. Parmi les 325 isotopes naturels connus, seulement 51 sont instables tandis que les 1200 éléments artificiels sont tous instables (puisque non-observés dans la nature à cause de leur durée de vie courte). 12C est le carbone naturel stable le plus abondant, de même 13C est un isotope lourd, stable du carbone naturel. Par contre, 14C est un isotope radioactif du carbone : il est radioactif car son noyau est instable (trop riche en protons), c’est-à-dire qu’il émet un rayonnement β– consécutif à la transformation d’un neutron en proton.

L Labile : se dit d’une substance peu stable, sensible aux facteurs physiques (substance thermolabile), chimiques (acidolabile) ou physiologiques. Lactase : enzyme* présente normalement dans notre intestin et servant à la digestion du lactose*, le sucre du lait. Lactose : présent dans le lait des mammifères, le lactose représente le seul glucide alimentaire d’origine animale. C’est un diholoside, composé d’une molécule de glucose et d’une molécule de galactose. Il constitue une source énergétique importante chez l’enfant. Toutefois, certains individus sont incapables de le digérer, ce qui provoque un phénomène d’intolérance*. Lactosérum : phase hydrique et ensemble des substances dissoutes du lait (lactose*, sels, protéines solubles). On l’appelle familièrement le petit lait. Lait maternisé : lait commercial, à base de protéines de lait de vache (le plus courant) ou de protéines de soja, traité pour rapprocher sa composition de celle du lait de femme. La composition des laits maternisés est déterminée de façon réglementaire : la qualité et quantité des nutriments* qu’ils contiennent varient selon l’âge des enfants et leur état de santé. Lathyrisme : intoxication neurologique provoquée par l’absorption de certaines espèces du genre Lathyrus (gesses) et entraînant des troubles locomoteurs des membres inférieures. L’homme y semble particulièrement sensible. Les principes toxiques responsables sont des dérivés d’acides aminés* : β-aminopropionitrile qui affecte particulièrement les tissus osseux et conjonctif (modification de la synthèse du collagène), acides diaminobutyrique et oxalyl-diaminopropionique qui altèrent le tissu nerveux. Les plantes lathyrogènes peuvent être détoxifiées par des traitements thermiques appropriés. Lectines : protéines globulaires* ou glycoprotéines* caractérisées par leur grande affinité spécifique pour les résidus glucidiques de glycoconjugués. Les lectines sont présentes dans une grande variété d’organes ou d’organismes (ex. graines et racines de protéagineux* et d’oléagineux*, champignons, bactéries*, éponges et mollusques*, œufs de poissons, membranes des cellules de mammifères…).

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Légumineuses : famille de plantes dont le fruit est une gousse qui s’ouvre en deux (ex. luzerne, trèfles, haricots, pois). Les Légumineuses sont caractérisées par la présence de nodules bactériens sur leurs racines qui permettent à la plante d’utiliser l’azote atmosphérique et donc réduit le besoin d’engrais azoté et indirectement améliore le sol. Leucotriènes : classe d’eicosanoïdes* polyinsaturés, dérivant de l’acide arachidonique, formés par action de la lipoxygénase et agissant comme des hormones*, notamment comme régulateurs dans les réactions inflammatoires et les réactions allergiques comme constricteurs bronchial dans l’asthme. Ces composés ont des doubles liaisons adjacentes à la chaîne carbonée et ne possèdent pas de structures cycliques comme dans le cas des prostaglandines*. Lévogyre : se dit d’une molécule possédant un carbone asymétrique, qui en solution dévie vers la gauche le plan de la lumière polarisée (dans le sens inverse des aiguilles d’une montre). Cette propriété est indiquée par le signe (–) ou L, placé devant le nom. Levures : micro-organismes eucaryotes* (Champignons, Ascomycètes) unicellulaires, très répandus, qui se multiplient de façon asexuée par bourgeonnement (cas des Saccharomyces) ou par fission en produisant deux cellules filles de taille égale (cas des Schizosaccharomyces). Saccharomyces cerevisiae (appelée communément levure de bière ou levure de boulanger) est capable de provoquer dans certaines conditions (anoxie) la fermentation* des sucres avec formation d’alcool éthylique d’où son emploi en vinification. Elle est également utilisée pour faire « lever » le pain, grâce à la production de dioxyde de carbone lors de la fermentation des sucres de la farine. La rapidité de leur multiplication et la simplicité de leur structure ont fait de certaines levures des outils intéressants pour le génie génétique* (ex. Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Yarrowia lipolytica). Liaison covalente : liaison forte entre deux atomes, établie par la mise en commun d’un doublet électronique (chacun des deux atomes met en commun un électron) liant et assurant la cohésion de l’édifice moléculaire. Elle peut être simple, double ou triple. Liaison hydrogène  : liaison chimique faible (20 fois plus faible que la liaison covalente* classique) qui relie les molécules par attraction électrostatique faible existante entre un atome d’hydrogène (lié par covalence à un atome relativement électronégatif comme O, N ou F) et un atome électronégatif voisin. Ex. les brins d’ADN* complémentaires sont reliés par des liaisons hydrogène établies entre les paires de bases. Liaison hydrophobe : il s’agit d’interaction entre molécules qui ont très peu d’affinité pour le solvant dans lequel elles sont dissoutes comme l’eau ; de ce fait, ces molécules apolaires* et peu polarisables ont tendance à se regrouper, ce qui crée une force intermoléculaire dite liaison hydrophobe. Lichen : organisme constitué par l’association symbiotique d’un champignon* et d’une algue. Le champignon est souvent un ascomycète constituant le thalle de l’individu, l’algue est souvent une Chlorophycée (algue verte), elle peut-être remplacée par une Cyanobactérie comme le Nostoc.

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Ligand : toute molécule caractérisée par sa tendance à se lier à une autre molécule par des liaisons non-covalentes. Sa fixation est souvent spécifique d’un récepteur dont la structure tridimensionnelle traduit un arrangement dans l’espace de différents groupements chimiques intervenant dans cette interaction. Lignée cellulaire : population homogène de cellules, stables après des mitoses successives. Ex. lignée HeLa, issue d’un cancer du col de l’utérus. Lignine : polymère* phénolique complexe à base de phénylpropanoïdes (alcools coumarylique, coniférylique et sinapylique), à structure réticulée, enchâssé dans la matrice* cellulosique de la paroi cellulaire* des plantes vasculaires, dites ligneuses, et qui constitue une adaptation qui rend possible le port dressé des arbres et des arbustes. La lignine permet aussi à la plante de résister aux herbivores et aux organismes pathogènes. L’accumulation de lignine est d’autant plus importante que la plante est âgée. Lipidomique : la lipidomique est l’étude à grande échelle des voies de synthèses et de dégradation des lipides cellulaires. Elle provient du mot «lipidome» utilisé pour décrire le profil lipidique complet d’une cellule, d’un tissu ou d’un organisme. La recherche en lipidomique implique l’identification et la quantification des milliers d’espèces moléculaires lipidiques des cellules et l’étude de leurs interactions avec d’autres lipides, des protéines et d’autres métabolites*. Lipophile : se dit d’une substance présentant une affinité pour une phase lipidique ou grasse. Lipoprotéine : molécule résultant de l’association d’une protéine avec un ou plusieurs corps gras* (lipide) : c’est une hétéroprotéine* (par opposition aux holoprotéines constituées uniquement d’acides aminés*) servant de transporteur de lipides dans le sang. Parmi les lipoprotéines, on distingue les chylomicrons*, les lipoprotéines de basse densité (LDL, qui transportent le « mauvais » cholestérol*) et les lipoprotéines de haute densité (HDL, qui transportent le « bon » cholestérol). Douées de propriétés amphiphiles*, les lipoprotéines participent à la stabilité physique de nombreux systèmes biologiques (ex. sang, lait) comme à celle de certains systèmes alimentaires (ex. émulsions*). Ce sont des agents tensioactifs*. Lymphocyte : type de cellules du sang et de la lymphe, intervenant dans la défense de l’organisme contre les agents infectieux. Lyophilisation : procédé de dessiccation*, par sublimation de l’eau (contenue dans un produit préalablement congelé) sous vide poussé, permettant une meilleure préservation de la structure et de la composition des produits biologiques fragiles (antibiotiques, extraits cellulaires, micro-organismes, hormones*, produits pharmaceutiques…) qui ne peuvent être conservés en solution et ceci même après de longues périodes de stockage. Lyse : éclatement et libération du contenu d’une cellule (cytolyse), sous l’influence d’agents biologiques (lysozyme*, bactérie*, virus lytique), chimiques ou physiques (choc osmotique, sonication, broyage, rayonnements ionisants*).

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Lysozyme : protéine contenue dans les fluides d’origine animale (plasma, liquide lacrymal, blanc d’œuf…), dotée d’une activité enzymatique très spécifique qui lui permet d’hydrolyser la partie glucidique des peptidoglycanes de la paroi de certaines bactéries* pathogènes, Gram*+ en particulier. Son action bactéricide* est moins nette sur les bactéries Gram–). L’hydrolyse* se fait au niveau des liaisons (1J 4), ce qui entraîne la solubilisation partielle des parois des bactéries provoquant leur éclatement (lyse*) et leur mort.

M Malt : graines d’orge laissées germer pour convertir l’amidon insoluble en substances solubles et en sucres servant à fabriquer de la bière ou du whisky. Le pouvoir amylolytique se développe durant la germination. Lorsqu’il atteint sa valeur maximale, l’orge est stabilisée par un séchage qui peut se faire à température ménagée ou par une légère torréfaction. Marc : résidu solide obtenu après pressurage de certains fruits : peaux et rafles* du raisin ; peaux, résidus de la pulpe et de fragments des noyaux d’olive. Margarine : matière grasse alimentaire solide à température ambiante. Contrairement au beurre, la margarine provient de graisses et d’huiles végétales plus ou moins hydrogénées. Margarinerie : transformation des huiles en graisse par hydrogénation*, suivie d’une émulsification avec de l’eau ou du lait. Marqueur : se dit de tout caractère qui distingue deux molécules, deux individus, deux variétés ou deux populations, facilement et rapidement repérable spécifiquement, à déterminisme génétique simple. Il peut être morphologique (nanisme, couleur, forme), biochimique (isozymes*, protéines, métabolites* secondaires), physique (radioactivité d’une macromolécule par suite de l’incorporation d’un précurseur* radioactif), génétique ou moléculaire (une séquence d’ADN*). Matière sèche (teneur en –) : masse des constituants secs d’un aliment après séchage à l’étuve à une température altérant le moins possible ces derniers (40 à 80 °C) pendant un temps suffisant (24 à 48 h) pour atteindre un poids constant. Matrice : 1. Oligonucléotide copié lors de la réplication* ou de la transcription par des polymérases permettant de régénérer un brin complémentaire. 
.JMJFV
Pá
FTU
JODPSQPSÏ
VO
DPNQPTÏ
EPOOÏ 3. En électrophorèse* de zone ou en chromatographie*, support solide constituant la phase stationnaire*. 4. Substance fondamentale des mitochondries et des plastes. Maturation : 
.PEJöDBUJPOT
RVF
TVCJTTFOU
MFT
USBOTDSJUT
QSJNBJSFT
EF
MARN*, notamment l’excision des introns, la réunion des exons par épissage et la modification des extrémités 5’ et 3’.

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2. Dans le cas d’une protéine, ensemble des modifications qu’elle subit après sa synthèse au cours de la traduction. La protéine peut, par exemple, être coupée, phosphorylée* ou glycosylée par des enzymes*. 3. Ensemble des événements biochimiques permettant de passer d’un précurseur* à une molécule active finale. 4. Ensemble des transformations physiologiques et morphologiques que subit un organe (graine, fruit…) le rendant apte à remplir sa fonction. La maturation des fruits est un processus complexe, associé à de nombreux changements biochimiques et moléculaires. L’éthylène occupe une place centrale dans le processus de maturation. Médecine légale : branche de la médecine qui détermine les causes de décès en pratiquant, notamment, l’autopsie du corps de la victime. Mégacaryocytes : grandes cellules de la moelle osseuse à gros noyau, à l’origine des plaquettes. Mélasse : sous-produit* sirupeux de l’industrie sucrière, après séparation du sucre par cristallisation* à partir de jus de cannes ou de betteraves sucrières. Elle est retirée du circuit de fabrication lorsque la concentration en sucres devient trop faible. Elle contient généralement 45-60 % de sucre et des quantités suffisantes de tous les éléments nécessaires à la croissance des micro-organismes. Elle est utilisée en alimentation animale ou en fermentation* pour la production d’alcool industriel, de boissons alcoolisées et de levures* de boulangerie ou de brasserie*. Les mélasses constituent également des substrats* de fermentation pour la production d’acides aminés* (acide glutamique, lysine), d’acide lactique, de nucléotides, d’antibiotiques divers et d’enzymes* (pectinases, lipase) pour les industries alimentaires, textiles ou pharmaceutiques. Mésophile : qualifie une espèce dont l’optimum de croissance se situe entre 15 et 45 °C, avec un optimum habituellement situé entre 20 et 40 °C. Métabolisme : ensemble des processus biochimiques permettant aux cellules de produire les métabolites* et l’énergie qui sont nécessaires à leur fonctionnement, par la transformation (dégradation ou synthèse) de molécules organiques complexes. Les réactions orientées vers la synthèse de nouvelles substances (anabolisme) sont étroitement liées à celles orientées vers la dégradation de molécules (catabolisme) en formant un ensemble complexe, le métabolisme intermédiaire et les séquences de réactions impliquées sont nommées voies métaboliques. Métabolite  : tout produit du métabolisme* résultant de la transformation (synthèse ou dégradation) enzymatique d’un substrat* présent dans un organisme. Méthylation : fixation d’un groupement méthyle (–CH3) sur une molécule. Microfiltration : technique de filtration* sous pression sur des membranes perméables dont le diamètre des pores est compris entre 0,1 et 10 mm. Micelle : une micelle est, en solution aqueuse, un agrégat de molécules amphiphiles* groupées en sphères, c’est-à-dire ayant des régions polaires* et des régions apolaires*. Leur formation a lieu à une concentration définie appelée concentration micellaire

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coque extérieure en contact avec l’eau, alors que les queues hydrophobes* apolaires sont à l’intérieur. Microscope photonique à contraste de phase : microscope qui transforme les différences d’indice de réfraction* de l’objet observé en différences d’intensité perceptibles à l’œil. Cette technique a l’avantage de permettre l’observation vitale de la cellule dans sa physiologie : mouvements internes, sécrétion, division… Le matériel de choix reste les cellules isolées : protoplastes*, cellules embryonnaires… Milieu de culture : milieu nutritif utilisé pour la culture des cellules comprenant tous les éléments organiques (substrats* glucidiques ou azotés, vitamines*, facteurs de croissance*) et inorganiques (les sels minéraux) nécessaires à leur croissance. Le milieu peut être liquide ou solidifié par des biopolymères* comme l’agar. Sa composition peut être ajustée à l’espèce ou la variété que l’on cultive. Mixotrophie : caractère d’un organisme se développant en utilisant à la fois le CO2 par photosynthèse* et des composés organiques et minéraux comme sources de carbone et d’énergie. Il est donc, suivant les conditions du milieu (présence ou absence de lumière), autotrophe* ou hétérotrophe*. Modification post-traductionnelle : modification chimique d’une protéine après sa traduction, c’est-à-dire après la synthèse du polypeptide. Ce changement de structure est généralement effectué par une enzyme* à l’issue de sa synthèse ou au cours de la vie de la cellule ou au cours de son transfert entre différents compartiments, ce qui entraîne une modification de la fonction de la protéine par l’addition d’un groupe fonctionnel comme l’amidation du peptide C-terminal ou par la glycosylation*, l’hydroxylation, la phosphorylation*, la prénylation, l’acylation*, l’ubiquination, la protéolyse* partielle, la formation de liaisons entre résidus (pontages), l’addition ou l’élimination de groupes peptidiques, un changement de la nature chimique des acides aminés* qui la compose ou encore par un changement dans la structure même de la protéine. Moisissures : champignons microscopiques constitués d’éléments filamenteux, le mycélium. Les moisissures sont aérobies* et se multiplient très rapidement (24 h) en formant des spores en atmosphère humide. Les moisissures sont capables d’altérer chimiquement de nombreux milieux organiques sur lesquels elles se développent avec, en général, de fortes activités enzymatiques (amylolytique et cellulolytique*, notamment) et la production de toxines. Mollusque : organisme animal à corps mou invertébré, vivant en général dans l’eau ou au moins dans les milieux humides ; certains possédant un squelette externe, une coquille comme la moule, la palourde ou l’huître. Les mollusques terrestres sont représentés par la classe des Gastéropodes dont font partie les escargots et les limaces. Monomère : unité structurale de base d’un dimère (associée à une autre molécule identique) ou trimère (3 molécules), oligomère (une dizaine de molécules) ou polymère* (ex. un acide aminé* est un monomère des protéines).

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

Mousse : la mousse est une émulsion* constitué d’un matériau solide ou liquide intimement mêlé à du gaz. Mucines : classe de protéines hautement O-glycosylées de grande taille qui compose la plupart des mucus. La fraction glucidique est sulfatée, entraînant une forte charge négative. Ce sont les propriétés physiques des mucines qui sont responsables de la fixation de l’eau et, donc, de la viscosité* du mucus. Mutagène : agent biologique (substance antimitotique), chimique (acide nitreux, acridine, colchicine, hydroxylamine, peroxyde…) ou physique (rayons X* ou γ) qui interagit avec l’ADN* et provoque des mutations.

N Nanofiltration : procédé de filtration* destiné à éliminer des particules de moins de 15 nm tels que certains virus (parvovirus* B  19) à travers des membranes et par application d’une pression. Nappe phréatique : réservoir naturel souterrain d’eau souvent douce régulièrement alimentée par les eaux de ruissellement issues de la pluie. Certains sont fossiles, isolés depuis des millénaires. Ils peuvent être saumâtres ou salés. Néphropathie : affection du rein. Ninhydrine : réactif (C9H6O4) spécifique, utilisé en biochimie* pour détecter des acides aminés*, des amines primaires ou de l’éphédrine dans les éluats de chromatographie* ou en chromatographie sur couche mince. Nutraceutiques : substances qui peuvent être considérées comme des aliments ou fabriqués à partir d’aliment et qui possèdent des propriétés bénéfiques pour la santé ou qui assurent une protection contre les maladies chroniques. Un aliment nutraceutique est habituellement vendu sous différentes formes galéniques* (comprimés, capsules…). Le nom provient de la contraction de nutrition et de pharmaceutique. Nutriment : molécule ou élément nutritif directement utilisable par les cellules, nécessaire à la croissance, au développement et à l’entretien des fonctions vitales d’un organisme. On distingue : Z les macronutriments : protides, glucides et lipides (sources de carbone et d’azote, sources énergétiques), Z les micronutriments : vitamines*, sels minéraux et oligo-éléments*, fibres végétales… Un nutriment utile pour un organisme peut ne pas l’être pour un autre. De plus, pour un même organisme et selon le stade physiologique de développement, un nutriment peut être ou non-utile. Un nutriment est considéré comme essentiel lorsque sa carence* provoque des symptômes cliniques reconnaissables qui disparaissent par addition de ce nutriment au régime alimentaire.

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O Obésité : accumulation excessive de tissu adipeux. Chez l’adulte, l’obésité est définie par VO
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LHN2. Obstétrical : qui a un rapport avec les accouchements. Oléagineux : qualifie une plante contenant une proportion importante de lipides dont la culture est destinée à la production d’huiles, à usages alimentaire (soja, tournesol, arachide, colza, olivier…), industriel (lin, ricin, carthame…) ou pharmaceutiques et cosmétiques (amandier, noisetier, avocatier, cacaoyer…). Oligo-élément : élément chimique intervenant en très petite quantité dans la composition et dans le métabolisme* des tissus des organismes vivants mais exerçant une fonction biologique définie, de sorte que la carence* en l’un de ces éléments entraîne des disfonctionnements. Chez les végétaux, certains oligo-éléments sont indispensables ; c’est le cas des métaux UFMT
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OJDkel (Ni) et le vanadium (V) ont parfois des effets bénéfiques. Certains sont des cofacteurs* ou activateurs d’enzymes* (ex. fer, magnésium, molybdène, manganèse, nickel, sélénium, vanadium, zinc), d’autres entrent intégralement dans la constitution des enzymes réalisant des couples métallo-enzymatiques (Ex. le fer dans la catalase et les cytochromes ; le cuivre dans la peroxydase et la laccase, le molybdène dans la nitrate réductase et la nitrogénase), des vitamines* (ex. le cobalt dans la vitamine B12), de la chlorophylle (magnésium)… Oligotrophe : 1. Qualifie une espèce pouvant se développer avec des taux très faibles d’éléments nutritifs. 2. Qualifie un milieu pauvre en nutriments*. Omega-3 (ω-3) : acides gras polyinsaturés* que l’on trouve en grandes quantités dans certains poissons gras, dans le lin, la noix et le colza, certaines microalgues. En comptant depuis la fin de la chaine de l’acide, notée oméga (dernière lettre de l’alphabet grec), la première double liaison rencontrée occupe le troisième rang, d’où le terme « oméga-3 *». Ce sont les acides α-linolénique (ALA), éicosapentanénoïque (EPA) et docosahexaénoïque (DHA). Les oméga-3 auraient des effets bénéfiques sur la santé cardiovasculaire, réduiraient les niveaux de triglycérides* plasmatiques et pourraient être des nutriments* clés lors du développement de l’être humain en période néonatale. Oncogène : 1. Gène associé au déclenchement de la cancérisation (prolifération anarchique des cellules). C’est, généralement, une forme mutante d’un gène* normal (proto-oncogène) impliqué dans le contrôle de la croissance ou de la division cellulaire. Ils peuvent être également apportés par des virus cancérigènes (oncogènes viraux, ou onc-v).

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

2. Qualifie toute substance causant la production de tumeur, notamment tumeur maligne. Le terme est habituellement utilisé pour désigner les virus impliqués dans les cancers, comme certains rétrovirus, papovavirus, adénovirus, et virus de l’herpès. Organoleptique : caractère d’un produit pouvant être apprécié par les organes des sens humains : aspect, toucher (texture*), saveur* (goût), odorat (parfum). L’appréciation professionnelle d’un produit est appelée analyse sensorielle. Osmose inverse : procédé de séparation de l’eau et des sels dissous par perméation à travers des membranes semi-perméables, sous l’effet d’un gradient de pression artificielle qui contrarie le flux osmotique naturel de l’eau donc allant de la solution la plus concentrée à la moins concentrée. Oxydation : perte complète ou partielle des électrons par une substance participant à une réaction d’oxydoréduction*. Un oxydant fait perdre des électrons à un atome ou à un ion. Oxydoréduction : réaction chimique mettant en jeu un transfert d’électrons d’un réducteur à un oxydant. A la suite de ce transfert, le réducteur est oxydée et l’oxydant réduit.

P Paillage : technique agricole consistant à recouvrir le sol au-dessus de la partie racinaire à l’aide de substances organiques (écorces, sciures…) ou d’un film plastique afin de réduire l’évaporation de l’eau et d’augmenter la température du sol pour favoriser la croissance des jeunes plantes au printemps et d’empêcher la croissance des adventices et des dégâts sur les cultures. Les films biodégradables sont de plus en plus utilisés dans ce domaine. Palatabilité : sensations gustatives agréables au palais procurées par la consommation d’un aliment. Palmier à huile : palmier (Elaeis guineensis) cultivé dans les régions tropicales chaudes pour son huile. Palmiste : amande séchée de la noix du palmier à huile* qui fournit l’huile de palmiste. Paraffines : hydrocarbures* solides qui se ramollissent à la chaleur, de couleur blanche, translucides, caractérisés par leur neutralité chimique, utilisés comme substrat* de culture pour la production des protéines d’organismes unicellulaires. Paroi cellulaire : structure rigide caractéristique des cellules végétales (et des bactéries*), doublant extérieurement la membrane plasmique. La paroi des cellules végétales est constituée de cellulose, d’hémicelluloses, de substances pectiques et de lignine*. La paroi des bactéries est par contre notamment formée d’un polymère* : le peptidoglycane. Parvovirus : virus de toute petite taille (origine de son nom) comprenant un seul brin d’ADN
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Pasteurisation : opération utilisée en industries agro-alimentaires*, visant à inactiver par une chaleur moins sévère que la stérilisation* (autour de 80-85 °C max.) les microbes pathogènes pouvant se trouver dans un produit alimentaire en évitant d’altérer sa structure physique et ses constituants biochimiques. Un lait pasteurisé se conserve (au froid) quelques jours, mais il n’est pas stérile. Le contrôle de la pasteurisation s’effectue par la recherche d’enzymes* (test de la phosphatase*, test de la peroxydase ; la première est détruite à 62 °C, durant 30 min et la seconde par passage à 75 °C durant 5 min ou 70 °C durant 5 h). Patate douce : plante de la famille des Convolvulacées et dont les tubercules ont une chair comestible rappelant la pomme de terre. Son nom scientifique est Ipomoea batatas. Pâte à papier : produit non-fini, à base de bois ou d’autres plantes à fibres broyés mécaniquement, de qualité moyenne, destiné à la fabrication de papiers peu coûteux, comme le papier journal, ou traités chimiquement afin d’en enlever la lignine* et utilisés pour la fabrication de papiers de qualité supérieure. Pâté : préparation de charcuterie* à base d’un mélange de viande et d’abats en morceaux ou finement hachés auxquels peuvent être ajoutés des herbes, des épices ainsi que d’autres ingrédients* et qui peuvent être liés avec des œufs, du lait, de la gelée, des substances amylacées*. Pepsine : famille d’enzymes* (pepsines A, B, C et D) appartenant aux protéases à aspartate, de 31 à 36 kDa. Présentes dans le suc gastrique des vertébrés, elles amorcent l’hydrolyse* des protéines. Leur optimum d’activité se situe à pH* 2-3. Elles catalysent préférentiellement l’hydrolyse des liaisons peptidiques formées par des résidus d’acides aminés* hydrophobes* ; certaines différences de spécificité* existent entre les différentes pepsines. Perfusion : technique permettant de maintenir un organe en vie en le faisant traverser continuellement par du sang ou du liquide physiologique. Perméabilisation : action de rendre momentanément perméable les membranes cellulaires, par des traitements chimiques ou électriques (électroperméabilisation). Divers antibiotiques agissent en rendant les membranes des cellules perméables aux ions ce qui fait disparaître le potentiel membranaire. Cela permet aussi de faire rentrer dans des cellules, des molécules comme des fragments d’ADN*. Peroxydation : oxydation* des acides gras insaturés par des espèces radicalaires de l’oxygène ou catalysée par des enzymes*. Cette réaction est responsable du rancissement* des aliments. Au niveau cellulaire, cette réaction se traduit par des dommages au niveau cellulaire en particulier au niveau des membranes plasmiques. Pesticides : substances servant à protéger les cultures, à perturber la croissance des végétaux (ex. phytohormones) ou à la supprimer en bloquant une réaction du métabolisme* (ex. glyphosate), à combattre les insectes ou à traiter les semences. Les pesticides comprennent des herbicides* (comme le 2, 4-D et le Paraquat®) qui tuent les plantes indésirables ou les mauvaises herbes, des insecticides* (comme le pyrèthre) qui tuent les insectes nuisibles, des fongicides* qui tuent les champignons et des

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

rodenticides (comme la warfarine) qui tuent les rongeurs. Les problèmes liés aux pesticides sont qu’ils sont très souvent non-spécifiques et peuvent donc être toxiques pour les organismes qui ne sont pas des ravageurs*; ils peuvent également être non-biodégradables, persistant dans l’environnement et pouvant s’accumuler dans les organismes vivants. Les insecticides organophosphorés sont biodégradables, mais nocifs pour les systèmes nerveux et respiratoire de l’homme et tuent les insectes utiles, comme les abeilles. Ils agissent en inhibant l’action de la cholinestérase. Les insecticides organochlorés, comme le DDT, sont très persistants et non facilement biodégradables. Pétrochimie : secteur de la chimie appliquée aux produits issus du pétrole. pH : mesure de l’acidité ou de l’alcalinité* d’une solution. Logarithme décimal de l’inverse de la concentration en ions H3O+ d’une solution, le pH ou potentiel hydrogène peut prendre une valeur variant de 0 (le plus acide) à 14 (le plus alcalin). Le pH neutre est de 7,0. Phase exponentielle : lors d’une culture de cellules discontinue non-alimentée (en batch), la phase exponentielle correspond au stade où la population double rapidement mais régulièrement ce qui correspond à la partie linéaire de la courbe de croissance. Phase mobile : en chromatographie*, courant gazeux ou liquide circulant dans le dispositif et qui entraine plus ou moins rapidement les substances à séparer. Phase stationnaire ou phase plateau : 1. Lors d’une culture de cellules discontinue non-alimentée (en batch), la phase stationnaire correspond au stade où la concentration cellulaire reste constante et se traduit par un plateau au niveau de la courbe de croissance. 2. En chromatographie*, support immobile sur lequel vont migrer en fonction de leur affinité les substances à séparer sous l’action de la phase mobile*. pHi : pH* isoélectrique d’une molécule (acide aminé* ou protéine), c’est-à-dire le pH auquel cette molécule a une charge nette nulle. Au dessus de ce pH (à pH plus basique), la molécule est chargée négativement. Au dessous de ce pH (à pH plus acide) la molécule est chargée positivement. Phosphatase : enzyme* qui élimine un groupement phosphate d’une molécule par hydrolyse* d’une liaison ester phosphorique. Par exemple, au niveau du foie, le glucose phosphorylé* peut être clivé en glucose à l’aide de la phosphatase hépatique. Selon le pH* où se situe l’optimum d’efficacité de ces enzymes, on distingue les phosphatases acides (E.C : 3.1.3.2., pH optimum voisin de 5) et les phosphatases alcalines (E.C : 3.1.3.1., pH optimum voisin de 9). Phospholipides : lipides polaires* formant la double couche lipidique des membranes et les monocouches entourant les lipoprotéines* et les micelles*. Ils possèdent un groupement phosphate et un ou deux acides gras. Les phosphoglycérides ou phosphatides ou phosphoglycérolipides sont basés sur le glycérol dont les trois groupes hydroxyles* sont estérifiés par deux acides gras et un groupement phosphate. Si celui-ci reste libre, on a un acide phosphatidique. Dans certains cas, une des fonctions de l’acide phosphorique estérifie à son tour une molécule de choline dans le cas des lécithines (phosphatidylcholine), ou une molécule d’éthanolamine (phosphatidyléthanolamine) ou une

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molécule d’inositol (phosphatidylinositol). Les sphingolipides sont basés sur la sphingosine et contiennent un seul acide gras lié au groupement amine. Phosphorylation : transfert direct d’un groupement phosphate inorganique (acide phosphorique) d’un substrat* à l’adénosine monophosphate ou diphosphate ou de l’adénosine mono-, di- ou triphosphate à un substrat, catalysé dans la cellule par des kinases. Ce transfert se fait généralement par formation de liaisons ester phosphoriques riches en énergie. L’énergie ainsi accumulée peut être libérée et utilisée dans les réactions endergoniques. La phosphorylation des protéines intervient en général sur les chaînes latérales de sérine, de thréonine, de tyrosine, d’histidine ou d’aspartate. Les réactions de phosphorylation sont importantes pour le stockage de l’énergie, la biosynthèse d’intermédiaires durant le métabolisme* ainsi que pour la régulation de nombreuses enzymes*. Photoautotrophe ou phototrophe : se dit d’un organisme qui utilise la lumière comme source d’énergie pour synthétiser, par photosynthèse*, sa matière organique à partir d’éléments de base que sont le dioxyde de carbone et d’eau. Photobioréacteur : dispositif (bioréacteur*) fermé mais éclairé (lumière naturelle ou artificielle) permettant la culture en conditions optimales de micro-organismes photosynthétiques (microalgues ou Cyanobactéries). Photopériode : alternance d’éclairement (ou héméropériode) et d’obscurité (nyctopériode) au cours du cycle nycthéméral ou cycle photopériodique (24 h), variable suivant la latitude et la saison, ayant des conséquences sur la croissance et la physiologie des plantes (floraison, par exemple). Lors de chaque cycle photopériodique, les plantes doivent recevoir une durée minimale d’un éclairement suffisamment intense pour assurer une activité photosynthétique compatible avec une bonne croissance. Photosynthèse : voie métabolique par laquelle les plantes vertes (chlorophylliennes), les algues, les Cyanobactéries, convertissent le dioxyde de carbone (de l’air ou dissous dans l’eau) et l’eau en présence de lumière, en composés organiques (sous forme de glucides essentiellement). Chez les bactéries* photosynthétiques, en dehors des Cyanobactéries qui sont oxygéniques, cette photosynthèse est non-oxygénique et utilise l’H2S ou des molécules équivalentes comme donneur d’électrons et de protons. Ce processus est localisé au niveau du chloroplaste. Chez les végétaux terrestres, toutes les parties vertes de la plante, y compris les tiges vertes et les fruits non encore mûrs, sont pourvus de chloroplastes, mais ce sont surtout les feuilles qui en renferment le plus et, donc, qui assurent la quasi-totalité de l’activité photosynthétique. Les produits énergétiques qui y sont élaborés peuvent être utilisés sur place ou transférés vers d’autres sites d’utilisation ou encore accumulés dans des organes de réserve de la plante (tubercules, rhizomes*, bulbes). Leur acheminement se fait par la sève* élaborée grâce à un tissu conducteur, le phloème. Phytohémagglutinines : lectines* végétales, extraites essentiellement des graines de Légumineuses*, capables de provoquer l’agglutination des globules rouges du sang des Vertébrés et de stimuler la division des lymphocytes*. Les lectines sont utilisées, entre autres, pour la préparation de caryotypes à partir de cellules du sang.

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

Phytoplancton : plancton végétal composé essentiellement de microalgues unicellulaires et de Cyanobactéries vivant en suspension* dans l’eau. Phytostérol : stérol caractéristique des plantes supérieures. Les phytostérols constituent, en commun avec d’autres lipides, les membranes des cellules végétales. On les retrouve donc dans toutes les huiles végétales alimentaires comme le sitostérol et le campestérol ; le stigmastérol est également très fréquent. D’autres stérols, de moindre importance quantitative, peuvent se trouver dans certaines huiles végétales : brassicastérol, cholestérol*, fucostérol et ergostérol. Plusieurs études ont démontré que les phytostérols réduisent l’absorption du cholestérol dans l’intestin grêle. Piézoélectrique : l’effet piézoélectrique est la propriété chez certains corps de se polariser électriquement en générant un champ ou un potentiel électrique sous l’action d’une contrainte mécanique. Le plus connu des matériaux présentant cette propriété est le quartz, mais dans l’industrie il est remplacé par des céramiques synthétiques. Piézophile : synonyme de barophile*. Pigment : substance colorée qui absorbe la lumière visible, chez les organismes photoautotrophes* (ex. la chlorophylle, pigment des plantes vertes). Un pigment est en suspension* dans son milieu d’utilisation alors qu’un colorant* est en solution. La couleur d’un pigment dépend de sa capacité à absorber sélectivement certaines longueurs d’onde et à réfléchir les autres longueurs d’onde : il sera de la couleur des radiations qu’il n’absorbe pas. La chlorophylle, par exemple, absorbe la lumière dans les parties violettes, bleue et orange-rouge du spectre lumineux et réfléchit la lumière dans les parties vertes et jaunes du spectre. Par conséquent, la chlorophylle paraît verte. Plasmaphérèse : la plasmaphérèse est une technique qui consiste, après prélèvement du sang chez un donneur, à séparer le plasma des cellules sanguines du patient par filtration* ou centrifugation*. Plasmide : petite molécule d’ADN* extrachromosomique souvent circulaire, présente naturellement dans le cytoplasme de certaines bactéries*, capable de se répliquer de façon autonome, dans la cellule d’origine ou dans la cellule hôte. Z Les plasmides Ti et Ri sont des plasmides portés respectivement par les bactéries Agrobacterium tumefaciens et A. rhizogenes. Ils comportent un segment d’ADN transférable et intégrable dans le génome* d’une cellule végétale. Ils sont souvent utilisés comme vecteurs* efficaces et fiables dans le transfert et l’intégration de façon précise d’un segment d’ADN étranger dans l’ADN d’une grande variété de plantes et permettent d’obtenir, ainsi, des plantes transgéniques*. L’ADN nouvellement inséré est BMPST
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.FOEFM Z Chez les Eucaryotes*, les plasmides sont présents dans les mitochondries et les chloroplastes. Plasticité physiologique : pour une plante ou une algue, capacité d’adapter ses principales fonctions aux modifications de son environnement comme le niveau et la qualité de l’éclairement, la température, la salinité…

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Point de fusion ou température de fusion : température à laquelle une substance solide passe à l’état liquide, sous une pression donnée. Dans le cas des hydrocarbures*, le point de fusion dépend de 2 facteurs : Z nombre de carbones : le point de fusion augmente avec le nombre de carbones, pour une série homologue. Z le degré d’insaturation : le point de fusion diminue avec l’insaturation, pour un nombre constant d’atomes de carbone. Point isoionique (pI) : il correspond au pH* d’une solution (d’une protéines ou d’un autre ampholyte) pour lequel le nombre de groupements chargés positivement est égal au nombre de groupements chargés négativement. Polaire : se dit d’une molécule à l’intérieur de laquelle les charges ne sont pas réparties de manière symétrique. Polarité : 1. Propriété d’une molécule (dite polaire*) dont les charges électriques font apparaître une ou plusieurs zones chargées électriquement, constituant des dipôles (une partie partiellement positive et une partie partiellement négative) ou des multipôles. Plus une molécule sera polaire, plus elle devient hydrophile* et, donc, lipophobe ; plus faible sera sa polarité (molécule dite apolaire*), plus elle sera hydrophobe* et, donc, lipophile*. Les molécules polaires sont solubles dans les solvants polaires car elles s’attirent par interaction électrique. Les molécules apolaires sont solubles dans les solvants apolaires. 2. En biologie moléculaire*, c’est la distinction entre les extrémités 3’ et 5’ des acides nucléiques*. Pollution : modification défavorable, temporaire ou chronique, d’un milieu naturel entraînant un déséquilibre définitif ou réversible de la biocénose*. Polymère : macromolécule constituée par la répétition d’unités moléculaires de base dénommées monomères*, unis les uns aux autres par des liaisons covalentes*, tels l’amidon et les protéines. La réaction de synthèse des polymères à partir des monomères s’appelle une polymérisation. Polyphénols : ce terme désigne une catégorie de molécules organiques, le plus souvent produites par les végétaux et qui proviennent de leur métabolisme* secondaire. Comme leur nom l’indique, elles sont constituées d’un assemblage de molécules plus petites, les phénols formant souvent des structures complexes de masse moléculaire élevée. On les trouve, par exemple, en grande quantité dans le vin rouge ou dans le thé vert et le café. Du fait de leur fort pouvoir antioxydant*, ils sont connus pour être bénéfiques pour la santé. Les polyphénols participent à la défense des plantes contre les agressions environnementales. Porosité : au niveau d’une membrane ou d’un gel, la porosité est le rapport entre le volume des interstices (pores) et le volume total des particules solides. Pouvoir moussant : capacité d’une substance à réaliser une dispersion homogène d’une phase gazeuse (ex. bulles d’air) dans une denrée alimentaire liquide ou solide, et à stabiliser la mousse* ainsi obtenue.

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ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE

Les protéines du blanc d’œuf, du lactosérum*, de soja, les caséinates, le gluten* possèdent de bonnes propriétés moussantes. Elles sont utilisées dans un grand nombre de produits agro-alimentaires* (ex. pâtisseries, confiseries*, crèmes glacées, crèmes fouettées…). Pouvoir tampon : le pouvoir tampon est le nombre de moles d’acide ou de base forte à ajouter à 1 L de solution tampon* pour faire varier le pH* d’une unité. ppm (partie par million) : expression un peu désuète de concentration en masse ou en volume, dans le cas des très petites quantités ; par exemple un cm3 de la substance par million de cm3 d’air. Cependant, ppm reste très employé pour les déplacements chimiques en résonance magnétique nucléaire. Précipitation : phénomène physique dû à l’agrégation de nombreuses molécules protéiques ; il se produit au sein d’un milieu liquide lorsque les protéines qu’il contient ont été rendues insolubles par floculation, relargage* ou dénaturation*. Précurseur : substance biochimique souvent inactive sur le plan biologique mais susceptible d’être convertie en molécule constitutive complexe ou en molécule active, soit par voie enzymatique dans l’organisme (ex. β-carotène, précurseur de la vitamine* A), soit par voie physico-chimique (ex. transformation de la provitamine D par irradiation* aux ultraviolets*). Pression hydrostatique : pression en chaque point d’un liquide au repos. Cette pression augmente d’environ 1 bar par tranche de 10 m sous l’eau. Pression lithostatique : pression due aux roches et sédiments sus-jacents, s’exerçant sur une unité de surface, le m2 par exemple. Pression oncotique : différence de pression osmotique* entre le contenu du compartiment cellulaire et le milieu extracellulaire. Elle est due en majeure partie aux macromolécules protéiques (ex. protéines du plasma sanguin). Pression osmotique : pression ou plutôt force responsable du passage des molécules d’eau depuis une solution moins concentrée vers une solution plus concentrée lorsqu’elles sont séparées par une membrane hémiperméable. Principe actif : molécule pure d’origine biologique, minérale ou organique, naturelle ou synthétique, chimiquement bien définie, entrant dans la composition d’un médicament et lui conférant des propriétés thérapeutiques ou biologiques. Cette molécule est, souvent, en très faible proportion dans la formulation du médicament, par rapport aux autres constituants (excipients*). L’efficacité des principes actifs est évaluée d’abord par divers tests in vitro et in vivo, puis par des essais cliniques. Prion : Acronyme venant de l’anglais (PRoteinaceous Infectious ONly particle) ou particule protéique glycosylée infectieuse rencontrée dans le tissu nerveux et le cerveau, transmissible par voie orale et responsable des maladies dites « à prion » dont les plus connues sont chez l’homme la maladie de Creutzfeldt-Jakob et chez l’animal, la tremblante du mouton et l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB).

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Procaryote : organisme dépourvu d’un véritable noyau délimité par une membrane, d’organites (mitochondries, plastes…) et ne possédant qu’un ADN* souvent circulaire, libre dans le cytoplasme (ex. les bactéries*, les Cyanobactéries). Producteurs primaires : organismes autotrophes, généralement photosynthétique, qui produisent de la matière organique et sont donc, dans les cycles biologiques, les premiers maillons des chaînes alimentaires*. Ex. plantes vertes, algues et bactéries* photosynthétiques. Productivité : 1. Aptitude potentielle d’un organisme (végétal, animal ou bactérien) à fournir une certaine quantité d’un produit déterminé (biomasse*, fruits, graines, fourrages*, huile, principe actif*…) dans des conditions optimales, en l’absence de tout facteur limitant. 2. Pour un écosystème, c’est la quantité de biomasse produite en un temps donné (= vitesse de production). Pronase : nom de marque donné à un mélange de divers exo- et endopeptidases, provenant de Streptomyces griseus, capable d’hydrolyser pratiquement n’importe quelle protéine presque entièrement (70 % dans le cas des caséines) en acides aminés* libres. Elle est utilisée pour l’hydrolyse* de beaucoup de protéines, la digestion des mucines*, l’isolement de l’ADN* ou l’ARN* intacts des cellules ou des virus ou la dispersion de certains types de cellules de tissus de mammifères, par exemple les chondrocytes. Prostaglandines : classe de composés dérivant des acides gras polyinsaturés* par oxydation* et réarrangement. Les prostaglandines (PGD, PGE, PGF, PGG, PGH, PGI) contiennent un cycle à 5 atomes de carbone et au moins 3 atomes d’oxygène. Ceux contenant 3 doubles liaisons carbone-carbone dérivent de l’acide eicosapentaénoïque (EPA) ; ceux à 2 doubles liaisons de l’acide arachidonique et ceux à 1 double liaison de l’acide dihomo-γ-linoléique. Les prostaglandines sont libérées dans le liquide interstitiel de la plupart des types de cellules animales et humaines et jouent le rôle de régulateur local en agissant de diverses façons sur les cellules voisines. Parmi leurs nombreux effets physiologiques, on peut citer la contraction des muscles lisses de l’utérus, l’élévation ou la diminution de la pression sanguine, la stimulation de l’inflammation des tissus affectés, l’agglutination des plaquettes, la coagulation* sanguine… Ils peuvent faire l’objet d’indications thérapeutiques. Les différentes prostaglandines ont souvent des effets opposés ; par exemple, la PGE et la PGA réduisent la pression sanguine, tandis que la PGF l’augmente. Protéagineux : se dit d’un végétal cultivé pour sa richesse en protéines. Ex. Légumineuses*, pois, féveroles, lupins, luzerne… Protéines globulaires : ensemble des protéines ayant une structure quaternaire globalement globulaire (ex. insuline, ribonucléase), se distinguant des protéines fibreuses comme le collagène et le fibrinogène* de forme allongée, par exemple. Les protéines globulaires sont généralement solubles. Dans leurs formes biologiquement actives, elles ont une structure spatiale définie (conformation* native). Si cette structure est détruite, elles perdent non seulement leur activité biologique, mais elles précipitent

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sous forme insoluble. Ceci se produit, par exemple, lorsque des œufs sont bouillis; les protéines solubles du blanc d’œuf sont dénaturées par la chaleur et se durcissent. Protéine de transport : protéines dont la structure leur confère la propriété de facilement se lier avec des substances diverses (ex. minéraux, acides gras, vitamines*, oxygène…). Il existe deux catégories de protéines de transport : celles qui facilitent la diffusion* de molécules dans le sens des gradients électrochimiques et celles qui transportent ces molécules de manière active, contre le gradient électrochimique. Les premières sont des protéines tridimensionnelles de trois sortes, suivant qu’elles transportent une (uniports), ou deux (symports) molécules à la fois, et que ces deux molécules se déplacent dans le même sens ou non (antiports). La seconde catégorie correspond aux transporteurs actifs, car elles ne fonctionnent qu’en présence d’énergie métabolique provenant soit de l’hydrolyse* de l’ATP, soit en utilisant l’énergie d’un gradient ionique comme le gradient sodium par exemple. Sans cette source d’énergie, elles ne sont pas capables de lutter contre les forces du gradient électrochimique. Protéoglycanes : les protéoglycanes sont des glycoprotéines* (protéines fortement glycosylées) qui constituent la matrice* extracellulaire des tissus conjonctifs chez les animaux. L’unité de base des protéoglycanes se compose d’une protéine centrale avec une ou plusieurs chaînes de glycosaminoglycanes (GAG) fixées de manière covalente et formant des complexes de haute masse moléculaire. Les protéoglycanes, qui se rencontrent également dans la paroi des Eubactéries*, sont constitués par un maillage de polysaccharides alternes d’acide N-acétylmuramique et de N-acétylglucosamine, liés à des oligopeptides comportant des acides aminés*. Les protéoglycanes contractent des liaisons covalentes* avec des protéines de la membrane externe chez les bactéries* à Gram* négatif. Appelés aussi muréines. Les protéoglycanes peuvent être distingués en sulfate d’héparane, sulfate de chondroïtine, sulfate de dermatane et sulfate de kératane selon la nature de leurs chaines de GAG. Protéolyse : hydrolyse*, par voie chimique (ex. par un acide) ou enzymatique des protéines en leurs acides aminés* constitutifs. Elle peut être partielle (formation de peptides) ou totale (libération quantitative des acides aminés). Une partie des acides aminés provenant de la protéolyse alimente la synthèse protéique. Les enzymes* responsables sont appelées « enzymes protéolytiques » ou « protéases ». La protéolyse est fréquemment utilisée dans les industries alimentaires, pour des applications variées. Protéomique : la protéomique est une approche qui a pour but de détecter, d’isoler, d’identifier et de caractériser l’ensemble des protéines exprimées (ou protéome, par analogie au génome*) dans une cellule, un tissu, un organe ou un organisme vivant, dans un environnement et un moment (toutes les protéines ne sont pas synthétisées en même temps) donnés ainsi que les interactions protéine-protéine au sein de cet organisme. Protoplaste : cellule végétale débarrassée de sa paroi par des traitements enzymatiques ou mécaniques et que l’on peut obtenir à partir de différents organes. La fusion de protoplastes (in vitro), entre cellules appartenant à des espèces différentes, est notamment utilisée lorsque le croisement (voie sexuée) entre les deux espèces est impossible.

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Psychrophile : qualifie une espèce vivante qui se développe aux basses températures, au-dessous de 20 °C. Les psychrophiles extrêmes se développent au-dessous de 5 °C ou sur la neige (algues, lichens*). Psychrozyme : enzyme* qui fonctionne aux basses températures. Pulpe de betterave : co-produit de la sucrerie obtenu après extraction* du sucre des betteraves. Les pulpes sont généralement pressées, séchées et utilisées en alimentation animale. Pyranose : dans le cas des oses, structure cyclique (cycle pyrane) à 6 atomes (5 carbones et 1 oxygène). Ex. le D-glucopyranose, une forme de glucose qui existe sous deux configurations anomériques* α et β.

R Radicaux libres : atomes ou molécules ayant un électron célibataire. Les radicaux libres, tel que l’anion superoxyde* O2–, sont formés par exemple à la suite d’oxydation* des nutriments* lors des traitements tels que la friture*, l’irradiation*… ou même lors du métabolisme* cellulaire normal de l’oxygène. Dans certaines situations, cette production augmente fortement, entraînant un stress oxydatif*. Etant très réactifs et très instables, ils sont, chez les organismes vivants notamment, responsables de l’oxydation des composés cellulaires, phénomène important dans le processus de vieillissement, du cancer, des maladies cardio-vasculaires et de l’arthrite. Leur action est atténuée par les antioxydants*, naturels ou apportés par l’alimentation. Raffinage : procédé de purification de diverses substances d’origine végétale telle que le sucre ou les huiles. Dans ce dernier cas, le raffinage fait appel à une série d’opérations physiques et chimiques fort complexes dont les principales sont : démucilagination*, neutralisation, décoloration et désodorisation*. Rafles : grappes de raisin sans leurs grains. Rancissement : altération des corps gras* sous l’influence de l’oxygène de l’air, de la température, de la lumière et des traces de métaux. Le rancissement entraîne une modification désagréable de leur odeur et de leur saveur*, due souvent à une hydrolyse* des triglycérides* et à la libération des acides gras constitutifs. Ration : quantité d’un aliment ou d’une combinaison d’aliments correspondant aux besoins journaliers d’un individu. Ravageur : se dit d’un organisme capable de causer des dommages à un autre organisme. Les ravageurs des plantes comprennent des insectes et divers agents phytopathogènes, dont des bactéries*, des champignons, des virus, des nématodes. Rayons X (RX) : ondes électromagnétiques semblables à la lumière (constitués également de photons), mais de longueurs d’onde très courtes comparable aux distances interatomiques, comprises entre 0,5 et 2,5.10 –10 m. Les RX sont émis par les atomes durant les transitions électroniques produites par une radiation incidente ou par les atomes de

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certains radioéléments durant leur transformation par capture d’électrons. Les RX présentent des longueurs d’onde caractéristiques des éléments qui les produisent. Selon leur énergie, les RX sont répartis en RX durs (> 5 à 10 keV) et RX mous. Rayonnement ionisant : rayonnement très énergétique, susceptible d’arracher des électrons aux atomes des molécules, en générant des molécules ionisées. Ex. rayons gamma des substances radioactives, rayons cosmiques et rayons X*. Les tissus biologiques sont sévèrement endommagés par de tels rayonnements à cause des radicaux libres* qu’ils génèrent. Réaction de Maillard : réaction de brunissement des aliments, associant sucres réducteurs* et acides aminés* soufrés, lors d’un traitement par la chaleur (ex. cuisson, stérilisation*). Elle est à l’origine de la coloration des produits de panification* et de biscuiterie, mais aussi de la formation d’arômes* typiques. Elle s’accompagne également d’une diminution de la qualité nutritive. Récepteur nicotinique : ce sont des récepteurs ionotropes : leur activation par la nicotine entraîne une entrée d’ions sodium et une sortie d’ions potassium, et par suite, une dépolarisation du neurone post-synaptique entrainant une accélération du rythme cardiaque, de la respiration et une élévation de la pression artérielle et une activation des sécrétions hormonales. Récepteur synaptique : protéine réceptrice participant à la transmission synaptique entre les neurones. Recombinaison génétique : tout processus conduisant à l’apparition dans une cellule ou dans un individu, de gènes* ou de caractères héréditaires dans une association différente de celle observée chez les cellules ou individus parentaux. La recombinaison peut être naturelle (grâce au crossing over lors de la méiose) ou provoquée in vitro (génie génétique*) par intégration dans le génome* d’un transgène (gène issu d’un autre organisme). Recombinant : désigne un fragment de matériel héréditaire modifié par des méthodes de génie génétique*. Des protéines sont dites recombinantes lorsqu’elles ont été produites artificiellement au moyen d’organismes génétiquement modifiés ou en culture cellulaire. Dans le cas de l’ADN*, il s’agit d’une molécule hybride formée à partir d’au moins deux fragments n’ayant pas la même origine (provenant soit d’organismes de deux espèces différentes, soit de deux chromosomes différents d’un même organisme, soit de deux fragments du même chromosome qui n’étaient pas adjacents à l’origine). Recyclage : ensemble des techniques ayant pour but de récupérer les déchets (urbains, industriels, agricoles) de façon à les réutiliser. Il comprend un tri sélectif, des moyens de traitements appropriés, la maîtrise des rejets et, finalement, la transformation en un produit utile. Réducteurs (sucres –) : sucres simples ayant une fonction aldéhyde* ou cétone libre, capables de réduire un certain nombre d’ions métalliques. Le réactif couramment utilisé pour la mise en évidence de cette caractéristique de structure est la liqueur de Fehling, qui contient des ions Cu2+ (cuivriques) complexés dans les solutions alcalines à des ions

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tartrate et qui sont tous de couleur bleue mais en présence de sucres réducteurs, il se forme, en milieu alcalin, un précipité rouge brique d’oxyde cuivreux ou oxydule (Cu2O). Au niveau industriel, ces sucres participent aux réactions de Maillard* ou de caramélisation lors des cuissons. Réduction : gain d’électrons par une substance participant à une réaction d’oxydoréduction*. Relargage : procédé d’extraction* des protéines par addition de certains sels minéraux (ex. sulfate d’ammonium) au sein du milieu liquide dans lequel elles se trouvent. Au-dessus d’une certaine concentration en ces éléments salins, il n’y a plus assez de molécules d’eau disponibles pour dissoudre les sels et les protéines. Ces dernières s’agrègent et précipitent. Rendement : 1. Dans le cas des cultures, production (en masse, volume, nombre) rapportée à l’unité de surface (en hectare ou en are). Le rendement est souvent la traduction de la résultante des interactions entre les caractères propres de la plante considérée et les facteurs et les conditions de l’environnement. 2. Dans le cas d’une culture de cellules, c’est la différence entre la biomasse* produite ou nombre de cellules produites sur une période de temps, par rapport à la biomasse ou le nombre de cellules au départ de la culture. Réplication : processus au cours duquel une molécule d’ADN* est copiée à l’intérieur d’un noyau ; aussi appelée synthèse de l’ADN. La réplication a lieu pendant l’interphase suivant la mitose. Ces molécules sont ensuite réparties entre les cellules filles. Les deux brins de la molécule d’ADN matrice* (molécule parentale) se séparent par rupture des liaisons hydrogène* qui relient les bases nucléotidiques complémentaires entre elles et servent chacun de leur côté de modèle à la synthèse d’un nouveau brin complémentaire. Au fur et à mesure de cette scission, les nucléotides libres, porteurs des bases complémentaires de la molécule parentale viennent se fixer sur chaque brin dissocié. Une enzyme*, l’ADN polymérase catalyse la polymérisation* de ces molécules libres dans un ordre qui est strictement complémentaire de celui du brin parental. Il se produit, ainsi, deux nouvelles molécules d’ADN à double hélice, identiques à la molécule mère et portant un brin d’origine parental et un brin néosynthétisé; ce mécanisme est qualifié de semi-conservateur. La réplication permet, ainsi, la conservation de l’intégrité de l’information génétique, nécessaire à sa transmission héréditaire dans toutes les générations cellulaires ultérieures. Résection : acte chirurgical qui consiste à enlever une anomalie, une tumeur, un organe ou une partie d’organe. Résine échangeuse d’ions : polymère* synthétique modifié pour que des groupes ioniques (cationiques ou anioniques) soient présents sur les chaînes. Les résines échangeuses d’ions sont très utilisées dans les laboratoires dans les techniques de chromatographie* sur colonne pour désioniser des extraits, purifier des protéines, déminéraliser l’eau…

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Résineux : arbres du groupe botanique des Gymnospermes, qui produisent des cônes et dont les feuilles sont des aiguilles ou ressemblent à des écailles. Réticulation : 1. Durant le processus de copolymérisation, formation d’une matrice* tridimensionnelle d’un gel* par addition d’un monomère* bifonctionnel pour former des ponts entre les chaînes de polymères* en laissant entre eux des mailles plus ou moins grandes. Le copolymère* résultant, de masse moléculaire plus élevée, présentera des propriétés physico-chimiques différentes du polymère initial, par exemple une insolubilité dans les solvants. Le degré de réticulation est déterminé par la quantité de monomère ajouté au milieu réactionnel. Le gonflement et la diffusion* caractéristiques du gel obtenu sont affectés par le degré de réticulation. 2. Procédé d’immobilisation* chimique d’une enzyme* en l’absence de support par la mise en jeu de liaisons intermoléculaires de type covalent entre l’enzyme et un agent bi- ou multifonctionnel. Rétinopathie : affection microvasculaire due à l’hyperglycémie, conduisant à une hémorragie de la rétine et son décollement puis la perte de vision. Rhéologie : branche de la physique qui traite les phénomènes qui conditionnent l’écoulement, les déformations des substances, et plus généralement la viscosité* des matériaux sous l’action de contraintes extérieures. La plasticité, l’élasticité, la dureté… relèvent également de la rhéologie. En agro-alimentaire*, ces phénomènes déterminent souvent les propriétés fonctionnelles* des aliments et interviennent pendant les traitements (comportement mécanique); pendant l’entreposage (stabilité physique) et au moment de la consommation (texture*). La rhéologie trouve son application dans les milieux de fermentation* liquide pour optimiser le brassage et permettre une bonne homogénéisation du milieu de culture*. Rhizome : tige souterraine de certaines plantes (ex. Fougères) dont la face inférieure donne naissance à des racines adventives, et dont la face supérieure émet des bourgeons qui se transforment en tiges aériennes. Rumen : appelée également panse, c’est le premier et le plus grand compartiment des quatre poches stomacales des ruminants*. La cellulose des végétaux y est digérée sous l’action de la flore microbienne*. Ruminant : catégorie de mammifères dont l’estomac est composé de plusieurs poches et qui pratiquent la rumination, c’est-à-dire faire remonter à la bouche les végétaux précédemment ingérés pour les mâcher avant de les avaler définitivement. En font partie, les bovins, caprins, ovins.

S Saponification : conversion d’un ester en alcool et en sel de l’acide correspondant sous l’action d’une base forte (la soude le plus souvent). C’est une réaction utilisée entre autres dans la fabrication des savons.

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Saprophyte : désigne les organismes (bactéries*, mycètes, végétaux, animaux) qui se nourrissent de matière organique inerte. Ils constituent une proportion importante de la faune du sol et de la litière, dont les vers de terre qui en représentent l’essentiel de la biomasse*. Les espèces saprophytes jouent un rôle essentiel au sein des cycles biologiques en «minéralisant » les matières végétales ou animales mortes. De nombreux champignons saprophytes sont considérés comme des auxiliaires précieux de la médecine moderne, grâce à leur production d’antibiotiques (ex. Penicillium). Beaucoup d’espèces sont également utilisées dans l’industrie (fabrication de fromages, obtention d’enzymes*, de vitamines*, d’acides organiques…). Saveur : propriété d’un aliment détectée par les papilles du goût de la langue et des glandes du palais et qui provoque une réponse positive ou négative à l’ingestion supplémentaire d’aliments. Sédimentation : technique de séparation utilisant les propriétés physiques (masse, densité) de composés séparés sous l’effet de la gravité. Pour accélérer ce phénomène on utilise la force centrifuge, on parle alors de centrifugation*. Sélectivité : 1. Capacité d’une plante à prélever dans le milieu environnant uniquement les éléments dont elle a besoin pour sa croissance et son développement. 2. Aptitude d’une méthode analytique ou d’un instrument à détecter qualitativement un groupe d’espèces chimiques, plus ou moins restreint, en présence d’autres composants contenus dans l’échantillon examiné. 3. Aptitude en chromatographie* d’une phase stationnaire* à retenir sélectivement certaines molécules selon leurs caractéristiques chimiques (polarité*, taille…). Sensibilité : aptitude d’une méthode analytique ou d’un instrument à donner une réponse fiable pour une quantité donnée (la plus basse possible) d’un composé. Séquestrant : synonyme de chélateur*. Sève : solution (liquide) ou pseudo solution chargée de substances nutritives (sels minéraux) prélevées dans le sol par les poils absorbants des racines, ou formée de substances organiques élaborées dans les feuilles et qui circule dans les tissus conducteurs des plantes. Site de fixation : région d’une protéine comprenant les groupements chimiques assurant la fixation d’une molécule ou d’une macromolécule, grâce à l’établissement de liaisons diverses, en générale de faible énergie : liaisons hydrogène*, ioniques ou interactions hydrophobes*… Solubilité : 1. Aptitude d’un corps (soluté) à se dissoudre dans un liquide (solvant) particulier, dans des conditions définies (pH*, température…). 2. Quantité maximale d’un soluté qui se dissout dans une certaine quantité d’eau à une certaine température (ex. g de sucre par g d’eau).

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Sous-produit : produit secondaire obtenu par fabrication industrielle ou transformation des végétaux ou des animaux. Ex. lactosérum*, drêches de distillerie, pulpe de betterave*, farine de viande et d’os, sang, farine de poisson. Spécificité : 1. Capacité d’un test à reconnaître un seul analyte dans un échantillon qui peut contenir diverses espèces différentes en produisant un signal proportionnel à la quantité de cet analyte ciblé spécifiquement. 2. Capacité d’une enzyme* ou d’un récepteur à distinguer une seule molécule parmi divers substrats* ou ligands*. Spectrométrie de masse en tandem (SM1/SM2) : technique qui consiste, après ionisation d’une espèce chimique dans la source du spectromètre de masse, à sélectionner un ion BV
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TUSVDUVSF Stabilisant : produit qui, ajouté à une denrée alimentaire, permet de maintenir ses caractéristiques physico-chimiques en ralentissant les réactions chimiques. Les stabilisants comprennent aussi les substances qui permettent de maintenir la dispersion homogène de deux ou plusieurs substances non-miscibles, ainsi que les substances qui conservent ou intensifient la couleur d’une denrée alimentaire. Standardisation : action visant à rendre un processus de production conforme à certaines normes de référence (normalisation). Elle peut porter sur le choix des méthodes, des ingrédients*, des appareils utilisés et des conditions opératoires. Stérilisation : procédé de conservation appliquée à un produit de façon à détruire tout germe microbien, y compris des spores qu’il contient. Il peut être réalisé par la chaleur sèche ou humide (autoclavage), par microfiltration*, par agents chimiques (gaz, produits chimiques…), antibiotiques, irradiation* (UV, émission radioactive)… Des barèmes de stérilisation donnent, en fonction des produits à traiter, la température à utiliser et la durée nécessaire pour atteindre l’effet cherché. La température n’est jamais inférieure à 100 °C. Dans le domaine laitier, la stérilisation repose sur des températures élevées, qui détruisent tous les micro-organismes sans aucune adjonction chimique. Plus la température utilisée est élevée, moins le temps nécessaire d’exposition à la chaleur est long. Ainsi, le lait peut être chauffé 15 à 20 min à 115 °C (stérilisation traditionnelle classique) ou 2 s à 150 °C (stérilisation « UHT », Ultra Haute Température). Stérilité : 1. Etat de ce qui est stérile, c’est-à-dire exempt de toute contamination par des microorganismes revivifiables. 2. Pour un organisme, incapacité à se reproduire. Stress : ensemble des perturbations physiologiques, métaboliques ou pathologiques chez un organisme, résultant des conditions environnementales non-satisfaisantes pour son développement et sa croissance. Le stress peut résulter de facteurs biotiques (action de pathogènes, de parasites, de prédateurs…) ou abiotiques* (chaleur, salinité, sécheresse, pollution*, lumière…).

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Stress oxydatif : condition physiologique dans laquelle la fonction mitochondriale est altérée, conduisant à la production excessive d’espèces réactives de l’oxygène* et une activité antioxydante* inadéquate. Cette situation qui se produit dans le cas d’un déséquilibre entre les oxydants (production accrue) et les antioxydants, peut occasionner des dommages aux cellules et à certains constituants vitaux pouvant conduire à de nombreuses maladies (néphropathie*, cardiomyopathie…). Structure primaire : définie, pour une protéine, par la séquence linéaire des acides aminés*. Cette séquence est aujourd’hui bien établie pour de nombreuses protéines, mais la détermination de la séquence est longue et laborieuse. Il est beaucoup plus rapide et aisé de déterminer la séquence des nucléotides du gène* correspondant à la protéine, ce qui permet d’en déduire la séquence des acides aminés. Subendothélial : sous l’endothélium. Substitut du plasma : solution de remplissage vasculaire utilisée pour compenser la diminution du volume de sang circulant à la suite d’un choc hypovolémique* ou hémorragique et dont les qualités physico-chimiques doivent se rapprocher le plus possible de celle du plasma. Substrat : 1. Substance sur laquelle agit spécifiquement l’enzyme* qui la transforme. 2. Corps ou substance (ou groupe de substances) servant simplement de support mécanique et/ou de milieu nutritif de base à un micro-organisme ou à une plante en culture. Sucre inverti ou interverti : solution aqueuse sucrée obtenue par hydrolyse* du saccharose en un mélange de glucose et fructose en proportions égales. Ce nom vient du fait que l’hydrolyse (appelée aussi inversion) du saccharose (qui dévie le plan d’une lumière polarisée vers la droite), s’accompagne d’un changement de signe du pouvoir rotatoire au cours de la formation du mélange équimoléculaire de D-glucose et de D-fructose. Ce mélange est appelé sucre inverti. Il est utilisé pour ses propriétés humectantes et anticristallisantes. C’est le sucre des confiseries*, des pâtes d’amande et autres pâtisseries qui, à l’image du pain d’épices, doivent rester moelleuses. Superoxyde : désigne l’anion O2– produit par réduction à un électron de l’oxygène diatomique. L’anion superoxyde (souvent noté O2t –, le point indiquant la présence d’un électron célibataire supplémentaire et le signe moins indiquant la présence d’une valence supplémentaire) est en même temps un radical. Il est formé lorsque des éléments métalloïdes très réactifs (ex. sodium, potassium, rubidium et césium) réagissent avec l’oxygène. C’est un agent oxydant puissant et une base forte. L’une des sources courantes de superoxyde est due à l’activité des oxydases des cellules procaryotes* et eucaryotes*, où il est potentiellement dangereux. Supplémentation : synonyme de complémentation*. Surfactant : substance, en général tensioactive*, capable de se dissoudre à la fois dans l’eau et dans un liquide gras, ce qui a pour effet de faciliter la dissolution des lipides dans des solutions aqueuses. Les surfactants sont constitués d’une portion hydrophobe, généralement une longue chaîne alkyle* attachée à un groupe hydrophile* favorisant sa

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solubilité* dans l’eau. Ils peuvent être anionique, non-ionique, cationique et ampholytique, selon la charge portée par la partie hydrophile de leur molécule. En biochimie*, les surfactants sont utilisés, par exemple, pour dissocier les protéines liées aux membranes telles que le cytochrome P-450 ou l’ATPase-(Na+

,+) et pour la solubilisation des lipoprotéines*. Surgélation : technique de conservation consistant à amener rapidement et à maintenir un produit à une température de – 18 à – 40 °C, ce qui évite la formation de gros cristaux de glace, déchirant les tissus du produit. Suspension : dispersion de fines particules solides (poudre) ou de cellules (suspension de microalgues) visibles à l’œil nu ou au microscope, au sein d’un liquide. Synérèse : séparation progressive d’un liquide de son gel, sous l’effet d’un changement de conditions physiques. En établissant lentement des zones de jonction entre les macromolécules du gel, celui-ci se contracte en expulsant sa phase liquide.

T Tamis moléculaire : résine permettant la séparation des molécules en fonction de leur taille. En biologie, le tamisage est une technique qui permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme (voir chromatographie d'exclusion stérique*). Tampon : une solution tampon est une solution qui s’oppose à de forte variation de pH* EBOT
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faible et de sa base conjuguée (pouvoir tampon* en milieu acide) ou d’un mélange d’une base faible et de son acide conjugué (pouvoir tampon en milieu basique). Tanins : groupe hétérogène de dérivés phénoliques végétaux ayant la propriété de précipiter les solutions d’albumine et de rendre le cuir (tannage des peaux) imputrescible en se fixant sur les protéines. Leur masse moléculaire varie de 0,5 à 3 kDa. Leurs effets biologiques sont dus à leur capacité à se complexer avec les protéines alimentaires et/ou les enzymes*. Ils sont aussi responsables de la baisse de digestibilité* des protéines chez les animaux domestiques. Taxon : groupe taxonomique (systématique) de rang identifié, quel qu’en soit le niveau, représenté par l’ensemble des entités qui partagent un certain nombre de caractères communs. Un taxon est constitué par la réunion des diverses populations présentant des caractéristiques suffisamment distinctes des autres groupes voisins pour qu’il soit érigé en un groupe séparé. Le genre, la famille, la classe, l’embranchement sont des taxons. Ex. Apiacées est un taxon de famille ; Triticum est un taxon de genre. Température de fusion : synonyme de point de fusion*. Température de transition vitreuse : dans le cas d’un polymère*, température (notée Tg) en dessous de laquelle, il devient dur et fragile, comme le verre. Tensioactif : qualifie un produit naturel ou synthétique (comme les détergents*, les agents mouillants, dispersants*, moussants*) qui abaisse la tension superficielle de l’eau ou du

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milieu dans lequel il est dissous. Les agents tensioactifs* possèdent une chaîne carbonée assez longue à propriété hydrophobe*, liée à un groupe hydrophile*. Ils sont donc amphiphiles*. Une telle molécule est capable d’interagir aussi bien avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse du système. On distingue les tensioactifs cationiques, anioniques, amphotères* et les tensioactifs non-ioniques comme le tween très couramment utilisé en biologie. Certaines substances biologiques se comportent aussi comme des agents tensioactifs naturels ioniques comme les sels biliaires, les phospholipides* (lécithines) et le phosphate d’inositol ou non-ioniques comme le cholestérol* et les saponines. Les tensioactifs sont utiles dans une multitude d’applications, à la fois domestiques (lessives, crèmes) et industrielles (sidérurgie). Une grande partie des dérivés de la lipochimie sont utilisés dans la fabrication des tensioactifs pour la détergence. Tension de surface : force résultant de la cohésion des molécules entre elles à la surface d’un liquide et s’opposant à leur séparation. La tension superficielle de l’eau est élevée parce que les molécules sont attirées par les molécules situées en dessous grâce aux liaisons hydrogène*. Texturant : additif alimentaire* qui permet de modifier les propriétés physiques d’un aliment sans en modifier sensiblement le goût et la saveur*. Texture : ensemble des propriétés mécaniques, géométriques et de surface d’un produit perceptibles par les récepteurs sensoriels (organes des sens) (norme NF ISO 5492). C’est souvent l’une des caractéristiques premières de la qualité d’un produit appréciée par le consommateur et une source d’innovation, en particulier pour les produits alimentaires ou cosmétiques. Elle est la résultante de sa structure. Thermophile : qualifie un organisme dont la température optimale de croissance est à des températures élevées, généralement au-dessus de 60 °C. Ex. les algues présentes dans les sources chaudes ou les plantes des biotopes désertiques. Une culture de micro-organismes thermophiles, comme biocatalyseurs, dans un bioréacteur* présente plusieurs avantages. Elle évite des contaminations par des microorganismes mésophiles* (vivant à température < 40 °C), et permet d’augmenter la vitesse de bioconversion*, la solubilité* des substrats* et des produits et de diminuer la viscosité* du milieu. Thermoplastique : se dit de matières qui se ramollissent par chauffage et durcissent par refroidissement dans un intervalle de température spécifique de la matière considérée. Thermoréversible : qualifie certains gels qui se forment au refroidissement mais qui se liquéfient lorsque la température augmente (gélatine, carraghénane, agar…) suite à la rupture des interactions hydrogènes. Thermozyme : enzyme* thermostables qui peuvent fonctionner à des températures élevées (entre 60 et 120 °C). Thrombogène : se dit d’une substance capable de favoriser la formation de caillots sanguins (ou thrombus) dans les artères ou les veines. Thrombose : formation de caillots dans les vaisseaux sanguins.

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Thromboxanes : eicosanoïdes* dérivant des acides gras polyinsaturés* à 20 carbones (acide arachidonique). La forme la plus active, TXA2 qui dérive de l’acide arachidonique, provoque l’agrégation des plaquettes durant la coagulation* et la constriction des vaisseaux, mais elle est rapidement dégradée en une forme biologiquement inactive, le TXB2. Thylacoïdes : composants membranaires en forme de saccules situés à l’intérieur du chloroplaste. Ces membranes portent la chlorophylle et d’autres pigments* photorécepteurs associés en antennes collectrices de l’énergie lumineuse ainsi que des transporteurs d’électrons des deux photosystèmes mais aussi l’ATPsynthase permettant les réactions de photophosphorylation. Titration : méthode permettant de déterminer la concentration d’une substance dans une solution par addition progressive d’un réactif spécifique de concentration connue jusqu’à obtenir la fin de la réaction (équivalence) entre les deux composés. Ce point d’équivalence est mis en évidence par plusieurs techniques permettant ensuite de calculer la concentration de la solution inconnue : neutralisation acide-base provoquant un changement de couleur de l’espèce titrée (ou du réactif titrant), réactions d’oxydoréduction* (parfois lentes), potentiométrie (changement de pH*), coulométrie, complexométrie, chélatométrie, argentométrie, iodométrie et précipitation*. Topinambour : plante vivace de la famille des Asteracées (Helianthus tuberosus), cultivée comme légume pour ses tubercules riches en inuline. Transestérification : alcoolisation d’un ester en présence d’acides ou de bases. Dans le cas des glycérides, par exemple, la transestérification consiste à redistribuer les différents acides gras (constitutifs d’un ou de deux corps gras*) sur les trois fonctions hydroxyles* du glycérol. La réaction se fait en présence d’éthylate ou de méthylate de sodium à 200-250 °C sous vide. On obtient finalement un mélange, à l’équilibre, de monoesters, de diesters et de triesters, selon une loi statistique. Une application très intéressante de cette réaction est l’obtention du Diester® obtenu par transestérification d’huiles de tournesol, de maïs, de soja…, par le méthanol ou l’éthanol permettant de les utiliser comme carburant dans les moteurs diésels. Tourteau : sous-produit* solide obtenu après extraction* de l’huile des graines d’oléagineux* par procédé mécanique (ex. tourteau d’arachide, de soja, de colza, de palmiste*, de coton…). Contenant parfois jusqu’à plus de 40 % de protéines, c’est, en alimentation animale, un complément de choix des rations* à base de Céréales*. Parfaitement délipidé par élimination de la matière grasse à l’aide de solvants (ex. hexane), il sert à la fabrication de concentrats* et d’isolats protéiques*. Transgénique : se dit d’un être vivant, animal, plante ou micro-organisme, issu d’une cellule dans laquelle a été introduit, par des techniques de génie génétique*, un ADN* comportant un ou plusieurs caractères génétiques d’un autre organisme, que cet organisme soit ou non de la même espèce. L’organisme transgénique possède dans la majorité ou dans toutes ses cellules l’ADN étranger introduit qui peut donc être transmis à la descendance. Sont exclues de cette définition, les plantes obtenues par recombinaison naturelle, par mutagenèse, par fusion de protoplastes* entre espèces de la même

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famille ou par multiplication in vitro à partir de n’importe quelle cellule de la plante. Certaines plantes transgéniques présentent une résistance accrue aux herbicides*, une résistance aux insectes et aux virus ou produisent des fruits ou des fleurs possédant des caractères absents chez les plantes sauvages. Une telle modification du génome* d’une plante n’implique pas forcément une modification de son aspect extérieur. Translocation : 1. Déplacement ou migration d’un métabolite* d’un site de l’organisme vers un autre. 2. Clivage d’un segment de génome* suivi de son intégration au niveau d’un autre site. Triglycéride : lipide constitué de trois acides gras liés aux trois hydroxyles* d’une molécule de glycérol par des liaisons ester. C’est la principale composante des matières grasses et huiles alimentaires et du tissu adipeux. Les propriétés physiques et chimiques des triglycérides dépendent de la nature de leurs acides gras constitutifs. Ils peuvent être simples, ayant les trois acides gras identiques ou mixtes, ayant deux ou trois acides gras différents. Ils sont transportés dans le sang sous forme de particules lipoprotéiques appelées chylomicrons* et de cholestérol* à très basse densité (VLDL). Triglycéridémie : taux de triglycérides* dans le sang. Ce taux est considéré comme normal lorsqu’il est inférieur à 1,7 mmol/L. Il existerait un lien entre un taux élevé de triglycérides et le risque de maladies cardiovasculaires. Trophique : qui se rapporte à la nutrition. Trypsine : enzyme* digestive sécrétée par le pancréas et qui hydrolyse les liaisons peptidiques des protéines à partir de l’extrémité carboxyle de l’arginine et de la lysine. La trypsine est secrétée sous forme de précurseur* inactif, le trypsinogène qui est converti en trypsine par une entérokinase secrétée par l’intestin grêle. Certaines plantes contiennent un inhibiteur de la trypsine qui empêche l’enzyme de fonctionner normalement. Turbidité : état d’un liquide trouble, provoqué par la présence de particules ou d’impuretés en suspension*, et de matières colloïdales, d’origine minérale ou organique et diminuant sa transparence. La mesure de la turbidité (turbidimétrie) est basée sur l’intensité de la lumière diffusée par des particules en suspension, appelé effet Tyndall. L’intensité de lumière diffusée, mesurée par des cellules photoélectriques, est proportionnelle au degré de turbidité ou au nombre de particules en suspension.

U Ultrafiltration : technique particulière de filtration* sur membrane à pores extrêmement fins (diamètre inférieur à 0,05 μm). Sous l’action de la pression, la solution contenant les molécules à séparer est placée dans le compartiment d’une presse limité par une membrane qui ne laisse passer que le solvant et les molécules de petite taille (ultra-filtrat) et qui retient les solutés de dimensions supérieures au seuil de rétention moléculaire de la membrane (rétentat). Cela se traduit donc par une concentration progressive et sélective de la solution de départ. Cette technique est employée, par exemple, pour récupérer les protéines des lactosérums* de fromagerie.

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Ultrason : vibration de même nature que le son mais dont la fréquence est trop élevée (supérieure à 20 kHz) pour être perçue par l’oreille humaine. Les ultrasons sont utilisés, entre autres, dans le diagnostic* médical (échographie), en particulier lorsque l’utilisation des rayons X est prohibée comme lors d’une grossesse par exemple. Ultraviolet (UV) : se dit d’une partie du spectre électromagnétique correspondant à des radiations très énergétiques, d’origine naturelle (soleil) ou artificielle (lampes UV), non-détectable par l’œil humain, de longueur d’onde comprise entre 10 et 380 nm. On distingue les UV-A (380 à 315 nm), les UV-B (315 à 280 nm) et les UV-C (280 à 100 nm). Les UV extrêmes (120 – 10 nm) sont considérés comme des radiations ionisantes. Les rayons UV, de par leur pouvoir bactéricide*, sont couramment utilisés dans certains procédés de stérilisation*. Ils facilitent également un grand nombre de réactions chimiques (oxydation*, décomposition…). Ils peuvent être produits artificiellement et utilisés sous surveillance, pour traiter certaines maladies de la peau comme le psoriasis par exemple.

V Valeur ajoutée : terme économique qui décrit le gain financier résultant de la transformation d’un produit brut ou semi-brut en un produit final de consommation courante ayant plus de valeur que le produit original. Valeur nutritionnelle ou valeur nutritive  : la valeur nutritionnelle d’un aliment correspond à l’apport calorique d’un aliment du point de vue de la nutrition. Elle informe aussi sur la part des apports en protéines, glucides, et liquides, et en autres éléments nutritionnels. Vecteur : en génétique moléculaire, petite molécule d’ADN* capable de s’auto-répliquer, utilisée pour la recombinaison in vitro de l’ADN, donc dans laquelle on insère de l’ADN étranger et que l’on utilise ensuite pour faire rentrer cet ADN dans une cellule hôte. Par exemple, les plasmides* sont utilisés comme vecteurs pour cloner des fragments d’ADN dans Escherichia coli. Vesou : liquide obtenu par extraction* (par écrasement) de la canne à sucre. Débarrassé de ses protéines et neutralisé par chaulage*, filtré, décoloré et concentré, il donne le saccharose brut cristallisé (sucre roux). Ce sucre subit ensuite un raffinage*. Viennoiserie : produits de boulangerie fabriqués avec une pâte fermentée pouvant contenir du sucre, du lait, des matières grasses et des œufs. Ex. brioches, croissants, pains au chocolat, pains au lait, aux raisins… Viscosimètre : appareil servant à mesurer la viscosité* des liquides. Viscosité : état de la consistance (épaississement) d’un liquide et de sa résistance plus ou moins marquée à l’écoulement uniforme et sans turbulence. La viscosité est due aux forces de frottement des particules entre elles. Elle dépend de la nature physico-chimique du solvant, de la concentration du soluté, de la température, de la charge électrique des particules dispersées et de leur affinité pour le solvant. La viscosité est une grandeur exprimée en Pascal seconde (Pa.s ou kg.m–1.s–1 dans le système interna-

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tional) indiquant le degré de fluidité d’un liquide. Plus la viscosité est importante, plus le fluide est épais ; plus la viscosité est faible, plus il est liquide. D’autres unités sont encore utilisées : le poiseul (1 PI = 1 Pa.s) et la poise (1 Po = 0,1 Pl = 0,1 Pa.s). La capacité de certaines substances à accroître la viscosité du milieu dans lequel elles se trouvent est une caractéristique recherchée dans la fabrication de nombreux produits alimentaires (ex. potages, sauces, crèmes…). Vitamine : molécule indispensable à faible dose au bon fonctionnement des organismes animaux et de l’homme. La plupart, ne pouvant être synthétisées par l’organisme, doivent être fournies par l’alimentation. Les carences en vitamines se traduisent par certaines maladies appelées avitaminoses qui peuvent parfois être graves. Par exemple, l’absence de vitamine B1, de vitamine C ou de vitamine D dans l’alimentation de l’homme provoque le béribéri, le scorbut et le rachitisme respectivement. Par contre, un excès de vitamines principalement A et D peut aussi générer des maladies plus ou moins graves comme des maux de tête du à une augmentation de la pression intracrânienne par hypervitaminose A ou entrainer des lésions voire une cirrhose du foie par hypervitaminose B. Volémie : volume sanguin total circulant (plasma et éléments figurés). C’est un des facteurs essentiels de l’équilibre hémodynamique de l’organisme, régulé par les reins. La volémie typique d’un être humain adulte est environ 5 L (soit environ 7 % du poids corporel). Volume mort (V0) : en chromatographie d’exclusion stérique*, le volume mort désigne le volume interstitiel, compris entre les granules poreuses du gel. Seules les molécules dont la taille est supérieure à celle des pores internes des granules circulent dans le volume mort.

X Xénobiotique : désigne tout composé chimique minéral ou organique qui est étranger à la vie, habituellement engendré par les activités humaines. Des substances naturelles comme les métaux toxiques comme le plomb ou encore les innombrables composés organiques de synthèse polluants (comme les insecticides* organochlorés) en constituent des exemples classiques. Xérophile : qualifie un organisme (xérophyte, dans le cas d’une plante) adapté à un habitat aride.

7KLVSDJHLQWHQWLRQDOO\OHIWEODQN

INDEX A Acacia 33 ACCase (acétylcoenzyme A carboxylase) 207 accélérine (facteur VI) 226 Acer saccharum (érable à sucre) 16 acétate d’uranyle 276 Acetobacter xylinum 323 acétylcoenzyme A carboxylase (ACCase) 207 acide – abiétique 105 – abscissique 103, 104 – arachidonique 92 – ascorbique (vitamine C) 41 – aspartique 59, 283 – brassylique 95, 130 – caféique 159 – cinnamique 159 – citrique 17 – docosahexaénoïque (DHA) 120, 198, 265 – domoïque 214 – éicosapentaénoïque (EPA) 198, 265 – érucique 130 – férulique 29, 159, 170, 363, 449 – fusidique 315 – galacturonique 29, 33, 35 – gluconique 17, 325, 399 – glucuronique 33, 334, 339 – glutamique 59, 66, 194, 256, 283, 332 – jasmonique 450 – kaïnique 214 – lévulinique 17 – linoléique 92, 124 – linolénique 90, 92, 99, 124 – mévalonique 101 – mucique 35 – myristique 120 – nalidixique 316

– okadaïque 213 – oléique 124 – palmitique 120 – pectinique 30 – pectique 30 – phosphatidique 98 – phosphorique 98 – pimarique 105 – pyruvique 334 – rétinoïque 105 – rosmarinique 449 – sinapique 159 – stéarique 120 – sulfonique 35 – urique 304 – uronique 12, 18, 33, 35 – ω–3 267 – ω–6 267 acide aminé 55, 76, 366, 441 applications 58 caractérisation 76 fractionnement 74 production 59 propriétés 56 – indispensable 60 acide caféique-3-O-méthyltransférase 166 acide férulique estérase 29 acide gras 88, 202, 229 caractéristiques 91 isomères 90 nomenclature 90 point de fusion 93 principaux types 89 propriétés physico-chimiques 93 répartition 95 – essentiel (AGE) 92 – indispensable 120

554 – insaturé – polyinsaturé (AGPI) – saturé – substitué – ω-3 acide nucléique acide organique acidophile Acontium velutium acrylamide Actinidia deliciosa (kiwi) actinidine Actinomyces antibioticus actinomycine activateur du plasminogène additif alimentaire

89 90, 193 89 93 199 12 14, 364 424, 429-430 429 361, 375 358 358 317 311, 317 358 110, 186, 273, 290, 330, 337, 340, 364, 366 adénosine triphosphate (ATP) 13 ADN ligase 426 ADN polymérase 426 adriamycine 317 adsorption 235 Aeromonas 304 affinage 370 aflatoxine 307 Afrolicania elaeosperma 93 agar 186 agar-agar 277 extraction 187 importance économique 188 propriétés physico-chimiques 186 structure 186 utilisation 188 agarose 450 AGE (acide gras essentiel) 92 agent de texture 337 agent osmotique 451 aglycone 9 AGPI (acide gras polyinsaturé) 90 agrégation plaquettaire 120 ajonc (Ulex europaeus) 179 alanine 58, 366 albumine 241, 255 albumine sérique (sérumalbumine) 228, 256 alcalase 258 Alcaligenes 304 – faecalis 326 – latus 342 alcalinophile 424, 429-430

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE alcaloïde 450 alcool – cinnamylique 164 – coniférylique 157 – coumarylique 157 – sinapylique 157 alcool cinnamylique déshydrogénase (CAD) 164 aldose 10 Alexandrium minutum 213 alginate 183, 277 extraction 185 importance économique 185 propriétés physico-chimiques 184 structure 183 utilisation 185 alginate de calcium 450 algue 183 Alkaliphilus transvaalensis 429 Aloe vera 35 Alstonia 110 amandier (Prunus dulcis) 133 amidon 14, 36, 335 applications 38 composition 37 digestibilité 38 estérification 41 éthérification 41 hydrolyse 38, 40 liquéfaction 377 oxydation 41 propriétés 38 réticulation 41 saccharification 377 structure 37 transformation 377 – thermoplastique 42 aminoacylase 415 amphotéricine 317 amylase 66, 376, 378, 387 α-amylase 14, 38, 40 β-amylase 38 amyloglucosidase 14, 378 amylopectine 37, 38 amylose 37, 38 Ananas comosus (ananas) 358 anatoxine 216 Ancalomicrobium 432 androgenèse 437 Angiosperme 163

INDEX anguille électrique (Electrophorus electricus) 418 ansamycine 317 anthelminthique 194 Anthemis 110 anthocyanine 449 antibiotique 309 applications 314 classes 309 production 311 anticoagulant 194 anticorps 454 – monoclonal 236, 246, 454, 456 – polyclonal 454 antimétabolite 316 antimycine 316 antioxydant 445 antiprotéase 273 antithrombine (AT) 227 α-antitrypsine 227 aphérèse 230 arabinose 33, 35 Arachis hypogea (arachide) 121 Archaebactérie 425 ARN antisens 452 arôme 362 Artemia 199 Arthrospira 305 – maxima 305 – platensis 196 artichaut (Cynara scolymus) 42 Asclepias 110 Ascophyllum 183 asparaginase 401 aspartame 59, 367 aspartate β-décarboxylase 366 Aspergillus 167, 303, 307, 311, 373, 392 – flavus 307 – niger 40, 364, 371 – oryzae 307, 415 – parasiticus 307 astaxanthine 197 Astragalus gummifer 33 AT (antithrombine) 227 ATP (adénosine triphosphate) 13 aunée (Inula helenium) 42 Aureobasidium pullulans 327 auréomycine 310 aurovertine 316 autotrophie 203

555 auxine avénasténol avénine avidine Azotobacter – chroococcum – vinelandii

438 112 66 263, 271 342 342

B Bacillus 40, 44, 304, 311, 319, 425 – alcalophilus 423 – clausii 430 – megaterium 341 – subtilis 387, 399 – thermoproteolyticus 367 bacitracine 311, 317 bactérie 304 bagasse 16 banane (Musa sapientum) 58 barophile 427 base de Schiff 243 bassorine 33 bergamote (Citrus bergamia) 145 Beta vulgaris (betterave sucrière) 16 Bifidobacterium 374 biocapteur enzymatique 416 biorécepteur 418 caractéristiques 420 définition 417 domaines d’application 421 immobilisation de l’enzyme 420 transducteur 419 biocarburant 393 biocompatibilité 350 bioconversion 59, 363, 462 biodégradabilité 322, 329, 337 biodégradation 349 biodiesel 202, 209, 396 biodiversité 203 bioéthanol 202, 393 biogaz 204 biopolymère 323, 337, 341, 351 bioréacteur 345, 440, 446, 459 bioremédiation 431 biotransformation 145, 313, 457, 460 blanc d’œuf (composition) 262 blasticidine 318 bleu de toluidine 171 bois 24

556 – dur – raméal – tendre Botryocooccus braunii bradykinine brasserie Brassicacée Brassica napus (colza) brassicastérol Brevibacterium – flavum bromélaïne broméline Burkholderia cepacia butanol

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 28, 159 169 28, 159 205 227 383 95 121 113 307 365 358 258 396 17

C C4-H (cinnamate-4-hydroxylase) 159, 164 CAD (alcool cinnamylique déshydrogénase) 164 cadinène 103 caféol-CoA-3-O-méthyltransférase 166 calcineurine 317 callogenèse 438 callose 35 Calotropis 110 campestérol 112 canal ionique 71 Canavalia ensiformis 174 Candida tropicalis 303 canne à sucre (Saccharum officinarum) 16 canthaxanthine 197 caoutchouc 101, 110, 111 capsanthine 110 Capsicum annuum (paprika) 110 capsule 293, 321 carboxyméthylcellulose 27 cardon (Cynara cardunculus) 370 cardosine 370 carence 195 Carica papaya (papayer) 358 carmino vert 171 carotène 105, 107, 109 caroténoïde 101, 106, 194, 267 caroubier (Ceratonia siliqua) 34 carraghénane 188, 277, 451 extraction 190 importance économique 191 propriétés physico-chimiques 188 structure 188

utilisation cartilage caséinate caséine – acide – lactique – présure β-caséine κ-caséine catalase catécholamine Catharanthus roseus QFSWFODIF
EF
.BEBHBTDBS
Caulobacter CCR (cinnamoyl-CoA réductase) cellobiose cellophane cellulase celluloïd Cellulomonas – flavigena cellulose applications hydrolyse microfibrilles propriétés physico-chimiques structure acétates de – éthers de – nitrates de – xanthate de – céphaline céphalosporine Cephalosporium Ceratonia siliqua (caroubier) Céréale céride (cire) cétose Chaetoceros calcitrans champignon filamenteux chicorée (Cichorium intybus) chimiotype chitinase chitine applications désacétylation extraction hydrolyse chitobiose

191 276 253 253 253 253 252 252, 253 358 58  432 166 25 27 25, 388, 392 26 304, 392 326 24, 392 26 25 25 24 24 26 27 26 27 98 312, 317 311, 429 34 28, 65 97 10 199 303 42 151 19 18 19 19 19 18 18

INDEX chitosamine 18 chitosane 19 chloramphénicol 315 chlorolignine 166 Chlorophycée 206, 207 cholestérol 111, 113, 120, 229 cholestérolémie 120 choline 98 Chondrus crispus 188 chromatographie 234 – d’affinité 235, 245 – d’échange ionique 245 – en phase gazeuse (CPG) 136 – liquide basse pression (CLBP) 245 – liquide haute performance (CLHP) 136, 245 o
TVS
DPVDIF
NJODF
$$.
 chromophore 195 chromoprotéine 242 Chrysanthemum (chrysanthème) 103 chymosine 250, 358, 370 chymotrypsine 258 Cichorium intybus (chicorée) 42 cidre 32 ciguatoxine 213 cinnamate-4-hydroxylase (C4-H) 159, 164 cinnamoyl-CoA réductase (CCR) 166 cire (céride) 97 citrinine 307 citronellol 449 citrulline 58 Citrullus 110 Citrus 32 – bergamia (bergamote) 145 4CL (p-coumarate-coenzyme A ligase) 164 Claviceps 307 clone 448 Clostridium 319, 425 – butyricum 257 coacervation 287 coagulation (facteurs de) 222 Coccomyxa actinabiotis 430 Cochlospermum 33 Cocos nucifera (cocotier) 121 Cohn (fractionnement de) 231 Coleus blumei 449 collagène 227, 275 collodion 26 colza (Brassica napus) 121 complément alimentaire 194

557 complexe prothrombique composé aromatique conalbumine (ovotransferrine) concentrat conglycinine Conifère conservateur convertine Corynebacterium glutamicum cosmétique couenne Crepis foetida cryoprécipitation Cryphonectria parasitica Crypthecodinium cohnii Cucurbita culture cellulaire applications cellules animales culture continue ou en perfusion culture discontinue alimentée culture discontinue non-alimentée culture en milieu liquide culture primaire culture sur milieu solide cellules végétales conduite milieu de culture définition généralités cutine Cyamopsis tetragonolobus Cyanidium caldarium Cyanobactérie acides gras polyinsaturés (AGPI) métabolites toxines cyclodextrine applications complexation obtention solubilité cyclosérine cyclosporine cylindrospermopsine Cynara – cardunculus (cardon) – scolymus (artichaut) cyprosine

241 449 263, 271 67 67 24, 28 282 226 59, 364 399 277 94 235 370 199 110 437 452 440 446 446 446 440 440, 448 440 437 438 438 437 437 24 33 429 193, 305 198 193 212 43 46 45 44 47 309, 317 317 214 370 42 370

558 cystéine Cytisus scorparius (genêt) cytoculteur cytokinine

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 58, 59 58 446 438

D daptomycine daunomycine degré Bloom Deinococcus radiodurans délignification densitométrie dépollution dépolymérase dérivatisation désoxy-ose désoxyribose détergence dextrine dextrogyre diabète Diatomée diatoxanthine Diester Digitalis lanata (digitale laineuse) digitoxine digitoxose dihydroxyacétone Dinophysis dinophysistoxine diterpénoïde applications Dolichos biflorus DOPA dopamine Dunaliella – acidophila – salina

316 317 286 430 162 245 406 31 138 12, 13 12 387 38 11 244 206 107 130 462 462 13 12 213 213 105 105 179 58 58 429 195, 197

E ecdystéroïde 114 échange d’ions 234 édulcorant 14, 19, 367, 462 Elaeis guineensis (palmier à huile) 121 élastine 276 électrophorèse 245 Electrophorus electricus (anguille électrique) 418 élicitation 449 ELISA (dosage immuno-enzymatique) 404

embryogenèse 437 – somatique 438 – zygotique 438 &.)7
FTUFS
NÏUIZMJRVF
EIVJMFT
WÏHÏUBMFT
 émulsifiant 17 énantiomère 136 Endomycopsis filuliger 303 endo-polygalacturonase 31 enfleurage 147 enzyme 71, 355, 411 applications 359 – médicales 400 classification 356 généralités 355 nomenclature 356 obtention 358 outils analytiques 403 réglementation 407 spécificité 357 enzyme immobilisée 411 avantages 414 procédés d’immobilisation 411 érable à sucre (Acer saccharum) 16 ergotamine 307 érythromycine 310 érythrose-4-phosphate 12 Escherichia coli 59 estérification 385 ETBE (éthyl-tertio-butyl éther) 394 éthanol 14, 17 éthanolamine 98 éthylènediamine 286 éthylméthylcellulose 27 Eubactérie 425 Eucalyptus 154 Eugenia caryophyllata (giroflier) 151 Euglena gracilis 211 Euphorbia 110 – lagascae 95 exhausteur de goût 364 exo-polygalacturonase 31 explant 438 extraction 209, 346 extrêmophile 423 extrudeuse 281

F F5H (férulate-5-hydroxylase) facteur

166

INDEX – antinutritionnel 68, 69 – antitrypsique 66 – d’attachement 441, 444 – de croissance 444 facteur de la coagulation 222-228 – antihémophilique 237 – I (fibrinogène) 224 – III (thromboplastine) 226 – II (prothrombine) 226, 227 – IX (antihémophilique B) 226, 240 – VI (accélérine) 226 – VIII (antihémophilique A) 226 – VII (proconvertine) 226, 240 – von Willebrand (F vWa) 226, 241 – V (proaccélérine) 226 – XI (de Rosenthal) 227, 241 – XII ( de Hageman) 227 – XIII (transglutaminase) 225, 227, 241 – X (thrombokinase) 223, 226 farnésol 103 fénugrec (Trigonella foenum-graecum) 58 fermentation 322, 357-359, 364-366, 378-383, 388-398, 432 fermenteur 203, 306, 311, 324, 335 Ferroplasma acidarmanus 429 férulate-5-hydroxylase (F5H) 166 féruloyl estérase 170 Feuillu 24, 28, 160, 161 fève (Vicia faba) fibrine 224, 225, 227 fibrinogénase (thrombine) 226 fibrinogène (facteur I) 224, 239 fibrogénase (thrombine) 224 fibronectine 227 ficine 358 Ficus 110 – carica (figuier) 358 – cunia 174 filtration sur gel 234 Fisher (représentation de) 11 Flacourtiacée 94 flavoprotéine 271 flavoxanthine 109 fluconazole 317 fluorimètre 212 fosfomycine 309 fractionnement de Cohn 231 Fraxinus ornus (frêne) 20 froment (Triticum aestivum) 42

559 fructofuranosidase β-fructofuranosidase fructose 1,6-diphosphate fructose (isoglucose) hydrogénation métabolisme fucose Fucus fumarase furanose furfural Fusarium – heterosporum Fusidium

380 15 18 13, 14, 19, 40 20 43 33 183 365 11 29 307 106 311

G galactose Gallus domesticus (poule) Gambierdiscus toxicus gel gélatine de poisson Gelidium gélification gélule genêt (Cytisus scorparius) génie métabolique génine génomique géraniol gibbérelline Gigartina – mamillosa – stellata giroflier (Eugenia caryophyllata) gliadine globine globuline glucanase glucide analyse structurale chromatographie classification dosage extraction identification oxydation purification glucoamylase Gluconacetobacter xylinus

13, 33, 35 261 213 285 278, 290 186 288 293 58 451 9 52 103 106 188 188 151 66, 67 242 66, 228, 255, 269 391 9 50 50 9 49 48 49 9 49 40 323, 325

560 glucosamine glucose applications fermentation hydrogénation isomérisation propriétés stéréoisomères structure glucose isomérase glucose oxydase glucosidase α-glucosidase glucoside glucosinolate glutamine gluten gluténine glycane glycation glycémie glycéraldéhyde glycéride glycérine glycérol glycérophospholipide glycine Glycine hispida (soja) glycinine glycoconjugué glycogène glycolipide glycome glycomique glycoprotéomique glycoside glycosylation gomme applications structure – arabique (ou d'acacia) – de guar – karaya – tragacanthe gossypol Gracilaria gramicidine Graminée grande ortie (Urtica dioïca)

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 18 13, 19, 20, 35, 345, 377 14 14 20 14, 40 13 14 13 14, 40, 378 373 38 15 13 130 58 67 66, 67 53 243 243 12 95 17 98 97 58, 283 121 67 51 19 100, 200 51 51 52 9 243, 461 34 32 28, 33, 287 33 33 33 104 188 311 28, 161 174

griseofulvine groupe prosthétique guaiacyle gui (Viscum album) gutta-percha Gymnosperme gynogenèse

317 242 163 175 110 163 438

H Haematococcus pluvialis 197 halophile 424, 428-429 haricot vert (Phaseolus vulgaris) 175, 176 Helianthus – annuus (tournesol) 121 – tuberosus (topinambour) 42 Helminthosporium 311 hème 242 hémicellulase 167, 389 hémicellulose 27 applications 29 hydrolyse 27, 29 propriétés 27 structure 27 hémoglobine glyquée 243 héparine 227 heptulose 12 hétéroside 9, 13 – cardiotonique 13 hétérotrophie 193, 203 Hevea brasiliensis 110 hexose 12 hexulose 12 High Fructose Corn Syrup (HFCS) 378 histidine 58, 59, 60 holoside 9 hordéine 66 hormone 444 huile modification 384 raffinage 383 huile essentielle 141 composition 142 contrôle 152 définition 141 entraînement à la vapeur d’eau 148 expression 149 extraction par CO2 à l’état supercritique 150 extraction par solvant 149

INDEX facteurs affectant la composition et le rendement 150 génie métabolique 152 hydrodistillation 148 localisation 141 méthodes d’étude 152 obtention 147 propriétés – biologiques et pharmacologiques 144 – physico-chimiques 142 répartition 141 utilisations 145 huile végétale 121 altération 124 applications – alimentaires et industrielles 128 – pharmaceutiques et cosmétiques 133 décirage 123 décoloration 123 dégommage 122 démucilagination 122 désodorisation 123 fractionnement 125 hydrogénation 126 interestérification 126 obtention 121 oxydation 124 raffinage 121 rancissement 125, 126 saponification 127 transestérification 127 transformation 125 – d’amande douce 133 – d’arachide 129 – d’arganier 133 – d’avocat 133 – de cacao 133 – de chènevis 131 – de coco 129 – de colza 128, 130, 132 – de coprah 128, 129, 132 – de germe de maïs 133 – de karité 133 – de lin 128, 131, 133 – de maïs 129, 130 – de noisette 133 – de noix 131 – de palme 129 – de palmiste 128, 129, 132

561 – de pépins de raisin – de ricin – de sésame – de soja – de tournesol – d’œillette – d’olive – siccative humulène hybridome hydrocolloïde hydrogénation hydrolase hydrolysat hydrolyse 20-hydroxyecdysone hydroxyméthylfurfural hydroxypropylcellulose hydroxypropylméthylcellulose hyperthermophile hyperuricémie Hyphomicrobium

129 128, 132, 133 133 128, 129, 130, 133 129, 131, 132, 133 131 129 131 103 454, 455 337 386 282 68 280, 284 114 14 27 27 424-426 304 432

I if (Taxus brevifolia) iminoacide immobilisation des cellules immortalisation des cellules immunogénicité immunoglobuline (Ig) indice – d’acide – d’anisidine – de peroxyde – de saponification – d’iode industrie papetière inhibiteur inositol applications insaponifiable insuline interestérification Inula helenium (aunée) inuline applications hydrolyse sources structure

459 283 450 448 401 228, 241, 255 134 135 134 135 135 162, 388 356 21, 98 22 135 59 96, 386 42 42 43 43 42 42

562 invertase Iridaea cordata Isochrysis galbana isoenzyme isoglucose (fructose) isolat isoprène (2-méthyl-1,3-butadiène) isoprénoïde

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 15 188 199 355 40 68 101 101

J jaune d’œuf (composition)

264

K kallicréine kératinase kétoconazole kétolide kinogène kiwi (Actinia deliciosa) Kluyveromyces

227 399 317 315 227 358 374

L Labrys 432 laccase 358, 389, 398 α-lactalbumine (α-La) 255 Lactobacillus 304, 331 – lactis 319 lactoferrine (Lf) 256 β-lactoglobuline (β-Lg) 255 lactopéroxidase 372 lactose 250, 259, 335, 373 lactosérum 249, 250 fractionnement 250 obtention 249 poudres de – 251 produits commerciaux 258 traitement 249 lait 249 Laminaria 183 lécithine 98, 269, 273 lectine 66, 173 action sur la synthèse protéique 176 activité entomotoxique 176 agglutination des érythrocytes 174 défense des plantes 177 définition 173 distribution 173 effet antinutritionnel et toxique 175 interactions plantes/micro-organismes 177

localisation 174 lymphostimulation 176 propriétés 174 purification 178 rôles physiologiques 174 structure 174 toxicité 174 utilisations 178 Légumineuse 65, 66, 358 Lens culinaris (lentille) 175 leucine 59 Leuconostoc mesenteroides 331 lévogyre 11 levure 303 Lf (lactoferrine) 256 liaison hydrogène 289 liaison hydrophobe 285 Licania rigida 93 lignée cellulaire 448 – hyper-productrice 448 lignine 24, 25, 157 biosynthèse 157 bromure d’acétyle 172 dégradation microbiologique 161 détermination structurale 172 dosage 171 élimination 323 extraction 161 généralités 157 génie génétique 163 importance économique 161 NÏUIPEF
EF
,MBTPO
 méthodes d’étude 171 propriétés 159 structure 159 thioacidolyse 172 – industrielle 160 o
,SBGU
 – native 160 – organosolve 160 – stake 161 lignosulfonate 160 limonène 102, 103 linoxine 131 lipase 358, 386, 387, 390, 396, 397, 399, 401, 407 lipide 87 classification 87 définition 87 identification 136

INDEX

563

importance médicale 120 importance nutritionnelle et métabolique 118 méthodes d’étude 133 – insaponifiable 88 – plasmatique 229 – saponifiable 88 séparation 136 lipidomique 137 lipochimie 120, 383 lipoprotéine 257, 268 lipovitellenine 264 lipovitelline 264, 269 lipoxygénase 66, 358, 376 liqueur noire 162 Listeria 319 livetine 264, 269 Lotus tetragonolobus 179 lutéine 107, 274 lycopène 107 lymphocyte 454 lysine 58, 59 lysozyme 257, 263, 271, 358, 372 lysyloxydase 275

M Macrocystis macrolide maïs (Zea mays) Mallotus japonica maltodextrine mannane mannitol applications épimérisation mannose margarine .ÊVMF
SÏBDUJPO
EF
NÏEJDBNFOU
EÏSJWÏ
EV
TBOH
.%4
mélasse Mentha – arvensis (menthe des champs) – piperata (menthe poivrée) menthol mésophile métabolisme – primaire – secondaire métabolite métabolite secondaire

183 315 42 462 40 28 20 20 20 13, 33, 35 126, 386   16 153 153 102, 103 425 450 449 194 457

rendement métallophile métal lourd méthanolyse Methanopyrus kandleri méthionine 2-méthyl-1,3-butadiène (isoprène) 2-C-méthyl-D-érythritol-4-phosphate méthylcellulose β-méthyldigitoxine β-méthyldigoxine microalgue acides gras polyinsaturés biocarburants colorants culture généralités isotopes métabolites pigments polysaccharides stérols toxines microalgue-fourrage microcystine microencapsulation microfibrille microscopie électronique mixotrophie modification post-traductionnelle moisissure monoglutamate de sodium monolignol monosaccharide Monostroma fuscum monoterpénoïde mucilage applications hydrolyse sources structure Mucor miehei Musa sapientum (banane) mycotoxine myrcène

457 424, 431 431 131 425 58, 59 101 101 27 462 462 193 198 202 194 193 193 211 193 194 211 201 212 193 215 294 324 276 193, 203 52, 242 304 58 157, 164 9 58 102 33, 34 35 35 35 34 371 58 307 102, 103

N Nannochloropsis napine

199 67

564 néomycine nérol neurotoxine neutrase nikkomycine nisine nitrocellulose nodularine nonulose nutraceutique nystatine

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 310 449 214 258 318 309, 318 26 215 12 208 317

O ochratoxine octulose Odontella aurita Olea europaea (olivier) œuf composition valeur nutritionnelle oléagineux oligo-élément oligomycine oligophile oligotrophe 0NÏUIZM
USBOTGÏSBTF
0.5
oncogène organogenèse ornithine Oryza sativa (riz) os ose configuration – aminé oside osséine ovalbumine ovocystatine ovoflavoprotéine ovoglobuline ovoinhibiteur ovomacroglobuline (ovostatine) ovomucine ovomucoïde ovoproduit propriétés fonctionnelles utilisations ovostatine (ovomacroglobuline) ovotransferrine (conalbumine)

307 12 199 121 261 262 266 65 441 316 424, 432 424  448 438 58 42 276 9, 10 11 12 9 278 263, 269, 271 273 263 263 273 263, 273 263, 269, 271 263, 273 261 267 269 263, 273 263, 271

P paclitaxel 459 culture cellulaire 459 hémisynthèse 459 palmier à huile (Elaeis guineensis) 121 PAL (phénylalanine ammonia-lyase) 159, 164 pancréatine 258 papaïne 258, 358 papayer (Carica papaya) 358 paprika (Capsicum annuum) 110 paroi cellulaire 23, 168 pâte à papier 162, 164, 166 blanchiment 389 blanchiment chimique 166 blanchiment enzymatique 167 p-coumarate-coenzyme A ligase (4CL) 164 PC (phosphatidylcholine) 98, 273 PCR (Polymerase Chain Reaction) 405 peau 276 pectinase 381 pectine 29, 277 applications 32 extraction 32 gel 30 propriétés 29 sources 32 structure 29 pectine-lyase 31 pectinestérase 31 pénicilline 310, 312, 313, 317 Penicillium 311 – chrysogenum 314 – citrinum 307 – roqueforti 371 pentosane 28 pentose 12 pentulose 12 PE (phosphatidyléthanolamine) 98 pepsine 250, 258, 358, 370 Perilla frutescens 449 perméabilisation des membranes 451 peroxydase 159, 389 QFSWFODIF
EF
.BEBHBTDBS
Catharanthus roseus) 450 pesticide 146 petit pois (Pisum sativum) 175 Phaeodactylum tricornutum 199 Phanerochaete chrysosporium 168 phase exponentielle 345 Phaseolus vulgaris (haricot vert) 175, 176

INDEX phénylalanine 59, 449 phénylalanine ammonia-lyase (PAL) 159, 164 phénylpropane 157 phloroglucine 171 phosphatidylcholine (PC) 98, 273 phosphatidyléthanolamine (PE) 98 phosphatidylinositol (PI) 98 phosphinothricine 318 phosphocaséinate de calcium 252 phospholipase 99, 122, 384 phospholipide 97, 200, 229, 269 phosvitine 264, 273 photoautotrophe 193 photobioréacteur 195 phycobiliprotéine 195 phycocyanine 195 phycoérythrine 195 phytase 22, 391 phytate 390 phytine 22 phytoalexine 309 phytoecdystéroïde 114 phytol 101, 105 phytostanol 113 phytostérol 111, 112, 113 Pichia pastoris 303 Picrophilus 429 piézophile 424, 427-428 pinène 102, 103, 449 PI (phosphatidylinositol) 98 pissenlit (Taraxacum officinale) 42 Pisum sativum (petit pois) 175 plasma 221 composition 221 cryoprécipitation 232, 235 fractionnement 231 précipitation 232, 235 plasmaphérèse 230 plasmine 227 plasminogène 227 Plumeria 110 point isoélectrique 284 polyester 322 polygalacturonase 31 Polymerase Chain Reaction (PCR) 405 polymère 334, 350 polyméthylgalacturonase 31 polymyxine B 310 polyol 12, 19

565 hydrogénation 19 polypeptide 283 polysaccharide 23 exopolysaccharide (EPS) 321, 323 – microbien 321 polyterpénoïde 110 pomme de terre (Solanum tuberosum) 42 pommier (Pyrus malus) 32 Populus tremuloides 164 Porphyridium 196 – cruentum 199 POU (protéines d’organismes unicellulaires) 301 poule (Gallus domesticus) 261 pouvoir filmogène 288 précurseur 449 prékallikréine 227 pression oncotique 222 présure 370 proaccélérine (facteur V) 226 proconvertine (facteur VII) 226 prolamine 66 prolifération 212 Prosthecomicrobium 432 protéagineux 65 protéase 387, 397 protéine 61 applications 66 caractérisation 76, 78 définitions 61 dénaturation 62 détermination de la structure 78 digestibilité 68 diversité 63 dosage 79 extraction 71 fonctions biologiques 63 modifications post-traductionnelles 62 précipitation 74 purification 74 séparation 74, 78 structure 61 techniques chromatographiques 75 – de réserve 65 – de transport 444 – du lait 251 – globulaire 65 – insoluble 63 – membranaire 70 – plasmatique 222

566 – sérique 254 – soluble 63, 70 – végétale 68 protéine C 226, 227 protéine d'organismes unicellulaires (POU) 301 extraction 306 traitement 306 protéine S 228 protéomique 52, 81-84 prothrombine (facteur II) 226, 227 protide 55 protopectinase 31 protoplaste 405 Prunus dulcis (amandier) 133 Pseudomonas 304, 311 – dacunhae 366 – oleovorans 344 Pseudo-nitzschia 214 psychrophile 424-427 psychrozyme 427 ptéridine synthétase 316 pullulanase 329, 378 Pullularia pullulans 327 Pycnoporus cinnabarinus 364 pyranose 11 Pyrococcus furiosus 425, 431 Pyrolobus fumarii 425 Pyrus malus (pommier) 32

R radiophile 424, 430-431 Ralstonia – eutropha 342 – metallidurans 344, 431 rayonne 26, 27 réacteur enzymatique 415 – à acides aminés 415 – à lactose 416 SÏBDUJPO
EF
.ÊVMF
 rebeccamycine 317 récepteur des hormones 71 recombinaison génétique 236 résine 33 Résineux 24, 160, 161 SÏTPOBODF
NBHOÏUJRVF
OVDMÏBJSF
3./
 rétinoïde 400 rhamnose 13, 33, 35 rhizogenèse 438 Rhizomucor miehei 370, 386

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE Rhizopus rhodaxanthine Rhodobacter sphaeroides ribonucléase A ribose rifampicine Rilsan riz (Oryza sativa) RuBisCO ruminant rutamycine

303 107 342 307 12 310, 316 132 42 63 25 316

S saccharide 9 saccharose 14, 19, 59, 335, 380 applications 16 cristallisation 16 extraction 16 fermentation 17 hydrolyse 15, 380 pouvoir rotatoire 15 propriétés 15 raffinage 16, 380 rendement 16 solubilité 15 structure 15 Saccharum officinarum (canne à sucre) 16 Salvia officinalis (sauge officinale) 449 sang 221 constituants 221 fonctions 221 valorisation 230 santonine 103 saxitoxine 213 Scenedesmus obliquus 101 Schiff (base de) 243 Schizochytrium 200 Schwanniomyces 303 sécaline 66 sélénocystéine 58 sénescence cellulaire 448 sérine 59, 98 sérum 221 sérumalbumine (albumine sérique) 228 sérum de veau 441 sesquiterpénoïde 103 sigmastérol 112 sitostérol 112, 113 soja (Glycine hispida) 121

INDEX Solanum – dubium 370 – tuberosum (pomme de terre) 42 sorbitol 19, 41, 42 applications 19 Sorbus aucuparia 19 spectinomycine 315 spectrométrie o
EF
NBTTF
4.
 – infrarouge à transformée de Fourier 136 spectroscopie o
EF
SÏTPOBODF
NBHOÏUJRVF
OVDMÏBJSF
3./
 – infrarouge (IR) 172 spermidine 286 spermine 286 sphingolipide 100 sphingosine 100 Spirulina maxima 196, 197, 305 squalène 101 Staphylococcus 307 Stella 432 Sterculia 33 – foetida 94 stéride 97 stéroïde 111 applications 113 propriétés biologiques 113 structure 111 stérol 113 Stevia rebaudiana 368, 462 stéviobioside 462 stévioside 368 stigmasténol 112 Streptococcus 319, 331 Streptomyces 14 – avidinii 272 – griseus 310 – hygroscopicus 310 – viridosporus 168 streptomycine 310 subérine 24 subtilisine 311, 387, 392 sucre inverti 17, 331, 380 sucroglycéride 17 sulfate d’aniline 171 Sulfolobus solfataricus 423, 425 supplémentation 200 synergie 337 synthèse organique 359

567 syringyle

163

T TAL (tyrosine ammonia-lyase) 159 Tamarindus indica (tamarin) 34 Taq polymérase 405 Taraxacum 110 – officinale (pissenlit) 42 taxol 449, 460 Taxus – brevifolia (if du Pacifique) 459 – cuspidata (if du Japon) 449 télomérase 448 tendon 276 terpène 102 terpénoïde 102 terramycine 310 tétracycline 310 tétraterpénoïde 106 tétrose 12 Thermococcus litoralis 425, 431 thermolysine 367 thermophile 424-426 Thermophilus 425 Thermoproteus 425 thermoréversible 291 thermozyme 425 Thermus 424-426 – aquaticus 405, 425 – thermophilus 424, 426 thréonine 59 thrombine (fibrogénase) 224, 226, 227 thrombokinase (facteur X) 223, 226 thromboplastine (facteur III) 226 Thymus vulgaris (thym) 151 tissu conjonctif 275 tocophérol 115, 116, 118 tocotriénol 117 topinambour (Helianthus tuberosus) 42 totipotence 438 tournesol (Helianthus annuus) 121 tragacanthine 33 transestérification 385 transglutaminase (facteur XIIIa) 225, 227 transporteur 71 Trichoderma 303, 392 trichothecène 307 triglycéride 89, 96, 200, 229 Trigonella foenum-graecum (fénugrec) 58

568 triose triterpénoïde Triticum aestivum (froment) tropocollagène trypsine tryptophane turbidité tyrocidine tyrosine tyrosine ammonia-lyase (TAL)

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE 12 106 42 275 258, 358 59 287 311 59 159

U Ulex europaeus (ajonc) uréase uricase Urtica dioïca (grande ortie)

266, 441 115, 135 22 41 116, 135 116, 135 
 115, 135 264, 265 264

X 179 66 304 174

V valine valinomycine vancomycine Vanilla planifolia (vanillier) vanilline Vernonia galamensis vesou Vicia faba (fève) viciline Vigna radiata violaxanthine viscose viscosité Viscum album (gui)

vitamine –A – B8 – C (acide ascorbique) –D –E o
,
– liposoluble vitellenine vitelline

59 316 310, 317 170, 363, 449 170, 363, 449 95 16 175, 178 66 178 107 27 285, 336, 347 175

xanthane milieu de culture Xanthomonas campestris xanthophylle Xeromyces bisporus xérophile xylanase xylane xylitol applications xylose hydrogénation

334-338 335 334, 364 106, 110, 194 432 424, 432 29, 167, 378, 389, 391 28 21 21 33, 35 21

Z Zea mays (maïs) zéaralanone zéaxanthine zéine Zygosaccharomyces rouxii zymogène

42 307 107, 274 66 20 222

TABLE DES MATIÈRES Préface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V Avant-propos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII Sommaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XIII Abréviations, symboles et acronymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Partie I - Substances d'origine végétale 1 - Les glucides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.2. Classification structurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3. Oses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.4. Diholosides ou disaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.5. Dérivés glucidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.6. Polysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.7. Glucides des parois . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.7.1. Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.7.2. Hémicelluloses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.7.3. Pectines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.7.3.1. Structure et propriétés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.7.3.2. Enzymes pectiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.7.4. Gommes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 
.VDJMBHFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 1.7.6. Callose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.8. Glucides de réserve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.8.1. Amidon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.8.1.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.8.1.2. Structure et composition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 1.8.1.3. Propriétés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 1.8.2. Inuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 1.9. Cyclodextrines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 1.9.1. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 1.9.2. Obtention . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 1.9.3. Formation du complexe d’inclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 
.ÏUIPEFT
EBOBMZTF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 1.10.1. Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 1.10.2. Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 1.10.3. Identification et dosage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 1.10.4. Analyse structurale des polysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 1.10.5. Glycomique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

570

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

2 - Les protides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.2. Acides aminés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.2.1. Propriétés générales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.2.2. Acides aminés indispensables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.3. Protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.3.1. Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.3.2. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 
.PEJöDBUJPOT
QPTUUSBEVDUJPOOFMMFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 2.3.4. Dénaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 2.3.5. Diversité et fonctions biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 2.3.5.1. Protéines de réserve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 2.3.5.2. Protéines membranaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF
EFT
QSPUJEFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 2.4.1. Extraction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 2.4.1.1. Etat de la protéine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 
.ÏUIPEFT
EFYUSBDUJPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 2.4.2. Séparation et purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 2.4.2.1. Acides aminés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 2.4.2.2. Protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 2.4.3. Caractérisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 2.4.3.1. Acides aminés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 2.4.3.2. Protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2.4.4. Dosage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 2.4.4.1. Dosage titrimétrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 2.4.4.2. Dosages colorimétriques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 
.ÏUIPEFT
TQFDUSPQIPUPNÏUSJRVFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 2.4.5. Protéomique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 3 - Les lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.1. Définition, généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.2. Classification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.3. Lipides simples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.3.1. Acides gras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.3.1.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.3.1.2. Principaux types . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.3.1.3. Nomenclature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 3.3.1.4. Acides gras essentiels (AGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 3.3.1.5. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.3.1.6. Acides gras substitués . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.3.1.7. Répartition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.3.2. Glycérides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.3.3. Stérides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.3.4. Cérides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.4. Lipides complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 3.4.1. Phospholipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.4.1.1. Glycérophospholipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 3.4.1.2. Sphingolipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 3.4.2. Glycolipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

TABLE DES MATIÈRES

571

3.5. Isoprénoïdes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 3.5.1. Terpénoïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 
.POPUFSQÏOPÕEFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 3.5.1.2. Sesquiterpénoïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 3.5.1.3. Diterpénoïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 3.5.1.4. Triterpénoïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.5.1.5. Tétraterpénoïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.5.1.6. Polyterpénoïdes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 3.5.2. Stéroïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 3.5.2.1. Structure générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 3.5.2.2. Phytostérols et phytostanols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 3.5.2.3. Ecdystéroïdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 3.5.3. Vitamines liposolubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 3.6. Importance nutritionnelle et métabolique des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 3.7. Importance médicale des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 3.8. Lipochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 3.8.1. Obtention des huiles végétales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 3.8.2. Facteurs favorisant l’altération des huiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 3.8.3. Traitements de transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 3.8.3.1. Fractionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 3.8.3.2. Hydrogénation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 3.8.3.3. Interestérification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 3.8.3.4. Transestérification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 3.8.3.5. Saponification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 3.9.1. Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 
.ÏUIPEFT
BOBMZUJRVFT
HÏOÏSBMFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 
.ÏUIPEFT
DIJNJRVFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 
.ÏUIPEFT
QIZTJRVFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 3.9.3. Séparation et identification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 3.9.4. Lipidomique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 4 - Les huiles essentielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 4.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 4.2. Répartition, localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 4.3. Composition et propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 4.4. Propriétés biologiques et pharmacologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 
.PEFT
EPCUFOUJPO
EFT
IVJMFT
FTTFOUJFMMFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 4.5.1. Huiles essentielles obtenues par entraînement à la vapeur d’eau . . . . . . . . . . . . . . . 148 4.5.2. Hydrodistillation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 4.5.3. Huiles essentielles obtenues par expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 4.5.4. Autres méthodes d’extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 4.5.4.1. Extraction par solvant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 4.5.4.2. Extraction par CO2 à l’état supercritique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 4.6. Facteurs affectant la composition et le rendement des huiles essentielles . . . . . . . . . . 150 4.7. Génie métabolique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 4.8. Contrôle des huiles essentielles et méthodes d’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 5 - Les lignines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 5.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

572

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

5.2. Biosynthèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 5.3. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 5.4. Propriétés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 5.5. Importance économique des lignines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 5.5.1. Industrie papetière . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 5.5.1.1. Amélioration des espèces forestières . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 5.5.1.2. Travaux de génie génétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 5.5.1.3. Blanchiment chimique et biologique de la pâte à papier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 5.5.2. Alimentation animale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 5.5.3. Amendement du sol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 5.5.4. Culture des champignons comestibles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 5.5.5. Synthèse de produits chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 5.5.6. Autres utilisations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 
.ÏUIPEFT
EÏUVEF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 
.ÏUIPEFT
IJTUPDIJNJRVFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 5.6.2. Dosage quantitatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 
.ÏUIPEF
EF
,MBTPO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 
.ÏUIPEF
BV
CSPNVSF
EBDÏUZMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 5.6.3. Détermination structurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 6 - Les lectines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 6.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 6.2. Distribution et localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 6.3. Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 6.4. Propriétés, rôles physiologiques et toxicité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 6.4.1. Agglutination des érythrocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 6.4.2. Effet antinutritionnel et toxique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 6.4.3. Activité entomotoxique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 6.4.4. Action sur la synthèse protéique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 6.4.5. Lymphostimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 6.4.6. Interactions plantes/micro-organismes et défense des plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 6.5. Purification des lectines et utilisations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

Partie II - Substances issues des algues 7 - Les polysaccharides des parois des algues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 7.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 7.2. Alginates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 7.2.1. Structure et propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 7.2.2. Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 7.3. Agars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 7.3.1. Structure et propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 7.3.2. Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 7.4. Carraghénanes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 7.4.1. Structure et propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 7.4.2. Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 8 - Les métabolites des microalgues et des Cyanobactéries. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 8.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 8.2. Pigments et colorants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 8.3. Acides gras polyinsaturés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198

TABLE DES MATIÈRES

573

8.4. Stérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 8.5. Production de biocarburants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 8.5.1. Avantages de la culture des microalgues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 
.PEFT
EF
QSPEVDUJPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 8.5.3. Principales voies de production d’energie à partir de la biomasse microalgale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 
.ÏUIBOJTBUJPO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 8.5.3.2. Production de biodiesel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 8.5.3.3. Production de bioéthanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 8.5.4. Défis à relever . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 8.6. Production des polysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 8.7. Isotopes biochimiques stables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 8.8. Toxines des microalgues et des Cyanobactéries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212

Partie III - Substances d'origine animale 9 - Les produits sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.1. Constituants du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.2. Fonctions du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.3. Composition du plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.3.1. Facteurs de la coagulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 9.3.2. Autres constituants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 9.4. Valorisation des produits sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 9.4.1. Fractionnement du plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 
.ÏUIPEFT
EF
QVSJöDBUJPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 9.4.2.1. Techniques de chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 9.4.2.2. Précipitation par les polyéthylènes glycols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 9.4.2.3. Ultrafiltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 9.4.2.4. Avantages et inconvénients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 
1SPEVDUJPO
EFT
NÏEJDBNFOUT
EPSJHJOF
TBOHVJOF
.%4
SFDPNCJOÏT . . . . . . . . . . . 236 9.4.3.1. Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236 
"WBOUBHFT
FU
JODPOWÏOJFOUT
EFT
.%4
SFDPNCJOÏT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 9.4.4. Obtention des médicaments dérivés du sang et leur utilisation en thérapeutique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 9.5. L'hémoglobine en biochimie médicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242 9.5.1. Hémoglobine glyquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243 
.ÏUIPEFT
EF
EPTBHF
EF
MIÏNPHMPCJOF
HMZRVÏF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 10 - Les produits laitiers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 10.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 10.2. Obtention et traitement du lactosérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 10.3. Fractionnement et utilisation du lactosérum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250 10.4. Protéines du lait . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 10.4.1. Protéines non-solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 10.4.1.1. Phosphocaséinate de calcium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 10.4.1.2. β-caséine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 10.4.1.3. κ-caséine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 10.4.1.4. Caséine acide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 10.4.1.5. Caséinates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 10.4.1.6. Caséine lactique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 10.4.1.7. Caséine présure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253

574

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

10.4.2. Protéines solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 10.4.2.1. β-lactoglobuline (β-Lg) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 10.4.2.2. Immunoglobulines (Ig) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 10.4.2.3. α-lactalbumine (α-La) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 10.4.2.4. Albumine sérique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 10.4.2.5. Lactoferrine (Lf) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 10.4.2.6. Lipoprotéine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 10.4.2.7. Lysozyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 10.4.3. Produits commerciaux à base de protéines du lactosérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 10.5. Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259 11 - Les ovoproduits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 11.1. Généralités. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 11.2. Structure et composition des œufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 11.2.1. Œufs entiers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 11.2.2. Composition du blanc d’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 11.2.3. Composition du jaune d’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264 11.3. Valeur nutritionnelle de l’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 11.3.1. Valeur biologique des protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 11.3.2. Digestibilité des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 
.JOÏSBVY
FU
WJUBNJOFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 11.4. Propriétés fonctionnelles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 11.4.1. Propriétés aromatiques et colorantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 11.4.2. Coagulation et gélification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 11.4.3. Propriétés émulsifiantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 11.4.4. Propriétés moussantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 11.4.5. Autres propriétés fonctionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 11.5. Utilisations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 11.5.1. Utilisation des ovoproduits comme ingrédients alimentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 
.PMÏDVMFT
CJPBDUJWFT
EJOUÏSÐU
UFDIOPMPHJRVF
FU
QIBSNBDFVUJRVF . . . . . . . . . . . . . 270 11.5.2.1. Séparation et fractionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 11.5.2.2. Extraits du blanc d’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 11.5.2.3. Extraits du jaune d’œuf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 12 - La gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 12.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 
.BUJÒSFT
QSFNJÒSFT
VUJMJTÏFT
QPVS
MB
QSPEVDUJPO
EF
MB
HÏMBUJOF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 12.3. Procédés de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 12.3.1. Traitements prélimiaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 12.3.2. Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 12.3.2.1. Hydrolyse alcaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 12.3.2.2. Hydrolyse acide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 12.3.2.3. Hydrolyse enzymatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 12.4. Nature protéique de la gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 12.5. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 12.5.1. Solubilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 12.5.2. Propriétés amphotères . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 12.5.3. Viscosité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 12.5.4. Force du gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 12.5.5. Dérivés chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286

TABLE DES MATIÈRES

575

12.5.6. Action protective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 12.5.7. Coacervation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 12.5.8. Couleur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 12.5.9. Turbidité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 12.5.10. Cendres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 12.6. Propriétés fonctionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 12.6.1. Gélification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 12.6.2. Emulsification et formation de mousse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 12.6.3. Pouvoir filmogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 12.7. Statut réglementaire et sécurité alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 12.8. Avenir de la gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 12.9. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297

Partie IV - Substances d'origine microbienne 13 - Les protéines d'organismes unicellulaires (POU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 13.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 
.JDSPPSHBOJTNFT
QSPEVDUFVST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302 13.2.1. Levures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 13.2.2. Champignons filamenteux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 13.2.3. Bactéries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 13.2.4. Cyanobactéries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305 13.3. Substrats de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305 13.4. Extraction et traitement des protéines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 14 - Les antibiotiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 14.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 14.2. Classes d’antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 
.JDSPPSHBOJTNFT
QSPEVDUFVST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310 14.4. Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311 14.4.1. Extraction et purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312 14.4.1.1. Séparation solide-liquide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312 14.4.1.2. Extraction à partir du milieu liquide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312 14.4.1.3. Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 14.4.2. Biotransformations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 14.5. Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314 14.5.1. Biochimie et biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314 
.ÏEFDJOF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317 14.5.3. Agro-alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 15 - Les polymères microbiens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321 15.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321 15.2. Homopolysaccharides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 15.2.1. β-D-glucanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 15.2.1.1. Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 15.2.1.2. Curdlane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326 15.2.2. α-D-glucanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327 15.2.2.1. Pullulane. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327 15.2.2.2. Dextrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330 15.3. Hétéropolysaccharides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 15.3.1. Xanthane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334

576

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

15.3.1.1. Structure et composition chimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 15.3.1.2. Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335 15.3.1.3. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336 15.3.2. Gellane et polymères apparentés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339 15.3.2.1. Structure et composition chimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339 15.3.2.2. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339 15.3.2.3. Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 15.4. Polyesters bacteriens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341 15.4.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341 15.4.2. Historique des polyhydroxyalcanoates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341 15.4.3. Structure et composition chimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 15.4.4. Biosynthèse des PHA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 15.4.5. Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345 15.4.5.1. Substrats pour la production des PHA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 15.4.5.2. Extraction et purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 15.4.5.3. Propriétés physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 15.5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352

Partie V - Enzymologie appliquée 16 - Les enzymes en industrie et en médecine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 16.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 16.2. Obtention des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 16.3. Applications et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 16.3.1. Synthèse organique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 16.3.1.1. Résolution de mélanges racémiques et synthèse d’énantiomères . . . . . . . . . . 361 16.3.1.2. Synthèse de l’acrylamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361 16.3.1.3. Synthèse des composés responsables du goût et des arômes. . . . . . . . . . . . . . 362 16.3.1.4. Synthèse des exhausteurs de goût . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364 16.3.1.5. Synthèse enzymatique des acides organiques et des acides aminés. . . . . . . . 364 
²dulcorants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 16.3.2. Transformation des produits agro-alimentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368 16.3.2.1. Utilisation des enzymes dans l’industrie laitière . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370 16.3.2.2. Réduction de l’acrylamide dans les aliments préparés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375 16.3.3. Panification et biscuiterie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 376 16.3.4. Préparation des sucres alimentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 16.3.4.1. Glucoserie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 16.3.4.2. Raffinage et transformation du saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 16.3.5. Préparation des boissons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381 16.3.5.1. Jus de fruits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381 16.3.5.2. Brasserie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 16.3.6. Enzymes en lipochimie et détergence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 16.3.6.1. Lipochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 16.3.6.2. Détergence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 16.3.7. Utilisation des enzymes en industrie du papier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 388 16.3.7.1. Peroxydases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 16.3.7.2. Laccases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 16.3.7.3. Xylanases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 16.3.7.4. Lipases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 16.3.8. Utilisation des enzymes en alimentation animale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390

TABLE DES MATIÈRES

577

16.3.9. Valorisation des sous-produits agro-alimentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392 16.3.9.1. Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392 16.3.9.2. Production de biocarburants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393 16.3.10. Traitement de la viande et du poisson . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397 16.3.11. Industrie du textile et du cuir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 398 16.3.12. Produits cosmétiques et parfums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399 16.3.13. Applications médicales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 16.3.14. Les enzymes comme outils analytiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403 16.3.15. Isolement des protoplastes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 16.3.16. Dépollution et traitement des eaux usées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406 16.3.17. Enzymes et réglementation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407 17 - Les enzymes immobilisées et leurs intérêts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411 17.1. Procédés d’immobilisation des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411 17.2. Avantages des enzymes immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414 17.3. Réacteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 17.3.1. Réacteur à acides aminés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 17.3.2. Réacteur à lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 17.4. Biocapteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 17.4.1. Définition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417 17.4.2. Biorécepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418 17.4.3. Transducteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 17.4.3.1. Transducteurs électrochimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 17.4.3.2. Transducteurs thermiques ou calorimétriques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 17.4.3.3. Transducteurs optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 17.4.4. Caractéristiques des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 17.4.5. Immobilisation de l’enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 17.4.6. Domaines d’application des biocapteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421 17.4.6.1. Domaine de la santé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421 17.4.6.2. Industrie agro-alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421 17.4.6.3. Environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422 18 - Les extrêmozymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423 18.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423 18.2. Organismes thermophiles et hyper-thermophiles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425 18.3. Organismes psychrophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426 18.4. Organismes piézophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427 18.5. Organismes halophiles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428 18.6. Organismes acidophiles/alcalinophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429 18.7. Organismes radiophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430 18.8. Organismes metallophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431 18.9. Organismes xerophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432 18.10. Organismes oligophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432 18.11. Production des enzymes extrêmophiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432

Partie VI - Cultures cellulaires 19 - Les cellules végétales et les cellules animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 19.1. Définition, généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 19.2. Cultures de cellules végétales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 19.2.1. Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437

578

ABRÉGÉ DE BIOCHIMIE APPLIQUÉE

19.2.2. Conduite d’une culture de tissus végétaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438 19.3. Cultures de cellules animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440 19.3.1. Conduite d’une culture de cellules animales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440 
.JMJFVY
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DVMUVSF
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440 19.3.1.2. Conditions de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445 19.3.2. Systèmes de culture cellulaire industrielle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446 19.3.3. Immortalisation des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447 19.4. Amélioration de la production de métabolites secondaires chez les plantes . . . . . . . 448 19.4.1. Criblage et sélection de lignées cellulaires hautement productrices. . . . . . . . . . . . 448 19.4.2. Optimisation de la croissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448 19.4.3. Utilisation de précurseurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449 19.4.4. ²licitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449 19.4.5. Immobilisation de cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 450 19.4.6. Perméabilisation des membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 19.4.7. Stress osmotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 19.4.8. Génie métabolique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 19.5. Applications et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452 19.5.1. Biologie cellulaire et biochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452 19.5.2. Criblage pharmaceutique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452 19.5.3. Production de molécules pharmaceutiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453 19.5.3.1. Cellules animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453 19.5.3.2. Cellules végétales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 457 19.5.4. Biotransformations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 460 Bibliographie sommaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 Ouvrages généraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 Chapitre 1 - Glucides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Chapitre 2 - Protides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Chapitre 3 - Lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Chapitre 4 - Huiles essentielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Chapitre 5 - Lignines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Chapitre 6 - Lectines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Chapitres 7 et 8 - Substances issues des algues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Chapitre 9 - Produits sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468 Chapitre 10 - Produits laitiers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468 Chapitre 11 - Ovoproduits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468 Chapitre 12 - Gélatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 Chapitres 13 et 14 - Substances d'origine microbienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 Chapitre 15 – Polymères microbiens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 Chapitres 16 et 17 - Enzymologie appliquée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 Chapitre 18 – Extrêmozymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 Chapitre 19 - Cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 Glossaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473 Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 555 Table des matières . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 569